DIAGNOSTIC DE LA LMMC: PHÉNOTYPAGE

JOURNÉE GFHC-AFC_3 FÉVRIER 2016

Orianne Wagner-BallonHématologie Cellulaire

Hôpitaux universitaires Henri Mondor

LES SOUS-POPULATIONS MONOCYTAIRES

CIRCULANTES CHEZ LES SUJETS SAINS

LES 3 SOUS-POPULATIONS MONOCYTAIRES

ZIEGLER-HEITBROCK et al, Blood 2010WONG et al, Blood 2011

NOMENCLATURE COMMITEE OF THE INTERNATIONAL UNION OF IMMUNOLOGICAL SOCIETIES

MO3MONOCYTES

NON CLASSIQUES

CD14faibleCD16++

MO2

MO1MONOCYTES

CLASSIQUES

CD14++CD16-

10 ±4%

85 ±6%

5 ±2%

MONOCYTES

INTERMÉDIAIRES

CD14++CD16+

CARACTÉRISATION PAR CMF À PARTIR DE PBMC

CD14

CD

16

MO2: 5.2%

MO3:5.4%

MO1:89.4%

Monocyte sans DN

CD45

SS

C-A

SS

C-A

CD24

Singulets

SS

C-A

CD16

CD14

CD

16

Monocyte

CD56

SS

C-A

DN

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

VALIDATION DE LA STRATÉGIE D’ANALYSE

MORPHOLOGIE MONOCYTAIRE DES POPULATIONS MO1, MO2 & MO3

MO1

MO2

MO3

CD14

CD

16

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

MO

1

MO

2

MO

3

CD16

VALIDATION DE LA STRATÉGIE D’ANALYSE

EXPRESSION DE GÈNES MONOCYTAIRES PAR LES POPULATIONS MO1, MO2 & MO3

MO

1

MO

2

MO

3

MO

1

MO

2

MO

3

CD14 CX3CR1 CD115

MO

1

MO

2

MO

3

MO

1

MO

2

MO

3

MO

1

MO

2

MO

3

CD64 CCR2 CD62L

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

MO

1

MO

2

MO

3

VALIDATION DE LA STRATÉGIE D’ANALYSE

HIÉRARCHISATION DES POPULATIONS PAR SPADE

T cells

B cells

Residual Gran

NK

CD14

CD16

CX3CR1

CCR2MO1 MO2

MO3SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

LES SOUS-POPULATIONS MONOCYTAIRES

CIRCULANTES DANS LA LMMC

SIGNATURE PHÉNOTYPIQUE DE LA LMMC

ACCUMULATION DE MO1 DANS LA LMMC

Au

tres

hém

op

ath

ies

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

COHORTE D’APPRENTISSAGE (PBMC)

MO

1(%

mo

no

cyte

s to

taux

)

Co

Age

d-C

o

Non

-CM

ML

Rea

ctiv

e

CM

ML

60

70

80

90

100

Co

ntr

ôle

s

Co

ntr

ôle

s âg

és

No

n L

MM

C

Mo

no

cyto

ses

réac

tio

nn

elle

s

LM

MC

� 26 Témoins < 65 ans: 86,1%

� 39 Témoins > 65 ans: 84,0%

� 24 Hémopathies non LMMC: 84,4%

� 33 Monocytoses réactionnelles: 79,1%

� 53 LMMC: 96,6%

***175 PATIENTS

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

CO

HO

RT

ED

’AP

PR

EN

TIS

SA

GE

(PB

MC)

MO1 (% monocytes totaux)

C o

A g e d -C o

N o n -C M M L

R e a c tiv e

C M M L

60 70 80 90

100

Contrôles

Contrôles âgés

Non LMMC

Monocytosesréactionnelles

LMMC9

4%

Sp

écificité: 95,1%

Sen

sibilité: 9

0,6%

SE

LIM

OG

LU

-BU

ET

et al, B

loo

d 2

015

VALIDATION EN ROUTINE ?

200 µl de sang total

CD64 FITCCD24 PECD56 PC5.5CD14 PC7CD2 APCCD16 PBCD45 KOr

Acquisition ≥ 50 000 évènements dans gate MO1

% MO1 au sein des monocytes totaux

Harmonisation: cibles sur Versacomp

TRANSPOSITION DU PROTOCOLE SUR SANG TOTAL

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

STRATÉGIE D’EXCLUSION SUR SANG TOTAL

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

BOOLÉENNE « MONO2 » =CELLULES AND SINGULETS AND MONO

AND (NOT CD56+) AND (NOT CD2+) AND (NOT CD24+) AND (NOT "PN CD16+")

STRATÉGIE D’EXCLUSION SUR SANG TOTAL

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

BOOLÉENNE « MONO Bis » =MONO2 AND (NOT DN)

COHORTE DE VALIDATION (SANG TOTAL)C

on

trô

les

âgés

No

n L

MM

C

Mo

no

cyto

ses

réac

tio

nn

elle

s

LM

MC

� 68 Témoins > 65 ans: 85,1%

� 79 Hémopathies non LMMC: 81,9%

� 74 Monocytoses réactionnelles: 85,8%

� 86 LMMC: 96,4%

307 PATIENTS

MO

1(%

mo

no

cyte

s to

taux

)

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

COHORTE DE VALIDATION (SANG TOTAL)

94%

Co

ntr

ôle

s âg

és

No

n L

MM

C

Mo

no

cyto

ses

réac

tio

nn

elle

s

LM

MC

Spécificité: 94,1%Sensibilité: 91,9%

MO

1(%

mo

no

cyte

s to

taux

)

Résultat similaire sur la moelle

� Difficulté du fenêtrage +++

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

ACCUMULATION DE MO1 DYSPLASIQUES DANS LMMC

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

SIGNATURE PHÉNOTYPIQUE SANGUINE DE LA LMMC

� Indépendante de la monocytose

� Indépendante des mutations/anomalies

cytogénétiques

� Indépendante de la forme de LMMC (proliférative vs

dysplasique)

� Indépendante du type de LMMC (Type 1 vs 2)

60 70 80 90 1000

10

20

30

CMMLReactive

Mo

no

cyto

se (G

/L)

MO1 (% monocytes totaux)

SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

LES CAS TYPIQUES

LES CAS TYPIQUES DE LMMC AVEC MO1≥ 94%

LES CAS DE LMMC AVEC <94% DE MO1

���� Sensibilité de 91,9%

LES DIFFICULTÉS TECHNIQUES

DU PHÉNOTYPAGE LMMC

LES DIFFICULTÉS TECHNIQUES PRÉ-ANALYTIQUES

�Acquisition d’un nombre suffisant d’évènements (50 000 MO1 minimum)

�Technique à partir de 200 µl de sang total

�Attention aux grandes hyperleucocytoses avec myélémie (dilution: 10 G/L de

leucocytes) �CD16 +++

� Panels d’anticorps d’exclusion: non imposé (exclusion des NK et de la myélémie +++)

� Deux anticorps diagnostiques: CD14 et CD16

LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE D’EXCLUSION

�Attention à la stratégie d’exclusion ���� large fenêtre « monocytes »

sur CD45/SSC

LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE D’EXCLUSION

�Attention à ne pas exclure les monocytes CD16+ ni les monocytes CD56+

���� Privilégier les histogrammes FL/SSC

LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE D’EXCLUSION

� Exclure la myélémie

���� Intérêt du CD24

LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE DES MO1

� Difficulté de positionnement des fenêtres

- distinction MO2/MO3: pas prise en compte dans calcul %

- distinction MO1/MO2 +++: travailler en density plot

VERS UN NOUVEAU CRITÈRE DIAGNOSTIQUE…

� Limites de la définition OMS :

- diagnostic a posteriori

- un seul critère positif: monocytose > 1 G/L persistante depuis au moins 3 mois

- dysplasie non obligatoire

- présentation hétérogène

� Nouveau critère diagnostique indépendant de la monocytose : % MO1 ≥ 94%

PERTINENCE DU SEUIL DE LA MONOCYTOSE À 1 G/L?

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Mo

no

cyto

se (G

/L)

0,49 G/L

193 témoins (145 témoins <65 ans

+ 48 patients > 65 ans)

LES LMMC AVEC HEMATOFLOW® (BECKMAN-COULTER)

Remisol

Préparateurd’échantillons

FC500

CytoDiff®

AnalyseurDxH

CD36 FITC/CD2-CRTH2 PE/CD19 ECD/ CD16 PC5/ CD45 PC7

CytoDiff®

LES LMMC AVEC HEMATOFLOW® (BECKMAN-COULTER)

TÉMOIN SAIN

LES LMMC AVEC HEMATOFLOW® (BECKMAN-COULTER)

LMMC

AUTRES CRITÈRES DIAGNOSTIQUES

À PRENDRE EN COMPTE

LES ANALYSES CYTOGÉNÉTIQUES ET MOLÉCULAIRES

�Caryotype médullaire : anomalies cytogénétiques dans 20 à 30% des cas

� Biologie moléculaire:

SALLMAN & PADRON, 2015

CONCLUSIONS

CYTOLOGIE: TAKE HOME MESSAGES

�Aspects cytologiques hétérogènes

� Rechercher des signes de dysplasie même minimes, y compris sur la lignée

monocytaire

� Prudence en cas de tableau infectieux associé, porte d’entrée fréquente de la maladie

�Quantification du compartiment blastes + promonocytes souvent délicate

� Le score mono-dysplasie sur automate XN permet d’éliminer les monocytoses

réactionnelles ne nécessitant pas de revue de lame

IMMUNOPHÉNOTYPAGE: TAKE HOME MESSAGES

� Accumulation ≥ 94% de MO1 dans le sang périphérique : signature phénotypique

très spécifique de la LMMC

� Permet de distinguer LMMC des autres diagnostics différentiels dès l’analyse du sang

� Importance du pré-analytique

� Importance du panel et de la stratégie d’exclusion +++

� Intérêt de la solution HEMATOFLOW® pour le dépistage des LMMC

�Approche complémentaire de la cytologie

REMERCIEMENTS

U1009

� Dorothée BUET

� Margot MARABITO

� Nathalie DROIN

� Éric SOLARY

Laboratoire d’Hématologie

� Valérie BARDET

� Michaela FONTENAY

Hématologie Cellulaire

� Emmanuel BENAYOUN

Laboratoire d’Hématologie

� Véronique SAADA

Cliniciens GFM

BREVET EUROPÉEN DÉPOSÉ