diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa
TRANSCRIPT
![Page 1: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/1.jpg)
Diagnóstico en microbiología de los alimentos:
de la placa de cultivo a la era
genómica
Dr. David Rodríguez Lázaro Grupo de Investigación en Seguridad Alimentaria
SEGURIDAD ALIMENTARIA: VIEJOS PATOGENOS, NUEVOS RETOS
Murcia 29 Enero de 2014
![Page 2: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/2.jpg)
?
![Page 3: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/3.jpg)
¿Seguridad Alimentaria? ¿Qué y por qué?
![Page 4: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/4.jpg)
Scallan et al. (2011). Emerg Inf Dis 17: 7-15
USA
9,388,075 casos
![Page 5: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/5.jpg)
• Coste anual en EE.UU. de casos agudos de gastroenteritis asociados a alimentos (47.780.779): 77.700 M$
Scharff, 2012
81% 77.700 M$ ≈ 59.759 M€
243% 74.284 M€ 24.598 M€ (Investigación)
Gran impacto económico
![Page 6: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/6.jpg)
Epidemiología
Control del riesgo
Análisis del riesgo
Exposición
Comunicación del riesgo
Barreras colectivas Barreras individuales
Gestión del riesgo
SEGURIDAD ALIMENTARIA
![Page 7: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/7.jpg)
Epidemiología
Control del riesgo
Análisis del riesgo
Exposición
Comunicación del riesgo
Barreras colectivas Barreras individuales
Gestión del riesgo
SEGURIDAD ALIMENTARIA
![Page 8: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/8.jpg)
1. Paso final de aislamiento en medio sólido (agar)
2. Este medio será selectivo o diferencial (favorece el crecimiento y/o diferenciará las bacterias bajo estudio según éstas empleen fuentes de energía)
3. Siempre será un resultado presuntivo (NO DEFINITIVO), es necesario confirmación mediante pruebas extras para la correcta identificación
![Page 9: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/9.jpg)
TIEMPO
= $$$$$ Reducción de tiempo de personal
Movilización rápida de los lotes (Reducción tiempo en almacén)
Capacidad discriminatoria • Origen de contaminación
• Detección de formas re-emergentes
Ausencia de métodos de referencia o adecuados • Microorganismos patógenos emergentes: p.ej. Cronobacter • Microorganismos alterantes específicos.
![Page 10: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/10.jpg)
• A nivel mundial: 750 millones análisis anuales • Industria alimentaria: 420 millones • Análisis de rutina (viables totales): 360 millones
• Dos ideas importantes: Las compañías diagnósticas preparan tests diagnósticos antes de los requerimientos normativos Las empresas de alimentos no quieren realizar los análisis microbiológicos in situ, prefieren enviarlos a laboratorios alimentarios o centros de investigación
Tom Wesler. Strategic Consulting Inc. USA
• Análisis microbiológico:
56 % alimentos
30 % farmacia
10 % agua ambiental
4 % agua de consumo
37,2 % aerobios mesófilos
30,8 % E. coli (coliformes)
15,7 % mohos y levaduras
16,3 % patógenos
El coste es igual a la suma del resto
![Page 11: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/11.jpg)
![Page 12: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/12.jpg)
![Page 13: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/13.jpg)
+ Más rápida
+ Más sencilla
+ Más sensible
+ Más específica
+ permite CUANTIFICACIÓN
![Page 14: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/14.jpg)
![Page 15: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/15.jpg)
Organización Internacional para la Estandarización
CEN/TC 275– Food analysis – Horizontal methods WG 6 – Microbial contamination
COMITÉ EUROPEO PARA LA NORMALIZACIÓN
![Page 16: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/16.jpg)
La PCR diagnóstica tendrá el mismo estatus que las técnicas de cultivo bacteriológico convencionales para el año 2010.
![Page 17: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/17.jpg)
La PCR diagnóstica tendrá el mismo estatus que las técnicas de cultivo bacteriológico convencionales para el año 2010 2020.
![Page 18: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/18.jpg)
MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN
Concentration/pre-enrichmentPrecipitation (PEG), ultra-filtration-centrifugation
immunoconcentration, cationic separation TYPING
DETECTION
CultureCell cultureMicroscopy
SAMPLING1. Representativeness 2. sample characteristics 3. time of conservation4. conditions of storage
Molecularmethods
Immunologicalmethods
Nuclec acidpurification
Amplification Reactione.g. PCR, real- time PCR, RT-PCR, NASBA, LAMP, EMA-PCR
e.g.Plaque assayTCDI50
e.g.EIARIAELISA
e.g.SequencingMultiplex PCRserology
ExtractionSwabbing, rinsing, homogenization, gland. extraction
Rodríguez-Lázaro et al. FEMS Microbiol Rev. 2012
![Page 19: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/19.jpg)
MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN
MENSAJE:
Deben ser: 1. Armonizados: definición y uso de PNTs 2. Controlados: uso de controles 3. Validados: empleo de ensayos de validación
(“ring trials )
![Page 20: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/20.jpg)
?
![Page 21: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/21.jpg)
USO de CONTROLES
PARA EVALUAR LOS RESULTADOS
![Page 22: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/22.jpg)
MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN
Concentration/pre-enrichmentPrecipitation (PEG), ultra-filtration-centrifugation
immunoconcentration, cationic separation TYPING
DETECTION
CultureCell cultureMicroscopy
SAMPLING1. Representativeness 2. sample characteristics 3. time of conservation4. conditions of storage
Molecularmethods
Immunologicalmethods
Nuclec acidpurification
Amplification Reactione.g. PCR, real- time PCR, RT-PCR, NASBA, LAMP, EMA-PCR
e.g.Plaque assayTCDI50
e.g.EIARIAELISA
e.g.SequencingMultiplex PCRserology
ExtractionSwabbing, rinsing, homogenization, gland. extraction
Rodríguez-Lázaro et al. FEMS Microbiol Rev. 2012
![Page 23: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/23.jpg)
![Page 24: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/24.jpg)
• Control del procesado de la muestra • Control negativo del procesado de la muestra • Control ambiental • Control negativo de extracción
• Control positivo de amplificación • Control negativo de amplificación • Control estándar (sólo para cuantificación) • Control de amplificación
PREPARACIÓN
DETECCIÓN
![Page 25: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/25.jpg)
ISO 22174:2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens -- General requirements and definitions
![Page 26: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/26.jpg)
![Page 27: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/27.jpg)
![Page 28: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/28.jpg)
adenovirus humano(virus diana)
norovirus murino(virus control SPC)
11 laboratorios a nivel europeo
![Page 29: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/29.jpg)
• El y puede interferir con los resultados finales
• La definición y discusión de los es
• El para evitar problemas
• Los evaluados son para la detección de
![Page 30: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/30.jpg)
![Page 31: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/32.jpg)
Selection and improving of fit-for-purpose sampling procedures for specific foods and
risks
(www.baselineeurope.eu)
Coordinator – Prof. Gerardo Mamfreda UNIBO (IT)
![Page 33: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/33.jpg)
![Page 34: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/34.jpg)
Aproximación: Usar los mismos medios de enriquecimiento (Half-Fraser para L. monocytogenes)
Evaluar alternativas para reducir el tiempo para resultados finales
Reducir los tiempos de incubación
Usar una protocolos de extracción de ADN sencillos y fáciles
Usar un método de PCR a tiempo real
Evaluar alternativas para reducir el coste del análisis
Usar rango de diluciones más bajo (1:3 y 1:5)
Parámetros a evaluar: Tamaño de la muestra (25 g o 50 g)
Dilución de la muestra (1:3, 1:5 o 1:10)
Tiempos de incubación (8, 18 or 24 horas de enriquecimiento)
Protocolo de extracción de ADN (calentamiento, resina Chelex, o kit de columna)
![Page 35: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/35.jpg)
Comparación métodos alternativos vs ISO standards
L. monoctyogenes 1-10 ufc
10-100 ufc 100-1000 ufc
25 g 50 g
ISO Diluciones: 1:3 1:5 1:10
Incubación: 8 h 18 h 24 h Extracción ADN:
Calentamiento Chelex columna
![Page 36: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/36.jpg)
Dilution Incubation times ISO
Baseline QIAGEN
Baseline CHELEX
Baseline BOILING
1 cfu / sample
1:3
8 h 3/3 0/3 0/3 0/3
18 h 3/3 0/3 0/3 0/3
24 h 3/3 1/3 0/3 0/3
1:5
8 h 3/3 0/3 0/3 0/3
18 h 3/3 0/3 0/3 0/3
24 h 3/3 2/3 1/3 0/3
1:10
8 h 3/3 0/3 0/3 0/3
18 h 3/3 0/3 0/3 0/3
24 h 3/3 3/3 1/3 0/3 ✔
50 muestras naturales:
25 contaminadas: 25/25 25/25
25 no-contaminadas: 25/25 25/25
ISO BASELINE
![Page 37: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/37.jpg)
Listeria monoctyogenes
Dilución 1:10 Half Fraser (ISO)
Incubación 24 h
Extracción ADN: Columnas de QIAGEN
PCR a tiempo real Rodríguez Lázaro et al (2004) Appl. Environ. Microbiol.
![Page 38: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/38.jpg)
7 Países 13 Institutos
![Page 39: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/39.jpg)
![Page 40: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/40.jpg)
![Page 41: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/41.jpg)
Grupo de Investigación en Seguridad Alimentaria
Investigadores principales: Dr. David Rodríguez Lázaro Dra. Marta Hernández Pérez
Becarios: Jaime Ariza Miguel Eva Antolín Simón
Técnicos Superiores de Inv: Patricia González García Lorena López Enríquez
Antiguos miembros: Dra. Marta Diez (Univ. Burgos, ES) Dra. Lucía González (ITACyL, ES) Dra. Katarina Kovac (Biosistemika Inc., SL) Dra. Mónica Martínez (ICP-CSIC, ES) Dra. Katarina Oravcova (Univ. St. Andrews, UK) Diana Bezos (Univ. Valladolid, ES) Raquel Campo (Univ. Valladolid, ES) Sonia Ramos (Univ. Burgos, ES)
![Page 42: Diagnóstico en microbiología de los alimentos: de la placa](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070103/62bc49b58b2e0071bf21b6e6/html5/thumbnails/42.jpg)