1

脱分化脂肪細胞脱分化脂肪細胞脱分化脂肪細胞脱分化脂肪細胞(DFAT)を用いたを用いたを用いたを用いた血管再生細胞治療血管再生細胞治療血管再生細胞治療血管再生細胞治療

日本大学日本大学日本大学日本大学 医学部医学部医学部医学部 医学科医学科医学科医学科

教授教授教授教授 松本太郎松本太郎松本太郎松本太郎

2

間葉系幹細胞間葉系幹細胞間葉系幹細胞間葉系幹細胞 (Mesenchymal stem cell, MSC)

骨髄液

遠心分離間葉系幹細胞 (MSC)

脂肪組織由来幹細胞(ASC)

沈降分画の

付着培養

骨骨骨骨 軟骨軟骨軟骨軟骨 心筋心筋心筋心筋脂肪脂肪脂肪脂肪 血管血管血管血管

分化誘導

� 骨髄液や脂肪組織を付着培養して得られる細胞群

� 高い増殖能と中胚葉組織（骨、軟骨、脂肪など）への多分化能を有する

� 間質分画に微量に存在：骨髄細胞の1万個に１個（新生児）,10万個に１個（成人）,40万個に１個（高齢者）

� 種々の液性因子の分泌を介した血管新生作用、創傷治癒作用、免疫制御作用を有する。

� 腫瘍原性がなく、移植安全性が高いため多くの臨床研究が行われている

吸引脂肪組織

3

治療用細胞治療用細胞治療用細胞治療用細胞としてのとしてのとしてのとしてのMSCMSCMSCMSCのののの問題点・課題問題点・課題問題点・課題問題点・課題

・ 調製時に他細胞の混入が避けられない

・ MSC自体もヘテロな細胞集団である

（特異的マーカーなし、前駆細胞などが含まれている可能性）

・ 継代培養により形質が変化する

・ 高齢者、骨粗鬆症患者など必要な細胞数を得

られない症例が存在する

患者から同じ品質のMSCが得られない

細胞医薬品としての製品化が困難

4

脱分化脂肪細胞脱分化脂肪細胞脱分化脂肪細胞脱分化脂肪細胞 (Dedifferentiated fat cell; DFAT)

成熟脂肪細胞成熟脂肪細胞成熟脂肪細胞成熟脂肪細胞脱分化脂肪細胞脱分化脂肪細胞脱分化脂肪細胞脱分化脂肪細胞

(DFAT)脱分化脱分化脱分化脱分化

骨骨骨骨 軟骨軟骨軟骨軟骨 心筋心筋心筋心筋

Matsumoto T et al. J Cell Matsumoto T et al. J Cell Matsumoto T et al. J Cell Matsumoto T et al. J Cell PhysiolPhysiolPhysiolPhysiol, 2008, 215:210, 2008, 215:210, 2008, 215:210, 2008, 215:210----222222222222

細胞増殖活性細胞増殖活性細胞増殖活性細胞増殖活性

脂肪脂肪脂肪脂肪 血管血管血管血管

加野浩一郎（国際特許出願加野浩一郎（国際特許出願加野浩一郎（国際特許出願加野浩一郎（国際特許出願PCT/JP2004/007322)PCT/JP2004/007322)PCT/JP2004/007322)PCT/JP2004/007322)

脱分化脂肪細胞（DFAT）は成熟脂肪細胞を天井培養という方法で脱分化させることにより得られるMSCと同等の多能性を有する細胞である。

5

DFATDFATDFATDFATの調製法（天井培養法）の調製法（天井培養法）の調製法（天井培養法）の調製法（天井培養法）

約１ｇの脂肪組織を酵素処理し、浮遊層を採取することにより成熟脂肪細胞を単離することができ

る。これを天井培養という方法で培養すると脂肪細胞は非均等性に分裂し、DFATが産生される。

培養１週間後にフラスコを反転させ、通常の付着培養を行うとDFATは急速に増殖する。

6

DFATDFATDFATDFATと間葉系細胞との遺伝子発現差異のと間葉系細胞との遺伝子発現差異のと間葉系細胞との遺伝子発現差異のと間葉系細胞との遺伝子発現差異の比較比較比較比較（（（（DNADNADNADNAマイクロアレイ法）マイクロアレイ法）マイクロアレイ法）マイクロアレイ法）

DFATと脂肪組織由来幹細胞(ASC)は非常に近似した遺伝子発現プロファイルを示す。

7

人工誘導性幹細胞人工誘導性幹細胞人工誘導性幹細胞人工誘導性幹細胞(DFATととととiPS細胞の違い）細胞の違い）細胞の違い）細胞の違い）

受精卵受精卵受精卵受精卵

胚盤胞胚盤胞胚盤胞胚盤胞

体性（組織）幹細胞体性（組織）幹細胞体性（組織）幹細胞体性（組織）幹細胞

間葉系幹細胞間葉系幹細胞間葉系幹細胞間葉系幹細胞 (MSC)

成熟細胞成熟細胞成熟細胞成熟細胞

ES細胞細胞細胞細胞胚性幹細胞胚性幹細胞胚性幹細胞胚性幹細胞

脱分化

DFAT初期化

iPS細胞細胞細胞細胞

皮膚線維芽細胞皮膚線維芽細胞皮膚線維芽細胞皮膚線維芽細胞 成熟脂肪細胞成熟脂肪細胞成熟脂肪細胞成熟脂肪細胞

iPS細胞は成熟細胞を加工してES細胞に類似した細胞を作る技術である。一方、DFATは成熟細胞を加工してMSCに類似した細胞を作る技術である。

8

DFATDFATDFATDFATはドナー年齢に無関係はドナー年齢に無関係はドナー年齢に無関係はドナー年齢に無関係に調製できるに調製できるに調製できるに調製できる

脂肪誘導 (Oil red-O)

骨誘導 (Alizarin-red S)

軟骨誘導 (Pellet culture)

81yo M

分化誘導４週間後に評価。

脂肪分化（Oil red-O), 骨分化(Alizerin-red S), 軟骨分化(Pellet culture)

Donor age Sex Passage Adipogenic Osteogenic Chondrogenic

2 F P3 ＋ ＋ ＋

4 M P5 ＋ 3＋ ＋

7 M P5 ＋ 2＋ ＋

10 M P3 ± ＋ ＋

10 M P8 ＋ ＋ ＋

16 M P4 2＋ 3＋ ＋

46 F P7 ＋ 3＋ ＋

58 F P4 2＋ 2＋ ＋

68 M P4 2＋ ＋ ＋

69 F P6 ＋ ＋ ＋

75 F P3 2＋ 2＋ ＋

77 F P2 3＋ 3＋ ＋

81 M P3 2＋ 2＋ ＋

9

成熟脂肪細胞

培養DFAT

平滑筋細胞

血管内皮細胞 脂肪由来幹細胞(ASC)

組織マクロファージ

脱分化脂肪細胞(DFAT)

付着培養

付着培養天井培養

培養ASC間質血管分画(SVF)細胞

脂肪組織

DFATは少量の脂肪組織から均質な細胞を大量調製できるできるできるできる

松本太郎：医学のあゆみ 242:326-331, 2012

10

10 ml10 ml10 ml10 mlの吸引脂肪からの吸引脂肪からの吸引脂肪からの吸引脂肪から得られる得られる得られる得られるDFATDFATDFATDFATととととASCASCASCASCの細胞数の細胞数の細胞数の細胞数の比較の比較の比較の比較

10 ml 吸引脂肪組織

細胞数細胞数細胞数細胞数付着・付着・付着・付着・

増殖細増殖細増殖細増殖細胞数胞数胞数胞数

播種細胞播種細胞播種細胞播種細胞密度密度密度密度

（（（（/cm2)

培養面積培養面積培養面積培養面積（（（（T-25フラフラフラフラスコ枚数）スコ枚数）スコ枚数）スコ枚数）

初代培養初代培養初代培養初代培養

で得られで得られで得られで得られる細胞数る細胞数る細胞数る細胞数

成熟脂肪細胞

1x106

(100万）4x105

(40万)2x103 1,250cm2

(50枚）DFATs 1.4x108

SVF細胞2x106

(200万）8x104

(8万)5x104 100cm2

（２枚）

ASCs 5.6x106

10 mlの吸引脂肪から約２週間の培養で108個のDFATを得ることができる。DFATはASCに比べ約25倍の調製効率を示す。

11

移植用ドナー細胞としての移植用ドナー細胞としての移植用ドナー細胞としての移植用ドナー細胞としてのDFATDFATDFATDFATの利点の利点の利点の利点

約1gの脂肪組織（10 mlの吸引脂肪）から大量調製が可能� MSC・ASCに比べ採取に伴う侵襲が少ない

� 重症心不全、重度熱傷など全身状態不良の症例でも自家移植が可能

ドナー年齢や基礎疾患に関係なく多能性細胞が調製できる� 高齢者・骨粗鬆症などに対する自家移植が可能

MSC・ASCに比べ、他細胞の混入が非常に少ない� 移植に伴うリスクが低い

� 継代早期に移植できる

手術時に破棄される脂肪組織を利用したバンキングシステムの

構築が容易� 他家移植への適応も有望（急性期疾患、遺伝性疾患など）

12

培養ヒト培養ヒト培養ヒト培養ヒトDFATの発現サイトカイン解析の発現サイトカイン解析の発現サイトカイン解析の発現サイトカイン解析

低酸素刺激により分泌が

亢進するタンパク

PlGFVEGF-ASDF-1TGFβ-1TGFβ-3

IL-16PDGF-BBNT-4Leptin

Kikuta S et al. Tissue Eng Part A, 19:1792-1802, 2013

FGF6FGF7Thrombopoietin

PARCIGFBP-3

DFATはASCや骨髄MSCとほぼ一致した液性因子の分泌パターンを示す。また低酸素で刺激することにより種々の血管新生因子が分泌される。

13

Con

cent

ratio

n (n

g/m

l)C

once

ntra

tion

(ng/

ml)

Con

cent

ratio

n (n

g/m

l)

Con

cent

ratio

n (n

g/m

l)

Con

cent

ratio

n (n

g/m

l)

Con

cent

ratio

n (n

g/m

l)

Con

cent

ratio

n (n

g/m

l)C

once

ntra

tion

(ng/

ml)

DFATASC

BM

-MS

C

Preadipocyte

Fibroblast

HGF SDF-1

DFATASC

BM

-MS

C

Preadipocyte

Fibroblast

DFATASC

BM

-MS

C

Preadipocyte

Fibroblast

DFATASC

BM

-MS

C

Preadipocyte

Fibroblast

MCP-1 IL-6

DFATASC

BM

-MS

C

Preadipocyte

Fibroblast

DFATASC

BM

-MS

C

Preadipocyte

Fibroblast

VEGF-A VEGF-A (低酸素)

Leptin

DFATASC

Preadipocyte

Fibroblast

BM

-MS

C

Leptin (低酸素)

DFATASC

BM

-MS

C

Preadipocyte

Fibroblast

DFATDFATDFATDFATに特徴的な分泌蛋白の比較解析に特徴的な分泌蛋白の比較解析に特徴的な分泌蛋白の比較解析に特徴的な分泌蛋白の比較解析 (ELISA)(ELISA)(ELISA)(ELISA)

DFATはASCに比べHGF、SDF-1、VEGF-A、Leptinの分泌が高い傾向にあり、VEGF-A、Leptinは低酸素刺激により分泌が亢進する。

14

血管内皮細胞との共培養により血管内皮細胞との共培養により血管内皮細胞との共培養により血管内皮細胞との共培養によりDFATは血管構成細胞は血管構成細胞は血管構成細胞は血管構成細胞(ペリサイトペリサイトペリサイトペリサイト)へと分化するへと分化するへと分化するへと分化する

GFP/Hoechst NG2/Hoechst GFP/NG2/Hoechst

マウス血管内皮細胞 (MS-1)マウスGFP-DFAT

72時間共培養

NG2: ペリサイトマーカー

15

免疫不全免疫不全免疫不全免疫不全(SCID)マウスマウスマウスマウス下肢虚血モデルに対するヒト下肢虚血モデルに対するヒト下肢虚血モデルに対するヒト下肢虚血モデルに対するヒトDFAT移植の効果移植の効果移植の効果移植の効果

0

20

40

60

80

100

0 week 1 week 2 week 3 week 4 week

対側

健常肢

に対

する虚

血率

（％

）

DFAT

PB-MNC

Control

＊

†

†

†＊

移植前 移植4週間後

脱分化脂肪細胞(DFAT)

末梢血単核球(PB-MNC)

生理食塩水(Control)

+p < 0.05 vs Control* p < 0.05 vs PB-MNC

ヒトDFATをマウスの虚血筋肉内に移植すると血流改善効果が認められる。DFATの血流改善効果はヒト末梢血単核球に比べ有意に高い。

16

ウサギ下肢虚血モデルに対する自家ウサギ下肢虚血モデルに対する自家ウサギ下肢虚血モデルに対する自家ウサギ下肢虚血モデルに対する自家DFAT移植の効果移植の効果移植の効果移植の効果

・ウサギ下肢虚血モデル: 片側大腿動脈を結紮切離・同日、①自家DFAT(1x 107), ②自家Fibroblast(1x 107), ③生理食塩水(Control)を虚血筋肉内投与

内皮細胞のみからなる血管数内皮細胞のみからなる血管数内皮細胞のみからなる血管数内皮細胞のみからなる血管数

平滑筋細胞を伴う血管数平滑筋細胞を伴う血管数平滑筋細胞を伴う血管数平滑筋細胞を伴う血管数

*p < 0.05 vs Control#p < 0.05 vs Fibroblast+p < 0.05 vs PB-MNC

*

*

*

#

#

#

+ +

DFAT移植は線維芽細胞や末梢血単核球に比べて高い血流改善効果を示す。DFATは特に平滑筋細胞を伴う分化度の高い血管を増加させる。

17

吸引脂肪組織(10ml)

成熟脂肪細胞(5 x 105)

脱分化（天井）培養

x

DFAT(1 x 107/ml, 25ml)

DFAT (P0, 1.5 x 107)

DFAT (P1-2, 2.5 x 109)

DFAT(5 x 106/0.5ml・ 50本)

筋肉内注射（50カ所）

トリプシン処理・継代増殖培養

トリプシン処理・濃縮

２W

1-2W

局所麻酔脂肪吸引

100 µm フィルト

レーション・低速度遠心分離 浮遊分画を播種

0.5mlシリンジに分注

凍結保存

セルファクトリー

ＰＡＤ患者

末梢動脈疾患末梢動脈疾患末梢動脈疾患末梢動脈疾患(PAD)に対するに対するに対するに対するDFAT自家移植による血管新生細胞治療自家移植による血管新生細胞治療自家移植による血管新生細胞治療自家移植による血管新生細胞治療

18

DFATDFATDFATDFAT細胞治療が期待できる疾患とポテンシャル細胞治療が期待できる疾患とポテンシャル細胞治療が期待できる疾患とポテンシャル細胞治療が期待できる疾患とポテンシャル

� 低コストの細胞治療・再生医療が可能となる（大規模な細胞調製施設, 遺伝子導入, 抗体選別など必要なし）

� 細胞医薬品として薬事法トラック下での臨床開発が可能（一定した品質のMSC様細胞を大量調製できる）

� 万人に適応可能な未来の一般医療となる可能性（高齢者や基礎疾患を有する患者に対する自家細胞治療、バンクシステム

構築によるHLAフルマッチした他家細胞治療が可能）

� 末梢動脈疾患PAD(閉塞性動脈硬化症、バージャー病）に対する細胞治療

� 難治性潰瘍・褥瘡に対する細胞治療

� 重度熱傷に対する真皮再生促進治療

� がん術後の皮弁術時の生着領域拡大

� その他 （骨・軟骨疾患に対する再生医療など）

19

ビジネスモデルビジネスモデルビジネスモデルビジネスモデル

1. 自家DFAT細胞医薬品調製供給事業モデル

– 自家細胞によるPAD向けDFAT細胞調製供給型事

業を、日大病院内CPC等を製造拠点に、日大病院お

よび関連する診療所を中心にサービス展開する。

– 細胞調製サービスの提供および調製キット販売によ

る収益モデル。

2. 他家移植用HLA適合DFAT細胞医薬品ライセンシ

ングモデル

– 自家細胞医薬品事業による臨床応用を背景に、他家向

けDFAT製品事業化にむけた臨床開発を行う。

– 再生医療細胞医薬品に興味を持つ企業向けに、DFAT細胞医薬品技術のライセンシング導出を開発する。

– 既存の臍帯血バンク施設を活用し、細胞調製技術およ

び細胞バンクのノウハウを確立し、共に導出を行う。

– ライセンス•ロイヤリティ収入モデル。

日本大学病院

・他関連診療所

局所麻酔

下 に 約

10ml の 脂

肪 組 織 を

吸引採取

自家DFAT調製

キット

細胞調製施設（日本大学CPC他）

成熟脂肪細胞の単離

DFAT調製・増殖

DFAT加工•品質テスト

移植 細胞医薬品

• 筋注用

DFAT

• 点滴静注

用DFAT

キット販売

DFAT Company

③供給

①回収

②調製

ライセンシー（製薬企業）

提携病院

医療廃棄物として廃棄される脂肪組織等を採取

細胞調製施設・DFAT細胞バンク（製薬企業社内もしくは外部提携）

成熟脂肪細胞の単離

DFAT の 調製・増殖

HLA検査・品質検査

HLAマッチした

患者に移植

液体窒素タンクに凍結保存

一部解凍・HLA検査、品質検査

病院

A病院

発注

病院

B

病院

C

②調製③保存

①採取

④供給

細胞医薬品

• 筋注用

DFAT

• 点滴静注

用DFAT

• DFAT細胞医薬品の研究開発と製品ラインナップの拡大• 新しい対象疾患向けの臨床開発

DFAT Company

ライセンシング

特許フィーロイヤリティ

20

実用化に向けた課題実用化に向けた課題実用化に向けた課題実用化に向けた課題

• GMP準拠した臨床グレードのDFAT調製が可

能なところまで開発済み。現在、末梢動脈疾患(PAD)を対象とした自家DFAT移植療法の作業手順書（SOP）を作成中。

• 今後、移植安全性試験などのデータを取得し、2017年中に再生医療新法の下でFirst in Man試験を行う予定。

• 今後、細胞医薬品としての実用化に向けて、改正薬事法に適合した高い品質のDFAT製造法を確立する必要がある。

21

企業への期待企業への期待企業への期待企業への期待

• DFATを細胞医薬品として臨床開発・販売を目指す製薬企業などとの共同研究を希望

• 再生医療用細胞医薬品に興味をもつ企業に対し、DFAT細胞医薬品技術のライセンシング導入を検討していただきたい

• DFAT事業を展開するバイオベンチャーの設立協力、投資を希望

22

本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：脱分化脂肪細胞を有効成分とする

血管再生療法用組成物

• 出願番号 ：特願2015-065598• 出願人 ：日本大学

• 発明者 ：松本太郎、加野浩一郎、風間智彦

• 発明の名称 ：前駆脂肪細胞由来の分化細胞およびその

取得方法

• 出願番号 ：特願2005-506883 (PCT/JP2004/007322)• 出願人 ：日本大学

• 発明者 ：加野浩一郎

基盤特許

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産学連携の産学連携の産学連携の産学連携の経歴経歴経歴経歴

• 2008年-2009年 JST産学共同シーズイノベーション化

事業（顕在化ステージ）に採択

• 2008年-2009年 ニプロ株式会社と共同研究実施

• 2013年 JST知財活用促進ハイウェイ「大学特許価値向

上支援」に採択

• 2014年- JST大学発新産業創出プログラム(START)事業に採択(事業プロモーター 360ipJAPAN)

• 2014年- 文科省 私立大学戦略的研究基盤形成支援

事業に採択

24

おおおお問い合問い合問い合問い合わせ先わせ先わせ先わせ先

日本大学

産官学連携知財センター(NUBIC)

コーディネーター 松岡義人

TEL 03-5275-8139

FAX 03-5275-8328

e-mail matsuoka.yoshihito＠nihon-u.ac.jp