dg2013-01 recommedation to prepare calibration...

Japan Bioanalysis Forum

6th JBF Symposium, DG-01 1

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DG2013-01： Recommedation to prepare

calibration standards and QC samples

Harue Igarashi1, Akinori Aoyama2, Midori Ochiai3, Mitsuhiko Kawabata4, Aki Koyama5, Kaori Suzuki6, Kuretake Soejima7, Kazuhiro Takegami8, Kazutaka Togashi9, Kumiko Hikida10, Naohito Yamada11

1 GlaxoSmithKline K.K., 2 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., 3 Towa Pharmaceutical Co., Ltd., 4 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd., 5 JCL Bioassay Corporation, 6 Ono Pharmaceutical Co., Ltd., 7 Toyama Chemical Co., Ltd., 8 Toray Research Center, Inc., 9 Sumika Chemical Analysis Service, Ltd., 10 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, 11 Japan Tobacco Inc.



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Background

• Bioanalysts have experienced that preparation procedures of calibration samples and/or QC samples might lead differences in quantification results because biological matrix has heterogeneous nature.

• We had presented the variability to prepare calibration standards and QC samples according to survey from 148 bioanalysts in Japan at the 5th JBF symposium.

• In this symposium, we introduce our recommendation and discussion including pros and cons of each procedure.



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Questionnaires of Survey

Calibration standards (CS)

• Set concentration

• Solvent composition

• Serial dilution

• Prepare calibration samples

• Multiple analyte

CS/QC common

Kind of solvents, preparation order, preparation person, equipment

Matrices

• Surrogate matrix

• Maintain blank matrix

• Stability in tissue

QC

• Set concentration

• Preparation frequency and volume

• Check prepared samples

• Bench-top stability

• Recovery, Matrix effect

• Whole blood stability

• Dilution

• Special (Parallel QC, Dilution QC)

Note: Red characters are discussion topics focused in the DG.



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Background of Responders • 1st Survey • 2nd Survey

91

63

6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Article 43* GLP Others

Num

ber of vote

rs

76

60

20

10

20

30

40

50

60

70

80

Article 43* GLP Others

Num

ber o

f vot

ers

Total number of voters：98

*The reliability standard for application

materials in Japan.


Regulations Regulations

New drug manufacturer

(Japan), 52.0%

Generic drug manufacturer

(Japan), 10.2%

CRO (Japan), 27.6%


(Foreign owned), 6.1%

Others, 4.1%

New drug manufacturer (Japan), 47.7%

Generic drug manufacturer (Japan), 5.8%

CRO (Japan), 36.0%


(Foreign owned), 7.0%

Others, 3.5%



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/ ピペット管理 Pipette check

点検

タイミング

Inspection timing

ピペット誤差シミュレータ

Simulator of pipette error

点検の基準

Inspection criteria



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/

推奨：ピペット点検のタイミング Recommendation: Pipette inspection (Timing)

容量可変式ピペット点検のタイミング

①使用前点検＋定期（業者）点検 (58.1%)

②定期（業者）点検のみ(22.6%)

③使用前後で挟み込み(19.4%)

の順であった。検定機器や蛍光試薬（e.g.アキュマスター）の使用例もあった。

使用時点検：リークチェック・目盛りチップで簡略化の例もあり。

推奨：①と③は適切であると考えられる。 ②の場合、使用前点検を推奨する。

Recommendation: The inspection is necessary just before use



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議論：ピペット点検の基準 Discussion: Pipette inspection (Criteria)

真度のクライテリア(Criteria of accuracy)

±2%, ±5%, ±3%, ±2.5%, ±4%で約70%を占めた。

→50%以上の回答者が「±2%超」に設定。

精度のクライテリア(Criteria of precision)

2%, 1%, 5%, 3%で約70%を占めた。

→30%以上の回答者が「2%超」に設定。

議論：(±)2%超のクライテリアは「甘い」と考える。以下のポスターで考察する。



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2% Precision, 25.3%

1 % Precision, 17.1%



0.5 % Precision, 8.2%


0.7 % Precision,

2.7%



4 % Precision, 2.1%


0.4 % Precision,

1.4%



0.6 % Precision,

0.7%





Survey：ピペット点検の基準 Pipette inspection (Criteria: ±5% is acceptable?)

全体の約1/5がクライテリアを（±）5%に設定している。このクライテリアは適切だろうか?

± 2 % Accuracy, 21.6%

± 5 % Accuracy, 20.5%

± 3 % Accuracy, 13.6%

± 2.5 % Accuracy, 7.4%

± 4 % Accuracy, 5.1%

± 0.6 % Accuracy, 4.5%


± 1.5 % Accuracy, 4.5%

± 1.8 % Accuracy,

4.5%

± 3.5 % Accuracy,

2.8% ± 0.8 %

Accuracy, 1.7%

± 2.4 % Accuracy,

1.7%

± 20 % Accuracy,

1.7%

± 0.9 % Accuracy, 0.6%

± 1.2 % Accuracy,

0.6%

± 1.4 % Accuracy,

0.6%

± 1.6 % Accuracy,

0.6% ± 6 %

Accuracy, 0.6%

± 7.5 % Accuracy,

0.6%



± 10 % Accuracy, 0.6%

± 15 % Accuracy, 0.6%



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ピペット誤差シミュレータ Simulator of pipette error

●検量＆QC　ピペット誤差シミュレータ ver. 2.0, by Akinori AOYAMA

[email protected]

P-200の誤差： -5 % ←ここのみ変更！赤文字：検量線用標準溶液

P-1000の誤差： 0 % ←ここのみ変更！水色：QC試料調製用標準溶液(WS)

1000000 ng/mL

95 uL（P-200）

900 uL（P-1000）

95477.387 ng/mL

95 uL（P-200） 800 uL（P-1000）

900 uL（P-1000） 190 uL（P-200）

9115.9314 ng/mL 77153.444 ng/mL

190 uL（P-200） 95 uL（P-200）

800 uL（P-1000） 900 uL（P-1000）

1749.5222 ng/mL 870.36531 ng/mL

95 uL（P-200） 95 uL（P-200） 500 uL（P-1000）

900 uL（P-1000） 900 uL（P-1000） 500 uL（P-1000）

167.03981 ng/mL 83.100206 ng/mL 435.18266 ng/mL

95 uL（P-200） 95 uL（P-200） 95 uL（P-200）

900 uL（P-1000） 900 uL（P-1000） 900 uL（P-1000）

15.948524 ng/mL 7.9341905 ng/mL 41.550103 ng/mL

95 uL（P-200） 95 uL（P-200） 95 uL（P-200）

900 uL（P-1000） 900 uL（P-1000） 900 uL（P-1000）

1.5227234 ng/mL 0.7575358 ng/mL 3.9670952 ng/mL

＜検量線＞＜QC＞実際の調製値検量線の実際の QC試料の

理論値（レスポンス）逆回帰値真度残差平方重み重み*残差平方理論値調製値逆回帰値真度

x y （ng/mL） (% Diff) f(x)=ax+b (f(x)-y) 2̂ 1/y 2̂ 1/y 2̂*(f (x)-y ) 2̂ （ng/mL）（ng/mL）（ng/mL） (% Diff)

1000 870.365 1049.099 4.91 829.627 1659.5914 1.32E-06 0.0021908 HQC 800 771.534 929.985 16.25

500 435.183 524.604 4.92 414.768 416.7431 5.28E-06 0.0022005 MQC 20 17.495 21.195 5.97

200 167.040 201.430 0.72 165.853 1.4083844 3.584E-05 5.048E-05 LQC 2 1.670 2.122 6.11

100 83.100 100.264 0.26 82.881 0.0479277 0.0001448 6.94E-06 LLOQ 1 0.831 1.111 11.06

50 41.550 50.186 0.37 41.395 0.0239343 0.0005792 1.386E-05

20 15.949 19.331 -3.35 16.504 0.3084024 0.0039315 0.0012125

10 7.934 9.672 -3.28 8.207 0.0742544 0.0158853 0.0011796

5 3.967 4.890 -2.19 4.058 0.0082816 0.0635411 0.0005262

2 1.523 1.944 -2.79 1.569 0.0021365 0.4312786 0.0009214

1 0.758 1.022 2.21 0.739 0.0003352 1.7425839 0.0005841

0.008886 ←重み1/y 2̂の残差平方和

y=ax+b

傾き：a= 0.8297 ←ここに「ソルバー」で計算された「傾きa」の値が自動で入ります。切片：b= -0.0905 ←ここに「ソルバー」で計算された「切片b」の値が自動で入ります。

1049.099

524.604

201.430

100.264

50.186

19.331

9.672

4.890

1.944

1.022

0.1

1.0

10.0

100.0

1000.0

10000.0

0.1 1.0 10.0 100.0 1000.0

逆回

帰値

(ng

/mL

)

理論値 x (ng/mL)

Excelの「ソルバー」機能を用い、 1/y2の重みを付けた検量線を作成。ピペット誤差と検量・QCの関係を評価。（本ポスターは-5%の例）



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シミュレーション条件・注目点 Simulation conditions

検量線用標準原液： 1 mg/mL (Stock solution)

検量範囲： 1-1000 ng/mL (Range)

検量ポイント： 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 ng/mL (10 points)

希釈系列数： 3系列（例示ポスターをご覧ください)

HQC： 800 ng/mL ： 80000 ng/mL（Working soln.）を1%スパイク（Spiked 1% to Matrix)

MQC： 20 ng/mL ： 2000 ng/mL （Working soln.）を1%スパイク（Spiked 1% to Matrix)

LQC： 2 ng/mL ： 200 ng/mL（Working soln.）を1%スパイク（Spiked 1% to Matrix)

LLOQ： 1 ng/mL ： 100 ng/mL（Working soln.）を1%スパイク（Spiked 1% to Matrix)

検量線： y=ax+b, Weight: 1/y2

容量可変式ピペットA： 200 uL（e.g. P-200）

容量可変式ピペットB： 1000 uL（e.g. P-1000）

設定誤差： -5%, -3%, +3%, -2%, -1% of error

注目点1：誤差がどのように累積するか？(Cumulative error)

注目点2：誤差が（大きく）累積しても、検量線の逆回帰値は正常に見える点（非常に気づきにくい）。(Back calculated conc. is normal)

注目点3： ISRを含めた分析の信頼性に及ぼす影響。(Effect to ISR etc.)



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誤差：-5%のシミュレーション Simulation: -5% error of accuracy

検量線 y = 0.8297x - 0.09049 重み1/y 2̂ QC

(ng/mL) (ng/mL) (%) （ng/mL） (% Diff) (ng/mL) (ng/mL) (%) （ng/mL） (% Diff)

1000 870.365 -13.0 1049.099 4.9 OK HQC 800 771.534 -3.6 929.985 16.2 NG

500 435.183 -13.0 524.604 4.9 OK MQC 20 17.495 -12.5 21.195 6.0 OK

200 167.040 -16.5 201.430 0.7 OK LQC 2 1.670 -16.5 2.122 6.1 OK

100 83.100 -16.9 100.264 0.3 OK LLOQ 1 0.831 -16.9 1.111 11.1 OK

50 41.550 -16.9 50.186 0.4 OK

20 15.949 -20.3 19.331 -3.3 OK

10 7.934 -20.7 9.672 -3.3 OK

5 3.967 -20.7 4.890 -2.2 OK

2 1.523 -23.9 1.944 -2.8 OK

1 0.758 -24.2 1.022 2.2 OK

真度判定

理論値実際の

調製濃度累積誤差逆回帰値真度

判定理論値

実際の調製濃度

累積誤差逆回帰値

誤差が累積しても原点付

近を通る「正常な」検量線

に見える。

LLOQ：「実際は」

25%近い誤差

しかし、逆回帰値（真度）には

全く問題がない。

→異常に気づけない

HQCが外れてしまう（スパイクした高濃度の標準溶液は

検量線よりも段階希釈数が少なく、

誤差が少ないため）

1049.099

524.604

201.430

100.264

50.186

19.331

9.672

4.890

1.944

1.022

0.1

1.0

10.0

100.0

1000.0

10000.0

0.1 1.0 10.0 100.0 1000.0

逆回

帰値

(ng

/mL

)

理論値 (ng/mL)



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誤差：±3%のシミュレーション Simulation: ±3% error of accuracy and study sample analysis (ex. ISR)

誤差：-3%のピペットで初回分析誤差：+3%のピペットでISR


1000 920.937 -7.9 1028.312 2.8 OK 1000 1082.951 8.3 974.732 -2.5 OK

500 460.468 -7.9 514.189 2.8 OK 500 541.476 8.3 487.331 -2.5 OK

200 179.740 -10.1 200.750 0.4 OK 200 221.757 10.9 199.541 -0.2 OK

100 89.600 -10.4 100.107 0.1 OK 100 111.210 11.2 100.034 0.0 OK

50 44.800 -10.4 50.087 0.2 OK 50 55.605 11.2 49.982 0.0 OK

20 17.487 -12.6 19.592 -2.0 OK 20 22.773 13.9 20.428 2.1 OK

10 8.717 -12.8 9.800 -2.0 OK 10 11.420 14.2 10.209 2.1 OK

5 4.359 -12.8 4.933 -1.3 OK 5 5.710 14.2 5.069 1.4 OK

2 1.701 -14.9 1.966 -1.7 OK 2 2.339 16.9 2.035 1.7 OK

1 0.848 -15.2 1.014 1.4 OK 1 1.173 17.3 0.985 -1.5 OK

HQC 800 783.033 -2.1 874.340 9.3 OK HQC 800 816.636 2.1 735.012 -8.1 OK

MQC 20 18.474 -7.6 20.694 3.5 OK MQC 20 21.594 8.0 19.367 -3.2 OK

LQC 2 1.797 -10.1 2.074 3.7 OK LQC 2 2.218 10.9 1.926 -3.7 OK

LLOQ 1 0.896 -10.4 1.067 6.7 OK LLOQ 1 1.112 11.2 0.931 -6.9 OK

UK sample　(High) 950 950.000 None 1060.762 11.7 ISR　(High) 1061 950.000 None 855.058

UK sample (Low) 2.00 2.000 None 2.300 15.0 ISR (Low) 2.30 2.000 None 1.730

ISR＝（ISRの定量値 - 初回定量値）/ ISRと初回定量値の平均　x 100

真度理論値実際の

調製濃度累積誤差逆回帰値

ISR: -21.5%

ISR: -28.3%

真度判定判定

理論値実際の

調製濃度累積誤差逆回帰値

★Unknown sample の濃度が

15%真の値からずれている。

しかし、この時点で気づくことは不可能

初回測定値

をもとにISR

を実施

★検量・QCともに基準を満

たすため、ISRの分析単

位をRejectできない。

★初回測定時「-3%」のピペット誤差

★ISR測定時「+3%」のピペット誤差

ISRの基準を逸脱してしまう



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1000 946.862 -5.3 1018.510 1.9 OK 1000 1054.866 5.5 982.841 -1.7 OK

500 473.431 -5.3 509.278 1.9 OK 500 527.433 5.5 491.397 -1.7 OK

200 186.330 -6.8 200.466 0.2 OK 200 214.335 7.2 199.664 -0.2 OK

100 92.978 -7.0 100.054 0.1 OK 100 107.382 7.4 100.008 0.0 OK

50 46.489 -7.0 50.050 0.1 OK 50 53.691 7.4 49.981 0.0 OK

20 18.297 -8.5 19.725 -1.4 OK 20 21.819 9.1 20.283 1.4 OK

10 9.130 -8.7 9.865 -1.3 OK 10 10.931 9.3 10.139 1.4 OK

5 4.565 -8.7 4.955 -0.9 OK 5 5.466 9.3 5.046 0.9 OK

2 1.797 -10.2 1.977 -1.1 OK 2 2.221 11.1 2.023 1.1 OK

1 0.897 -10.3 1.009 0.9 OK 1 1.113 11.3 0.990 -1.0 OK

HQC 800 788.726 -1.4 848.416 6.1 OK HQC 800 811.127 1.4 755.734 -5.5 OK

MQC 20 18.975 -5.1 20.455 2.3 OK MQC 20 21.055 5.3 19.572 -2.1 OK

LQC 2 1.863 -6.8 2.049 2.5 OK LQC 2 2.143 7.2 1.951 -2.5 OK

LLOQ 1 0.930 -7.0 1.045 4.5 OK LLOQ 1 1.074 7.4 0.954 -4.6 OK




真度判定

ISR: -14.3%

ISR: -18.9%

判定理論値


累積誤差逆回帰値理論値実際の


★Unknown sample の濃度の

ずれは10%未満である。

初回測定値

をもとにISR

を実施



ISRの基準（±20%）の範囲内（ただし、ギリギリである）



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★DG内で実際の「誤差」を議論： →実際の測定値は±1%程度の誤差であるケースが多かった。



1000 973.216 -2.7 1009.078 0.9 OK 1000 1027.216 2.7 991.259 -0.9 OK

500 486.608 -2.7 504.551 0.9 OK 500 513.608 2.7 495.618 -0.9 OK

200 193.083 -3.5 200.216 0.1 OK 200 207.084 3.5 199.816 -0.1 OK

100 96.445 -3.6 100.019 0.0 OK 100 103.645 3.6 99.996 0.0 OK

50 48.222 -3.6 50.021 0.0 OK 50 51.823 3.6 49.987 0.0 OK

20 19.134 -4.3 19.862 -0.7 OK 20 20.895 4.5 20.141 0.7 OK

10 9.558 -4.4 9.932 -0.7 OK 10 10.458 4.6 10.069 0.7 OK

5 4.779 -4.4 4.977 -0.5 OK 5 5.229 4.6 5.023 0.5 OK

2 1.896 -5.2 1.989 -0.6 OK 2 2.108 5.4 2.011 0.6 OK

1 0.947 -5.3 1.005 0.5 OK 1 1.055 5.5 0.995 -0.5 OK

HQC 800 794.382 -0.7 823.658 3.0 OK HQC 800 805.582 0.7 777.378 -2.8 OK

MQC 20 19.484 -2.6 20.224 1.1 OK MQC 20 20.524 2.6 19.783 -1.1 OK

LQC 2 1.931 -3.5 2.025 1.2 OK LQC 2 2.071 3.5 1.975 -1.2 OK

LLOQ 1 0.964 -3.6 1.023 2.3 OK LLOQ 1 1.036 3.6 0.977 -2.3 OK




真度判定

ISR: -7.2%

ISR: -9.5%

判定理論値


累積誤差逆回帰値理論値実際の


★Unknown sample の濃度の

ずれは5%未満である。

初回測定値

をもとにISR

を実施



→ISRの基準（±20%）の範囲内



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/

まとめ：「甘い」評価基準の場合 Summary: “Loose” criteria

真度のクライテリア：±3～5%の場合誤差が大きくても検量線の逆回帰値は「きれい」に見える。

→ピペット誤差に気づきにくいため注意が必要。

実試料濃度を見誤る

→広く波及する大きな問題となる。 QCが不適合の可能性

→分析単位をRejectしなくてはならない。

ISRが不適合の可能性

→検量・QCともに基準を（ギリギリ）満たすため（不適合な）ISRの分析単位をRejectできない。

→要因は（単なる）ピペットの誤差にもかかわらず、ISR不適合により分析系全体の妥当性が問われてしまう。

推奨：真度のクライテリア：±2%以内



http

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ioana

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m.jp

/

真度のクライテリア：±2%以内の場合誤差が最大の場合でもQC及びISRに大きな影響を与えない。

経験上の誤差は±1%前後である場合が多い。

精度のクライテリア：真度の基準に合わせた適切な精度を設定

推奨：真度のクライテリア：±2%以内を推奨する Recommendation: ±2% of accuracy

推奨：ピペット点検の基準 Recommendation: Pipette inspection (Criteria)



http

://b

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lysis

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m.jp

/

Appendix：器具の公差 Air Displacement Pipet Positive Displacement Pipet Transfer Pipet Volumetric Frask (PIPETMAN) (MICROMAN)

ISO Class A ISO Class B ISO Class A ISO Class B

Accuracy

(%)

Precision

(%)

Accuracy

(%)

Precision

(%)

Accuracy

(%)

Precision

(%)

Accuracy

(%)

Precision

(%)

Accuracy

(%)

Accuracy

(%)

Accuracy

(%)

Accuracy

(%)

0.2 ± 12 6 ± 40 20 0.5 ± 1 ± 2

0.5 ± 5 2.4 ± 16 8 1 ± 0.8 ± 1.5

2 ± 1.5 0.7 ± 4 2 2 ± 0.5 ± 1

1 ± 2.5 1.2 ± 12 8 1 ± 9 3 ± 20 10 5 ± 0.3 ± 0.6 5 ± 0.5 ± 1

5 ± 1.5 0.6 ± 2.4 1.6 5 ± 2 0.6 ± 4 2 10 ± 0.2 ± 0.4 10 ± 0.25 ± 0.5

10 ± 1 0.4 ± 1.2 0.8 10 ± 1.5 0.6 ± 2 1 20 ± 0.15 ± 0.3 20 ± 0.2 ± 0.4

2 ± 5 1.5 ± 10 5 25 ± 0.12 ± 0.24 25 ± 0.16 ± 0.32

5 ± 2 0.8 ± 4 2 50 ± 0.1 ± 0.2 50 ± 0.12 ± 0.24

10 ± 1 0.5 ± 2 1 10 ± 2.7 0.8 ± 7 3 100 ± 0.08 ± 0.15 100 ± 0.1 ± 0.2

20 ± 1 0.3 ± 1 0.5 25 ± 1.2 0.4 ± 2.8 1 200 ± 0.05 ± 0.1 200 ± 0.075 ± 0.15

20 ± 1.7 1 ± 3.5 1.5 250 ± 0.06 ± 0.12

50 ± 1.4 0.6 ± 1.4 0.6 300 ± 0.083 ± 0.17

20 ± 1.75 0.5 ± 4 1.5 10 ± 5 2 ± 15 6 500 ± 0.05 ± 0.1

50 ± 0.8 0.24 ± 1.6 0.6 50 ± 1.5 0.6 ± 3 1.2 1000 ± 0.04 ± 0.08

100 ± 0.8 0.15 ± 0.8 0.3 100 ± 1 0.4 ± 1.5 0.6 2000 ± 0.03 　－

50 ± 1 0.4 ± 3.2 1.2 50 ± 3 0.6 ± 12 4 3000 ± 0.067 　－

100 ± 0.8 0.25 ± 1.6 0.6 100 ± 1.7 0.3 ± 6 2 5000 ± 0.04 　－

200 ± 0.8 0.15 ± 0.8 0.3 250 ± 1 0.2 ± 2.4 0.8

200 ± 1.5 0.3 ± 4 1.5 100 ± 3 1.6 ± 12 4

500 ± 0.8 0.2 ± 1.6 0.6 500 ± 1 0.5 ± 2.4 0.8

1000 ± 0.8 0.15 ± 0.8 0.3 1000 ± 0.8 0.4 ± 1.2 0.4

1000 ± 1.2 0.3 ± 4 1.5

2000 ± 0.6 0.25 ± 2 0.75

5000 ± 0.6 0.16 ± 0.8 0.3

1000 ± 3 0.6 ± 6 3

2000 ± 1.5 0.3 ± 3 1.5

5000 ± 0.8 0.2 ± 1.2 0.6

10000 ± 0.6 0.16 ± 0.6 0.3

Volume

(mL)

± 23.3 10

Volume

(µL)

GILSON ISO 8655Volume

(mL)

M-50

M-250

GILSON ISO 8655

M-10

3 ± 8.3 2.7

Volume

(µL)

P-2

P-10

P-20

P-200

P-1000

P-5000

P-10ml

M-25P-20 M-25

M-100P-100

M-1000



http

://b

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foru

m.jp

/

調製方法 Preparation method

標準溶液調製溶媒

Solvent of working solution

調製順序

Preparation order

調製担当者

Study personnel

添加割合

Percentage of working solution

濃度確認

Check concentration



http

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m.jp

/

検量線用標準溶液（Working solution）を調製する際、検量線用標準原液（Stock solution）と異なる溶媒を用いて調製をした経験はありますか？また、このように調製した場合、各濃度の検量線用標準溶液（Working solution）で溶媒の組成（比率）の変化が生じる可能性がありますが、どのように対処していますか？



Survey：標準溶液の調製 Preparation of standard solutions



http

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ioana

lysis

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m.jp

/

一定量（1回分以上の）の検量線用標準試料（Calibration standard ）を「一括調製（バッチ調製）」し、分注・保存したものを使用した経験はありますか？また、「一括調製（バッチ調製）」した検量線用標準試料（Calibration standard）を保存する場合、その有効期限はどのように設定していますか？

Total number of voters：98 Long-term stability: 長期保存安定性の確認された期間と同様

（例：凍結保存、数ヶ月など）

Short-term stability: 短期保存安定性の確認された期間と同様

（例：冷蔵保存、数日など）

Survey：検量線用標準試料 Preparation of calibration standards



http

://b

ioana

lysis

foru

m.jp

/

マトリックスと標準溶液（Working Solution）の添加する順番をお答えください。また、補足があればご記入ください。

64 11 11

70

7 9

70

6 10

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

1. M

atrix 2

. Stand

ard so

lutio

n

1. Stan

dard

solu

tion

2

. Matrix

No

t de

cide

d

Nu

mb

er o

f vo

ters

For QC samples (Stability in matrix) For QC samples (Intra- and Inter-assay) For Calibration standard


(Multiple answer) ★マトリックスに標準溶液を添加する方の意見：11件

被験物質の容器への吸着回避のため。（6件）

マトリックスへのコンタミ防止のため。（3件）

標準溶液の方が添加量が少ないため、マトリックスで共洗いしている。

溶液（緩衝液など）をマトリックスに添加したあとで標準溶液を添加することがある。

★標準溶液にマトリックスを添加する方の意見：1件

標準溶液を蒸発乾固する場合。

Survey：調製時の添加順序 Preparation order



http

://b

ioana

lysis

foru

m.jp

/

バリデーション及び実試料分析において、同一の試験内で、検量線やQC試料の調製を複数の担当者が実施した場合、調製者間の違いを確認しますか？また、違いを確認する場合、どのように確認しますか？

Total number of voters：53 Total number of voters：28

Prepare a set of calibration and QC by individual analyst: 検量線及びQC試料を同じ人が調製し、調製者ごとに基準を満たすか Analysts separate to prepare calibration and QC: 検量線試料とQC試料をそれぞれ異なる調製者が調製して基準を満たすかCompare responses of chromatograms obtained by different analysts: 調製者間のクロマトグラムのレスポンスを比較して確認

Survey：調製担当者 Study personnel



http

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ioana

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m.jp

/

標準溶液（Working solution）を調製する際によく使用する溶媒の種類について、各試料ごとにご回答下さい。（複数回答可）また、有機溶媒と水の混液を選択された方、その有機溶媒の濃度を教えて下さい。（複数回答可）

12 20 6

11 61 55 53 16 18

7 12

56 51 49

19 18 6

12

53 48 47

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

Matrix

Wate

r

Bu

ffer

DM

SO

Alco

ho

l

Aceto

nitrile

Organ

ic solve

nt

+ wate

r

Nu

mb

er o

f vo

ters



(Multiple answer)

36 25 14

33 23

12

32

21

12

0

25

50

75

100

125

150

Nu

mb

er o

f vo

ters



(Multiple answer)

Survey：標準溶液の調製溶媒 Kind of solvents



http

://b

ioana

lysis

foru

m.jp

/

15 19

28

14 14

9

0

10

20

30

40

Nu

mb

er o

f vo

ters

ブランクマトリックスに対して添加する標準溶液（Working Solution）の割合について、各試料ごとにもっともよく添加する割合を以下から選択してください。

7 8

19 16 16

18

0

10

20

30

40

Nu

mb

er o

f vo

ters

Calibration standards QC samples (Intra- and Inter-assay)

QC samples (Stability in matrix)

17

25

36

12 12

1 0

10

20

30

40

Nu

mb

er o

f vo

ters


(Multiple answer)


(Multiple answer)


(Multiple answer)

Survey：標準溶液の添加割合 Ratio of standard solutions



http

://b

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lysis

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m.jp

/

全ての添加濃度で、標準溶液（Working Solution）は一定の割合で添加していまか？また、標準溶液の溶媒の種類（水か有機溶媒）によってマトリックスに対して添加する割合を変えていますか？

77 11

66

21

52

35

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

Constant ratio (Yes)

Different ratio (No)

Nu

mb

er o

f vo

ters



(Multiple answer)

43 22 3 20

39

29 4 16

34

38

4 12

0

25

50

75

100

125

150

No

chan

ge

Ch

ange

in so

me

cases

Ch

ange

No

t de

cide

d

Nu

mb

er o

f vo

ters



(Multiple answer)

Survey：標準溶液の添加割合 Ratio of standard solutions



http

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/

日内及び日間再現性用，及び実試料分析用QC試料の調製方法（一括調製／個別調製，用事調製／凍結保存）について選択してください。また，凍結保存とお答えいただいた方で一括調製して保存する場合、保存容器への分注量はどのようにしていますか。（前処理には、50 μLを用いるとする）

For Intra- and Inter-Assay For Analysis of Study Samples

Total Response: 103 Total Response: 102

Survey： QC試料の調製時期・容量 Timing and Volume to prepare QC samples

一括調製／個別調製一括調製／個別調製



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/

For Intra- and Inter-Assay For Analysis of Study Samples




用事調製／凍結保存用事調製／凍結保存

分注量分注量



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/

マトリックス中安定性評価時のQC試料の調製方法（一括調製／個別調製）について選択してください。また，「一括調製」の経験がある方で、保存容器への分注量はどのようにしていますか。（前処理には、50 μLを用いるとする）





http

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/

Survey： QC試料の確認 Confirming the QC samples

QC試料の調製濃度が正しく調製されていることを確認してから試験に用いますか？また，確認する場合、いつ確認し，調製濃度の妥当性をどのように評価しますか？

調製濃度の確認確認時期確認方法 For Intra- and Inter-assay Total number of voters: 95

For Stability in Matrix Total number of voters: 94

For Analysis of Study Samples Total number of voters: 94

For Intra- and Inter-assay Total number of voters: 25



For Intra- and Inter-assay Total number of voters: 33





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/

Overview of Survey： Preparation of Calibration and QC Samples


Solvent of Working solution

①Alcohol＞②Acetonitrile＞③Organic solvent + Waterの順に回答が多かった。

「+ Water」を選択する理由は、有機溶媒の取り扱い難さを改善し、水の雑菌繁殖等を回避するため。

Organic solvent contentは溶解度、吸着等を考慮して設定され、≧50%という回答が最も多い。

標準溶液の溶媒組成のわずかな変化は無視しているという回答が約90%と最も多い。

調製順序Preparation order

調製試料によらず、1.Matrix⇒2.Working solutionの順で添加する回答が約80%と最も多い。

少数意見ではあるが、高濃度の検量線用標準試料をマトリックスで段階希釈（serial dilution using blank matrix）したり、検量線用標準試料を一括調製（Batch preparation）している。

煩雑な調製操作を効率化している。

調製担当者 Study Personnel

複数の調製者で試験を実施している場合でも調製者間の比較は行わないという回答が約1/3。すべての回答者は、信頼性基準あるいはGLPで試験を行っている。



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/

Recommendation： Preparation of Calibration and QC Samples


Solvent of Working solution

Organic solvent （Alcohol，Acetonitrile），Organic solvent + Waterなど様々な媒体が使用できる。

溶解度、吸着等を考慮して選択する。「+ Water」では、有機溶媒の取り扱い難さを改善し、水の雑菌繁殖等を回避できる。

標準溶液の溶媒組成のわずかな変化は無視できる。

調製順序Preparation order

1.Matrix⇒2.Working solutionの順で添加する。吸着回避，マトリックスへのコンタミ防止のため

調製担当者 Study Personnel

担当者変更の場合は測定の信頼性担保のために最低限の確認を実施することが望ましい。

例）選択性，検量線，真度・精度…



http

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/

Overview of Survey ： Preparation of Calibration Standards and QC Samples

Calibration sample

QC sample

Accuracy and precision

Stability Analysis of

Study Samples

方法用時調製

Preparation in use

一括調製 Batch preparation

用時調製 Preparation in use



添加割合

10%以上を許容（回答者の約60%）

一括調製：5%以下用時調製：10%以上を許容

5%以下（回答者の約75%） ⇒実試料に近づける必要あり

アンケート未実施

分注量

アンケート未実施測定時の採取量より多く分注

測定時の採取量より多く分注

測定時の採取量より多く分注

濃度確認

適用外 20%が実施と回答調製直後に真度で確認が

多い

60%が実施と回答調製直後に真度で確認

が多い

35%が実施と回答調製直後に真度で確認

が多い



http

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/

Recommendation： Preparation of Calibration Standards and QC Samples

Calibration sample

QC sample

Accuracy and precision

Stability Analysis of Study

Samples

方法用時調製

Preparation in use 一括調製Batch preparation

検量線試料のぶれに対して、どれだけ再現性良く、検体を測定できるかを検証するため

添加割合

制限しない。 2%以下（多くても5%）蛋白変性回避のため

希少Matrix等、用時調製せざるをえない場合は添加割合を制限しない。

希少Matrix等、一括調製できない場合は評価を実施しない。

希少Matrix等、用時調製せざるをえない場合は添加割合を制限しない。

分注量

適用外測定時の採取量より多く分注実試料の模擬的試料として評価するため、実試料と同量を採取して測定すること

濃度確認

適用外

実施を推奨

調製直後～使用前までベンチトップ安定性は調製直後に実施

調製直後～使用前まで



http

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/ 濃度設定 Concentration points

検量線試料

Calibration curve samples

QC試料

QC samples



http

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/

5

31

42

5

13

1 0

10

20

30

40

50

Nu

mb

er

of vo

ters

フルバリデーション時に3オーダー（1～1000 ng/mL）の検量線を作成する場合についてうかがいます。検量線を何ポイント設定するか、もっとも多く用いる設定を以下からひとつ選択して下さい（ブランクとゼロは除いたポイント数

を選択して下さい）。

Survey：検量線のポイント数 Survey results: Points of calibration curve

Total number of

voters ：97

★ルールによるという意見：8件

SOPやガイドラインで最低6ポイント以上となっているため（2件）。

1オーダーに3ポイントを設定するルールになっているため。

基本設定が「1，2，5，20，50，200，500，1000」の倍率で設定するため (2件）．

濃度レンジが200倍以内なら8ポイント．

各オーダー（1の位、10の位、100の位）に3濃度

1-3-10-30･･･，1-2-10-20･･･等のパターンで設定するため，自ずと数が決まってくる。

★ガイドラインで2ポイント除外可能なことを念頭に置いた意見：13件

「BMVガイドライン」に準じて、8ポイント（75%=2ポイント除外→6ポイント）を検量線の基準とする（13件）。

★「公比」の考え方によるという意見：6件

公比「2」で設定（2件）．公比「3」で設定（3件）．公比2～3で設定。

★実験者の裁量によるという意見：3件

上記数字は最低の濃度ポイント数であり，それ以上に設定するのは各分析科学者の裁量

実験者に任されているので、実験者に依存します。

慣例。

★その他の意見：2件

標準溶液の調製本数を少なくしたいことと，全ポイントで真度の基準を満たさなくてはならない心理的な重圧を回避するために，7ポイントとしています。

異常値等の対応のため1点外せる環境下で実施しています。2点外すと少し信頼性に欠けると考え7点で実施しています。



http

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/

1～1000 ng/mLの検量線を作成する場合、具体的にどの濃度を設定しますか？

Survey：検量線の設定濃度 Points and concentrations of calibration curve

1 10 100 1000

11 Points (n=1)

10 Points (n=13)

9 Points (n=5)

8 Points (n=42)

7 Points (n=31)

6 Points (n=5)


1 2 5 10 20 50 100 200 500 1000

2.5 3 25

30 250

300

Scale of the order of the “two” common ratio

≒800

To Exclude ULOQ ?

↓



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/

推奨：検量線濃度ポイント Recommendation: Points of calibration curve

①対数で均等な濃度選択（公比設定）を行うケースがほとんどであった。

公比「約2」（1-2-5-10-20-パターン）

公比「約3」（1-3-10-30-パターン）

② 3オーダーの検量線で「8ポイント」（43.3%）、「7ポイント」（32.0%）で全体の75%以上を占めた。「BMVガイドライン」の規定によると考えられる。

★8ポイントの75%はGLが求める、最低数の6ポイントである。2ポイントが除外可能で「お値打ち感」がある。

出典：http://www2u.biglobe.ne.jp/~SATORU/A1data.pdf など

推奨：「公比」で設定することを推奨。 3オーダーの場合、公比2で10ポイント、公比3で7ポイント Recommendation: Follow the common ratio rules

http://www2u.biglobe.ne.jp/~SATORU/A1data.pdf





http

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/

推奨：検量線濃度ポイント Recommendation: Concentrations of calibration curve

★約25%の回答者が「対数で均等ルール」から外れるポイント(750～900)

を設定していた。（750: 2例、800: 18例、900 :5例＝合計25例、全回答：97例）。

「BMVガイドライン」の規定によると考えられる。

高濃度QCを「750」に設定：ULOQ(=1000)が除外可能。

低濃度QCを「3」に設定：公比約2のポイント「2 or 2.5」が存在するため、 LLOQ(=1)が除外可能。

★低濃度側にポイントを多く設定する意見も散見された。

対数均等でないため、重み付けに問題が出る可能性に留意。重み付けは本来、1/y、1/y2で付与するべきであるが、1/x、1/x2が多用されている。

「1/x」の重み付け：濃度xに「yの標準偏差が比例する」と仮定した場合に使用する。

「1/x2」の重み付け：濃度xに「yの分散が比例する」と仮定した場合に使用する。

出典：http://www2u.biglobe.ne.jp/~SATORU/A1data.pdf など

推奨：「公比」で設定した以外の濃度ポイントにより、検量線の重み付けが変わる。

このため、高濃度・低濃度に「公比」以外のポイントを設定することは推奨されない。 Recommendation: Be sure to follow the common ratio rules in all range






http

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/

Survey：QC試料の濃度設定 Concentrations of QC samples

定量下限濃度の設定について以下から選択してください For Intra- and Inter-Assay For Stability in Matrix For Sample Analysis

低濃度の設定について以下から選択してください For Intra- and Inter-Assay For Stability in Matrix For Sample Analysis

95

4 1 0

20406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs

11

89

0 0

20406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs

14

85

1 0

20406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs

3748

4 11

020406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs

3450

4 12

020406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs

3549

5 11

020406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs



http

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/


中濃度の設定について以下から選択してください For Intra- and Inter-Assay For Stability in Matrix For Sample Analysis

高濃度の設定について以下から選択してください For Intra- and Inter-Assay For Stability in Matrix For Sample Analysis

1741 33

3 60

20406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs

9 18 14

56

30

20406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs

1742 32

4 50

20406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs

73

186 3

020406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs 78

154 3

020406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs 77

14 6 30

20406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs



http

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/


定量上限濃度の設定について以下から選択してください For Intra- and Inter-Assay For Stability in Matrix For Sample Analysis

33

66

10

20406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs

12

88

00

20406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs

12

87

10

20406080

100

Perc

enta

ge fo V

ote

rs



http

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/

Discussion：ULOQについて

（ULOQを含めない）・ULOQでは、評価時に検量線外の値になる場合があ

るので、ULOQを設定しないとする場合もある。（検量線のULOQのRatio以下の値を採用するとの考え方もあるため）

・直線性に乗っていれば、ULOQは無くても、検量線全範囲を確認できているとしても良い。測定系の再現性と考えた場合、上下限濃度にこだわる必要は無い。

定量上限（ULQO）の設定の要否について回答が割れている点に注目しDGで議論した。

（DG-01での議論及びアンケート結果の議論から）



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/

Discussion：ULOQについて

（ULOQを含める）・定量限界点での定量精度・再現性を評価しないと

検量線範囲をすべて定量できることを検証できないとして5濃度または，4濃度で高濃度をULOQとして評価。

・ULOQでは、QC試料の役割は，検量線試料のぶれを考えた上で、どれだけ再現性良く検体を測定できているかを確認するもの。定量上限（HQCではない）、定量下限を確認することは必須と考える。

（DG-01でのRecommendation議論から）



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/

Discussion

Analyte concentration

LLOQ Low-levels Middle-levels High-levels ULOQ

Method 1

4 concentration, n=5

LLOQ Between 2 and 3

times of the LLOQ Geometric mean

Between 75% and 85% of the ULOQ

-

Method 2 5 concentration,

n=5

LLOQ Between 2 and 3

times of the LLOQ Geometric mean

Between 75% and 85% of the ULOQ

ULOQ

Method 3 4 concentration,

n=5

LLOQ

Between 2 and 3 times of the LLOQ

Geometric mean - ULOQ

真度及び精度確認用のQC試料の設定濃度は以下の3つの方法を提案する．



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/

Discussion 解説真度及び精度確認用QC試料の設定濃度：

BMVガイドライン通り4濃度（定量下限、低、中、高濃度）を設定とする．高濃度については、ULOQを含めるか否か本DG内で意見が割れているが、分析を適用する濃度範囲全域の妥当性を保証するためには、検量線の両端濃度（検量線上限濃度と下限濃度）を評価すべきとの意見が半数を占めている。中濃度は、検量線範囲の幾何平均を推奨する。



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/

Recommendation

実試料分析用QC試料の推奨は以下のとおり


QC for stability

2 concentration, n=3

- Between 2 and 3 fold of the LLOQ

- Between 75% and 85% of the ULOQ

-

安定性用QC試料の推奨は以下のとおり


QC for sample

analysis 3 concentration, n=2

- Between 2 and 3 fold of the LLOQ

Geometric mean Between 75% and 85% of the ULOQ

-



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/ 試料調製 Sample preparation

回収率

Recovery

ﾏﾄﾘｯｸｽ

効果

Matrix effects



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/

Survey：回収率 Recovery

回収率評価に用いる試料の組み合わせを選択してください（複数回答）

Total number of voters: 97

I : マトリックスに標準物質を添加して前処理した試料（通常のQC試料）

II : マトリックス以外（生理食塩水やバッファーなど）に標準物質を添加した試料（マトリックスを含まないQC試料）

III : 前処理後のブランク試料に標準物質を添加した試料



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/

Survey：マトリックス効果 Matrix effects

マトリックス効果の評価に用いる試料の組み合わせを選択してください。（複数回答）

Total number of voters: 96




IV : 前処理後のマトリックス以外（生理食塩水やバッファーなど）の試料

に標準物質を添加した試料



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/

Discussion：回収率・マトリックス効果 Recovery and matrix effects

分析（前処理後）サンプル中の影響因子サンプル

I II III IV

A : マトリックス成分ありなしありなし

B : 前処理での化合物の回収率ありなしなしなし

C : 前処理操作・前処理資材からの溶出物ありなしありあり




IV : 前処理後のマトリックス以外（生理食塩水やバッファーなど）の試料に標準物質を添加した試料

各サンプル中の影響因子は何か？



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/

Discussion：回収率・マトリックス効果 Recovery and matrix effects

A : マトリックス成分の影響

B : 目的化合物の前処理における回収率の影響

C : 前処理の資材からの溶出物や前処理操作の影響比較サンプル比較因子確認可能な項目

IとII Iのみ

A・B・C ⇒ 回収率マトリックス効果

・回収率またはマトリックス効果が100％付近の場合のみそれぞれの項目の評価が可能・光学検出器での分析では回収率の評価可能・実試料分析ではマトリクス効果+回収率の両方が同時に影響するのでそれぞれを厳密に評価せずとも複数個体のブランクマトリックスのQC試料のRE・CV評価で再現性は評価可能．

IとIII B ⇒ 回収率・マトリックス効果の影響を除外した回収率を評価可能・添加する標準溶液の濃度が異なる場合は調製誤差が影響する

IIとIII A・C ⇒ マトリックス効果マトリックスファクター

・回収率を除外してマトリックス効果の評価が可能・機材の影響を含めて検証可能・添加する標準溶液の濃度が異なる場合は調製誤差が影響する

IIIとIV A ⇒ マトリックス効果マトリックスファクター

・回収率を除外してマトリックス効果の評価が可能。・厳密にマトリックス効果のみを検証できるが，実検体では必ずCの影響があるので，他の項目でCの評価が必要になる？

IとIV A・B ⇒ 回収率マトリックス効果

・回収率またはマトリックス効果が100％付近であれば、それぞれの項目の評価が可能・光学検出器での分析は回収率の評価可能・添加する標準溶液が異なる場合は濃度の調製誤差が影響する

比較するサンプルの組み合わせから確認できるものは？



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/

回収率の評価方法





Discussion (Recovery)

推奨方法の候補長所短所

方法1 IとIIIの比較マトリクス効果の影響を除外するため、純粋な回収率を評価できる。ガイドラインに準拠

前処理の条件によってはIIIの試料の調製が困難。 III用の濃度にあわせた標準溶液が必要な場合は標準溶液の誤差が含まれる。

方法2 IとIIの比較

実試料の分析の変動率を評価できている。実試料のレスポンスはマトリックス効果+回収率が含まれている。

マトリックス効果が含まれるため純粋な回収率の評価はできない。



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/

Recommendation(Recovery) 方法１を推奨する

回収率の評価は，マトリックスに標準物質を添加して前処理した試料（ I ）と前処理後のブランク試料に標準物質を添加した試料（ III )を比較する。

Recommendation Extracts of matrix samples containing reference standard (standard QC samples) are compared with samples using blank sample extract spiked with reference standard.

In order to the investigation of recovery only, matrix effects are ignored.

純粋な回収率を検証するためにマトリックスの影響を除外する



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/

Discussion(Matrix Effect)





推奨方法の候補長所短所

方法1 IIとIIIを比較回収率の影響を除外できる。前処理

の影響も含めて評価出来得る

前処理の条件によってはIIIの試料の調製が困難な場合がある． IIとIIIで別の標準溶液を使用する場合は標準溶液の誤差が含まれる．手間

方法2 IIIとIVを比較

回収率の影響を除外して、試料前処理に用いる器具への吸着や妨害等の溶出を含めたイオン化の再現性を評価出来る。前処理器材のロット差、個体差が見られる。

前処理の条件によってはIIIの試料の調製が困難な場合がある．手間

マトリックス効果の評価方法



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/

Recommendation(Matrix Effect) 方法１を推奨する

マトリックス効果は，前処理後のブランク試料に標準物質を添加した試料（II）とマトリックス以外の溶媒に標準物質を添加した試料（III）を比較する

【解説】方法1が、実試料分析におけるマトリックスの影響を評価できると考えるため推奨する。アンケート結果では方法2も実施されているケースが多い。方法2は、前処理器材由来の物質の影響がキャンセルされるためマトリックス由来の影響のみを評価できるが、マトリックスのみの影響だけの評価では不十分。 MFの算出がエンドポイントならこれでも良いが、ガイドラインでは、MFを求めるのがエンドポイントではない。結局、精度を見るのなら、他の項目でも確認するので、作業におけるお得感もない？



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希釈操作の

許容基準 Acceptable dilution

process



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/

バリデーションにおいて希釈妥当性を、10 µL + 90 µLで2段階、 100倍希

釈のみ確認した場合、実測定で許容する希釈操作について

Total Responses： 96

Only 100-fold dilution

10-fold and 100-fold dilutions

Any dilution within 100-fold (e.g. 50-fold),

36.5%

Not decided

1.0% Others 7.3%

Survey：希釈操作の許容基準 Acceptable dilution process

Single and two steps dilution ,

dilution , 25.0% Any steps dilution , 29.2%

Others, 2.1%

Same volume (Only 10 µL+90 µL

→ 10 µL+90 µL),

Any volume

any ratio,

Others, 5.2%

and 29.2%

38.5%

Same ratio

(e.g. 20 µL+180 µL →30 µL+270 µL etc.)

希釈倍率

段階数

採取量 Only two steps

43.8%

22.9% 33.3%

26.0%



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回答結果からみる実測定で許容する希釈操作

100-fold dilution, 2 steps, same volume

10- and 100-fold dilution, 2 steps, same volume

100-fold dilution, 2 steps, same ratio

10- and 100-fold dilution, 2 steps, same ratio

Any dilution within 100- fold, 1 and 2 steps, any volume and ratio

Any dilution within 100- fold, any steps, volume and ratio

Others

(Same procedure as the validation )

(Same procedure as the validation )

0 10 20 30

23 (24.0%)

14 (14.6%)

5 (5.2%)

19 (19.8%)

9 (9.4%)

16 (16.7%)

10 (10.3%)

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

Total Responses：96

Summary：希釈操作の許容基準 Acceptable dilution process



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Discussion：希釈操作の許容基準

・希釈割合が小さくなるほど混合するマトリックスの割合が減るので、希釈による影響は出にくいと考える。

・バリデーションで検証した容量比以外でも、希釈倍率より小さいものについては、許容する。

・段階数は、バリデーション時より増やさない限り悪影響は考えづらい。・最終結果がOKならば途中もOKという考え方も許容できる。

・バリデーションで検証した採取量の最少容量を下回らなければ、精度への影響は少ないと考えられるため、採取量にはこだわらなくても良い。

希釈倍率

段階数

採取量

バリデーションで実施した操作以外許容しないとする意見とそれ以外でも許容する意見の2つに分かれている背景を推察して議論した。

（DGｰ01での議論）



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Recommendation

（希釈倍率）100倍希釈以内

（段階数）1段階及び2段階の両方

（調製容量）バリデーションでの最少の採取容量以上であればよい

例）バリデーションにおいて希釈妥当性の試料を10 µL + 90 µLの2段階で100倍希釈のみ確認した場合の希釈操作の許容範囲

バリデーションで確認した内容以外でも、最少のサンプル採取容量以上で、バリデーションで確認した希釈倍率以下であれば許容することを推奨する。但し，ディスペンサーの精度は許容以内であることが前提！



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Recommendation

（ Dilution Factor ） Up to 100-fold dilution is acceptable

（ Steps ） Both of first and second steps are acceptable

（ Volume ) A target volume should exceed a minimum volume in validation

Acceptance criteria for dilution procedures： In the case of a 100-fold dilution integrity test (two serial dilutions: 10 µL + 90 µL), our ideas for acceptable dilution procedures are:

Our concept: Sample volumes exceed the minimum volume validated and a dilution factor does not exceed one which was validated. Dispensers have to be appropriately calibrated.



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/

2成分以上の同時定量

Simultaneous determination

標準溶液

調製

Preparation of working

solution

分析対象を減らす

Reduction of analyte



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/

2成分以上の分析対象物質を同時定量する場合、検量線用標準試料（Calibration standards）の調製は、以下のどの方法で実施しますか？その理由は？


★全ての分析対象物質を含有する、混合検量線用標準溶液

（Working solution mixture）を調製：12件同じ検量線範囲であれば，混合検量線用標準溶液を調製することにより対応．（3件）

分析対象ごとにWorking solutionがあると、試料調製時の手間が増えるため、混合Working solutionを使用している。（3件）

調製がより簡便で操作ミスが生じにくいため。（2件）

分析対象が相互に影響がないことを確認する。（2件）

標準溶液の添加量を減らすため。

標準原液は成分ごとに調製するが、最初に標準溶液を調製する時に混合して調製する。用時調製なので科学的に問題ないと考える。

★1つの分析対象物質のみを含有する検量線用標準溶液

（Working solution）溶液をそれぞれ調製：7件

検量線範囲が異なるなどの理由で混合不可の場合は別々に標準溶液を調製する。（3件）

保存期間中における成分間の相互作用，相互変換のリスクを除去するため。（2件）

最適な希釈溶媒が異なる場合があるため。（2件）

Survey : Simultaneous determination



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/

2成分以上の同時定量でフルバリデーションを実施したが、実試料分析時に分析対象物質を減らしたい場合、検量線用標準試料（Calibration standards）はどのように調製しますか？その理由は？

Survey : Simultaneous determination


★フルバリデーションと同じ方法（全ての分析対象物質を含有）で

調製する。：6件

基本的にフルバリデーション取得時と同等の条件で調製する。（3件）

分析対象が含まれている状態でのバリデーションが前提なので，測定も含めてフルバリデーションと同じ方法で実施し，解析対象から除外する．

混合検量線用標準溶液ですべての分析対象物を含有するように調製し、データも多成分取り込みをしてバリデーションを実施しているため。

定量性能が変わる危険性があると感じています。溶液のｐHが変わる場合がありますので，特に，「標準溶液中の安定性」や「調製段階の容器への吸着」に不安を感じます。

★目的とする分析対象物質のみで調製する。：8件

分析対象外の物質の有無が測定に影響しないと考えられる場合は，不要な操作は割愛します．（4件）

目的とする物質のみでパーシャルバリデーションを実施した上で成分を減らす。（2件）

標品が希少な場合にはやむなく対象物質を減らすことになると考える。

（2件）



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Overview of Survey： Simultaneous determination

①検量線用標準試料（Calibration standards）の調製方法 73.5％の回答者が全ての分析対象物質を含有する混合検量線用標準

溶液（Working solution mixture）を用いている。選択理由：調製の簡便化。操作ミスの回避。選択条件：分析対象物質が相互に影響しないこと。同じ定量範囲であること。

②実試料分析時に分析対象を「減らす」場合の検量線用標準試料（Calibration standards）の調製方法 74.5％の回答者がフルバリデーションと同じ方法（全ての分析対象

物質を含有）で調製している。選択理由：フルバリデーション取得時と同等の条件とし、定量性能（安定性、吸着等）が変わることを避ける。

14.3％の回答者が目的とする分析対象物質のみで調製している。選択条件：測定に影響しないと考えられる場合。希少な標準物質である場合。

非分析対象物質の添加を中止するために必要なパーシャルバリデーション項目とは？



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/

Discussion： Simultaneous determination

①検量線用標準試料（Calibration standards）の調製方法混合検量線用標準溶液（Working solution mixture），個別検量線用

標準溶液（Individual working solutions）のいずれを用いても良い。

②実試料分析時に分析対象を「減らす」場合の検量線用

標準試料（Calibration standards）の調製方法フルバリデーションと同じ方法（全ての分析対象物質を含有）で調

製・測定し，データ解析から除外する対応が望ましい。

Solution Pros Cons

Mixture

溶液調製，添加操作の簡便化⇒操作ミスの回避分析対象物質が相互に影響しないことの確認必要．定量範囲が異なる場合調製が難しい．最適な媒体が異なる場合は混合調製できない．

Individual

分析対象物質が相互に影響するリスクが無い．定量範囲が異なっても対応できる．分析対象物質毎に最適な媒体を選択できる．分析対象を減らす際，安定性が確認された標準溶液がそのまま使える．

溶液調製，添加操作が煩雑になる⇒操作ミスの誘発



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代替

マトリックス

Surrogate matrices

バリデーション

Validation study

実測試験

Sample analysis



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Recommendation for use of surrogate matrices

・ 5th JBF Symposium に先立って実施したアンケート結果をふまえ，バリデーションと実測試験における代替マトリックスの使用方法に着目してグループ討議を行った．・分析対象となる生体マトリックスの入手が困難な場合に最低限どのようなバリデーション項目を評価すべきか，代替マトリックスをどのような項目で使用すべきかを中心にグループ討議を行った．・本ポスターでは，使用量が限定される希少な生体マトリックスを対象と

したバリデーションにおいて代替マトリックスを使用する際に,グループとして推奨するバリデーション項目および代替マトリックス使用方法を示す．

A surrogate matrix can be used in cases where the same matrix as the study samples is difficult to obtain. We had a survey about the cases before the 5th JBF Symposium. Our poster shows which parameters should be assessed and how a surrogate can be used for validation of assay performance of a matrix of limited availability.



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/

分析法バリデーションを実施する際、代替マトリックスと本来のマトリックスをどのように使い分けていますか？

Survey : Validation using surrogate matrix

0

10

20

30

40

50

60

70

Biological surrogate matrix

Intended biological matrix

Validation Items

0

10

20

30

40

50

60

70

Num

ber

of

resp

onse

s 0

10

20

30

40

50

60

70

0

10

20

30

40

50

60

70

Num

ber

of

resp

onse

s

Validation Items

Artificial surrogate matrix

Intended biological matrix



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/

バリデーションにおいて代替マトリックスを使用する分析法の妥当性が確認された場合、その後の実試料分析において、代替マトリックスと本来のマトリックスをどのように使い分けていますか？

Survey : Study sample batch using surrogate matrix


Calibration Standards

Surrogate matrix, 94.6%

Intended biological matrix, 3.6%

QC Samples (for accuracy monitoring)

Surrogate matrix, 76.8%


Intended biological matrix, 23.2%



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バリデーション：検量線は代替マトリックス，再現性QCは本来のマトリックスを使用し，両者間の測定値の整合性を確保すべきである．選択性，回収率は本来のマトリックスを使用することが望ましい．希釈の妥当性の希釈操作に代替マトリックスを使用すれば，実測試験での希釈に代替マトリックスを適用できると考えられる．保存安定性は本来のマトリックスを使用することが望ましいが，困難な場合は代替マトリックスで実施するか，投与サンプルで安定性を評価する等の対応を検討するべきである．

Our concept of using surrogate matrix

実測試験：バリデーションで両者間の測定値の整合性が確保されていれば，検量線，精度管理QC，試料の希釈に用いるマトリックスとして代替マトリックスを使用してよいと考えられる．並行保存QCをいずれのマトリックスで調製すべきか，バリデーションにおける保存安定性の評価方法，および，本来のマトリックスの使用可能量に応じて検討するべきである．



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Recommendation Possible cases in validation using surrogate matrix

Availability ofanimals

Matrix volumeper animal

【Intended】Plasma of disease modelmouse

【Surrogate】 Plasma of healthy mouse

【Intended】Spinal cord homogenate ofhealthy mouse

【Surrogate】 Phosphate buffered saline

【Intended】Liver homogenate ofdisease model mouse

【Surrogate】Liver homogenate ofhealthy mouse

【Intended】Spinal cord homogenate ofdisease model mouse

【Surrogate】 Phosphate buffered saline

Example

Case A

Case B

Case C

Relativelyhigh

Relativelyhigh

Low

Relativelylarge

LowCase D

Small

Relativelylarge

Small

Availability of intended matrix



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Recommendation Case A: Both the number of animals and the volume of matrix are sufficient.

Validation item Contents

Selectivity・6 samples from 6 individuals (n=1, 1 analytical run)

Calibration standards・6 levels or more (n=1, 3 analytical runs)

Reproducibility, matrix effects,and both limits of calibrationcurve in intended matrix

・2 levels (LLOQ and ULOQ)・6 samples from 6 individuals (n=1, 1 analytical run)・Prepared in bulk

Reproducibility insurrogate matrix

・4 levels (LLOQ, LQC, MQC, and HQC) (n=5, 3 analytical runs)・Prepared in bulk

・2 levels (LQC and HQC) (n=3 at each test point)・Prepared in bulk

Biological surrogate・2 levels (LQC and HQC) (n=3 at each test point)・Prepared in bulk

Artificial surrogate・No stability test (to be evaluated with actual study samples later)

Stability

Matrix for use

Intended (6 lots)

Surrogate

Intended (6 lots)

Surrogate

Intended

If intendedmatrix is not

available



http

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/

Recommendation Case B: The number of animals is sufficient, but the volume of matrix is not sufficient.





・2 levels (LLOQ and ULOQ)・6 samples from 6 individuals (n=1, 1 analytical run)・Prepared separately



・Not evaluated with intended matrix because of small volume



Matrix for use

Intended (6 lots)

Surrogate

Intended (6 lots)

Surrogate

Stability

Intended


available



http

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Recommendation Case C: The number of animals is not sufficient, but the volume of matrix is sufficient.








・2 levels (LQC and HQC) (n=3 at each test point)・Prepared in bulk



Matrix for use

Intended (3 lots)

Surrogate

Intended (3 lots)

Surrogate

Stability

Intended


available



http

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Recommendation Case D: Neither the number of animals or the volume of matrix is sufficient.








・Not evaluated with intended matrix because of small volume



Matrix for use

Intended (3 lots)

Surrogate

Intended (3 lots)

Surrogate

Stability

Intended


available



http

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Recommendation -comments-

検量線範囲の両端の評価：分析を適用する濃度範囲全域の正当性を保証するためには，検量線の両端濃度を評価すべきと結論付けた．濃度範囲全域についての保証を目的とするため，両端濃度としては，定量下限及び検量線の上限（HQCではない）を評価する．検量線の両端濃度は，必ず一度は本来のマトリックスを使用して評価すべきであると考える．

保存安定性の評価：保存安定性は可能な限り本来のマトリックスで評価すべきと考える．本来のマトリックスが僅少の場合は代替マトリックスを使用した評価を検討すべきである．ただし代替マトリックスが人工のものである場合（緩衝液など），保存安定性を評価する意義が薄いと考え，保存安定性を評価しない．代替マトリックスが生体マトリックスである場合（本来とは別系統の動物のマトリックスなど），代替マトリックスを使用して保存安定性を評価すべきと考える．



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Recommendation -comments- Evaluating both limits of calibration curve Concentrations at both the limits of the calibration curve should be

assessed to verify the entire range. The LLOQ and ULOQ (not HQC) levels should be investigated to

verify the validity of the entire range. Both the limits should be checked with the intended matrix at least

once. Evaluating stability The intended matrix should be used as much as possible. If the intended matrix is difficult to obtain, the surrogate can be

one option. If an artificial surrogate is used (e.g. buffer), stability is not

investigated because an artificial surrogate is not useful. If a biological surrogate is used (e.g. animals of different strains),

the biological one should be used.

dg2013-01 recommedation to prepare calibration...

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