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Diagnóstico microbiológico de las infecciones por micobacterias
Juan Carlos Rodríguez
S. Microbiología
Hospital General
Universitario de Alicante
Características de los microorganismos
Características de los microorganismos del
género Mycobacterium � Bacterias aerobias� Bacilos curvados� No se tiñen por la coloración de Gram� Tienen ácidos micólicos en la pared, por lo que son ácido-alcohol resistentes
� Crecimiento lento (tiempo de generación entre 2 y 20 horas)
� El género incluye más de 60 especies, algunas patógenas y otras saprófitas
� Necesitan tratamientos especiales y no responden a los antibióticos habituales
Características de los microorganismos del
género Mycobacterium
� No crecen en los medios de cultivo habitualmente utilizados en los laboratorios de Microbiología. ¡¡Hay que solicitar expresamente su aislamiento!!
� Mediante la tinción de Gram no se visualizan, ¡hay que hacer tinciones especiales!
� Los cultivos tardan semanas
Mycobacterium tuberculosis complex
� El complejo está formado por varias especies:� M. tuberculosis (causa la mayoría de los casos)
� M. bovis: Se transmite además, por leche de vaca con tuberculosis. Resistente a pirazinamida
� M. africanum
Mycobacterium
Mycobacterium
Características de la tuberculosis
Características clínicas de la tuberculosis� Fue descrita por Koch en 1886� Generalmente se contagia por inhalación, en pocas ocasiones por ingestión y excepcionalmente por inoculación cutánea
� En pacientes inmunocompetentes, afectación pulmonar en el 80% de los casos y extrapulmonar en el 20%
� En pacientes con HIV se produce afectación extrapulmonar en el 30-60% de los pacientes
Distribución de la tuberculosis extrapulmonar
� Linfática: 30%� Pleural: 23%� Genitourinaria: 12%� Osea: 10%� Miliar: 7%� Meningea: 5%� Peritoneal:3%� Otras: 10%
Patogenia de la tuberculosis-1� Cuando nos infectamos, el microorganismo llega al pulmón
� Se produce una bacteriemia� El sistema inmune reacciona y generalmente controla la infección, quedando los microorganismos acantonados en algunas células humanas (persiste intracelularmente durante largos periodos de latencia).
� La activación del sistema inmune se produce la positividad del Mantoux
Patogenia de la tuberculosis-2� Si el sistema inmune no controla la infección, se desencadena la enfermedad clínica llamada TBC primaria (generalmente en los dos primeros años).
� Puede haber reactivaciones cuando se deteriora el sistema inmune, muchos años después de la infección:
SIDA, ancianos, inmuno-
deprimidos
Transmisión de la tuberculosis
� Sólo son infecciosos los pacientes con tuberculosis pulmonar
� Se puede adquirir la enfermedad tras un contacto ocasional con un paciente tuberculoso, pero generalmente es necesario un contacto prolongado (familiares, etc.)
Diagnóstico de la tuberculosis
Prueba de Mantoux� También llamado, prueba de la tuberculina, útil para
el diagnóstico de la tuberculosis latente� Es una intradermorreacción tras inoculación de un
extracto antigénico de M. tuberculosis� Si el paciente ha estado en contacto con el
microorganismo, se desencadena una reacción del sistema inmune que produce induración
� El Mantoux positivo indica contacto con el microorganismo, pero no siempre se asocia a enfermedad
Prueba de Mantoux
Quantiferon TB� Nueva alternativa al Mantoux, ya que éste presenta reacciones cruzadas con otras micobacterias y con la vacunación
� Se basa en que dos proteínas de M. tuberculosis (ESAT-6 y CFP-10) estimulan al sistema inmune e inducen una fuerte producción de IFN-gamma por las células CD4
� Estos antígenos están ausentes en la mayoría de las micobacterias, incluído BCG, excepto M. kansasii, M. marinum y M. szulgai
Quantiferon TB
� La sangre del paciente se incuba toda la noche con los antígenos (obtenidos de forma sintética)
� Se detecta la presencia de interferon
Muestras a procesar� Pulmonar: 3 muestras de esputo, BAS, BAL, aspirados gástricos
� Linfática: Punción del ganglio � Pleural: Líquido o biopsia pleural� Genitourinaria: 3 muestras de orina de tres días (más de 25 ml)
� Osea: Material quirúrgico� Miliar: Muestras respiratorias, orina, sangre y otras muestras
� Meningea: LCR
Diagnóstico de la tuberculosis pulmonar� La muestra más utilizada es el esputo� Es necesario procesar tres esputos, obtenidos en días distintos (el primero de la mañana)
� Procesar esputos de calidad, no saliva� Un elevado porcentaje de enfermos (30-40%) pueden tener tb pulmonar y tinción negativa
� En niños o adultos que no expectoran puede utilizarse el jugo gástrico (añadir carbonato sódico para neutralizar el ácido del estómago), pero puede haber micobacterias no tuberculosas
Diagnóstico de la tuberculosis pulmonar� También pueden utilizarse muestras invasivas:� Aspirado bronquial (BAS)� Lavado broncoalveolar (BAL)� Cepillado bronquial� Biopsia transbronquial� Aspirado transtraqueal� Biopsia pulmonar, obtenida quirúrgicamente
� Los esputos obtenidos en los dias siguientes a estos procedimientos son muy rentables
Tuberculosis extrapulmonar
� En general hay pocas micobacterias, por lo que hay que procesar la mayor cantidad de muestra posible, por tanto, las muestras en torunda no son útiles
� La tinción suele tener escasa rentabilidad
� Diagnóstico semejante a la tb pulmonar
Tuberculosis genitourinaria
� Es necesario procesar al menos tres muestras de tres días distintos
� Es más rentable la primera orina de la mañana, ya que es la que está más tiempo en contacto con la pared de la vejiga
� Es necesario procesar 25 ml como mínimo
Cultivo de heces
� En la flora gastrointestinal puede haber micobacterias no tuberculosas como flora saprofita
� Sólo es útil cultivar las heces en pacientes con HIV para aislar M. avium-intracelullare
� Si se aísla en heces, hay más riesgo de tener una bacteriemia por este patógeno
Lisis-centrifugación
� Util para el diagnóstico de las infecciones por micobacterias en muestras de sangre
� La sangre se extrae en un tubo especial con saponinas que lisan las células sanguineas y permiten la salida de las micobacterias
� Se centrifuga y le sedimento se procesa como el resto de las muestras para micobacterias (medios líquidos y sólidos)
Lisis-centrifugación
Tinción� Se basa en demostrar la existencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en la muestra
� La tinción de Ziehl Neelsen utiliza fuschina y azul de metileno y se observa a 1000 aumentos en microscopio óptico
� La tinción de auramina se observa a 200 aumentos en microscopio de fluorescencia
� La sensibilidad es de 50-75% dependiendo de la calidad de la muestra
� No diferencia las especies del género
Ziehl Neelsen
Densidad de la población bacilar en función de la localización
LESION Nº BACTERIAS
Nódulos 100-1.000
Gánglios 100-100.000
Riñón 100.000
Cavernas pulmonares 10-100.000 millones
Meninge y pleura 100-100.000
Hueso 1-100.000 millones
Tinción positiva Mas de 100.000
Tinción negativa 100-100.000
Cultivo� Puede hacerse en medios sólidos o líquidos� Se incuban 2 meses, aunque suelen ser positivos
entre 2 y 4 semanas. El rango de crecimiento está entre 2 días y 8 semanas.
� Se incuban a 37ºC salvo algunas excepciones� Los medios sólidos se leen cada semana, mientras
que los líquidos tienen lectura diaria automatizada� Siempre hay que hacer cultivo porque mejora la
sensibilidad, la especificidad y permite estudiar la sensibilidad de la cepa
Cultivo en medio sólido� Cultivos con base de huevo:
� Lowenstein Jensen� Coletsos� Petragnani
� Cultivos con base de agar:� Middelbrook 7H10� Middelbrook 7H11
� Medios selectivos:� Adición de antibióticos
Cultivo sólido
Colonias de Mycobacterium
Cultivo en medio líquido� Clásicos:
� Middlebrook 7H9� Dubos
� Semiautomáticos: Detectan el metabolismo bacteriano mediante el estudio del consumo de oxígeno y la producción de anhídrido carbónico� BACTEC� ESP� MGIT
Cultivos líquidos semiautomáticos� Utilizan caldo Middlebrook � La positividad de la máquina debe confirmarse mediante tinción y cultivo en medio sólido
� Detecta la presencia de micobacterias en menos tiempo que en medio sólido
� Es más sensible que el medio sólido, por lo que es útil en muestras con pocas bacterias (tuberculosis extrapulmonar)
Medios líquidos
Nuevos métodos diagnósticos
� Recientemente se han desarrollado métodos diagnósticos rápidos basados en la reacción en la cadena de la polimerasa (PCR)
� Utiles en muestras respiratorias con tinción negativa y alta sospecha clínica
� Más útiles en muestras con pocas bacterias, como las extrapulmonares
PCR
PCR a tiempo real
Sensibilidad antibiótica
Estudios de sensibilidad
� Tratan de predecir la eficacia de un fármaco frente a la cepa del enfermo
� Es necesaria la cepa, luego debe hacerse siempre cultivo de las muestras de los pacientes
� Puede hacerse por métodos clásicos o mediante técnicas de biología molecular
Estudios in vitro
� Antibiograma:� Se realiza con medios sólidos o líquidos con antibióticos incorporados. Los antibióticos activos no dejaran crecer al microorganismo
� Detección de genes de resistencia: � Puede detectarse la presencia de mutaciones de algunos genes por biología molecular, como el que codifica resistencia a rifampicina o a las fluoroquinolonas
Estudios in vitro
Fármacos antituberculosos
� 1ª línea: Isoniacida, rifampicina, etambutol, pirazinamida
� 2ª línea: Estreptomicina, ofloxacino, levofloxacino, moxifloxacino, linezolid, ácido paraaminosalicílico (PAS), capreomicina, kanamicina, etionamida, cicloserina, etc.
Isoniacida y rifampicina
� Son los fármacos mejores� Bactericidas� Se toleran bien en dosis única diaria por vía oral
� Baratos� Pocos efectos secundarios� Difunden bien a todos los órganos y tejidos
Mutantes resistentes a los fármacos
FARMACO Nº BACILOS
Isoniacida 100.000-1 millón
Rifampicina 10-100 millones
Etambutol 1 millón
Estreptomicina 100.000- 1 millón
Pirazinamida 100-10.000
INH+RMP+ETB 1019 bacilos
INH+RMP+PZ 1016 bacilos
Resistencias� Dentro de una cepa existen microorganismos
intrínsecamente resistentes a los antibióticos, por lo que nunca se puede emplear la monoterapia y se debe controlar la adherencia al tratamiento
� Puede aparecer resistencias primarias (la cepa era resistente cuando infectó al enfermo) o secundarias (por mal cumplimiento del tratamiento, la cepa se hace resistente)
� Se considera que un microorganismo es multirresistente (MDR-TB) si presenta resistencia a isoniacida y a rifampicina; si además es resistente a fluoroquinolonas y a uno de los fármacos inyectables (amikacina, kanamicina, capreomicina) se llama XDR
� Recientemente se han descrito los TDR
Resistencias
Tuberculosis en EspañaIncidencia estimada/
100.000 h
Resistencias primarias a isoniacida
España 25-49 Barcelona: 3,5
Madrid: 2,7-4
Guipuzcoa <3
Colombia
Perú
25-49
100-300
8,5
9,0
Marruecos
Nigeria
100-300
>300
7,8
5,6-16,5
India
China
100-300
100-300
15,4
6,1-24
Rusia
Italia
100-300
25-49
19,4
5,6
Otras especies del género
Identificación de los microorganismos� Crecimiento lento y no cromógenas (>7 días): M. tuberculosis, M. bovis, M. avium intracellulare, M. malmoense
� Crecimiento lento y fotocromógenas: M.kansasii y M. marinum
� Crecimiento lento y escotocromógenas: M. gordonae, M. scrofulaceum
� Crecimiento rápido (< 7 días): M. fortuitum, M. chelonae
Pruebas bioquímicas� Es un método lento y difícil de poner a punto en los laboratorios
� Están siendo desplazadas por las técnicas de biología molecular
� Las más importantes son:� Producción de niacina� Producción de nitratos� Producción de catalasa� Hidrólisis del tween
Cultivo sólido
Colonias de Mycobacterium cromógenas
Técnicas moleculares� Rotura de la bacteria (sonicación y calor)� El DNA extraído se pone en contacto con unos cebadores (primers) especificos de todas las especies del género Mycobacterium
� El termociclador amplifica las secuencias si hay DNA de este género
� El amplificado se pone en contacto con una membrana de nylon en la que hay fijadas unas sondas específicas de las principales especies de micobacterias
� Aparece una banda en la especie que hibrida
Amplificación y detección mediante sondas (LIPA)
LIPA
Secuenciación del 16 S� Este fragmento del DNA bacteriano tiene extremos comunes a todas las bacterias y un fragmento medio característico de cada especie bacteriana
� Se hace una PCR con cebadores que se unen a la zona estable de los extremos
� Se secuencia las bases de la zona media� Se envía a secuencia de bases a Gen Bank por internet
� La base de datos responde con el nombre de la especie bacteriana
Secuenciación del 16 S
Secuenciación del 16 S
Secuenciación del 16 S
Secuenciación del 16 S
Secuenciación del 16 S
Mycobacterium leprae� Bacilo de Hansen� Produce la lepra� En el diagnóstico son muy importantes los datos clínicos y epidemiológicos
� No crece en medios de cultivo artificiales, por lo que sólo se puede diagnosticar por tinción
� Biopsias cutáneas, moco nasal o biopsia de tronco nervioso engrosado
� Dapsona, rifampicina, acedapsona, clofazimida
Mycobacterium leprae
Mycobacterium leprae
Micobacterias ambientales oportunistas
� Responsables de las micobacteriosis� Afectan principalmente a pacientes inmunodeficientes, niños y pacientes con procesos pulmonares crónicos
� Reservorios: Agua, suelo, aves y otros animales
� No hay transmisión interhumana
Micobacterias ambientales oportunistas
Infección pulmonar Avium, Kansasii, Malmoense, Fortuitum
Diseminada en inmunodeprimidos
Avium, genavense
Linfadenitis en niños Avium, kansasii, scrofulaceum, haemophylum, abscessus
Piel y partes blandas Fortuitum, peregrinum, chelonae, abscessus, marinum, kansasii
Osteoarticulares Fortuitum, mucogenicum, peregrinum, chelonae, abscessus, marinum
Asociada a catéteres Chelonae, mucogenicum
M. avium-intracellulare
� Produce enfermedades diseminadas, diarreas y cuadros pulmonares en pacientes con HIV
� También infección de ganglios linfáticos en inmunocompetentes,frecuentemente en niños
� Muestras a procesar: sangre, médula ósea, heces, esputos
� Claritromicina, etambutol, rifabutina, azitromicina, ciprofloxacino, amikacina
M. fortuitum complex� Lesiones cutáneas y de tejidos blandos, queratitis e infecciones de prótesis
� Crecimiento rápido� Crece en medios habituales de las otras bacterias (agar sangre y agar chocolate)
� M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessus, M. mucogenicum
� Amikacina, cefoxitina, ciprofloxacino, claritromicina
M. kansasii
� Clínica semejante a la tuberculosis, con formas pulmonares y extrapulmonares
� Infecciones diseminadas en inmunodeprimidos
� Isoniacida, rifampicina, etambutol, estreptomicina
M. genavense
� No crece en medios sólidos, sólo en medios líquidos
� Infecciones sistémicas en pacientes con HIV, semejantes a las infecciones por M. avium
� Etambutol, rifampicina, rifabutina, clofazimida, claritromicina
M. marinum
� Crece mejor a 30ºC, por lo que se debe indicar cuando haya sospecha clínica
� Lesiones de tejidos blandos asociadas a lesiones con espinas de pesado, acuarios, agua de mar, etc.
� Claritromicina, minociclina, cotrimoxazol,rifampicina, etambutol
M. marinum