diagnostikk ved nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk … · 2016. 11. 8. · serologi •...
TRANSCRIPT
Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for
medisinsk mykologi
Lonny M. Kløvfjell Fagbioingeniør
Avdeling for mikrobiologi OUS-Rikshospitalet
Referanselaboratorium
Referansefunksjoner
• Bistå primærlaboratorier med identifikasjon og resistensbestemmelse av alle Candidaisolat fra blodkultur, og å forvalte nasjonal stammebank for invasive Candidaisolat.
• Nasjonal overvåkning av Candidaresistens
• Bistå primærlaboratorier med identifikasjon og resistensbestemmelse av andre kliniske soppisolat.
Hvilke analyser har vi? • Identifikasjon av gjærsopp, muggsopp og dermatofytter. - Maldi-TOF - Sekvensering - Mikroskopi - Selektive medier - Vitek2
• Påvisning av sopp-DNA (PCR). Utføres på molekylær-enheten
for oss. • Langtidsdyrkning mhp sopp • Resistensbestemmelse av gjær- og muggsopp. • Pneumocystis IF • Serologi • Antigenpåvisning (galaktomannan, utføres på virus).
LITT TALL……
• I 2015 mottok vi 203 soppisolater fra blod, hvorav 199 var candida.
• Vi får også flere isolater fra andre lokalisasjoner enn blod. I
2015 var det 191 slike gjærsoppisolat og 79 muggsoppisolat. • 32 dermatofyttisolater til identifikasjon i 2015.
• Candida albicans er hyppigst isolert ved candidemi, 67,8 %. C.glabrata utgjør 16,6 % mens andel av andre candidaarter er lav, C.tropicalis C.dubliniensis og C.parapsillosis er av disse hyppigst forekommende med 3- 4 %.
Sopp - analyser
Totalt antall analyser i 2015: 6989
SOPPTYPER
GJÆRSOPP
MUGGSOPP
DIMORFE SOPP
DERMATOFYTTER
Gjærsopp
• Får tilsendt alle isolater fra blodkultur, samt en del fra andre materialer.
• -Såes ut på Saboraud og kromskål
• Identifikasjon:
–Krom (grønn/ikke grønn)
–Maldi-TOF
–Evt. Vitek
–Sekvensering
•Resistensbestemmelse
• Fryses i vårt stammearkiv
Muggsopp
• Hvis sendt på skål:
– Rask vurdering av farge og øvrig morfologi
– Lupe
– Mikroskopi (bomullsblått, tapeteknikk)
– Sub på ulike temperaturer (28/37/45/50+ °C)
– Resistensbestemmelse dersom ønsket
• Maldi-TOF – ID kommer nå
• Sekvensering
• Fra flere ulike prøvematerialer
•Aspergillus
•Penicillum
•Mucorales
12
Aspergillus sp
• A.fumigatus
• A.flavus
• A.niger
• A.terrus
• 180 species • Vel 30 assosiert med
human sykdom
Aspergillus
A.fumigatus A.flavus A.niger A.flavus
Penicillum
Mucorales
Dermatofytter • Tinea pedis – fot • Tinea unguis (onychomycose) – negler (hånd/fot) • Tinea corporis – kropp (ringorm) • Tinea capitis – hode (hår/skjegg)
• Trichophyton rubrum
• Trichophyton mentagrophytes
(interdigitale)
• Microsporum canis
• Microsporum audouinii
• Trichophyton soudanense
• Trichophyton violaceum
Identifikasjon av dermatofytter
Dyrkning og tilsendte isolat:
• Mikroskopi • Kolonimorfologi • Veksttemperatur • Selektive medier • Sekvensering
Direkte på prøvematerialet: • Dermatofytt – PCR
Trichophyton sp T.soudanense Reflexive hyfer
Microsporum - makrokonidier
Dermatofytt-PCR
• Hud, hår og negler dyrkes ikke lenger rutinemessig, kun PCR
• Metoden påviser de vanligste artene: Trichophyton, Microsporum og Epidermophyton
• Realtime PCR
• Smeltepunktsanalyse:
Dimorfe sopp
• Gjærsoppform ved 37C • Mugggsoppform 28C
• Histoplasma • Blastomyces • Coccidioides • Penicillum marneffeii
• Sjelden i Norge • Reiseanamnese! • Immunsupprimerte (HIV)
• P3-lab
Histoplasma capsulatum
Mikroskopi
Ulike metoder: • CFW – direkte på prøvemateriale • Bomullsblått - Blokkpreparat - Nålepreparat - Tapeteknikk • Lupe
Viktig oppgave • Rask og sikker • Krever øvelse • Oppslagsverk
• Struktur • Mikrokonidier • Makrokonidier • Sporangier («stilk») • Forgreninger • Vesikkel («hoder») • Apophyse («hals») • Phialider • Fruktlegemer – chleistotechia/pycnidia • Røtter • Størrelse
• Må alltid sees på sammen med kolonimorfologi og andre egenskaper.
-veksthastighet -temperatur
Sekvensering + mikroskopi Maldi-TOF + mikroskopi
Aspergillus
Penicillum
Mucorales
BOMULLSBLÅTT - tapeteknikk
• Lactophenolblått
• Blank tape
• Objektglass
• Dekkglass
CALCOFLUORWHITE
• Flourescens – farging • Binder seg til chitin som finnes i celleveggen hos sopp. • Direkte på prøvemateriale • Rask diagnostikk • Kan til en viss grad skille noen typer muggsopp fra
hverandre.
Pneumocystis - Immunfluorescens
• Monoklonal, FITC merket antistoff • BAL og Indusert sputum
1. Forbehandler med di-thio-threitol og PBS 2. Sentrifugerer 3. Bunnfall på objektglass 4. Tørkes 5. Fikseres 6. Farges 7. Mikroskoperes
Resistensbestemmelse av sopp • Etest
• Flytmetode (ikke lenger anbefalt)
• RPMI-skåler
• Gjærsopp
• Muggsopp
• Vi bruker brytningspunkter anbefalt
av EUCAST • Ikke alle sopp har fått
brytningspunkter
• Vi har som mål å starte med buljongfortynning (gullstandard metode) på blodkulturisolater.
• Amphotericin • Fluconazole • Voriconazole • Caspofungin • Anidulafungin • Micafungin • Itraconazole
• Posaconazole • Flucytosin
• Isovuconazole
Serologi
• Aspergillus antistoff (presipiterende antistoff mot aspergillus)
- Utføres ved klinisk mistanke om aspergillose og lungeaspergillose. Liten verdi hos
pasienter med kraftig nedsatt immunforsvar.
- Elektroforese.
- Titrering ved positivt funn.
• Galaktomannan (utføres hos virus-avdelingen)
- Immunsupprimerte, langvarig nøytropene pasienter.
- Komponent i celleveggen hos Aspergillus.
- Enzym immuno assey; EIA-teknikk som påviser Aspergillus galactomannan antigen i
serum (spinalvæske og BAL).
Fritekst..... fritekst..... fritekst
• Dimorfe sopp (immundiffusjon):
–Utføres ved mistanke om sykdom/eksposisjon for dimorfe sopp (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis)
Kryptokokk-antigen • Ø-hjelp • Utføres på spinalvæske, serum og BAL • Hurtigtest fra IMMY • Rimelig, rask og enkel
Påvisning av sopp-DNA
Spesifikke PCR analyser til bruk direkte på prøvematerialet • Aspergillus sp og Aspergillus fumigatus DNA - Utføres vanligvis parallelt - Sterilt materiale - BAL hos immunsupprimerte
• Mucorales DNA - Rhizomucor sp - Lichtheimia sp (Absidia) - Rhizopus sp • Pneumocystis jirovecii DNA - semikvantitativ - Pneumosystis IF på moderat og sterkt positive
• Påvisning av sopp-DNA direkte på prøvematerialet - Ulike målgener som er felles for de fleste sopparter - ITS2 og D1D2 - Der sopp-DNA påvises, utføres en sekvensering - Gensekvensene sammenlignes med tilsvarende sekvenser i
internasjonale databaser for sopp. - Arbeidskrevende metode.
Takk for oppmerksomheten
Mykologi.no