diagnostické metody v lékařské ... -...
TRANSCRIPT
![Page 1: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/1.jpg)
Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii
Výuková prezentace z:Lékařské mikrobiologie
Jan Smíšek © ÚLM 3. LF UK 2009
![Page 2: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/2.jpg)
• Soubor znaků s rozdílnou diskriminačníhodnotou
• Základní problémy– Minimum morfologických znaků– Podobné antigeny– Genomová nestabilita – mutace, plasmidy
Princip identifikace
![Page 3: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/3.jpg)
• Přímá diagnostika– Přímý průkaz přítomnosti mikroba (kultivace)
nebo jeho částí (antigen, DNA)
• Nepřímá diagnostika– Průkaz specifické imunitní reakce proti
mikrobovi (specifické protilátky)
• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
Principy diagnostiky
![Page 4: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/4.jpg)
• Přímé diagnostické metody– Odběr z postiženého orgánového systému –
ideálně pouze málo invazivní (stěr z tonsil, sputum, krev, moč, mozkomíšní mok)
• Nepřímé diagnostické metody– Průkaz protilátek v séru, vzácněji např. v
mozkomíšním moku
• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE ODBĚR
Odběr materiálu
![Page 5: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/5.jpg)
• Klasické metody přímé diagnostiky– Mikroskopické vyšetření– Kultivační vyšetření
• Pokročilé metody přímé diagnostiky– Specifické testy– Biochemické testy– Detekce antigenu– Citlivost k ATB
• Moderní metody přímé diagnostiky– Detekce DNA
Přímá diagnostika
![Page 6: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/6.jpg)
• Světelná mikroskopie– Nativní (nefixované a nebarvené
preparáty) pozorované fázovým kontrastem nebo v zástinu – slouží jen k popisu základní morfologie
– Fixované a barvené preparáty• Rozdělení podle vlastností buněčné stěny
– Gramovo barvení (Gram pozitivní a negativní)– Ziehl-Neelsenovo barvení (Acidorezistentní)
Klasická přímá diagnostika
![Page 7: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/7.jpg)
Klasická přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE BAKTERIE A MIKROSKOPIE
![Page 8: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/8.jpg)
• Kultivace na kultivačních půdách– Obecné kultivační půdy – roste na nich většina
mikrobů– Selektivní kultivační půdy – jsou vhodné pro růst
konkrétního skupiny nebo druhu– Diagnostické kultivační půdy – lze jimi prokázat
určitou vlastnost mikroba (zkvašování cukru)– Speciální kultivační půdy – vhodné k růstu náročných
druhů, které nelze běžně kultivovat– Na pevných půdách (agarech) hodnotíme morfologii
kolonií, na tekutých (bujónech) typ růstu
Klasická přímá diagnostika
![Page 9: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/9.jpg)
Klasická přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE KULTIVACE
![Page 10: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/10.jpg)
• Mikroskopické a kultivační vyšetření– Výhody
• Snadné• Levné• Není náročné na technické vybavení
– Nevýhody• Vyžaduje interpretaci zkušeným pracovníkem
Klasická přímá diagnostika
![Page 11: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/11.jpg)
• Specifické testy– Po interpretaci výsledků mikroskopického a
kultivačního vyšetření– Odliší od sebe příbuzné a vzájemně podobné
mikroby– Jsou založeny na specifických chemických
vlastnostech či kultivačních podmínkách• Chemické vlastnosti – průkaz oxidázy, katalázy• Kultivační vlastnosti – CAMP, satelitismus,
rozpustnost ve žlučových solích
Pokročilá přímá diagnostika
![Page 12: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/12.jpg)
Pokročilá přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
![Page 13: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/13.jpg)
• Biochemické testy– Jsou založeny na schopnosti bakterií metabolizovat
různé substráty (cukry, aminokyseliny aj.)– Většina bakterií umí zpracovat pouze konkrétní
substráty kombinace substrátů typická pro bakterii biochemický profil
– Komerčně vyráběné testové sady s diagnostickými půdami pro určité skupiny bakterií
• Enterobakterie – fermentující Gram neg. tyčky• Nefermentující Gram neg. Tyčky
– Pro snazší hodnocení zpracování substrátu změna barvy diagnostické půdy
Pokročilá přímá diagnostika
![Page 14: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/14.jpg)
Pokročilá přímá diagnostika
Biochemické vlastnosti bakterií čeledi Enterobacteriacae (tzv. „Krátká pestrá řada“)
indol laktóza sacharóza manitol glukóza ureáza Simons SIM
+ - + - + - + - + + plyn
- + - + - + - HS
Pozn.
1 Test na produkci indolu - Kovácsovo činidlo (podobné Ehrlichovu činidlu); test je pozitivní při přítomnosti červené vrstvičky na hladině
2-4
Test štěpení (utilizace) laktózy, sacharózy a manitolu - indikátorem je bromthymolová modř
5 Test štěpení glukózy - ve Wassermanově zkumavce (je široká), v ní menší zkumavka - tzv. „plynovka“ - pokud je v ní bublina vzduchu, znamená to, že bakterie štěpí glukózu za vzniku plynu
6 Test na produkci ureázy (tzn. schopnost štěpit močovinu) - zkumavka s šikmo nalitým agarem obsahujícím močovinou, indikátorem změny pH je fenolováčerveň
7 Amoniumcitrát (Simons)
8 SIM agar - pokud je zákal jen kolem vpichu, bakterie je nepohyblivá (nebo byla její pohyblivost nějakým způsobem ovlivněna); pokud je zákal v celém objemu agaru, bakterie je pohyblivá (např. Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, etc.); dále se na tomto agaru testuje produkce sirovodíku - ten zde tvoří černé sraženiny
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
![Page 15: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/15.jpg)
• Výsledky se hodnotí podle matice a zaznamenají např. do hodnotícího programu v PC
Pokročilá přímá diagnostika
![Page 16: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/16.jpg)
• Program vyhodnotí pravděpodobnost shody s typovými biochemickými profily konkrétních druhů
Pokročilá přímá diagnostika
![Page 17: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/17.jpg)
• Detekce antigenu– Přímý průkaz antigenu v biologickém
materiálu – průkaz infekce konkrétním druhem
• Aglutinací (latexová aglutinace)• Imunofluorescenčně• ELISA
– Průkaz antigenu v čisté kultuře – identifikace konkrétního kmene
• Používají se diagnostická séra sérotypizace(zpětná aglutinace)
Pokročilá přímá diagnostika
![Page 18: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/18.jpg)
Pokročilá přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
![Page 19: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/19.jpg)
• Určení citlivosti k antibiotikům– Velký terapeutický význam– Určení citlivosti / rezistence konkrétního kmene– Disková difúzní metoda – nejčastější, disky
napuštěné ATB – měří se velikost inhibičních zón– E test – proužek s klesající koncentrací ATB, drahé !!!– MIC (Minimální Inhibiční Koncentrace) – bujón s
klesající koncentrací ATB – nejnižší koncentrace při níž bakterie nevyroste = MIC
Pokročilá přímá diagnostika
![Page 20: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/20.jpg)
Pokročilá přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE ATB
![Page 21: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/21.jpg)
• Detekce DNA mikroba– Hybridizační metody
• Průkaz navázáním značených genových sond na specifické úseky DNA nebo RNA
– Amplifikační metody• Průkaz pomnožením specifických úseků DNA• Polymerázová řetězová reakce (PCR)
• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
Moderní přímá diagnostika
![Page 22: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/22.jpg)
• Založena na průkazu specifických protilátek hostitele proti mikrobovi
• Klasické metody nepřímé diagnostiky– KFR, Přímá aglutinace, Hemaglutinace
• Moderní metody nepřímé diagnostiky– ELISA, Western blot
• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE SEROLOGIE
Nepřímá diagnostika
![Page 23: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/23.jpg)
• Lokalizovaná infekce (pneumonie)– Odběr lokálního materiálu (sputum)– Mikroskopie (morfologie, Gram, Ziehl-
Neelsen)– Kultivace (krevní agar, McConkeyho agar,
Sabouraudův agar)– Diagnostický test dle výsledků mikroskopie a
kultivace• CAMP, satelitismus, enterotest atd.
– Určení citlivosti k ATB terapeutickédoporučení
Diagnostický postup
![Page 24: Diagnostické metody v lékařské ... - mikrobiologie.unas.czmikrobiologie.unas.cz/soubory/dg_metody.pdf · – Disková difúzní metoda – nejčastější, disky napuštěné](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013008/5d5666a488c993e0768ba287/html5/thumbnails/24.jpg)
• Závažná specifická infekce (meningitida)– Odběr lokálního materiálu (likvor) i krve– Rychlý průkaz antigenů v likvoru (latexová
aglutinace)– Mikroskopie a kultivace likvoru– Hemokultura (kultivace krve)– Při průkazu bakteriálního původce vyšetření
citlivosti k ATB– Jinak průkaz protilátek (spirochety a viry) a
DNA (viry)
Diagnostický postup