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43ème Colloque National des Biologistes Hospitaliers Marseille, 5-‐7 novembre 2014

Diagnostic et suivi biologique de l’Hémoglobinurie Paroxystique Nocturne

(HPN)

Caroline Bret Pôle Biologie-‐Pathologie Laboratoire de Biologie Médicale du CHRU de Montpellier Département d’Hématologie Biologique

43ème Colloque National des Biologistes Hospitaliers Marseille, 5-‐7 novembre 2014

ACNBH

ODPC N°1495

DECLARATION D’INTERET DANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION REALISEES POUR L’ACNBH

Caroline Bret, exerçant au CHRU de Montpellier, déclare sur l’honneur ne pas avoir d'intérêt, direct ou indirect (financier) avec les entreprises pharmaceu@ques, du diagnos@c ou d’édi@on de logiciels suscep@ble de modifier mon jugement ou mes propos, concernant le DMDIV et/ou le sujet présenté.

Définition

Anomalie clonale acquise de la cellule souche hématopoïéGque :

a<einte des différentes lignées sanguines pathologie rare : 15 à 20 nouveaux cas par an en France incidence esHmée : 1 à 5 cas pour 106

gène codant une enzyme de la biosynthèse de l’ancre GPI glycosyl-‐phosphaHdyl-‐inositol

Conséquences : n°1 = anomalie de synthèse de l’ancre GPI

n°2 = défaut parHel ou complet de molécules GPI-‐liées à la surface cellulaire : « clones HPN »

Rosse et al. The Lancet 1996

hAp://biochimiej.univ-‐angers.fr

PhosphaHdylinositol

Core glycanne : Glucosamine + 3 mannoses

Ethanolamine phosphate

(n> 100 protéines de la surface cellulaire)

Aspects physiopathologiques

hFp://www.biken.osaka-‐u.ac.jp/biken/men-‐eki-‐huzen/pages/gpisynthesis_e.html

gène PIGA (chromosome X) +++ phospha@dyl-‐inositol-‐glycan anchor biosynthesis, class A MutaKons ou microdéléKons

W. Shen et al. JCI 2014 R.A. Brodsky Blood 2014

hFp://www.biken.osaka-‐u.ac.jp/biken/men-‐eki-‐huzen/pages/gpisynthesis_e.html

Autres anomalies : gène PIGT

Krawitz et al. Blood 2013

Complexe transamidase

Autres anomalies : gène CD59 (anomalie congénitale) M. Yamashina et al. NEJM 1990

Anomalies généHques addiHonnelles : MutaHons somaHques possibles des gènes NRAS, JAK2, NTNG1, TET2, MAGEC1, BRPF1, KDM3B, STAC3…

Y. Mortazavi et al. Blood 2000 C. Sugimori et al. Blood Journal Cancer 2012 W. Shen et al. JCI 2014

Similitudes avec physiopathologie des SMD (gènes communs)

Complexité de l’architecture clonale +++

MutaHon PIGA = évènement iniHal ou non

W. Shen et al. JCI 2014

≈ 55% ≈ 10%

≈ 30% ≈ 5%

Tolérance immune/pression de sélecGon Anomalies généGques addiGonnelles

Hypothèse : seraient responsables de l’hétérogénéité clinico-‐biologique au cours de l’HPN

W. Shen et al. JCI 2014

Modèle de l’aplasie médullaire avec désordre auto-‐immun médié par les lymphocytes T Hyp : avantage de survie des CSH HPN+ par rapport aux CSH normales Présence d’un peHt clone HPN : meilleure réponse aux thérapies immunosuppressives

W. Dameshek, Blood 1967 P. Hillmen et al. NEJM 1995 N. Hanaoka et al. Blood 2006 C. Sugimori et al. Blood 2006 JJ. Pu et al. Eur J Heamatol. 2011 L. Gargiulo et al. Blood 2013

Emergence et mainGen du clone de CSH porteur de la mutaGon :

Conséquences du déficit en GPI = déficit en molécules GPI-‐liées

Risitano and Rotoli, Biologics : target and therapy 2008

Conséquences du déficit en GPI = déficit en molécules GPI-‐liées

principale répercussion = défaut de CD55 et CD59, protéines de régulaHon de l’acHon du complément

sensibilité accrue à l’acGon lyGque du complément Cible +++ mais non exclusive = globules rouges

avec possibilité de phénomènes paroxys@ques

en lien avec une majora@on de l’ac@va@on du complément (ex : infec@on,…)

R.A. Brodsky Blood 2014

hémolyse intra-‐vasculaire chronique

Manifestations clinico-‐biologiques

Hémolyse Insuffisance médullaire Thrombose

Hétérogénéité de la présentaGon clinico-‐biologique (diversité et sévérité des signes)

H. Schrezenmeier et al. Haematologica 2014 R.A. Brodsky Blood 2014

Triade :

-‐ asthénie, épisodes abdominaux douloureux, dysphagie, dysfoncKon érecKle -‐ insuffisance rénale -‐ hypertension pulmonaire

Forme « classique »

Hémolyse avérée Thrombose

Absence d’insuffisance médullaire associée

Forme « infra-‐clinique »

Absence d’hémolyse ou de thrombose objecHvable(s) biologiquement ou cliniquement

Présence d’une insuffisance médullaire

possible

Forme associée à une « anomalie médullaire »

Hémolyse avérée

Présence d’une Insuffisance médullaire

C. Parker et al. Blood 2005

Classifica@on interna@onale I-‐PIG : Interna@onal PNH Interest Group




Triade :


1ère cause de mortalité au cours de l’HPN

-‐ au moins 1 épisode thrombo-‐embolique (ETE) chez 29 à 44% des paHents

-‐ chez 19% des paHents : ETE précède le diagnosHc d’HPN

-‐ survenue d’ETE = facteur de mauvais pronosHc : survie à 4 ans après ETE au diagnosHc = 40%

A. Hill et al. Blood 2013

Thrombose et HPN

LocalisaGons anatomiques préférenGelles :

MTEV : localisaGon abdominales a<einte des veines hépaGques = syndrome de Budd Chiari 7,5 à 25% des paHents HNP complicaHon : insuffisance hépatocellulaire, mortalité élevée a<einte des veines mésentériques, duodénales veines cérébrales a<einte du sinus sagi<al supérieur localisaHon neurologique la plus fréquente conduit à 1/3 de décès autres localisaHons : sinus latéral, sinus caverneux, sinus sigmoïde TA : artères cérébrales et coronaires +++

A. Hill et al. Blood 2013

Thrombose et HPN

Physiopathologie des thromboses au cours de l’HPN

AcGvaGon plaquefaire

Hémolyse intra-‐vasculaire

DérégulaGon de l’hémostase

DysfoncGon endothéliale

Etat pro-‐inflammatoire




Triade :


A. Raza et al. Cytometry part B 2014

Etude mulH-‐centrique prospecHve EXPLORE

Aplasie médullaire Syndromes

myélodysplasiques

clone HPN Chez 39,5% des paHents

Sujets ≤ 50 ans +++

clone HPN chez 1,8% des paHents

Sujets > 75 ans +++

Cytopénies réfractaires avec dysplasie unilignée +++

clone HPN chez 2% des paHents

* Clone > ou égal à 0,01%

ObjecKf = déterminer la prévalence de l’HPN* chez paKent avec insuffisance médullaire n=1746 paKents

« Autres » situaGons d’I.M.

Prise en charge thérapeutique

2 opKons pour les formes sévères :

Eculizumab

Greffe de CSH AnHcorps monoclonal humanisé anH-‐C5

Formes hémolyKques

AdministraHon en I.V. au long cours

CompensaHon du déficit en CD59 avec correcHon de l’hémolyse intra-‐vasculaire

Pas de compensaHon du déficit en CD59,

pas de correcHon de l’hémolyse extra-‐vasculaire (dépôt de C3d sur les GR)

Efficacité et sécurité vérifiées en essai de phase III

Formes sévères Absence de réponse à l’éculizumab

Aplasies

Bénéfice/risque

(morbi/mortalité liées à la greffe)

Diagnostic biologique

Points d’appel clinico-‐biologiques :

ManifestaGons thromboGques : Sujet jeune Localisa@on anatomique inhabituelle localisa@ons abdominales localisa@on cérébrales aFeinte cutanée

ExploraHon d’une hémolyse ou d’une hémoglobinurie

Éventuellement associée à des épisodes abdominaux douloureux, dysphagie, dysfonc@on érec@le, insuffisance rénale, hypertension pulmonaire

ExploraHon de cytopénies associées, en parHculier au cours de l’aplasie médullaire

MJ. Borowitz et al. Cytometry Part B 2010 A. Hill et al. Blood 2013

Examens à réaliser (critères minimums nécessaires) :

Haptoglobine : ê Bilirubine libre : é LDH : é

Hémogramme

anémie normo/macrocytaire régénéraKve modérée/sévère (non systémaKque)

+/-‐ thrombocytopénie +/-‐ leucopénie (neutropénie)

Bilan d’hémolyse


Cytopénies :

Seuil retenu : >1,5 x limite haute Corréla@on avec taille du clone :

> 3% pour les GR et > 23% pour les PNN au cours de l’aplasie médullaire LDH : associa@on significa@ve avec -‐ le risque de thrombose

-‐ la mortalité

JJ. Pu et al. Eur J Heamatol. 2011

Intérêt du taux de LDH :

JW Lee et al. Abstract ASH Blood 2011

H. Schrezenmeier et al. Haematologica 2014

Examens à réaliser (critères minimums nécessaires) :

Haptoglobine : ê Bilirubine libre : é LDH : é . Test de Coombs* : -‐ Taux de réHculocytes* : é (en dehors des situa@ons d’I.M.)"

Recherche de clone HPN

Myélogramme (BOM), cytogénéGque

Hémogramme anémie normo/macrocytaire régénéraKve modérée/sévère (non systémaKque)

+/-‐ thrombocytopénie +/-‐ leucopénie (neutropénie)

Bilan d’hémolyse


JJ. Pu et al. Eur J Heamatol. 2011

Recherche de clone HPN par cytométrie en flux =

méthode diagnosGque de référence (explora@ons géné@ques non réalisées en rou@ne)

Principe = mise en évidence du déficit en marqueurs GPI-‐liés sur au minimum deux lignées sanguines disGnctes

Présence d’un clone : oui/non

Si oui : déterminaGon de la taille du clone

Recherche de clone HPN = mise en évidence de cellules déficientes en marqueurs GPI-‐liés mais ≠ diagnosKc de l’HPN

Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2010

Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2012

Intérêt pour la détecHon de clones mineurs chez les paHents a<eints : -‐  d’aplasie médullaire

-‐  de SMD

Test de « rouGne »

Sensibilité = 1% AcquisiHon de

5000 cellules cibles

Test de « haute sensibilité »

Sensibilité = 0,01%PNN (0,005%GR) AcquisiHon de

200 000 cellules cibles

versus

Réponse au traitement immunosuppresseur Risque de majoraKon du clone : 10-‐25% des paKents vers forme classique

A. Tichelli et al. Leuk Lymph. 1994 C. Sugimori et al. Blood 2006

Nature de l’échanHllon : sang périphérique, EDTA

Examen à réaliser dans les 24h, le jour même idéalement

1ère étape = recherche de cellules déficientes en marqueurs GPI-‐liés parmi les PNN, avec confirmaGon sur les monocytes

Absence de clone significaHf détectable Présence de cellules déficientes

2ème étape = recherche de cellules déficientes en marqueurs GPI-‐liés parmi les GR

Spanish Society of Hematology, SEHH 2012 MJ. Borowitz et al. Cytometry Part B 2010

Parker et al. Blood 2005

Mosaïcisme du phénotype :

Type I : expression normale Type II : défaut d’expression parHel Type III : absence d’expression

Déficit en marqueurs GPI-‐liés variable au sein des cellules sanguines :

chez un même pa@ent :

MJ. Borowitz et al. Cytometry Part B 2010

Polynucléaires neutrophiles et monocytes : différentes approches possibles

Marqueurs de sélecHon (« gaHng »)

CD45/SSC CD33 CD15 CD64

FLAER/CD24 FLAER/CD14

Marqueurs GPI-‐liés

SélecKon rigoureuse des populaKons Combinaison = sécurité

AnGcorps/réacGfs uGlisés :

FLAER = -‐ dérivé d’une lysine sécrétée par Aeromonas hydrophila pro-‐aérolysine sans ac@vité ly@que -‐ couplé à un fluorochrome (Alexa 488)

liaison spontanée aux ancres GPI

RéacKf : -‐ performant +++ pour la mise en évidence des déficits d’expression de marqueurs GPI-‐liés, -‐ désormais incontournable pour l’évaluaHon des GB

FCS/SSC CD235a

CD59

mieux que CD55 car sépare mieux les types II

Globules rouges :

Marqueurs de sélecHon (« gaHng »)

Marqueur GPI-‐lié

Modalités de préparaHon de l’échanHllon 2 lavages, pas de « vortex »

Choix des réacHfs, quanHté d’anHcorps uHlisée An@-‐CD235a : clone KC16 An@-‐CD59 : clone MEM43 ou OV9A2

R. Sutherland et al. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2010, 2012

Risque d’agrégaGon des globules rouges

ValidaGon de la méthode en « haute sensibilité »

Nécessité de déterminer la sensibilité de la méthode méthode de dilu@on

Nécessité d’évaluer une série de sujets sains « bruit de fond » m= 4 GR de type III/106 chez sujets sains

Modalités de préparaHon de l’échanHllon en vue de l’acquisiHon de plus de 200 000 cellules cibles

aFen@on notamment aux sujets leucopéniques

R. Sutherland et al. Cytometry Part B 2012

Lymphocytes = contrôle interne

FSC-‐A

FSC-‐H

SSC-‐A

CD45

PNN

Monocytes

1ère étape = sélecKon des populaKons à évaluer

SSC-‐A

CD15

CD15

CD33

CD33

CD64

1ère étape (suite) = sélecKon des populaKons à évaluer

SélecKon « affinée »

FLAER FLAER

CD24 CD14

PNN : 0,00% de type III, monocytes : idem

2ème étape = évaluaKon de l’expression des marqueurs GPI-‐liés/FLAER

FSC-‐H

FSC-‐A

SSC-‐A

FSC-‐A

SSC-‐A

CD235a

CD235a

CD59

FSC-‐A

FSC-‐H SSC-‐A

CD45

SSC-‐A

CD15

CD15

CD33

CD33

CD64

1ère étape = sélecKon des populaKons à évaluer

PNN : 4,7% de type III Monocytes : 58,9% de type III

2ème étape = évaluaKon de l’expression des marqueurs GPI-‐liés/FLAER

FSC-‐H

FSC-‐A

SSC-‐A

FSC-‐A

SSC-‐A

CD235a

CD235a

CD59

3,1

ObjecGfs de l’examen : -‐  rechercher la présence d’un clone HPN -‐  le quanHfier au sein des leucocytes et des globules rouges

= taille du clone

Compte-‐rendu :

Nature de l’échanHllon,… Renseignements cliniques éventuels Marqueurs de sélecHon uHlisés (marqueurs de « gaHng ») Marqueurs GPI-‐liés évalués Sensibilité de la méthode (PNN et globules rouges), à compléter par la sensibilité de l’examen si inférieure

1/4

AfenGon à la formulaGon : objecGf = éviter les erreurs d’interprétaGon !

1er cas de figure : absence de clone HPN

Conclusion avec formulaGon claire

éviter les « posiHfs »/ »négaHfs »

+ Donner la limite de sensibilité

sur les PNN

2/4

A. Illingworth and R. Sutherland, ESCCA congress Dublin 2011

ex à proscrire : « le test HPN est néga@f » « toutes les cellules sont posi@ves »…

Taille de clone HPN dans chaque catégorie de cellules : -‐  type II -‐  type III -‐  type II + III = taille totale du clone

3/4

2ème cas de figure : Présence d’un clone HPN

Conclusion dictée par la taille du clone au sein des PNN :

ConfirmaGon par le clone au sein des monocytes et des globules rouges :

« confirmé sur les monocytes (x%) et sur les globules rouges (x%) »

si HPN II+III < 0,1% si HPN II+III ≥ 0,1% et ≤ 1% si HPN II+III > 1% « Présence de rares

cellules présentant un déficit en protéines GPI-‐

liées »

« Présence d’un clone HPN minoritaire

esGmé à x % sur les PNN »

« Présence d’un clone

HPN esGmé à x% sur les PNN»

4/4

Groupe HPN-‐AFC -‐ A. Illingworth and R. Sutherland, ESCCA congress Dublin 2011

Forme « classique »

Forme « infra-‐clinique »

Forme associée à une anomalie médullaire

R. Hu et al. Blood 2005 C. Parker et al. Blood 2005

Clone HNP > 50% des PNN Clone HNP < 30% Clone HNP mineur < 1%

Théoriquement :

Hémolyse +++

LDH Anémie régénéra@ve

ManifestaGons des anomalies

de l’hématopoïèse

Cytopénies, anémie arégénéra@ve,

moelle pauvre

PaGents pauci-‐ ou asymptomaGques

(évolu@on possible mais plus rare)

Sujets sains : jusqu’à 0,003%

A. Raza et al. Cytometry part B 2014

Etude mulH-‐centrique prospecHve EXPLORE

Aplasie médullaire Syndromes

myélodysplasiques

Taille médiane du clone

= 5,1%


= 17,6%

* Clone > ou égal à 1%

ObjecKf = déterminer la prévalence de l’HPN chez paKent avec insuffisance médullaire n=5398 paKents

« Autres » situaGons d’I.M.


= 24,4%

Suivi des patients présentant un clone HPN

Stabilité clinique Surveillance annuelle

Survenue d’une complicaHon

Ré-‐évaluer la taille du clone par CMF (suspicion de majoraGon : évoluGon vers la forme classique notam-‐ ment)

PaHents traités par l’eculizumab Surveillance mensuelle :

Surveillance annuelle du clone par CMF

NuméraHon sanguine Taux de réHculocytes Bilirubine LDH

Test de Coombs En cas de suspicion d’hémolyse :

PaGe

nts n

on traités

PaGe

nts traité

s

R.A. Brodsky Blood 2014 MJ. Borowitz et al. Cytometry Part B 2010 À intégrer dans le compte-‐rendu de biologie

Conclusion

Pathologie rare avec des répercuHons cliniques hétérogènes mais potenHellement sévères

triade Hémolyse/Thrombose/Insuffisance médullaire Rôle majeur des exploraGons biologiques :

-‐ mise en évidence et suivi des conséquences de l’hémolyse, des cytopénies,

-‐ mise en évidence et suivi du clone HPN par cytométrie en flux

méthode de « rouHne »/méthode de haute sensibilité

-‐ nécessité d’une approche rigoureuse -‐ intérêt des évaluaHons externes de la qualité

diagnosticet suivi*biologiquede l’hémoglobinurie ... ·...

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