DIANA FERNANDA VERA R.Bióloga-Universidad Nacional de Colombia

DIRECTOR

FABIO A. ARISTIZABAL

Departamento de Farmacia

Facultad de Ciencias

DIRECTOR ASOCIADO

EMILIANO BARRETOInstituto de Biotecnología

20041

TÍTULO EN ESPAÑOL: DISEÑO DE UNA ESTRATEGIA PARA LA EVALUACIÓN DE ATRIBUTOS FUNCIONALES EDÁFICOS MEDIANTE SONDAS DE ADN

TÍTULO EN INGLÉS: DESIGN OF A STRATEGY FOR THE EVALUATION OF FUNCTIONAL ATTRIBUTES NEANS DNA PROBES.

RESUMEN EN ESPAÑOL: Haciendo acopio de la información depositada en las tres principales bases de datos genómicos internacionales, y por medio del análisis y aplicación de estrategias de minería de datos, se desarrolló una metodología base para el ulterior diseño de una Herramienta Molecular de Evaluación Funcional de Suelos. Dicha herramienta sería aplicable en el estudio de la diversidad bioquímica y los ciclos minerales en los que participan los microorganismos de diversos ecosistemas terrestres. La información bibliográfica y aquella contenida en las bases, permitió luego de su evaluación, filtrado y clasificación, el diseño de un modelo conceptual en el cual se visualizan las rutas metabólicas microbianas involucradas en los ciclos biogeoquímicos del carbono, nitrógeno, azufre e hierro, sus enzimas correspondientes y los genes codificantes. Dicho modelo pudo ser utilizado en la proposición de 192 marcadores moleculares para 13 grandes procesos bioquímicos, que incluyen: la reducción de sulfato, oxidación de compuestos azufrados, metanogénesis, carboxidotrofía, oxidoreducción de hierro, reducción de nitrato, nitrito, óxido nítrico, óxido nitroso, amonificación, nitrificación y fijación de nitrógeno, así como marcadores para dos grupos taxonómicos de endomicorrizas (géneros Paragbmusy Archaeospora). A través de la utilización de herramientas bioinformáticas se condujo al desarrollo de 191 sondas representativas del 38% de estos marcadores.

TRADUCCIÓN DEL RESUMEN AL INGLÉS: The investigation stocked up on the information placed in the three main international genomic databases, and through analysis and application of data mining strafiegies, conducted to development of a methodology that to subsequently facilítate the design of a Molécula- Tool of Functional Evaluation of Soils, applicable to the sfcudy of the biochemical diversity of the mineral cycles in diverse terrestrial ecosystems inside which the microorganisms are involved. After evaluation, the information was filtered and classificated, it permitted the design of a conceptual model in which, the metabolical routes involved in the biogeochemical cycles of the carbón, nitrogen, sulfur and iron, their corresponding enzymes and the genes are visualized. Said model it could be utilized in the proposal of 192 molecular markers for 13 biochemical processes, that include: sulphate reduction, sulfur compounds oxidation, methanogenic way, carboxidotrophy, iron redox, nitrate reduction, nitrite reduction, nitric oxide reduction, nitrous oxide reduction, ammonification, nitrification and nitrogen fixation, and for two taxonomic groups of endomycorrhizae (genus Paragbmus and Archaeospora). The útil catión of bioinformatic toob was conducted to development of 191 probes, wich represent 38% of the markers.

DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES EN ESPAÑOL: ciclos biogeoquímicos, marcadores moleculares, evaluación de suelos, minería de datos, diseño de sondas.

TRADUCCIÓN AL INGLÉS DE LOS DESCRIPTORES: biogeochemical cycles, molecular markers, soil evaluation, data mining, probes design.

FIRMA DEL DIRECTOR:

Nombre(S) completo(s) del(tos) autor (es) y (Ano de nacimiento): DIANA FERNANDA VERA RAIGOSA, 21 de Octubre de 1974 (21-10-74).

DISEÑO DE UNA ESTRATEGIA PARA LA

EVALUACION DE ATRIBUTOS

FUNCIONALES EDAFICOS MEDIANTE¡<

SONDAS DEADN

DIANA FERNANDA VERA RAIGOSA

Investigación presentada como requisito parcial para optar

al título de Magister Scientiae en Microbiología

BOGOTÁ D.C., DICIEMBRE DE 2004

MAESTRIA INTERFACULTADES EN MICROBIOLOGÍA

FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

"El Director de Tesis, el Presidente de Tesis y el Consejo Examinador de Grado, no serán

responsables de las ideas emitidas por el candidato".

(Artículo 217, estatutos de la Universidad Nacional de Colombia)

PRESIDENTE DEL JURADO

A . * £ 7

JURADO

JURADO

Bogotá D.C., 2004

<Este y todos mis [ogros a quienes no soCo me fian dado (a vida,

sino que [a Han enriquecido con su amor y sabiduría, mis padres.

♦ Agradezco a mis directores de tesis EMILIANO BARRETO y FABIO ARISTIZÁBAL por sus ideas y

orientación oportunas.

♦ A la UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA por el excelente nivel académico, al que he tenido

la fortuna de acceder durante todos mis años de formación profesional.

♦ A mis padres, OMAYRA RAIGOSA y ALCIDES VERA, por haberme apoyado siempre en la

consecución de mis logros con infinito amor.

♦ A mi tía ROSALBA RAIGOSA, por su comprensión y consejo.

♦ A mi amiga CLAUDIA I. MARTÍNEZ, quien me ayudó en los momentos difíciles, con su apoyo

moral y muy importante también: económico.(r

♦ A VLADIMIR PAEZ FONSECA, quien a lo largo de diez años me ha brindado su amistad

incondicional, apoyándome en la realización de todas mis metas y ofreciéndome su valiosa

ayuda. Su aporte en esta tesis es invaluable.

♦ A GERMAN GÓMEZ, por su cariño, amistad y paciencia durante las etapas de realización de

esta tesis y por su importante aporte de conocimientos en el área de sistemas.

♦ A la Profesora MARTHA R. FONTANILLA por su calidad docente, gracias a la cual inicié el

aprendizaje y comencé a interesarme en la biología molecular.

♦ Al profesor ABDÓN CORTÉS, quien promovió mi cariño por la ciencia del suelo.

INTRODUCCIÓN.................................................................................................. 11

OBJETIVOS........................................................................................................ 15

2.1. OBJETIVO GENERAL.................................................................................. 15

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................15

MARCO CONCEPTUAL............................................................................................16

3.1. BIODIVERSIDAD........................................................................................16

3.2. GRUPOS FUNCIONALES Y DIVERSIDAD FUNCIONAL........................................... 17

3.3. CICLOS BIOGEOQUÍMICOS...........................................................................18

3.4. EVALUACIÓN DE SUELOS............................................................................. 20

3.5. ARREGLOS DE ADN Y EL ACCESO A LA BIODIVERSIDAD....................................... 21

3.6. CONCEPTOS PARA EL DISEÑO DE UN MICROARREGLO.........................................23

3.7. BIOINFORMÁ TICA......................................................................................25

METODOLOGÍA...................................................................................................32

4.1. LA CONCEPCIÓN HOLÍSTICA DE LOS CICLOS BIOGEOQUÍMICOS.............................32

4.2. OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE DATOS MOLECULARES.....................................32

4.3. DISEÑO DE SONDAS...................................................................................38

RESULTADOS........................................................................ ............................. 42

DISCUSIÓN DE RESULTADOS.................................................................................. 67

6.1. RUTAS BIOQUÍMICAS..................................................................................71

6.1.1. Cido del Carbono:................................................................................ 71

6.1.2. Cido del Azufre:...................................................................................74

6.1.3. Cido del Nitrógeno............................................................................... 75

6.1.4. Cido del Hierro................................................................................... 77

6.1.5. Cido del Fósforo.............................................................................. .....78

6.2. MODELO CONCEPTUAL...............................................................................79

6.3. APROXIMACIÓN FUNCIONAL........................................................................ 81

6.4. BASE DE DATOS.......................................................................................32

6.5. ANÁLISIS DE LAS HERRAMIENTAS Y CRITERIOSBIOINFORMÁTICOS........................87

6.6. DISEÑO DE OUGONUCLEÓTIDOS...................................................................91

CONCLUSIONES.................................................................................................. .95

RECOMENDACIONES.............................................................................................97

BIBLIOGRAFÍA

Figura 1. Esquema genera! de la realización de un microarreglo, Lucchini et ai.,

[2001]................................... ............................................................... .....22

Figura 2. Salida del programa ClustalX...................... .................. .....................35

Figura 3. Salida de! programa CeneDoc en donde se observa la salida del

alineamiento en ClustalX de secuencias pertenecientes a l ADN codificante para

ARNr 18S de Arcbaeospora. Las zonas azules corresponden a áreas de gran

sim ilitud, en tanto que las naranja presentan algunas discrepancias. Abajo

secuencia consenso.............................. .............. .......................... ..... . 37

Figura 4. Salida de! programa NJPLOT, donde se observa un cladograma obtenido a

través de CíustafX..... ..................................... . 38

Figura 5. Ventana de! subprograma Oligo, de GeneRunner............ ........ ............40

Figura 6. Diagrama de rutas bioquímicas de los ciclos del carbono, nitrógeno, azufre

e hierro (páginas siguientes)................... ................ ................................. .....42

Figura 7. Modelo conceptual de integración de los ciclos biogeoquímicos

considerados {página siguiente)..... ....................................... .......... ............ 50

Figura 8. Representación de la proporción de secuencias de ADN para cada grupo

enzimático a nivel de Dominio taxonómico. Clave de abreviaturas ver Tabla 3......52

Figura 9. Distribución de las secuencias de ADN encontradas por División.............53

Figura 10. Histograma de frecuencia de secuencias de ADN por Género...............53

Figura 11. Representación de la proporción de secuencias de proteína para cada

grupo enzimático a nivel de Dominio taxonómico (abreviaturas ver Tabla 3).......... 54

Figura 12. Distribución de ¡as secuencias de proteína encontradas, por División.... 55

Figura 13. Histograma de frecuencia de secuencias de proteína por Género......... 55

Figura 14. Número de sondas seleccionadas a partir de las secuencias de ADN, por

nive! taxonómico........... ................. ............. ....... ............................. ..66

Figura 15. Número de sondas seleccionadas por nivel taxonómico, a partir de las

secuencias de proteína traducidas................... ............................................ . 66

Figura 16. Ventana de bienvenida a la consulta para ¡a base de datos

Bioproc_suelos..................................... .............................. ................. .......,.S3

Figura 17. Ventana de consulta de la base de datos BioProc_suelos............ ........83

Figura 18. Salida del programa BlastN del NCBI............................................... 91

Tabla 1. Formato de ingreso de información a la base de datos Bioproc_Sueíos...... . 33

Tabla 2. Parámetros utilizados para e l análisis de especificidad por medio de BLAST... 39

Tabla 3. Listado de géneros microbianos y enzimas seleccionadas, incluidos en e l

análisis.......................... ..................... *....-............... ..................................... 56

Tabla 4. Listado de procesos enzimáticos, catalizadores y genes codificantes utilizados..

60

Tabla 5. Elementos esenciales para la mayoría de las plantas superiores y

concentraciones internas que se consideran adecuadas [Salisbury & Ross. 1994]...... 70

ANEXO 1. Oligonuc/eótidos diseñados y sus parámetros termodinámicos y físicos

(páginas siguientes)...................... .............. .............. ..................... ........ ..111

ANEXO 2. Listado de primers reportados en la literatura para ¡os principales procesos

enzimáticos considerados en la investigación......................... ........ ...................118

ANEXO 3. Listado de enzimas-genes para las cuales no existió reporte de dominios en

la base ProDom................... ................... ....................................................... 123

INTRODUCCIÓNEl suelo constituye una fuente primordial de vida para la Tierra, siendo el medio de sostenimiento y

nutrición para las plantas. Es un hábitat que posee una gran diversidad de microorganismos

(bacterias, arqueas, hongos, algas, protozoarios y virus), y en el cual se desarrolla todo tipo de

biota macroscópica (coleópteros, miriápodos, hormigas, colémbolos, nemátodos, ácaros, larvas,

mamíferos pequeños y reptiles). Sus componentes bióticos y abióticos en permanente interacción,

son el motor de los ciclos biogeoquímicos en los ecosistemas terrestres (mineralización de la

materia orgánica, nitrificación, fijación de nitrógeno y oxidación de metano, entre otros procesos)

[Luna etal, 2002], considerándose que entre el 80 y 90% de los procesos edáficos, se encuentran

mediados por microorganismos [Nannipieri et al., 2003]. El suelo es un sistema de suma

complejidad, por lo que no obstante la realización de numerosos estudios (básicamente ex situ)

que han ayudado a comprender sus procesos fisiológicos individuales, así como los mecanismos y

organismos involucrados, persisten la incertidumbre y el desconocimiento acerca de la manera

como se produce el acoplamiento de dichos componentes en una maquinaria eficiente, y de los

principios que rigen su resistencia al cambio y promueven la homeóstasis.

El estudio de los ecosistemas, en particular del edáfico, puede emprenderse no solo a partir de la

consideración de los organismos o poblaciones, sino también estudiando el ambiente abiótico en

relación con ellos. De los 90 elementos químicos que se encuentran en la naturaleza, 30 a 40 son

necesarios para los organismos vivos. Algunos, son requeridos en grandes cantidades (carbono,

hidrógeno, oxígeno y nitrógeno), en tanto que otros lo son en menor proporción. Ciclos como el del

carbono, son considerados más "móviles" que otros, debido a que el material es devuelto al medio

tan rápidamente como le es quitado. Otros en cambio, son menos móviles, y así una porción de la

reserva puede perderse por largos periodos de tiempo, en lugares o formas químicas inaccesibles

para los organismos [Odum, 1972]. De allí la importancia que tiene distinguir qué procesos

bioquímicos y con qué intensidad son llevados a cabo por parte de los diversos grupos microbianos,

para así determinar su dinámica de consumo/retorno en un suelo particular.

Hasta hace muy poco, la identificación de grupos fisiológicos microbianos y la evaluación de su

diversidad en suelos, exigía el aislamiento a partir de cultivos en medios diferenciales [Amann et

al, 1995]. El establecimiento de sus niveles poblacionales requería la utilización de técnicas de

conteo en placa, las cuales no revelan la realidad edáfica. Se sabe que en muchos casos, las

células no forman colonias visibles sobre medios de cultivo [Amann etai, 1995] y en la mayoría de

ellos, se trata de especies no cultivables, pues con los métodos tradicionales solo se ha registrado

cerca del 1% de la comunidad microbiana total del suelo [Borneman & Triplett, 1997]; otros

presentan requerimientos específicos, no dilucidados aún. De esta forma, se estima que en el

suelo, del 80 al 90% de los microorganismos aún permanecen sin identificar [Borneman et al,

1996]. Debido a las deficiencias existentes en cuanto al conocimiento de la magnitud de grupos

taxonómicos, es posible que este acercamiento no sea adecuado al momento de diseñar un

método de evaluación de suelos; puesto que ello implicaría tres aspectos relevantes y generadores

de sesgo: i) Solo estaría representado un muy pequeño porcentaje de la totalidad de especies; ii)

Se debería hacer una jerarquización por importancia ecológica de las especies a seleccionar, con el

fin de escoger solo aquellas "relevantes", esto, si se ha podido establecer previamente el alcance

del término; y iii) para que el método no tuviera una aplicación restringida, se deberían tener en

cuenta especies microbianas consideradas como "ubicuas", las cuales no han sido determinadas

experimentalmente [Cho &Tiedje, 2000]. Como indican algunos autores [Hooper et al, 2002], la

riqueza de especies como una medida simple de diversidad biótica, no tiene un suficiente poder

descriptivo: la dinámica de los procesos que se dan al nivel de un ecosistema, dependen más de

las características funcionales (metabólicas) de los organismos involucrados, que de su identidad

taxonómica, aunque esta sea implícita. La diversidad funcional, se refiere al intervalo y valor de

tales características, que resultan influyentes en las propiedades o atributos del ecosistema. De

acuerdo con algunos autores [Hooper etal, 2002], esta medida puede ser expresada en una gran

variedad de formas, incluyendo el número y abundancia relativa de grupos funcionales, la variedad

de interacciones con los procesos ecológicos o la diferencia promedio entre especies en aspectos

relacionados con la función. El funcionamiento y la estabilidad de cualquier ecosistema son

posibles gradas a la compartimentalización de procesos llevados a cabo por diferentes poblaciones,

de tal manera que su coexistencia depende de que no haya sóbrelapamiento total de sus nichos

funcionales. De esta manera, una comunidad extremadamente dinámica facultará el sostenimiento

de un ecosistema funcionalmente estable [Fernández etal, 1999].

Por último, la problemática de la variedad de técnicas utilizadas en el estudio de las poblaciones

microbianas del suelo (FISH, extracción y reasociación de ADN, comparación de lípidos de

membrana [McCaig et al, 1999]; detección por variantes de PCR, RFLPs, ARDRA, clonación de

ARNr 16S, DGGE, TGGE [McCaig et a/, 1999]; RISA [Jensen etal, 1993]; SSCP [Lee et al, 1996],

entre otras), además de las modificaciones desarrolladas para cada aplicación en particular, hacen

que el proceso de encontrar patrones ecológicos para las especies microbianas, empleando las

diferentes investigaciones publicadas, sea una labor imposible; haciendo irrealizable el contraste de

resultados a nivel taxonómico.

Las posibilidades de evaluación de un gran número de genes en paralelo, han hecho que la

aplicación de microarreglos sea una herramienta cada vez mas utilizada y con grandes perspectivas

en el área ambiental; esto ha sido reconocido por diversos autores, entre ellos, Dennis et al.

(2003), quienes encontraron en la técnica, una solución para la deteccción de la expresión de

genes bacterianos en aguas residuales y otros sistemas complejos. Algunos investigadores, han

empleado esta herramienta para la exploración de vías bioquímicas aisladas en algunos ciclos de la

materia, tal es el caso de Loy et al (2002), quienes realizan una aproximación taxonómica por

medio de marcadores para ARNr, en la evaluación de linajes de reductores de sulfato. Otros, usan

la aproximación funcional en la evaluación de rutas parciales, como el caso de Wu et al (2001),

recurriendo a esta técnica para la estimación de la reducción de nitrito y la oxidación de metano y

amonio en ambientes marinos. Sin embargo, una aproximación funcional, que además faculte la

visualización y comprensión completas de la complejidad funcional del suelo, no ha sido abordada.

Adicional mente, se detectó la carencia de esquemas que permitieran visualizar las interaciones que

pueden generarse entre los ciclos biogeoquímicos, y que de esta manera, facilitan el análisis de los

resultados que pueden ser encontrados por medio de la aproximación experimental.

Con base en las anteriores premisas, se plantea el diseño de una metodología que permita a

futuro, el desarrollo y aplicación de una herramienta, utilizando marcadores moleculares específicos

para grupos funcionales microbianos, involucrados en los ciclos biogeoquímicos de ecosistemas

terrestres. Dada la complejidad del subsistema edáfico y el alto grado de incertidumbre existente al

momento de establecer la causalidad de la mayoría de los fenómenos ocurrentes en él [Burke et

al, 2003], el diseño de la metodología y la futura aplicación de una herramienta molecular,

generarán avances en el proceso de evaluación de la relación existente entre tales factores y la

dinámica funcional de los microorganismos telúricos.

OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Diseñar una metodología para la evaluación molecular de grupos funcionales

microbianos de relevancia en suelos.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

2.2.1.Realizar un modelo conceptual que permita la comprensión del funcionamiento e

interacciones existentes entre los grupos metabólicos microbianos del suelo.

2.2.2.Identificar con ayuda del modelo conceptual, aquellas enzimas que resulten más

representativas de los procesos funcionales seleccionados.

2.2.3.Determinar los marcadores moleculares apropiados para cada una de las enzimas

designadas.

2.2.4.Diseñar los oligonucleótidos necesarios en la construcción de las sondas de ADN para cada

marcador elegido.

MAMO CONCEPTUALLos microorganismos habitan prácticamente todas las regiones del planeta, desde los polos, en

ambientes bajo el punto de congelación y muy secos, hasta los trópicos con temperaturas altas y

con elevada precipitación pluvial. Su presencia y actividad son esenciales para la salud y

funcionamiento adecuado de todos los ecosistemas [Olalde & Aguilera, 1998].

3.1. BIODIVERSIDAD

Biodiversidad, es la variedad y variabilidad de todas las formas de vida, el complejo ecológico en el

cual están presentes, y los procesos de los que forman parte [Olalde & Aguilera, 1998]. En este

sentido, y en relación con los microorganismos, el suelo es un ecosistema de enorme riqueza

microbiana [Olalde & Aguilera, 1998]. El estudio de la diversidad de microorganismos en el suelo

es un reto formidable, en primer lugar, porque las definiciones clásicas de especie no se aplican a

los microorganismos (muchos no tienen ciclo sexual) y hay que ajustarlas: el aspecto morfológico

no es muy útil, debido a que morfológicamente muchos microorganismos distintos parecen

similares. De esta manera, se tiene que hacer uso de las características fisiológicas para definir

especies. En segundo lugar, la necesidad de mantener condiciones controladas, hace que los

microorganismos deban ser aislados y estudiados en el laboratorio; además del hecho de que un

mismo microorganismo puede comportarse de maneras muy distintas ante cambios ambientales

[Valencia & Peña, 2001].

La evaluación de la diversidad genética expresa el potencial de las capacidades metabólicas en un

ambiente, no obstante es más difícil de efectuar [Valencia & Peña, 2001], debido a que requiere

conocer el número de genomas distintos y el conjunto total de genes microbianos presentes en un

espacio/tiempo determinado. Una medición de la diversidad más operativa, es la diversidad

funcional, definida como el conjunto de capacidades metabólicas o procesos distintos presentes en

el suelo; es una información más gruesa que no repara en taxa y que no requiere graneles

conocimientos acerca de los microorganismos presentes y sus ciclos, pero que expresa las

capacidades metabólicas de éstos [Valencia & Peña, 2001].

3.2. GRUPOS FUNCIONALES Y DIVERSIDAD FUNCIONAL

Los pasos en la transformación individual de sustratos están asociados con grupos microbianos

meta bélicamente definidos (ej. denitrificantes, nitrificantes y fijadores de nitrógeno, etc.)

[Taroncher et al., 2003]. Diversos microorganismos pueden llevar a cabo un paso individual,

proveyendo un ensamblaje con redundancia de capacidades. Tales agrupamientos que realizan un

proceso bioquímico común, pueden ser definidos como un grupo funcional. Recientes estudios en

el área de diversidad microbiana, centrados sobre los genes de ARNr 16S y otros genes

funcionales, codificantes de enzimas responsables de transformaciones específicas, indican que los

grupos funcionales pueden ser inmensamente diversos [Taroncher etal, 2003].

A menudo, la clasificación funcional tiene dos objetivos distintos, uno de los cuales es investigar los

efectos de las especies sobre las propiedades del ecosistema (grupos funcionales de efecto) y otro

que examina la respuesta de las especies a cambios en el ambiente, tales como disturbios,

disponibilidad de recursos, o clima (grupos funcionales de respuesta) [Hooper etal., 2002].

Los organismos del suelo parecen tener un alto nivel de redundancia funcional [Wolters et al.,

2000]. Esto sugiere que los procesos que involucran la transferencia de nutrientes a través de la

esfera de nutrición del suelo están ampliamente distribuidos a través de la comunidad subterránea.

Las funciones llevadas a cabo por especies con actividades únicas sin embargo, son una excepción.

El ejemplo más notable es provisto por los pocos géneros de bacterias que llevan a cabo ciertas

transformaciones en el ciclo del nitrógeno (como nitrificación, denitrificación) [Wolters etal., 2000].

En forma similar, la habilidad para degradar substratos orgánicos recalcitrantes tales como lignina

o sustancias húmicas, está confinada a unos pocos géneros microbianos [Wolters et al., 2000].

Una gran acumulación de mantillo sobre la superficie del suelo debida a la pérdida de organismos

capaces de romper materiales recalcitrantes, puede alterar drásticamente la disponibilidad de

nutrientes para las plantas [Wolters etal., 2000].

3.3. CICLOS BIOGEOQUÍMICOS

Los organismos de la superficie y subterráneos, resultan críticos dentro de los ciclos

biogeoquímicos, pero aún existe un conocimiento limitado acerca de la manera como la biota que

vive bajo tierra y sus funciones, son dependientes de la biota existente en la superficie y viceversa.

El mantenimiento de la vida con cierto grado de equilibrio, depende de dos factores: el recambio

cíclico de elementos indispensables, fundamentalmente, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo y

azufre y el aporte constante de energía solar. A través del proceso fotosintético y la energía solar,

los productores primarios, extraen elementos del medio ambiente en forma de compuestos

inorgánicos y biosintetizan compuestos orgánicos, que son incorporados en células y tejidos. Estos

materiales orgánicos acumulados, representan de forma directa o indirecta la fuente de energía

para otros integrantes de las redes tróficas. Antes de que estos elementos puedan ser utilizados

nuevamente como alimento para los organismos fotosintéticos, deben volver a su estado

inorgánico [Sztern & Pravia, 1999]. Esta conversión del estado orgánico al inorgánico es conocida

como mineralización y se debe en gran parte a la descomposición de los restos vegetales y

animales, así como de los productos orgánicos de la excreción de estos últimos [Sztern & Pravia,

1999]. Es llevada a cabo por un grupo de microorganismos denominados genéricamente como

descomponedores. Se estima que aproximadamente el 90% del C02que se produce en la biosfera

se debe a la actividad metabólica de este grupo. La gran importancia de los microorganismos en el

proceso de mineralización es el resultado de tres factores [Sztern & Pravia, 1999]: su

omnipresencia en la biosfera, consecuencia de la facilidad de propagación de los organismos; su

elevada velocidad metabólica y de crecimiento, y la gran diversidad fisiológica que les confiere una

capacidad colectiva para degradar todos los compuestos orgánicos naturales que se pongan a su

alcance. Todas las sustancias orgánicas naturales, son descompuestas por al menos una población

microbiana, lo que explica la ausencia de materia orgánica inalterada en la biosfera cuando se

mantiene el equilibrio entre la velocidad de emisión de ésta, y la capacidad de transformación de

los descomponedores [Sztern & Pravia, 1999]. Sin embargo, cualquier especie microbiana en si

misma, es un agente limitado de mineralización, la gran versatilidad metabólica es consecuencia de

la acción conjunta de una gran diversidad de grupos fisiológicos [Coates et al., 2002].

Compuestos de Importancia Especial en el Ciclo del Carbono

Dentro del ciclo del carbono, los hongos juegan un papel fundamental, puesto que son unos de los

organismos responsables de transformar alrededor del 80% de la celulosa que se produce, la cual

es la mayor reserva de carbono existente y el polisacárido más abundante en la naturaleza, con

una producción que se estima en 1.4 billones de ton/año [Cabrera, 2000].

Entre los hongos, los basidiomicetos son comúnmente los recicladores dominantes de los residuos

de plantas, debido a que son importantes productores de enzimas modificadoras de lignina:

peroxidasas de lignina y manganeso, y lacasas [Thorn et al, 1996]. La degradación del

componente lignina en la materia orgánica es el paso más limitante para la descomposición

eficiente de la celulosa asociada. El conocimiento de la fisiología de la degradación de lignina por

los basidiomicetos, está limitada a unas pocas especies habitantes de leños; aquellos que causan la

pudrición blanca en la madera, son los más eficientes degradadores de lignina en la naturaleza

(Phanerochaete chrysosporium y Trametes versico/o/) [Thorn et al, 1996]. Otro compuesto

importante es la quitina, un polímero de N-acetilglucosamina, constituyente común de los

exoesqueletos de los artrópodos y que también está presente en las paredes celulares de algunos

hongos. La hidrólisis es usualmente mediada por enzimas extracelulares inducibles denominadas

quitinasas, encargadas de romper los enlaces beta entre carbonos 1-4 del carbohidrato [Stanier et

al, 1986].

Las sustancias húmicas son los materiales orgánicos naturales no vivos más extendidos y ubicuos

en medios acuáticos y terrestres y representan la principal fracción de materia orgánica del suelo

[Steffen et al, 2002]. Las sustancias húmicas comprenden una mezcla física y químicamente

heterogénea de compuestos biogénicos de peso molecular relativamente alto con una naturaleza

mixta, alifática y aromática [Steffen et al, 2002], La degradación microbiana de las sustancias

húmicas - particularmente de las de alto peso molecular, mitades aromáticas en AH (ácidos

húmicos) y humina—es una parte importante del retorno del humus y es de esta manera esencial

para el mantenimiento del ciclo del carbono global [Steffen et al, 2002]. Algunos de los hongos

basidiomicetos de la pudrición blanca, que colonizan madera, desintegran AH de alto peso

molecular formando AF (ácidos fúlvicos) de bajo peso molecular y dióxido de carbono. Se observó

correlación entre la actividad de las peroxidasas extracelulares y la degradación de AH, y una

peroxidasa de manganeso (MnP) que despolimerizaba y mineralizaba in vitro diferentes AH

[Steffen etal, 2002].

3.4. EVALUACIÓN DE SUELOS

Todos los parámetros físicos y químicos usados en el conocimiento de la textura y calidad del

suelo, tales como densidad de poros, capacidad de infiltración, materia orgánica, pH, conductividad

eléctrica y fertilidad, pueden ser medidos por los laboratorios de suelo de manera rutinaria. Sin

embargo, los parámetros biológicos tales como biomasa microbiana, nitrógeno potencialmente

mineralizable y respiración, son indicadores recientes y un poco más problemáticos. Existen tres

vías básicas para acceder a la biomasa microbiana del suelo: su conteo a través de microscopio, la

medición de un indicador de actividad como el C02, o la medición de partes de microorganismos,

tales como membranas. Generalmente estos métodos son indicadores muy amplios de la biomasa

microbiana o de su actividad. Últimamente, se han diseñado métodos moleculares como

indicadores de biomasa microbiana y/o diversidad y composición de especies, tales como AFLPs y

RISA entre otros [Gregory etal., 2003; Peplies etal., 2003].

La aplicación de técnicas moleculares se ha incrementado durante los últimos años [Morris et al.,

2002], debido a que éstas permiten un mejor acceso a las comunidades. Sin embargo, no se han

desarrollado herramientas que permitan analizar conjuntamente diversas rutas metabólicas.

Algunos autores [Borneman & Triplett, 1997], aplicaron la técnica RISA para determinar los efectos

de la deforestación en la Amazonia, lo cual demostró un impacto profundo, cuantitativo de ésta

sobre la diversidad bacteriana del suelo. Este trabajo efectuado para acceder a los efectos del

manejo del suelo sobre la diversidad microbiana en forma independiente de cultivo, estuvo seguido

por otras investigaciones, como aquella realizada por Buckley et al. [1998], quienes en un estudio

a largo plazo realizado en la estación biológica Kellogg, encontraron que la diversidad de los

campos cultivados sin otra intervención, difirió poco de aquella que sí sufrió regímenes de manejo

agrícola; aún así, la diversidad bacteriana de los suelos con manejo fue significativamente diferente

de aquella de suelos que nunca habían sido cultivados. El estudio de Taroncher et al. [2003],

utilizando un microarreglo de oligonucleótidos para analizar la diversidad funcional de genes

implicados en el ciclo del nitrógeno en sedimentos de río (sistema de bahías de Shesapeake),

resulta ser pionero en el tema. Una investigación centrada en la caracterización de una comunidad

microbiana dependiente de nitrato, utilizando al gen narG como marcador funcional, fue llevada a

cabo por Gregory et al. [2003]. También, la utilización de DGGE en el trabajo de Ovreas et al.

[1998], permitió determinar cambios en la comunidad microbiana en un suelo sometido a actividad

agrícola en Krohnestykket, Noruega. No obstante, para ejecutar análisis de este tipo de manera

masiva, es necesario determinar aquellos marcadores moleculares que puedan resultar mas

adecuados.

Los marcadores moleculares (fragmentos o porciones de ADN, detectados de forma directa o

mediante su expresión sea ARNm o proteína), pueden asociarse a características fenotípicas

deseables en el organismo de interés. Una gran variedad de estos marcadores ha sido aplicada

para el estudio de las comunidades de microorganismos, tales como los genes para proteínas del

choque térmico, glutamina sintetasa, ATPasa, topoisomerasas, genes para ARNr, muy útiles en la

caracterización de tales comunidades. Para los microorganismos del suelo, han sido utilizados

marcadores relacionados con el metabolismo del nitrógeno, tales como genes para la enzima

nitrogenasa, óxido nitroso reductasa y nitrito reductasa. Asimismo, se han aplicado genes que

intervienen en la oxidación de metano o de amonio entre otros [Kent & Triplett, 2002], a través de

técnicas que aprovechan la capacidad de hibridización existente entre cadenas de nucleótidos,

tales como los arreglos de ADN.

3.5. ARREGLOS DE ADN Y EL ACCESO A LA BIODIVERSIDAD

Los microarreglos de ADN son una herramienta poderosa para el análisis paralelo de muchos

genes, basados en el fenómeno de hibridización ADN-ADN (Figura 1) [Kent & Triplett, 2002]. Los

arreglos de ácidos nucleicos o chips de ADN, proveen oportunidades para la detección múltiple de

ácidos nucleicos. Originalmente diseñados para secuenciación a gran escala, diagnóstico clínico y

análisis genético [Small et al, 2001], los arreglos tienen un enorme potencial para el análisis de

comunidades microbianas, detección de patógenos y monitoreo de miles de genes [Dennis et al,

2003].

Muestra bacteriana de referencia Muestra bacteriana de prueba

.*$§&>. v

/^DNc marcado mezclado e hibridizado al microarreglo

ADNc se une al gen correspondiente

F • • ■:■-© 'ó- ' • --".y.-'-7$Expresado solo Btpnesado en Solo en No

Figura 1. Esquema general de la realización de un microarreglo, Lucchini et al., [2001].

Las aproximaciones comunes para la fabricación y análisis de arreglos, incluyen sondas de ADNc y

oligonucleótidos fijos sobre un elemento plano, geles, o láminas de vidrio [Small etal, 2001]. Solo

recientemente, la tecnología del arreglo se ha extendido al área ambiental, y aunque tiene un gran

potencial para caracterizar las comunidades microbianas y su función en el ambiente [Taroncher et

al., 2003], su uso es limitado por el costo de los equipos para la generación de imágenes e

impresión del arreglo. Las aplicaciones ambientales de esta tecnología incluyen los estudios de

expresión genética, la identificación y genotipificación de bacterias basada sobre similitudes ADN-

ADN, genética de poblaciones y detección de genes funcionales [Taroncher et al, 2003]. Ellos

pueden ser usados para identificar y cuantificar los genes microbianos involucrados en las

transformaciones biogeoquímicas del ambiente. Basados en el principio de hibridización

mencionado, las sondas son diseñadas para una multiplicidad de blancos, incluyendo diferentes

genes y variantes del mismo gen, que llevan a la determinación de la presencia y abundancia de

genes específicos. Las aplicaciones más comunes de los microarreglos utilizan oligonucleótidos de

ADN de diferentes tamaños, representando la secuencia parcial o total de los genes específicos. En

el estudio realizado por Taroncher et al. [2003], los autores detectaron múltiples variantes del

mismo gen optimizando el proceso de diseño de la prueba y las condiciones de hibridización con

22

oligonucleótidos de 70-meros; llevaron a cabo ensayos con los genes representativos de las

familias de genes para la nitrogenasa, la nitrito reductasa desasimilativa y la amonio

monooxigenasa, y no observaron hibridización cruzada entre las tres familias de genes o entre los

tres subgrupos de genes de la nitrito reductasa (nirS, nirK, y nirK). Ahora, es posible diseñar un

microarreglo de oligonucleótidos que tenga en cuenta una variedad de genes involucrados en

diferentes vías geoquímicamente relevantes en paralelo y analizarlos simultáneamente en un

estudio completo.

3.6. CONCEPTOS PARA EL DISEÑO DE UN MICROARREGLO

Los primeros microarreglos de oligonucleótidos contenían cientos de sondas distintas por gen, en

orden a maximizar la sensibilidad y especificidad de detección [Norton et al., 2002]. No obstante,

con el paso de los años, el número de oligos utilizado por gen ha decrecido, debido parcialmente al

incremento en la cantidad de información que se ha hecho disponible en las bases de datos; así

mismo, los algoritmos de selección de sondas han mejorado, con lo cual, el número requerido de

oligos ha disminuido y la tendencia ha sido la de maximizar el número de genes que son ensayados

simultáneamente sobre un microarreglo, más que la colocación indiscriminada de todo tipo de

secuencias sobre él [Antipova et al., 2002]. Debido a esta necesidad, se han incrementado los

métodos utilizados para reducir el número de sondas por gen, mientras se maximiza la sensibilidad

y especificidad de estos grupos reducidos de oligos [Antipova et al., 2002].

Tampoco se consideró la utilización de "todas" las variantes posibles de una secuencia como una

orientación adecuada, debido a que esto hace que la aproximación sea más de tipo taxonómico

que funcional. El objetivo primordial es llegar a la detección de la actividad efectiva de una gran

variedad de organismos en el suelo para una función dada, mas no el hallazgo de una especie

particular, aún cuando esta información pueda ser obtenida. Las variaciones de secuencia que

puedan detectarse por medio del uso de las sondas diseñadas no se conoce y solo podrá evaluarse

una vez se realicen estudios de campo. Sin embargo, en otros estudios, se ha determinado que

una sonda degenerada de 70 nucleótidos puede detectar genes con quienes comparta hasta un

87% de identidad [Tamaru et al., 2000], lo cual implica una variación de 9 nucleótidos. El hecho de

que las sondas proceden de secuencias involucradas en procesos de gran importancia para la

supervivencia de los microorganismos, es una circunstancia que podría favorecer su escasa

variabilidad.

Igualmente, el microarreglo puede ser diseñado de una manera tal, que los genes puedan ser

dispuestos por grupo funcional, facilitando la visualización de la ocurrencia de las reacciones

aisladas, en conjunto dentro de un ciclo, o a nivel integrado de todos los ciclos. El microarreglo

permite detectar puntos de ruptura de los procesos y correlacionarlos con parámetros ambientales

para establecer sus causas. Igualmente, poner en evidencia las porciones de un ciclo que pueden

resultar más susceptibles de ser afectadas, ya sea porque el sustrato enzimático no está presente

en concentraciones adecuadas, por la carencia de factores inductores o porque los organismos

encargados de su ejecución se encuentran inactivos o pueden haber sido eliminados del medio. Sin

embargo, es necesario precisar que como otro tipo de aproximaciones, ésta permite obtener

resultados comprobatorios mas no reprobatorios, es decir la señal de hibridización puede

manifestar la ocurrencia del proceso enzimático con un nivel de significancia dado, pero la ausencia

de señal no permite aseverar que la reacción no se está produciendo.

Un aspecto que debe ser considerado para el diseño y evaluación del microarreglo, es el número

de copias de un gen que pueden estar presentes en una célula en un momento dado, puesto que

este factor incide en la intensidad de la señal registrada [Farrelly et ai, 1995]. Por ejemplo, en

Nitrosomonas europaea, se ha encontrado que los genes amoC, amoA y amoB (amonio

monooxígenasa), que son adyacentes, se presentan en dos copias [Hirota etaí, 2000]. En el caso

de los genes para la denitrificación y la fijación de nitrógeno se reporta un bajo número de copias.

En tanto que los genes para la hidroxilamina oxidoreductasa {hao), presentan números variables

de éstas. Nuevamente en N. europaea se han reportado 3 copias de hao, que muestran tan solo 1

pb de diferencia en sus 1701 pb [Hommes et al, 2001]. Este hecho hace pensar en la necesidad

del cálculo de factores de corrección para tal evento. La dificultad que existe en el presente, es que

aun cuando para algunos grupos taxonómicos ya se conoce información acerca del número de

copias, esta no es la regla. Se sabe que este número puede variar entre especies y esto hace casi

imposible el conocimiento total a mediano plazo.

La planificación de un microarreglo va más allá del proceso de laboratorio, inicia con una estrategia

que debe dar respuesta a preguntas como: ¿Cuál será el alcance del microarreglo?, ¿cuál será la

forma de extracción de ARN que maximice la información?, ¿qué limitaciones tiene el proceso de

extracción?, ¿cuales restricciones técnicas y financieras existen?, ¿cuántas réplicas de la muestra se

van a tener en cuenta? (normalmente se sugieren 3), ¿cuál va a ser el número de copias de la

sonda?, etc. [Peng & Stromberg, en línea].

Las principales fuentes de variabilidad en el diseño del arreglo son: Las interacciones no específicas

debidas a complejidades combinatoriales en la población blanco, la equivalencia termodinámica de

las sondas, y la preparación y amplificación del ADN prueba, todas las cuales fueron tenidas en

cuenta para el establecimiento de la población final de oligonucleótidos [Taroncher etal, 2003].

Entre las diferentes fuentes de error previas al desarrollo del microarreglo se encuentran:

a. La técnica de extracción de ADN, puesto que algunas técnicas extraen una menor concentración

de ADN fúngico frente al bacteriano, y existen probabilidades de coamplificacion de otros

organismos eucariotes como algas, plantas y nemátodos, la presencia de compuestos húmicos,

etc. Hoy día existen diversos métodos que han mostrado eficiencia en la recuperación de ADN

de buena calidad, especialmente en suelos con altos contenidos de ácidos húmicos y taninos,

como los tropicales [Nannipieri et al., 2003].

b. El número de ciclos considerados para la amplificación por PCR puede ser problemático. Soares

et al [1997], recomiendan intervalos entre 22 y 25 ciclos para evitar el incremento en la

proporción de secuencias quiméricas.

c. Los cebadores (primers) empleados en la amplificación del ADN microbiano a partir de suelo

deben ser lo suficientemente sensibles como para amplificar todas las secuencias posibles

[Soares et al., 1997]. Los cebadores universales pueden ofrecer una buena solución y deben

complementarse con aquellos específicos para el gen de interés (ver Anexo 2), para aumentar

las posibilidades de obtener resultados representativos.

3.7. BIOINFORMÁTICA

La bioinformática se encuentra en la intersección entre las aplicaciones de la información y las

ciencias de la vida. Comprende la investigación y el desarrollo de sistemas útiles para entender el

flujo de información desde los genes a las estructuras moleculares, su función bioquímica, su

conducta biológica y, finalmente, su influencia [Febles & González, 2002]. Se ocupa de la utilización

y almacenamiento de grandes cantidades de información biológica, mediante el uso de los

computadores para el análisis de la datos biológicos, los análisis de correlación, la extracción y el

procesamiento de la información [Febles & González, 2002].

La bioinformática hace uso de lo que se conoce como minería de datos, la cual ha sido definida

como "la exploración y análisis, por medios automáticos o semi-automáticos, de grandes

cantidades de datos en orden a descubrir patrones completos y reglas". El objetivo final es

convertir datos en información y esta información en conocimiento [Basset et al, 1999].

Existen dos aproximaciones a la minería de datos, la primera comprende la prueba de hipótesis con

el descubrimiento de conocimiento, en la cual la inducción o perturbación de un proceso biológico

llevará a los resultados predichos, aunque a menudo también revela nuevos fenómenos; y una

aproximación por análisis exploratorio, en la cual los datos son llevados a "hablar de si mismos"

después de una serie de procedimientos que pueden incluir la estadística, el reconocimiento de

patrones, la clasificación y la predicción [Basset et al, 1999; Febles & González, 2002]. En este

último aspecto, la minería de datos aplica una dinámica que se mueve en sentido contrario al

método científico tradicional, aquí no se formula una hipótesis para luego diseñar un experimento y

cuestionar las premisas, por el contrario, se captan y procesan los datos con la esperanza de que

de ellos surja una hipótesis apropiada. Se desea que los datos describan o indiquen el porqué

presentan determinada configuración y comportamiento [Febles & González, 2002].

Las técnicas de minería de datos no pueden utilizarse para confirmar o rechazar hipótesis, porque

puede conducir a errores. Su función es tratar de explorar datos, darles sentido, convertir un

volumen de datos, que poco o nada aportan a la descripción, en información para interpretar un

fenómeno o para adoptar decisiones [Febles & González, 2002].

Herramientas Bioinformáticas

Las bases de datos de secuencias, constituyen el sustrato de todas las herramientas

bioinformáticas usadas en análisis de secuencias. El mayor motor para el desarrollo de la

bioinformática ha sido la biología molecular, y en concreto la disponibilidad de secuencias de ADN

y proteína. Las herramientas bioinformáticas más usadas se han desarrollado como una respuesta

a las necesidades de información sobre las secuencias, aprovechando el conocimiento previo

almacenado en las bases de datos. Para secuencias de nucleótidos, existen tres bases de datos

principales que colaboran entre sí, cada una colecta y procesa las nuevas secuencias e información

biológica relevante que hubiera podido ser consignada por los científicos de la región, cada 24

horas. Por tal motivo, presentan un contenido idéntico, excepto para cualquier secuencia que haya

sido añadida en el último día. La base de datos de nucleótidos, presenta información de secuencias

del GenBank, EMBL, y DDBJ. Cada entrada en la base tiene un identificador único, que es una

cadena de letras y/o números. Si bien existe gran cantidad de iniciativas que ha producido un

enorme número de bases de datos más o menos especializadas con distintos contenidos, estos

servidores recopilan las secuencias de ADN que se han ido depositando desde su primera versión,

que para el EMBL fue el año 1982 existiendo por aquel entonces 568 secuencias [Dopazo &

Valencia, 2001].

En lo referente a la información de proteínas, el PIR es la base de secuencias moleculares más

antigua (1984); sus entradas surgieron a partir de esfuerzos de colaboración entre instituciones y

son organizadas biológicamente usando sus relaciones estructurales, funcionales o evolutivas. Las

entradas incluyen secuencias de aminoácidos y en muchos casos, las anotaciones posteriores

incluyen citaciones, referencias a la base de datos de nucleótidos, información genética común,

etc. PIR-NREF es una base de datos de referencia, no redundante generada al interior de PIR. Ha

sido diseñada para proveer una colección completa de todos los datos de secuencias de proteína,

de acuerdo con los proyectos de secuenciación de genomas actuales. Contiene todos los atributos

de las fuentes, que corresponden a secuencias en PIR-PSD, SwissProt, TrEMBL, RefSeq, GenPept y

PDB y ofrece una redundancia mínima. Las secuencias idénticas, del mismo organismo reportadas

en diferentes bases de datos, son presentadas como una entrada NREF única, con IDs de proteína

y nombres de cada base de datos, además de la secuencia, taxonomía y bibliografía. La base de

datos es reevaluada cada dos semanas y la versión 1.46 de Mayo 6 de 2004 contenía 1'634.871

entradas, en su mayoría procedentes de TrEMBL y GenPept fhttp://www-

nbrf.aeoraetown.edu/pirwww/search/pirnref.shtmn.

La búsqueda de las secuencias puede ser ejecutada a partir de los servidores ubicados en las

páginas de los proveedores mencionados, o puede ser realizada mediante una estrategia más

flexible y completa como es el SRS o Sequence Retrieval System creado por Lion Bioscience. El SRS

es un potente gestor y es la herramienta más utilizada para la búsqueda de información, contiene

elementos de aproximadamente 180 bases de datos diferentes que incluyen bibliografía

(MEDLINE), secuencias, motivos, señales, información adicional (taxonomía, códigos genéticos,

etc.,) estructuras de proteínas, mapas genéticos y cromosómicos, mutaciones, mutaciones

específicas de locus, rutas metabólicas y resultados de búsquedas (alineamientos, BLAST, etc.),

entre otras. Toda esta información se puede consultar mediante preguntas con expresiones lógicas

que pueden tener la complejidad deseada. Las consultas se pueden hacer sobre los distintos

campos de las diferentes bases de datos y habitualmente implican el uso de palabras clave que

definen los intereses de la búsqueda [Dopazo & Valencia, 2001]. El objetivo del SRS es

proporcionar un acceso eficiente a las distintas bases de datos utilizando cualquier formato

disponible. SRS permite dos modos de trabajo, uno con un interfaz gráfica de usuario, sencillo de

usar y otro basado en la línea de comandos, orientado al especialista y a su uso por medio de

programas auxiliares.

El servidor presenta una pantalla inicial con varias opciones que proporcionan ayuda e información

adicional, y un botón de entrada para iniciar una sesión de trabajo. SRS permite buscar en más de

una base de datos al mismo tiempo, de una manera sencilla o detallada. Para este último caso

existe un formulario en donde se indican los criterios de búsqueda deseados, la manera como

deben combinarse y el modo de visualizar los resultados. Una característica interesante es que se

puede trabajar sobre algunas o todas las secuencias mostradas indicando "todas menos las

elegidas" o "todas las elegidas", para aplicar a un conjunto de secuencias operaciones como

guardar en disco duro el listado de las entradas seleccionadas o ver el listado de esas secuencias.

Otra propiedad importante de SRS, es que establece enlaces entre la información almacenada en

todas las bases de datos, con lo cual se puede saltar a la entrada correspondiente para acceder a

información relativa, sin necesidad de realizar nuevas búsquedas en cada base de datos

rhttp://www.eez.csic.es/cursos/bioinfP0/cap2.html. ir

Una de las bases de datos especializada, y que se centra en la búsqueda de particularidades en las

secuencias de aminoácidos es ProDom, contiene información acerca de las familias de proteína,

obtenida por análisis automatizado de las secuencias disponibles. Es útil para el análisis de los

arreglos de dominios de familias protéicas complejas y ayuda a analizar relaciones de homología en

proteínas modulares. Presenta una interfaz gráfica de fácil navegación entre arreglos esquemáticos

de dominios, alineamientos múltiples, árboles filogenéticos, entradas de SwissProt, patrones de

Prosite, familias de pFam y estructuras 3D de PDB. Las nuevas secuencias pueden ser buscadas

contra ProDom, alineadas con las familias de dominios existentes y modeladas sobre las bases de

dominios homólogos en PDB [Corpet et a/.,2000].

La aspiración al momento de realizar alineamientos entre secuencias, es que la función de puntaje

refleje de manera más o menos fiel, los eventos biológicos que les dieron origen; de tal manera,

que si los puntajes son optimizados, se produzca un alineamiento biológicamente correcto. Los

programas de alineamiento pueden dividirse en dos categorías principales: los métodos que

alinean secuencias usando la longitud total (globales) y los métodos que alinean solamente

regiones de alta similitud (locales). Tradicionalmente el método de alineamiento global más común

es Clustal, que es más comúnmente utilizado cuando las secuencias presentan longitudes similares.

La única forma de conocer la calidad del alineamiento sin embargo, es comparando las salidas de

diferentes programas [Lassmann & Sonnhammer, 2002].

ClustalW es un programa diseñado para el alineamiento pareado y múltiple de secuencias tanto de

ADN como de proteína. Trabaja en tres pasos principales: 1) Alineando todos los pares de

secuencias de manera separada con el fin de calcular una matriz de distancias que indique la

divergencia existente entre cada par de secuencias; 2) Calculando un árbol guía a partir de la

matriz de distancias y 3) Alineando progresivamente las secuencias de acuerdo al orden de

ramificación del árbol guía [Thompson et a!., 2003]. ClustalX (1.8) es la interface gráfica para

ClustalW, en donde el esquema de color permite determinar la presencia de elementos

conservados en el alineamiento. El programa utiliza el método de NJ (Neighbour Joining) para

calcular las distancias (porcentaje de divergencia) entre todos los pares de secuencias del

alineamiento, y luego vuelve a aplicar el método a la matriz de distancias. Clustal provee un

indicador de la calidad del alineamiento brindando una gráfica de puntaje de conservación para

cada columna, el cual se incrementa con una mayor conservación. Se espera que existan residuos

de bajo puntaje a una frecuencia moderada en todas las secuencias, debido a la divergencia del

proceso natural de evolución. NJPLOT es un programa de diagramación de árboles filogenéticos

que viene incluido con ClustalW, permite la visualización de los árboles iniciales formulados por

este programa durante las primeras etapas de comparación pareada de secuencias, y facilita su

utilización en la discriminación de grupos de secuencias [Perriére & Gouy, 1996].

Por otra parte, T-coffee (Tree-based Consistency Objective function for alignment Evaluation) un

método que adicionalmente utiliza el alineamiento local, provee un medio simple y accequible de

generar alineamientos múltiples y que admite fuentes heterogéneas de datos. Estos pueden ser el

resultado de alineamientos pareados locales y globales, almacenados en una librería.

Adicionalmente, usa una estrategia progresiva alineando primero los mejores datos de la librería de

manera similar a la utilizada en ClustalX. Es un método un poco más lento, pero incrementa la

precisión del alineamiento [Notredame etal, 2000].

Con el fin de evaluar la especificidad de cadenas de nucleótidos o aminoácidos frente a todas las

secuencias reportadas en una base de datos, puede utilizarse un método de alineamiento como

Blast. Blast es el programa de alineamiento de secuencias más rápido, debido a lo cual

compromente algún grado de sensibilidad. El grupo de subprogramas incluye: BLASTN el cual

realiza una búsqueda de un nucleótido contra una base de datos de secuencias nucleotídicas;

BLASTP que compara una secuencia de aminoácidos contra una base de datos de secuencias

protéicas; BLASTX que compara los productos de la traducción conceptual de los 6 marcos de

lectura de una secuencia de nucleótidos (ambas cadenas) contra una base de datos de secuencias

protéicas; TBLASTN que realiza una búsqueda de una secuencia de proteina contra una base de

datos de secuencias nucleotídicas traducidas en sus 6 marcos de lectura (ambas cadenas) y

TBLASTX que compara las traducciones de los 6 marcos de lectura de una secuencia de nucleótidos

contra traducciones en 6 marcos de lectura de una base de datos de secuencias nucleotídicas

rwww.ncbi.nlm.nih.oov/BLASTI.

Para la manipulación de alineamientos se han diseñado una gran variedad de programas

disponibles vía web, muchos de ellos de forma gratuita o a manera de Trial. Bioedit V5.0 es un

editor de secuencias biológicas de interfaz gráfica, escrito en lenguaje C++ que corre sobre la

plataforma Windows. Provee las funciones básicas para la edición, alineamiento, manipulación y

análisis de secuencias de ácidos nucleicos y proteína. Tiene una capacidad para 20000 secuencias y

provee un gran contenido de información que incluye el sombreado dinámico de posiciones de

alineamiento, perfiles de hidrofobicidad/hidrofilicidad, graficación 2D, adición de comentarios, entre

otra. Otro programa que ofrece utilidades para análisis y edición de alineamientos es GeneDoc,

diseñado para ayudar a los usuarios a mejorar sus alineamientos y sobrepasar las limitaciones mas

comunes en los programas de alineamiento múltiple. Ayuda en la extracción de información para

ser usada en la planeación e interpretación del trabajo experimental. Permite hacer una buena

anotación de los alineamientos, remoción de secuencias, sombreado y definición de características

estructurales de los mismos. http://www.concentric.net/~Ketchup/Qenedoc.shtml.

GeneRunner 3.05., es un programa de análisis simple en biología molecular; permite el ingreso de

secuencias de ADN o proteína de manera manual o a partir de bases de datos como el GenBank.

Puede realizar manipulaciones estándar de datos de secuencia como: Búsqueda de secuencias de

ADN para sitios de restricción; búsqueda de secuencias de proteína para sitios de clivaje de

peptidasas; traducción de ADN en secuencias de proteína y búsqueda de marcos abiertos de

lectura; diseño de primers para PCR y secuenciación y alineamientos múltiples de secuencias. I_a

herramienta OligoAnalysis utilizada en la investigación, faculta al investigador a ingresar un

oligonucleótido de manera directa o seleccionarlo a partir de una secuencia. Faculta el calcular las

principales características de un oligo como, Tm, %GC, estructura secundaria, etc. Adicionalmente

los resultados obtenidos pueden ser impresos de una manera tal, que pueden ser fácilmente

incluidos en informes y presentaciones .

METODOLOGÍA4.1. LA CONCEPCIÓN HOLÍSTICA DE LOS CICLOS BIOGEOQUÍMICOS

Durante la primera etapa del diseño de la metodología, se llevó a cabo la búsqueda de información

referente a los diferentes ciclos biogeoquímicos, considerados claves en el reciclaje de la materia

orgánica y el sostenimiento de la dinámica de nutrientes en el subsistema suelo. Se analizaron los

diferentes componentes de los ciclos y las reacciones bioquímicas implicadas. Con base en la

información disponible, se generó un modelo conceptual en el que se involucraron los diferentes

procesos realizados por grupos funcionales microbianos conocidos, y se visualizaron las

interacciones existentes entre ellos. De igual manera, partiendo de dicho modelo se establecieron

las enzimas propias de cada uno de los procesos, que pudieran ser útiles como marcadores, con

ayuda de los siguientes preceptos:

❖ Están involucradas en la ocurrencia de los ciclos biogeoquímicos en los suelos.

❖ Permiten un seguimiento de procesos intermedios del ciclo, es decir, que son un factor

primordial en pasos críticos dentro de cada uno de ellos.

❖ Los productos enzimáticos están presentes siempre para el mismo proceso y son

propios de éste (especificidad de acción: un marcador - un proceso).

❖ Su actividad se encuentra asociada a grupos funcionales específicos y no es de

distribución generalizada.

❖ Existen suficientes secuencias reportadas en las bases de datos.

4.2. OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE DATOS MOLECULARES

En una fase consecutiva, se efectuó la búsqueda de las secuencias de ADN y proteína reportadas a

nivel mundial para cada una de las enzimas elegidas, a través de la exploración en las bases de

32

datos GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), EMBL (European Molecular Biology Laboratory;

http://www.embl-heidelberQ.de’> y DDBJ (DNA Data Bank of Japan; http://www.ddbi.niQ.ac.ipV a

través del SRS de Lion Bioscience (Sequence Retrieval System; http://srs.im.ac.cn/srs71bin/coi-

bin/waetz?-paae+srsq2+-noSession) ubicado en el Instituto de Microbiología de la Academia China

de Ciencias y PIR NREF (Non-Redundant Reference Protein Database; http://www-

nbrf.qeoraetown.edu/pirwww/search/pirnref.shtml) (miembro del consorcio Uniprot desde el

2002), respectivamente.

Adicionalmente la pre-existencia de dominios fue establecida por medio de la búsqueda en la base

ProDom (http://protein.toulouse.inra.fr/pnodom/current/html/form.Dho). estableciendose que a

pesar de que existieran reportes para las enzimas, se continuaría su aplicación en las etapas

subsecuentes de la investigación.

Los datos a utilizar fueron determinados con base en los siguientes criterios:

♦ Seleccionar aquellas secuencias relacionadas con microorganismos terrestres o de suelos

inundados, observando los campos de descripción para las secuencias reportadas.

♦ No tener en cuenta secuencias STS y secuencias de elementos en Cis.

La información seleccionada, recopilada y depurada fue catalogada de acuerdo a criterios como

número de accesión, longitud, tipo de molécula (ADN o proteína), organismo, etc. y organizada en

una base de datos Local, la cual se denominó BIOPROC_SUELOS, de forma manual y con base en

el formato de la Tabla 1:

Tabla 1. Formato de ingreso de información a la base de datos Bioproc_Suelos.

CAMPO EJEMPLO

PROCESO REALIZADO Celulólisis

GRUPO ENZIMÁTICO B-glucosidasas

GEN glu

# ACCESION AB088351

SECUENCIA ADN aataacacttagcaagtaaggctgaacttaagcttgcggtcctggttagcaacgccga

agtacttctcgacctcggtggtttgggcaggtgtgtcgaaagcagtgaaccagaaacc

actggcatccttctgctgccagagccagcatccaacattgttgtagaactgctgcagact

ggcggtcgtggcagcagccttctggtagttgggtcccttggtaggccagccggtctcac

caacccagacagtagccttg

CAMPO EJEMPLO

SECUENCIA PROTEINA mkffsttetlavalmmtgeavagtykgfsmganradgvckweadwkkdfqaiksw

nkalvkavpaakatgmkilvgiwstddahfgrdkaallkaikqhgtgwiaaisvgsedl

yrkdispqklaqqiydvrgmvhqynkalkvghtdtwtawvdgtndwtkacdiaitn

gfpywqgvpikdalrlktfqnsywnvkkhvqavnskatvwvgetgwptkgpnyqk

aaattaslqqfynnvgcwlwqqkdasgfw

# LOCUS (GenBank reportado en PIR) >BAC66096

DESCRIPCION DEL GEN rga genes for putative beta-l,3-glucosidase, putative

rhamnogalacturonan acetyltransferase, complete cds

ORGANISMO Gibberella zeae

LONGITUD (#bases) 3411

TIPO DE SECUENCIA complete cds

OTROS The trichothecene biosynthesis gene cluster of Fusarium

graminearum F15 contains a limited number of essential

pathway genes and expressed non-essential genes

DOMINIO Eukarya

RENO Fungi

DIVISION Ascomycota

SUBDIVISION Pezizomycotina

CLASE Sordariomycetes

SUBCLASE Hypocreomycetidae

ORDEN Hypocreales

FAMILIA Nectriaceae

GENERO Gibberella

a. Los campos relacionados con la clasificación taxonómica (de Dominio a Género), fueron

utilizados con el fin de generar una organización jerárquica, relacionada con los campos Gen y

Grupo enzimático, por medio de una herramienta de filtrado en el manejador de bases de datos

MySQL.

Por ejemplo, para el Gen [lac] mostrar todos los datos por debajo del nivel taxonómico de

la Subdivisión Homobasidiomycota.

b. Con base en dicha jerarquización, los campos correspondientes a Accesión o Locus fueron

empleados en la generación de archivos de texto (*.txt) para ADN y Proteína, que contenían las

secuencias respectivas. Tales archivos fueron formateados utilizando un procesador de texto.

Ejemplo: "Secuencias de ADN para el gen lac, Fungi-Basidiomycota-Homobasidiomycota"

>AJ420176cactggcatgggtttttccagagaggtcccaattgggcggatggtcctgttttcgtcacacagtgcccgatcgctagcggatactcgtttctata

cgacttccgagttcctggtcaggctggtaggtcgcgtctttctccctttgtttaatgttcgtgatgctgaggatccacatcctagggacgttctggt

accacagtc

>AJ420175cactggcacgggttcttccaacatggtaccaactgggccgatggcgccgccttcgtgaaccagtgccctatcgctactggcaactcgttcctgt

acgacttcggcgtcccggatcaagcgggtaagtcctacagcaccaatgtattatcctcgctgctcacgtgtgtacagggacgttctggtacca

cagtc

>X52134

tatgcacactttccttcgctccacggcactcgttgtggcaggcctgtctgcccgcgcccttgccagcattgggcccgttaccgactttcacatcgt

caacgccgccgtctctcccgatggtttctctcgccaggctgtcctggctgagggtgtcttccctggcccgctcatcgccggcaacaaggtactcc

atttctctctcatccccgggatatgcgctgacggtcggcacagggcgacaatttccagatcaat

Los archivos de texto generados para ADN y Proteína, fueron empleados para llevar a cabo los

alineamientos múltiples, cuya finalidad fue la de determinar secuencias únicas y conservadas, con

la utilización de los programas CLUSTAL X [Thompson et al., 2003] (Figura 2) y TCOFFEE (versión

GNU-Linux) [Notredame etal, 2000].

File EdS Alignment Trees Cotors Quality Help

¡Múltiple Alignment Mode Font Size:¡10

_ Ai

A

1 CAA931502 CAD126S93 AAF701804 AAF375805 AALS78546 BAA029187 BAC452518 BAB168909 BAA34922

10 AAB7091711 BAA92251

ruler

—BFSÜHSBHII®3SLIS«£

KDPKRH5

~Si®Rí®KQfSpHlB|5p¡^£^jgTlST8AREM(DNGQ£NVí-----^1'DPpR^^SMPÍáRHKRuA^A^ftWP

1 ....... 1 0 ......... 20......... 3 0 .........4 0 ......... 5 0 .....

File D:\DocumentosVTesis\Escritos\genchiAbacteria.aln loaded.

ñgura 2. Salida del programa Clusta IX.

Se ensayaron diferentes combinaciones de parámetros, cuyo objetivo fue el obtener buenos

alineamientos; para tal procedimiento se utilizaron archivos por lotes *.BAT, con la finalidad de

acceder vía comando al panel de control de ClustalX y ejecutar simultáneamente múltiples

ventanas de alineamiento.

Para el alineamiento de las secuencias de ADN se utilizaron los siguientes parámetros:

♦ Penalización por apertura de espacios (0-100) de 80, de extensión 70, retraso por divergencia

40%, peso de transición 0.5. También se utilizaron los parámetros por defecto del programa

(15,6.66, 30% y 0.5, respectivamente).

Para los alineamientos de secuencias protéicas, los parámetros usados fueron: Penalización residuo

específica, penalización por residuos hidrofílicos (GPSNDQEKR), separación de gaps (0-100) de 4,

no separación de espacios terminales, y se variaron las siguientes condiciones:

❖ para una matriz PAM40 la penalización por apertura de espacios (0-100) de 80, de

extensión 70, retardo por divergencia de 40%.

❖ Para PAM120 penalización por apertura de espacios (0-100) de 50, de extensión 50,

retardo por divergencia de 40%.

❖ Para PAM350, por defecto, penalización por apertura de espacios (0-100) de 10,

extensión 0.2, retardo por divergencia de 40%.

Las anteriores matrices fueron calculadas por medio de una herramienta bioinformática ubicada en

la dirección: http://www.cmbi.kun.nl/bioinf/tools. la cual realiza una extrapolación a diferentes

distancias evolutivas partiendo de una matriz PAM 1.

Se realizó un tipo de alineamiento utilizando los parámetros por defecto, que incluyen el uso de

una Matriz Blosum 62, con penalizaciones por apertura (0-100) de 10 y por extensión de 0.2 y un

retraso por divergencia de 30%.

Los alineamientos obtenidos en ClustalX, fueron re-introducidos en el programa T-coffee 1.37 para

la plataforma Windows, al cual se accedió vía línea de comandos utilizando igualmente archivos por

lotes. Los parámetros usados fueron aquellos que el programa configuró por defecto.

Los alineamientos fueron visualizados por medio de la herramienta de importación de *.ALN, del

programa GENEDOC (Figura 3) [Nicholas & Nicholas, 1997], el cual permite tanto la observación de

las secuencias consenso, como las gráficas de porcentaje de identidad que permiten detectar la

consistencia del alineamiento.GcmcOóc - |gen18S arc h a ea *p «> 4T»*f‘f V:ÍSÉ»§Í

Fie Project &S Arrange Sha^e £roups Scfire Iree Reports F|ot Mndow Help

DjcglBl a í t M c|8|g| m-Iffl x|

_| |»[ « M a |5 lc n |P |E |8 |H | I|L | 0|1Í I S.I I I I * U N M|U]

C T TC tG G AAGG G a g:cgTGGTAAT TCTAGA

Figura 3. Salida del programa GeneDoc en donde se observa la salida del alineamiento en ClustalX

de secuencias pertenecientes al ADN codificante para ARNr 18S de Archaeospora. Las zonas azules

corresponden a áreas de gran similitud, en tanto que las naranja presentan algunas discrepancias.

Abajo secuencia consenso.

Aquellas secuencias generadoras de ruido, fueron extraídas mediante el programa Seaview [Galtier

et ai, 1996], utilizando como criterio los cladogramas generados por ClustalX que fueron

observados con la ayuda del programa NJPLOT (ver Figura 4). Estos cladogramas también fueron

empleados para agrupar aquellas secuencias más similares y favorecer el hallazgo de consensos

más consistentes que siguieran una asociación natural de las secuencias.

naiGGammapioteobacteria.dnd□File Edit Fort Paper

Operation----------------------------------------------(• Full tree C New outgroup C Swap nodes Subtree

jJS lx J

Display[“ jBranch lengthsj T Bootstrap valúes Subtree Up j Help j

,0.05,■Y11935

E rH

Y11936

Y11937

— Y11938

-Y11939

Y15252

•U71398

— A F 197465

■X16181

Figura 4. Salida del programa NJPLOT, donde se observa un dadograma obtenido a través de

ClustalX.

Luego de la obtención de resultados a partir de las variaciones realizadas en los parámetros de

alineamiento, para un mismo grupo de secuencias, se efectuó una comparación visual

seleccionando aquellos que pudieran ser más adecuados, por mostrar regiones comunes más

consistentes.

4.3. DISEÑO DE SONDAS

Además del requisito mencionado arriba, las secuencias consenso fueron seleccionadas con base

en su longitud: La cadena de caracteres continuos no podía ser menor de 11 con el fin de permitir

un diseño de oligonudeótidos adecuado.

Las secuencias fueron posteriormente sometidas a un análisis de especificidad vía web, a través del38

subprograma BLASTN 2.2.9. para ADN y BLASTP para proteína, del NCBI. Las características

utilizadas se encuentran en la Tabla 2:

Tabla 2. Parámetros utilizados para el análisis de especificidad por medio de BLAST.

Características BLASTN BLASTP

Filtro de baja complejidad X X

Búsqueda Nr, Est, Environmental para Nr, Environmental, SwissProt para todos

todos los organismos los organismos

Longitud palabra 11 3

Valor E 0.001 0.001

Otros Matriz Blosum62 (penalización apertura:

12, extensión: 1)

Las secuencias (ADN y proteína) que detectaban cadenas blanco relacionadas, con una alta

similitud (altos puntajes) y valores E altamente significativos (<0.001), fueron elegidas para la

posterior evaluación de las características termodinámicas adecuadas para la disposición en un

microarreglo.

Adicionalmente, fue tomada en cuenta la información gráfica mostrada por Blast referente a

dominios catalíticos o estructurales, con el fin de complementarla con aquella relativa a los valores

de significancia y el grado de especificidad requeridos para el nivel taxonómico al cual se evaluó

cada gen.

Las secuencias de proteína seleccionadas luego de la ejecución de BLAST, fueron traducidas a

ADN, utilizando el subprograma Reverse Transíate de Bioedit, mediante una tabla de codones

universal para Bacteria, Archaea y Eukarya, al igual que las tablas #11 (bacterial and plant plastid)

y #4 (Mold, protozoan and Coelenterate) del GenBank, referidas a Bacterias-Archaea y Hongos,

respectivamente.

Posteriormente, la base de datos de los posibles oligonucleótidos fue analizada de conformidad con

el esquema desarrollado por Matveeva et al. [2004], para la discriminación de secuencias

conservadas, en cuanto a utilidad en el desarrollo de microarreglos. Se utilizó la subrutina Oligo

del Programa GeneRunner 3.05 (Figura 5). Las características son:

0Sgo:jAGCTATAAC6ATGATCGACGGATT

MolWt: <Senxe ohfo> Sliand M oleculeTm: 63.0 |E'«*l - 9 lop « DNAFrttei Tm. 614 Len: |24 C E«p C RNA*GC Tm; 70.5 j | Edil «tíñeme J| Switch otgos |6C+AT Tu: 68.0 f lee energr IdGJ T emp: 18.0nMol/A260: 4.1 [Piobe con £pico Mol); 0.60ug/A260: Saft con (millj Molí; 1000.00X6C: 41.7 j 4 Fotnainide: 0.0rtfi -42.8 j 3*-151 id huí. 17 Bo«o ijjn > - |«dH 184.8 j len >- [5 Slem len >- [5dS -481.5 i Base luns / Palindiomes3'-end dG -8.3 j _ _ úfr - r fT " q h >ii[ il Sort |Tm;| 0 0 d6:| "T"(■ Uaitpin loop» P D iroen C fiu lge lo opt P Interna! loop»5 * BGCTftTfiflCGflT

i f i G 3 ' TTflGGCAGCTfl STEM « 1 9 IS 3 BP LONG. LOOP 3 .

IT| O * lf~ C A U C EL ]| H ELP ]| Erin> ]| P e lauft» |

Figura 5. Ventana de¡ subprograma Oligo, de GeneRunner.

❖ Los oligonucleótidos deben haber sido originados a partir de una secuencia consenso.

❖ Los oligonucleótidos que tengan potenciales de auto-apareamiento debidas a

interacciones intra e intermoleculares mayores que los umbrales definidos (Inter: (AG°

37) > -8 kcal/mol e Intra: (AG°37) > -1.1 kcal/mol, deben ser rechazados. Es

necesario tener en cuenta las temperaturas desde 37°C, puesto que algunos ensayos

de hibridización oligo-ARN la utilizan. Las temperaturas de hibridización deben ser

bajas para asegurar la estabilidad de los híbridos.

❖ Las secuencias deben ser evaluadas en cuanto a su potencial de apareamiento mayor

a un umbral definido, con el fin de reducir las posibilidades de hibridización cruzada.

Además de los anteriores lincamientos se debe tener en cuenta:

❖ La longitud de los oligonucleótidos, puesto que es mejor para el microarreglo utilizar

secuencias similares en este aspecto [Cho & Tiedje, 2002] y que de preferencia

posean una longitud mayor a 25 nucleótidos [Bhanot et al., 2003].

❖ Deben excluirse aquellas sondas que sean particularmente ricas en AT o GC, en

concordancia con los lincamientos empíricos dados por Affymetrix [Bhanot et ai,

2003].

En orden a estimar estos parámetros, se determinaron algunas condiciones estándar: La

concentración establecida para el ADN prueba fue de 0.6 pM, el cual se considera un valor seguro

para la mayoría de hibridizaciones. La concentración de sales fue de 1M por defecto. La

concentración de Formamida fue 0. Se debe tener en cuenta que otros valores requeridos por el

investigador, deben generar resultados diferentes.

La Tm es definida como la temperatura a la cual la mitad de las moléculas de ADN aún se hallan

en doble cadena. Este valor es calculado por el programa GeneRunner usando la siguiente fórmula:

Tm=AH/(AS + R In (CT) - 273.15

en donde, H es la entalpia, S la entropía, R es 1.987 cal.mol1, y CT es la concentración total de la

hebra, y condiciona la temperatura a la cual se realiza la etapa me/ting o de separación de las

hebras. Está directamente relacionada con el porcentaje o contenido de GC, por esta razón este

valor debió ser menor al 55% (43.1% en promedio).

Affimetrix publicó un grupo de heurísticos que se usa en el diseño de sondas. Estos fueron

derivados empíricamente y son usados por esta empresa para diseñar oligonucleótidos de

aproximadamente 20 nucleótidos de longitud:

b. El número total de As o Ts debe ser menor a 10 (<50%).

c. El número total de Cs o Gs debe ser menor a 9 (<45%).

d. El número total de As y Ts en cualquier ventana de 8 bases debe ser menor de 7 (<87.5%).

e. El número de Cs y Gs en cualquier ventana de 8 bases debe ser menor de 6 (<75%).

Las sondas inicialmente escogidas fueron recortadas hasta cumplir con los criterios propuestos, o

eliminadas, y una vez depuradas fue creada una base de sondas definitivas, las cuales se utilizaron

para la evaluación de posibles apareamientos entre ellas, con ayuda de la rutina BlastN del

programa BioEdit.

RESULTADOS

Figura 6. Diagrama de rutas bioquímicas de los ciclos del carbono, nitrógeno, azufre e hierro

(páginas siguientes).

-Ifc <o

Mem

bra

na

Pe

rip

lasm

a

Alíe

m b

ran

a

pla

sm

áti

ca

NO

SH

-S-C

oM

M+

Te

tra

h i

dro

- so

rcin

ap

teri

no

?

H2SP

T:CoM

itlran

sferas

a

AT

P

Ab

P^

'J

Coe

nzw

ia A

T e

tra

hid

ro-

sarc

ina

pte

r in

a

2H»

CO

Z-C

oA

i)F

orm

ato

k)3

H2

0

H2

2 gl

utat

íon

redu

cido

s

^ 2

glut

ort-

¡i

Fe3+

dep

endi

ente

Sulfi

to O

xida

sa

oxid

ados

3H

20

4

Fe

-3

8H

*

4F

e *

2

Ox

i dor

edu

ct a

sa

5-F

e

►C

aden

a d

e tr

an

spo

rte

de

e-

*A

TP +

H20

2t- l

Josu

lfa

to

C 6

xid

o-

r e

du

cta

sa

rto ox

idasa

AP

red

uct

'j'V

',• ‘?

ÍO •'

Att

P2e-

ADP

>2t

-

"ÍHt

TP

▼A

PS

AbPi

sulf

ur

¡I Pi*fc

.,AbP

CIT

OPLA

SM

A

AD

P A

TP

< 5

04-2

"/

o

n)

Aer

obio

sis

¡jUpfi

c'loivr

c

✓;Fe

2+

N*■

Fe30

4 4

Fs30

4 «s

-i

X

Ana

erob

iosi

s

•S,

Fe 3+

Keda

Eín

dela

fe-5 o

»tóH

<u<t

asa

y n# a

otíe

se J

epen

tíler

te de

Fí>

.&•

H2

02

H

20

/tCE

TATO

Mem

bran

o

LACT

ATO

PIR

UV

ATO

Tro

ns

f e

ras

a

-AC

ETA

TONA

DPH

NADP

-k-*

'''(f:

foilna

«Tu»

u2-fji

)-;{u 2t

(niK

u2*(D

>^

*f

l)-2Cu

;*q

i-i>

Cu

iji i

))

(tu

i♦ (

i)-20

i;*;

ni>

cn

*g

ij>

2H+

^A.

zcoz

ff)-a

cu*(

ni)-cu

2-

3NAD

PH

3NAD

P-HÍ

T(tu

tq>-

;cii z-

(iip-cu

2-kii

£>

■£>■

Red

ucci

ón d

esas

in il

ativ

a 5

site

sis

00

Redu

cció

n as

imik

itiva

Aci

do o

rgán

ico

quel

onfre

__

H 2

0

6>

Acid

o or

gáni

co

quel

orits

, ÁAn

3+

R.

X

H20

2 *1

)(F

e 3+

) -

-A

Í ^

-^

20

íf.*

)=

o

AfaP

X

Ra

dí c

a Fe

as

>A

ta 2

+ __

____

0=®

VFe4

n

MnP

II

Ata

2+

Y

** 3+

>f5

t

Aci

do

orq

én

it-

te

Acid

o or

góni

t^f

e

Abr

evia

tura

s U

tiliz

adas

:

QH

2-Q

Qui

nona

red

ucid

a-ox

idad

a; C

rrA

Per

mea

sa-s

iste

ma

de t

rans

port

e de

nitra

to e

n ho

ngos

: N

iaD

Nit

rato

red

ucta

sa

de h

ongo

s; N

iiA N

itri

to r

educ

tasa

de

hong

os;

nasF

ED

Sis

tem

a de

tra

nspo

rte

nitr

ato-

nitr

ito;

Nas

C N

AD

H-n

itra

to

redu

ctas

a; N

rf A

BCD

Sub

unid

ades

de

la n

itri

to r

educ

tasa

: M

6C)-

Nas

A S

ubun

idad

cat

alític

a de

la n

itra

to r

educ

tasa

y :¡

u co

fact

or b

is-m

olib

dopt

erin

gua

nina

din

ucle

ótid

o; N

arB

N

itra

to r

educ

tasa

fer

redo

xin

depe

ndie

nte;

;Fd

red

Ferr

edox

ina

redu

cida

; N

irA

nitra

to r

educ

tasa

asi

mila

to-i

a fe

i-re

doxi

n de

pend

ient

e (a

lgun

as b

acte

rias

); H

ao

Hid

roxi

lam

ina

oxid

ored

ucta

sa;

nirB

D N

itri

to r

educ

tasa

ci

topl

asm

átic

a N

AD

H-d

epen

dien

te (

2 su

buni

dade

s);

CO

-des

h CO

-des

hidr

ogen

asa;

CoM

, Co

B Co

enzi

ma

M, C

oenz

ima

B; A

PS

Ade

nosi

n fo

sfos

ulfa

to;

PAPS

Fos

foad

enos

in fos

fosu

lfato

; LD

H la

ctat

o de

shid

roge

nase

!; H

2asa

Hid

roge

nase

,

a) V

ías

de r

espi

raci

ón d

e ni

trat

o (n

ar) y

denitri

ficac

ión

(nos

, ni

r, ñ

or)

en b

acte

rias

. Se

obs

erva

la o

rgan

izac

ión

de la

cad

ena

tran

spor

tado

ra d

e el

ectr

ones

ana

erob

ia [

mod

ifica

do d

e M

oren

o et

al.,

199

9].

b)fted

ucci

ón a

sim

ilativ

a de

nitra

to e

n ho

ngos

. El

sis

tem

a de

tra

nnsp

orte

del

nitra

to in

cluy

e un

per

mea

sa (

gen

crnA

), los

gen

es

codi

fican

tes

de la

nitra

to r

educ

tasa

(ni

aD)

y de

la

nitr

ito

redu

ctas

a (n

ii A)

form

an u

n "c

lust

er"

[Tom

ado

de K

ingh

orn,

198

9].

c) R

eacc

ione

s qu

ímic

as q

ue o

curr

en d

uran

te la

fijac

ión

de n

itróg

eno

[Bas

ado

en Z

ehr

eta

l 20

03].

d) A

sim

ilaci

ón d

e N

itra

to.

Se

mue

stra

la n

itra

to r

educ

tasa

asi

mila

tiva

depe

ndie

nte

de f

erre

doxi

na (

Fd)

(cia

nobc

cíer

ias)

y la

s ni

trit

o re

duct

asas

y n

itra

to r

educ

tasa

s N

AD

H d

epen

dien

tes

(Kle

bsie

lla y

Rho

doba

cter

) [M

oren

o e

t a/

, 19

99].

e)Ac

opla

mie

nto

de la

oxi

daci

ón d

e am

onio

y p

oste

rior

red

ucci

ón d

e hi

drox

ilam

ina

en e

l pr

oces

o de

den

itrifi

caci

ón.

f)Red

ucci

ón d

esas

imila

tiva

de n

itra

to a

nit

rito

y a

am

onio

, dis

ipac

ión

de p

oder

red

ucto

r y

deto

xific

ació

n de

nitrito

, j)

Vía

red

uctiv

a de

sde

com

pues

tos

carb

onad

os o

xida

dos

com

o CO

Z ha

cia

met

ano

[Tha

uer,

199

8],

g) V

ía m

etan

ogén

ica

por

redu

cció

n de

ace

tato

[Ba

sado

en

Ferr

y, 1

995]

.h,

i )O

xida

ción

de

com

pues

tos

redu

cido

s de

car

bono

con

la lib

erac

ión

de C

02,

en la

que

se

invo

lucr

a la

enz

ima

CO-

desh

idro

gena

sa.

Bac

terias

met

anot

rofa

s, c

arbo

xido

trof

as [

Basa

do e

n Con

rad,

199

6].

k)O

xida

ción

de

azufr

e el

emen

tal.

Bac

terias

qui

mio

autó

trof

as [

Basa

do e

n Pr

esco

tt e

t al

, 20

00]

I) Rut

as d

e ox

idac

ión

anae

robi

a de

com

pues

tos

sulfu

rado

sre

duci

dos

en b

acte

rias

(m

uy c

omún

en

foto

sint

étic

as)

[Brü

ser

et

ai,

2000

].m

)Esq

uem

a de

aco

plam

ient

o de

la r

educ

ción

asi

mila

tiva

y de

sasi

mila

tiva

de s

ulfa

to, ox

idac

ión

de H

2 y

la s

ínte

sis

de A

TP e

nba

cter

ias

redu

ctor

as d

e su

lfato

[Ba

sado

en

Brü

ser

et

ai,

2000

].n)

Proc

eso

oxid

ored

uctiv

o en

el c

iclo

del

hie

rro

[mod

ifica

do d

e Pr

esco

tt e

t al

., 20

00].

o)Ci

clo

cata

lític

o de

la

Lign

in P

erox

idas

a [T

omad

o de

Luc

as e

t ai

, 20

01],

¡Xp)

Cicl

o ca

talít

ico

de las

laca

sas

[Tom

ado

de L

ucas

et al

. 200

1].

d)Ci

clo

cata

lític

o de

la

enzi

ma

Man

gane

so p

erox

idas

a [T

omad

o de

Luc

as e

t ai

. 20

011.

Figura 7.Modelo conceptual de integración de los ciclos biogeoquímicos considerados {página

siguiente).

«JWt

□ Archaea [.J Bacteria

Desconocido 0 Eukarya

tlpffShaea---- - QBacterla

Si Desconocido ~ EJEukafya

Figura 8. Representación de la proporción de secuencias de ADN para cada grupo enzimático a

nivel de Dominio taxonómico. Clave de abreviaturas ver Tabla 3.

Figura 9. Distribuciónión de tas secuencias de ADN encontradas por División.

Figura 10. Histograma

#géneros

de frecuencia de secuencias de ADN por Género.

Figura 11. Representación de la proporción de secuencias de proteína para cada grupo enzimat/co

a nivel de Dominio taxonómico (abreviaturas ver Tabla 3).

54

Figura 12. Distribución de ias secuencias de proteína encontradas, por División.

#géneros

Figura 13. Histograma de frecuencia de secuencias de pro teína por Género.

ENZIMA/PROCESO GÉNERO

AMONIO MONOOXIGENASA Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosovibrio, Pseudomonas

(amo)

APS QUINASA (apsq) Escherichia, Klebsiella

APS REDUCTASA (apsr) AHochromatium, Desulfovibrio

APS SULFURILASA AHochromatíum, complejo Burkholderia cepacia,

Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium,

Rhodococcus, Sinorhizobium

B-G LUCOSIDASA (bgluc) Agrobacterium, Aspergillus, Bacillus, Bifidobacterium,

Butyrivibno, Candida, Celluiomonas, Cellvibrio,

Chryseobacteríum, Clavibacter, üostridium, Cochliobolus,

Debaryomyces, Escherichia, Gibberella,

Gluconacetobacter, grupo Bacillus cereus, Humicola,

Hypocrea, Klebsiella, Kluyveromyces, Lactobacillus,

Lactococcus, Paenibacillus, Pantoea, Pectobacterium,

Phaeosphaeria, Pichia, Rhizobium, Serrada,

Sphingomonas, Streptococcus, Taiaromyces,

Thermobifída, thermobispora, Thermotoga

ENDOGLUCANASA (endog) Actinomyces, Agaricus, Aspergillus, Bacillus, Bionectria,

Celluiomonas, Chaetomium, üostridium, Debaryomyces,

Emericella, Erwinia, Fusarium, Gluconacetobacter,

Humicola, Hypocrea, Irpex, Methanococcus, Nectria,

Paenibacillus, Pectobacterium, Phytophthora,

Promicromonospora, Pseudomonas, Rolstonia, Rhizobium,

Stachybotrys, Taiaromyces, Thermoascus, Thermobifída,

Trametes, Trichoderma, Xanthomonas

EXOGLUCANASA (exog) Acremonium, Alternaría, Aspergillus, Blumeria, Candida,

Celluiomonas, üostridium, Cochliobolus, Complejo

Cryphonectña/Endothia, Fusarium, Humicola, Hypocrea,

Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Streptomyces,

Taiaromyces, Thermoascus, Trichoderma, Volvariella

CO-DESHIDROGENASA (codh) Methanosaeta, Methanosarcina

ENZIMA/PROCESO GÉNERO

ENDO-MICORRIZACIÓN

(SUBUNIDADES ARNr)

Archaeospora (archaeo), Paraglomus (parag)

FERREDOXIN NITRITO

REDUCTASA ASIMILATIVA

(feniderasi)

Emericella, Nostoc, Synechococcus, Acinetobacter

FERREDOXIN SULFITO

REDUCTASA ASIMILATIVA

(fesiderasi)

AHochromatium, Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium,

Salmonella, Thiocapsa

DINITROGENASAS (n2) Anabaena, Azomonas, Azotobacter, Azorhizophilus,

Oostridium, Heliobacterium, Metanosarcina, Rhodobacter,

Rhodospirillum

NITROGENASA FEMO (n2femo) Aicaiigenes, Azospirillum, Azotobacter, Bradyrhizobium,

Burkholderia, Calothrix, Chlorogloecopsis, Oostridium,

Cytindrospermum, Fischerella, Gtuconacetobacter,

Herbaspirillum, Klebsiella, Leptospirillum, Mesorhizobium,

Methanothermobacter, Nodutaria, Nostoc, Pseudomonas,

Rhizobium, Rhodobacter, Scytonema, Synechococcus

OXIDO NÍTRICO REDUCTASA

(niored)

Achromobacter, Aicaiigenes, Azospirillum, Nitrosomonas,

Pseudomonas

OXIDO NITROSO REDUCTASA

(nored)

Achromobacter, Aicaiigenes, Azospirillum,

Bradyrhizobium, Ochrobactrum, Paracoccus,

Pseudomonas, Ralstonia, Rhodobacter, Sinorhizobium

OXIDO REDUCTASA NADPH

(nadphredox)

Escherichia, Salmonella, Thiocapsa

PAPS REDUCTASA (papsred) AHochromatium, complejo Burkholderia cepacia,

Escherichia, Rhizobium, Salmonella, Thiocapsa

QUITINASA (quit) Aeromonas, Ajel/omyces, Arthrobacter, Aspergillus,

Bacillus, Blumeria, Botryotina, Candida,

Chromobacterium, Oostridium, complejo Burkholderia

cepacia, Cordyceps, Doohwaniella, Emericella, grupo

Bacillus cereus, Janthinobacterium, Kurthia, Nocardiopsis,

Pseudomonas, Rhizopus, Serraba, Stenotrophomonas,

Streptomyces, Trichoderma, Ustilago, Verticillium,

Xanthomonas

RUSTICIANINA (rust) Acidithiobacillus

SULFITO REDUCTASA

ASIMILATIVA (siderasi)

Klebsiella, Rhizobium, Salmonella

SULFITO REDUCTASA

DESASIMILATIVA (siredd)

AHochromatium, Archaeoglobus, Bilophila, Desulfacinum,

Desulfitobacterium, Desulfobacter, Desulfobacterium,

Desulfobacula, Desulfobotulus, Desulfobulbus,

Desulfocella, Desulfococcus, Desulfofaba, Desulfofustis,

Desulfohalobium, Desulfomicrobium, Desulfomonile,

Desulfonatronum, Desulfonatrovibrio, Desulforhabdus,

Desulforhopalus, Desulfosarcina, Desulfosporosinus,

Desulfotomaculum, Desulfovibrio, Dseulfovirga,

Syntrophobacter, Thermodesulfovibrio

TIOSULFATO REDUCTASA

(tiosared)

Salmonella

HIDROXILAMINA ÓXIDO

REDUCTASA (hao)

Nitrosomonas, Nitrosospira

FENOLOXIDASAS (fenol) Trametes

LACASAS (lac) Agaricus, Aspergillus, Botryotina, Ceriporiopsis,

Climacocystis, Colletotrichum, Coriolopsis, Cryphonectria,

Cyathus, Daedalea, Fusarium, Gaeumannomyces,

Ganoderma, Gymnopus, Heterobasidion, Hypholoma,

Lentinula, Neurospora, Phlebia, PHoderma, Pleurotus,

Podospora, Pycnoporus, Streptomyces, Thanatephorus,

Trametes

ENZIMA/PROCESO GÉNERO 1

LIGNIN PEROXIDASAS (ligper) Bjerkandera, Ceriporiopsis, Phanerochaete, Trametes

MN-PEROXIDASAS (mnper) Ceriporiopsis, Dichomitus, Heterobasidion,

Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Tylospora

METANO OXIGENASA

PARTICULADA (pmo)

Methylobacter, Methylocaldum, Methyíocapsa,

Methy/ococcus, Methylocystis, Methylomicrobium,

Methylomonas, Methylosinus, Nitrosomonas

METIL- CO-M-REDUCTASA

(mcomred)

Methanobacterium, Methanobrevibacter,

Methanocaldococcus, Methanococcus,

Methanocorpusculum, Methanoculleus, Methanofollis,

Methanomethylovorans, Methanomicrobium,

Methanopyrus, Methanosaeta, Methanosareina,

Methanosphaera, Methanospirillum,

Methanothermococcus, Methanotorris,

NADH-NITRITO REDUCTASA

ASIMILATIVA (nadhniredasi)

Amyco/atopsis

NITRATO REDUCTASA

ASIMILATIVA (naredasi)

Oostridium, Oscillatoria, Pseudomonas, Amyco/atopsis,

Azospirillum, Baciitus, Klebsiella

NITRATO REDUCTASA

DESASIMILTTATIVA DE

MEMBRANA (nareddmem)

Bacillus, Escherichia, grupo Bacillus cereus, Paenibacillus,

Pectobacterium, Pseudomonas, Ra/stonia, Serratia,

Shewanella, Staphy/ococcus

NITRATO REDUCTASA

DESASIMILTTATIVA

PERIPLASMICA (nareddper)

Azospirillum, Moraxella, Paracoccus, Pseudomonas,

Ralstonia, Rhodobacter, Rhodopseudomonas,

Sulfurospirillum, Synechococcus, Wolinella

NITRITO REDUCTASA

DENITRIFICANTE (niredden)

Achromobacter, Alcaligenes, Azospirillum, Blastobacter,

Bradyrhizobium, Ensifer, Hyphomicrobium,

Mesorhizobium, Nitrosomonas, Ochrobactrum,

Pseudomonas, Rhizobium, Rhodobacter, Sinorhizobium

NITRITO REDUCTASA

DESASIMILATIVA PERIPLASMICA

(nireddper)

Alcaligenes, Azorhizobium, Azospirillum, Desulfovibrio,

Escherichia, Gluconacetobacter, Klebsiella, Paracoccus,

Penicillium, Pseudomonas, Ralstonia, Roseobacter,

Staphy/ococcus

Metano monooxigenasa

particulada

Oxidación de metano metanotrofos

tipo I y II

pmoA

Sulfito reductasa

desasimilativa

(desulfoviridina)

Reducción desasimilativa de sulfito

(SOs=) a sulfuro de hidrógeno

(H2S)

dsrA, subunidad alpha

dsrB, subunidad beta

dsrD, subunidad delta

Nitrito reductasa

denitrificante periplásmica

Reducción de nitrito (NO2) a óxido

nítrico (NO)

Catalizado por los productos

de dos genes nirK (contiene

cobre) y el otro tiene un

citocromo cdl nirS

Nitrito reductasa

desasimilativa periplásmica

Reducción desasimilativa de nitrito

(NO2) a amonio (NH4+)

(respiración de nitrato),

amonificación

nrfA subunidad catalítica

citocromo c

Nitrito reductasa

desasimilativa periplásmica

Reducción desasimilativa de nitrito

(NO?) a amonio (Nrtt+) (disipación

de poder reductor y detoxificación

de nitrito)

nirB, subunidad beta

nirD, subunidad delta

Óxido nitroso reductasa Reducción de óxido nitroso (N2O) a

nitrógeno molecular (N2)

nosZ

Amonio monooxigenasa Oxidación de amonio (NH4+) a

nitrito (NO2)

amoA, subunidad A

amoB, subunidad B

amoC, subunidad C

Metil CoenzimaM reductasa Reducción de CO2 a metano

(metanógenas)

mcrA subunidad A, unidad de

transcripción para las 3

subunidades de la enzima:

mcrBDCGA

CO-deshidrogenasa (en

carboxidotrofas la enzima

contiene un cofactor de

molibdopterina)

oxidación de CO a C02, también

oxidación de sulfuro de carbono

(OCS)

cdhA, subunidad alpha

cdhB, subunidad epsilon

cdhC, subunidad beta

cdhD, Codesh. componente

Co/Fe-S subunidad delta

cdhE, subunidad gamma

coxL, subunidad grande.

coxM, subunidad mediana

Acetil-CoA sintetasa, en

homoacetógenos actúa en

conjunción con la CO-

deshidrogenasa

Utilización de acetato acsA

NADH-Nitrito reductasa

asimilativa (bacterias como

K. oxytocá)*

y ferredoxin nitrito reductasa

asimilativa (cianobacteria)**

Reducción de nitrito (NCV) a

hidroxilamina (NH2OH) y a amonio

(NIV, vía asimilativa) biosíntesis

de compuestos de N

nasB*

nirA**

Hidroxilamina oxido

reductasa

Reducción de hidroxilamina

(NH2OH) a amonio (NIV)

hao

Nitrogenasa dinitrogenasa

FeMo dinitrogenasa

reductasa Fe

nitrogenasa V

reducción de nitrógeno molecular

(N2) a amonio (NH4+)

Subunidad I de la

dinitrogenasa, 2

heterodímeros: nifD-nifK.

Dinitrogenasas alternativas:

vnfH (vanadio),

anfH (hierro).

Nitrogenasas alternativas

- con vanadio:

vnfD, subunidad alfa de la Va-

nitrogenasa.

vnfG, subunidad delta de la

Va-nitrogenasa.

vnfK, subunidad beta de la

Va-nitrogenasa.

- con hierro:

anfD, subunidad alfa3 de la

dinitrogenasa.

anfG, subunidad delta3 de la

dinitrogenasa.

anfK, subunidad beta3 de la

dinitrogenasa.Complejo enzimático de

tiosulfato-tiosulfato

reductasa, cataliza a sulfito y

H2S

Oxidación de tiosulfato (S203=) a sulfato (S04=)

phsA, tiosulfato reductasa

phsB, proteína hierro -

azufre.

phsC, proteína anclada a

membranaRusticianina oxidación de Fe+2 a Fe+3 rusA

rusB

rustA

: PROCESO GEN

ATP sulfurilasa Sulfato (S04=) a APS cysD, sulfato adenilil

transferasa subunidad

pequeña.

cysN, sulfato adenilil

transferasa subunidad grande.

APS quinasa Fosforilación de APS a PAPS cysC

APS reductasa Sulfito (S03=) a APS aprA, adenililsulfato reductasa

subunidad alfa.

aprB, adenililsulfato reductasa

subunidad beta.

surC, adenilil sulfato

reductasa.

PAPS reductasa PAPS reductasa cysH

Sulfilo reductasa Reducción asimilativa de sulfito

(S03=) a sulfuro de hidrógeno

(HaS)

cysG, Sulfito reductasa-

sirohemo sintetasa.

cysl, sulfuro de H:ferredoxin

oxidoreductasa.

cysJ, NADPH sulfito reductasa

componente de flavoproteina.

Nitrato reductasa asimilatoria

o soluble (cianobacteria)**

Reducción de nitrato (NOs) a

nitrito (NO2) vía asimilativa,

biosíntesis de compuestos de N.

narB**

Nitrato reductasa asimilatoria

o soluble citoplasmática

(bacterias como K. oxytoca)*

Reducción de nitrato (NO3) a

nitrito (NO2) vía asimilativa,

biosintesis compuestos de N.

nasC, subunidad pequeña de

transferencia de electrones.

nasA*, subunidad catalítica

grande.

Nitrato reductasa

desasimilativa de membrana

Reducción de nitrato (NO3) a

nitrito (NO2) vía desasimilativa

(respiración y denitrificación)

disipadora de rédox

narG, unidad catalítica de Mo

unida a membrana.

narH, subunidad beta.

narl, subunidad gamma.

Nitrato reductasa

desasimilativa periplásmica

Reducción de nitrato (NCK) a

nitrito (NCb) vía desasimilativa

(disipación de poder reductivo y

densificación)

napA, subunidad grande.

napB, subunidad pequeña,

dihemo citocromo c.

Nitrato reductasa asimilativa

en hongos

Reducción de nitrato ( N O 3 ) a

nitrito (NO?) vía asimilativa,

biosintesis compuestos de N.

nit2 (no hubo reportes)

nit4 (no hubo reportes)

niaD, (dependiente de

NADPH)

Nitrito reductasa asimilativa

en hongos

Reducción de nitrito (NOf) a

amonio (NIV, vía asimilativa)

biosintesis de compuestos de N

niiA

Óxido nítrico reductasa Reducción de óxido nítrico (NO) a

óxido nitroso (N20)

norB, consta de dos

su bu n ida des: qnorB

relacionada con la

detoxificacón y cnorB.

Lacasas Mineralización de lignina y

huminas

lccl-5, IccK, lacl-14, yA,

ti ¡A, Icsl, lapl, Iap2

Fenoloxidasa pox,l-3, poxA

Manganeso Peroxidasas Mineralización de lignina y

huminas

mnpl, mnp2, mnp3, mnp4,

mnpB.

Lignin Peroxidasas Mineralización de lignina y

huminas

üpA, HpB, tipC, UpE> lipl,

HpG, HpH, HpJ, vgll, Iip2r

tpgl, IpgA, IpgB

Archeospora spp.

Paragtomus spp.

Endomicorrización r r s i

Archeospora spp.

Paragtomus spp.

Endomicorrización r r s 2

Archeospora spp.

Paragtomus spp.

Endomicorrización 1 8 S

Archeospora spp.

Paragtomus spp.

Endomicorrización 5 .8 S

ENZIMA-MOLECULA/GÉNERO PROCESO GEN

quitinasas Quitina chiC, chiB, chiA, bcc, ch¡F,

chil, chilS, ch ill, ch i(3, 37,

41, 55, 60, 67, 69, 80, 92),

chil9, chit, chitiA, chitiB,

ctsl, cts2, cht4, kchi,

pchA, bccl.

Endo-B-glucanasas Degradación de celulosa Bg/H, cenA, bg/2, egl,

egll, eg!3, eg¡4, eg¡5, bglB,

bg/C, bglA, egltA, b g ll

Exo-6-glucanasas Degradación de celulosa Cex, exgl, bg ll, exg2

Celobiohidrolasas Degradación de celulosa Cé/1234567, cbhl, cbh2,

cbhA, cbhB

Endo/Exoglucanasas Degradación de celulosa ce!

Celodextrinasas Remoción de la celobiosa celACGDYDCO

acc2

xynA

engBDEHKLMNXY

eme

cenC

bgxA

bglxA

Figura 14. Número de sondas seleccionadas a partir de las secuencias de ADN, por nivel

taxonómico.

Figura 15. Número de sondas seleccionadas por nivel taxonómico, a partir de las secuencias de

proteína traducidas.

DISCUSIÓN DE RESULTADOSLa investigación realizada, hizo acopio de la información depositada en las tres principales bases de

datos genómicos internacionales, y a través de su análisis condujo al desarrollo de una

metodología de trabajo, cuyo objetivo a largo plazo, será el diseño de una Herramienta Molecular

de Evaluación Funcional de Suelos. El estudio hace uso de estrategias de minería de datos,

disciplina que aplica un punto de vista contrario al método científico tradicional. Se basa en el

aprovechamiento de la información que ha sido recopilada en estas bases por parte de diversos

investigadores, y en el concepto de que es posible desarrollar aplicaciones tomando rutas

diferentes a la experimentación a priori. La información contenida en las bases, debió ser evaluada

de acuerdo al objetivo central del trabajo, filtrada y clasificada. Las bases de datos son una gran

fuente de información que puede ser aprovechada desde diferentes perspectivas, siendo esta una

de las posibilidades.

0 suelo, resulta ser el componente más importante dentro de los ecosistemas terrestres, puesto

que a pesar de carecer de autonomía en términos productivos (las bacterias fotosintéticas y

quimiosintéticas como aquellas oxidantes de compuestos inorgánicos simples como amoniaco,

nitrito, sulfito, hierro ferroso no pueden suplir la producción del ecosistema), permite el sustento

físico y nutricional de la comunidad de productores existente en la superficie, facultando de esta

manera la estabilidad funcional del ecosistema. Los microorganismos del suelo participan en todos

y cada uno de los procesos de degradación de la materia, y son los primeros eslabones en la

cadena alimenticia, puesto que de ellos depende en primer término, la liberación de los nutrientes

que posteriormente serán tomados por las plantas, y en consecuencia el sostenimiento de los

ecosistemas. Adicionalmente, se ha demostrado que la composición y la diversidad funcional de las

comunidades de microbios, resulta el principal factor controlador de la productividad ecosistémica

[Phillips et al., 2000]. Por tal razón, la comprensión de tales interacciones microbianas, puede

permitir un incremento en los beneficios obtenidos de su aprovechamiento, la reversión en

procesos de degradación, la restauración de ecosistemas, etc. Dado que el sistema suelo puede ser

considerado como una caja negra, gracias al gran número de variables ambientales asociadas con

su dinámica, se proyectó el diseño de un método que permitiera entender la influencia e

interacción de los diversos factores ambientales sobre procesos críticos del ecosistema.

Uno de los principales problemas que llevaron a la formulación de la investigación, fue la

preocupación de que aún las técnicas de cultivo microbiológicas tradicionales son el sistema de

análisis de suelos más utilizado, especialmente en nuestro país, en donde se hace uso de ellas para

acceder al conocimiento de la composición a grosso de la microflora y microfauna del suelo, y de

su diversidad. La veracidad de la información obtenida por esta vía, es discutible, dado el error que

se genera durante el proceso de aislamiento de los microorganismos, la variedad tanto de formas

de vida como de microambientes en el suelo, sugieren así mismo una gama muy extensa de

condiciones de crecimiento, que hacen poco probable que la microflora quede representada en el

escaso número de medios de cultivo que pueden ser utilizados para la evaluación ex situ.

Adicional mente, el problema del favorecí miento o no de ciertos microorganismos bajo estas

condiciones, hacen que la mayoría de ellos no puedan ser registrados o sean subestimados en

cuanto a su abundancia y diversidad. De ninguna manera, la densidad microbiana en una caja de

cultivo, refleja la densidad real que subyace en el suelo. Por estas y más razones, es claramente

necesario explorar metodologías y hacer acopio de las técnicas más avanzadas, con el fin de

determinar si resultan apropiadas para estos propósitos. Como primer paso para lograr este

objetivo, se requiere analizar la forma de su ejecución, para tener claramente definidas las

condiciones de operación del método, cuales pueden ser los posibles pasos a seguir y las

dificultades que deben ser afrontadas.

Como elemento de evaluación en desarrollos posteriores, se definieron algunas de las

características que debía poseer un buen método de análisis de suelos, cualquiera sea su

mecanismo de aproximación:

♦ Debe ser una técnica económicamente viable, cuyos costos sean fácilmente cubiertos frente a

su utilidad e información; en donde los costos de equipos y operación, permitan el ofrecimiento

del servicio a la comunidad.

♦ Debe ser muy confiable, puesto que los datos tienen que reflejar de manera adecuada la

realidad edáfica. Esto se logra con una estandarización de la técnica en laboratorio, controlando

las posibles fuentes de error.

♦ Debe ser lo suficientemente rápida en la obtención de resultados, como para permitir el

procesamiento de un gran número de muestras en un tiempo tal, que no sea considerado una

fuente de error adicional.

♦ Debe permitir obtener la máxima información posible, observando las diferentes escalas de

funcionamiento del ecosistema, permitiendo generar tanto una imagen global del estado de un

suelo, como la detección de puntos de ruptura de procesos.

♦ Debe permanecer vigente, es decir, que a medida que nuevos procesos sean evaluados y se

obtenga información al respecto, pueda ser adicionada y la técnica no resulte obsoleta.

♦ Debe evaluar los diferentes procesos que ocurren en el suelo, no simplemente la existencia de

un grupo taxonómico determinado, especialmente, en lo referente a aquellos procesos que no

son exclusivos de un grupo microbiano en particular. Sin embargo, debería permitir el acceso a

esta información si es requerida.

♦ Debe ser reproducible, lo cual permite la implementación de normas de calidad y así mismo el

establecimiento de resultados repetibles en diferentes laboratorios.

♦ No puede estar restringida a un tipo particular de suelo, por el contrario, debe ser aplicable a

toda clase de ellos, incluyendo sedimentos y suelos inundados de cualquier procedencia.

La utilización de la información genómica de los microorganismos, permite que se obtengan datos

reales de los procesos ocurrentes en el suelo, en donde las limitaciones, estarán ya no

determinadas por la fuente de datos, sino por la optimización de los procedimientos que se llevan a

cabo en su consecución. De esta manera, la aplicación de técnicas moleculares permite cumplir con

gran número de los requerimientos antes indicados; por otra parte, los microarreglos de ADN han

demostrado ser una técnica fiable, repetible y lo suficientemente rápida como para ser

implementada en servicios de análisis. Al tratarse de sistema relativamente nuevo, adolece de no

estar lo suficientemente estandarizado como para minimizar el efecto del error, pero se están

haciendo grandes adelantos al respecto, que hacen pensar que su fiabilidad tendrá un incremento

vertiginoso.

Una vez definida la problemática o motivo del estudio, se plantearon los posibles mecanismos de

abordaje para el diseño de la metodología. En primer lugar, la búsqueda de información publicada,

permitió entrever una carencia de herramientas de evaluación holística de los procesos

biogeoquímicos, puesto que en la literatura solo se encontró la evaluación de ciclos aislados, así

que el diseño de este tipo de herramientas, aún no ha sido abordado. Para determinar el tipo de

funciones bioquímicas que iban a ser tenidas en cuenta, fue necesario observar todo el universo de

ciclos de nutrientes existentes y comenzar por darles un valor de importancia que favoreciera su

selección. Dado que la productividad de los ecosistemas terrestres proviene de la vegetación, y

debido a que los servicios que ésta brinda pueden ser vistos económicamente, como fuente de

diversidad, generación de oxígeno, sustento de la cadena alimenticia, o en la generación de

recursos de aprovechamiento humano, una buena motivación en la inversión de esfuerzos de

investigación, es el sostenimiento y desarrollo de la biomasa vegetal. Por tal motivo, los ciclos

biogeoquímicos de mayor importancia fueron determinados pensando en los elementos que son

esenciales para las plantas y las concentraciones en las que son requeridos (Tabla 5).

Tabla 5. Elementos esenciales para la mayoría de las plantas superiores y concentraciones internas

que se consideran adecuadas [Salisbury & Ross, 1994].

ELEMENTO SÍMBOLO QUÍMICO CONCENTRACIÓN EN

TÜIDO SECO (%)

Molibdeno Mo 0.00001

Níquel Ni ?

Cobre Cu 0.0006

Cinc Zn 0.002

Manganeso Mn 0.005

Boro B 0.002

Hierro Fe 0.01

Cloro Cl 0.01

Azufre S 0 .1

Fósforo P 0.2

Magnesio Mg 0.2

Calcio Ca 0.5

Potasio K 1

Nitrógeno N 1.5

Hidrógeno H 6

Oxígeno 0 45

Carbono C 45

Los microorganismos se encuentran involucrados en la mayor parte de los ciclos referentes a estos

elementos. Dado su papel como degradadores de materia orgánica en el retorno de nutrientes,70

como reguladores en la velocidad con que ésta ocurre y como fórmulas de ingreso de nutrientes

gaseosos o en estados insolubles, se consideró que en la medida en que mayores cantidades de

algunos nutrientes son reclamados por la biomasa vegetal, su importancia se incrementa. Por ese

motivo, fueron seleccionados los elementos Carbono, Nitrógeno, Fósforo, Azufre, Hierro e

Hidrógeno para el estudio, y la búsqueda de información se centró sobre el tipo de reacciones

ocurrentes en las diferentes porciones de tales ciclos y las enzimas involucradas en ellas, con lo

cual se procedió a la búsqueda y/o diseño de los diagramas correspondientes.

6.1. RUTAS BIOQUÍMICAS

Los diagramas de reacciones observados en la Figura 6, fueron obtenidos a partir de las diferentes

fuentes bibliográficas consultadas, y muestran cada una de las transformaciones que suelen ocurrir

para las diferentes vías metabólicas dentro de los ciclos biogeoquímicos. Como es implícito, un ciclo

biogeoquímico sugiere la existencia de procesos químicos como reacciones de oxidoreducción, con

la mediación de agentes biológicos, que involucran la transformación de nutrientes importantes

para la subsistencia de los procesos vitales a nivel global. Se requiere evaluar cada uno de estos

procesos con el fin de seleccionar aquellos que resultan críticos y detectar las enzimas clave y su

utilidad como marcadores.

6.1.1. C ic lo del Carbono:

El carbono puede estar presente en formas reducidas, tales como el metano (CH4) y la materia

orgánica, y en formas más oxidadas como el monóxido de carbono (CO) y el C02. Los reductores

(como el hidrógeno) y oxidantes (como el 02), influyen en el curso de las reacciones biológicas y

químicas que involucran al carbono. Si el hidrógeno y el metano se mueven desde áreas

anaerobias hacia aerobias, se crea una oportunidad para que los oxidantes aerobios de hidrógeno

y metano puedan actuar [Prescott et al., 2000].

De los 500 millones de toneladas de metano producidas anualmente en el planeta, las bacterias

oxidantes de metano contribuyen al reciclaje del 60% [Gilbert etal., 2000]; dado que mantienen el

equilibrio en la reserva de este gas de invernadero deben ser incluidas en cualquier evaluación

microbiológica realizada en suelos. Los genes involucrados en la oxidación de metano (pmoA,

mmoB, y mxaF), ya han sido usados para caracterizar comunidades microbianas del suelo [Kent &

Triplett, 2002], lo cual facilita su elección. La metano monooxigenasa (MMO) (Figura 6i) existe en

dos formas diferentes [Murrell et al, 2000], la enzima seleccionada para este estudio se encuentra

ligada a membrana y está evolutivamente relacionada con la amonio monooxigenasa (AMO) de las

bacterias denitrificantes, siendo sintetizada solo en presencia de suficientes concentraciones de

cobre. La ventaja que presentó para su selección, es que a diferencia de la MMO particulada, se

encuentra presente en todos los metanotrofos [Conrad, 1996], pudiendo ser usada como marcador

funcional para estos organismos.

Los organismos que efectúan la reacción contraria, los metanógenos, poseen varios biomarcadores

potenciales, incluyendo 1) la coenzima F420, 2) los isoprenoides y éteres lipídicos en las

membranas celulares, y 3) la coenzima M (CoM). El segundo marcador es del tipo bioquímico, por

lo cual no es aplicable a la metodología planteada. Se consideró la coenzima M como el marcador

más útil, debido a que todos los metanógenos conocidos expresan esta enzima [Hallam et al,

2003]. Por otra parte, la coenzima F420 tiene dos limitaciones, la primera se debe a que las

concentraciones intracelulares de coenzima F420 presentan muchas variaciones y la segunda es

que se encuentra extendida en grupos que no son metanógenos [Elias et al, 1999].

La coenzima M está involucrada en otras reacciones de reducción a metano como la que ocurre a

partir de C02 o acetato (Figura 6gj) entre otros. Este último, es una de las principales fuentes y

solo se han cultivado dos géneros que lo llevan a cabo: Methanosarcina y Methanothrix. En este

conjunto de reacciones, el acetato debe ser activado a AcetilCoA antes del clivaje de los enlaces C-

C y C-S. El grupo carbonilo es oxidado a C02, el grupo metilo es transferido vía

tetrahidrosarcinapterina a la coenzima M. La metanogénesis partiendo de CO2, toma lugar bajo

condiciones anóxicas y es una forma de respiración anaerobia [Conrad, 1996].

Las CO-deshidrogenasas también son enzimas claves en el ciclo del carbono en los suelos, puesto

que intervienen en el metabolismo del CO de microbios diversos fisiológica y filogenéticamente,

que lo utilizan como única fuente de energía y carbono [Lorite et al, 2000], entre ellos se cuentan

hongos, actinomicetos, otras bacterias y arqueas [King, 2003]. Además de la oxidación de CO, se

encuentran involucrados en la reducción de acetil-coA (metanogénesis) y en la reducción de

compuestos como el sulfuro y disulfuro de carbono (Figura 6gh), por lo cual fueron consideradas.

La degradación de compuestos orgánicos naturales más recalcitrantes como la quitina, la lignina y

la celulosa, es de suma importancia para el retorno al sistema de sus principales constituyentes,

siendo el carbono el elemento de mayor proporción. La despolimerización de estos compuestos

también conlleva la liberación de una importante fuente de nitrógeno y azufre, por lo cual, estos

polímeros pueden ser incluidos en los respectivos ciclos biogeoquímicos. A continuación, se

establecen las principales enzimas involucradas en dichos procesos, en donde su carácter único, las

lleva a ser seleccionadas como marcadores. Los hongos como unos de los mejores degradadores

de lignina, secretan varias enzimas oxidativas incluyendo LiP, MnP, lacasas y quitinasas [Larrondo

et al., 2003], utilizadas como marcadores.

Las lacasas (bencenodiol oxigeno oxidoreductasas), son glicoproteínas que contienen cuatro

átomos de cobre y catalizan la oxidación de la lignina, usando oxígeno molecular como aceptar de

electrones; el cual es luego reducido a agua. Las lacasas fúngicas, degradan lignina en conjunción

con la lignin peroxidasa (LiP) y la manganeso peroxidasa (MnP) [Muñoz et al., 1997] (Figura 6p).

Los sustratos van formando radicales libres que pueden convertirse en quinonas mediante

oxidaciones [Lucas etal., 2001].

El ciclo catalítico de las LiP o ligninasas es semejante al de otras peroxidasas. La oxidación de la

enzima a expensas del peróxido de hidrógeno, origina la transformación de su sitio activo en un

compuesto intermediario (compuesto I, Figura 6o). Este compuesto actúa como generador de

radicales libres. Así, en presencia de un compuesto aromático (fenólico o no) donador de

electrones, el compuesto I es reducido a compuesto II (ganando un electrón) a la vez que se

genera un radical aromático (.+). Tras una segunda reducción del compuesto II con un sustrato

aromático se regenera la enzima nativa, cerrándose el ciclo. Es la peroxidasa con el más alto

potencial de oxidoreducción, lo que explica su poder oxidante sobre las unidades aromáticas no

fenólicas de la lignina [Lucas etal., 2001].

0 ciclo catalítico de la Manganeso Peroxidasa es semejante al de la LiP, pero hay diferencias en la

reacción de reducción, siendo el Mn(II) el donador de electrones. Tanto el compuesto I como el II

son reducidos por el Mn(II) (Figura 6q), a la vez que éste es oxidado a Mn(III). Los iones Mn(III)

con alto potencial de reducción son estabilizados mediante la formación de quelatos con ácidos

orgánicos como el oxalato, malonato, malato, tartrato o lactato [Lucas etal, 2001].

Los genes para celulasas fueron recopilados teniendo en cuenta la selección de éstos genes

realizada por Lynd et al. [2002], en la cual se indican los diferentes genes codificantes para los

grupos de acción catalítica de éstas: endo-B-glucanasas, exo-B-glucanasas, celobiohidrolasas y

celodextrinasas. La inclusión de estos procesos y las proteínas catalizadores de la despolimerización

de la celulosa, se basa en que este compuesto es el mayor componente de la biomasa vegetal.

6.1.2. C ic lo del A zufre:

Los microorganismos son los principales contribuyentes del ciclo del azufre, por ejemplo, los

microorganismos fotosintéticos usan sulfuro como fuente de electrones. En ausencia de luz, este

compuesto puede pasar hacia ambientes oxidados, en donde géneros de quimiolitoautótrofos como

Thiobacillus realizan su acción. En contraste, cuando el sulfato se difunde hacia hábitat reducidos,

provee una oportunidad para que otros grupos microbianos lo reduzcan, utilizándolo como aceptar

de electrones para la producción de energía. Este es un ejemplo de un proceso de reducción

desasimilativa y de respiración anaerobia. En comparación, la reducción de sulfato para su uso en

biosíntesis de aminoácidos y proteínas es descrita como reducción asimilativa. El sulfito es un

intermediario que puede ser reducido a sulfuro por una amplia variedad de microorganismos,

incluyendo A/teromonasy Clostridium, Desulfovibrio y Desulfotomaculum [Prescott etal., 2000].

Se ha reconocido que enzimas como la sulfuro oxigenasa, que cataliza la oxidación de compuestos

de azufre muy reducidos como el azufre elemental e iones sulfuro, la tiosulfato citocromo C-

oxidoreductasa que aprovecha la capacidad donadora de electrones del tiosulfato, la sulfito oxidasa

encargada de la oxidación de sulfito a sulfato, la APS reductasa involucrada en la producción de

Adenosin-fosfosulfato, que ha sido propuesta como un marcador útil por el grado de conservación

de las secuencias codificantes en diferentes grupos [Friedrich, 2002] y la ADP sulfurilasa encargada

de la liberación del ión sulfato, son las principales encargadas de la etapa oxidativa del ciclo del

azufre, que permite su aprovechamiento por las plantas y otros organismos (Figura 61). Otra vía de

oxidación de azufre ocurre a través de la oxidación a ácido sulfídrico, la posterior oxidación a sulfito

por medio de la enzima Sulfito reductasa, la cual es dependiente de Fe3+ y la formación de SO<t“

con la ayuda de la oxidoreductasa S-Fe (Figura 6k).

La reducción de sulfato por las dos vías existentes, asimilativa y desasimilativa, muestran enzimas

de distribución generalizada entre los grupos funcionales. La primera vía es requerida para la

formación de aminoácidos como la cisteína, precursora de las moléculas orgánicas que contienen

azufre reducido [Snoeek et al., 2003]. La respiración anaerobia de sulfato es un componente

central del ciclo global del azufre y es exhibida solo por procariotes [Loy etal., 2002].

Las enzimas ATP sulfurilasa, flavoproteina hierro-azufre adenosin 5-fosfosulfato reductasa (APS) y

la sirohemo sulfato reductasa, están involucradas en el metabolismo tanto oxidativo como

reductivo (Figura 6m), la primera, por ejemplo, es la enzima clave encargada de la activación del

sulfato [Snoeek et al., 2003]. Todas las enzimas son encontradas generalmente en bacterias y

arqueas reductoras de sulfato. Además, la presencia de APS reductasa y ATP sulfurilasa ha sido

reportada para varias especies de bacterias sulfuro-oxidantes quimiotróficas y fototróficas, esto las

hace de utilidad en la evaluación de la ocurrencia de las reacciones en suelo. La enzima(bi)sulfito

reductasa desasimilativa (DSR), ha sido reportada como la enzima primordial en la ruta

desasimilativa de reducción de sulfato y sulfito [Karkhoff etal., 1995].

6.1.3. C ic lo del N itrógeno

Debido a que el nitrógeno del nitrato se haya muy oxidado, debe ser primero reducido a amonio

antes de poder ser convertido a una forma orgánica. Esta reducción de nitrato es de tipo

asimilativo. En este caso, el nitrógeno hará parte de la materia orgánica y no es utilizado para la

generación de energía [Prescott et al., 2000]. Este proceso se consideró trascendente por cuanto

permite una forma de almacenamiento temporal del nitrógeno, regulando su disponibilidad

biológica, lo que es muy importante en suelos tropicales en donde el exceso de nitrógeno se pierde

rápidamente, ya sea por denitrificación o por lavado, así que la reserva en la biomasa microbiana

resulta crítica para la fertilidad de los suelos. Como puede observarse en la figura 6b) en los

hongos existen dos enzimas claves ejecutando la función, la nitrato reductasa (NIAD) y la nitrito

reductasa (NIIA) [Kinghorn, 1989]. En bacterias pueden estar involucradas varias enzimas

diferentes, dependiendo del organismo a tratar (5d), NARB y NIRA en Cianobacterias y NASA,

NASB y NASC en una amplia diversidad de microorganismos [Alien et al., 2001]; también fueron

consideradas dos enzimas relacionadas con la transferencia de electrones hacia el citoplasma NRFA

(Figura 6f) y NASC.

La nitrificación, el proceso aerobio de oxidación del ión amonio (NH4+) a nitrito (NCh) y

subsecuentemente a nitrato (N03 ), es de igual manera una transformación que permite que exista

disponibilidad de nitrógeno en un estado fácilmente asimilable por las raíces [Salisbury & Ross,

1994]. En un aspecto negativo, las bacterias oxidantes de amonio tienen actividad sobre

fertilizantes a base de urea y de amonio, oxidándolos a nitrito, por lo cual son fácilmente lavados,

generando importantes pérdidas al favorecer también la denitrificación [Purkhold etal, 2000]. La

enzima AMOA (Figura 6e), es una enzima única para los mirificantes oxidantes de amonio y de la

cual se sabe que provee un nivel de resolución filogenético que cubre los diferentes taxa [Casciotti

& Ward, 2001; Purkhold et al., 2000; Rosch et al., 2002; Aakra et al., 2001], por lo cual fue

escogida como marcador adecuado en la evaluación de esta función en suelos.

0 proceso de densificación, requiere un conjunto de condiciones ambientales diferente. En este

proceso desasimilativo, el nitrato es usado como un oxidante en la respiración anaerobia. Los

principales productos incluyen N2 y N20, aunque el nitrito (N02) también puede acumularse. El

nitrito es de importancia ambiental, debido a que contribuye a la formación de nitrosaminas

carcinogénicas y constituye un compuesto tóxico para las plantas. Finalmente, el nitrato puede

también ser transformado a amonio en una reducción desasimilativa por una variedad de bacterias,

incluyendo Geobacter metall/reducens, Desulfovibriospp., y Clostridium spp. [Prescott etal., 2000].

Dado que la densificación completa requiere de la acción secuencial de 4 enzimas, la nitrato

reductasa, la nitrito reductasa, la óxido nítrico reductasa (monóxido de nitrógeno reductasa), y la

óxido nitroso reductasa (monóxido de dinitrógeno reductasa) (Figura 6a), éstas, deben ser

consideradas conjuntamente para la evaluación de la acción biológica sobre el ciclo del nitrógeno.

De las dos nitrato reductasas, la enzima asociada a membrana está típicamente involucrada con la

respiración de este compuesto bajo condiciones anóxicas, y juega probablemente el papel más

importante en el ciclo ambiental del nitrógeno [Gregory et al., 2003]. Esta enzima condiciona el

éxito de las bacterias oxidantes de amonio para tolerar grandes cantidades de nitrito o el

crecimiento en ambientes anóxicos. Así mismo, la nitrito reductasa en una enzima clave en la vía

de la denitrificación, como lo indican Casciotti & Ward [2001]. Por el contrario, la utilidad de la

monóxido de nitrógeno reductasa ha sido puesto en duda, debido a que se ha encontrado que

pequeñas cantidades de NO son originadas a menudo a partir de la respiración de nitrato, y no de

la denitrificación, por lo que esta propiedad parece no ser exclusiva de los denitrificantes [Zumft,

1997].

La asociación catalítica napAB (Nitrito reductasa periplásmica, Figura 6f) tiene una variedad de

papeles fisiológicos en diferentes organismos, desde la catálisis del primer paso para una

verdadera vía de densificación anaerobia, hasta el aprovechamiento de bajas concentraciones de

nitrato, permitiendo su respiración en presencia de oxígeno y conduciendo al consumo de

equivalentes reductores durante el crecimiento sobre carbono reducido [Richardson, 2000; Zumft,

1997],

La enzima hidroxilamin oxidoreductasa también puede catalizar una reacción de densificación en

ausencia de oxígeno utilizando como aceptor de electrones el nitrito (Figura 6f), se ha descrito en

especies de Planctomycetales como Scalíndua sorokinn, Kuenenia stuttgartiensis, Brocadia

anammoxidans, P/anctomyces. Es una reacción inhibida además por exceso de nitrito o fosfatos

[Strous et al., 1999].

Por otra parte, la fijación de nitrógeno, proceso biológico único que permite el aprovechamiento de

la fuente atmosférica de este macroelemento, es llevada a cabo por procariotes aerobios y

anaerobios, simbióticos y libres, en un proceso de alto consumo energético en el cual se suceden

consecutivamente procesos reductivos graduales, cuyo objetivo final es la obtención de amonio

(Figura 6c). Debido a que ha sido extensamente estudiada, la subunidad II de la dinitrogenasa de

hierro codificada por el gen nifH no fue incluida en el estudio. Se han diseñado cebadores y sondas

eficientes para este marcador [Poly et al., 2001], por lo cual, se consideró realizar la búsqueda

para los heterodímeros de la subunidad I de la dinitrogenasa (nifD y nifK), para las subunidades

alfa, delta y beta de la nitrogenasa de vanadio (vnfD, vnfG y vnfK) y para las subunidades alfa3,

beta 3 y delta3 de la dinitrogenasa II (anfD, anfG y anfK), así como las nitrogenasas alternativas

(vnfH y anfH).

Para genes representativos del ciclo del nitrógeno, como nitrogenasa, nitrito reductasa

desasimilativa y amonio monooxigenasa, no existe hibridización cruzada con genes de la nitrito

reductasa nirS y nirK [Taroncher et al., 2003], por ello fueron considerados candidatos para el

estudio realizado, puesto que pueden ser analizados en paralelo.

6.1.4. C ic lo del H ierro

El ciclo del hierro, incluye varios géneros microbianos diferentes que realizan su oxidación, la

transformación de ión ferroso (Fe2+) a férrico(Fe3+). ThiobacWus ferrooxidans lo ejecuta bajo

condiciones acidas, Gallionella es activa bajo pHs neutros y Sulfolobus funciona bajo condiciones

ácidas y termofílicas. Otros organismos como Sphaerotüus y Leptothrix, producen esta oxidación

con la formación de hierro insoluble, que precipita a pH neutro pero creciendo sobre sustratos

orgánicos (quimioheterótrofos) [Straub et al., 1996]. Este ciclo está estrechamente ligado al del

azufre, siendo muy dependiente de los procesos oxidoreductivos de los compuestos azufrados

(figura 6k) y a la metanogénesis, en donde la disponibilidad de Fe(III) como un aceptor de

electrones alterno para la respiración microbiana es un factor controlador. Su acción donante de

electrones también es sumamente importante en bacterias aerobias [Straub et al, 1996]. La

importancia de este ciclo tiene entre sus argumentos el hecho de que en suelos del trópico, este

elemento contribuye a la "pérdida" del fósforo disponible en los suelos; el alto contenido de hierro

hace casi inoficiosa la aplicación de fertilizantes fosforados, los cuales son rápidamente

inmovilizados. En ecosistemas inundados o con regímenes pluviométricos variables, la

disponibilidad del fósforo y otros elementos está relacionada con los estados de oxidación del

hierro. La única enzima considerada específica para este ciclo es la rusticianina, la cual es una

proteína de cobre y el componente principal en la cadena de transporte de electrones en

quimiolitótrofos acidófilos como T. ferrooxidans, razón por la cual fue seleccionada [Walter et al.,

1996] (Figura 6n).

6.1.5. C ic lo del Fósforo

Debido a que el ciclo del fósforo es de carácter sedimentario, y a que no existe un grupo funcional

que sea considerado como solubilizador o fijador de fósforo, encontrar un marcador específico para

este ciclo no fue posible. La capacidad degradadora de materia orgánica, y la actividad de

fosfatasas con la consecuente liberación de compuestos fosforados, es una capacidad extendida en

el mundo microbiano, por lo tanto, se estimó adecuado tener en cuenta solo aquellos organismos

que por sus características, facilitan el acceso de este importante elemento a las plantas, las

micorrizas; las cuales funcionan a manera de bombas, concentrando el escaso fósforo de algunos

suelos en su micelio. Las micorrizas son un puente entre diferentes ciclos, como el del carbono y el

nitrógeno; parecen estar involucradas en la fijación de este último, gracias a la presencia de

endosimbiontes del género Burkholdería [Minerdi et al., 2001] y, adicionalmente permiten la

recuperación de fósforo del sumidero geoquímico retornándolo al sistema biológico. Dado que para

la detección de estos organismos se han diseñado cebadores y sondas basadas en ARNr subunidad

pequeña [Kjoeller & Roendahl, 2001; Redecker, 2000; Redecker etal, 2000], su evaluación es una

excepción a la orientación original de esta investigación, por cuanto no se trata de un grupo

funcional sino de un grupo taxonómico. La información recopilada alrededor del Orden Gomales

permitió conocer la existencia de secuencias que permitieran la detección de dos nuevos grupos

que han sido considerados recientemente, el género Archaeospora y el género Paraglomus [Morton

& Benny, 2001] y por consiguiente en este trabajo fueron abordados, observando las regiones

codificantes para ARNr 18S, 5.8S, y los espaciadores intergénicos USl e US2.

La utilización de hidrógeno como donante de electrones por muchas bacterias, con ayuda de

hidrogenasas para la producción de ATP o para crecimiento autotrófico está ligada a muchas

reacciones dentro de los ciclos biogeoquímicos, como se observa en el modelo que fue diseñado

posterior al establecimiento de las reacciones enzimáticas.

6.2. MODELO CONCEPTUAL

Una vez detectadas las vías bioquímicas para los procesos mencionados, se inició la búsqueda de

los genes encargados de la codificación de sus enzimas, teniendo en cuenta que a pesar de que

éstas medien las reacciones bioquímicas de una ruta metabólica particular y por ello pueden

parecer semejantes, los nombres de los genes codificantes pueden variar entre organismos, como

pudo observarse para las enzimas: rusticianina (Rus, rust), Nitrito reductasa (nrfA, nirB) y lacasa,

entre otras.

A partir de las fuentes de información recopiladas (vías bioquímicas, enzimas y genes), se diseñó

un modelo conceptual (Figura 7) en el que se integraron las principales etapas de la actividad

biológica en el retorno de los elementos químicos hacia el suelo, como un primer paso para el

desarrollo del sistema de sondas moleculares, que permitiera seguir las dinámicas de dichos

procesos. Esta forma de representación, permitió observar de una manera más explícita las vías de

retroalimentación y de qué manera las alteraciones en alguno de sus componentes pueden afectar

a los restantes.

A continuación, se describen las diferentes zonas en que se divide el modelo (ver Figura 7),

iniciando con el proceso de mineralización de la materia orgánica: La mineralización de la

necromasa es un aspecto vital para el componente heterotrófico; en esta transformación, se

liberan componentes en diferentes estados de degradación [Odum, 1972; Brock & Madigan, 1993]

a partir de sustancias complejas que de esta manera pueden ingresar a un ciclo biogeoquímico, o

ser aprovechados directamente y de forma inmediata por ia biota. Dentro del ciclo del carbono, se

representa la actividad de los hongos micorrícicos en el retorno de materia desde el suelo hacia las

plantas (uniendo dos compartimientos del ecosistema), la actividad de los organismos

fermentadores y de otros microorganismos que degradan compuestos recalcitrantes como lignina,

quitina, huminas y celulosa en sus constituyentes simples [Steffen et al., 2002; Muñoz et al., 1997;

Metcalfe et al., 2002] y que aumentan de esta manera la velocidad de retorno de los diferentes

elementos químicos. Otra forma de ingreso del carbono involucra el componente gaseoso, en

donde éste es fijado a través de procesos fotosintéticos con mediación del oxígeno o de sustratos

diferentes (fotosíntesis anoxigénica), u oxidado por bacterias carboxidotrofas [Drake et al., 2002;

King, 1999]. Así mismo, se produce su retorno hacia la atmósfera en forma de metano, con la

mediación de compuestos reductores como el hidrógeno [Valentine, 2002]. Otro ciclo que involucra

a este último, es el del hierro, el cual exhibe formas de mayor o menor solubilidad de acuerdo a su

estado de oxidación [Sobolev & Roden, 2002], lo que incide también en los ciclos del azufre y del

fósforo, elemento éste, al que comúnmente se encuentra ligado [Vera et al., 2002]. El ciclo del

nitrógeno también se ve afectado por el estado redox del sustrato, puesto que su retención o

liberación, obedece a los niveles de saturación hídrica del suelo [Braker & Tiedje, 2003]; así, en

suelos inundados o anóxicos predominan procesos de denitrificación [Braker & Tiedje, 2003] que

tienen como resultado la pérdida del nitrógeno hacia la atmósfera, caso contrario a suelos bien

drenados en donde son frecuentes los procesos de fijación de este elemento y su circulación en

formas oxidadas [Zehr et ai, 2003]. Se encontró hace un tiempo, que la oxidación del hierro (II)

está acoplada al proceso de denitrificación siguiendo la reacción: lOFeCOs + 2NQ3 + 24H20 ---- >

10Fe(OH)3 + N2 + lOHCOf + 8H+ [Zumft, 1997],

Finalmente, el ciclo del azufre resulta ser bastante complejo debido a los diferentes grados de

oxidación que puede presentar, y a la gran variedad de compuestos de los que forma parte; su

trayectoria va desde compuestos muy oxidados como el sulfato, hasta formas gaseosas como el

ácido sulfídrico, que domina en suelos reductores [Castro et al., 2002] y que condiciona su

desaparición del ecosistema.

Los elementos químicos considerados, pueden hacer parte tanto de vías degradativas, como de

vías de construcción de estructuras biológicas, o simplemente de mecanismos de disipación de

energía. La visualización esquemática de las enzimas involucradas en cada uno de los procesos

mencionados, así como de los genes encargados de su codificación, facilitan el seguimiento y

desarrollo de la Investigación, pues establecen un primer paso en la búsqueda de secuencias

anotadas en las bases de datos, y permiten su actualización a medida que el conocimiento de la

biología molecular de estos procesos es ampliada para un mayor número de organismos. Como se

dijo anteriormente, los nombres de los genes codificantes suelen sufrir variaciones, por este

motivo, se requiere efectuar búsquedas exhaustivas en las bases de datos, no solamente

ingresando el nombre particular de un gen, sino también la actividad enzimática. Con la estrategia

planteada fueron encontradas secuencias para 192 genes (ver Tabla 4).

6.3. APROXIMACIÓN FUNCIONAL

El estudio fue proyectado para centrarse en la clasificación funcional más que en la taxonómica,

puesto que la especialización microbiana se manifiesta más de forma bioquímica que morfológica.

Ha sido un punto de vista discutido, sin embargo las razones son evidentes:

1. Aún se desconoce la existencia de un elevado porcentaje de microorganismos del suelo, con lo

cual se pueden deducir iguales falencias en cuanto a su ubicación taxonómica; no es posible prever

si nuevas secuencias reportadas pertenecerán a un grupo anteriormente descrito o constituirán un

nuevo taxón.

2. El abordaje funcional es mas incluyente, permite asociar de manera más segura un

organismo, aún cuando no haya sido anteriormente descrito, puesto que es más probable que un

gen de gran importancia metabólica, exhiba regiones conservadas que ayudan en su identificación,

aún en grupos diversos. Su variación estará condicionada por el tiempo de divergencia a partir de

un ancestro común, y por ello las sondas a construir deben tener en cuenta diferentes niveles

taxonómicos.

3. El diseño de sondas que permitan un abordaje taxonómico viable (es más difícil cubrir la

totalidad de especies descritas), debe tomar en cuenta solo niveles de clasificación por encima de

especie, ya que es conocido que bacterias que pertenecen a un mismo género, de hecho pueden

diferir en cuanto actividades metabólicas específicas.

4. Debido al desconocimiento que persiste para la mayoría de géneros y especies del suelo, el

abordaje taxonómico encasilla a los microorganismos dentro de un grupo fisiológico en particular.

Por el contrario, en la naturaleza, es común que un organismo desempeñe diferentes funciones

dependiendo de su hábitat y de variaciones ambientales específicas (historia de vida), por ello la

aplicación taxonómica resulta ser restrictiva y excluyente.

5. El abordaje taxonómico también puede dejar de lado especies endémicas, nunca descritas y

que pueden ser claves en la productividad del ecosistema gracias a su actividad.

6. La comunidad es una unidad funcional, con una estructura que es más variable que el tipo de

metabolismo, las especies que la componen son hasta cierto punto intercambiables en tiempo y

espacio (Fernández etal., 1999).

Con lo anterior, se concluye que la evaluación funcional integral, permite visualizar de una manera

más real el nivel de estabilidad de un ecosistema, en donde el suelo puede ser utilizado como un

mecanismo que refleja su estado de salubridad. La evaluación de un proceso químico aislado no

siempre resulta tan informativa en la detección de alteraciones, puesto que los organismos están

asociados en comunidades bióticas, las cuales mantienen su unidad gracias a la interdependencia

de sus miembros. La evaluación de la diversidad funcional en conjunto, permite establecer si un

ecosistema es sustentable o ha sido gravemente disturbado, establecer grados de alteración y

generar indicadores de niveles de recuperación o del estado sucesional en que se encuentra un

ecosistema.

Otra ventaja de este abordaje frente al procedimiento tradicional (cultivo en medios artificiales), es

que a través de esta metodología, puede ser posible detectar la actividad biológica, aun cuando

ésta sea muy reducida, incluso bajo umbrales que no pueden ser detectados por métodos

convencionales, ya que por medio del uso de microarreglos se ha llegado a la detección de

cantidades muy pequeñas de ADN, del orden de 10 pg (equivalente a aproximadamente 10

copias) por blanco [Cho & Tiedje, 2002]. Por el contrario, si un organismo perteneciente a un

grupo funcional, no crece en el medio de cultivo selectivo, existe la incertidumbre de si en realidad

dicha función está ocurriendo en el suelo o no, o se trata tan solo de que aquellos grupos

encargados de la misma no pueden ser aislados.

6.4. BASE DE DATOS

A partir de la información de secuencias obtenidas en los bancos mundiales de datos como se

menciona en la bibiografía, se creó una base de datos para consulta local, con 3668 entradas para

ADN y 3955 entradas para proteína, escrita en lenguaje basic de OpenOffke, para las plataformas

Windows y Linux, a la cual es posible acceder mediante una interfase gráfica que se despliega por82

medio de la Suite OpenOffice, como se observa en las Figura 16 y 17, este programa es de tipo

"Open Source" por lo cual se incluye en el CD adjunto.

Acerca de BioPiocSuelos

Ayuda

Este programa forma parte integral de la

Tesis de Grado

DISEÑO DE UNA ESTRATEGIA PARA LA

EVALUACION DE ATRIBUTOS

FUNCIONALES EDAFICOS MEDIANTE

SONDAS DE ADN

Bogotá D.C.. Colombia Octubre de 2004

Figura 16. Ventana de bienvenida a la consulta para la base de datos Bioproc_suelos.

BloProcSiSistema de Consulta a la Base de Dato

r....MOLECULA - — — -— ------------------------ — — ----------■-----------------

A D N r P r o t e ín a s

1 Seleccione Campo _Ljjsel J l l 1 Seleccione Campo JÜr y1 Seleccione Campo j J ) - ' - J 1 Seleccione Campo j jr *

-iJI: | Seleccione Campo JÜ

ConsultarCancelar Ayuda

Figura 17. Ventana de consulta de la base de datos BioProc_suelos.

La base se encuentra dispuesta en formato CD, fue dividida en secciones correspondientes a los

datos de proteína y de ADN, en la cual se consignó la información referente a los campos

previamente seleccionados en la metodología, además de otros como información de ID de familia

de proteína en la base ProDom, descripción general de la familia y la fuente a partir de la cual se

obtuvo el ID de las secuencias.

El análisis de la cantidad y calidad de los datos de la base, se presenta en las Figuras 8 a 13, que

se consideran a continuación. La Tabla 3 muestra los géneros de microorganismos reportados en

las bases de datos.

Las gráficas 7 y 10 muestran una mayor cantidad de reportes de secuencias de ADN y proteína

pertenecientes al Dominio Bacteria, frente a los Dominios Eukarya y Archaea; lo cual se justifica,

debido a que la mayoría de estudios difundidos han estado dirigidos hacia este dominio en

particular. Los informes de secuencias de hongos son más escasos y se limitan a grupos fisiológicos

particulares como los ligninolíticos y los quitinolíticos, en donde su alta capacidad de degradación

de compuestos recalcitrantes ha sido comprobada [Gutiérrez & Roncando, en línea].

Tradicionalmente, el Dominio Archaea ha sido asociado con hábitats extremos; posiblemente esta

ha sido la causa de que muy poca atención haya sido puesta en el análisis de sus actividades en

suelos. Sin embargo, empieza a reconocerse su presencia e importancia en ecosistemas terrestres

[Basset et al., 1999; Borneman & Triplett, 1997; Kent & Triplett, 2002],

Se cuenta también con una modesta representación de secuencias no identificadas más allá del

nivel de dominio, indicio del desconocimiento que persiste en el área de la microbiología de suelos,

en donde según ha sido señalado anteriormente, un mínimo porcentaje de microorganismos han

sido aislados [Ovreas et al., 1998]. Existen aún un gran número de microorganismos edáficos por

ser reconocidos y por ende muchos de los genes involucrados en ciclos biogeoquímicos por

identificar y secuenciar; en tanto que la vasta mayoría de las secuencias referidas en las bases de

datos pertenecen a organismos cuyos genomas han sido el foco de interés y definidos como

organismos tipo. Los análisis moleculares filogenéticos de los genes norB, detectaron dos

subgrupos separados: por una parte los organismos cultivados y por otra genes obtenidos de

muestras ambientales, demostrando una discrepancia típica entre estos dos tipos [Braker & Tiedje,

2003]. Scala & Kerkhof [1999], también indican que no existe sobrelapamiento en las secuencias

del gen nosZentre los microorganismos del grupo cultivado y las secuencias ambientales. Dado lo

anterior, una mayor diversidad de grupos taxonómicos representados en las bases de datos,

redunda en una mayor precisión en el desarrollo de herramientas que permiten la detección de los

grupos funcionales, en sistemas complejos como el suelo. Sin embargo, es de esperarse que dada

la importancia que las actividades enzimáticas requeridas en los ciclos de nutrientes tienen para los

organismos que las llevan a cabo, las similitudes entre grupos de secuencias de ADN de diferentes

organismos sean consistentes y que por lo tanto las secuencias consenso desarrolladas, permitan

cubrir un amplio intervalo de éstas en los suelos. Por otra parte, se ha encontrado que el grado de

conservación de los genes microbianos, es similar entre diferentes genomas y que alrededor de un

70% de los genes de cualquier organismo tiene homólogos en otros genomas [Peplies et al,

2003].

Otro aspecto relevante, es el relativamente escaso número de investigaciones que se relacionan

con la microbiología del suelo, realizadas durante los últimos años. No obstante haberse

encontrado entre los datos alrededor de 700 reportes de diversa índole que involucran a estos

microorganismos, existen tan solo 35 investigaciones en donde el objetivo principal fue la

microflora edáfica. Es llamativo encontrar que de estos reportes, alrededor del 90% han sido

llevados a cabo en suelos de climas templados. Los conocimientos acerca de la biología molecular

de microorganismos de suelos tropicales que han sido difundidos entre la comunidad científica, son

poco numerosos, y no existen trabajos suficientes que aborden la existencia de endemismos que

incluyan áreas relativamente pequeñas [Cho &Tiedje, 2000; Febles & González, 2002].

En las gráficas 8 y 11, se demuestra una mayor representación de la división Proteobacteria

respecto a otros grupos, esto se debe a que son bacterias que despiertan gran interés y que han

sido ampliamente estudiadas fisiológica y filogenéticamente, en primer lugar, por su capacidad

oxidativa de metano [Lucchini etal., 2001; Morris et al., 2002]; en segundo lugar, la enzima clave

de este proceso, la metano oxigenasa (pmoA) ha mostrado estar relacionada filogenéticamente

con otra enzima prioritaria, la amonio monooxigenasa (amoA) [Lucchini etal, 2001; Morris etal,

2002] y esto ha despertado gran interés. El elevado número de secuencias reportadas,

procedentes de estos dos genes son la causa de este fenómeno (secuencias de ADN reportadas

para amoA, 156; para pmoA, 99; secuencias de proteína reportadas para los genes amoA, 154;

para pmoA, 109).

Las gráficas 9 y 12, indican una escasa representación de géneros microbianos entre las secuencias

de ADN y proteína registradas en las bases de datos. Por ejemplo, en la figura 10 se puede

observar que más del 80% de los géneros exhibe un escaso número de secuencias, los genes

bgxA, abg, ce/A, ce/C, celY, chi92, pchA, sat, para los que se registra solo una secuencia, no

pudieron ser incluidos en el análisis, mientras que otros genes mostraron solo dos secuencias, lo

cual es insuficiente para la obtención de consensos adecuados para el desarrollo de sondas

[Taroncher et al., 2003]. Un comportamiento similar se observa para las secuencias de proteína. El

número y calidad de las secuencias evaluadas, es un factor de suma importancia en el diseño de

oligonucleótidos, puesto que la evaluación de un número adecuado de secuencias permitirá así

mismo, apreciar la mayor cantidad posible de sus variantes y con ello, la probabilidad de

recuperación en una muestra de suelo de secuencias relacionadas con una vía metabólica en

particular, se incrementa.

Uno de los principales obstáculos encontrados, fue la ausencia de reportes de secuencias

referentes a algunos procesos enzimáticos de los ciclos del nitrógeno y azufre: oxidación de nitrito,

oxidación de azufre elemental, oxidación de sulfito y oxidación de APS, entre otros. A pesar de los

esfuerzos realizados para la comprensión de los procesos ocurrentes en los suelos, la aún escasa

aplicación de metodologías moleculares en el área de suelos, no ha permitido acelerar el proceso

de conocimiento de los diversos genomas presentes en ellos, como primer paso para la detección

de secuencias codificantes de enzimas involucradas en ciclos biogeoquímicos. Sin embargo, la

aplicación de estrategias de minería de datos como es el caso de la presente investigación,

permiten identificar carencias en estos campos y por lo tanto pueden ayudar a focalizar los nuevos

estudios hacia áreas que aún no han sido abordadas.

Cuando los alineamientos obtenidos fueron observados en una escala taxonómica encima del nivel

de familia (en donde se espera una alta divergencia de secuencias), aún se encontraron secuencias

consenso muy similares a las de niveles inferiores (napA, narH, nosZ, y anfDentre otros, evaluados

al nivel de división), lo que puede revelar eventos de transferencia horizontal de genes, como se ha

comprobado para la enzima sulfito reductasa desasimiiativa (dsrAB), Adenosin-5-fosfosulfato

reductasa (apsA) [Friedrich, 2002; Wagner et al, 1998], lignin peroxidasa {Hp) [Stewart & Cullen,

1999], el grupo de genes /7/r (nitrito reductasa) [Braker et al., 1998] y para el gen nap (nitrito

reductasa periplásmica) [Moreno et al., 1999], ya que estos eventos son relativamente frecuentes

[Prozorov, 2001], incluso entre bacterias y hongos [Zumft, 1997]. Dado que las partículas de arcilla

pueden proteger al ADN liberado de ser degradado por nucleasas, el hecho puede facilitar la

transformación de células bacterianas competentes [Nannipieri et al, 2003]; el fenómeno también

puede ser causado por un alto grado de conservación de secuencia, a pesar de las grandes

distancias evolutivas que pueden separar estos grupos.

Friedrich [2002], ha sugerido otro planteamiento para explicar este tipo de fenómeno en los genes

dsrAB, indicando que éstos pueden ser parte de islas metabólicas móviles. Las APS reductasas

desasimilativas muestran homología con las succinato y fumarato reductasas, mientras el tipo

asimilativo se ha relacionado con la superfamilia CysH. Así, las dos clases de la enzima, que llevan

a cabo reacciones catalíticas similares, pueden tener orígenes evolutivos diferentes [Bick et al,

2000].

6.5. ANÁLISIS DE LAS HERRAMIENTAS Y CRITERIOS BIOINFORMÁTICOS

En la búsqueda efectuada en las 3 principales bases de datos mundiales, fueron seleccionadas

aquellas secuencias codificantes relacionadas con las vías metabólicas de interés; elementos en Cis

y secuencias STS no fueron evaluadas, debido a que en primer lugar, las STS son secuencias

relativamente inseguras, altamente redundantes y que pueden constituir contaminantes o

artefactos de la clonación [Schuler, 1997], por otra parte, las secuencias en Cis, corresponden a

elementos controladores que participan en eventos de replicación, transcripción y traducción

[Lewin, 2001]. Dado que para la detección de la actividad microbiana relacionada con los ciclos

deberá hacerse acopio de transcritos, estos elementos no fueron considerados. Adicionalmente, la

falta de conocimiento acerca de muchos de los elementos reguladores para las diversas rutas

metabólicas hacen de momento incierta su utilización.

Se decidió utilizar ambos tipos de secuencias, ADN y proteína, con el objetivo de obtener

resultados más consistentes y en algunos casos complementarios. Es necesario tener en cuenta

que, dado que las proteínas son un producto funcional del gen, la preservación de su secuencia es

crítica, por esta razón, resulta ser de mayor utilidad su evaluación a diferentes niveles

taxonómicos, en tanto que las secuencias de ADN pueden ser más útiles cuando se analizan

relaciones en categorías por debajo de familia o en secuencias que se sabe que evolucionan muy

lentamente [Alyar, 2001].

Se prefirió la utilización del sistema de recuperación de secuencias de Lion Bioscience, debido a

que ofrece una mayor flexibilidad para la formulación de búsquedas, al permitir la inclusión de

re/eases y updates de las diferentes bases de datos de manera separada y la realización de

búsquedas más complejas gracias a las posibilidades de cruzar diferentes bases de datos. Así

mismo, los campos de búsqueda se amplían incluyendo colecciones de cultivos y listados

taxonómicos cuando así se requiere.

Se realizaron variaciones en los grados de rigurosidad para los parámetros de alineamiento de

Clustal X, con la finalidad de reducir el número de espacios (gaps) y desapareamientos requeridos,

pues la inserción de espacios realizada de manera indiscriminada puede generar consensos cuya

ocurrencia natural es poco probable. Para algunos casos, las mayores penalizaciones tanto de

apertura de espacios como de extensión, produjeron regiones que visualmente mostraron alto

grado de similitud (diagrama de barras de ClustalX), respecto a otras combinaciones menos

estrictas. Debido a que las regiones del ADN que representan sitios activos de la proteína tienden a

ser más conservadas, los costos de apertura y extensión mayores tenderán a hacer evidentes este

tipo de regiones, a diferencia de áreas de la proteína que pueden permitirse una mayor flexibilidad

y que por lo tanto tenderán a variar mayormente a lo largo de su evolución, debido a la

acumulación de mutaciones, fenómenos de recombinación, etc. [Prozorov, 2001]. Este tipo de

secuencias puede llegar a hacerse visible con la disposición de parámetros menos exigentes

(costos de aperturas y extensiones más moderados), aunque se corre el riesgo de generar

secuencias consenso laxas, a costa de insertar y extender espacios de una manera que no pudo

ocurrir en el transcurso evolutivo. La estrategia utilizada durante la investigación, fue la alineación

de todas las secuencias, sin importar su nivel de relación, utilizando los parámetros por defecto los

cuales prevén una baja penalización (10 para apertura y 0.2 por extensión, para una escala entre

0-100), arrojando una aproximación inicial. Posteriormente, las condiciones fueron modificadas a

un valor de penalización de 80 para apertura y 70 para extensión, para aquellas secuencias

taxonómicamente más cercanas. Esto es justificado, debido a que la colocación de espacios (gapi)

en alineamientos entre secuencias estrechamente relacionadas, es mucho más segura que entre

las más distantes, puesto que el intervalo de valores de penalización que pueden encontrar la

solución correcta o la mejor posible es muy amplio [Thompson et al, 2003]. Por el contrario, con

secuencias muy divergentes, los puntajes dados a residuos no idénticos deben elegirse

cuidadosamente. Además, las diferencias de tamaño entre las secuencias pueden resultar

contraproducentes si no se penaliza debidamente la inserción de espacios, dado que el programa

tenderá a igualar en tamaño a las secuencias a través de la inserción y extensión de espacios

[Thompson et al, 2003]. Para secuencias de proteína, la elección de bajos niveles de penalización

resulta ser aún más crítica, puesto que los espacios (gaps) no ocurren aleatoriamente, sino más a

menudo entre los principales elementos estructurales secundarios de las hélices alfa y de las hojas

beta, que a su interior [Thompson etal, 2003].

Dado que los cladogramas arrojados por el subprograma NJPLOT de ClustalX fueron utilizados para

encontrar secuencias consenso por grupos de similitud de secuencias, esto permitió un máximo

aprovechamiento de la información mostrada por los alineamientos. Esta aproximación reduce la

generación de lo que podría considerarse como ruido, pero que no es más que la presencia de

subgrupos de secuencias similares entre sí pero divergentes al ser comparadas con otros

subgrupos. Su extracción puede ser muy costosa desde el punto de vista de pérdida de

información, por tal motivo deben ser reservadas para posteriormente ser tomadas como variantes

del gen que pueden ser de utilidad en el diseño del método.

Basándose en el hecho de que ClustalX alinea en primer lugar aquellas secuencias que presentan

mayor similitud, se deduce que aquellas más divergentes, resultan más difíciles de alinear de

manera correcta, por lo tanto, se considera que es mejor retardar su incorporación hasta que las

primeras secuencias hayan sido alineadas. Esto brinda una mejor oportunidad de que la decisión

de introducir los espacios (gaps) entre las posiciones menos conservadas sea correcta, por tal

motivo, el parámetro de retardo que por defecto se encuentra configurado al 30% de identidad,

fue modificado incrementándolo al 40%.

Para las secuencias de proteína se propuso un esquema similar de penalizaciones, pero

adicional mente, fue necesario considerar el tipo de matrices de puntuación utilizado. Debido a que

las matrices PAM son mas sensibles para alineamientos de secuencias homologas, se utilizó el valor

por defecto para ClustalX (PAM350), con el fin de realizar los alineamientos preliminares; luego, de

manera selectiva y de acuerdo al nivel taxonómico de agrupación, se probaron las matrices PAM40

y PAM 120 para secuencias más cercanas en su jerarquía taxonómica (como aquellas

pertenecientes a una misma familia) o aquellas más lejanas, respectivamente. Se evaluaron los

resultados de manera comparativa, para obtener el alineamiento con regiones más conservadas,

menos espacios intercalados y el mayor costo de penalización. La utilización de varios parámetros

es soportada por las recomendaciones realizadas por Thompson etal. [2003], quienes indican que

cuando las distancias mutacionales entre las secuencias son desconocidas, se deben correr por lo

menos tres búsquedas utilizando estos criterios. La matriz Blosum utilizada, fue aquella establecida

por defecto para ClustalX (Blosum 62).

De acuerdo a lo reportado por Lassman & Sonnhammer [2002], las diferencias entre los programas

Clustal y Tcoffee es escasa (5% en promedio); a pesar de lo cual, los datos fueron también

probados con este último obteniendo las ventajas de ambos métodos, dado que Tcoffee realiza el

alineamiento dos veces, una primera con el programa ClustalW (más útil cuando se quiere

comparar una secuencia en toda su extensión) y una segunda con el programa Lalign

(alineamiento local, lo que permite un alineamiento más acorde con la presencia de motivos), a

partir de los cuales genera una librería seguida de la comparación simultánea de las secuencias.

Tcoffee presenta la desventaja de que en la versión actual, no permite el alineamiento de un

número de secuencias mayor a 50, que presenten una longitud promedio de 160 residuos, ya que

genera mensajes de error.

El alineamiento por Tcoffee fue realizado con los parámetros por defecto, tanto para ADN como

para proteína, con la finalidad de cubrir las deficiencias que pudieran presentarse con la sola

utilización de ClustalX. Sin embargo, para que los alineamientos produjeran buenos resultados, fue

necesario filtrar aquellas regiones de baja complejidad, de acuerdo a lo recomendado por

Notredame etal., [2000].

Las secuencias consenso fueron ingresados en el programa BLAST (BlastN y BlastP) para la

búsqueda de secuencias similares, un ejemplo de salida está dado en la Figura 18. Dado que la

especificidad de la asociación prueba-blanco depende del grado de divergencia de la secuencia, la

cual puede ser muy alta entre genes blanco en poblaciones naturales [Pearson, 2001], es necesario

seleccionar un nivel de significancia para similitud muy bajo (<0.01), con el fin de disminuir el

riesgo de hibridización cruzada. Debido a que el número de entradas de la base de datos del NCBI

es muy grande, el valor umbral debe ser lo más bajo posible, puesto que E se incrementa

linealmente con el número de entradas [Pearson, 2001]. El valor de significancia estadística

seleccionado se consideró adecuado, puesto que una disminución demasiado grande puede

aumentar el riesgo de cometer error estadístico tipo II, el cual debe ser minimizado.

Sequences pr-oriucinq siqnificant alignaents:

gi|5713167lgbl«F165921.1|0F165921 GIoimis brasilianun» strain... gl|5713168|gb|AF165922.1|ftF165922 Glows brasilianun strain... gi|5713166|gb|AF165920.1|AF165920 Gloiws brasilianu* strain... gi|5713165|gb|l»Fl6S919.1| AF165919 Glonus brasili¿nun strain... gl|571316*|gb|flF165910.1|W165918 Glowis brasilianun strain... gi (22098271 gb jUB 1987.1 (GOUS1987 Glonus occultum strain GR58... gi|6093125|enbJAJ012112.2|6BR012112 Glonus brasiliaou» 5.8S... gi j3299*927|dbj|ftK109710.1| Oryza sativa (japónica cultivar... gi¡288*309M|gb|WCBHK/HH.9| Hnno sapiens chronoso» 19 clon#... gi¡1*509603jgb|AC01916*.9¡ Hono sapiens BAC clone RP11 1*6J... gi¡2l952878|dbj|BP88*36*-*| Oryza sativa (japónica cultiua»*... gi|188«»*785|dbj|AP003291.3| Oryza sativa (Japónica cultivar... gi17131*551gb|AC009*2*.21AC 009*2* Mono sapiens, clone RP11-... gi|136999981dbjjAP8028*6.2| Hono sapiens genonic DHft, chron... gl|1«SWliil|íM|IU.r<NI/6S.l8| Human ONfi sequence fron clone ...

Alignnents>gi(5713167Jgb18F165921„1|AF165921 Glows brasilianun strain UU22* clone 1* 18S ribosonal RNAgene.

partial sequence; internal transcriben spacer 1, 5.8S ribosonal RNA gene and internal transcribed spacer 2, conplete sequence; and 26S ribosomal RHA gene, partial sequence Lcnyth - 525

Score - *8.1 bits (2*>, Expect - 2c-tt*Identities - 2*/2* (180*)Strand * Plus / Plus

Qvery: 1 gtagtycacaatgaatagcgcggg 2*1111111 tti 11111111111111

Sbjct: 3*6 gtagtgcacaatgaatagcgcggg 369

*i

Score E(bits) Ualue

*8 2e-ft**8 2e 0**8 2e-8**8 ?e-8**8 2e-0**8 2e-«J**8 8.0593* 3.73* 3.73* 3.73* 3.73* 3.73* 3.73* 3.78* 3.7

Figura 18. Salida del programa BlastN del NCBI.

6.6. DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS

Luego de la evaluación de especificidad de las secuencias de ADN, se debió determinar la

homogeneidad del perfil termodinámico, así como la de su estructura secundaria, con base en las

recomendaciones reportadas para el diseño de oligonucleótidos. La energía libre de Gibbs, fue

calculada por el programa a través del método del vecino más cercano (Nearest-Neighbor) de

Breslauer et al. [1986] para ADN y dado que la energía de un oligo a temperatura T, mide la

tendencia de éste a hibridizar con su pareja perfecta sobre un gen blanco Sugnet [1999], un valor

fuertemente negativo indica que el oligo tiende a hibridizar espontáneamente con su pareja a una

temperatura T. Al incrementarse la temperatura, AG crecerá hacia cero [Rahman, 2004].

Se optó por la selección de oligos que tuvieron una temperatura de fusión uniforme (Tm promedio

de 73°C), valores de energía libre negativos (en promedio -45 kcal/mol) y longitudes alrededor de

las 26 bases (ver Anexo 1). En cuanto a este último factor, se ha comprobado que a medida que la

longitud de la sonda se incrementa, tiende a perderse la capacidad de discriminar

desapareamientos; en tanto que si su longitud es escasa, la intensidad de la señal de hibridización

en un microarreglo decrece ostensiblemente (Zhou & Thompson, 2002).

La presencia de estructuras secundarias, resulta de importancia crítica para el proceso de

hibridización in vitro, puesto que las asas en hairpin, los dímeros y otras formas de

autohibridización, compiten por la sonda con la secuencia blanco. Lo anterior, impide un correcto

apareamiento entre ellas, lo que recae sobre la intensidad de señal del microarreglo. La estabilidad

de este tipo de formaciones fue evaluada a través del valor de energía libre de Gibbs que poseían

dichos enlaces.

Las sondas fueron recortadas o eliminadas de acuerdo a la adaptación que presentaron respecto a

todos los criterios definidos. Posterior a este proceso, se efectuó un nuevo análisis BlastN en la

base de datos del GenBank, con el fin de determinar si su especificidad inicial fue conservada,

luego del acortamiento de las secciones.

Referente a la categoría de las sondas que pudieron ser diseñadas, al menos de manera teórica,

sería posible la detección de 73 genes de los 192 valorados inicialmente, con ayuda de 191

oligonucleótidos. Este número equivale al 38% de la población total. Con lo cual se confirma

nuevamente la necesidad de intensificar esfuerzos hacia el reconocimiento de nuevas secuencias

en suelos. De esta población de oligonucleótidos se destacan aquellos que pudieron ser diseñados

para los géneros Paragtomus y Archaeospora, miembros recientes de las endomicorrizas, entre

estos se incluyen sondas para los genes ARNrl8S (2), 5.8S (1), para los espaciadores intergénicos

ITS1 (2) e 1JS2 (3), que constituyen un nuevo reporte.

Los oligonucleótidos fueron diseñados partiendo de la agrupación de secuencias procedentes de

diferentes niveles taxonómicos, que pudieran permitir la detección de una actividad enzimática en

suelos, de ser posible a una jerarquía taxonómica superior (Dominio); sin embargo, esto está

condicionado por la variabilidad de secuencia que puede generarse en las categorías inferiores. Así

que finalmente se consiguieron oligonucleótidos que están orientados a la distinción de un grupo

funcional en particular a nivel de Reino, División, Clase, Orden, Familia y en algunos casos en que

no pudo ser más amplio, a Género.

En la Figura 14, se indica el número de sondas que podrían ser utilizadas en la captura de

organismos por debajo de determinado nivel taxonómico, se destaca que para los genes bglA,

chiA, chil y LiP, las sondas podrían ser utilizadas en la captura de organismos por encima del nivel

de dominio. Además, los genes anfG, anfK, tacasa, narG, nifD, dsrA y vnfK, referidos en la base de

datos de oligonudeótidos (ver Anexo 1) para jerarquías por debajo de dominio, ofrecen

posibilidades para la detección de secuencias no identificadas aún. Para el primer caso, el número

resulta pobre al comparar la gran cantidad de genes evaluados, las causas, relacionadas con el

desconocimiento de una mayor variedad de secuencias y a diferentes niveles taxonómicos, ya han

sido analizadas. En otros niveles taxonómicos, la representatividad es alta, destacándose los

grupos de genes que pueden ser analizados al nivel de división; este nivel de resolución es bueno y

en muchos casos suficiente. Al nivel de familia podría detectarse el mayor número de secuencias

(49).

La Figura 15, muestra la representación de secuencias traducidas a partir de proteína, que pueden

llegar a ser utilizadas para la captura de genes en los niveles taxonómicos superiores como Orden

e incluso Dominio. Al primer nivel, se podría brindar información acerca de muchos de los grupos

funcionales microbianos en suelos, que llevan a cabo funciones como la oxidación de amonio

(amoA), la celulólisis (ce/F), la reducción de C02 a metano (mcrA), la fijación de nitrógeno {riifD y

nifK), la reducción asimilativa de nitrato (nasA) y la denitrificación (nosZ). A niveles inferiores a

dominio, sería posible detectar secuencias para genes codificantes de la reducción desasimilativa

de sulfito (dsrB) y oxidación de amonio (amoB).

Como se indicó en la metodología, siempre existe la posibilidad de que las sondas planteadas,

presenten hibridizaciones entre ellas, por lo cual se hace necesario examinar dicha característica.

Su evaluación permitió eliminar algunas de las secuencias que presentaron regiones comunes para

el mismo gen, y facultó la detección de dos sondas con regiones redundantes entre genes

diferentes (Iccl y chil), las cuales fueron señaladas en la base de datos. Este tipo de factores

deben ser tenidos en cuenta al momento de diseñar el microarreglo, puesto que se podría

presentar hibridizaciones competitivas in vitro, que causarían alteraciones en la interpretación de

las señales.

El reconocimiento de similitudes entre las secuencias diseñadas y motivos de proteína ya

existentes, procedentes de la base ProDom, fue efectuado por medio del programa BLASTX, el cual

indicó coincidencias para algunas de las secuencias, aunque otras no se hallaban reportadas. Esto

significa que pudieron haberse encontrado motivos de proteína para los genes subrayados en el

anexo 3, que no tenían reporte en la base ProDom, los cuales deben ser evaluados más

profundamente.

Los microarreglos basados en grupos funcionales, permiten diferenciar entre la diversidad conocida

de blancos de ADN y la parcialmente desconocida, con una alta identidad de secuencia. Por esta

razón, es muy probable que las secuencias tipo o consenso puedan ser de ayuda en la captura de

genes que incluyan el universo de microorganismos hoy inexplorado, a medida que la diversidad de

secuencias codificantes para un gen se incrementa. Esta investigación proporciona bases acerca de

la factibilidad de realizar una aproximación utilizando esta vía metodológica.

Si se desea detectar un grupo taxonómico en particular al nivel de resolución deseado, se puede

hacer uso de las regiones consecutivas a la zona consenso que en los alineamientos no mostraron

similitudes entre sí, para el diseño de cebadores, debido a que son exclusivas de cada una de las

secuencias. Un proceso posterior de secuenciación podría facilitar el acceso a nuevas secuencias

de organismos desconocidos, y potenciar así la adquisición de nueva información. A medida que la

tecnología de los microarreglos se perfecciona, la opción de prescindir de la amplificación por PCR

y utilizar directamente el ADN aislado del suelo puede permitir la cuantificación de la actividad

biológica evaluada, ampliando la información obtenida.

Las secuencias de aminoácidos que identifican motivos de proteína, y cuya traducción a ADN no

pudo ser realizada de la manera descrita, pueden tener aplicación en otro tipo de herramientas.

Los arreglos de proteína son un campo que comienza a hacerse extenso [Joos, 2004] y aunque las

aplicaciones actuales son más restringidas que para el ADN, es posible que el tiempo permita

ampliarlas, razón por la cual se incluyeron en la base de datos.

La metodología planteada, el abordaje, el tratamiento y el análisis practicado a los datos, pueden

hacerse extensivos a otras áreas de la ciencia diferentes a la microbiología de suelos, con lo cual su

incidencia es más amplia. Los razonamientos aquí aplicados para la utilización de las herramientas

bioinformáticas, pretenden ser de utilidad en la toma de decisiones para otras situaciones. La

consecución de los objetivos planteados en esta y otras investigaciones, permiten sustentar que

existen otras vías efectivas para la construcción de conocimiento, que incluyen el aprovechamiento

de información existente y aparentemente inconexa, en la creación de aplicaciones.

CONCLUSIONES1. Se estableció una vía metodológica diferente a la microbiológica clásica como aproximación al

estudio de la dinámica biológica en suelos, con base en la minería de datos, la cual tiene

aplicación en la evaluación de atributos funcionales del suelo, tales como la diversidad

bioquímica y los ciclos minerales en los que participan los microorganismos en diversos

ecosistemas terrestres.

2. Se analizaron las diferentes etapas del proceso, además de los aciertos y dificultades ofrecidos

por las herramientas bioinformáticas utilizadas.

3. Se propusieron algunas enzimas mediadoras en 13 grandes procesos bioquímicos, como

marcadores potenciales para el seguimiento de la dinámica biológica en suelos, entre estos se

cuentan: la reducción de sulfato, oxidación de compuestos azufrados, metanogénesis,

carboxidotrofía, oxidoreducción de hierro, reducción de nitrato, nitrito, óxido nítrico, óxido

nitroso, amonificación, nitrificación y fijación de nitrógeno, fundamentada en la información

existente en cuanto a su función, ubicación, tipo de aplicación, presencia en diferentes

organismos, reportes de posibilidad o uso como marcador.

4. Fue posible sugerir 192 marcadores para las enzimas elegidas, seleccionados por estar

comprometidos en los principales procesos bioquímicos del ecosistema suelo. A partir de las

secuencias, se diseñaron 183 oligonucleótidos representativos de 73 genes.

5. Se diseñaron 8 sondas específicas para dos nuevos géneros de micorrizas arbusculares, 6 de

ellas para el género Paragtomus y 2 para Archaeospora. Tales oligonucleótidos constituyen

nuevos reportes para los genes ARNrl8S (2), 5.8S (1) y para los espaciadores intergénicos ITS1

(2) e ITS2 (3) de estos grupos.

6. Se desarrolló un modelo conceptual que presenta de una manera interrelacionada los

principales aspectos de los ciclos del carbono, nitrógeno, azufre e hierro, facilitando de esta

forma, la visualización de las enzimas y genes codificantes que han sido reportados hasta el

momento. Es una iniciativa útil para la comprensión holística de las funciones que se cumplen

en el suelo y que son el sustento del ecosistema.

7 . El modelo conceptual también posibilita un abordaje de la ecología del suelo, a través de la

observación de las relaciones causa-efecto entre los componentes microbianos, la predicción de

la estabilidad de un ecosistema con base en el componente edáfico, y la detección de

actividades metabólicas sin necesidad de conocer la identidad de los microorganismos

presentes.

8. Se discutieron las ventajas y consideraciones observadas para optar por el abordaje funcional y

no taxonómico.

9. Se recopiló una base de datos de 3668 entradas para ADN y 3955 entradas para proteína, la

cual puede ser actualizada para su utilización en el área de la microbiología de suelos;

permitiendo por medio de un motor de búsqueda, acceder a información relevante de las

secuencias como: fuente (ADN, proteína), función, accesión, secuencia (nucleótidos o

aminoácidos), longitud, organismo, descripción, datos taxonómicos.

10.La herramienta de evaluación que se obtenga a raíz de la metodología desarrollada, podría

emplearse en el análisis funcional de todo tipo de suelos, debido a que en su diseño se han

tenido en cuenta organismos procedentes de diferentes regiones geográficas y hábitat.

H .E l desarrollo de las sondas para los genes bg/A, chiA, chil y LiP, podría resultar de utilidad en

el estudio general de procesos como celulólisis, quitinólisis y ligninólisis en suelos, debido a que

se abarcó toda su jerarquía taxonómica. Genes como aquellos para la oxidación de amonio,

fijación de nitrógeno, reducción de nitrato y reducción de sulfato, podrían ser evaluados a

niveles inferiores a dominio.

1 2 .Durante la investigación, fueron obtenidas cinco sondas que podrían permitir la detección

separada de los procesos mediados por los genes pmoA y amoA, los cuales habitualmente han

ofrecido dificultades para la distinción de sus actividades en suelos.

1 3 . Las sondas desarrolladas pueden ser empleadas en la búsqueda de secuencias de

microorganismos edáficos que no han sido previamente aislados, como una forma de

incrementar las posibilidades de ser representadas en los análisis, adicionalmente a la inclusión

de las secuencias moleculares obtenidas a partir de la búsqueda a través del SRS.

RECOMENDACIONES1. Se recomienda, la utilización de una herramienta de búsqueda de secuencias que permita la

elección de las tres principales bases de datos internacionales, puesto que a pesar del

intercambio diario que realizan entre ellas, existen diferencias debido a la inclusión de los

releasesand updates.

2. Se requiere intensificar la investigación dirigida hacia el área de la microbiología de suelos, con

énfasis especial en la detección y secuenciación de genes relacionados con los ciclos de la

materia, para de esta manera, asegurar que las sondas de ADN desarrolladas en un futuro,

tengan mayores posibilidades de detección de una amplia gama de microorganismos

pertenecientes a un grupo funcional.

3. Se propone la ampliación de estudios edáficos hacia el reconocimiento del dominio Archaea y su

importancia en los suelos; de manera que se profundice en el conocimiento de su diversidad

metabólica, la cual ha estado comúnmente orientada a la contribución que el grupo tiene en la

producción de metano.

4. Debido a que la variedad de géneros y secuencias reportadas para algunos genes, es en

muchos casos escasa y en otras inexistente, se debe reevaluar el enfoque que han tenido los

estudios de suelos a microorganismos tipo, ampliando el conocimiento hacia organismos

diferentes y hada genes que no han sido secuenciados. Por ejemplo, puede ser importante

conocer los organismos involucrados en el ciclo del hierro en suelos drenados, en donde las

variaciones en el nivel freático y de saturación, pueden generar micronichos para actividades de

oxidorreducción; o el caso de genes para la oxidación de nitrito, azufre elemental, sulfito y APS,

entre otros, los que a pesar de estar bien documentados, no presentaron reportes de

secuencias.

5. En cuanto a la aplicación de herramientas bioinformáticas, como puede deducirse de este

estudio, es recomendable hacer un análisis previo y profundo, sobre las posibilidades de

aplicación que puede ofrecer un programa, su nivel de resolución, mecanismos para aumentar

su precisión, parámetros que ofrece, etc., con ei fin de seleccionar los que resulten más

adecuados y que brinden la mayor información.

6. Se sugiere recopilar información acerca de los cebadores que han sido reportados para estas

enzimas, especialmente en lo referente a su especificidad génica y su capacidad de

amplificación de variantes, con el fin de determinar, si se require construir nuevos iniciadores o

realizar combinaciones de ellos.

7. Se plantean otras posibilidades de abordaje en el desarrollo de este tipo de sondas, por

ejemplo, partiendo de información molecular acerca de motivos y dominios que ofrecen las

bases de datos como ProDom, Pfam, etc.

8. Por último, se sugiere la continuación de este estudio en otras etapas, donde se evalúe la

especificidad in vi tro de las sondas señaladas, se realice la estandarización tanto del proceso de

extracción de ADN total de los microorganismos presentes en muestras de suelos, como de la

retrotranscripción a partir del primero. Así mismo, se plantee la inclusión de las diferentes

variantes de las regiones conservadas para establecer la disposición del microarreglo y su

factibilidad de implementación.

BIBLIOGRAFÍA♦ Aakra A., Utaker J.B. & Nes I.F. 2001. Comparative phylogeny ofthe ammonia monooxygenase

subunit A and 16S rRNA genes o f ammonia-oxidizing bacteria. FEMS Microbiology Letters,

205:237-242.

♦ Alien A.E., Booth M.G., Frischer M.E., Verity P.G., Zehr J.P. & Zant S. 2001. Diversity and

Detection o f Nitrate Assimiiation Genes in Marine Bacteria. Applied and Environmental

Microbiology, 67(ll):5343-5348.

♦ Alyar A. 2001. Methods in Molecular Biology, vol. 132: Bioinformatics Methods and Protocols.

Ed. S. Misener & S.A. Krawetz. Humana Press Inc., Totowa NJ.

♦ Amann R., Ludwig W. & Schleifer K. 1995. Phylogenetic Identification and In Situ Detection of

IndividualMicrobial Cells without Cultivation. Microbiological Reviews, 59(1): 143-169.

♦ Antipova A.A., Tamayo P. & Golub T.R. 2002. A Strategy for OUgonudeotide Microarray Probe

Reducthn. Genome Biology, 3: 0073.1-0073.4.

♦ Bang S.W., Clark D.S. & Keasling J.D. 2000. Engineering Hydrogen Sulfide Production and

Cadmium Removal by Expression ofthe Thiosulfate Reductase Gene (phsABC) from Salmonella

enterica Serovar Typhimurium in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 66

(9): 3939-3944.

♦ Basset D.E., Eisen M.B. & Boguski M.S. 1999. Gene Expression Informatics -It's ail in your mine.

Nature Genetics, 21 suppl: 51-55.

♦ Bayer E.A., Chanzy H., Lamed R. & Shoham Y. 1998. Cellulose, Cellulases and Cellulosomes.

Current Opinión in Structural Biology, 8:548-557.

♦ Bhanot G., Louzoun Y., Zhu J. & DeLisi C. 2003. The Importance of Thermodynamic Equilibrium

for High Throughput Gene Expression Arrays. Biophysical Journal, 84:124-135.

♦ Bick J.A., Dennis J.J., Zylstra G.J., Nowack J. & Leustek T. 2000. Identification ofa New Class of

S’-Adeny/ylsulfate (APS) Reductases from Sulfate-Assimilating Bacteria. Journal of Bacteriology,

182(1):135-142.

♦ Borneman J., Skroch P., O'Sullivan K., Palus J., Rumjanek N., Jansen J., Niehuis J. & Triplett E.

1996. Molecular Microbial Diversity of an Agricultura! Soil in Wisconsin. Applied and

Environmental Microbiology, 62(6): 1935-1943.

♦ Borneman J. & Triplett E. 1997. Molecular Microbial Diversity in Soils from Eastern Amazonia:

Evidence for Unusual Microorganisms and Microbial Population Shifts Associated with

Defbrestation. Applied and Environmental Microbiology, 63(7): 2647-2653.

♦ Bourne D.G., McDonald I.R. & Murrell J.C. 2001. Comparison of pmoA PCR Primer Sets as

Tools for Investigating Methanotroph Diversity in Three Danish Soils. Applied and Environmental

Microbiology, 67(9):3802-3809.

♦ Braker G., Fesefeldt A. & Witzelpplied K.P. 1998. Development of PCR Primer Systems for

AmpUfícation o f Nitrite Reducíase Genes (nirK and nirS) To Detect Denitrífying Bacteria in

Environmental Samples. Applied and Environmental Microbiology, 64(10): 3769-3775.

♦ Braker G. & Tiedje J.M. 2003. Nitric Oxide Reducíase (norB) Genes from Puré Cultures and

Environmental Samples. Applied and Environmental Microbiology, 69(6):3476-3483.

♦ Breslauer K.J., Franks R., Blockers H. & Marky L.A. 1986. Predicting DNA Dúplex Stability from

the Base Sequence (Nearest-neighbor interactions/DNA structure/thermodynamics).

Proceedings of the National Academical Sciences USA, 83:3746-3750.

♦ BrockT.D. & Madigan M.T. 1993. Microbiología. Sexta edición. Prentice Hall Hispanoamericana,

S.A., Naucalpán de Juárez, México.

♦ Browning D.F.,Beatty C.M.,Wolfe A.J.,Cole J.A. & Busby S.J. 2002. Independent Regulation of

the Divergent Escherichia coli nrfA and acsPl Promoters by a Nudeoprotein Assembly at Shared

Regulatory Región. Molecular Microbiology, 43(3):687-701.

♦ Brüser T., Selmer T. & Dahl C. 2000. ADP Sulfurylase from Thiobacillus denitrificans is an

Adeny/ylsulfate: Phosphate Adenylyltransferase and Belongs to a New Family of

Nudeotidyltransferases. Journal of Biology and Chemistry, 275(3): 1691-1698.

♦ Buckley D.H., Graber J.R., & Schmidt T.M. 1998. Phylogenetic Analysis o f Nonthermophilic

Members ofthe Kingdom Crenarchaeota and their Diversity and Abundance in Soils. Applied and

Environmental Microbiology, 64:4333-4339.

♦ Burke R.A. Molina M., Cox J.E., Osher L.J. & Piccolo M. 2003. Stable Carbón Isotope Ratio and

Composition of Microbial Fatty Acids in Tropical Soils. Journal of Environmental Quality, 32:198-

206.2.

♦ Cabrera L.T. Aporte al Conocimiento de la Microbiota Fúngica del Suelo de la Amazonia

Colombiana, con Enfasis en Tres Grupos Funcionales. Trabajo de Grado (Biólogo). Pontificia

Universidad Javeriana, Santafe de Bogotá, 2000.

♦ Casciotti K.L. & Ward B.B. 2001. Dissimi/atory Nitrite Reducíase Genes from Autotrophic

Ammonia-Oxidizing Bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 67(5):2213-2221.

♦ Castro H., Reddy K.R. & Ogram A. 2002. Composition and Function of Sulfate-Reducing

Prokaryotes in Eutrophic and Pristine Areas of the Florida Everglades. Applied and

Environmental Microbiology, 68(12):6129-6137.

♦ Cho J.C. & Tiedje J.M. 2000. Biogeography and Degree of Endemicity of Fluorescent

Pseudomonas Strains in Soil. Applied and Environmental Microbiology, 66(12): 5448-5456.

♦ Cho J.C. & Tiedje J. M. 2002. Quantitative Detection o f Microbial Genes by Using DNA

Microarrays. Applied and Environmental Microbiology, 68(3): 1425-1430.

♦ Coates J.D., Colé K.A., Chakraborty R., O'Connor S.M. & Achenbach L.A. 2002. Diversity and

Ubiquity o f Bacteria Capable o f Utitizing Humic Substances as Electron Donors for Anaerobic

Respiration. Applied and Environmental Microbiology, 68(5): 2445-2452.1.

♦ Conrad R. 1996. Soil Microorganisms as Controllers o f Atmospheric Trace Gases (H2, CO, CH4,

OCS, N20, and NO). Microbiological Reviews, 60(4): 609-640.

♦ Corpet F., Servant F., Gouzy J. & Kahn D. 2000. ProDom and ProDom-CG: tools for protein

domain analysis and whole genome comparisons. Nucleic Acids Research, 28:267-269.

♦ Dennis P., Edwards E.A., Liss S.N. & Fulthorpe R. 2003. Monitoring Gene Expression in Mixed

Microbial Communities by Using DNA Microarrays. Applied and Environmental Microbiology, 69

(2):769-778.

♦ Dopazo J. & Valencia A. 2001. [en línea]. Bioinformática y genómica. [ref. Enero 20 de 2004].

http://bioinfo.cnio.es/docus/courses/ leon2002/BioinfoGenomica.pdf.

♦ Drake H.L., Küsel K. & Matthies C. 2002. Ecological Consequences of the Phylogenetic and

Physiological Diversities ofAcetogens. Antonie van Leeuwenhoek, 81:203-213.

♦ Elias D.A., Krumholz L.R., Tanner R.S. & Suflita J.M. 1999. Estimation of Methanogen Biomass

by Quantítation o f Coenzyme M. Applied and Environmental Microbiology, 65(12):5541-5545.

♦ Farrelly V., Rainey F.A. & Stackebrandt E. 1995. Effect of Genome Size and rrn Gene Copy

Number on PCR Amplifícation o f 16S rRNA Genes from a Mixture o f Bacterial Species. Applied

and Environmental Microbiology, 61(7):2798-2801.♦ Febles J.P. & González A. [en linea], 2002. Aplicación de la minería de datos en la

bioinformática [ref. 24 de mayo de 2004]. http://www.infomed.sld.cu/revistas/aciA/ol10_2_02/aci03202.htm.

♦ Fernández A., Huang S., Seston S., Xing J., Hickey R., Criddle C. & Tiedje J. 1999. How Stable

Is Stable? Function versus Community Composition. Applied and Environmental Microbiology, 65

(8): 3697-3704.

♦ Ferry J.G. 1995. CO dehydrogenase. Annual Review of Microbiology, 49:305-333.

♦ Friedrich M.D. 2002. Phyiogenetic Ana/ysis Reveáis Múltiple Lateral Transfers of Adenosine-

5'-Phosphosulfate Reducíase Genes among Su/fate-Reducing Microorganisms. Journal of

Bacteriology, 184(1): 278-289.

♦ Galtier N., Gouy M. & Gautier C. 1996. Seaview and Phylo_win: two graphic too/s for sequence

alignment and molecular phylogeny. Applied Biosciences, 12:543-548. ftp://Dbil.univ-

♦ Gilbert B., McDonald I.R., Finch R., Stafford G.P., Nieisen A.K. & Murrell J.C. 2000. Molecular

Ana/ysis o f the pmo (Particulate Methane Monooxygenase) Operons from Two Type II

Methanotrophs. Applied and Environmental Microbiology, 66(3):966-975.

♦ Gregory L., Bond P., Richardson D. & Spiro S. 2003. Characteñzation of a Nitrate-Respiring

Bacterial Community using the Nitrate Reducíase Gene (narG) as a Functional Marker.

Microbiology, 149: 229-237.

♦ Gutiérrez G. & Roncando A. [en línea]. Estrategias para el Análisis de Genomas. [ref. 24 de

mayo de 2004]. Disponible en web: http://bioinf.ibun.unal.edu.co/~Qautierrez/EAG.html.

♦ Hallam SJ., Girguis P.R., Presten C.M., Richardson P.M. & DeLong E.F. 2003. Identification of

Methyl Coenzyme M Reducíase A (mcrA) Genes Associated wiíh Meíhane -Oxidizing Archaea.

Applied and Environmental Microbiology, 69(9):5483-5491.

♦ Hirota R., Yamagata A., Kato 1, Kuroda A., Ikeda T., Takiguchi N., & Ohtake H. 2000. Physical

Map Location ofíhe Mulíicopy Genes Coding for Ammonia Monooxygenase and Hydroxylamine

Oxidoreducíase in the Ammonia-Oxidizing Baclerium Nitrosomonas sp. Sírain ENI-11. Journal of

Bacteriology, 182(3):825-828.

♦ Hommes N.G., Sayavedra-Soto L.A. & Arp DJ. 2001. Transcripí Ana/ysis ofMulíiple Copies of

amo (Encoding Ammonia Monooxygenase) and hao (Encoding Hydroxylamine Oxidoreducíase)

in Nitrosomonas europaea. Journal of Bacteriology, 183(3): 1096-1100.

♦ Hooper D.U., Solan M., Symstad A., Díaz S., Gessner M.O., Buchmann N., Degrange V., Grime

P., Hulot F., Mermiilod F., Roy J., Spehn E. & Van Peer L. 2002. Species Diversity, Functional

Diversity and Ecosysíem Funcíioning. p. 195-281. In M. Loreau, S. Naeem, and P. Inchausti

(Ed.), Biodiversity and Ecosystem Functioning: Synthesis and Perspectives. Oxford Universlty

Press, London, UK.

♦ Jensen M., Webster J. & Strauss N. 1993. Rapid Identification o f Bacteria on the Basis of

Polymerasa Chain Reaction-Amplifíed Ribosomal DNA Spacer Polymorphirms. Applied and

Environmental Microbioiogy, 59: 945-952.

♦ Joos T. 2004. Protein Microarray Technology. Expert Review of Proteomics, l(l):l-3.

♦ Kang B.S. & Young M.K. 1999. Ooning and Molecular Characterization ofthe Genes for Carbón

Monoxide Dehydrogenase and Localization o f Molybdopterin, fíavin Adenine Dinudeotide, and

Iron-Sulfur Centers in the Enzyme of Hydrogenophaga pseudofíava. Journal of Bacteriology, 181

(18):5581-5590.

♦ Karknoff-Schweizer R.R., Huber D.P.W. & Voordouw 6. 1995. Conservatíon o f the Genes for

Dissimilatory Sulfite Reducíase from Desulfovibrio vulgaris and Archaeoglobus fulgidus allows

their Detection by PCR. Applied and Environmental Microbioiogy, 61:290-296.

♦ Kawase T., Saito A., Sato T., Kanai R., Fujii T., Nikaiao N., Miyasnita K. & Watanabe T. 2004.

Distribution and Phylogenetic Analysis of Family 19 Chitinases in Actinobacteria. Applied and Environmental Microbioiogy, 70(2): 1135-1144.

♦ Kent A.D. & Triplett E.W. 2002. Microbial Communities and their Interactions in Soil and

Rhizosphere Ecosystems. Annual Review of Microbioiogy, 56:211-36.

♦ King G.M. 1999. Attributes of Atmospheric Carbón Monoxide Oxidation by Maine Forest Soils.

Applied and Environmental Microbioiogy, 65 (12):5257-5264.

♦ King G.M. 2003. Molecular and Culture-based Analyses o f Aerobic Carbón Monoxide Oxidizer

Diversity. Applied and Environmental Microbioiogy, 69(12):7257-7265.

♦ Kinghorn J.R. 1989. Genetical, Biochemical and Structural Organization of the Aspergillus

nidulans crnA-niiA-niaD Gene Cluster. In J.R. Wray, J.R. Kinghorn eds. Molecular and Genetic

Aspects of Nitrate Assimilation. Oxford Science Publications, Oxford, pp. 69-87.

♦ Kjoller R. & Roendahl S. 2001. Molecular Diversity of Glomalean (arbuscular mycorrhizal) Fungí

Determined as Distinct Glomus Specific DNA Sequences from Roots o f Field Grown Peas.

Mycological Research, 105 (9):1027-1032.

♦ Kolb S., Knief C., Stubner S. & Conrad R. 2003. Quantitative Detection of Methanotrophs in Soil

by Novel pmoA-Targeted Real-Time PCR Assays. Applied and Environmental Microbioiogy, 69

(5): 2423-2429.

♦ Larrondo L.F., Salas L., Meló F., Vicuña R. & Cullen D. 2003. A Novel Extracellular Multicopper

Oxidase from Phanerochaete chrysosporium with Ferroxidase Activity. Applied and

Eenvi ron mental Microbioiogy, 69(10):6257-6263.

♦ Lassmann T. & Sonnhammer E.L.L. 2002. Quality assessment o f múltiple aiignment programs.

FEBS Letters 529:126-130.

♦ Lee D., Gun Zo Y. & Kim S. 1996. Non-radioactive Method to Study Genetic Profíles o f Natural

Bacterial Communities by PCR-Single Strand Conformation Polymorphism. Applied and

Environmental Microbiology, 62:3112-3120.

♦ Lewin B. 2001. Genes VII. Marbán Libros, Madrid España. 990p.

♦ Lorite M.J. Tachil J., Sanjuán 1, Meyer O., & Bedmar E.J. 2000. Carbón Monoxide

Dehydrogenase Activity in Bradyrhizobium japonicum. Applied and Environmental Microbioiogy,

66(5): 1871-1876.

♦ Loy A., Lehner A., Lee N., Adamczyk I , Meier H., Emst 1, Schleifer K.H. & Wagner M. 2002.

Oiigonudeotide Microarray for 16S rRNA Gene-Based Detection of aH Recognized Uneages of

Sutfate-Reducing Prokaryotes in the Environment. Applied and Environmental Microbiology, 68

(10):5064-5081.

♦ Lucas R., Robles A.M., del Postigo-Gáivez A., García T., Pérez R. & Aivarez G. 2001.

Biodegradación de la Celulosa y la Lignina. Ia Ed. Universidad de Jaén, Servicio de

Publicaciones e Intercambio Científico, D.L. España, pp. 146.

♦ Lucchini S., Thompson A. & Hinton J.C.D. 2001. Microarrays for microbiologists. Microbiology,

147: 1403-1414.

♦ Luna M.L., Vega C., Franco M.O., Vásquez S., Trujillo N., Ramírez E. & Dendooven L. 2002.

Actividad microbiana en suelos. Avance y perspectiva, 21: 328-332.

♦ Luton P., Wayne J.M., Sharp R.J. & Riley P.W. 2002. The mcrA gene as an atternative to 16S

rRNA in the phyiogenetic analysis of methanogen populations in landfill. Microbiology,

148:3521-3530.

♦ Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H. & Pretorius I.S. 2002. Microbial Cellulose Utiiization:

Fundamentáis and Biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66(3): 506-577.

♦ Matveeva O.V., Foley B.T., Nemtsov V.A., Gesteland R.F., Matsufuji S., Atkins J.F., Ogurtsov A.

% Shabalina S. 2004. Identification of regions in múltiple sequence alignments

thermodynamicaify suitabie for targeting by consensus oligonudeotides: application to H1V

genome. BMC Bioinformatics, 5(44): 1-13.

♦ McCaig A., Glover A. & Prosser, J. 1999. Molecular Analysis of Bacterial Community Structure

and Diversity in Unimproved and Improved Upland Grass Pastures. Applied and Environmental

Microbiology, 65: 1721-1730.

♦ McDevitt C., Burreil P., Biackaii L.L. & McEwan A.G.2000. Aerobic Nitrate Respiration in a Nitrite-

Oxidising Bioreactor. FEMS Microbioiogy Letters, 184:113-118.

♦ Metcaife A.C., Krsek M., Gooday G.W., Prosser J.I. & Weliington M.H. 2002. Molecular Analysis

of a Bacterial Chitinolytic Community in an Upland Pasture. Applied and Environmental

Microbioiogy, 68(10): 5042-5050.

♦ Minerdi D., Fani R., Gallo R.( Boarin A. & Bonfante P. 2001. Nitrogen Fixation Genes in an

Endosymbiotic Burkholderia Strain. Applied and Environmental Microbioiogy, 67(2):725-732.

♦ Mobarry B.K., Wagner M., Urbain V., Rittmann B.. & Stahl D.A. 1996. Phy/ogenetic Probes for

Analyzing Abundance and Spatial Organizaron ofNitrifying Bacteria. Applied and Environmental

Microbioiogy, 62:2156-2162.

♦ Moreno-Vivián C., Cabeiio P., Martínez-Luque M., Blasco R. & Castillo F. 1999. Prokaryotic

Nitrate Reductíon: Molecular Properties and Functionaí Distinction among Bacterial Nitrate

Reductases. Journal of Bacteriology, 181(21):6573-6584.

♦ Morris C.E., Bardin M., Berge O., Frey-KIett P., Fromin N., Girardin H., Guinebretiere M.H.,

Lebaron P., Thiery J.M., & Troussellier M. 2002. Microbia/ Biodiversity: Approaches to

Experimenta¡ Design and Hypothesis Testing in Primary Scientifíc Literature from 1975 to 1999.

Microbioiogy and Molecular Bioiogy Reviews, 66 (4): 592-6Í6.

♦ Morton J.B. & Benny G.L. 2001. Two new families o f Glomales, Archaeosporaceae and

Paragiomaceae, with two new genera Archaeospora and Paragiomus, based on concordant

molecular and morphological characters. Mycologia, 93:181-195.

♦ Muñoz C., Guillen F., Martínez A.T. & Martínez M.J. 1997. Laccase Isoenzymes of Pleurotus

eryngii: Characterization, Catalytíc Properties, and Participation in Activation of Molecular

Oxygen and Mn21 Oxidation. Applied and Environmental Microbioiogy, 63(6):2166-2174.

♦ Murrell, J.C., Giibert B. 8i McDonald I.R. 2000. Molecular bioiogy and regulation of methane

monooxygenase. Archives of Microbioiogy, 173:325-332.

♦ Nannipieri P., Ascher J., Ceccherini M.T., Landi L., Pietramellara G. & Renella G. 2003. Microbial

Diversity and Soil Functions. European Journal of Soil Science, 54:655-670.

♦ Nicholas K.B. & Nicholas H.B. 1997. GeneDoc: a too/ for editing and annotating múltiple

seguence atignments. Disponible en web: www.psc.edu/blomed/genedoc.

♦ Norton J.M., Alzerreca J.J., Suwa Y. & Klotz M.G. 2002. Diversity o f Ammonia Monooxygenase

Operon in Autotrophic Ammonia-oxidizing Bacteria. Archives in Microbioiogy, 177:139-149.

♦ Notredame C., Higgins D.G. & Heringa J. 2000. T-Coffee: A Novel Method for Fast and

AccurateMultiple Sequence Alignment. Journal of Molecular Bioiogy, 302: 205-217.

♦ Odum E. 1972. Ecología, 3ra edición. Interamericana, México.

♦ Ohrmund S.R. & Elrod S. [en línea]. The Development of Primers Specifíc to Bacterial Species

that Produce Celiuiase Enzymes Using the Tools of Bioinformatic [ref. 15 de abrii de 2004.

http://ebi.calpoly.edu/senior_projects/SteveO_SP.pdf.

♦ Olalde V. & Aguilera L.1.1998. Microorganisms and Biodiversity. Terra, 16(3): 290-292.

♦ Ovreas L., Jensen S., Daae F.L. & Torsvik V. 1998. Microbial Community Changes in a Perturbed

Agricultura! Soil Investigated by Molecular and Physiological Approaches. Applied and

Environmental Microbiology, 64(7):2739-2742.

♦ Pearson W.R. Methods in Molecular Biology, vol. 132: Bioinformatics Methods and Protocols. Ed.

S. Misener & S.A. Krawetz. Humana Press Inc., Totowa N.l

♦ Peng X. & Stromberg AJ. [en línea]. Microarray Experiment Design and Statisticai Anaiysis.

Chapter 7 [ref. 8 de septiembre de 2004]. http://www.kbnn.louisviile.edu/about/Pubs/Peng-

stromberg.pdf.

♦ Peplies X, Glóckner F.O. & Amann R. 2003. Optimization Strategies for DNA Microarray-Based

Detection o f Bacteria with 165 rRNA-Targeting OUgonudeotide Probes. Applied and

Environmental Microbiology, 69(3): 1397-1407.

♦ Perriére G. & Gouy M. 1996. WWW-Query: An on-Une retrieval system for biological sequence

banks. Biochimie, 78:364-369.

♦ Phillips CJ, Harris D., Dollhopf S.L., Gross K.L., Prosser 3.1. & Paul E.A. 2000. Effects of

Agronomic Treatments on Structure and Function o f Ammonia-Oxidizing Communities. Applied

and Environmental Microbiology, 66(12): 5410-5418.

♦ Poly F., Ranjard L., Nazaret S., Gourbiére F. & Monrozier L.J. 2001. Comparison of nifH Gene

Pools in Soils and Soil Microenvironments with Contrasting Properties. Applied and

Environmental Microbiology, 67(5):2255-2262.

♦ Prescott L.M., Harley J.P & Klein D.E. 2000. McGraw-Hill. Microbiology. 4th edition. Electronic

Book.

♦ flozorov A.A. 2001. Recombinational Rearrangements in Bacterial Genome and Bacterial

Adaptaban to the Environment. Mikrobiologiya, 70(5): 581-594.

♦ Purkhola U., Pommerening-Roser A., Juretschko S., Schmid M.C., Koops H.P. & Wagner M.

2000. Phylogeny of AH Recognized Species o f Ammonia Oxidtzers Based on Comparative 16S

rRNA and amoA Sequence Anaiysis: Implications for Molecular Diversity Surveys. Applied and

Environmental Microbiology, 66(12):5368-5382.

♦ Rahmann S. 2004. [en línea]. Promide, Probe Selection and Microarray Design. [ref. 18 de

Agosto de 2004].

♦ Redecker D. 2000. Specifíc PCR primers to identify arbuscular mycorrhizal fungi within cotonized

roots. Mycorrhiza, 10:73-80.

♦ Redecker D., Morton J.B. & Bruns T.D. 2000. AncestralUneages ofArbuscular Mycorrhizal Fungi

(dómales). Moiecuiar Phylogenetics and Evolution, 14(2):276-284.

♦ Richardson DJ. 2000. Bacterial Respiration: a flexible process for a changing environment.

Microbioiogy, 146:551-571.

♦ Rósch C., Mergeí A. & Bothe H. 2002. Biodiversity of Denitrifying and Dinitrogen-Fixing Bacteria

in an AcidForestSoii Applied and Environmentai Microbioiogy, 68(8):3818-3829.

♦ Rotthauwe J.H., Witzel K.P. & Liesack W. 1997. The Ammonia Monooxygenase Structural Gene

amoA as a Functional Marker: molecular fíne-scale analysis o f natural ammonia-oxidizing

populations. Applied and Envinomental Microbioiogy, 63:4704-4712.

♦ Salisbury F.B. & Ross C.W. 1994. Fisiología Vegetal. Grupo Editorial Iberoamérica S.A., México,

D.F. 759 p.p.

♦ Scala DJ. & Kerkhof L.J. 1999. Diversity o f Nitrous Oxide Reducíase (nosZ) Genes in

Continental Shelf Sediments. Applied and Environmentai Microbioiogy, 65(4): 1681-1687.

♦ Schuler G.D. 1997. Bioinformatics: Pieces o f the puzzle: expressed sequence tags and the

catalog o f human genes. Journal of Molecular Medicine, 75: 694-698.

♦ Small J., Cali D., Brockman F., Straub T. & Chandler D. 2001. Direct Detection of 16S rRNA in

Soil Extracts by Using Oligonucleotide Microarrays. Applied And Environmentai Microbioiogy, 67

(10):4708-4716.

♦ Soares A., Frois G., Seldin L. & van Elsas J.D. 1997. Molecular Microbial Ecoiogy. Revista de

Microbiología, 28:135-147.

♦ Sobolev D. & Roden E.E. 2002. Evidence for Rapid Microscale Bacterial Redox Cycling oflron in

Circumneutrai Environments. Antonie van Leeuwenhoek, 81: 587-597.

♦ Stanier R., Ingraham J.L., Wheelis M.L. & Painter P.R. 1986. The Microbial World. Fifht Edition.

Prentice Hall, New Jersey USA. 689p.

♦ Steffen K.T., Hatakka A. & Hofrichter M. 2002. Degradation o f Humic Acids by the Litter-

Decomposing Basidiomycete Collybia dryophila. Applied and Environmentai Microbioiogy, 68(7):

3442-3448.

♦ Stewart P. & Cullen D. 1999. Organization and Differential Regulation of a Cluster of Lignin

Peroxidase Genes of Phanerochaete chrysosporium. Journal of Bacteriology, 181(11):3427-

3432.

♦ Straub K.L. Benz M., Schink B. & Widdel F. 1996. Anaerobic, Nitrate-Dependent Microbial

Oxidation o f Ferrous Iron. Applied and Environmentai Microbioiogy, 62(4): 1458-1460.

♦ Strous M., Kuenen J.G. & Jetten M.S. 1999. Key Physiology of Anaerobic Ammonium Oxidation.

Applied and Environmental Microbiology, 65(7):

3248-3250.

♦ Sugnet C. 1999. [en línea]. Design Considerations [ref. 18 de Agosto de 2004].

http://www.cse.ucsc.edu/~sugnet/oligo_picker/node2.html.

♦ Sztern D. & Pravia M.A. Manual para la Elaboración de Compost: Bases Conceptuales y

Procedimientos. Uruguay: Presidencia de la República - Oficina de Planeamiento y Presupuesto -

Unidad de Desarrollo Municipal - Organización Panamericana de la Salud, 1999. 69 p.

♦ Tamaru Y., Karita S. Ibrahim A., Chan H. & Doi R. 2000. A Large Gene Cluster for the

üostrídium cellulovorans Cellulosome. Journal of Bacteriology, 182(20):5906-5910.

♦ Taroncher G.,Griner E.M., Francis C.A. & Ward B. 2003. OUgonudeotíde Microarray for the

Study of Functional Gene Diversity in the Nitrogen Cycle in the Environment. Applied and

Environmental Microbiology, 69(2): 1159-1171.

♦ Thauer R.K. 1998. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson.

Microbiology, 144:2377-2406.

♦ ThompsonJ.D., GibsonT.J., Plewniak F., Jeanmougin F. & Higgins D.G. (1997). The ClustalX

windows interface: flexible strategies for múltiple sequence alignment aided by quality analysis

tools. Nucleic Acids Research, 24:4876-4886.

♦ Thompson J.D., Higgins D.G. & Gibson T.J. [en línea]. CLUSTAL W: improving the sensitivity of

Progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position specifíc gap

penalties and weight matrix choice [ref. 20 de diciembre de 2003].

http://bimas.dcrt.nih.gov/dustalw/clustalw.html. bajado en diciembre 2003.

♦ Thorn R.G., Reddy C.A., Harris D. 8i Eldor A.P. 1996. Isolation of Saprophytic Basidiomycetes

fromSoil. Applied and Environmental Microbiology, 62(11): 4288-4292.

♦ Valencia E. & Peña JJ. 2001 El suelo y sus habitantes microbianos: consideraciones ecológicas.

Avance y Perspectiva, 20:401-406.

♦ Valentine D.L. 2002. Biogeochemistry and Microbial Ecology of Methane Oxidation in Anoxic

Environments: a review. Antonie van Leeuwenhoek, 81:271-282.

♦ Vera D.F., Pérez H. & Valencia H. 2002. Aislamiento de Hongos Solubilizadores de Fosfatos de

la Rizosfera de Arazá (Eugenia stipitata, Myrtaceae). Acta Biológica Colombiana, 7(1): 33-40.

♦ Wagner M, Roger A.J., Flax J.L., Brusseau G.A. & Stahl D.A. 1998. Phylogeny of Dissimilatory

Sulfite Reductases Supports an Early Origin o f Sulfate Respiration. Journal of Bacteriology, 180

(11): 2975-2982.

♦ Walter R.L., Ealick S.E., Friedman A.M., Blake R.C., Proctor P. & Shoham M. 1996. Múltiple

Wavelength Anomalous Diffraction (MAD) Crystal Structure o f Rusticyanin: A Highly Oxidizing

Cupredoxin with Extreme AcidStabiüty. Journal of Molecular Biology, 263:730-751.

♦ Wolters V., Silver W., Bignell D., Coleman D., Lavelle P., Van Der Putten W., De Ruiter P., Rusek

J., Wall D., Wardle D., Brussaard L, Dangerfieid J., Brown V., Giller K., Hooper D., Sala O.,

Tiedje J. & Van Veen J. 2000. Effects o f Global Changes on Above • and Beiowground

Biodiversity in Terrestrial Ecosystems: Implications for Ecosystem Functioning. Bioscience, 50

(12): 1089-1098.

♦ Wu L., Thompson D.K., Li G., Hurt R.A., Tiedje J.M. & Zhou J. 2001. Development and

Evaluation of Functional Gene Arrays for Detection of Se/ected Genes in the Environment

Applied and Environmental Microbiology, 67(12):5780-5790.

♦ Zehr J.P., Jenkins B.D., ShortS.M. & Steward G.F. 2003. Nitrogenase Gene Diversity and

Microbial Community Structure: a cross-system comparison. Environmental Microbiology, 5(7):

539-554.

♦ Zhou J. & Thompson D.K. 2002. Challenges in Applying Microarray to Environmental Studies.

Current Opinión in Biotechnology, 13(3):204-207.

♦ Zumft W.G. 1997. Cell Biology and Molecular Basis of Denitrification. Microbiology and Molecular

Biology Reviews, 61(4):533-616.

ANEXOS

ANEXO 1. OUgonudeótidos diseñados y sus parámetros termodinámicos y físicos (páginas

siguientes).

1 1 n i n i 1 1 1 t 1 1 1 1 1 1 i n i 1 1 1 1 ..............................................i i i í

I 2 5! i < i *3 t £ Ei t l sm i¡gis

tí 5£ <

3 • . i b $ *

isi riiüü<6 <

| - N « t » « O S O ( > 0 3 5 IO >0 K 00 Ov O •H «4 «4 H «-• N Í 5 Í 5 S S S Í S S S S 5 Í S 1 1 2

?

i o>o

3— .

81

0 . i*> -Vfu fC t « v£> <* n N m

noB

N .«0

«■4*

O —« «

TV M*m1

r^ ‘ o>"r^

rs"«?

UT>—9

97•-4 sí -• 5 *

•x.oa 00 i ¡

w<«> . - l «5 « ^

9 < y m if* x•s 9 9 i 1 •M ¥ 9 « t

00S I 0 <2 0°> a

t

f tN

ir>

I

® .

i?

n

•4

8 OOs

9 - r 9 0 •** % OJ

« — eo to ** •n —

¡? ’ ?$ 7 *

’V a u Q cC P. ? tí p■ « i ¡ \ j- « » & ooY o o — o

o. oP oSí. ?>o -.'

< y

in

*1

<V

«o«n *>.(V co^ 5*<**. O «0 , -9 5 - 9 o 9 t

!z- • «n. X 9 — « o 10K «*

O *!• N B » 00 £ O *>i S. I S •- .«•> O í O . O T O O O

o id o> OvOiN í t i n N r

*<M N; %o iri vb <n ^ m

u>■ 1 ■’. fv ' \ " ■ . i i-, y w- ™ A w ^ i- ^ -i ^ ® ^j a « n s s ? ; s ! 8 i * s * s s s ! n s 8 a í ; ; r. 8 ” *S £ £ £¡fe « sü i l¿ ¡t pi S í t p í í f c S Í É f c f c j é f í i f c ^ ¿se

if> •oo . - i -o rv íH^»^0 'T>*f>',f p«r •«- .o r\i o «r ~ o m o n« N N N N N W & N M N N N N N N S i n N W f t W N N W n f t i

O O B N f J Í l f l N W O Í W n N C U I f l m í i n

•ii ♦ •¿i po <s| <M fvl «QCDNOx'viroto

<0 ^ <w M N N

9 ? 3V Ü oiv m a

<S» <S» lf>» M (\l IM

I S ?

82 2

£ * t I ■ I I 2 2 2 2 2 2

J S 3 S-111 ! 1 1 ! 1 í í í 1 1 111 f 11 * I í 1 1 ! 11 i i i i i «8 <S

o p o p

U ? í s < < < <

lili I i £u>

IiS

|

I I

lililíf t t ru_ u . Ü_ U_

i* » 1* £ £ £

Uiil iilüillilüiüllit!‘l ü i i i i i i i i ü i m i i i i n u n i H H H : » ; »

8

l t ) 5 ' 0 ^ « ¿ - 0 < 0 ' 0 ' í ) ' 0 S l > S N t K) «O ^113

I! í |} í I i

1 1Ü8§8

&8£S:22a:9£l&S8K¡Í

f ! I I

f'4 lr f

°?1?» » » S?S8’?Ü'í Síf

iuwnuniunwnnunnn fv>C'^OA'á»-^*- ní o 'nJ co O

fOMitcaSNUiü)

wwroNNNWNM uuouuuit>uu

O ^ fy n a t-

§ & 1 i fc fc

W IM N N N l\)(O # O OI N #

roI

8 -v<

^ co r\j si »<%<*<*

& ¿ & á

N ni u N O w ui Jl

ff 5* rn *¿»f

N M | 'J OI ^

1

l> O vi >J S 'j , » \| S N >J o- S «o>ro»»o>u>xfcov|Oi»oro<!> « <• Ki - b' - <o ó í- m úi i> »

N^wíwoi^PP Mt /W L f /> i« (M 6. J C i»

í >1 N i> ^ » U U Ul « s «

(« Crü 0< (*■ >1 ^ 4» 00gi ai :o K>

m oí en *

Scuro iCüir\)Oi^Wi.u „ —UJChOiNjO>0>r5*>woc'0¡íW uNifflioKíáí.'- >.. n i-. ..tsstí;«^Sí;í5 n w w i» ct ws s i » 4 s oo \o r\j K-

lo w w* « 5} * N W

í? o o o i. r- A o •* o ^ o g g o u¡ £ g g * g i; § 'í*O j» 'J K> £ o SX o O 00 o ■—

o o

£ <b i* -k w ó Z «S»o> $ M JL.w *.<U Vi

'5 > V* s > s 3 ¿ g 2 i» >» >u K)

rt - ± S*S S:8Vj -vi

¿ 5

v¿> ¿Cí “

IV»r p ¿ vj <>. OC> £ £® o s

6 P 6 ? ¿ >

§ S §

o o o tai bv 'oo

§ J: £ 3 O -fe *- ‘o

oí r*o a>

£ $ w ;0 V> **

uj _•■* f\J ►*

_,. JS. o oN í

I¿i ¿> ó *-S? > >Ai ^ ¿ s 5

» > -2 * «*

P ¿> <> <i» r\> ent % c í-

z 3 i

mt- ►* m m *- t; »* ►* *- p o (A> IV) M O «

"i H 3 3

R 8 £ * M 1 i 8 3 S 3 * > 5> 5 3 >

1 1. 2 > * M „

*l|lii *3 9 -

n?SSJ2SS8SS??SSÜS282n*

2

? ? 5P 3P

Í1

12>Q>H>

2

§>>

3>>

$>

4 2 8 |

y i * * ¡I

n£[f íntimas* f mitjf j*

IIIIIIIIIIIIIIIII IIIII

7ti

|S

£

s 2 8 2 2 22 8 2 8

IB-

fÍ

•„ r>. «q . n O. C\í q N -I. m o «, » •<> m <r> <© co »

! ? " » § 7 a 2 ¡p t 2 ? S S m Sf o ? t S » ¡s 5" « S t

" í M ^ o -r' ^ 9 3 r 9 3 r = 2 t 9 ? 3 ;i ? S 5 ; ?

r*> O N *“1 W2 3 g S N'

1

i -

1 ? ’

OS

»\ O. o. « p o< «H 4 O iv» rr,'-- 1 ' 1OV «O O —!

a $ í a

«hcoOí

N X)

v 2 - 25 S

i § o 2 9 9

3 * » & £< 5 S > N—. ^ tf\ Q. «O.o — o o o

n oo £• < v 0s s ^ a ^ o^ -s. m ^ (V> v

.* «0

: 3 1 «*> r o

K

<r>tf>

O»*■*

<<*>9

N**OI

*

N*9>%

■ r <v

K9N %í*>•

■v VK. r-3 9

5 . 5

■A

♦.■o.0 2 O. ”*t o S í o■■3'" í § í ' ?o ó 9 o 9 o 9 o - ' 9 o’ o

- 1 < 0 » « - ! « O t f 1 N C O ' r K t f i ' O ^ t v j ^ n v ' T o

V « i tft « o ■«e pj M «e <*s

i¡ ♦ cu (Ni o m + N. <n MR

n oo Ni ■* s

m<M

iWÍO mm 8 3 í

•ótr>

«nt si 8 ur> Sí

CT* -o inR

fO■>r s

O(M®«*» 5

(u«n

í

a> h* o *-« ís o r< o V en * . K (SI • * -o 1 o en o. m co vOhs csi

r*— . .1

Or* £

vCf* fc ró

r* JÉ s'Oh* 'O ai

*K N

i(siK

KR

■oN-

lf) 5 <*>K

1 a tsi<Tm : s *2 o» ft> 8

<nCVJ a « s

<nt\í 2

4 f3 M 24

27 00

CJ 33 <D

<MO<*» 2

4 s?«H<• ."-.i «V*

<o«\l

4L7 <0 •#

5 8 «*>■<*'ÓT

Lf> 42

.9

69

H3 76

.8

74.7

77.5 ■O<o 778

68.1 ♦

s

♦<M 24 s 29 Oro en«SI (OCM CM C\i

2 < <1

9 5 ü o III! Hi i IS|?!!H!í!1 1 1 ? f ?H § § §< c 0 0 0 - . 0 f ^ 0 » 0 * i — i'j — i ír«j0rto<*»’«x>fM<s)r^*iO«>OOOt i O CO O

V § * i i -81 1 3

j ftl ! s s i i . l f f i|8

tí X c

■ 1 1 !

1 * í f í i

<

?5fj* í | 3 lili3 | S 3 1 5

a «.... HH i t t í

f i 1 1 U J U ) <B < Lii U l

I I

Ñ

01

II£ & <

I 1 1 III

l i l i l í

i g i f i 1 f f j f i

1 i i f O f f l f i i l l l í i l l I l l i S f f ¡1 i f t Z t 2 2 2 Í 2

»-<

* S S S S S § S 2 Í 3 3 « i § £ i § § 3 2 W <n tw « « « *•< *■*

lülll *í < < < < u

í S S ? S 2115

<*~o

I

t n ' < «m. ?•í ® 2 T - r 0? v - ; o . " S v

“ oO m cj 9 9 ' V •? j ^ o* 9 ” 9

r>K K N — <o n n *HK rr ~ - < — - - *»oo o _ > S¡ ¿i i

9 2 f

cu » 8 '

csj en

2 2 £ <3 fe T sT >L < <^ °V *.<y «o o

N N í*)O ••< N7 S¡ TN V v

i n9 *v

O. g *H *"<•& 3 s a s. " "9 9

N

¥V,«V'

*HS' - £ 5 a 5I ” 2 5 s ?^ s9 r « ? i 1 1 1

o *» o O Q,Sf § §' § 5|S ¡ ? .. ♦ N ,-• o o o o

s «o« *

ro IOO O

:• a s •- 5 °

8 fe« A N V O Q « » » ♦« ?

ir» «o n oo r*if> fú <) < j fs¡m s io n n

11 1 1 1 S

w 9 |

¡ 3▼ .

if> o rv'<n• 9 T

Ow «0 Ks K>M <Ó

j<> N

£»-«K O

M 1 *4 O<M m

<c oO

°v °. °. £ O oO O O ? O, O|\ 5. « . $ W oo o o : t o -

•O MP s¿í . 5o 9

o ^

§ ? 5 o5 i . S S9 o 9 cv* o

o< ~ <*> ^ f íp 5

i -4— -o " í '*. -* -'. "? q o ®

O i f i o o f ^ a d N O ' W^ ' O ' O N 'O® N S «O «O K K N

<n <si ? IO N k ^

<*> CJ n N CM

8 S S 8 3 s•* Oj ♦ í> IO -1S « m jfl «i nr * K N S K K

p i n M r í O>“ n ' a i ,i n o n N ’r n ' O O N »r •o<oo«oo>i c«3' t — — •«rof i l M N n M N n N N n N n i N M W M n N N N N M f t l N f l i M R N m r o N f t j

? 1 ! 3 5 i i% í I ! 1 1 ! ! 5 ? 1 1 § ! IT C \ j O r r' ~ O 0 J < M c 0 í \ ) O ® O < \ i O

„

? ? « ? ? ? § v %> v tá e* HM S lg N W (5 O

I

I

2 p o £ £ f l í í y s í ¥ i f ? ^ 2 2 í 2

P l l

< o o O

-5 cm <i> m «\j O

< ? ? ? í í ¿ 2 2 2 -b 2

¡Bi.S ! ti &Eí£O.Í'!Iu

;s;y miUiUiífíH!

s$ y $ i 5 < <I « 5 fc i 5 * 3 <¿ s h

i i i i l i i h i i l l i i i i i l í i i

mu

! IINII

* fi'rÜ j¡ *

iiruiiiiiiiiiniiiunJTl íj

w ro

iiiisisinsim^ I\) N O

l\> l\) W » > N

iunnmnnnimunimuu'Í^oobwo-ooiooojOq

w

yoóiiff¡vU«ijka>*ÍUHUÍH

ní Jí r* oo ° K> m K) o oasas* 00 <Jl O CU

5 5 "J K)>4 >4 >4 O* W * tV3 »>1 K) * -g

* ¿i

$ ¿'M ¿ ¿VM£ ¿"M ¿ ft fc fc £¡ N»vbl»f»9'ÍÓ'N W*»Us»Í]i'M:>JU(r

o A ir* .— .— o — *> •- o o*5 ■• > i § 'S % ° % t t o .O y o o o o o ui ^O 55 o O O 1» O O o >s ■*-- -

V

'§ O V» O» o V-

o o o

* S s o o

■¡FSNt k i £ > í* *'■ é ¿ é e 5 i g > c .*

¿ £ ü ¿ ¿ > «V» * * S

° fc

? -5 •?

.3 g .3 8 k i¡ É -“ $ S 5 * A V» o -'to ui Vn> ;*o K> 5

ú> r PV: * „

* P >v>

#¿5

L!fi<

5W(l

MTT

W.

één

bóM

INTO

BTBT

3HJN

"SU

BM

VTS

MN

""óü

bew

E bl

ast

Base

sTm

K¿¿

bé'

(Kca

l/mol

)H

airp

in(d

G/T

m)

bin

cros

(dG

/Tm

)17

6A

AC

ATT

AC

C&

&C

A&

CT6

66A

TSA

TTT

amoB

Bac

teria

Prot

eobac

teria

Bet

apro

teob

octe

riaN

itros

omon

adal

es0.

005

( 0.0

01)

2677

.746

.2-5

0,9

1,9/

0-5

,9/-

3917

7A

AA

CT6

CT6

AC

C6S

C6A

AA

CC

ATT

amoB

Bac

teria

0.01

5(0.

01)

2477

.450

-48,

6-5

,3/-

47,9

178

ATA

CC

T6S

CA

SA

CC

A A

AC

STT A

TATTA

&C

6an

fDB

acte

ria0.

007

(0.0

01)

3077

.643

.3-5

5,6

0,6/

2,9

-6/-

33,5

179

6A

AA

6T6

AC

CA

AC

6A

A66C

AG

C&

ÁT

Ce IF

Bac

teria

Act

inob

acte

ria

Act

inom

ycet

ales

0.06

7 (0

.001

)25

77.2

52-4

8,3

180

66

CT

AT

TA

TT

TT

ATT

CC

6AC

CA

AC

CA

6ch

iBB

acte

riaPr

oteo

bact

eria

Sam

map

rote

obac

teria

0.00

1 (0

.01)

2773

.340

.7-4

9,8

181

CTS

CA

666C

AA

CTA

TS6<

rrA

TCA

6ch

iBB

acte

riaPr

oteo

bact

eria

0.05

8(0.

01)

2472

.654

.2-4

4,4

2/0

-5,9

/-39

182

TGA

ATA

TCTG

GA

TAA

AG

TGTG

CG

AA

ATT

Cds

rBB

acte

riale

-04

(0.

01)

2973

.734

.5-4

9,7

1,7/

0-0

.4/-

984 J

18

3fT

ATA

CX

SÁ

TG

ATA

TTC

TG

6A

TG

ATTTT

mcr

A A

rcha

eaM

etha

noco

cci

Met

anoc

occa

les

0.34

(0.

01)

2869

.332

.1-4

6,3

1,4/

0í,6

/-1

00

¿ i

1S4^

CTG

CA

6CTG

GA

AA

ATT

TAT6

TGA

AA

AA

C6

narS

Bac

teria

Prot

eobac

teria

4e-0

4 (0

.01)

2977

.737

.9-5

3,8

0,2/

14,2

-5,9

/-39

185TC

T66A

AC

T6A

&C

6A

TT6C

6TG

AT

nasA

Bac

teria

Prot

eobac

teria

Gam

map

rote

obac

teria

Pseu

dom

onad

ales

0.23

(0.

01)

2475

50-4

4,7

lw[Á

TTA

CC

AC

C6

AT

TT

TC

A6

6A

AA

AA

6A

TA

TT

6nifD

Bac

teria

Prot

eoba

cter

iaA Ip

hopr

oteo

bact

eria

fthi

zobt

ales

5e-0

4 (0

.01)

3176

.332

.3-5

5,5

-0,4

/24

-37-

60,9

Í87

[lT

t6T

66

6C

A6

CC

A fA

tT AC

CGnifK

Arc

haea

Eury

arch

aeot

aM

etha

nosa

rcin

ales

0.1

5 (0

.01)

2271

.950

-43,

10,

6/2,

9-1

>/-

93,1

188A

TSS

C&

AA

AC

CC

T&6A

AC

C6A

TT A

nirS

Bac

teria

Prot

eoba

cter

iaG

amm

apro

teob

acte

ria70.2

3(0

.01)

2477

.250

-48,

818

9 C

GTC

T&

6A

T6

T6

AT6

AA

ATS

C6

ATA

AA

AT

nosZ

Bac

teria

Prot

eoba

cter

iaA

lpha

prot

eoba

cter

iaftho

doba

cter

ales

4e-0

4 (0

.01)

2977

.637

.9-5

2,3

190

TTA

T G

AA

C&

AT AAA

GC

GAA

CACC

CG

Trtos

ZB

acte

riaPr

oteo

bact

eria

Alp

hapr

oteo

bact

eria

Rho

dosp

irilla

les

0.00

5 (0

.01)

2675

.142

.3-4

9^

0,4/

24,8

-6,3

/11

2,6

;

191

Tno

sZB

acte

riaPr

oteo

bac

teria

Bet

apro

teob

acte

riaJ8

e-06 (

0.01

)32

77.4

37.5

-55,

52,

1/0

1,2/

-141

,3

ANEXO 2. Listado de primers reportados en la literatura para los principales procesos

enzimáticos considerados en la investigación.

Enzima-

Molécula/Taxón

Nombre Primer (5'-3')

PmoA Al 89 F

Mb661R

II223F

Mb601R

Mc468R

II646R

Mcap630R

Forest675R

Kolb et al., 2003

[GGNGACTGGGACTTCTGG]

[GGTAARGACGTTGCNCCGG]

[CGTCGTATGTGGCCGAC]

[ACRT AGT GGTAACCTT GYAA]

[GCSGTGAACAGGTAGCTGCC]

[CGTGCCGCGCTCGACCATGYG]

[CTCGACGATGCGGAGATATT]

[CCYACSACATCCTTACCGAA]

PmoA A650R Bourne et

al., 2001

[ACGTCCTTACCGAAGGT]

DsrAB, DsrD DSR1F

DSR4R Castro et

a!., 2002

[ACSCACTGGAAGCACG]

[GTGTAGCAGTTACCGCA]

DsrAB, DsrD P94F

P93R Karkhoff et

al., 1995

[CCTCTAGAATCGG(A/T)ACCTGGAAGGA(C/T)

GACATCAA]

[CCTCTAGAGGGCACAT(G/C)

GT GTAGCAGTTACCGCA]

Enzima-

Molécula/Taxón

Nombre Primer (5'-3')

DsrAB, DsrD DSR1F

DSR2F

DSR3F

DSR4R

DSR5R Wagner et

al, 1998

[AC[C/G]CACTGGAAGCACG]

[CTGGAAGGA[C/T]GACATCAA]

[GAAGAA[C/G]ATG[A/T]ACGGG 1 IJ

[GTGT AGCAGTT ACCGCA]

[TGCCGAGGAGAACGATGTC]

NirK, NirS NirKIF

NirK2F

nirK3R

nirK4R

nirK5R

nirSIF

nirS2F

nírS3F

nirS4F

nirS3R

nirS5R

nirS6R

Braker et al., 1998

[GG(A/C)ATGGT(G/T)CC(C/G)TGGCA]

[GC(C/G)(C/A)T(C/G)ATGGT(C/G)CTGCC]

[GAACTTGCCGGT(A/C/G)G(C/T)CCAGAC]

[GG(A/G)AT(A/G)A(A/G)CCAGG i TTCC]

[GCCTCGATCAG(A/G)TT(A/G)TGG]

[CCTA(C/T)TGGCCGCC( A/G)CA(A/G)T]

[TACCACCC(C/G)GA(A/G)CCGCGCGT]

[TTCCT(C/G/T)CA(C/T)GACGGCGGC]

[TTC(A/G)TCAAGAC(C/G)CA(C/T)CCGAA]

[GCCGCCGTC(A/G)TG(A/C/G)AGGAA]

[CTTGTTG(A/T)ACTCG(C/G)(C/G)CTGCAC]

tCGTTGAACrT(A/G)CCGGT]

NirK Cunir3

Cunir4 Casciotti &

Ward, 2001

[CGTCTA(C/T)CA(C/T)TCCGC(A/C/G)CC]

[GCCTCGATCAG(A/G)1T(A/G)TGG]

Enzima-

Molécula/Taxón

Nombre Primer (5'-3’)

NirK, NirS K15F

K16R

KA3F

KA25R Rósch et

al., 2002

[GGCATGGTACCTTGGCACGTAACCTCGGGC]

[CATTAGATCGTCGTTCCAATCACCGGT]

[CACGGYGTBCTGCGCAAGGGCGC]

[CGCCACGCGCGGYTCSGGGTGGTA]

nosZ NosZF

NosZR Rósch et

al., 2002

[CGYTGTTCMTCGACAGCCAG]

[CATGTGCAGNGCRTGGCAGAA]

NosZ CAMP-N0S661F

CAMP-N0S1773R

Sea la & Kerkhof,

1999

[CUACUACUACUACGGCUGGGGGCUGACCAA]

[CAUCAUCAUCAUAURUCGAUCARCUGBUCGU

U]

AmoA AmoA-lF

AmoA-2R

Rotthauwe et al.,

1997

[GGGGTTTCTACTGGTGGT]

[CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC]

AmoA NU3

NEU

NSO190

NS01225

Nsml56

Nsv443 Mobarry et

al., 1996

[CCTGTGCrCCATGCTCCG]

[CCCCTCTGCTGCACTCTA]

[CGATccccTGcrn iacc][CGCGATTGTATTACGTGTGA]

[T ATTAGCACATCTTTCGAT]

[CCGTG ACCGTTTCGTT CCG]

AmoA 301F

302R

304R

305F

308R

Norton etal., 2002

[GACTGGGACTTCTGGCTGGACTGGAA]

[TTTGATCCCCTCTGGAAAGCCTTCTTC]

[TAYCGCTTCCGGCGGCATTTTCGCCGC]

[GTGGTTTGGAACRGICARAGCAAA]

[TCCCAGCTKCCGGTRATGTTCATCC]

Enzima-

Molécula/Taxón

Nombre Primer (5’-3’)

AmoB A3

A4 H i rota et al.,

2000

[TATGTACTGCAGGCAG AAGTTGCGCTT G]

[CGAATTCG ACAGGCTAATTGATGCTTCG]

McrA F

R Luton et al.,

2002

[GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAG

C]

[TTCATTGCRT AGTTWGGRTAGTT]

CdhABCDE SL degenerados

Kang & Young,

1999

[GCNCARGARAARGCNGTNGARCC]

tTGNACNGGNGCRTTCAT]

NapA V16

V17

V66

V67

GC-clamp

McDevitt et al.,

2000

[GCNCCNTGYMGNTTYTGYGG]

[RTGYTGRTTRAANCCCATNGTCCA]

[TAYTTYYTNHSNAARATHATGTAYGG]

[DATNGGRTCATYTCNGCCATRTT]

[GCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC

ACGGGGGG]

Hao PhlO (hao3)

HB5 (haol,2)

para Nitrosomonas

spp. Hommes et

al., 2001

[CTCCGTAAATATGCGGGTCA]

[CTCCGTAATCTACCTGTTCGTCGGCTT]

HAO H4 Hirota et ai,

2000

[CTCTAGAAATATGGCAAAT ACGGCACAAGC]

[CTCTAGATAACGATACGGCGCTGTGTC]

NifH PolF

PoIR

Poly et al., 2001

[TGCGAYCCSAARGCBGACTC]

[ATSGCCATCATYTCRCCGGA]

NifH NifHF

nifHR

K07F

AMRR

Rósch et al., 2002

[AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC]

[1IGI1SGCSGCRTACATSGCCATCAT]

[GCGTTCT ACGGTAAGGGCGGTATCGGNAAR]

tGCTACTACYTCGCCSGA]

Enzima-

Molécula/Taxón

Nombre Primer (5'-3')

Nitrito oxidasa NblOOO

Mobarry et al.,

1996

[TGCGACCGGTCATGG-3]

NrfA Para D. vulgaris

pORF571C)f

pORF5712r

nrfAE87

nrfAH87

nrfAElO

nrfAHIO

Browning et al.,

2002

[CT GAGG AG AAGAGCCGCAAC]

[GCTTGGCGGAGACCAGAC]

PhsABC F

R

F

R Bang et al.,

2000

[TCAGCGAATTCTAATAACAGGAGG]

[CATTAI 1 1 IATGGATCCGCTCAGAC]

[TCAGCTGGATCCAATAACAGGAGG]

[CATTAI 1 1 IATGAATTCGCTCAGAC]

Glomales (ADNr) LOCT670R

ATRP420F

Redecker, 2000

[AAGGCCATGACGCTTCGC]

[ AACAATACAGGGCCTTTAC]

grupo Giomus

mosseae/ intraradices

GLOM1310

GLOM5.8R

Redecker, 2000

[AGCTAGGYC1AACATTGTTA]

[TCCGI1GTTGAAAGTGATC]

grupo Glomus

etunicatum/ claroideu

m

LETC1670

Redecker, 2000

[GATCGGCGATCGGTGAGT]

Acauiosporaceae ACAU1660

Redecker, 2000

[TGAGACrCrCGGATCGG]

Gigasporaceae GIGA5.8R

Redecker, 2000

[ACTGACCCTCAAGCAKGTG]

Enzima-

Molécula/Taxón

Nombre Primer (5'-3')

Grupos A.

gerdemanii/A. trappei

y G. occultumjG.

brasilianum

ARCH1311

Redecker, 2000

[TGCTAAATAGCCAGGCTGY]

ANEXO 3. Listado de enzimas-genes para ias cuales no existió reporte de dominios en la base

ProDom.

Enzimas genes

A m o n i o m o n o o x i g e n a s a amoBC

C O - d e s h i d r o g e n a s a cdhE, coxL, coxM

N i t r o g e n a s a I a l t e r n a t i v a s vnfH, anfH, anfK

R u s t i c i a n i n a rusA, rustA

A P S r e d u c t a s a surC

N it r i t o r e d u c t a s a a s i m i l a t i v a e n h o n g o s niiA

N i t r a t o r e d u c t a s a a s i m i l a t i v a e n h o n g o s niaD

L a c a s a s lccl-3, Iac34678, lacio, la c ll, Iacl2f Iacl3,

Iacl4, IccK, tHA, Icsl, lapl-2, poxl-3, poxA

M a n g a n e s o p e r o x i d a s a s mnpl234, mnpB

L ig n i n p e r o x i d a s a s HpABCEIGHJ, vgll, Hp2, IpglAB

Q u i t i n a s a s chiF, chil5, chi37, chi41, chi55r chi60,

chi69, chi80, chi92, chil9, chitiA, chitiB,

ctsl, cts2, cht4, kchi, pchA

E n d o - B - g l u c a n a s a s cenA, egl, egll, eg/3, eg¡4, eg!5, bglC,

egltA

C e l o b i o h i d r o l a s a s ce/3, cbhl, cbh2. cbh3. cbhA. cbhB

C e l o d e x t r i n a s a s celY, celO, acc2, engBDHKLMNY, cenC,

bgxA, bglxA