PRUEBAS DE DIAGNSTICO DE LA INFLUENZA AH1N1

INTRODUCCION

Desde la primera deteccin del virus AH1N1 en nuestra poblacin a la situacin actual, el comportamiento epidemiolgico de este ha cambiado rpidamente. En nuestro pas, en el rea metropolitana y rural actualmente el virus circula ampliamente en la poblacin, con elevada diseminacin sobre todo en nios en edad escolar y adultos mayores.

El nmero de personas que entran en contacto con el virus incrementa diariamente. En funcin de estos hechos el diagnstico del nuevo virus de influenza A (H1N1), se reserva para aquellos pacientes con infecciones moderadas o graves que requieran internacin o que pertenezcan a los grupos de riesgo.

La confirmacin diagnstica de la infeccin por el virus de influenza A (H1N1), requiere el empleo de tcnicas complejas de referencia como el cultivo viral o la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Por el importante retraso que implica el cultivo viral (das), las tcnicas ms recomendables son las basadas en la deteccin de material genmico principalmente PCR en tiempo real (RT-PCR), que pueden ofrecer resultados en horas.

En la actualidad hay una variedad de pruebas disponibles para detectar los virus de la influenza. Las ms comunes se denominan "pruebas de diagnstico rpido de la influenza" y pueden realizarse en ambientes ambulatorios. Estas pueden arrojar resultados en 30 minutos o menos.

Desafortunadamente, la capacidad de estas pruebas para detectar la influenza puede variar considerablemente. Estas se basan en la deteccin de antgenos virales, pero no permiten el diagnostico especifico de subtipos virales y tiene una sensibilidad limitada en comparacin con las pruebas de referencia que son ms precisas y sensibles y se realizan en laboratorios especializados, como los que se encuentran en los hospitales nacionales o los laboratorios de salud pblica.

El Ministerio de Salud ha dispuesto la descentralizacin del diagnstico, de acuerdo con las capacidades existentes en cada lugar, es por eso que en nuestro medio, la inmunofluorescencia indirecta tiene una alta correlacin, cercana al 90 %, con las muestras procesadas por RT-PCR en tiempo real, no as la inmunofluorescencia directa. Por lo tanto se puede hacer vigilancia estacional y screening de ser necesario. En este caso se enva a los laboratorios referenciales especializados que correspondan los positivos de AH1N1 y 10 % de los negativos.

La muestra idnea para la deteccin del virus de la gripe A es un aspirado nasofarngeo obtenido en los tres das que siguen a la aparicin de los sntomas tambin pueden utilizarse hisopados nasofarngeos; porque el virus replica con altos ttulos en las cavidades nasales y en la garganta. An no se dispone de informacin acerca del valor diagnstico en muestras no respiratorias, como por ej.: materia fecal. Los sueros obtenidos de fase aguda y convaleciente podran ser utilizados para demostrar el aumento del ttulo de anticuerpos especficos.

Los factores que podran contribuir a una menor sensibilidad en las pruebas de laboratorio para detectar el virus de la nueva gripe A (H1N1), incluyen: el tipo de muestra respiratoria, la calidad de la muestra, el tiempo de aparicin de la enfermedad a la recogida de muestras, la edad del paciente, el tiempo de la recogida de muestras para las pruebas, y el almacenamiento (4-8C). No se deben utilizar los hisopos de algodn con mango de

madera. No son aceptables las muestras coleccionadas con hisopos hechos con alginato de calcio.

DETECCIN RPIDA DE ANTGENOS

A. PRUEBAS DE DIAGNSTICO RPIDO DE INFLUENZA o (Rapid Diagnostic Influenza Test -RDITs)

Se basan en la deteccin de un antgeno viral mediante inmunocromatografia o inmunoanlisis, detectan la nucleoprotena (NP) del virus Influenza A (protena altamente conservada) y se caracterizan porque permiten obtener un resultado en un tiempo menor a 30 minutos y pueden ser realizados en el centro de atencin del paciente. Permiten tomar decisiones en el momento y orientan al mdico acerca de la conducta a seguir con cada paciente. Se dispone de varios ensayos de distintos proveedores, algunos permiten:

1. Detectar ambos virus de Influenza A y B sin diferenciarlos, pero ninguno de los RDIT permite distinguir entre los subtipos (H1N1 y H3N2 estacionales), ni proveer informacin acerca de la sensibilidad a los antivirales.

2. Deteccin nica del virus de la gripe A.

Las pruebas rpidas varan en su capacidad para detectar los virus de la influenza y son ms eficaces para detectar la influenza en nios que en adultos.

Estos ensayos presentan sensibilidad baja a moderada (10-70%) en la deteccin de Influenza estacional en muestras respiratorias, si se compara con el cultivo o a la RT-PCR.

Cuando el virus de influenza circula en la comunidad (alta prevalencia), un resultado positivo indica que probablemente el virus est presente en la muestra. Saber si es Influenza A o B puede orientar la conducta mdica a seguir. Un resultado negativo no asegura la ausencia de infeccin. Existen los resultados falsos negativos, y si la sospecha de que el paciente puede estar infectado es alta, deben implementarse las medidas de control y/o tratamiento del paciente, independientemente del resultado negativo de la prueba.

La sensibilidad de la RIDTs para detectar virus de la gripe B son ms bajas que para la deteccin del virus de la gripe A.

La especificidad de RIDT es generalmente alta. Sin embargo, especialmente en los perodos de baja actividad de influenza (ej.: al comienzo o final de la estacin) pueden ocurrir falsos positivos; por lo tanto, un resultado positivo por un mtodo rpido requiere la confirmacin por cultivo o RT-PCR en tiempo real.

Cuando se utilicen los ensayos RDIT, el informe debe ir acompaado de alguna explicacin que oriente al mdico en la conducta a seguir.

Un resultado RIDT negativo no descarta la infeccin por el virus de la gripe A (H1N1)

B. ANLISIS DE INMUNOFLUORESCENCIA

Un mtodo muy extendido y sensible para el diagnstico de las infecciones por los virus de la gripe A y B y otros cinco virus respiratorios de importancia clnica. El anlisis de inmunofluorescencia puede utilizarse para la deteccin de virus en muestras clnicas o en cultivos celulares. Son preferibles las muestras clnicas, obtenidas lo antes posible tras la aparicin de los sntomas, ya que el nmero de clulas infectadas presentes disminuye durante el curso de la infeccin.

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

Esta tcnica permite distinguir entre los virus Influenza A y B. Si da positivo para Influenza A por IFI, ese paciente pasa a considerarse un caso sospechoso. No diferencia el virus AH1N1 del de la Influenza A estacional. La tcnica de inmunofluorescencia requiere calidad de muestra clnica, pericia del operador, la sensibilidad y especificidad de la tcnica para este nuevo virus no se conocen an. Por lo tanto, un resultado negativo no debe ser asumido como diagnstico definitivo para el nuevo virus. El resultado se obtiene en horas de tomada la muestra.

CULTIVO DE VIRUS

El cultivo celular puede utilizarse para detectar virus respiratorios de importancia clnica.

El aislamiento de virus es una tcnica sensible que presenta la ventaja de que el virus est disponible tanto para la identificacin como para la ulterior caracterizacin antignica, gentica y la preparacin de vacunas. La lnea celular preferida para el cultivo de virus de la gripe es la MDCK (Madin Darby Canine Kidney Cells).

Los cultivos gripales positivos exiben los efectos citopticos como resultado de la replicacin Viral a partir de los 5 das posteriores a la infeccin, pero es preciso identificar el virus por un anlisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales especficos o bien por hemaglutinacin (HA) y anlisis antignico (determinacin del subtipo) por inhibicin de la hemaglutinacin (IHA) utilizando antisueros de referencia seleccionados en el medio de cultivo celular (sobrenadante).

Todas las muestras positivas por RT-PCR en tiempo real y un 10 % de las muestras negativas (para estudios de vigilancia virolgica / epidemiolgica) son cultivadas en monocapas de clulas MDCK, se incuba en una estufa a 37C con 5% de CO2 y atmsfera hmeda durante 7 das. Las monocapas celulares inoculadas se observan diariamente al microscopio ptico invertido, para detectar la aparicin del efecto citopatico viral.

Los cultivos con efecto citopatico positivo o las clulas sin el al final del perodo de incubacin (7 das) se cosechan (clulas + sobrenadante) y se extrae el ARN por RT-PCR en tiempo real.

Si el resultado es:

- positivo, el virus detectado debe ser tipificado.

- negativo, se informa.

El aislamiento del virus de influenza A (H1N1) es diagnstico de infeccin. Los resultados se pueden obtener entre 7 a 10 das por lo que no es til para el manejo clnico. Un cultivo negativo no excluye infeccin por el nuevo virus. Para el diagnstico del virus de influenza A (H1N1) se realiza el cultivo y secuenciacin del genoma.

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN TIEMPO REAL

(RCP-TR)

Esta tcnica detecta y cuantifica mRNA en muestras pequeas. El diagnstico molecular es actualmente el mtodo de eleccin para la deteccin y caracterizacin del virus de la influenza A (H1N1). Consiste en la deteccin del genoma viral (ARN) directamente en muestras clnicas o luego del cultivo de dichas muestras clnicas.

El uso de ensayos de amplificacin genmica que estn diseados para detectar ms de un gen viral son los ms apropiados para una correcta identificacin. Entre los genes blanco para la amplificacin son importantes:

El gen de la matriz (M) de influenza tipo A,

El gen de hemaglutinina (HA) especfico para el virus A (H1N1)

Los genes de HA especficos de influenza A estacional (H1/H3).

Esta es una potente tcnica para la identificacin de genomas del virus . El genoma del virus es un ARN de hebra nica; en primer lugar hay que sintetizar una copia de ADN (ADNc) utilizando una polimerasa de transcripcin inversa (transcriptasa inversa, TI). El procedimiento de amplificacin del genoma de ARN (RCP -TI) requiere un par de oligonucletidos cebadores. Los pares de cebadores se disean en funcin de la secuencia conocida del gen HA de los subtipos de gripe A y del N1, y amplifica especficamente el ARN de un solo subtipo. Los ADN generados mediante cebadores especficos de cada subtipo pueden despus analizarse utilizando tcnicas de gentica molecular como la secuenciacin.

La prueba de RT-PCR puede ser positiva para influenza A pero negativa para los subtipos estacionales H1 y H3. En ese caso se debe confirmar la presencia del nuevo virus de influenza A (H1N1) con un RTPCR especfica.

El tiempo aproximado para tener el resultado es de 24 horas a partir de hisopados clnicos o de cultivos de clulas infectadas pero el protocolo de la OMS indica repetir las determinaciones negativas a fin de confirmar el diagnstico por lo que se requiere un tiempo adicional.

- Un resultado positivo indica que el paciente est presuntivamente infectado con el nuevo virus de influenza pero no se identifica el estadio de la infeccin.

- Un resultado negativo, no excluye la posibilidad de que el virus este presente.

Limitaciones

Los analistas deben estar entrenados y familiarizados con los procedimientos de muestreo y la interpretacin de los resultados previo a la realizacin de la prueba.

Un resultado falso negativo puede ocurrir si existe una cantidad inadecuada de organismos presentes en la muestra debido a una recoleccin, manejo o transporte inapropiados.

Un resultado falso negativo puede ocurrir si hay un exceso de plantilla de DNA/RNA en la reaccin.

IDENTIFICACIN SEROLGICA

Los ensayos serolgicos son mtodos diagnsticos indirectos que detectan los anticuerpos (Ac) que pueden estar presentes en el suero de pacientes que han sido infectados con este virus.

Se considera que dos sueros, uno de la fase aguda y otro de fase convaleciente podran ser utilizados para detectar el aumento en el ttulo de anticuerpos especficos que resulten indicadores de infeccin reciente.

La deteccin de Ac especficos en el suero de pacientes infectados se puede realizar mediante ensayos de inhibicin de la hemoaglutinacin (IHA), microneutralizacin (NV) e inmunoanlisis enzimtico .

Estos ensayos deberan ser capaces de detectar la respuesta de Ac luego de la infeccin por este virus.

Las pruebas en sangre serolgicas en fases aguda (dentro de 1 semana de inicio de la enfermedad) y de convalecencia (recogidas 2-3 semanas ms tarde) pueden ayudar a de establecer un diagnstico retrospectivo de la infeccin por virus de la gripe para los estudios epidemiolgicos y de investigacin.

El aumento de 4 veces del ttulo de anticuerpos ante el virus Influenza A (H1N1), en una segunda serologa a los 10-14 das. A pesar ser una prueba cuyo resultado se obtiene de forma tarda, la presencia de hasta un 10% de falsos negativos en la deteccin de PCR en tiempo real en las muestras respiratorias, hace necesaria esta determinacin serolgica, especialmente en los casos de sospecha clnica en los que la PCR en tiempo real resulte negativa, y se considere necesario conocer la positividad.

A. INHIBICIN DE LA HEMOAGLUTINACIN (IHA)

El virus Influenza A (H1N1) puede aglutinar glbulos rojos de humano, cobayo, pollo y pavo en reacciones de hemoaglutinacin. Por lo tanto, la IHA, es una tcnica que podr ser utilizada para la deteccin de niveles de Ac especficos en el suero de un paciente que ha sido infectado.

B. MICRONEUTRALIZACIN (NV)

Los Ac neutralizantes especficos presentes en el suero de un paciente pueden neutralizar o reducir la infectividad del virus. Esta neutralizacin de la infectividad se visualiza mediante la reduccin del nmero de placas virales (unidades formadoras de placas, UFP) que se obtienen luego de enfrentar un nmero fijo de UFP frente a diluciones del suero del paciente en estudio y posterior infeccin de monocapas celulares. La reduccin del nmero de UFP virales detectadas en presencia del suero de un paciente es indicador de la presencia de Ac especficos en el mismo. Un aumento de 4 veces o ms en el ttulo de Ac especficos para el virus Influenza A (H1N1), resultara indicador de infeccin reciente.

CONCLUSIONES

En la actualidad como hemos visto se disponen de diferentes tipos de pruebas diagnsticas para detectar la presencia de virus de Influenza en muestras respiratorias, incluyendo pruebas de deteccin antignica, aislamiento de virus en cultivo celular o deteccin de cidos nucleicos especficos mediante PCR. Estas pruebas difieren en cuanto a su sensibilidad y especificidad, su disponibilidad comercial, el tiempo necesario para obtener resultado y su capacidad para distinguir entre diferentes tipos de virus gripales ( A, B o C) o subtipos de virus A ( nuevo virus pandmico H1N1 o virus estacional H3N2, etc). La deteccin de anticuerpos en suero frente a virus griaples requiere la recogida de sueros pareados con al menos dos semanas de intervalo, por lo que no tiene inters clnico, aunque puede ser til para diagnostico retrospectivo de la infeccin en estudios epidemiolgicos.

Considerando la mayor validez y relativa rapidez de las tcnicas de deteccin genmica (PCR) estas seran las pruebas ideales para el diagnstico de la nueva gripe pandmica. A pesar de la reconocida falta de estandarizacin de estas tcnicas, existe informacin suficiente como para aceptar la validez de sus diagnsticos. No obstante, en una situacion epidmica, resulta inviable su uso masivo, al menos como prueba de diagnstico clnico generalizado. Por ello tendremos que considerar criterios de coste y utilidad para la seleccin de pacientes candidatos a su empleo. Por lo tanto en la mayora de los pacientes con sospecha de gripe, la alternativa a considerar al diagnstico clnico emprico es el empleo de pruebas de diagnstico rpido, que si bien no permiten identificar el subtipo de virus, podran orientar en el manejo del paciente.

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PRUEBAS DIAGNSTICAS DE LABORATORIO PARA DETECTAR INFECCIONES POR EL VIRUS INFLUENZA AH1N1

Lic. Tecnlogo Medico David G. Quispe Aranda

Especialista Laboratorio Clnico y Anatoma Patolgica

ARTICULO DE REVISION

Aunque no es un criterio diagnstico, es caracterstica en las formas graves la presencia de niveles elevados de CPK y LDH.