die analyse der sauerstofftoleranz und biotechnologische
TRANSCRIPT
Die Analyse der Sauerstofftoleranz und biotechnologische
Anwendung der NAD+-reduzierenden Hydrogenase
aus Ralstonia eutropha H16
D i s s e r t a t i o n
zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Dipl. Biol. (t.o.) Lars Lauterbach
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Stefan Hecht, PhD
Gutachter/innen: 1. Prof. Dr. B. Friedrich
2. Prof. Dr. P. Hildebrandt
3. Prof. Dr. H. Dobbek
Tag der mündlichen Prüfung: 13.12.2013
Diese Arbeit wurde unter der Leitung von Frau Prof. Dr. Bärbel Friedrich und Dr. Oliver
Lenz am Institut für Biologie der Humboldt-Universität zu Berlin angefertigt.
Die Untersuchungen wurden aus Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft
( Exzellenzcluster „Unifying Concepts in Catalysis“) und dem European Research Council
gefördert. Die Forschungsaufenthalte an der Universität Oxford wurden aus Mitteln der Royal
Society finanziert.
Teile dieser Arbeit wurden publiziert:
- Horch M*, Lauterbach L*, Saggu M*, Hildebrandt P, Lendzian F, Bittl R, Lenz O und
Zebger I. 2010 Probing the active site of an O2-tolerant NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase
from Ralstonia eutropha H16 by in situ EPR und FTIR Spectroscopy Angew. Chem. Int. Ed.
49, 8026-8029
- Horch M*, Lauterbach L*, Saggu M*, Hildebrandt P, Lendzian F, Bittl R, Lenz O
und Zebger I. 2010 Untersuchung des katalytischen Zentrums der O2-toleranten NAD+-
reduzierenden [NiFe]-Hydrogenase von Ralstonia eutropha H16 mit In-situ-EPR- und -FTIR-
Spektroskopie Angew. Chemie 43, 8200–8203
- Lauterbach L*, Liu J*, Horch M*, Hummel P, Schwarze A, Haumann M, Vincent KA,
Lenz L, Zebger I. 2011 The hydrogenase subcomplex of the NAD+-reducing [NiFe]-
hydrogenase from Ralstonia eutropha- insights into catalysis und redox interconversions
Eur. J. Inorg. Chem. 1067-1079
- Ratzka J, Lauterbach L, Lenz O, Ansorge-Schumacher M 2011 Systematic evaluation
of the dihydrogen oxidising und NAD+-reducing soluble [NiFe]- hydrogenase from Ralstonia
eutropha H16 as a cofactor regeneration catalyst Biocat.& Biotrans.
doi:10.3109/10242422.2011.615393
- Lauterbach L, Idris Z,Vincent KA, Lenz O 2011 Catalytic properties of the isolated
diaphorase fragment of the NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha
PLoS ONE 6: e25939
- Horch M, Lauterbach L, Lenz O, Hildebrandt P, Zebger I 2012 NAD(H)-coupled
hydrogen cycling – structure–function relationships of bidirectional [NiFe] hydrogenases
FEBS Lett. 586:545-556
- Reeve H, Lauterbach L, Ash P, Lenz O, Vincent K 2012 A modular system for
regeneration of NAD cofactors using graphite particles modified with hydrogenase und
diaphorase moieties Chem. Commun. 48:1589–1591
- Ratzka J, Lauterbach L, Lenz O, Ansorge-Schumacher M 2012 Stabilisation of the
NAD+-reducing soluble [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 through
modification with methoxy-poly(ethylene) glycol J. Mol. Catal. B Enzym 74:219– 223
- Lauterbach L, Lenz O, Vincent K 2013 H2-driven cofactor regeneration with NAD(P)+-
reducing hydrogenases FEBS Journal 280:3058-3068.
- Herr N, Ratzka J, Lauterbach L, Lenz L, Ansorge-Schumacher MB 2013 Stability
enhancement of an O2-tolerant NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase by a combination of
immobilisation und chemical modification J. Mol. Catal. B Enzym 97:169– 174^
- Lauterbach L, Lenz O 2013 Catalytic water production by oxygen-tolerant [NiFe]-
hydrogenase during H2 cycling in the presence of O2, J. Am. Chem. Soc. 135, 17897-17905.
Patente:
Vincent KA, Lenz O, Lauterbach L, Reeve H, Idris Z, Ash P 2011 „Cofactor
regeneration system,” Vereinigtes Königreich Patentanmeldungsnr.: 1116971.1.
*zu gleichen Teilen beigetragen
i
Zusammenfassung:Die NAD+-reduzierende Hydrogenase (SH) aus Ralstonia eutropha katalysiert die reversible H2-Oxidation in
Verbindung mit der Reduktion von NAD+ in Gegenwart von Sauerstoff. Die bemerkenswerte O2-Toleranz des
Enzyms wurde zuvor auf eine für [NiFe]-Hydrogenasen ungewöhnliche Struktur des Wasserstoff spaltenden
Zentrums zurückgeführt. Diese Hypothese wurde in dieser Arbeit mittels in situ-Spektroskopie an SH-haltigen
Zellen widerlegt. Das [NiFe]-Zentrum trägt demnach wie in O2-sensitiven [NiFe]-Hydrogenasen einen CO-
sowie zwei Cyanid-Liganden. Zudem wurde der für [NiFe]-Hydrogenasen typische Nia-C-Zustand identifiziert,
der durch einen Hydrid-Brückenliganden zwischen Nickel und Eisen gekennzeichnet ist und wahrscheinlich ein
Intermediat im katalytischen Zyklus der SH darstellt.
Um die Untersuchung der aus sechs Untereinheiten und mindestens acht Kofaktoren bestehenden SH zu
erleichtern, wurde das Enzym mittels genetischer Methoden in seine beiden Module aufgeteilt. Beide gereinigten
Subkomplexe waren katalytisch aktiv mit nur einem minimalen Überpotential. Dies ist notwendig, da die
Standardpotentiale von 2H+/H2 und NAD+/NADH sehr nahe beieinander liegen. Das die H2-Oxidation
katalysierende Hydrogenase-Modul beinhaltet ein FMN-Molekül, welches für die reduktive Reaktivierung des
oxidativ modifizierten Zentrums benötigt wird. Das Diaphorase-Modul trägt ebenfalls ein FMN, und die
Reduktion von NAD+ wird von der Anwesenheit von O2 nicht beeinträchtigt. Das auf einer Graphitelektrode
immobilisierte Hydrogenase-Modul wurde dagegen bei hohem Redoxpotential langsam durch Sauerstoff
inaktiviert. Die Aktivität konnte durch Einstellung eines Redoxpotentials von unter -170 mV allerdings innerhalb
von Sekunden zurückgewonnen werden, auch in Gegenwart von O2.
Neben Wasserstoff reagiert das [NiFe]-Zentrum der SH auch mit Sauerstoff und zeigt dabei katalytische
Promiskuität: In Gegenwart von 60 % (v/v) Wasserstoff und 40 % (v/v) Sauerstoff im Reaktionsansatz lag das
Verhältnis der H2-Oxidationsrate zur O2-Reduktionsrate bei ungefähr 200:1. Dabei wurde Wasserstoffperoxid im
Hydrogenase-Modul freigesetzt. Durch einen in dieser Arbeit entwickelten massenspektrometrischen Ansatz
konnte gezeigt werden, dass die SH 18O2 reduktiv zu Wasser als Hauptprodukt umsetzt. Als Folge der
Sauerstoffreaktion werden vermutlich Sauerstoffmodifikationen am katalytischen Zentrum gebildet, die durch
rückläufigen Elektronentransport reduktiv entfernt werden. Die Sauerstofftoleranz der SH basiert somit auf einer
kontinuierlichen Reaktivierung des durch Sauerstoff oxidierten [NiFe]-Zentrums.
Aufgrund der außergewöhnlichen Sauerstofftoleranz stellt die SH ein vielversprechendes System für die
wasserstoffgetriebene Regeneration von NADH in gekoppelten enzymatischen Reaktionen dar. Da jedoch viele
Oxidoreduktasen NADPH benötigen, wurde in dieser Arbeit an der Substraterweiterung der SH gearbeitet.
Durch rationale Mutagenese wurden zwei negativ geladene Aminosäuren gegen kleinere, neutrale Reste
ausgetauscht. Das entsprechende SH-Derivat war in der Lage, wasserstoffabhängig NADP+ zu NADPH zu
reduzieren, und wies Aktivitäten auf, die vergleichbar sind mit denen der NADP+-abhängigen Formiat-
Dehydrogenasen. Durch Ganzzellansätze kann die zeitaufwändige und kostenintensive Proteinreinigung
vermieden werden. Um die wasserstoffabhängige in-vivo-Kofaktorregeneration zu ermöglichen, wurde ein
Überexpressionssystem mit insgesamt 13 Genen für die heterologe Produktion der SH in Pseudomonas putida
konstruiert. Der lösliche Extrakt des rekombinanten P .putida-Stammes wies tatsächlich SH-spezifische Aktivität
auf. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse sind somit sowohl für das molekulare Verständnis der H2-
abhängigen Katalyse als auch für die biotechnologische Anwendung der O2-toleranten SH relevant. ..
ii
InhaltsverzeichnisZusammenfassung: .................................................................................................................... i
Inhaltsverzeichnis ..................................................................................................................... ii
Abkürzungen ............................................................................................................................ vi
1. Einleitung ........................................................................................................................... 1
1.1 Drei Klassen von Hydrogenasen und deren Aufbau .................................................... 1
1.2 [NiFe]-Hydrogenasen................................................................................................... 3
1.3 Einteilung der [NiFe]-Hydrogenasen ........................................................................... 4
1.4 Das [NiFe]-Zentrum und der katalytische Zyklus ....................................................... 7
1.5 Die vier unterschiedlichen Hydrogenasen von Ralstonia eutropha ........................... 11
1.6 Zusammenbau des [NiFe]-Zentrums ......................................................................... 13
1.7 Sauerstofftoleranz der R. eutropha Hydrogenasen .................................................... 14
1.8 Die NAD+-reduzierende Hydrogenase aus R. eutropha ............................................ 15
1.9 Kofaktoren der SH ..................................................................................................... 16
1.10 Biotechnologische Anwendung von Hydrogenasen ................................................ 19
1.11 Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit ........................................................... 20
2. Material und Methoden .................................................................................................... 21
2.1 Bakterienstämme und Plasmide ................................................................................. 21
2.2 Kultivierung der Bakterien......................................................................................... 24
2.2.1 Wachstumsmedium .............................................................................................. 24
2.2.2 Bestimmung der Wachstumsparameter ............................................................... 25
2.2.3 Zellkultivierung .................................................................................................... 25
2.2.4 Konservierung von Bakterienstämmen ................................................................ 26
2.3 Zellfraktionierung und Proteinreinigung ................................................................... 27
2.4 Probenanalytik ........................................................................................................... 28
2.4.1 Proteinbestimmung .............................................................................................. 28
2.4.2 Bestimmung der Hydrogenase-Aktivität ............................................................. 28
2.4.3 Bestimmung der Diaphorase-Aktivität ................................................................ 29
2.4.4 Bestimmung der Oxidase-Aktivität ..................................................................... 29
2.4.5 Kofaktor-Quantifizierung ..................................................................................... 31
2.4.6 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen mittels SDS-PAGE ................... 31
2.4.7 Immunologische Detektion der Proteine.............................................................. 32
2.4.8 Aufnahme von UV-Vis-Absorptionsspektren ...................................................... 32
2.4.9 Fourier-Transform-Infrarot(FTIR-) Spektroskopie und Fit-Prozedur ................. 33
iii
2.4.10 EPR-Spektroskopie ............................................................................................. 33
2.4.11 Röntgenabsorptionsspektroskopie ...................................................................... 34
2.4.12 Elektrochemie ..................................................................................................... 34
2.4.13 Kristallisationansätze .......................................................................................... 35
2.5 DNA-Grundtechniken ................................................................................................ 36
2.5.1 Behandlung von Geräten und Lösungen .............................................................. 36
2.5.2 Konzentrationsbestimmung der DNA bzw. RNA ................................................ 36
2.5.3 Restriktionsverdau von DNA ............................................................................... 36
2.5.4 Dephosphorylierung von DNA ............................................................................. 36
2.5.5 Ligation von DNA-Fragmenten ........................................................................... 36
2.6 DNA-Isolierung .......................................................................................................... 37
2.7 Plasmidisolation ......................................................................................................... 37
2.8 Elektrophoretische Auftrennung der DNA in Agarosegelen ...................................... 37
2.9 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen.................................................. 38
2.10 Herstellung kompetenter Zellen ............................................................................... 38
2.11 Transformation ......................................................................................................... 38
2.12 Konjugation .............................................................................................................. 38
2.13 Sequenzierung .......................................................................................................... 39
2.14 Polymerase-Kettenreaktion ...................................................................................... 39
2.15 Gentechnische Konstruktionen ................................................................................. 40
2.15.1 SH Expressionsplasmide .................................................................................... 40
2.15.2 Ortsspezifische Mutagenese ............................................................................... 42
2.15.3 Genomische Deletionen ...................................................................................... 42
2.16 Chemikalien und Enzyme ......................................................................................... 43
2.17 Dokumentation, Statistik und Datenverarbeitung .................................................... 43
3. Ergebnisse ......................................................................................................................... 44
3.1 Untersuchung des [NiFe]-Zentrums der SH mit in-situ-EPR- und FTIR-
Spektroskopie ................................................................................................................... 44
3.1.1 Konstruktion einer RH- und MBH-negativen R. eutropha-Mutante .................... 44
3.1.2 In-situ-EPR-Spektroskopie der SH ....................................................................... 45
3.1.3 In-situ-FTIR-Spektroskopie der SH ..................................................................... 47
3.2 Überproduktion und Reinigung nativer SH ................................................................ 50
3.2.1 Ein Expressionsplasmid für die SH-Produktion ................................................... 50
3.2.2 Mikroaerobe Zellkultivierung für die SH-Überproduktion .................................. 51
iv
3.2.3 Ein optimiertes Protokoll für die Reinigung der SH ............................................ 51
3.2.4 Größenbestimmung der nativen SH ..................................................................... 53
3.2.5 Versuche zur Strukturaufklärung der SH ............................................................. 53
3.2.6 Redoxverhalten des [NiFe]-Zentrums .................................................................. 54
3.2.7 Analyse der [FeS]-Cluster und FMN in der SH ................................................... 55
3.3 Das Hydrogenase-Modul der SH ............................................................................... 57
3.3.1 Ein Expressionsplasmid für die Produktion des Hydrogenase-Moduls der SH ... 57
3.3.2 Reinigung des HoxHY-Moduls und dessen katalytische Eigenschaften ............. 57
3.3.3 Analyse der Kofaktoren im Hydrogenase-Modul ................................................ 59
3.3.4 Röntgenabsorptionsspektroskopie am HoxHY-Modul ........................................ 61
3.3.5 Elektrochemische Untersuchungen des Hydrogenase-Moduls ............................ 63
3.3.6 Reaktivierung des HoxHY-Moduls ..................................................................... 64
3.3.7 Katalytische Präferenz („Bias“) ........................................................................... 68
3.3.8 Produktinhibition durch Wasserstoff ................................................................... 69
3.3.9 Sauerstofftoleranz des Hydrogenase Moduls ....................................................... 69
3.3.10 Redoxverhalten des [NiFe]-Zentrums im Hydrogenase-Modul ........................ 72
3.4 Katalytische Eigenschaften des Diaphorase-Moduls ................................................. 76
3.4.1 Funktionalität eines plasmidbasierten Diaphorase-Moduls der SH ..................... 76
3.4.2 Reinigung des Diaphorase-Moduls ...................................................................... 76
3.4.3 Biochemische Charakterisierung des HoxFU-Moduls ........................................ 78
3.4.4 Kofaktor-Analyse des HoxFU-Moduls ................................................................ 80
3.4.5 Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies ........................................................ 85
3.4.6 Elektrochemische Untersuchung des HoxFU-Moduls ......................................... 86
3.4.7 Katalytische Präferenz ( „Bias“) des Diaphorase-Moduls ................................... 87
3.4.8 Das HoxFU-Modul setzt in Abwesenheit von Substrat FMN frei ....................... 89
3.4.9 Inaktivierung von HoxFU bei niedrigen Potentialen ........................................... 89
3.4.10 Affinität des HoxFU-Moduls für NAD(H) ........................................................ 90
3.4.11 Endproduktinhibition von HoxFU durch NAD(H) ............................................ 91
3.4.12 Die Sauerstofftoleranz des Diaphorase-Moduls ................................................ 93
3.5 Untersuchungen zur Sauerstofftoleranz der SH ......................................................... 94
3.5.1 Eingesetzte Derivate für die Experimente zur Sauerstofftoleranz der SH ........... 94
3.5.2 Reduktionsmittel und FMN erhöhen die SH-Aktivität ........................................ 95
3.5.3 Sauerstofftoleranz der nativen SH ....................................................................... 96
3.5.4 Der Sauerstoffreduktions-Aktivität der SH .......................................................... 96
v
3.5.5 Superoxid-Produktion durch die SH .................................................................... 97
3.5.6 Produktion von Wasserstoffperoxid durch die SH ............................................... 98
3.5.7 Wasserproduktion durch die SH ........................................................................... 99
3.5.8 Orte der H2O2- und H2O-Produktion in der SH .................................................. 101
3.6 Umwandlung der NAD+- in eine NADP+-Bindestelle ............................................. 102
3.6.1 Konstruktion der HoxF-Derivate und Funktionalitätstest .................................. 104
3.6.2 Reinigung der SH-Derivate und Bestimmung der Affinität für NAD(P)(H) ..... 105
3.7 Heterologe SH-Produktion in Pseudomonas putida ................................................. 108
4. Diskussion ...................................................................................................................... 111
4.1 Optimierung der SH-Produktion und Reinigung ...................................................... 111
4.2 Kofaktorzusammensetzung ...................................................................................... 113
4.3 Kontrovers diskutierte Ergebnisse zur Struktur des [NiFe]-Zentrums der SH ......... 114
4.4 Die SH besitzt einen Standard-Satz von zwei CN-- und einem CO-Liganden ......... 115
4.5 Der katalytische Zyklus am Nickel-Eisen-Zentrum der SH ..................................... 116
4.6 Katalytische Eigenschaften der SH .......................................................................... 119
4.6.1 NAD(P)(H)-Umwandlung des Diaphorase-Moduls ........................................... 119
4.6.2 Regulationsmechanismen der SH-Aktivität ....................................................... 121
4.6.3 Potential-abhängige Effekte auf die Aktivität der SH ........................................ 124
4.6.4 HoxFU produziert Superoxid ............................................................................. 125
4.6.5 Weitere Reaktionen des Diaphorase-Moduls mit Sauerstoff ............................. 126
4.6.6 Reaktionen des Hydrogenase-Moduls mit Sauerstoff ........................................ 127
4.7 Durch Sauerstoff hervorgerufene Redoxzustände in der SH .................................... 129
4.8 Modell der Sauerstofftoleranz der SH ...................................................................... 131
4.9 Einsatz der SH in der Kofaktorregeneration............................................................. 136
5. Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 142
6. Anhang ........................................................................................................................... 159
Danksagung ........................................................................................................................ 165
vi
Abkürzungen% (v/v) Volumenprozent
% (w/v) Gewichtsprozent
AK Antikörper
AS Aminosäure(n)
BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat
BV Benzylviologen
ddH2O Ultrareinstwasser
bp Basenpaar
BSA Rinderserumalbumin
CIP Alkalische Phosphatase (calf intestinal phosphatase)
CO Carbonyl
CN Cyanid
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
DCPK Dicyclopropylketon
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
DT Dithionit
DTT Dithiothreitol
dNTP 2'-Desoxynucleosid-5'-triphosphat
Extinktionskoeffizient
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EPR Elektronen-Paramagnetische-Resonanz
EXAFS extended X-ray absorption fine structure
et al. et alii
FGN Fruktose-Glycerin-Minimalmedium
FN Fruktose-Minimalmedium
FMN Flavinmononucleotid
FTIR Fourier-Transform-Infrarot-(Spektroskopie)
GGN Glukose-Glycerin-Minimalmedium
x g X-fache Erdanziehungskraft
H2ase Hydrogenase
ICP-OES optische Emissionsspektrometrie mittels induktiv gekoppeltem Plasma
kb Kilobasen
vii
kDa Kilodalton
Km Kanamycin
LE löslicher Extrakt
LB Lysogeny Broth
M Molar (mol/l)
mA Milliampere
MBH membrangebundene Hydrogenase
NAD Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid
NADH reduzierte Form von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid
NADP Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NADPH reduzierte Form von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
MCS “multiple cloning site”
ml Milliliter
mol 6,022 x 1023 Teilchen
MV Methylviologen
NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid
ODxxx optische Dichte bei einer Wellenlänge von xxx nm
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PDB “Protein data bank”
PEG Polyethylenglykol
PGE “pyrolytic graphite edge”; pryolytische Graphit-(Elektrode)
PMS 5-Methyl-phenaziniummethylsulfat
RH regulatorische Hydrogenase
RNase Ribonuklease
ROS reaktive Sauerstoffspezies
rpm Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
SCE Standard-Kalomel-Elektrode
SDS Natrium-Dodecylsulfat
SH „soluble hydrogenase“; NAD+ reduzierende Hydrogenase
SHE Standard-Wasserstoff-Elektrode
t Zeit
TCA Trichloressigsäure
viii
Tet Tetracyclin
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin
TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TXRF Totalreflektions-Röntgenfluoreszenz-Analyse
U Unit ( mol/min)
UV Ultraviolett
UZ Ultrazentrifugation
Vis sichtbares Licht
XAS Röntgenabsorptionsspektroskopie
EINLEITUNG 1
1. Einleitung
Saubere Energieträger aus erneuerbaren Quellen sind notwendig, um den wachsenden
Energieverbrauch in Zukunft ohne große Umweltschäden zu decken. Molekularer Wasserstoff
(H2) wird als vielversprechender alternativer Energieträger des postfossilen Zeitalters
betrachtet, da die Verbrennung von H2 mit O2, z. B. in einer Brennstoffzelle vergleichsweise
viel Energie freisetzt (-286 kJ/mol) und nur das unschädliche Reaktionsprodukt Wasser
entsteht. Obwohl Wasserstoff das häufigste Element in der Biosphäre der Erde ist, kommt H2
nur in geringen Mengen in der Erdatmosphäre vor (~ 0,5 ppm v/v). Aufgrund der hohen
Bindungsenthalpie der H-H-Bindung 436 kJ/mol ist das Wasserstoffmolekül unter
gewöhnlichen Bedingungen nicht reaktiv (Gurvich et al. 1989). Zur Vermeidung von
extremen Reaktionsbedingungen wie hohem Druck und hoher Temperatur ist zur Spaltung
von H2 ein Katalysator ist notwendig. In Brennstoffzellen wird Platin verwendet, das
allerdings nur in begrenzten Mengen verfügbar und daher sehr teuer ist (Bashyam und
Zelenay 2006). Die Suche nach günstigen und effizienten Alternativen, die auch stabil
gegenüber häufigen Verunreinigungen wie Kohlenstoffmonoxid sind, hat somit eine große
Bedeutung für die angewandte Forschung. Die Synthese von alternativen Katalysatoren, die
von der Natur inspiriert sind, könnte dieses Problem lösen. (Le Goff et al. 2009).
In der Natur wird H2 zu einem großen Teil durch fermentative Anaerobier freigesetzt. Ebenso
wird er als Nebenprodukt der Stickstofffixierung produziert und entsteht darüber hinaus im
Rahmen von nichtbiologischen, geochemischen Prozessen. In anoxischen Lebensräumen wird
der überwiegende Teil des produzierten H2 durch z.B. Methanogene, Azetogene oder
Sulfatreduzenten verbraucht, so dass nur geringste Mengen in die sauerstoffhaltige Umwelt
gelangen, wo sie von Knallgasbakterien umgesetzt werden (Conrad 1996). Alle genannten
Organismen enthalten Hydrogenasen, wasserstoffumsetzende Enzyme, die die reversible
heterolytische Spaltung von H2 in zwei Protonen und zwei Elektronen katalysieren
(Stephenson und Stickland 1931; Gitlitz und Krasna 1975). Aufgrund des niedrigen
Redoxpotentials des Protonen/H2-Paares (2H+/H2, E0= -0,42 V bei 1 bar H2) stehen im Fall
der Wasserstoffoxidation fast alle bekannten biologischen Elektronenakzeptoren zur Auswahl,
um schließlich eine Vielzahl von organischen und anorganischen Substraten zu reduzieren
wie z.B. CO2, Fe3+, NO3-, SO4
2- oder O2 (Conrad 1996).
1.1 Drei Klassen von Hydrogenasen und deren Aufbau
Die Nutzung von Wasserstoff als Energieträger war höchstwahrscheinlich eine frühe
Entwicklung in der Evolution, da die Atmosphäre der jungen Erde wasserstoffreicher als
2 EINLEITUNG
heute war (Martin und Muller 1998). Heutzutage werden Hydrogenasen in ganz
unterschiedlichen Organismen, wie z. B. in Archaeen, Proteobakterien, Actinobakterien,
Cyanobakterien und einigen niederen Eukaryoten gefunden, die in Böden, Flüssen, Ozeanen,
Tiefseehabitaten und heißen Quellen anzutreffen sind (Vignais und Billoud 2007; Petersen et
al. 2011). Hydrogenasen werden entsprechend dem Aufbau ihrer aktiven Zentren in drei
phylogenetisch nicht miteinander verwandte Klassen eingeteilt, die als Gemeinsamkeit ihrer
konvergenten Entwicklung ein „low-spin“ Fe2+ mit mindestens einem Carbonyl(CO)-
Liganden besitzen (Vignais et al. 2001; Kubas 2007). Die [FeFe]-Hydrogenasen weisen die
höchste Wasserstoffproduktionsaktivität auf, in dessen Rahmen überschüssige
Reduktionsäquivalente unter anaeroben Bedingungen entfernt werden (Fontecilla-Camps et
al. 2007; Adams 1990). Die prosthetische Gruppe der [FeFe]-Hydrogenasen, der sogenannte
H-Cluster, besteht aus einem [2Fe2S]-Zentrum, das über ein Cystein mit einem [4Fe-4S]-
Cluster verbunden ist. Beide Eisenatome des [2Fe2S]-Subclusters sind mit je einem CO- und
einem Cyanid-(CN-)Liganden komplexiert; wobei ein drittes CO und eine Dithiolate-Brücke
mit einem Di(methyl)amin beide Fe-Atome miteinander verbrückt (Peters et al. 1998; Silakov
et al. 2009). Bei den [NiFe]-Hydrogenasen erfolgt die katalytische Umwandlung von
Wasserstoff an einem heterodinuklearem [NiFe]-Zentrum, das von vier Cystein-Schwefeln an
die Proteinmatrix gebunden ist, wobei zwei Cysteine das Fe- und Ni-Atom verbrücken, die
restlichen zwei als terminale Ni-Liganden koordinierend fungieren (Volbeda et al. 1995).
Zusätzlich sind an das Eisenatom ein CO- und zwei CN-Liganden gebunden (Happe et al.
1997). Der Elektronen-Transfer zu oder von dem aktiven Zentrum erfolgt durch [Fe-S]-
Cluster. Die [NiFe]-Hydrogenasen katalysieren im Gegensatz zu den [FeFe]- Hydrogenasen
eher die H2-Oxidation als die H2-Produktion, obwohl einige Ausnahmen vorkommen (siehe
unten). Die meisten Vertreter dieser Enzymklasse werden durch Sauerstoff reversibel
inaktiviert, wobei einige sauerstofftolerante Vertreter dieser Enzymklasse bekannt sind
(Vignais und Billoud 2007). [Fe]-Hydrogenasen katalysieren den Hydridtransfer auf das
Substrat Methenyltetrahydromethanopterin in methanogenen Archaeen (Zirngibl et al. 1992).
Dieses lichtsensitive Enzym enthält ein Zentrum mit Eisen, das mit zwei CO Liganden, mit
einem Guanylylpyridinol-Derivat über eine Azyl-Gruppe und über ein sp2-hybridisiertes
Stickstoff koordiniert, und über ein Cystein mit der Proteinmatrix verbunden ist (Shima et al.
2008; Shima et al. 2011). Die auch als H2-produzierende Methylentetrahydromethanopterin-
Dehydrogenasen (Hmd) bezeichnete Enzymklasse besitzt keinen [Fe-S]-Cluster und wird bei
Nickelmangel gebildet (Thauer 1998). In der vorliegenden Arbeit wird eine [NiFe]-Hydrogenase
näher untersucht, daher wird der Fokus auf diese Enzymklasse gesetzt.
EINLEITUNG 3
1.2 [NiFe]-Hydrogenasen
Die [NiFe]-Hydrogenasen sind aufgrund ihrer sauerstofftoleranten Vertreter von hohem
Interesse für biotechnologische Anwendungen und sie sind in Bakterien und Archaeen weit
verbreitet. Sie bestehen aus mindestens zwei Untereinheiten, eine etwa 60 kDa große
Untereinheit mit dem [NiFe]-Zentrum und eine kleinere (ca. 30 kDa) Untereinheit mit
mindestens einem [4Fe-4S]- oder einem [4Fe3S]-Cluster nahe an dem aktiven Zentrum als
proximales Eisen-Schwefel-Zentrum (Vignais und Billoud 2007; Fritsch et al. 2011). Die
großen und kleinen Untereinheiten weisen dabei eine Sequenzhomologie zu der Nqo4 bzw.
der Nqo6 Untereinheit von der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) aus Thermus
thermophilus auf (Albracht 1993). Aufgrund der bekannten Struktur des Komplex I aus
Thermus thermophilus wird deren Nomenklatur im Nachfolgenden eingesetzt (Sazanov und
Hinchliffe 2006). Die Kristallstrukturen der Allochromatium vinosum und Desulfovibrio gigas
[NiFe]-Hydrogenasen repräsentieren die Struktur der sauerstoffsensitiven,
membrangebundenen „Standard“-Hydrogenasen, die sich auf der periplasmatischen Seite der
cytoplasmatischen Membran befinden und deren große und kleine Untereinheiten ein
globuläres Heterodimer bilden (Abbildung 1 oben links) (Volbeda et al. 1995; Ogata et al.
2010). In der kleinen Untereinheit ist das Elektronentransport-Relais mit einem medialen
[3Fe4S]-Cluster und einem distalen [4Fe4S]-Cluster verlängert, um die bei der H2-Oxidation
entstehenden Elektronen auf einen Elektronenakzeptor, oft ein Cytochrom, zu übertragen. Das
aktive Zentrum der [NiFe]-Hydrogenasen liegt tief im Inneren der großen Untereinheit
verborgen und ist über einen hydrophoben Gaskanal sowie vermutliche Protonentransferwege
mit der Proteinoberfläche verbunden (Montet et al. 1997; Volbeda et al. 2002).
4 EINLEITUNG
Abbildung 1: Übersicht der [NiFe]-Hydrogenasen (H2ase) der Gruppen 1, 2, 4 und 5 mit Aufbau des [NiFe]-Zentrums. Die exemplarischen Vertreter aus jeder Gruppe sind schematisch abgebildet. Die großen und die kleinen Hydrogenaseuntereinheiten sind dunkel- bzw. hellblau gekennzeichnet, ebenso die bevorzugte Reaktionsrichtung. Viele Hydrogenasen formen Multimere, die RH bildet einen (HoxBC)2HoxJ4 Komplex und die MBH ein Hox(GKZ)3 Homotrimer (Buhrke et al. 2004; Frielingsdorf et al. 2011). Bei der RH sprechen Sequenzvergleiche und neuere Mößbauer Spektroskopie für drei [4Fe4S]-Cluster (Oliver Lenz persönliche Kommunikation). Die Kofaktorenzusammensetzung des Formiat-Hydrogenlysase-Komplexes (Forzi und Sawers 2007) basiert auf Sequenz -und Strukturvergleichen zu Komplex I (Efremov und Sazanov 2012), dabei sind HycF als auch EchF homolog zu Nqo9 und der N-terminale Bereich von HycB als auch HoxU homolog zu Nqo3. Die Interaktion der SHI aus P. furiosus mit der Pyruvate-Ferredoxin-Oxidoreductase (PF1542) tritt mit der heterodimeren Form (PF0894+PF0893) der SHI auf (Hopkins et al. 2011). Eine Interaktion der cyanobakteriellen Aufnahme-Hydrogenase mit einer membranständigen Untereinheit (HupC) wird vermutet (Tamagnini et al. 2007). Abkürzungen: Fd: Ferredoxin mit zwei [4Fe4S]-Clustern, FDH-H: Formiat-Dehydrogenase H mit Molybdoseleno(MoSe)-Kofaktor.
1.3 Einteilung der [NiFe]-Hydrogenasen
Aufgrund der Sequenzähnlichkeit und Funktion können die [NiFe]-Hydrogenasen in fünf
Gruppen unterteilt werden (Vignais und Billoud 2007; Constant et al. 2011; siehe
Abbildung 1). Für eine Übersicht der [NiFe]-Hydrogenasen und deren katalysierten
Reaktionen siehe Abbildung 1 und 2. Die Gruppe 1 beinhaltet die bereits erwähnten
membrangebundenen, H2-oxidierenden [NiFe]-Hydrogenasen, die Gruppe 2 die
cyanobakteriellen H2-oxidierenden Hydrogenasen, die den während der Stickstofffixierung
freigesetzten Wasserstoff wieder oxidieren, sowie die H2-sensierende Hydrogenasen, die die
Expression von Hydrogenasegenen aktivieren (siehe Abbildung 1 links unten).
EINLEITUNG 5
Abb. 2: Übersicht [NiFe]-Hydrogenasen aus Gruppen drei. Jeweils ein exemplarischer Vertreter aus jeder Gruppe ist schematisch abgebildet. Die in dieser Studie eingesetzte NAD+reduzierende Hydrogenase (SH) aus R. eutropha besonders hervorgehoben. Die Ähnlichkeit der Hydrogenaseuntereinheiten mit den entsprechenden Untereinheiten aus Komplex I ist farblich gekennzeichnet (Efremov et al. 2010). Die cyanobakterielle NAD(P)-abhängige Hydrogenase (Schmitz et al. 2002) und die NAD+ reduzierende Hydrogenase aus R. eutropha bilden Homodimere. Der heterodimere Subkomplex (PF0894+PF0893) der SH I aus Pyrococcus furiosus kann mit der Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreductase (PF1542) einen Komplex bilden (Hopkins et al. 2011). Für weitere Beschreibungen siehe Abbildungsbeschreibung 1 und für Details zu Hydrogenasen aus methanogenen Organsimen siehe Thauer et al. 2010. Abkürzungen: CoM-SH, CoB-SH, CoA-SH Coenzyme M, B bzw A mit Thiol Gruppe; Fd, Ferredoxin mit zwei [4Fe4S]-Clustern; TPP Thiamine Pyrophosphat.
Die bidirektionalen cytoplasmatischen [NiFe]-Hydrogenasen sind in Gruppe 3
zusammengefasst, wobei das heterodimere Hydrogenase-Modul mit weiteren Untereinheiten
assoziiert ist, um lösliche Kofaktoren wie NAD (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid), NADP
(Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat), F420 ( 8-Hydroxy-5-Desazaflavin) oder das
Heterodisulfid aus Coenzym M und B für Redoxreaktionen zu verwenden (siehe Abbildung
2). Die Gruppe 3-Hydrogenasen funktionieren bidirektional, d. h. sie können sowohl
reduzierte Kofaktoren reoxidieren und Protonen als Elektronenakzeptoren zur H2-Produktion
benutzen als auch H2 oxidieren, wobei die meisten Hydrogenasen allerdings eine Präferenz
für eine Reaktionsrichtung besitzen. Viele Mitglieder dieser Gruppe werden in Archaeen
gefunden. Dazu gehören die heterotrimeren F420-Hydrogenasen, die freigesetzten Wasserstoff
reoxidieren (Gruppe 3a, Abbildung 2 links oben) und die Elektronen in die
energiekonservierende Elektronentransportkette transferieren, die heterotetrameren löslichen
Hydrogenasen von Hyperthermophilen (Gruppe 3b, Abbildung 2 links unten) und die
Heterodisulfide-Reduktase-assozierten Hydrogenasen aus Methanogenen (Gruppe 3c,
6 EINLEITUNG
Abbildung unten mittig; Stojanowic et al. 2003). Bidirektionale NAD(P)-abhängige
Hydrogenasen (Gruppe 3d) kommen in Proteobakterien und Cyanobakterien vor. Deren
Hydrogenase-Modul ist mit einem zusätzlichen NADH-Akzeptor-Oxidoreduktase-
(Diaphorase)-Modul verbunden, das die reversible Spaltung von Wasserstoff mit der
reversiblen Reduktion von NAD(P)+ koppelt. Der Diaphorase-Subkomplex besteht aus
mindestens zwei Untereinheiten, HoxF und HoxU, die ausgeprägte Sequenzähnlichkeit zu
dem peripheren Teil von Komplex I aus der Atmungskette (siehe Abbildung 2 oben rechts)
sowie zu NAD+-reduzierenden Formiatdehydrogenasen und [FeFe]-Hydrogenasen besitzen
(Pilkington et al. 1991; Schmitz et al. 1995; Cramm 2009). Die bidirektionalen Hydrogenasen
können weiter in zwei Gruppen unterteilt werden, die sich in Untereinheit- und
Kofaktorzusammensetzung sowie ihrer spezifischen physiologischen Funktion unterscheiden.
Die sauerstoffsensitiven, cyanobakteriellen
, bidirektionalen Hydrogenasen (Gruppe 3dI, Abbildung 2 rechts unten), die auch in
Schwefelpurpurbakterien vorkommen, besitzen ein Diaphorase-Modul mit einer zusätzlichen
HoxE-Untereinheit, die in Membran-Wechselwirkungen beteiligt sein könnte. Sie sind
wichtig, um überschüssige Reduktionsäquivalente aus der Fermentation und der
Photosynthese durch Wasserstoffproduktion zu entsorgen (Stal und Moezelaar 1997; Appel et
al. 2000). Da Untereinheiten des Komplex I in Cyanobakterien fehlen, wurde angenommen,
dass das Diaphorase-Modul diese substituieren könnte (Appel und Schulz 1996). Dies
erscheint jedoch eher unwahrscheinlich, da das Fehlen einer funktionalen bidirektionalen
Hydrogenase nicht das Zellwachstum beeinträchtigt (Boison et al. 1998; Boison et al. 1999).
Die zweiten Gruppe der bidirektionalen Hydrogenasen (Gruppe 3dII) besitzen keine HoxE-
Untereinheiten und kommen in dem Schwefelpurpurbakterium Thiocapsa roseopersicina, im
aeroben Actinobacterium Rhodococcus opacus MR11 und dem -Proteobakterium Ralstonia
eutropha H16 vor, siehe Abbildung 2 zentral oben (Maroti et al. 2010; Schneider und
Schlegel 1976; Schneider et al. 1984).
Die heteromultimeren Enzyme (sechs Untereinheiten oder mehr) der Gruppe 4 können
überschüssige Reduktionsäquivalente in Form von Wasserstoff durch anaerobe Oxidation von
C-1 Verbindungen mit niedrigem Redoxpotential, wie CO oder Formiate entfernen oder im
Falle der Ech-Hydrogenasen Energie in Form eines Ionengradienten konservieren (siehe
Abbildung1, rechte Seite; Vignais und Billoud 2007). Hydrogenase 3 aus Escheria coli ist der
Prototyp dieser Gruppe und katalysiert eine Teilreaktion des Formiat-Abbaus zu H2 und CO2
(Sawers 2005). Zu der Gruppe 5 gehört die phylogenetische Gruppe der hochaffinen [NiFe]-
EINLEITUNG 7
Hydrogenasen, die atmosphärische Konzentrationen von H2 oxidieren können (Constant et al.
2011).
1.4 Das [NiFe]-Zentrum und der katalytische Zyklus
Für [NiFe]-Hydrogenasen konnte durch infrarotspektroskopische Untersuchungen
nachgewiesen werden, dass CO- und CN-Liganden Teil des katalytischen Zentrums sind
(Happe et al. 1997). Eine Röntgenstrukturanalyse zeigte, dass diese das Eisen im [NiFe]-
Zentrum koordinieren (Volbeda und Fontecilla-Camps 2005). Der spektrochemischen Reihe
entsprechend bewirken die CO- und CN-Liganden eine starke Ligandenfeldaufspaltung.
Daher wird vermutlich das Eisenatom unter Beibehaltung der Oxidationsstufe +II in einem
diamagnetischen (S = 0) „low-spin“ Zustand gehalten (Armstrong und Fontecilla-Camps
2008). Der CO-Ligand, der die Elektrophilität der Bindungsstelle für Wasserstoff erhöht,
wurde als wichtig, sowohl für die reversible molekulare Bindung von Wasserstoff, als auch
für dessen heterolytische Spaltung, angesehen (Kubas 2007). Modellkomplexe von FeII-
Thiolatkomplexen deuteten darauf hin, dass CN-Liganden die Bindung von CO erleichtern
(Rauchfuss et al. 2001). Eine alternative Rolle für die Cyanid-Liganden könnte sein, dass sie
das Redoxpotential des [NiFe]-Zentrums für die H2-Umwandlung erniedrigen (Kubas 2007).
Zusätzlich zu den vier koordinierenden Cysteinen sind weitere Aminosäuren für die
Wasserstoff-Umwandlung am [NiFe]-Zentrum wichtig, dabei ist das Glutamat an der
Aminosäureposition 23 in der großen Hydrogenaseuntereinheit von D. gigas zu erwähnen,
das für den Protonentransfer von bzw. zum [NiFe]-Zentrum essentiell ist, siehe Abbildung 3
(Dementin et al. 2004). Das genannte Glutamat weist eine starke Wasserstoffbindung zu
einem der terminalen Nickel-koordinierenden Cysteine auf, das höchstwahrscheinlich deshalb
protoniert vorliegt (Garcin et al. 1999).
Das [NiFe]-Zentrum durchläuft während der Reaktivierung und der Katalyse mehrere
Redoxzustände, die mit verschiedenen spektroskopischen Verfahren in Standard-
Hydrogenasen untersucht wurden. Dabei ist das Nickel-Atom die redoxaktive Spezies in dem
Heterobimetall-Zentrum und durchläuft die Redoxzustände NiII, NiIII und vermutlich NiI,
wobei sich Eisen kontinuierlich in dem Redoxzustand FeII befindet (Dole et al. 1997).
Vergleichbare Nickel-enthaltende aktive Zentren besitzen die Methyl-Koenzym M Reduktase,
die Acetyl–S CoA Synthase oder CO-Dehydrogenase (Darnault et al. 2003; Scheller et al.
2010; Dobbek et al. 2001).
8 EINLEITUNG
Abb. 3: Modell der postulierten katalytischen Zyklen für die H2-Umwandlung (unten) und der oxidativen Inaktivierung (oben). Abhängig von der Verfügbarkeit von Elektronen und Protonen wird entweder der Nir-B- oder der Niu-A-Zustand gebildet. Die Nir-B-Form kann auch durch anaerobe Oxidation gebildet werden. Gezeigt sind lediglich die Schwefelatome (S) der koordinierenden Cysteine. Das Glutamat (Glu) befindet sich an Position 25 und das protonenakzeptierende Cystein an Position 543 in der großen Untereinheit der Hydrogenase von D. gigas. Gestrichelte Linien deuten Protonen- bzw. Elektronentransferprozesse an. Die Intermediate des katalytischen Zyklus beruhen unter anderem auf DFT-Berechnungen, EPR- und FTIR-Spektroskopie sowie entsprechenden Untersuchungen an Modellkomplexen (nach Siegbahn et al. 2007 und Armstrong et al. 2009, modifiziert). EPR-aktive und -inaktive Nickel-Zustände sind rot bzw. schwarz markiert (Niu= „nickel unready“, Nir = „nickel ready“; Nia = “nickel active“).
Durch EPR („electron paramagnetic resonance“)-Spektroskopie kann das [NiFe]-Zentrum der
Hydrogenasen untersucht werden. Durch Ein-Elektronen-Übertragungen können die EPR-
inaktiven NiII-Zustände Ni-S („S“ilent), Ni-SR („R“educed), zu paramagnetischen, EPR-
aktiven, NiIII-Zuständen im Falle von Niur-A, Nir-B, Nia-C oder NiI im Falle von Ni-L
umgewandelt werden. Mit der Infrarotspektroskopie können zusätzlich zu den
EINLEITUNG 9
paramagnetischen auch die diamagnetischen Redoxzustände des katalytischen Zentrums
anhand charakteristischer Streckschwingungen der drei anorganischen Liganden identifiziert
werden (deLacey et al. 1997; De Lacey et al. 2007). Die Fe(CO)(CN)2-Einheit des aktiven
Zentrums führt zu drei distinkten Infrarot-Absorptionen, die der Carbonyl-Streckschwingung
und den symmetrischen und antisymmetrischen Streckschwingungen der beiden gekoppelten
Cyanid-Liganden entspricht (Happe et al. 1997). Die exakten Bandenpositionen der
Streckschwingungen von den drei diatomaren Liganden sind aufgrund ihrer -Akzeptor- und
-Donor-Eigenschaften empfindlich gegenüber Änderungen der Elektronendichte sowie der
Ligandierung des [NiFe]-Zentrums (Bagley et al. 1995; Happe et al. 1997; Darensbourg et al.
2000). Diese Änderungen können durch IR-Spektroskopie als Positionsänderungen der
entsprechenden Absorptionsbanden verfolgt werden. In der Regel tauchen CN-
Streckschwingungen als Absorptionsbanden im Bereich zwischen 2100 und 2040 cm-1 auf,
während CO-Streckschwingungen im Bereich zwischen 1970 und 1900 cm-1 zu detektieren
sind (De Lacey und Fernández 2007). Streckschwingungen bei höheren Frequenzen
korrelieren mit einer Erniedrigung der Elektronendichte am Eisenatom (Darensbourg et al.
2000). Im Vergleich zu CN-Liganden sind die Schwingungen des CO-Liganden aufgrund der
stärkeren -Akzeptor-Eigenschaft sensitiver für Elektronendichteänderungen . Daher stellt die
Absorption des CO-Liganden einen besseren Indikator für den Redoxzustand des [NiFe]-
Zentrums als die Absorptionen der CN-Liganden dar (De Lacey und Fernández 2007;
Darensbourg et al. 2000). Zusätzlich zu dem Substrat Wasserstoff reagiert das [NiFe]-
Zentrum mit dem Inhibitor Sauerstoff. In „Standard“ [NiFe]-Hydrogenasen wurden zwei
inaktive oxidierte Redoxzuständen mit NiIII nachgewiesen. Die O2-Exposition unter
elektronenreichen Bedingungen führt hauptsächlich zu dem ''ready'' Nir-B Zustand
(Abbildung 3B), der auch anaerob bei Potentialen über -200 mV gebildet werden kann
(Vincent et al. 2007). Die O2-Behandlung unter Elektronenmangel-Bedingungen ruft vor
allem den ''unready“ Niu-A-Zustand hervor (Abbildung 3A) (Volbeda et al. 2002; Ogata et al.
2005; Cracknell et al. 2009). Die beiden Spezies mit für NiIII (S=1/2) charakteristischen EPR
Signalen weisen unterschiedliche Aktivierungs-Kinetiken auf. Für die Nir-B-Spezies wurde
ein Hydroxo-Ligand in der verbrückenden Position zwischen den beiden Metallen
nachgewiesen, der in Gegenwart von Wasserstoff schnell reaktiviert werden kann (Sekunden
bis Minuten) (Volbeda, Martin et al. 2005; van Gastel, Stein et al. 2006). Dagegen kann die
Reaktivierung des Niu-A Redoxzustandes mehrere Stunden dauern (Fernandez et al. 1985).
Dabei wird ein Hydroperoxo-Ligand in der verbrückenden Position vermutet. Ein-Elektronen-
Reduktionen der Niu-A- bzw. Nir-B-Zustände führen zu den EPR-inaktiven Niu-S („S ilent)
10 EINLEITUNG
bzw. Nir-S-Zuständen (jeweils NiII). Höchstwahrscheinlich bleibt der Brückenligand in diesen
Zuständen erhalten und muss für die vollständige Aktivierung des Enzyms entfernt werden.
Nir-S wird durch die Freisetzung von Wasser aktiviert und geht dabei in den „active“ Nia-S
(NiII) mit einer freien Koordinationsstelle zwischen den beiden Metallen über (Abbildung 3C)
(Ogata et al. 2005).
Für den katalytischen Zyklus wurden verschiedene Modelle vorgeschlagen. Ein Modell für
die heterolytische Wasserstoffspaltung ist in Abbildung 3 gezeigt. Es basiert auf
Strukturanalysen, spektroskopisch detektierten Zuständen, DFT-Berechnungen (Density
functional theory) und berücksichtigt ein terminales Cystein als primärer Protonenakzeptor
sowie ein Glutamat für den Protonentransfer (Siegbahn et al. 2007). Als erster Schritt wird die
Bindung von Wasserstoff an das sich im Nia-S-Zustand befindliche [NiFe]-Zentrum
angesehen (Abbildung 3D), der vermutlich eine freie Koordinationsstelle zwischen Nickel
und Eisen aufweist (Niu et al. 1999). Aufgrund von DFT-Berechnungen und der Affintität
von„low spin“-d-Metallen für molekularen Wasserstoff wird angenommen, dass das FeII des
aktiven Zentrums H2 bindet (Siegbahn et al. 2007; Kubas 2007). Eine Bindung des
Wasserstoffs an das Nickel ist allerdings ebenfalls möglich, da der hydrophobe Gaskanal am
Nickel endet und Nickel den Inhibitor CO bindet (Montet et al. 1997; Ogata et al. 2002). In
den meisten Modellen für den katalytischen Zyklus wird von einer heterolytischen Spaltung
des Wasserstoffes ausgegangen, bei der ein terminales Cystein als Protonenakzeptor dient und
reversibel ein Hydrid zwischen Nickel und Eisen gebunden wird (Siegbahn et al. 2007). Der
resultierende reduzierte Nia-SR-Zustand ist EPR-inaktiv (NiII) (Bleijlevens et al. 2004;
Volbeda et al. 2005). Bis zu drei unterschiedliche pH-Wert-abhängige Formen von Nia-SR
sind identifiziert worden, die sich in der Protonierung unterscheiden könnten (Volbeda et al.
2005; Fichtner et al. 2006). Des Weiteren könnten auch Liganden wie H- oder H2, die
entweder an das Nickel oder Eisen gebunden sind, eine Erklärung für die verschiedenen Nia-
SR-Zustände sein (Ogata et al. 2009).
Die anschließende Oxidation des Nickelions und Übertragung eines Elektrons auf die [Fe-S]-
Cluster ergibt den paramagnetischen Nia-C-Zustand (Abbildung 3H, NiIII, S = ½; De Lacey et
al. 2007). Durch EPR-spektroskopische Untersuchungen konnte in diesem Zustand ein
Hydrid (H-) als Brückenligand nachgewiesen werden, was im Zusammenhang mit pH-Wert-
abhängigen Messungen und H/D-Austauschexperimenten als Beweis für die heterolytische
Spaltung von molekularem Wasserstoff im [NiFe]-Zentrum gesehen wird (Lespinat et al.
1986; Brecht et al. 2003). Bei kryogenen Temperaturen reagiert der Nia-C-Zustand unter
Beleuchtung mit weißem Licht zu einer weiteren EPR-detektierbaren Spezies (Ni-L)(van der
EINLEITUNG 11
Zwaan et al. 1985), die vermutlich über den reversiblen Transfer eines Protons aus dem
Brückenliganden in die nähere Umgebung des aktiven Zentrums gebildet wird (Brecht et al.
2003). Obwohl dieser Zustand normalerweise unter nicht-physiologischen Bedingungen
entsteht, wird ein ähnliches, transientes NiI-Intermediat als Teil des katalytischen
Wasserstoffzyklus vorgeschlagen (Abbildung 3I; Pardo et al. 2006; Siegbahn et al. 2007; Lill
und Siegbahn 2009). Die Nia-S-Spezies wird durch eine weitere Oxidation und Übertragung
eines Elektrons auf die [Fe-S]-Cluster regeneriert.
Als alternatives Modell wird eine initiale heterolytische Spaltung von H2 mit einer
anschließenden oxidativen Addition von H2 postuliert, der zu dem Nia-X-Zustand mit zwei
Hydriden, eines verbrückend zwischen Nickel und Eisen und das zweite terminal gebunden an
Nickel, führt und ein formales NiIII aufweist (Lill und Siegbahn 2009). Als Initiation der
oxidativen Addition wird u.a. eine [NiFe]-Spezies mit einem NiI vorgeschlagen, die eine
Metallbindung zwischen Nickel und Eisen besitzt (Babtie et al. 2009).
1.5 Die vier unterschiedlichen Hydrogenasen von Ralstonia eutropha
Das Knallgasbakterium Ralstonia eutropha H16 ist ein strikt respiratorisches, fakultativ
lithoautotrophes Bakterium, das ubiquitär in Böden und Süßwasser vorkommt und erstmals
1962 von Erika Wilde isoliert wurde (Wilde 1962). Das peritrich begeißelte, stäbchenförmige
-Proteobakterium kann sowohl chemolithoautotroph mit CO2 als Kohlenstoffquelle, Wasserstoff
als Energiequelle und O2 als terminalen Elektronenakzeptor als auch auf organischen
Kohlenstoffquellen, wie z. B. Fruktose, Glycerin, aromatischen Verbindungen oder organischen
Säuren heterotroph wachsen (Johnson und Stanier 1971; Kersters et al. 1984). Unter anaeroben
Bedingungen kann das Bakterium zur Denitrifikation wechseln und Nitrat als alternativen
Elektronenakzeptor einsetzen (Pfitzner und Schlegel 1973). Organischer Kohlenstoff wird
unter Sauerstoff-, Stickstoff- oder Phosphatmangel in Form von Polyhydroxybutyrat (PHB)
gebunden, das als biologisch abbaubarer thermoplastisches Material bekannt wurde (A. 1992;
Lee und Park 2005). Während des lithoautotrophen Wachstums wird CO2 durch den Calvin-
Benson-Bassham-Zyklus (CBB) fixiert und der molekulare Wasserstoff wird durch zwei
energiekonservierende Hydrogenasen in R. eutropha oxidiert (Bowien und Kusian 2002). Das
Genom besteht aus drei zirkulären Replikons, nämlich zwei Chromosomen und einem
Megaplasmid pHG1, und umfasst insgesamt 6626 Gene, wobei die Gene des
Wasserstoffmetabolismus ausschließlich auf dem Megaplasmid lokalisiert sind (Pohlmann et
al. 2006). Eine der beiden energiekonservierenden Hydrogenasen ist die cytoplasmatische
NAD+-reduzierende Hydrogenase (soluble hydrogenase; SH). Sie gehört zur Gruppe 3dII und
reduziert NAD+ zu NADH durch Elektronen, die aus der Wasserstoffoxidation stammen.
12 EINLEITUNG
(Burgdorf et al. 2005). Während des lithoautotrophen Wachstums wird NADH für
Kohlenstofffixierung durch den CBB-Zyklus benötigt und kann durch Transhydrogenasen für
anabole Stoffwechselwege zu NADPH umgewandelt werden. Des Weiteren können
Reduktionsäquivalente in Form von NADH durch Komplex I der Atmungskette reoxidiert
werden, um einen Protonengradienten aufzubauen, so dass anschließend ATP produziert wird
(Cramm 2009). Herrscht dagegen ein Überschuss von NADH im Cytoplasma unter anaeroben
Bedingungen, kann die SH die reverse Reaktion, die H+-Reduktion zu Wasserstoff durch
NADH Oxidation katalysieren und damit als ein Redoxventil fungieren (Kuhn et al. 1984).
Die zweite energiekonservierende H2ase ist die periplasmatisch orientierte,
membrangebundene Hydrogenase (MBH), die mit der SH generell ko-synthetisiert wird. Sie
gehört zur Gruppe 1 der [NiFe]-Hydrogenasen. Elektronen aus der Oxidation von H2 werden
vom Heterodimer HoxGK über ein Cytochrom b (HoxZ) in den Chinonpool der
Atmungskette geleitet (Schink und Schlegel 1979; Bernhard et al. 1997). Studien zum
lithoautotrophen Wachstum zeigen, dass die Deletion der MBH-Strukturgene die
Verdopplungszeit nicht beeinträchtigt, wohingegen ein Fehlen der SH das Wachstum
signifikant erniedrigt, da durch reversen Elektronentransport über Komplex I erst wieder
NADH für die Kohlenstofffixierung gebildet werden muss (Kömen et al. 1992).
Die regulatorische Hydrogenase (RH) gehört zur Gruppe 2 und reguliert durch ein Zwei-
Komponenten-System, das aus der Histidinkinase HoxJ und dem Responseregulator HoxA
besteht die H2-abhängige Transkription der SH- bzw. MBH-Gene (Lenz und Friedrich 1998;
Lenz et al. 2002; Buhrke et al. 2004). Zusätzlich zu HoxA wird die SH- und MBH-
Expression durch den alternativen Sigmafaktor 54 kontrolliert (Schwartz et al. 1998; Schwartz
et al. 1999). Infolge eines Aminosäureaustausches (G422S) in HoxJ ist die Expression der
Hydrogenasegene im Wildtypstamm R. eutropha H16 allerdings nicht mehr H2 abhängig,
sondern wird nur durch eine globale Katabolit-Kontrolle reguliert (Lenz und Friedrich 1998).
Durch bevorzugte Kohlenstoffquellen wie Pyruvat, Succinat oder Fruktose wird die
Hydrogenase-Genexpression reprimiert und durch schlechter verwertbaren Substrate wie z. B.
Glycerin dereprimiert (Friedrich et al. 1981). Zu der Gruppe 5 gehört ein Enzym,
vornehmlich in Actinomyceten zu finden ist und daher Actinomyceten-Hydrogenase (AH)
genannt wird. Dieses Enzym wurde vor kurzem als vierte Hydrogenase in R. eutropha
nachgewiesen (Caspar Schäfer, unveröffentlichte Ergebnisse).
EINLEITUNG 13
Abb. 4: Schematische Darstellung des MBH- und des SH- Operons von Ralstonia eutropha H16 (Pohlmann et al. 2006).
Die Biosynthese der [NiFe]-Hydrogenasen von R. eutropha ist ein mehrstufiger Prozess,
einschließlich Kofaktor-Einbau, Untereinheiten-Assemblierung und im Falle der MBH die
Tat-abhängige Translokation durch die Membran (Übersichten in: Burgdorf et al. 2005; Böck
et al. 2006; Leach und Zamble 2007; Lenz et al. 2010). Kodiert werden die vier
Hydrogenasen in drei großen Operons auf dem Megaplasmid pHG1 (siehe Abbildung 4;
Schwartz et al. 2003). Das MBH-Operon von R. eutropha enthält 21 Gene, die die
Strukturproteine HoxKGZ, die MBH-spezifischen akzessorischen Proteine HoxMLOQRTV,
die Hyp-Proteine HypABFCDEX, verantwortlich für die Assemblierung des [NiFe]-
Zentrums, und die Strukturgene HoxBC der RH sowie die regulatorischen Proteine HoxAJ
codieren (Bernhard et al. 1996; Pohlmann et al. 2006; Fritsch et al. 2011). Die Gene für die
SH-Strukturproteine HoxFUHYI, der SH-spezifischen Endopeptidase HoxW und die
duplizierten Maturationsproteine HypA2B2F2 liegen in einer separaten Transkriptionseinheit.
Zwischen dem SH- und MBH-Operon liegt das AH-Operon mit den Strukturgenen hyd4SL,
den Genen für die Maturationsproteine und dem putativen Proteasegen PHG070, deren
Expression, Aktivität, physiologische Rolle und Struktur Gegenstand gegenwärtiger
Forschungen sind.
1.6 Zusammenbau des [NiFe]-Zentrums
Die Kofaktor-Synthese des [NiFe]-Zentrums und dessen Einbau in das Apoprotein wird durch
mindestens sechs Maturationsproteine katalysiert. Der CN--Ligand wird in einem ATP-
abhängigen Schritt aus Carbamylphosphat durch HypF synthetisiert. Die Carbamylgruppe
wird auf die Thiolgruppe des C-Terminalen Cysteins in HypE übertragen und anschließend
dehydriert. Dieses führt zu einem HypE-Thiocyanat. Daraufhin wird die Cyanogruppe auf den
eisenhaltigen HypCD-Komplex übertragen (Reissmann et al. 2003; Blokesch et al. 2004;
Blokesch et al. 2004; Jones et al. 2004; Böck et al. 2006; Rangarajan et al. 2008; Petkun et al.
2011). Die Quelle des Eisenatoms ist bislang unbekannt. Der CO-Ligand wird unter
anaeroben Bedingungen vermutlich durch eine Vielzahl von metabolischen Wegen gebildet,
G Z M LOhypA1
hoxAB1 F1 C ED X
hoxK U Y H W IhypA2 B2 F2
hoxFQ R T V CB J
14 EINLEITUNG
unter aeroben Bedingungen wird er durch HypX synthetisiert und bindet anschließend an dem
Eisen in dem Maturationskomplex HypCD (Ingmar Bürstel, persönliche Mitteilung).
Schließlich wird der Fe(CN-)2CO-Komplex in die metallfreie große Untereinheit übertragen,
gefolgt von einem Einbau von Nickel durch HypA und die GTPase HypB (Olson et al. 2001;
Blokesch und Böck 2002). Die hyp-Gene hypA2, hypB2 und hypF2 kommen dupliziert im
SH-Gencluster vor und können Deletionen ihrer homologen Gegenstücke im MBH-Operon
komplementieren (Wolf et al. 1998). Nach Einfügen des [NiFe]-Zentrums wird der C-
Terminus der großen Untereinheit durch die spezifische Endopeptidase mit „Proofreading“-
Funktion entfernt (Bernhard et al. 1996; Maier und Böck 1996; Thiemermann et al. 1996).
Schließlich kommt es zur Oligomerisierung der maturen großen Untereinheit mit der kleinen
Hydrogenase-Untereinheit.
1.7 Sauerstofftoleranz der R. eutropha Hydrogenasen
Als Folge der Eigenschaft von R. eutropha lithoautotroph mit Wasserstoff und Sauerstoff zu
wachsen, sind alle vier bislang charakterisierten Hydrogenasen aus diesem Organismus in der
Lage, Wasserstoff in der Gegenwart von Sauerstoff umzusetzen (Schneider und Schlegel
1976; Buhrke et al. 2005; Vincent et al. 2005; Burgdorf et al. 2005; Vincent et al. 2005).
Aufgrund ihrer Sauerstofftoleranz sind sie somit für biotechnologische Anwendungen
außerordentlich interessant. Im Falle der SH wurde ein modifiziertes aktives Zentrum mit
zwei zusätzlichen Cyaniden vorgeschlagen, die u. a. aufgrund sterischer Abschirmung eine
Rolle bei der Sauerstoff-Toleranz spielen sollten. (Happe et al. 2000; Bleijlevens et al. 2004;
van der Linden et al. 2004). Für die RH wurde ein verengter Gaskanal berichtet, der den
Zugang von Sauerstoff zum aktiven Zentrum einschränkt (Buhrke et al. 2005). In der MBH,
wurde vor kurzem ein ungewöhnlicher proximaler [Fe-S]-Cluster beschrieben, der eine Rolle
in der Sauerstofftoleranz spielt, indem er der Elektronen zur Reduktion von Sauerstoff zur
Verfügung stellen kann (Goris et al. 2011). Die Kristallstruktur der MBH und der verwandten
sauerstofftoleranten Hydrogenasen aus Hydrogenovibrio marinus und Escherichia coli
zeigen, dass der proximale Cluster durch zwei zusätzliche Cysteine koordiniert vorliegt und
einen außergewöhnlichen [4Fe3S]-Cluster darstellt (Fritsch et al. 2011; Shomura et al. 2011;
Volbeda et al. 2012).
Das [NiFe]-Zentrum der sauerstofftoleranten MBHs ist dagegen sehr ähnlich zu den O2-
sensitiven [NiFe]-Hydrogenasen, wie bereits spektroskopische Untersuchungen zeigten
(Saggu et al. 2009; Saggu et al. 2010). Zusätzlich weist die Röntgenstrukturanalyse der
R. eutropha MBH ein Netzwerk von Wasserkavitäten auf, die als ein Kanal für das Entfernen
von reduzierten Sauerstoff-Spezies von dem [NiFe]-Zentrum dienen könnten (Fritsch et al.
EINLEITUNG 15
2011). Wasserproduktion wurde zuvor bereits für die Reaktivierung der „Standard“-
Hydrogenasen in ihrem oxidierten Nir-B- und Niu-A-Zuständen postuliert (Jones et al. 2003;
Stein und Lubitz 2004). Für die sauerstofftoleranten Hydrogenasen wurde eine kontinuierliche
Bildung von Wasser als Folge der Reaktion des aktiven Zentrums mit O2 während der H2-
Oxidation vorgeschlagen. Dem aktuellen Modell entsprechend wird zunächst ein
Sauerstoffatom aus O2 direkt zu Wasser reduziert und das zweite Sauerstoffatom zunächst als
verbrückener Hydroxylligand zwischen Nickel und Eisen (Nir-B-Zustand) gelagert werden.
Der Hydroxylligand wird schlussendlich durch Protonierung als zweites Wassermolekül
freigesetzt wird. (Cracknell et al. 2009; Lenz et al. 2010; Goris et al. 2011). Allerdings steht
die experimentelle Verifizierung noch aus.
1.8 Die NAD+-reduzierende Hydrogenase aus R. eutropha
Die Sauerstofftoleranz macht die SH zu einem vielversprechenden Biokatalysator für
zukünftige biotechnologische Anwendungen. Eine Konzentration von 20 % Sauerstoff (v/v)
inhibiert die wasserstoffabhängige NAD+-Reduktion kaum merklich, sogar eine
Konzentration von 60 % (v/v) Sauerstoff inhibiert die Aktivität nur um 20 % (Schneider und
Schlegel 1981). Dagegen wird die Aktivität von Standardhydrogenasen, z. B. der aus
Allochromatium vinosum, vollständig durch Sauerstoff inaktiviert (Vincent et al. 2005).
Die SH ist als erste bidirektionale NiFe-Hydrogenase bereits 1976 von Schneider und
Schlegel im Detail charakterisiert worden. Inzwischen repräsentiert die SH die als am besten
untersuchte bidirektionale Hydrogenase und wird als etabliertes Modellsystem für diese
Enzymklasse angesehen, wie bereits über 50 Publikationen über dieses Enzym bezeugen.
Das aus den Strukturproteinen HoxFUHYI2 bestehende SH-Holoenzym katalysiert die
wasserstoffabhängige NAD+-Reduktion zu NADH. Bislang konnte keine NADP+-Reduktion
festgestellt werden (Schneider und Schlegel 1976; Burgdorf et al. 2005). In kinetischen
Untersuchungen weist die „as isolated“-SH eine Reaktivierungsphase („lag-Phase“) auf. Es
wird angenommen, dass sich ein Anteil der gereinigten SH noch im aktiven Zustand befindet
und NAD+ zu NADH reduziert, das wiederum inaktive SH durch reversen
Elektronentransport reaktiviert (Schneider und Schlegel 1976; Keefe et al. 1995). Burgdorf et
al. postulierten, dass das Homodimer HoxI2 hauptsächlich an HoxFU assoziiert vorliegt und
eine NADPH-Bindungsstelle für die Reaktivierung bildet. Beim Fehlen dieser Untereinheiten
soll die gereinigte SH nur durch NADH reaktiviert werden können (Burgdorf et al. 2005).
Wie andere bidirektionale Hydrogenasen besteht die SH aus zwei unabhängigen katalytischen
Einheiten, dem heterodimeren Hydrogenase-Modul (Untereinheiten HoxH und HoxY) und
dem Diaphorase(NADH:Akzeptor-Oxidoreduktase)-Modul, das aus aus HoxF und HoxU
16 EINLEITUNG
besteht und Ähnlichkeiten zu Untereinheiten aus Komplex I, Formiatdehydrogenasen und
[FeFe]-Hydrogenasen aufweist. Eine Strategie der Evolution ist offensichtlich die wiederholte
Anwendung von konservierten Protein-Domänen oder sogar ganzer Module in
unterschiedlichen Enzymen, um zuvor nicht miteinander verknüpfte katalytische Funktionen
zu verbinden. Im Gegensatz zu der Rhodococcus opacus SH, die in vitro leicht in der
Abwesenheit von zweiwertigen Metallionen (Ni2+, Co2+, Mg2+,Mn2+) und durch Verringerung
der Ionenstärke des Puffers in die zwei verschiedenen Module dissoziiert, ist die
heterotetramere Struktur der R. eutropha SH stabil (Johannssen et al. 1991). Nur HoxI
dissoziiert von der heterotetrameren HoxFUHY unter höherer Ionenstärke und leicht
alkalischen pH-Werten (Burgdorf et al. 2005). Für die Hydrogenase- und Diaphorase-Module
aus R. eutropha konnte gezeigt werden, dass die getrennte Expresssion beider Subkomplexe
und anschließende Mischung der löslichen Extrakte die katalytische Funktion des
Holoenzyms rekonstituiert (Massanz et al. 1998). Die SH ist durch die NAD(H)-Bindestelle
im Diaphorase-Modul direkt mit dem cytoplasmatischen NAD+/NADH-Pool gekoppelt,
während membrangebundene-[NiFe]-Hydrogenasen mit dem Chinon-Pool der Atmungskette
gekoppelt sind. Zusätzlich zu NAD(H) kann die SH mit einer Reihe von artifiziellen und
natürlichen Elektronenakzeptoren und -donoren reagieren, wie z. B. Methylviologen (MV),
Benzylviologen (BV), Ferricyanid (FCN), Methylenblau, Phenazinmethosulfat (PMS),
Flaovomononukleotid (FMN), Cytochrom c oder sogar mit Sauerstoff (Schneider und
Schlegel 1976). Dies ermöglicht es, SH-Teilreaktionen, wie z. B. die Wasserstoffproduktion
durch reduziertes MV durch das Hydrogenase-Modul oder NADH-abhängige
Benzylviologen-Reduktion durch das Diaphorase-Modul zu untersuchen.
1.9 Kofaktoren der SH
In der nativen SH wird das katalytische [NiFe]-Zentrum des Hydrogenase-Moduls durch eine
Serie von Eisen-Schwefel-Clustern und Flavinen mit der NAD+-Bindungsstelle von HoxF
verbunden (Abbildung 2; Burgdorf et al. 2005). Das Flavinmononukleotid kann dabei
insgesamt drei Redoxzustände einnehmen. Durch Ein-Elektronenübertragung entstehen aus
dem oxidierten FMN zwei verschiedene Semichinon-Radikal-Formen, die sich in der Ladung
unterscheiden. Eine weitere Elektronenübertragung führt zum vollständig reduzierten FMN
(Massey und Palmer 1966). Im Gegensatz dazu können Standard-[FeS]-Cluster nur zwei
Redoxzustände unter physiologischen Bedingungen einnehmen. Die FMN-Bestimmungen der
SH ergaben weniger als zwei Flavine pro SH-Molekül (Schneider und Schlegel 1978). Es ist
anzumerken, dass durch die kolorimetrische Proteinbestimmung eine zu hohe
Proteinkonzentration der SH bestimmt wurde, die für eine genaue Kofaktorquantifizierung
EINLEITUNG 17
notwendig ist. (Albracht et al. 2003). Im Zusammenhang mit Rekonstitutionsexperimenten ist
von zwei Flavinmononukleotiden in der SH ausgegangen worden (Schneider und Schlegel
1978; van der Linden et al. 2004). Basierend auf einer Sequenzähnlichkeit mit der Nqo1-
Untereinheit von Komplex I und spektroskopischen Untersuchungen des Diaphorase-Moduls
aus R. opacus , ist einer der Flavinkofaktoren, hier als FMN-b bezeichnet, ein Bestandteil der
HoxF-Untereinheit (Schneider und Schlegel 1978; Albracht und Hedderich 2000). Dabei
fungiert FMN als Kommunikator zwischen Ein-Elektronen-Zentren (Fe-S-Cluster) und Zwei-
Elektronen-Zentren (NADH) in Komplex I, was auf eine analoge Rolle in der SH hindeutet.
Der Bindungsort des zweiten Flavins, hier als FMN-a bezeichnet, wurde innerhalb von HoxY
postuliert (van der Linden et al. 2004). Diese Zuordnung basiert darauf, dass die N-terminale
Region von HoxY ähnlich zu dem FMN-bindenden Motiv von Flavodoxin ist. Jedoch
überlappt diese räumlich mit der Bindestelle des proximalen Clusters (Volbeda et al. 1995).
Daher wurde anfangs entweder von einem FMN oder einem [4Fe4S]-Cluster in HoxY
ausgegangen. Van der Linden und Mitarbeiter postulierten, dass das FMN-a nur lose
gebunden ist und leicht durch Reduktion mit NADH freigesetzt werden kann (van der Linden
et al. 2004). Als Funktion des FMN-a wurde eine Übertragung eines Hydrids während der
Wasserstoffspaltung auf das proximale [4Fe4S]-Cluster angenommen (siehe weiter unten).
Zweifel kamen jedoch auf, da in dem analogen Hydrogenase-Modul von R. opacus kein FMN
festgestellt werden konnte (Schneider et al. 1984). Die Fähigkeit des FMN, Ein-Elektronen-
Übertragungen zu ermöglichen, hat den Nachteil, womöglich reaktive Sauerstoffspezies
(ROS) zu produzieren, die zu Zellschädigungen führen können. Signifikante ROS-Produktion
wurden sowohl für Komplex I, als auch für die SH beobachtet (Schneider und Schlegel 1981;
Kussmaul und Hirst 2006).
Durch Sequenzanalyse mit Komplex I und verwandten, bereits untersuchten bidirektionalen
Hydrogenasen wurde das Vorhandensein von fünf [Fe-S]-Clustern für die SH vorhergesagt
(Pilkington et al. 1991; Albracht et al. 1997; Albracht und Hedderich 2000). Ein [2Fe2Fe]-
Cluster und mindestens ein [4Fe4S]-Cluster wurden im SH-Holoenzymn durch EPR-
Spektroskopie detektiert (Schneider et al. 1979; Erkens et al. 1996; Burgdorf et al. 2005). Das
in cyanobakteriellen bidirektionalen Hydrogenasen vorkommende Bindemotiv für einen
zusätzlichen [2Fe-2S]-Cluster in HoxF ist in der SH nicht konserviert. Außerdem fehlt die
HoxE-Untereinheit mit dem [2Fe2S]-Cluster in der SH. Im Falle von Komplex I wurde
postuliert, dass der [2Fe-2S]-Cluster N1a in Nqo2, der außerhalb des Haupt-Elektronen-
Transfer-Kette liegt, die Produktion von ROS durch die Annahme von Elektronen aus dem
reduzierten Flavin erniedrigt (Hinchliffe und Sazanov 2005; Esterhazy et al. 2008). Für das
18 EINLEITUNG
Hydrogenase-Modul wurde in der HoxY Untereinheit aufgrund konservierter Cysteine mit der
Nqo6 Untereinheit von Komplex I und anderer bidirektionaler Hydrogenasen ein einzelner
proximaler [4Fe4S]-Cluster angenommen (Pilkington et al. 1991; Albracht et al. 1997;
Albracht und Hedderich 2000; Sazanov und Hinchliffe 2006). EPR-, UV-Vis- und Mößbauer-
Studien zeigten in dem isolierten Hydrogenase-Modul der SH-ähnlichen Hydrogenasen aus R.
opacus und A. vinosum einen [4Fe4S]-Cluster (Schneider et al. 1984; Zaborosch et al. 1995;
Long et al. 2007). Durch das Fehlen des medialen [3Fe-4S]- und des distalen [4Fe-4S]-
Clusters im C-terminalen verkürzten HoxY im Vergleich zu Standard-[NiFe]-Hydrogenasen,
wird die elektronische Kopplung zu dem Diaphorase-Modul vermutlich durch den proximalen
[4Fe4S]-Cluster erreicht. Für das [NiFe]-Zentrum der SH wurde ein modifiziertes Zentrum im
Vergleich zu anderen [NiFe]-Hydrogenasen angenommen. Das IR-Spektrum der gereinigten,
oxidierten SH zeigte vier anstatt zwei CN- Absorptionsbanden sowie eine CO-Bande (Happe
et al. 2000). Basierend auf dieser Beobachtung und begleitenden chemischen Analysen wurde
für beide Metallionen des aktiven Zentrums die Koordination je eines zusätzlichen Cyanids
vermutet, die das aktive Zentrum sterisch vor Sauerstoff abschirmen sollten (van der Linden
et al. 2004). Ferner wurde postuliert, dass das Nickel-gebundene Cyanid, das der 2098 cm-1
Bande zugeordnet wurde, von HypX gebildet wird und insbesondere für die
Sauerstofftoleranz der SH wichtig sei, indem es die Bildung von Niu-A verhindert
(Bleijlevens et al. 2004). Während der Reduktion des [NiFe]-Zentrums sollte sich nur diese
2098 cm-1 Bande zu geringeren Wellenzahlen, zu 2090 cm-1 und 2051 cm-1, verschieben.
Unter allen getesteten Bedingungen war das [NiFe]-Zentrum EPR-inaktiv, deshalb wurde von
einem NiII in allen Redoxzuständen ausgegangen (Happe et al. 2000; van der Linden et al.
2006). Basierend auf Röntgenabsorptionsspektroskopie (X-ray absorption spectroscopy,
XAS)-Studien wurde vorgeschlagen, dass Nickel sechsfach koordiniert vorliegt und harte
Liganden wie C, O, oder N, besonders im vollständig oxidierten Zustand besitzt (Gu et al.
1996; Müller et al. 1997; Burgdorf et al. 2005; Löscher et al. 2005). Diese Beobachtung
wurde als Sulfoxygenierung der terminalen Nickel-gebundenen Cysteine-Thiole interpretiert,
wobei Sauerstoff direkt an Nickel wie auch eine weitere Sauerstoffspezies (OOH-) an Nickel
binden sollte (Burgdorf et al. 2005; van der Linden et al. 2006). Zusammenfassend wurde ein
(CN)(CysSO)2(OOH)Ni(μ-CysS)2Fe(CN)3(CO)-Zentrum im oxidierten Zustand
vorgeschlagen. Als Reaktionsmechanismus wurde angenommen, dass der Peroxid-Ligand am
Nickel im oxidierten Zustand mit drei Elektronen reduziert und dann als Wasser freigesetzt
wird, während die Wasserstoffspaltung nur an dem Nickel stattfindet, da das Eisen bereits
sechsfach koordiniert ist. Des Weiteren wurde ein Hydrid-Transfer von einem NiII-Hydrid-
EINLEITUNG 19
Intermediat zu FMN-a mit anschließender Oxidation des reduzierten FMN-a und
Weiterleitung der freigesetzten Elektronen an die [FeS]-Cluster postuliert (van der Linden et
al. 2004).
Kontroverse Resultate wurden sowohl aus EPR- als auch FTIR-spektroskopischen Studien
erhalten, wie unter anderem das Auftreten von Nia-C- und Nia-SR-Zuständen, die im
Widerspruch zu diesem Modell standen (Erkens et al. 1996; Burgdorf et al. 2005; van der
Linden et al. 2006). Es wurde angenommen, dass diese Redoxzustände, die in anaeroben
„Standard“-[NiFe]-Hydrogenasen zu beobachten sind, einen veränderten Zustand des Enzyms
darstellen und nicht am Katalysezyklus der SH beteiligt sind (Burgdorf et al. 2005; van der
Linden et al. 2006).
1.10 Biotechnologische Anwendung von Hydrogenasen
Aufgrund der außergewöhnlichen Sauerstofftoleranz stellt die NAD+-reduzierende
Hydrogenase ein vielversprechendes Enzym in der biotechnologischen Anwendung dar.
Kofaktoren, wie NAD(H) werden auch von vielen industriell genutzten Redoxenzymen
benötigt, wie z. B. von Dehydrogenasen und Oxygenasen. Während der Synthese dient die
reduzierte Form NADH als Überträger eines Hydrids (H-), wobei oxidiertes NAD+ entsteht.
Um das NAD+ wieder zu reduzieren, wird daher ein effektives und beständiges
Regenerationssystem benötigt, um die stöchiometrische Zugabe dieses teuren
Reduktionsmittels zu vermeiden. Die Verwendung einer Hydrogenase in einem solchen
Regenerationssytem bietet den Vorteil, dass Wasserstoff als preiswertes Reduktionsmittel
eingesetzt werden kann und keine weiteren Nebenprodukte außer Protonen entstehen
(Klibanov und Puglisi 1980; Ratzka et al. 2012). Des Weiteren wurde bereits der Einsatz von
Hydrogenasen als Wasserstoffsensor (Abbildung 32F) und in biologischen Brennstoffzellen
gezeigt (Lutz et al. 2005; Vincent et al. 2006). Momentan wird H2 fast ausschließlich durch
Elektrolyse von Wasser mittels Platinkatalysatoren oder aus fossilen Energiequellen, wie
beispielsweise Erdgas, gewonnen. Eine lichtgetriebene biologische Wasserstoffproduktion aus
Kopplung des wasserspaltenden Photosystems II mit H2-produzierenden Hydrogenasen in
Cyanobakterien würde eine nachhaltige Produktion von H2 nur aus Wasser und Sonnenlicht
erlauben (Krassen et al. 2009). Daher herrscht großes Interesse an der Aufklärung der
Funktionsweise von Hydrogenasen, um sie in der biotechnologischen Produktion und
Nutzung von H2 einzusetzen.
20 EINLEITUNG
1.11 Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit
Ziel dieser Arbeit war es, die O2-Toleranz der SH aus R. eutropha H16 aufzuklären sowie
verschiedene H2-abhängige Kofaktorregenerationssysteme zu etablieren. Das Modell der
Sauerstofftoleranz der SH mit vier CN-Liganden am [NiFe]-Zentrum war stark umstritten
(Erkens et al. 1996; van der Linden et al. 2006). Daher sollte die SH in ihrer natürlichen
Umgebung, als Bestandteil des Cytoplasmas, mit einem kombinierten EPR- und FTIR-
Spektroskopie-Ansatz in ganzen Zellen untersucht werden. Anschließend wurde die
Produktion und Reinigung der SH optimiert, um hochaktives homogenes Protein mit
unterschiedlichen spektroskopischen Methoden wie UV-Vis- und Infrarotspektroskopie zu
untersuchen und ausreichende Mengen für den Einsatz in der in vitro-Kofaktorregeneration zu
erhalten. Aufgrund der hohen Komplexität der SH in Bezug auf die Untereinheiten- und
Kofaktoren-Zusammensetzung, sollten die katalytische Module unabhängig voneinander
untersucht werden, um den Reaktionsmechanismus der SH in überschaubaren Teilreaktionen
zu betrachten. Dafür wurden Produktionssysteme für das Diaphorase- und Hydrogenase-
Modul benutzt, die bereits zuvor zur Aufklärung der Assoziation des HoxI Homodimer am
Diaphorase-Modul bzw. als Kontrolle der Hydrogenasefusionsporteine mit dem Photosystem
I eingesetzt wurden (Burgdorf et al. 2005; Doktorarbeit Alexander Schwarze).
Ein umfangreiche Charakterisierung beider Module in Bezug auf Kofaktoren,
Redoxeigenschaften und der Sauerstofftoleranz wurde im Rahmen dieser Dissertation
durchgeführt.
Um ein neues Modell zur Sauerstofftoleranz der SH aufzustellen, wurden die Reaktionen mit
Sauerstoff und deren Produkte näher untersucht. Dafür wurde eine neue
massenspektroskopische Detektionsmethode von Wasser, das durch isotopisch markiertes 18O2 und H2 durch die SH produziert wurde, etabliert.
Aufgrund der Sauerstofftoleranz stellt die SH ein vielversprechendes
Kofaktorregenerationssystem für NADH dar. Da die SH jedoch nur NAD+ reduzieren kann,
sollte die NAD+-Bindungsstelle zu einer NADP+-Bindungsstelle umgewandelt werden. Des
Weiteren sollte die SH in P. putida heterolog produziert werden, so dass dieses System
zukünftig für eine wasserstoffabhängige in vivo-Kofaktorregenerierung eingesetzt werden
kann.
MATERIAL UND METHODEN 21
2. Material und Methoden
2.1 Bakterienstämme und Plasmide
Bakterienstämme und Plasmide, die in dieser Arbeit verwendet wurden, sind in Tabelle 1
aufgeführt. E. coli D10 wurde standardmäßig für Klonierungen genutzt und E. coli S17-1 als
Donor für konjugativen Plasmidtransfer. R. eutropha H16 ist der Wildtypstamm. Derivate des
Stammes sind durch die Buchstaben HF gekennzeichnet. Die pCH-Plasmide besitzen
ausschließlich einen "ColE1-Origin" und werden demzufolge nur in E. coli-Verwandten
repliziert. Die pGE-Plasmide sind Weit-Wirts-Bereich-Plasmide und sowohl in E. coli als
auch in Nicht-Enterobakterien (z. B. Ralstonia eutropha, Pseudomonas putida)
vermehrungsfähig. Sie gehören zur IncP-Inkompatiblilitätsgruppe.
Tabelle 1: Verwendete Stämme und Plasmide.
Stämme/
Plasmide
Relevante Eigenschaften
Herkunft/ Referenz
E.coli
DH10 araD139 (ara-leu)7697 fhuA lacX74 galK ( 80 (lacZ)M15)
mcrA galU recA1 endA1 nupG rpsL (StrR) (mrr-hsdRMS-mcrBC)
(Grant et al. 1990)
S17-1 Tra+ recA pro- th-, hsdR chr:RP4-2 (Simon et al. 1983)
R. eutropha
H16 Wildtyp mit Megaplasmid pHG1, SH+ RH+ MBH+ HoxJ- DSM 428, ATCC 17699
(Wilde 1962)
HF210 Megaplasmidfrei (SH- MBH- RH-) (Kortlüke und Friedrich
1992)
HF500 hoxG hoxC hoxH (SH- MBH- RH-) (Kleihues et al. 2000)
HF788 Überproduktion von HoxHY (HoxY-Strep-tag II) hoxFU (Schwarze 2011)
HF798 Derivat von HF500, hoxG hoxC (SH+ RH- MBH-) Diese Arbeit
HF903 Derivat von HF798, hoxFU durch Rekombination mit pCH1462
(SH- RH- MBH-)
Diese Arbeit
HF424 SH- MBH-, hoxFUYHW hoxG (Massanz et al. 1998)
P.putida
KT2440 hsdR1, hsdM+, Ben+ DSM6125 (Bagdasarian et
al. 1981)
Plasmide
Litmus 28 Apr lacZ' ColE1 ori New England Biolabs
pLO1 Kmr, sacB, RP4 oriT, ColE1 ori (Lenz et al. 1994)
pBlueskrip
t II KS+
PT7, PT3, Plac, lacZ’, Ampr, ColE1 ori
Stratagene Cloning
Systems
pCM62 Weitwirtsbereich-Plasmid, TcR Mob+ (Marx und Lidstrom 2001)
22 MATERIAL UND METHODEN
pHD Plasmid aus HF788, Hydrogenase-Modul-Expressionsplasmid
hoxFUYWIhypA2B2F2CDEXhoxABCJ (Strep- tag II an HoxY)
(Schwarze 2011)
pEDY309 Weitwirtsbereich-PlasmidTcr RK2 ori Mob+ (Kleihues et al. 2000)
pTBu1085 hoxFUH Tanja Burgdorf
pCH1462 hoxFU in pLO1 (Schwarze 2011)
pCH1613 4,08 kbp-EcoRI-Fragment religiert pTBU1058; Strep-tag II an
HoxF
Diese Arbeit
pCH1614 pSPZ10 898 bp XhoI/HindIII-PCR-Produkt in 3,8 kbp-
XhoI/HindIII-Fragment aus pCH1613; PalkB-hoxF‘
Josta Hamann
pCH1615 3,4 kb BamHI/HindIII pJH3180 in Litmus 28 Diese Arbeit
pJH3180 1,8 kb EcoRV/HindII pCH1614+4,46 EcoRV/HindIII pTBu1085 Diese Arbeit
pJH3203 3,4 kb BamHI/HindII pJH31802,8kb BamHI/HindII Litmus28 Diese Arbeit
pCH1616 3kb XbaI/SapI-Fragment aus pJH3203 in 12,5kb XbaI/SapI-
Fragment aus pJH2904
Diese Arbeit
pLL1 15,5 kb-SpeI/XbaI-Fragment aus pJH1616 in 6,9kb-SpeI/XbaI-
Fragment aus pCM62
Diese Arbeit
pJH3001 hoxFUYWIhypA2B2F2CDEXhoxA in pEDY309 Oliver Lenz
pJH2904 14,9 kb-HindIII aus pGE770 in Litmus 28 Diese Arbeit
pCH1500 Derivat von pCH472: hoxH in pLO1 Diese Arbeit
pCH472 hoxH in pBluescript KS+ (Massanz et al. 1997)
pCH1596
15,3-bp-HindIII Fragment aus pGE770 + 3,557kb-HindIII-
Fragment aus pCH1597
Diese Arbeit
pCH1597 1,6 kb-SpeI/EcoRI-Fragment aus pCH646 in 2,8kb-SpeI/EcoRI-
Fragment ausLitmus28
Diese Arbeit
pCH1580 HoxHI64A Derivat von pCH1596 mit 5,27 kb FseI-PspMO1-
Fragment von pGE475
Diese Arbeit
pCH644 hoxC in pLO1 (Lenz und Friedrich 1998)
pCH646 hoxA in pBlueKS+ Oliver Lenz
pCH1575 Derivat von pCH1582; HoxF D400K; Quik Change Diese Arbeit
pCH1576 Derivat von pCH1582; HoxF D467S; Quik Change Diese Arbeit
pCH1578 Derivat von pCH1575; HoxFD400K; 2,1 kb-XbaI-PspMOI-Fragment
aus pCH1575+ 17 kB XbaI-PspMOI-Fragment aus pCH1581
Diese Arbeit
pCH1579 Derivat von pCH1576; HoxFD467S; 2,1 kb-XbaI-PspMOI-Fragment
aus pCH1576 in 17kb XbaI-PspMOI-Fragment aus pCH1581
Diese Arbeit
pCH1581 Derivat von pGE750; (HoxY Strep-tag II); 2,8 kB SpeI-XbaI-
Fragment aus Litmus28 + 16kb-SpeI-XbaI-Fragment aus pGE750
Diese Arbeit
pCH1582 Derivat von pGE750; HoxF-Fragment in pBluescript KS+; 2,1 kb-
XbaI-PspM0I-Fragment aus pGE750
Diese Arbeit
pCH1599 Derivat von pCH1582; HoxF D401K D340A Quik Change Diese Arbeit
pCH1601 Derivat von pCH1582; HoxF D401K D467S Quik Change Diese Arbeit
pCH1602 Derivat von pCH1582; HoxF E341A D467S Quik Change Diese Arbeit
pCH1604 Derivat von pCH1599; HoxF D401K D340A; 2,1 kb -XbaI-PspMOI- Diese Arbeit
MATERIAL UND METHODEN 23
Fragment aus pCH1599+ 17 kB-XbaI-PspMOI-Fragment aus
pCH1581
pCH1606 Derivat von pCH1601; HoxF D401K D467S ; 2,1 kb-XbaI-PspMOI-
Fragment aus pCH1601+ 17 kB-XbaI-PspMO1-Fragment aus
pCH1581
Diese Arbeit
pCH1607 Derivat von pCH1602; HoxF E341A D467S; 2,1 kb-XbaI-PspMOI-
Fragment aus pCH1602+ 17 kB-Xba1-PspMOI-fragment aus
pCH1581
Diese Arbeit
pLL113 Derivat von pCH1582; HoxF D341A; Quik Change Diese Arbeit
pLL110 Derivat von pCH1582; HoxF D340A; Quik Change Diese Arbeit
pLL123 Derivat von pLL113; HoxFD341A; 2,1 kb-XbaI-PspMOI-Fragment
auspCH1575+ 17 kB-XbaI-PspMOI-Fragment aus pCH1581
Diese Arbeit
pCH127 Derivat von pLL110; HoxFD340A; 2,1 kb-XbaI-PspMOI-Fragment
aus pLL110+ 17 kB-XbaI-PspMOI-Fragment aus pCH1581
Diese Arbeit
pLL143 19kb-SH Operon (StrepHoxY) hoxBCJ XbaI-SpeI-Fragment aus
pCH1578+ 6,8 kB-XbaI-Fragment aus pCM62 HoxFD340A
Diese Arbeit
pLL146 19kb-SH Operon(StrepHoxY) hoxBCJ XbaI-SpeI-Fragment aus
pLL123+ 6,8 kB-XbaI-Fragment aus pCM62 HoxFD341A
Diese Arbeit
pCom10
(PspAlk)
CYP153A Monooxygenase, Ferredoxin und Ferredoxin Reduktase
von Polaromonas sp. Stamm JS666
Bettina Nestl (AG Hauer),
nicht veröffentlicht
pGE475 SH-Überproduktionsplasmid mit HoxHI64A (Burgdorf et al. 2002)
pGE749 HoxHI64A 16 kb-SpeI-XbaI-Fragment von pCH1580 in 21 kb-XbaI
aus pEDY309
Diese Arbeit
pGE617 hoxFUYH WT hypA2B2F2 mit intergener Region am 3`-Ende von
hypF2 vor hypC in pCM783; hypF2 per PCR modifiziert; SH-
Überexpressionsplamid
Tanja Burgdorf (AG
Friedrich)
pGE553 Expressionssystem für hoxFU ( Strep-tag II an HoxF) (Burgdorf et al. 2005)
pGE770 hoxFUYWIhypA2B2F2CDEXhoxABCJ
( Strep-tag II an HoxF) in pCM62
Tanja Burgdorf (AG
Friedrich)
pGE760 SH-Überexpressionsplasmid hoxFUYWIhypA2B2F2CDEXhoxA
(Strep- tag II an HoxF)
16 kb SpeI/XbaI pCH1596 Fragment in pEDY309
Diese Arbeit
pGE750 SH-Überexpressionsplasmid (HoxY, Strep- tag II)
hoxFUYWIhypA2B2F2CDEXhoxA)
Diese Arbeit
pGE772 Derivat von pCH1604, HoxF D340A D400K 19 kb-XbaI-SpeI-Fragment
aus pCH1604+ 21 kB-XbaI-Fragment aus pEDY309
Diese Arbeit
pGE761 SH Operon(Strep-HoxY) hoxBCJ , 19 kb-XbaI-SpeI-Fragment aus
pCH1578+ 21 kB-XbaI-Fragment aus pEDY309 HoxFD401K
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pGE763 19 kb SH-Operon(Strep-HoxY) hoxBCJ XbaI-SpeI-Fragment aus
pCH1579+ 21 kB XbaI-Fragment aus pEDY309 HoxFD467S
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pGE774 Derivat von pCH1606 HoxF D400K D467S 19 kb XbaI-SpeI-Fragment Diese Arbeit
24 MATERIAL UND METHODEN
aus pCH1606 + 21 kB XbaI-Fragment aus pEDY309
pGE775 Derivat von pCH1607 HoxF E341A D467S 19 kb XbaI-SpeI-Fragment
aus pCH1607+ 21 kB XbaI-Fragment aus pEDY309
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a Für Genotyp-Abkürzungen siehe Bachmann (1983) b Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig
Tabelle 2: Verwendete Oligonukleotide.
Mutageneseprimer Sequenz (5´ 3´)
1 ll20_sense_hoxF_D340A CTTATATCTGCGGCGCCGAATCGGCGCTCAT 2 ll21_anti_hoxF_D340A ATGAGCGCCGATTCGGCGCCGCAGATATAAG 3 ll22_sense_hoxF_E341A ATCTGCGGCGACGCATCGGCGCTCATC
4 ll22_antisense_E341A GATGAGCGCCGATGCGTCGCCGCAGAT
7 ll54_D400K GGGCGATGGGAACGCCAAAGTCGGCCGGC 8 ll55_D400K_antisense GCCGGCCGACTTTGGCGTTCCCATCGCCC 9 ll56_D467S CGCAAGCTCGCGTACGAATCGCTTTCGTGCAATGGCGCC
10 ll57_D467S_antisense GGCGCCARRGCACGAAAGCGATTCGTACGCGGAGCTTGCG
11 ll14_AA GCTTATATCTGCGGCGCCGCCTCGGCGCTCATCGAG 12 ll15_antisense_AA ACTCGATGAGCGCCGAGGCGGCGCCGCAGCTATAAGC Sequenzierungsprimer
13 ll44_antisense_sequencing TAATACGACTCACTTAAGGC
14 M13_forward CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
15 M13_reverse CAGGAAACAGCTATGAC
16 3-9 HoxH Sac(+) TTT GCC GAG CTC GAT CAA TC
17 4-1 HoxH Sac(-) CCA TGC GGA GCT CCC ACT GC
18 4-2 HhaI-forward CAC GAA GGG GCG GAC GAA
19 4-3 HhaI-reverse ACC AGG TTG GCG AAC GTG
20 ll51_hoxF Promoter AAGTGACGCACCAAGCAAGG
21 ll33_HoxFU_PspOMI TCCTTCAGCGCCTTCTCATA
22 ll32_hoxU GTGAATTCGAGCTCGGTACC
23 ll31_HoxF TGCAGGTCGACTCTAGAACC
2.2 Kultivierung der Bakterien
2.2.1 Wachstumsmedium
R. eutropha-Stämme wurden in einem Mineralsalz-Medium kultiviert (Schlegel et al. 1961;
Friedrich et al. 1981). Das Medium basierte auf einem Phosphat-Puffer ("H16-Puffer"),
bestehend aus 25 mM Na2H(PO4) und 11 mM KH2(PO4) mit einem pH-Wert von 7,0. Weitere
Nährstoffe wurden als Stammlösungen in Endkonzentrationen von 37,4 mM NH4Cl, 0,81 mM
Mg(SO4)X 7 H2O, 0,068 mM CaCl2 X 2 H2O, 18 μM FeCl3 X 6 H2O, 1 μM ZnCl2, einfach
MATERIAL UND METHODEN 25
SL6 (Atlas 2004) und 1 μM NiCl2 hinzugegeben. Medien für heterotrophes Wachstum
enthielten Fruktose (0,4 % w/v; FN medium), eine Mischung aus Fruktose und Glycerin
(jeweils 0,2 %; FGN Medium), oder 0,05 % w/v Fructose und 0,4 % v/v Glycerin
(modifiziertes FGN medium; FGNmo). Chemolithoautotrophe Kulturen wuchsen im
Mineralsalz-Medium ohne C-Quelle unter einer Atmosphäre von H2, O2 und CO2 bei einem
Verhältnis von 70, 20, 10 % v / v, wenn nicht anders angegeben.
Für P.putida wurde als Kohlenstoffquelle 0,2 % w/v Glukose und 0,4 % v/v Glycerin (GGN
Medium) mit 36 μM FeCl3 eingesetzt. Als komplexe Medien wurden Lysogeny-Broth-
Medium (LB), mit 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l NaCl, salzarmes Luria-Broth-
Medium (LSLB) mit derselben Zusammensetzung, außer dass 2,5 g/l NaCl eingesetzt oder
Nährbouillon (NB) Medium mit 8 g/l Nährbouillon verwendet wurde. Feste Komplexmedien
enthielten 1,2 % w/v Agar-Agar (Roth) bzw. Minimalmedien 1,2 % w/v Reinst-Agar (Difco
BactoTM Agar). Antibiotika wurden als Stammlösungen hergestellt: 100 mg/ml Ampicillin
(Natriumsalz), 100 mg/ml Kanamycin-Sulfat jeweils in entionisiertem H2O, 10 mg/ml
Tetracyclin-Hydrochlorid in 70 % v/v Ethanol. Antibiotika wurden in den folgenden
Endkonzentrationen verwendet: Ampicillin 100 μg/ml für flüssige und feste Medien,
Kanamycin 50 μg/ml für E. coli und P. putida (flüssigen und festen Medien) und 400 μg/ml
für R. eutropha. Tetracyclin 10 μg/ml (flüssige Medien) und 15 μg/ml (feste Medien) für
R. eutropha, P. putida und E. coli.
2.2.2 Bestimmung der Wachstumsparameter
Das Wachstum von Bakterienkulturen wurde durch Messung der optischen Dichte mit einem
Photometer (U-2000, Hitachi, Japan) bei einer Wellenlänge von 436 nm (OD436) für
R. eutropha oder bei 600 nm (OD600) für E. coli oder P. putida gegen Medium oder H16-
Puffer bestimmt. Zellsuspensionen wurden verdünnt, so dass die gemessenen Werte unter
OD = 0,3 waren.
2.2.3 Zellkultivierung
Agarplatten wurden in der Regel bei 37 °C inkubiert. Kulturvolumen für Klonierungen und
Vorkulturen wurden stets mit einer Einzelkolonie beimpft. Die Kultivierung von R. eutropha
unter Hydrogenase-dereprimierenden Standardbedingungen erfolgte bei 30 °C in FGN in
100 ml gefüllten 500 ml-Schikanekolben. Heterotrophe Kulturen wurden unter
Luftatmosphäre, lithoautotrophe Kulturen in Exsikkatoren unter definierten Gasgemischen auf
einem Schüttler bei 120 rpm inkubiert. Je nach Gasverbrauch der in Exsikkatoren
gewachsenen Kulturen wurde die Atmosphäre häufig ausgetauscht. Heterotrophe Kulturen
26 MATERIAL UND METHODEN
wurden nach 48 h bei einer OD436 von ca. 8-10 geerntet, lithoautotrophe Kulturen wurden
ebenso bei einer OD436 zwischen 8-10 geerntet.
Die heterotrophen Kulturen von HF788 und HF424(pGE553) für Hydrogenase- bzw.
Diaphorase-Modul-Produktion wurden in 10 l-Fermentern (Biostat MD; Braun) bei einer
Rührergeschwindigkeit von 400 rpm und Begasung von 2 l/min Luft (21 % O2) inkubiert, bis
die optische Dichte der Kultur bei 436 nm (OD436) 10±1 erreichte. Schaumbildung wurde,
wenn nötig, durch Zugabe von wenigen Mikrolitern Polypropylenglycol 2000 reduziert.
Lithoautotrophe großtechnische Kultivierungen wurden in einem 10 l Fermenter mit einem
Gasgemische von 80 % H2, 10 % O2 und 10 % CO2 durchgeführt (Type NLF 22,
Bioengineering, Wald, Switzerland).
O2-limitiertes Wachstum konnte erreicht werden, indem die Zellen in FGNmo Medium mit
400 ml bzw. 4 l Kultur in einem gefüllten 500 ml bzw. 5 l Schikanekolben unter Luft bei
120 rpm für 5-7 d (bis OD436 = 8-10) bei 30 °C geschüttelt wurden.
Zur Expression von Genen unter der Kontrolle des alkB-Promotors wurden P. putida Zellen
in GGN bei 30 °C kultiviert. Die Genexpression wurde in der späten Wachstumsphase (OD600
von etwa 4) durch Zugabe von 0,05 % Oktan oder DCPK induziert und die Zellen zu
verschiedenen Zeitpunkten geerntet. Kleinere Kulturvolumen (weniger als drei ml) wurden
für eine min bei 15000 Xg (Biofuge 13, Heraeus, Deutschland) zentrifugiert. Kulturen mit
einem Volumen von 50 ml wurden für eine Dauer von 15 min bei 6000 x g bei 4 °C geerntet
(Heraeus Megafuge1.0R, Heraeus, Deutschland).
Die Ernte größerer Kulturen erfolgte bei 4 °C für 12 min bei 6000 x g (F9S-4x1000y; Thermo
Fisher). Im Falle der Diaphorase-Modul-Produktion wurden die geernteten Zellen in 50 mM
Kaliumphosphatpuffer (K-PO4) pH 7,0 mit 50 mM Succinat einmal gewaschen und erneut
zentrifugiert. Zellpellets wurden während der Ernte auf Eis gehalten, das Nassgewicht der
Pellets bestimmt, diese in flüssigem N2 schockgefroren (ca. -196 °C) und anschließend bei –
80 °C gelagert.
Für in situ-FTIR/EPR-Experimente wurde das Zellpellet zweimal mit 50 mM K-PO4 pH 7,0
gewaschen. Schließlich wurden die Zellen in demselben Puffer resuspendiert, um eine
endgültige OD436 von ca. 2000 (entspricht ca. 190 mg/ml Gesamtprotein) zu erhalten, und
anschließend auf Eis gelagert.
2.2.4 Konservierung von Bakterienstämmen
Zur Kurzzeitkonservierung wurden die Bakterienstämme auf selektiven Agarplatten bei 4 °C
bis zu einem Monat gelagert. Für Langzeitkonservierung der Stämme wurden diese in LB mit
dem jeweiligen Antibiotikum kultiviert (E. coli-Stämme), GN Medium (P. putida) oder FN
MATERIAL UND METHODEN 27
Medium (R. eutropha) und in der späten exponentiellen Phase mit Glycerin zu einer 22%
(v/v) Endkonzentration versetzt und anschließend bei -80 °C eingefroren. Bei Bedarf wurde
Zellmaterial zur Reaktivierung mit einer sterilen Impföse entnommen.
2.3 Zellfraktionierung und Proteinreinigung
Alle Schritte der Proteinreinigung wurden bei 4 °C oder auf Eis durchgeführt. Die
Anreicherung rekombinanter Proteine mit Strep-tag II wurde durch Affinitätschromatographie
erreicht (Schmidt et al. 1996; Voss und Skerra 1997). Für die Reinigung des Hydrogenase-
und des Diaphorase-Moduls wurden R. eutropha-Zellen im Resuspensionpuffer (150 mM
KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 ml pro 1 g Nassgewicht), der EDTA-freien Proteaseinhibitor-
Cocktail (Roche) enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden durch zwei Passagen in einer
4 °C gekühlten French-Press-Zelle (SLM Aminco; USA) bei 6,2 MPa aufgebrochen und die
entstandene Zellsuspension wurde bei 100000 x g für 45 min zentrifugiert. Der Überstand
(löslicher Extrakt) wurde in ein 2 ml Strep-Tactin Superflow-Säule (IBA), mit 6 ml
Resuspensionspuffer ohne Protease-Inhibitor gewaschen und mit dem gleichen
Resuspensionspuffer, der 5 mM Desthiobiotin enthielt, eluiert. Fraktionen, die das
gewünschte Protein enthielten, wurden gepoolt und durch Ultrafiltration (Amicon Diaflo Zelle
YM 30-Membran; Amicon, Witten, Deutschland) konzentriert. Im Falle des
Diaphorase-Moduls schloss eine Größenausschlusschromatographie (Superdex 200,
Amersham Biosciences, 120 ml Bett-Volumen) der Affinitätschromatographie an. Die
Größenausschlusschromatographie wurde mit Resuspensionspuffer bei einer Flussrate von
1 ml/min durchgeführt.
Die molekulare Masse der Proteinkomplexe wurde in Bezug auf die Laufeigenschaften von
Standard-Proteinen mit bekannten Größen während der Größenausschlusschromatographie
bestimmt. Für die Reinigung der heterohexamerer SH über eine Affinitätschromatographie
wurden die Zellen in Kaliumphosphatpuffer (50 mM K-PO4, 5 % Glycerin, 5 mM NAD+
pH 7,0 2 ml pro 1 g Nassgewicht) mit zusätzlichen Protease-Inhibitor-Cocktail (EDTA-free
Protease Inhibitor, Roche) resuspendiert, der mit Argon gesättigt war. Die Zellen wurden wie
oben beschrieben aufgebrochen und der lösliche Extrakt vom Sediment getrennt. Die
Suspension blieb dabei unter Argon. Der Überstand wurde auf einer 4 ml Strep-Tactin
Superflow Säule (IBA) aufgetragen, mit zuerst 8 ml Resuspensionpuffer aerob und
anschließend mit 12 ml des Resuspensionspuffer ohne NAD+ gewaschen und mit demselben
Puffer, der 5 mM Desthiobiotin enhielt, eluiert.
Heterotetramere SH ohne das HoxI-Homodimer konnte gereinigt werden, wenn der
Phosphatpuffer (50 mM K-PO4, 5 % Glycerin, pH 7,0) mit einem Puffer höherer Ionenstärke
28 MATERIAL UND METHODEN
und leicht alkalischem pH-Wert (150 mM KCl, 50 mM Tris-HCl, 5 % Glycerin pH 8.0)
ersetzt wurde.
2.4 Probenanalytik
2.4.1 Proteinbestimmung
Die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde mit dem BCATM-Kit nach
Herstellerangaben (Pierce, Thermo Fisher Scientific, USA) bestimmt. Die Messung bei einer
Wellenlänge von 562 nm erfolgte in 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatten, die in einem
SpectraMax 340 Plattenleser (Molecular Devices, USA) ausgelesen wurden. Als interner
Standard wurden die parallel gemessenen Absorptionswerte von sieben Verdünnungen (0 bis
1000 g/ml) einer BSA-Lösung (Pierce, Thermo Fisher Scientific oder Sigma-Aldrich, beide
USA) eingesetzt.
2.4.2 Bestimmung der Hydrogenase Aktivität
Die quantitative Aktivitätsbestimmung der SH beruhte auf der H2-abhängigen Reduktion von
NAD+ (Schneider und Schlegel 1976). Dabei entspricht 1 Unit (U) der Reduktion von 1 mol
NAD+ pro Minute. Die Reduktion wurde in einem Zweistrahl-UV-Vis-Spektrophotometer des
Typs Cary 300 von Varian™ bei einer Wellenlänge von 365 nm aufgezeichnet und mit dem
Programm CaryWin (VarianTM) ausgewertet. Die Messung erfolgte wie bei allen anderen
Aktivitätsansätzen bei 30°C in einer 3 ml Anaerobenküvette mit 2 ml H2-gesättigten 50 mM
Tris-HCl-Puffer pH 8,0, der 1 μM FMN, 1 mM DTT und 1 mM NAD+ enthielt. Die Reaktion
wurde mit 2-50 μl Enzym gestartet und die Reduktion von NAD+ bei 365 nm ( = 3.3 mM-1
cm-1) verfolgt. Bei Experimenten zur Bestimmung reduzierter Sauerstoffspezies wurde TCEP
anstelle von DTT benutzt. Für die H2-abhängige NAD+ Aktivitätsmessung mit Zellen wurden
diese durch die Inkubation mit 0,005 % (w/v) Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB),
permeabilisiert (Friedrich et al. 1981). Für Experimente zur Sauerstofftoleranz wurden
verschiedene Mischungen von 1 bar gesättigten O2-, N2- und H2-Puffern genutzt, sowie
entsprechende Gasgemische im Überstand eingestellt.
Analog zur H2-abhängigen NAD+ Reduktion wurde die Reduktion von 5 mM Methyviologen
(MV) bei 603 nm ( = 13 mM-1cm-1) (Watanabe und Honda 1982) in H2-gesättigtem 50 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) verfolgt. Experimente in Gegenwart von Sauerstoff waren mit MV
aufgrund der Reoxidation durch O2 von reduziertem MV nicht möglich.
Um die reduktive Aktivierung von HoxHY zu verfolgen, wurde in einem 15-μl Tropfen
120 pmol Protein, 90 nmol Dithionit (DT) mit (400 pmol) oder ohne FMN auf die Innenwand
der Küvette pipettiert. Nach 30 s wurde der Tropfen mit dem Assay-Puffer gemischt und die
MATERIAL UND METHODEN 29
H2-abhängige MV-Reduktion spektrophotometrisch gemessen. Für Experimente ohne
Vorinkubation, wurden 120 pmol HoxHY direkt in den 2 ml H2-gesättigten TrisHCl-Puffer
(50 mM, pH 8,0), der 5 mM MV und 45 M DT enthielt, hinzugefügt.
Die Wasserstoff-Produktion wurde bei 30 °C mit einer modifizierten Clark-Elektrode und
reduziertem MV als Elektronendonor quantifiziert (Schwarze et al. 2010). Die Test-Kammer
war dabei mit 1,3 ml N2-gesättigtem TrisHCl-Puffer (50 mM pH 8,0) gefüllt, der 7,7 mM DT
und 5 mM MV enthielt. Alternativ dazu wurden 100 μl Gasproben aus einem 1 mM NADH,
1 μM FMN, 1 mM TCEP, 55 μg SH Ansatz in einem gasdichten 5,1 ml-Gefäß entnommen
und mit einem Gaschromatographen (Shimadzu GC-2014AT ausgestattet für die Detektion
von Gasen mit einer „HayeSep N“-Säule und einem 13X-Molekularsieb entsprechend den
Spezifikationen A0608005) für Wasserstoffproduktion analysiert.
2.4.3 Bestimmung der Diaphorase Aktivität
Die Diaphorase-Aktivität wurde anaerob nach Schneider und Schlegel 1976 durch Reduktion
von BV durch NADH (50 mM TrisHCl-Puffer pH 8,0, 1 mM NADH, 5 mM Benzylviologen ,
90 μM DT und 10 bis 50 pmol des Enzyms) bestimmt. Die Reduktion von BV wurde
spektrophotometrisch bei 578 nm ( = 8,9 mM-1 cm-1) verfolgt.
Für Kinetiken mit NADP(H) wurde das Reaktionsvolumen von 2 ml auf 200 μl erniedrigt und
entsprechende 140 μl-Küvetten (Varian™) eingesetzt. Um die Affinität zum Substrat zu
bestimmen (Km-Werte), wurde die Konzentration von NAD(P)+ und von NAD(P)H bei den
jeweiligen Hydrogenase- und Diaphorase-Aktivitätassays variiert.
2.4.4 Bestimmung der Oxidase Aktivität
Die Sauerstoffreduktion wurde bei 30 °C mit einer Clark-Elektrode quantifiziert. Die Kammer
wurde mit 1,5 ml 1 mM NAD+, 1 M FMN, 1 mM TCEP in 40 % O2, 60 % H2 50 mM Tris-
HCl-Puffer pH 8,0 gefüllt und mit 50-200 pmol Enzym gestartet.
Die Bildung von Superoxid wurde durch die Oxidation von Hydroxylamin zu Nitrit nach
einem modifizierten Protokoll von (Schneider und Schlegel 1981) quantifiziert. Die Reaktion
wurde bei 30 °C in 450 μl 0,5 mM Hydroxylaminhydrochlorid 40 % O2, 60 % H2 50 mM
TrisHCl pH 8.0, 1 mM NADH, 1 mM TCEP, 1 μM FMN und 20-50 μg SH durchgeführt. Die
Bildung von Nitrit wurde durch Messung der Absorption bei 530 nm in einer 96-Vertiefungs-
Mikrotiterplatte nach der Zugabe von gleichen Volumina (2,33 mM) -Naphthylamin und
(6,33 mM) Sulfanilsäure zu einem 33 μl Probenansatz bei unterschiedlichen Zeitpunkten
bestimmt. Natriumnitrit wurde als Standard verwendet. Wenn erforderlich, wurde
Superoxiddismutase (SOD, Cu-Zn-SOD aus Rinder-Erythrozyten, Sigma) zugegeben. Bei
30 MATERIAL UND METHODEN
NADH-abhängigen Superoxid-Messungen wurde 1 mM NADH anstelle von NAD+ und 40 %
O2, 60 % N2 eingesetzt. Für Experimente zur Bestimmung reduzierter Sauerstoffspezies
wurden die Ansätze in 5,2 ml-Reaktionsgefäßen, die mit einem Gummideckel verschlossen
waren, mit 40 % O2 und 60% H2 für die wasserstoffabhängie NAD+-Reduktion bzw. mit
40 % O2 60 % N2 für die reverse Reaktion inkubiert.
Die Bildung von Wasserstoffperoxid wurde durch den Amplex RedTM Reaktionsansatz
(Sigma) quantifiziert. In Kombination mit Meerrettichperoxidase (HRP) reagiert die Amplex
RedTM Reagenz mit H2O2 zu dem fluoreszierenden Oxidationsprodukt Resorufin. Die
Reaktion wurde bei 30 °C in 600 μl 1 mM NAD+, 1 μM FMN, 40 % O2, 60 % H2 mit 20-
50 μg SH in 5,2 ml verschlossenen Röhrchen durchgeführt. Bei NADH-anhängigen H2O2
Messungen wurde 1 mM NADH anstelle von NAD+ und 40 % O2 60 % N2 eingesetzt. 50 μl
Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen, bei 80 °C für 2 min gestoppt und
anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Für die Wasserstoffperoxid-Quantifizierung
wurden 50 μl mit 1 μM Amplex RedTM und 2 mU/ml HRP in 50 mM TrisHCl pH 8,0
hinzugefügt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die Bildung von Resorufin durch
Fluoreszenz bei einer Anregung bei 571 nm und Emission bei 585 nm mit H2O2-Standards
bestimmt. NADH und FMN interferieren mit dem Amplex RedTM und HRP-System
(Votyakova und Reynolds 2004), daher wurde die Hintergrundfluoreszenz eines Ansatzes, der
alle Bestandteile mit Ausnahme des Enzyms beinhaltet, von den eigentlichen
Reaktionsansätzen subtrahiert. DTT und TCEP stören den H2O2-Test, daher wurde auf beide
Reduktionsmittel verzichtet.
Die H2O-Bildung wurde durch ein Quadrupol-Massenspektrometer (Pfeiffer OmniStarTM
GSD 301) in Kombination mit isotopisch markierten stabilen 18O2 detektiert. Die Reaktion
wurde bei 30 °C in 30 μl 1 mM NAD+, 1 μM FMN, 1 mM TCEP, 40 % 18O2, 60 % H2 mit 50-
1000 μg SH in 5,2 ml geschlossenen Reaktionsgefäßen inkubiert. Im Falle von NADH wurde
100 mM NADH statt NAD+ und 60 % N2 statt 60 % H2 eingesetzt. 10 μl Proben wurden zu
verschiedenen Zeitpunkten genommen, in einem verschlossenen 1,5 ml Gefäß mit einem
eisgekühlten Deckel für 20 min bei 100 °C inaktiviert, verdampft, und das sich im Deckel
befindende Kondenswasser wurde durch Zentrifugation in einem neuen Röhrchen bei
4000 x g für 1 min gesammelt. Dadurch wurde sichergestellt, dass die Kapillare des MS nicht
durch Salze, Chemikalien und Proteine im Reaktionsgemisch blockiert wird. 7 l der
kondensierten Probe wurde direkt auf der Öffnung der Kapillare aufgebracht, die auf 160 °C
erhitzt wurde. Eine Durchflussgeschwindigkeit von etwa 4 ml/min wurde eingestellt und m/z
MATERIAL UND METHODEN 31
von 2 (H2), 18 (H2160), 20 (H2
18O), 32 (16O2), 36 (18O2), 38 (H218O2), 44 (CO2) und deren
Fragmente wurden aufgezeichnet.
2.4.5 Kofaktor Quantifizierung
Die Quantifizierung des Metallgehaltes der Proteinproben wurde mit einem Totalreflektions-
Röntgenfluoreszenz (TXRF)-Spektrometer (Fa. Bruker PICOFOX) in Zusammenarbeit mit
Dr. Michael Haumann, Freie Universität Berlin, durchgeführt (Klockenkämper 1997). Die
8 μl Proben wurden mit 8 μl eines 10 mg/l Gallium-Standards (Sigma) gemischt und davon
wurden 5 μl-Aliquots auf Quarz-Probehalter aufgebracht, die für 20 min bei 50 °C getrocknet
wurden. Die Röntgenfluoreszenz wurde für 20 min gesammelt. Metallkonzentrationen in den
Proteinproben wurden mit Bezug auf den Gallium-Standard durch die eingebauten Routinen
des Spektrometers bestimmt. Alternativ dazu wurde der Metallgehalt durch optische
Emissionsspektrometrie mittels induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES) (Optima 2100 DV,
PerkinElmer Life Sciences) unter Verwendung einer Multi-Element Standardlösung XVI
(Merck) als Referenz in Kooperation mit Silke Leimkühler, Universität Potsdam,
quantifiziert. Die Flavinmononukleotid-Konzentrationen wurden fluorimetrisch nach einer für
96-Vertiefungs-Mikrotiterplatten modifizierten Methode (Schneider und Schlegel 1978) mit
einem Spektrofluorometer (Spectramax Spektrofluorometer M4) analysiert. Die Enzymprobe
wurde bei 4 °C mit gleichen Volumen von eiskalter 20 % Trichloressigsäure gemischt. Nach
15 min wurde die Probe bei 5000 rpm für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde sofort mit
demselben Volumen von 4 M K2H(PO)4 neutralisiert. Die Freisetzung von FMN wurde durch
seine Fluoreszenz bei einer Anregung bei 460 nm und Emission bei 526 nm mit bekannten
FMN Konzentrationen (73-79 % fluorometrischer Grad, Sigma) bestimmt und anschließend
mit reinen FMN-Standards (95 %, Sigma) normiert.
2.4.6 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen mittels SDS PAGE
Die Proteine wurden per diskontinuierlicher SDS-PAGE („Sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis“) unter denaturierenden Bedingungen nach (Laemmli
1970) aufgetrennt. Die Acrylamidkonzentration betrug für die Sammelgele 4 % und für die
Trenngele 12 %. Minigele (10 x 8 x 0,1 cm) in der Vertikalgelkammer MTV-1 der Firma Cti
(Idstein, Germany) wurden verwendet. Vor dem Beladen der Gele wurden die Proteinproben
mit 6-fach konzentrierten Probenpuffern (0,5 M Tris/HCl, pH 6,8, 33 % (v/v) Glycerin, 0,6 M
DTT, 10 % (w/v) SDS, 0,1 % (w/v) Bromphenolblau) versetzt und für 5 min bei 100 °C
denaturiert. Die Auftrennung erfolgte bei 35 mA (Netzgerät ECPS 3000/150, Pharmacia) im
Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % (w/v) SDS). Als Molekulargewichtsstandard
32 MATERIAL UND METHODEN
wurde der "Precision Plus Protein Dual Color Standard" (10-250 kDa; BIO-RAD, USA)
eingesetzt.
Die Visualisierung von Proteinbanden im Polyacrylamidgel erfolgte nach einem modifizierten
Protokoll von Wilson (Wilson 1983). Hierzu wurden die Gele für 30 min in einer Färbelösung
(425 ml 96 % (w/v) Ethanol, 100 ml Essigsäure, 50 ml Methanol, 42 ml H2O, 2,0 g
Coomassie Brilliant Blue R-250 und 0,5 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (SERVA,
Germany)) geschwenkt und anschließend mit Entfärbelösung (250 ml Methanol, 50 ml
Eisessig; ad 1000 ml dd H2O) für mindestens 16 h unter kontinuierlichem Schwenken
inkubiert, so dass Proteine als blaue Banden sichtbar wurden.
2.4.7 Immunologische Detektion der Proteine
Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE wurden diese im
Semi-Dry-Blotverfahren (PEQLAB PerfectBlueTM SemiDry Electroblotter SedecTM) auf
eine Nitrocellulosemembran (BioTrace NT, Pall, USA) übertragen (Towbin et al. 1979). Nach
dem Proteintransfer wurde die Blotmembran für mindestens 30 min in Blockpuffer (3% Skim
Milk Powder; Fluka, Germany in TBST-Puffer mit 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl,
0,05% v/v Tween 20) geschwenkt und anschließend mit primären Antikörper gegen entweder
HoxF, HoxU, HoxH, HoxY, HoxG oder HoxC (Verdünnung 1:500-1:10000 in TBST-Puffer)
für 1 h inkubiert. Danach wurde drei Mal für 5 min mit TBST-Puffer gewaschen und eine 1 h
Inkubation mit sekundären Antikörpern (Ziege anti-Kaninchen IgG-Alkalische Phosphatase
Konjugat, Dianova, Germany, Verdünnung 1:20000 in TBST-Puffer) erfolgte. Anschließend
wurde die Membran zweimal in TBST-Puffer und einmal in Entwicklungspuffer (100 mM
Tris/HCl, pH9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) für jeweils 5 min gewaschen. Für die
Farbreaktion wurde die Membran in Entwicklungspuffer mit 50 μg/ml BCIP (5-Brom-4-
chlor-3-indolylphosphat Roth, Germany) und 100μg/ml NBT (p-Nitroblautetrazoliumchlorid
AppliChem, Germany) inkubiert. Die alkalische Phosphatase-abhängige Farbreaktion wurde
durch Waschen mit H2O gestoppt.
2.4.8 Aufnahme von UV Vis Absorptionsspektren
Die Aufnahme von UV-Vis-Spektren erfolgte im Zweistrahl-UV-Vis-Spektrometer (Cary
5000 von Varian™, Palo Alto, USA). Die Messung wurde in 100- l-Quarzküvetten (Varian)
bei 16 °C und einer Scangeschwindigkeit von 600 nm pro min im Wellenlängenbereich von
200-800 nm durchgeführt. Als Referenz diente der jeweilige Lagerungspuffer. Für Messungen
des Spektrums einer oxidierten Probe wurden 110 l der Probe direkt nach der Reinigung
eingesetzt. Zur Reduktion wurde die gleiche Probe mit einem Gummiseptum luftdicht
MATERIAL UND METHODEN 33
verschlossen, zum Anaerobisieren für 15 min mit Wasserdampf gesättigtem Argon gespült
und anschließend mit Dithionit reduziert.
2.4.9 Fourier Transform Infrarot(FTIR ) Spektroskopie und Fit Prozedur
Die FTIR-Spektren wurden in Zusammenarbeit mit Marius Horch, Philip Hummel und Dr.
Ingo Zebger am Max-Volmer-Labor für Biophysikalische Chemie an der Technischen
Universität Berlin mit einem Tensor 27- oder einem IFS28-Spektrometer der Firma Bruker
(Deutschland) aufgenommen. Dies geschah mit in flüssigem Stickstoff gekühlten Mercury-
Cadmium-Tellurid (MCT)-Detektoren und einer spektralen Auflösung von 2 cm-1. Der
Probenraum wurde dabei mit getrockneter Druckluft oder Stickstoff gespült und die zu
untersuchende Probe (100–200 M Protein) wurde in einer gasdichten,
temperaturkontrollierten IR-Flüssigkeitszelle mit CaF2-Fenstern bei 10 °C gemessen
(Zellvolumen ~ 7 l, optische Weglänge = 50 m). Für ein Spektrum erfolgte die Addition
von 200 Scans. Um das Signal/Rausch-Verhältnis zu verbessern, wurden bis zu 30 Spektren
gemittelt. Die Spektren wurden mit der OPUS 5.5 Software unter Verwendung einer Spline-
Funktion Basislinien-korrigiert. Reduzierte SH-Proben wurden bei Raumtemperatur durch 30-
minütige Inkubation mit 5-10 mM NADH in einer mit Stickstoff gefüllten anaeroben Box
präpariert. Mit Wasserstoff reduzierte Proben wurden in einem mit Formiergas (95-97 % N2,
3-5 % H2) gefüllten Anaerobenzelt nach Inkubation mit 1 mM NADH und 1 bar H2
hergestellt. Reduziertes HoxHY-Modul wurde bei Raumtemperatur 30 min mit 1 bar H2 und
2-5 mM FMN in dem zuvor genannten Anaerobzelt inkubiert. Die reduktive Aktivierung
durch chemische Mittel wurde durch Inkubation mit 7,7 mM DT, 5 mM MV erreicht.
Für die in situ-Spektroskopie wurden resuspendierte Zellen mit einer OD436 von ca. 2000
eingesetzt. Für die SH-Oxidation wurden die Zellen durch Inkubation mit 33 mg ml-1 CTAB
permeabilisiert (Friedrich et al. 1981). Oxidation fand entweder anaerob durch Zugabe von
5 mM NAD+ oder durch Luftsauerstoff statt. Alternativ wurde die Oxidation der Zellen durch
drei Gefrier-Auftau-Zyklen unter Luftatmosphäre durchgeführt. Reduzierte SH wurde bei
Raumtemperatur durch Inkubieren ganzer Zellen mit 1 bar H2 für 30 min in dem oben
beschriebenen Anaerobzelt hergestellt.
2.4.10 EPR Spektroskopie
Die 9,5 GHz X-Band Spektren von SH-Derivaten (100 μl 50-100 M) wurden von Dr.
Miguel Saggu am Max-Volmer-Labor für Biophysikalische Chemie an der Technischen
Universität Berlin an einem EPR-Spektrometer des Typs Bruker ESP300E Spektrometer mit
einem rechteckigen Mikrowellenhohlraumresonator (Bruker, Deutschland) im TE102-Modus
34 MATERIAL UND METHODEN
durchgeführt. Für Tieftemperaturmessungen 10-100 K wurde die Probe in einem Oxford
ESR-900-Helium-Durchflusskryostaten (Oxford ITC4, Oxford Instruments, UK) gekühlt. Die
durch standardmäßige CW-(continuous wave) EPR-Spektroskopie aufgenommenen
Absorptionsspektren wurden meist als erste Ableitung aufgezeichnet und dargestellt. Die
Basislinienkorrektur erfolgte durch Abzug eines Hintergrundspektrums, welches mit der
entsprechenden Pufferlösung aufgenommen wurde. Zur Spin-Quantifizierung wurde das
doppelt integrierte Signal mit dem Signal eines Cu(SO4)-Standard bekannter Konzentration
verglichen. Die SH-Proben wurden analog wie im vorigen Kapitel beschrieben präpariert, in
EPR-Röhrchen mit einem inneren Durchmesser von 3 mm überführt, in flüssigem N2
schockgefroren und gelagert.
2.4.11 Röntgenabsorptionsspektroskopie
Die röntgenabsorptionsspektroskopischen (X-ray absorption spectroscopy, XAS) Messungen
der SH-Derivate wurden von Dr. Michael Haumnann von der Freien Universität Berlin an der
Beamline KMC-1 am BESSY (Berlin, Deutschland) durchgeführt. Die K Fluoreszenz-
detektierte XAS-Spektren wurden an der Fe-Kante unter Verwendung eines Doppel-Kristall
(Si111) Monochromators mit einem mit flüssigem Helium auf 20 K gekühlten Probenhalter
(Oxford) und einem 13-Element Ge-Detektor (Canberra) gesammelt.
Die XAS-Spektren (6-10 Scans) wurden nach Energie-Kalibrierung der einzelnen Scans mit
dem ersten Flexionspunktes bei 7112 eV im Absorptionsspektrum einer Eisen-Folie als
Energie-Standard gemittelt. Die Normalisierung der Spektren und Extraktion der EXAFS-
Oszillationen wurde - wie zuvor beschrieben - durchgeführt (Dau et al. 2003). Die
Energieskala von EXAFS-Spektren wurde zur Wellenvektor (k)-Skala mit einem Wert von E0
7112°eV umgewandelt. Ungefilterte k3-gewichtete Spektren wurden für Kurvenanpassung
nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate verwendet und die Fouriertransformationen
mit dem Programm SimX auf der Basis der berechneten Phasenfunktionen durch FEFF8.4
(Zabinsky et al. 1995) und einer Amplitudenreduktionsfaktor (S02) von 0,9 durchgeführt (Dau
et al. 2003).
2.4.12 Elektrochemie
Elektrochemische Experimente wurden in Zusammenarbeit mit Juan Liu, Zul Idris und Dr.
Kylie Vincent von der Oxford Universität durchgeführt. Die Experimente fanden in einer N2
gefüllten anaeroben Box (O2 <1 ppm; M. Braun, Deutschland) in einer elektrochemischen
Messzelle (4 ml) mit einem Wassermantel für die Temperaturkontrolle statt, der durch einen
O-Ring zu einem Elektrodenrotor abgedichtet wurde. Die Messzelle war mit einem
Gaseingang und -ausgang versehen, um einen Austausch von Gasen mit dem Kopfraum zu
MATERIAL UND METHODEN 35
gewährleisten und enthielt zudem ein Septum für Injektionen. Gasmischungen wurden durch
einen Durchflusskontroller (Brooks SLA Series mit Digibox Lite) eingestellt. Eine
pyrolytische Graphit ‘edge’ (PGE) rotierende Scheibenelektrode (Fläche 0,03 cm2) wurde mit
einem Elektrodenrotor (EG&G 636) eingesetzt. Potentiale wurden durch einen Autolab128N
oder 302N Potentiostaten eingestellt (EcoChemie, Niederlande). Die Gegenelektrode war eine
Platinelektrode. Eine Ag/AgCl (3 mM NaCl)-Elektrode wurde für die Hydrogenase-Modul-
Experimente als Referenz eingesetzt. Potentiale, die mit Hilfe der Ag/AgCl-Elektrode
aufgenommen wurden, wurden mit Hilfe der folgenden Formel auf die
Standardwasserstoffelektrode (SHE) bezogen:
E(SHE) = E(Ag/AgCl; 3 m NaCl) + 0,201 V bei 30 °C oder + 0,216 V bei 10 °C.
Für das Diaphorase-Modul wurde eine kalometrische Elektrode (Quecksilber/Quecksilber(I)-
chlorid, SCE) eingesetzt und zu V vs. SHE mit der folgenden Formel umgewandelt:
E(SHE)=E(SCE)+242 mV bei 25 °C (+238 mV bei 30 °C). Um einen Proteinfilm zu
präparieren, wurde die PGE für 30 s mit einer wässrigen -Aluminiumoxid-Suspension
(1 m, Buehler, Germany) poliert, mit H2O gewaschen und für 10 s mit Ultraschall behandelt.
Anschließend wurde 0,5 μl Enzym (0,4-1 mg/ml) auf die Elektrode pipetiert und für 30 s
inkubiert, bevor überflüssige Enzymlösung entfernt, die PGE mit enzymfreiem Puffer
abgespült und in die elektrochemische Zelle eingesetzt wurde. Die Elektrode wurde mit 2000
bis 2500 rpm rotiert, um eine optimale Versorgung an Substrat und eine optimale Entsorgung
an Produkt zu gewährleisten. Alle Diaphorase-Modul-Experimente wurden in 50 mM Tris-
HCl pH 8,0 Puffer durchgeführt. Für das Hydrogenase-Modul ist der betreffende Puffer im
Ergebnisteil angegeben. Für elektrochemische KM- und Ki-Wert-Bestimmungen wurde
NADH (Melford) und NAD+ (Sigma oder Melford) durch eine Ionenaustauscher-
Chromatographie mit einer Q HyperD F Säule (Pall Corporation) weiter gereinigt und
Konzentrationen der Eluatfraktionen durch Vergleich bei Absorption bei 340 nm und 260 nm
mit Standards bestimmt. Aliquots von NAD+ und NADH wurden von Stammlösungen in die
Messzelle hinzugegeben. Ein Film aus "totem" HoxHY wurde für die Brücksichtigung des
kapazitiven Beitrags der Proteinbeladung der Elektrode hergestellt, indem der Proteinfilm bei
0,5 V oxidativ geschädigt wurde.
2.4.13 Kristallisationansätze
Kristallisationsansätze zur Strukturaufklärung erfolgten in Zusammenarbeit mit Dr. Hideaki
Ogata vom Max Planck Institut für Bioanorganische Chemie, Mülheim an der Ruhr, mit
frischen SH-Präparationen (ohne Einfrieren) in 96-Vertiefungs-MRC-Platten (Jena
Bioscience) mittels der sitting-drop-Methode. Das Reservoir wurde mit 90 μl des jeweiligen
36 MATERIAL UND METHODEN
Puffers versetzt, jeweils 0,3 μl des Puffers wurden in den Vertiefungen vorgelegt.
Anschließend wurde die Protein-Lösung (0,3 μl, 5-100 mg ml-1) in die Vertiefungen gegeben,
und die Vertiefungen wurden mit einer klaren, gasdichten Folie (Jena Bioscience,
Deutschland) verschlossen. Verschiedene kommerzielle Kristallisation-Reihenuntersuchungen
wurden eingesetzt (Jena Bioscience, Deutschland). Die Platten wurden bei 4 °C inkubiert und
mikroskopisch über einen Zeitraum von etwa drei Wochen überprüft.
2.5 DNA-Grundtechniken
2.5.1 Behandlung von Geräten und Lösungen
Hitzebeständige Geräte und Lösungen wurden durch Autoklavieren (121 °C bei gesättigtem
Wasserdampf für 20 min) sterilisiert sowie von DNase-Aktivität befreit und anschließend für
2 bis 3 Tage bei 70 °C getrocknet. Glasgefäße wurden z. T. bei trockener Hitze (180 °C für
6 h) sterilisiert. Hitzelabile Lösungen wurden gegebenenfalls sterilfiltriert (Porendurchmesser
0,2 m).
2.5.2 Konzentrationsbestimmung der DNA bzw. RNA
Die Konzentrationsbestimmung von DNA erfolgte durch Messung in einem
Spektrophotometer (Nanodrop) bei 260 nm. Zur Feststellung des Reinheitsgrades wurde
außerdem die Absorption bei 280 nm bestimmt. Das Verhältnis A260/A280 liegt für reine
DNA um 1,8 (Sambrook und Russell 2006).
2.5.3 Restriktionsverdau von DNA
Der Restriktionsverdau von DNA erfolgte nach Herstellerangaben (New England Biolabs) in
50 l Reaktionsansätzen.
2.5.4 Dephosphorylierung von DNA
Um intra- und intermolekulare Ligation der geschnittenen Vektorfragmente im
Ligationsansatz zu verhindern, wurden die 5´Enden mit alkalischer Phosphatase (CIP, calf
intestinal - phosphatase, New England Biolabs) nach Herstellerangaben dephosphoryliert.
2.5.5 Ligation von DNA Fragmenten
Die Ligation von DNA-Fragmenten erfolgte mit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs,
USA) unter den von der Bezugsfirma vorgegebenen Bedingungen. Bei Ligation von
überhängenden Enden wurde Insert und Vektor im Verhältnis 3:1 eingesetzt und der
Ligationsansatz für 2 - 12 h bei 16 °C inkubiert. Bei glatten Enden wurde der Ligationsansatz
für 8-2 h bei RT inkubiert.
MATERIAL UND METHODEN 37
2.6 DNA-Isolierung
Zur Reinigung nach Modifikation der DNA wurde der Reaktionsansatz nach dem Spin
PCRapace Kit (Invitek, Berlin) gereinigt und in 10 mM TrisHCl pH 8,0 eluiert.
2.7 Plasmidisolation
Für Plasmidisolationen aus E. coli wurden 1,5 ml einer Übernacht-Kultur in einem
Reaktionsgefäß geerntet und der Überstand verworfen (modifiziert nach (Birnboim und Doly
1979). Das Pellet wurde in 100 l Lösung I (25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0,
100 mg/ml RNase) resuspendiert. Die alkalische Lysis erfolgte durch Zugabe von 200 l
Lösung II (0,2 N NaOH, 1 % (w/v) SDS). Durch Zugabe von 200 l Lösung III (3 M K-
Acetat, pH 4,8) wurden die Lösung neutralisiert und Proteine präzipitiert. Nach einer
Zentrifugation (15000 × g, 3 min) wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt
und die DNA nach Zugabe von 1000 l eiskaltem, absolutem Ethanol abzentrifugiert
(15000 × g, 7 min). Das nach Waschen mit 70 % (w/v) Ethanol erhaltene Pellet wurde im
Vakuum getrocknet und anschließend in 50 l 1 mM TrisHCl pH 8,0 gelöst.
Zur Isolierung von hochreiner Plasmid-DNA aus E. coli über Anionenaustauscher-Säulen
wurde das Invisorb Spin Plasmid Mini Two (250) Kit (Invitek GmbH, Berlin) verwendet. Die
Aufarbeitung erfolgte nach Vorgaben des Herstellers. Zur Isolierung einer großen Menge an
reinem Plasmidmaterial, besonders von Plasmiden mit geringer Kopienzahl, wie z. B.
pEDY309, wurde das „Qiagen Tip 100 Kit“ benutzt und es wurde nach Handbuch verfahren.
2.8 Elektrophoretische Auftrennung der DNA in Agarosegelen
Die elektrophoretische Trennung von Nukleinsäure-Fragmenten erfolgte in horizontalen
Gelkammern (100 x 70 x 2,5 mm Werkstätten der FU und HU Berlin). Die Gele wurden mit
0,5 % bis 2 % w/v hochschmelzender Agarose (Invitrogen) in Tris-Phosphat-EDTA-Puffer
(TPE-Puffer: 80 mM Tris, 8 mM EDTA; pH 7,6 mit 85 % w/v Phosphorsäure eingestellt)
angesetzt. Die Elektrophorese erfolgte in TPE-Puffer bei einer Spannung von 90 V. Vor dem
Auftragen auf das Gel wurden die Proben mit 0,2 Volumenanteilen Farbstoff-Schwerelösung
(33 % v/v Glycerin in TPE-Puffer, 0,07 % w/v Bromphenolblau) versetzt. Zur Detektion der
DNA-Banden für analytische Zwecke wurden die Gele in einer Ethidiumbromid-Lösung
(2 g/ml) inkubiert. Die Sichtbarmachung der markierten DNA erfolgte mittels eines UV-
Transilluminators bei 254 nm. Zur Größenbestimmung von DNA-Fragmenten im Agarosegel
wurde 2-Log DNA Leiter (0,1–10,0 kb; New England Biolabs, USA) eingesetzt. Für
präparative Zwecke erhielten die Agarosegele zusätzlich Gel-Red (Biotium), so dass auf eine
38 MATERIAL UND METHODEN
Nachfärbung verzichtet werden konnte. Anregung der markierten DNA fand bei 280 nm statt
und die Emission wurde bei 600 nm verfolgt.
2.9 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Zur Gewinnung der DNA aus präparativen Agarosegelen wurde das "QIAEX II Gel
Extraction Kit" (Qiagen, Germany) verwendet und es wurde nach Handbuch verfahren.
2.10 Herstellung kompetenter Zellen
Für Transformationen von Plasmid-DNA in die E. coli-Stämme D10 und S17-1 wurden
diese durch das folgende Verfahren in einen kompetenten Zustand gebracht: 100 ml eines
vorgewärmten LB-Mediums (37 °C) wurden mit 1 ml einer Übernachtkultur beimpft und für
2-3 h bei 37 °C auf dem Rotationsschüttler bis zu einer OD600 von 0,5-0,8 inkubiert. Die
Zellen wurden mit 4000 rpm bei 4 °C geerntet, das Zellpellet in 30 ml eiskaltem TFB1-Puffer
(100 mM RbCl, 50 mM MnCl2, 30 mM Na-Acetat, 10 mM CaCl2, 15 % (v/v) Glycerin,
pH 5,8 sterilfiltriert) resuspendiert und 90 min auf Eis gestellt. Anschließend wurden die
Zellen erneut abzentrifugiert und in 4 ml eiskaltem TFBII-Puffer (10 mM MOPS, 10 mM
RbCl, 75 mM CaCl2, 15 % w/v Glycerin; pH 6,8 mit KOH eingestellt, sterilfiltriert)
resuspendiert. Die nunmehr chemisch-kompetenten Zellen wurden in 100 l Aliquots in
vorgekühlte 2 ml-Eppendorfgefäße überführt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
2.11 Transformation
Zur DNA-Übertragung wurden die gefrorenen kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut, mit 7 l
des Ligationsansatzes oder mit 1 l der Plasmidpräparation versetzt, vorsichtig gemischt und
30 min auf Eis gestellt. Darauf folgte ein Hitzeschock bei 42 °C für 30 Sekunden, woraufhin
die Zellen wieder 2 min auf Eis gestellt wurden. Anschließend wurden 0,9 ml LB-PSI-
Medium (LB Medium, 4 mM MgSO4, 10 mM KCl) zugegeben und die Zellen 60 min bei
37 °C auf einem Rotationsschüttler (450 rpm) inkubiert. Anschließend wurden 0,05-0,9 ml
der transformierten Zellen auf geeignetem Selektivmedium ausplattiert.
2.12 Konjugation
Durch konjugativen Transfer mobilisierbare Plasmide wurden mit Hilfe von dem
Donatorstamm E. coli S17-1, der die tra-Gene des Plasmids RP4 auf dem Chromosom
enthält, in die Rezipienten R. eutropha oder P. putida durch „Spotmating" übertragen
(Friedrich et al., 1981). Donor und Rezipient wurden über Nacht in jeweils 10 ml LB-
(E. coli, P. putida) bzw. NB-Medium (R. eutropha) mit entsprechendem Antibiotikum
angezogen. Die über Zentrifugation (10 min. 4000 rpm, RT) gewonnenen Zellpellets wurden
in jeweils 5 ml sterilem H16-Puffer (25 mM Na2PO4, 11 mM KH2PO4; pH 7,0) gewaschen
MATERIAL UND METHODEN 39
und nach erneuter Zentrifugation in je 1 ml H16-Puffer aufgenommen. Je 0,2 ml dieser
Zellsuspensionen wurden auf einer NB-Platte zusammen ausplattiert und 4 bis 12 h bei 37 °C
inkubiert. Anschließend wurde Zellmaterial mit einer sterilen Pipettenspitze abgenommen und
in 5 ml H16-Puffer resuspendiert. Schließlich wurden geeignete Verdünnungsstufen (10-0 bis
10-5) auf FN-Platten mit den entsprechenden Antibiotika ausplattiert und etwa 48 h bei 37 °C
inkubiert. Für den Allelaustausch durch doppelte homologe Rekombination wurde der Vektor
pLO1 (Lenz et al. 1994) verwendet. Dieser Vektor basiert auf dem ColE1-Replikon und trägt
neben dem neo-Gen für eine Kanamycinresistenz auch das sacB-Gen aus Bacillus subtilis, das
für eine Laevan-Saccharase codiert, welches bei Vorhandensein von Saccharose im Medium
zur Synthese und Anhäufung von Laevan im Periplasma gramnegativer Bakterien und
letztendlich zur Lysis der Zellen führt (Gay et al. 1985). Der pLO1-Vektor ist von E. coli
S17-1 nach R. eutropha mobilisierbar (mob+), kann aber nur nach der Integration in das
Genom des Rezipienten stabil replizieren. Aus einer Konjugation hervorgegangene
R. eutropha-Rekombinanten mit integrierten Suizidplasmiden wurden auf Kanamycin
haltigen FN-Platten selektiert. Aus den resistenten Isolaten wurden über Reinigungsausstrich
gewonnene Einzelkolonien in 10 ml NB-Medium ohne Antibiotikum bei 30 °C über Nacht
inkubiert. Nach der Ernte der Kulturen und einem Waschschritt mit 5 ml H16-Puffer wurden
die Zellen in geeigneten Verdünnungsstufen (100 bis 10-4) auf Selektiv-Medium (LB mit 15 %
(w/v) Saccharose) ausplattiert. Stämme mit weiterhin präsentem sacB-Gen können unter
diesen Bedingungen kein Wachstum zeigen. Wachsende, Saccharose resistente
Rekombinanten hingegen, welche den konditional letalen Plasmidteil durch die zweite
Rekombination wieder verloren hatten, wurden auf FN-Agarplatten erneut ausgestrichen und
homogenote Rekombinanten wurden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bestätigt
(Kapitel 2.14).
2.13 Sequenzierung
Die Sequenzierung PCR-generierter Konstrukte erfolgte nach der Kettenabbruchmethode
nach Sanger et al. (Sanger et al. 1977) und wurde durch das molekularbiologische Labor von
Dr. Martin Meixner, Services in Molecular Biology (Berlin, Germany) durchgeführt. Die
Analyse von Sequenzdaten erfolgte unter Nutzung der Software FinchTV
(http://www.geospiza.com/Products/finchtv.shtml).
2.14 Polymerase-Kettenreaktion
Zur in vitro Amplifikation doppelsträngiger DNA-Fragmente (Mullis und Faloona 1987) für
analytische (Kontrolle von Rekombinanten) als auch für präparative Zwecke (in-vitro-
40 MATERIAL UND METHODEN
Amplifizierung von DNA-Fragmenten) wurde ein DNA Thermal Cycler PTC 255 (MJ
Research, USA) eingesetzt. Nach dem initialen Aufschmelzen der DNA für 1-5 min bei 94-
96 °C wurden 25 bis 30 Zyklen der anschließenden aufeinanderfolgenden Schritte wiederholt:
1 min, 96 °C zur Trennung des DNA-Doppelstrangs; 1 min 50-65 °C zur Anlagerung der
Primer. Die genaue "Annealing"-Temperatur orientierte sich an der Schmelztemperatur
eingesetzter Primer und wurde mit dem Programm Vector NTI berechnet (life technologies).
Anschließend wurde für 0,5-1 min pro kbp das zu amplifizierende Fragment bei 68-72 °C
inkubiert (je nach eingesetzter Polymerase). Abschließend nach en 25-30 Zyklen wurde zum
Auffüllen unvollständiger Amplifikate die DNA für 5 min bei 68-72 °C inkubiert. Die
genauen Bedingungen und der Reaktionsansatz folgte den Herstellerangaben der eingesetzten
Polymerasen (Taq-Polymerase, Invitrogen; Phusion, Long Amp Polymerase, NEB, PfuUltra
Stratagene). Für Klonierungen wurde Phusion oder PfuUltra DNA-Polymerase mit 3' 5'
Korrekturfunktion und somit geringerer Mutationshäufigkeit eingesetzt. Für analytische
Einsätze wurde eine Kolonie-PCR mit Zellmaterial als Template durchgeführt. Mit einer
sterilen Pipettenspitze wurde dafür eine sehr geringe Menge Zellmaterial direkt von einer
Bakterienkolonie auf einer Agarplatte entnommen und direkt in den PCR-Ansatz überführt.
Der initiale Schritt der PCR wurde auf 5 min bei 96 °C verlängert, um ein vollständiges
Aufbrechen der Bakterienzellen zu gewährleisten. Zur Analyse wurden 2- l-Aliquots der
PCR-Ansätze mittels Agarose-Gelelektrophorese getrennt.
2.15 Gentechnische Konstruktionen
Für gentechnische Konstruktionen wurde E. coli D10 eingesetzt. Alle PCR-generierten
Konstrukte wurden sequenziert. Die verwendeten Vektoren und Stämme sind in Tabelle 1
aufgelistet.
2.15.1 SH Expressionsplasmide
Das Expressionsplasmid für die Affinitätsreinigung der SH aus R. eutropha wurde wie folgt
konstruiert: Das verwendete Plasmid pGE770 enthielt hoxF mit einer N-terminalen Strep-tag
II codierenden Sequenz und die hoxFUYWIhypA2B2F2CDEXhoxABCJ-Gene unter Kontrolle
des nativen SH-Promotors. Die Deletion der RH-Gene, hoxBCJ, wurde durch Transferieren
des 14,9 kb-HindIII-Fragmentes aus pGE770 in das gleich geschnittene pCH1597 erreicht.
Das Plasmid pCH1597 beinhaltete ein 1,6 kb SpeI/EcoRI-Fragment aus pCH646 in dem
gleichermaßen verdauten Litmus28. Schließlich wurde ein 16,5 kb -SpeI/XbaI-Fragment aus
dem resultierenden Plasmid pCH1595 in den 21,2 kb gleich verdaute pEDY309-Vektor ligiert
und ergab pGE760.
MATERIAL UND METHODEN 41
Ein SH-Expressionsplasmid mit einem N-terminalen Strep-tag II an HoxY wurde unter
Verwendung des Plasmids pG785 mit den hoxFUYWIhypA2B2F2CDEXhoxABCJ-Genen als
Basis gebaut. Die Deletion der RH-Gene, hoxBCJ, wurde durch Transferieren des 14,8 kb-
HindIII-Fragmentes aus pCH1612 in das gleich geschnittene pCH1597 erreicht. Schließlich
wurde ein 16,5 kb-SpeI/XbaI-Fragment aus dem resultierenden Plasmid pCH1617 in den
gleichermaßen verdauten pEDY309-Vektor (21,2 kb-Fragment) ligiert. Dies ergab pGE785.
Das 14,9 kb-HindIII-Fragment aus HF782, das HoxY mit einem N-terminalen Strep-tag II
codiert, wurde in das gleich geschnittene 22,8 kb-Fragment aus pJH3001inseriert, woraus sich
pGE750 ergab. Eine Übersicht der verwendeten SH-Produktionsplasmide ist in Abbildung 5
dargestellt.
Um das HoxHI64A-Derivat (Burgdorf et al. 2002) mit einem analogen Strep-tag II
auszustatten, wurde das 5,27 kb-FseI-PspOMI-Fragment aus pGE475, das den HoxHI64A-
Austausch codiert, in das gleich geschnittene 13 kb-Fragment aus pCH1596 transferiert, was
pCH1580 ergab. Anschließend wurde das 16,5 kb-SpeI/XbaI-Fragment aus pCH1580 in den
XbaI-geschnittenen Vektor pEDY309 übertragen. Dies resultierte in pGE749. Die Plasmide
pGE760, pGE750 und pGE749 wurden durch Konjugation in HF210 transferiert.
Abb. 5: Übersicht der genetischen SH-Konstrukte für die Produktion verschiedener SH-Derivate. Ein rotes X stellt die deletierten Untereinheiten dar.
Für die SH-Synthese in P. putida wurden die SH-codierenden Gene unter den PalkB-Promoter
gestellt. Das XhoI/HindIII geschnittene PCR-Produkt aus pSPZ10 wurde in das ebenso
verdaute 3,8 kb-Fragment aus pCH1613 ligiert, das aus der Religation des 4,1 kb-EcoRI
geschnittenen pTBu1058-Vektors stammte. Dies ergab pCH1614. Das resultierende 1,8 kb-
U Y H W IhypA2
hoxAB2 F2 C ED X
hoxFStrep
Strep
Strep XX
pGE760
pGE750
pLL1
pGE553
pHD
PSH
PSH
PalkB
PSH
PSH
B C J
Strep
SHStrep HoxY
SH-Produktion in P. putida
Diaphorase-Modul
Hydrogenase-Modul
SHStrep HoxF
42 MATERIAL UND METHODEN
EcoRV/HindIII-Fragment wurde mit dem ebenso geschnittenen 4,46 kb-Fragment aus
pTBU1085 ligiert, was pJH3180 ergab. Das 3,4 kb-BamHI/HindIII-Fragment wurde mit dem
ebenso geschnittenen 2,8 kb-Litmus28-Fragment ligiert, woraus das Plasmid pJH3203
entstand. Das 12,5 kb XbaI/SapI-Fragment aus pGE770 in Litmus28 wurde mit dem 3 kb-
XbaI/SapI-Fragment von pJH3203 hoxF ligiert, was pCH1616 ergab. Das 15,5 kb-Fragment
aus pCH1616 wurde anschließend in den ebenso geschnittenen Vektor pEDY309 inseriert,
was in Plasmid pLL1 resultierte. Durch Konjugation wurde pLL1 in P. putida transferiert.
2.15.2 Ortsspezifische Mutagenese
Der Austausch von Aminosäuren der NAD+-Bindetasche in HoxF wurde durch ortsgerichtete
Mutagenese nach dem QuikChange® II XL Site-Directed MutagenesisKit (Agilent, USA)
durchgeführt, wobei mutagene Primer mit dem Online Programm des Herstellers
erstellt ,wurden (http://www.genomics.agilent.com).
Für den D340A-Austausch in HoxF (SHD340A) wurde das Primerpaar 1/2 verwendet, für den
SHE341A -Austausch das Primerpaar 3/4, für SHD401K das Primerpaar 7/8, SHD467S das
Primerpaar 9/10 und für SHD340A E341A das Primerpaar 11/12. Tabelle 2 gibt eine Übersicht
über die verwendeten Primer. Als Ursprungsplasmid wurde pCH1582 verwendet, das das
2,0 kb-XbaI-PspMOI-Fragment aus pGE750 mit hoxF einschließlich dem SH-Promoter auf
der Basis von pBluescriptII KS+ enthält. Für die Doppelsubstitutionen SHD340A D401K und SH
D400K D467S wurde pCH1575 als Basis, und für SHE341A D467S wurde pCH1576 verwendet. Das
2,2 kb-XbaI-PspMOI-Fragment aus den resultierenden mutagenisierten Plasmiden wurde in
das ebenso geschnittene 16 kb-Fragment aus pCH1581 ligiert, welches das 16 kb-XbaI-SpeI-
Fragment mit den hoxFUYHWIhypA2B2F2CDEXA-Genen und einer den N-terminalen Strep-
tag II codierenden Sequenz am 5`-Ende von hoxY auf Litmus28-Basis beinhaltete.
Anschließend wurde das 16 kb-XbaI-SpeI-Fragment aus den hervorgehenden Plasmiden in
den 21 kb-XbaI-geschnittenen pEDY309-Vektor oder im Falle von SHD340A, SHE341A und
SHD340A E341A in pCM62 inseriert. Die so entstandenen Plasmide mit breitem Wirtsspektrum
wurden daraufhin über Konjugation in den megaplasmidfreien R. eutropha-Stamm HF210
transferiert. Eine detaillierte Übersicht der resultierenden Plasmide und Stämme ist in Tabelle
1 zu finden.
2.15.3 Genomische Deletionen
Für die Konstruktion von HF798 ( hoxG hoxC) wurde die SH-Synthese in HF500 ( hoxH
hoxG hoxC (Kleihues et al. 2000)) durch die Einführung des Wildtyp-Allels hoxH
( pCH1500) in das Genom über Rekombination wiederhergestellt. Das hoxH-kodierende
Plasmid pCH1500 wurde wie folgt hergestellt: ein 1,9 kb hoxH-enthaltendes Ecl136II-
MATERIAL UND METHODEN 43
Fragment aus dem Plasmid pCH472 (Massanz et al. 1997) wurde in den PmeI-geschnittenen
pLO1-Vektor inseriert. Die zu HF798 analoge hypX-Deletionsmutante, HF799, wurde durch
Deletion von hoxC durch Rekombination von pCH644 (Lenz und Friedrich 1998) in HF480
( hoxG hypX (Bleijlevens et al. 2004)) konstruiert. Für Komplementationsexperimente
wurde hoxFU in R. eutropha HF798 unter Verwendung des konditional letalen Plasmids
pCH1462 (Schwarze et al.2011) in-frame deletiert, was zu HF903 führte.
2.16 Chemikalien und Enzyme
Chemikalien wurden von den Firmen Sigma-Aldrich (Steinheim) Merck (Darmstadt), Fluka
(Neu-Ulm), Serva (Heidelberg) BIO-RAD (München), MWG Biotech (München)oder Roth
(Karlsruhe) bezogen und waren mindestens analysenrein (p. a.). Restriktionsendonukleasen
und DNA-modifizierende Enzyme lieferten New England Biolabs (Frankfurt) und Invitrogen
(Karlsruhe). Oligonukleotide wurden von MWG Biotech (München) und Sigma (München)
bezogen. Ultrafiltrationseinheiten lieferte die Firma Millipore (Eschborn). Von der Firma
Qiagen (Hilden) und Invitek (Berlin) wurden Kits für die Isolierung von Plasmid-DNA und
von IBA (Göttingen) Säulenmaterial für die Aufreinigung von Strep-tag II-Fusionsproteinen
bezogen. Gase lieferte die Firma Messer Griesheim (Frankfurt).
2.17 Dokumentation, Statistik und Datenverarbeitung
Strategien für Klonierungen wurden mit dem Computerprogramm Vector-NTI ausgearbeitet.
Die Analyse von Sequenzchromatogrammen erfolgte mit Vector-NTI und FinchTV. Gefärbte
Polyacrylamidgele und Western-Blots wurden zur Dokumentation mit einem Scanner
(AtrixScan 1800f, Mikrotek) mit 300 bis 600 dpi digitalisiert. Zur Grafikbearbeitung wurde
Adobe Photoshop X4, Adobe Illustrator und Microsoft PowerPoint 2010 genutzt. Microsoft
Excel 2010 und CaryWin 3.0 wurden für die Auswertung von Aktivitätsmessungen und UV-
Vis-Spektren verwendet. Statistische Berechnungen wurden durch Sigma plot 10.0 und Excel
2010 durchgeführt. Mittelwerte und Standardabweichungen von mindestens drei
unabhängigen Experimenten sind angegeben. Datenbankabgleiche erfolgten mit dem
Programm BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) und multiple
Aminosäuresequenzvergleiche wurde mit Hilfe des Programms ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) durchgeführt. Ein Homologie-Modell von HoxF
wurde über SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) in automatischem Modus
erstellt. Als Strukturtemplate diente die Kristallstruktur des peripheren Teils von Komplex I
aus Thermus thermophilus, 2FUG, die über die „Protein Data Bank“ (Berman et al. 2000)
44 MATERIAL UND METHODEN
abgerufen wurde. PDB-Dateien wurden mit dem Programm Pymol 1.3 (Johnson und
Srivastava 1993) analysiert und entsprechende Abbildungen wurden erzeugt.
44 ERGEBNISSE
3. Ergebnisse
Im Rahmen dieser Arbeit sollten der strukturelle Aufbau und die O2-Toleranz der NAD+ -
reduzierenden Hydrogenase (SH) aus Ralstonia eutropha H16 sowie deren Anwendung in der
Kofaktorregenerierung in gekoppelten Enzymreaktionen untersucht werden. Um die SH in
ihrer physiologischer Umgebung, d. h. als Bestandteil des Cytoplasmas zu betrachten, wurde
das [NiFe]-Zentrum der SH in ganzen Zellen von R. eutropha mit spektroskopischen
Methoden untersucht. Um möglichst aktive und homogene Proben der isolierten SH für
spektroskopische Untersuchungen zu bekommen, wurden die Kultivierungsbedingungen für
die Produktion und Reinigung der SH optimiert. Des Weiteren wurden zwei Subformen der
SH, das Hydrogenase- und das Diaphorase-Modul konstruiert, um die Untersuchung der SH
zu erleichtern. Schließlich sollte der Produktion von reduzierten Sauerstoffspezies
nachgegangen werden, um die Sauerstofftoleranz der SH erklären zu können. Auf dem
Grundverständnis der Sauerstofftoleranz aufbauend, wurde die Anwendung der SH in der
Kofaktorregenerierung betrachtet. Neben Fragen der SH-abhängigen Kofaktorregenerierung
sowohl in vitro als auch in vivo, wurde das Substratspektrum der SH um NADP+ erweitert.
3.1 Untersuchung des [NiFe]-Zentrums der SH mit in-situ-EPR- und FTIR-
Spektroskopie
Das Modell der Sauerstofftoleranz der SH mit vier CN-Liganden am [NiFe]-Zentrum wurde
durch biochemische und spektroskopische in vitro-Studien aufgestellt (Erkens et al. 1996;
Happe et al. 2000; van der Linden et al. 2004; van der Linden et al. 2006). Daher sollte dieses
Modell in vivo überprüft werde und die SH in ihrer physiologischen Umgebung, d. h. als
Bestandteil des Cytoplasmas in einem kombinierten EPR- und FTIR-spektroskopischen
Ansatz untersucht werden.
3.1.1 Konstruktion einer RH und MBH negativen R. eutropha Mutante
Die hier beschriebenen Experimente wurden mit dem Wildtyp-Derivat R. eutropha HF798
durchgeführt, das ausschließlich die SH synthetisiert, um eine Interferenz der SH-spezifischen
spektroskopischen Signale mit denen der RH und MBH auszuschließen. Dafür wurde die SH-
Synthese in R. eutropha HF500 ( hoxH, hoxG, hoxC (Kleihues et al. 2000)) durch
Widereinführung eines hoxH-Wildtyp-Allels in das Genom über homologe Rekombination
wiederhergestellt.
ERGEBNISSE 45
Abb. 6: Immunologischer Nachweis für die erfolgreiche Eliminierung der großen Untereinheiten von RH und MBH im Stamm R. eutropha HF798. Eingesetzt wurden polyklonale Antiseren gegen HoxG, HoxC und HoxH. Als Positivkontrolle wurde R. eutropha H16 (SH+, MBH+, RH+) verwendet, als Negativkontrolle diente R. eutropha HF500 (SH-, MBH-, RH-).
Die immunologische Analyse des resultierenden Stammes R. eutropha HF798 zeigte, dass die
MBH- und RH-Untereinheiten HoxG und HoxC fehlen, wohingegen die HoxH-Untereinheit
der SH wieder produziert wurde (Abbildung 6). Ebenso wurde die katalytische Aktivität der
SH wiederhergestellt (Abbildung S1, Tabelle 3). Die wasserstoffabhängige NAD+-
Reduktionsaktivität der SH lag in derselben Größenordnung wie die des Wildtyps H16
(Tabelle 3).
Tabelle 3: SH-Aktivitäten in mit CTAB behandelten Zellen und löslichen Extrakten von unterschiedlichen R. eutropha-Derivaten.
H2: NAD+ [ U x mg-1]a
Stamm
Genotyp Phänotyp lösliche
Fraktion
CTAB-behandelte
Zellen
HF500 hoxH, hoxG, hoxC SH-, MBH-, RH- <0,001 <0,001
H16 Wildtyp SH+, MBH+, RH+ 6,9 ± 1,7 3,5 ± 1,0
HF798 hoxG, hoxC SH+, MBH-, RH- 11,4 ± 3,9 3,2 ± 0,9 a Die Stämme wurden in FGN-Medium angezogen und die Aktivität der löslichen Hydrogenase - wie in "Material und Methoden" beschrieben - gemessen. Die Werte repräsentieren das arithmetische Mittel sowie die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten.
3.1.2 In situ EPR Spektroskopie der SH
Für die Untersuchung der paramagnetischen Kofaktoren in der SH wurden EPR-
spektroskopische Experimente von Dr. Miguel Saggu und Dr. Friedhelm Lendzian in der
Gruppe von Prof. Dr. Peter Hildebrandt am Max-Volmer-Institut für Biophysikalische
Chemie der Technischen Universität Berlin durchgeführt. Die EPR-Spektroskopie erlaubt die
Identifizierung und Charakterisierung von paramagnetischen Spezies und beruht auf der
Messung von Energiedifferenzen bei der Wechselwirkung ungepaarter Elektronen mit einem
von außen angelegten Magnetfeld. Bei paramagnetischen Metallzentren kann man drei g-
46 ERGEBNISSE
Komponenten (gx, gy und gz) detektieren, die einen spezifischen Fingerabdruck des jeweiligen
Elements, dessen Redoxzustand und elektronischer Struktur darstellen (Lubitz et al. 2007).
Unbehandelte Zellen wiesen im niederen Feldbereich starke Ni-Signale mit gut aufgelösten
gx- und gy-Komponenten auf (Abbildung 7). Die aus Simulationen erhaltenen g-Werte von
2,20, 2,14 und 2,01 mit einer Linienbreite von 1,8 mT konnten dem Nia-C-Redoxzustand
zugeordnet werden, der durch ein Hydrid in der Brückenposition zwischen Nickel und Eisen
im aktiven Zentrum charakterisiert ist und auch in „Standard“-[NiFe]-Hydrogenasen gefunden
wird (Foerster et al. 2005). Zusätzlich wurden auch die Signale eines [2Fe2S]+-Clusters und
für FMN-Radikale (g = 2,00) detektiert.
Abb. 7: In-situ-EPR-Spektren der SH (durchzogene Linien) sowie dazugehörige Simulationen (gestrichelte Linien). A: “Frisch” geerntete Zellen B: Differenz zwischen dunkel-adaptierten und belichteten Zellen C: frisch geerntete Zellen, die mit H2 inkubiert wurden. D: CTAB-behandelte Zellen, die anaerob mit NAD+ oxidiert wurden. Alle Spektren wurden bei 35 K aufgenommen.
Eine relative Spinquantifizierung basierend auf dem Vergleich zwischen der
doppeltintegrierten Simulation von Nia-C und dem quantitativ reduzierten [2Fe2S]+-Cluster
ERGEBNISSE 47
ergab einen Nia-C-Gehalt von ca. 60 % in frisch geernteten Zellen. Wie in „Standard“-
Hydrogenasen wird der Nia-C-Zustand der SH durch 30-minütige Weißlichtbestrahlung bei
T = 80 K vollständig in den Ni-L-Zustand umgewandelt, der durch ein vom [NiFe]-Zentrum
dissoziertes Proton gekennzeichnet ist (Brecht et al. 2003). Nach einer 10-minütigen
Dunkeladaptation bei T>100 K wurde Ni-L vollständig zu Nia-C rücktransformiert. Die
Simulation des Differenzspektrums liefert für den Ni-L-Zustand g-Werte von 2,27, 2,10 und
2,05 mit einer Linienbreite von 1,5 mT (Abbildung 7B).
Um die absolute SH-Aktivität in vollständigen Zellen zu bestimmen, wurde eine EPR-basierte
Spin-Quantifizierung des SH-eigenen [2Fe2S]-Clusters durchgeführt, wobei CuSO4 als
Standard benutzt wurde. Nach Subtraktion des [2Fe2S]-Cluster-Signals des SH-, MBH- und
RH-negativen Stammes HF500 betrug die Konzentration des Spin-Signals des [2Fe2S]-
Clusters der SH ca. 15 μM. Unter Berücksichtigung des Molekulargewichts der nativen SH
von 205 kDa ergibt sich daraus eine SH-Konzentration von 3,1 mg/ml. Auf der Basis der
spezifischen Aktivität von 3,2 U/mg (Tabelle 3) lässt sich daraus eine absolute SH-Aktivität
von ca. 185 U/mg errechnen, die gut mit der Aktivität gereinigter SH korreliert (van der
Linden et al. 2006).
Eine 30-minütige Inkubation mit H2 führte zu dem Verschwinden der Nia-C-Signale
(Abbildung 7C), während die Signale für FMN und den [2Fe2S]+-Cluster bestehen blieben.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das aktive Zentrum weiter zu den auch in
„Standard“-[NiFe]-Hydrogenasen gefundenen Nia-SR-Zuständen reduziert wird. Des
Weiteren führte die Oxidation von SH-haltigen Zellen, die sich nach Permeabilisierung durch
CTAB-Behandlung und anschließender Inkubation mit einem Überschuss an NAD+ unter
anaeroben Bedingungen einstellte, zum Verschwinden sämtlicher Nickel- und [FeS]-
bezogenen EPR-Signale (Abbildung 7D). Es waren lediglich Hintergrundsignale einer
unbekannten, zellulären paramagnetischen Spezies sichtbar. Das Signal besitzt Ähnlichkeit zu
solchen, die auf einem Stickstoff-Liganden am Eisen basieren, wie z. B. in der Prostaglandin-
H-Synthase (Karthein et al. 1987). EPR-Signale, die den oxidierten Ni(III)-Spezies Niu-A
oder Nir-B zuzuordnen sind, konnten in der SH bislang nicht identifiziert werden.
3.1.3 In situ FTIR Spektroskopie der SH
Für eine Untersuchung der Redoxzustände des [NiFe]-Zentrums ist EPR-Spektroskopie
alleine nicht ausreichend, da nur paramagnetische Zustände des Nickels detektierbar sind.
Daher wurde zusätzlich zu der EPR- auch Infrarot-Spektroskopie in Zusammenarbeit mit
Marius Horch und Dr. Ingo Zebger (AG Prof. Dr. P. Hildebrandt, Max-Volmer-Institut für
Biophysikalische Chemie der Technischen Universität Berlin) durchgeführt.
48 ERGEBNISSE
Die Infrarot-Spektroskopie beruht auf der Anregung von Molekülschwingungen durch die
Absorption von Infrarotstrahlung. Änderungen der Elektronendichte am katalytischen
Zentrum der [NiFe]-Hydrogenasen, einschließlich Modifikationen in der Ligandensphäre
können anhand der resultierenden Verschiebungen der absoluten Position von den
Absorptionsbanden der CO- und CN--Liganden des Eisen verfolgt werden.
Abb. 8: In situ-FTIR Untersuchungen (zweite Ableitung) des [NiFe]-Zentrums der nativen SH. A: “frisch” geerntete Zellen. B: nach 30 min Inkubation mit 1 bar H2. C: anaerobe Oxidation mit NAD+ und D: nach aerobe Oxidation.
So spiegelt beispielsweise eine Verschiebung der Streckschwingungen zu höheren
Wellenzahlen eine Erniedrigung der Elektronendichte des aktiven Zentrums wider
(Darensbourg et al. 2000). Dabei sind die Banden im Spektralbereich von 2100-2040 cm-1 alle
durch CN-Liganden hervorgerufen, während Banden zwischen 1980-1900 cm-1 auf den CO-
ERGEBNISSE 49
Liganden in [NiFe]-Hydrogenasen zurückzuführen sind (Happe et al. 1997; Pierik et al. 1999;
De Lacey et al. 2007).
Da die Untersuchungen in ganzen Zellen durchgeführt wurden, waren die CO- und CN-
Bandenintensitäten in den FTIR-Spektren relativ gering und wurden von einer stark
modulierten Basislinie überlagert (Abbildung S2). Um eine zuverlässige Bandenzuordnung zu
gewährleisten, wurde die zweite Ableitung der Spektren berechnet, in der Absorptionsbanden
durch negative Peaks gekennzeichnet sind. Die FTIR-Spektren der unterschiedlich
behandelten R. eutropha-Zellen sind in Abbildung 8 gezeigt. In frisch geernteten R. eutropha–
Zellen dominierte eine CO-Absorption bei 1961 cm-1. Die zugehörigen CN-
Streckschwingungsbanden lagen bei 2080 und 2091 cm-1 (Abbildung 8A). In
Übereinstimmung mit der EPR-Spinquantifizierung wurden diese Banden dem Nia-C-Zustand
der SH zugeordnet. Die dem Nia-C zugeordneten Streckschwingungen sind im Vergleich zu
früheren Untersuchungen am isolierten Enzym bei kryogenen Temperaturen um 2-5 cm-1 zu
niedrigeren Wellenzahlen verschoben (van der Linden et al. 2006).
Diese Abweichungen könnten auf unterschiedliche pH-Werte im Cytoplasma und im Puffer
des gereinigten Enzyms oder durch temperaturabhängige Änderungen im
Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk beruhen (Fichtner et al. 2006; De Lacey et al. 2007).
Des Weiteren waren niederfrequente Absorptionsbanden der CO- bzw. CN-
Streckschwingungen bei 1913, 1922, 2052 und 2068 cm-1 zu beobachten. Die beiden letzteren
Banden waren aufgrund der Überlappung von benachbarten Absorptionen verbreitert. Nach
Inkubation mit 1 bar H2 verstärkte sich die Intensität dieser Banden signifikant (Spektrum
8B), so dass diese den reduzierten Spezies Nia-SR’ und Nia-SR’’ zugeordnet werden konnten.
Die Banden bei 1946, 2069 und 2080 cm-1 repräsentieren den Nia-SR-Zustand. Die
Zuordnung der reduzierten Redoxzustände wurde durch die zuvor ermittelten
spektroelektrochemischen FTIR-Daten der gereinigten SH gestützt, die unter reduktiven
Bedingungen bei -391 mV vs. SHE aufgenommen wurden (van der Linden et al. 2006).
Zudem wurden spektroskopische Studien der cyanobakteriellen SH von Synechocystis sp.
PCC 6803, der MBH aus R. eutropha, sowie D. vulgaris Miyazaki F für die Zuordnung aller
Redoxzustände verwendet (Tabelle 7; Germer et al. 2009; Ludwig et al. 2009; Millo et al.
2009). Die Banden bei 1958, 2068 und 2080 cm-1 repräsentieren eine weitere reduzierte, nicht
EPR-aktive Nia-SR2-Spezies, die bereits in der gereinigten bidirektionalen Hydrogenase aus
Synechocystis gefunden wurde (Germer et al. 2009). Dabei ist die Reduktion mit H2
reversibel. Nach Begasung mit Stickstoff nahm die Intensität der verschiedenern Nia-SR-
Banden wieder ab und Nia-C prägte sich wieder aus (Abbildung S3). Die Inkubation der
50 ERGEBNISSE
CTAB-behandelten Zellen mit NAD+ unter anaeroben Bedingungen (Abbildung 8C) oder mit
Luft (Abbildung 8D) führte zu drei Banden bei 1957, 2079 und 2089 cm-1. In
Übereinstimmung mit Daten, die kürzlich für die bidirektionale Hydrogenase von
Synechocystis sp. ermittelt wurden, können diese Banden einem “Nir-B-artigen”-Zustand
zugeordnet werden, der allerdings nicht EPR-aktiv ist. Zwei weitere Behandlungen führten
ebenfalls zur Bildung des Nir-B-artigen Redoxspezies. Dies war zum einen die aerobe
Permeabilisierung der Zellen durch drei aufeinanderfolgende Einfrier-Auftau-Zyklen ohne
Zusatz von Detergenzien. Dabei war es möglich, das oxidierte Enzym durch H2-Inkubation
wieder zu reduzieren, so dass die katalytisch aktiven Zustände wiederhergestellt wurden
(Abbildung S4). Zum anderen konnte für lithoautotroph gewachsene Zellen ein komplett
reversibles Redoxverhalten der SH infolge des Wechsels von einer Inertgas- zu einer
oxidierenden Atmosphäre und vice versa nachgewiesen werden (Abbildung S5).
Die vorliegende in-situ-Studie belegt, dass das aktive Zentrum der SH einen „Standardsatz“
anorganischer Liganden, d. h. zwei CN-- und einen CO-Liganden enthält. Dies widerspricht
früheren Studien an der gereinigten SH, bei denen zwei zusätzliche Cyanide am aktiven
Zentrum postuliert wurden, die für die Sauerstofftoleranz der SH wichtig sein sollten (Happe
et al. 2000; Van der Linden et al. 2004; Burgdorf et al. 2005).
3.2 Überproduktion und Reinigung nativer SH
Für weitere spektroskopische Untersuchungen und den Einsatz in der Kofaktorregenerierung
war es erforderlich, größere Mengen möglichst aktiver und homogener SH zu produzieren
und zu reinigen. Dafür sollte ein einfaches und schnelles Überexpressionssystem etabliert und
die SH zur Homogenität gereinigt werden.
3.2.1 Ein Expressionsplasmid für die SH Produktion
Für die SH-Produktion wurde ein Plasmid verwendet, das die Gene
hoxFUYHWIhypA2B2F2CDEXhoxABCJ unter der Kontrolle des nativen SH-Promotors trägt.
Um nur einen Minimalsatz von Genen für die SH-Expression einzusetzen, wurden die Gene
hoxBCJ deletiert, die die regulatorische Hydrogenase sowie die Histidin-Protein-Kinase
kodieren. Eine den Strep-tag II codierende Sequenz wurde stromaufwärts des hoxF-Gens
eingefügt, um eine schnelle, einstufige Reinigung mittels Affinitätschromatographie zu
gewährleisten. Das daraus hervorgegangene Plasmid pGE760 (Abbildung 5) wurde in den
Stamm R. eutropha HF210, dem das Megaplasmid pHG1 mit allen bekannten
Hydrogenasegenen fehlt, konjugativ übertragen. Um die resultierende Transkonjugante
R. eutropha HF210(pGE760) mit dem Wildtyp R. eutropha H16 zu vergleichen, wurden
beide Stämme heterotroph unter Hydrogenase-dereprimierenden Bedingungen in Fruktose-
ERGEBNISSE 51
Glycerin-Minimalmedium (FGN) in einem Schikanenkolben mit 20 % Füllhöhe kultiviert.
Die wasserstoffabhängige, NAD+-reduzierende Aktivität im löslichen Extrakt von R. eutropha
HF210(pGE760) betrug 10,63 ± 0,38 U/mg und war im Vergleich zum Wildtyp (6,93 ± 1,0
U/mg) um den Faktor 1,5 höher. Aufgrund der hohen SH-Aktivität wurde der Stamm
R. eutropha HF210(pGE760) für die SH-Produktion eingesetzt.
3.2.2 Mikroaerobe Zellkultivierung für die SH Überproduktion
Mikroaerobe Anzuchtbedingungen hatten bereits für die MBH gezeigt, dass ein niedriger
Sauerstoffpartialdruck (pO2) zu einer deutlich höheren MBH-Aktivität in der Membran führt
(Goris et al. 2011). Analog zur MBH-Überproduktion wurden daher für die SH-Synthese ein
5 l-Schikanekolben verwendet, der zu 80 % mit Medium gefüllt war. Bei dem Medium
handelte es sich um ein Fruktose-Glycerin-Minimalmedium-Medium mit reduzierter
Fruktosekonzentration (0,05 % w/v, FGN*) und erhöhter Glycerinkonzentration (0,4 % v/v).
Nach sieben Tagen Anzucht von R. eutropha HF210(pGE760) wurde die OD600 von 9 ± 1
erreicht und es konnten SH-Aktivitäten von 17,00 ± 1,73 U/ mg im löslichen Extrakt
festgestellt werden. Dies übertraf die SH-Aktivität von 10,49 ± 1,13 U/ mg nach
Kultivierungen in Standard-FGN-Medium (20 % Füllhöhe in Schikanekolben) um den Faktor
1,6. Für die folgenden Untersuchungen wurde R. eutropha generell unter den oben genannten
Bedingungen (mikroareob in FGN*-Medium) kultiviert, um eine große Menge aktives SH-
Enzym zu erlangen.
3.2.3 Ein optimiertes Protokoll für die Reinigung der SH
In früheren Arbeiten wurde die SH stets in klassischen, mehrstufigen und mehrtägigen
Reinigungsschritten angereichert, die aufwändige Pufferaustausche sowie mehrere
chromatographische Schritte beinhalteten (Schneider und Schlegel 1976; van der Linden et al.
2006). In Zusammenarbeit mit Juliane Ratzka am Institut für Chemie/Enzymtechnologie (AG
Prof. Dr. Marion Ansorge-Schumacher) der Technischen Universität Berlin konnte ein
stabilisierender Effekt von Glycerin (5 % v/v) und neutralem pH 7,0 auf die Aktivität
gereinigter SH festgestellt werden (Ratzka et al. 2011). Der SH-Reinigungspuffer wurde
dementsprechend angepasst. In der Vergangenheit hatte die anaerobe Oxidation der SH mit
K3Fe(CN)6 während der Proteinreinigung bereits zu erhöhter Aktivität geführt (van der
Linden et al. 2006). Allerdings führt K3Fe(CN)6 zu einer starken Erniedrigung der
Bindekapazität der Strep-Tactin-Matrix und wurde in der vorliegenden Arbeit durch NAD+
ersetzt, da es den physiologischen Elektronenakzeptor der SH darstellt. Die Reinigung der SH
erfolgte aus löslichem Extrakt von mikroaerob angezogenen R. eutropha-Zellen mittels einer
52 ERGEBNISSE
schnellen, einstufigen Affinitätschromatographie in einem Puffer, der 50 mM K-PO4, pH 7,0,
5 mM NAD+, und 5 % (v/v) Glycerin enthielt (weitere Details der Reinigung in Kapitel 2.3).
Nach anschließendem Auswaschen des NAD+ mit demselbem Puffer ohne NAD+ wurde die
SH mittels Ultrafiltration konzentriert.
Tabelle 4: Repräsentatives Beispiel für die Reinigung der SH aus R. eutropha HF210(pGE760).
Volumen Protein
Gesamt-
protein
Spezifische
Aktivität
Gesamt-
aktivität
Anreicherungs-
faktor Ausbeute
[ml] [mg/ml] [mg] [U/mg]* [U]* [%]
Zellpellet 12,0 200 2400,0 7,9 ±0,62 18960±1440 1 100
Löslicher Extrakt 25,0 29,5 737,5 17,0 ± 1,73 12540±1280 2,2 66,1
Nach Affinitäts-
chromatographie 50,0 1,3 65,0 137,0 ±15,0 8910 ± 980 17,3 46,9
*Die Aktivität wurde mittels H2-abhängiger NAD+-Reduktion in einem anaeroben Test bestimmt. 1 U entspricht dem Umsatz von 1 mol H2 x min-1. Ein Kulturvolumen von 4 l mit einer OD436 von 9 enthielt ca. 18 g Zellen (Nassgewicht), von denen 12 g für die Reinigung verwendet wurden.
Die mit dem neuen Protokoll gereinigte SH besaß eine H2-abhängige NAD+-
Reduktionsaktivität von durchschnittlich 137,0 ± 15,0 U/ mg (Tabelle 4), wobei selbst nach
Konzentrieren der Proben durch Ultrafiltration bis auf eine Konzentration von etwa 1 mM (ca.
205 mg/ml) und anschließender Verdünnung kein Aktivitätsverlust festgestellt
Abb. 9: Anreicherung der SH. SH-Protein wurde aus dem löslichen Extrakt von R. eutropha HF210(pGE760) über Strep-Tactin-Affinitätschromatographie gereinigt. Proteine im löslichen Extrakt (LE jeweils 20 μg) und im Eluat nach Affinitätschromatographie (El, jeweils 5 μg) wurden in 12 %-igen SDS-PAGE-Gelen getrennt und mit Coomassie-Blau angefärbt bzw. mittels Western-Blot-Analyse mit Antikörpern gegen HoxFUHYI sichtbar gemacht Die Positionen und Molekülmassen der Markerproteine (Precision Plus ProteinTM Standards Dual Color, Bio-Rad) sind angegeben.
wurde. Die fünf Proteinbanden in Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gelen mit den
molekularen Massen von 71, 60, 27, 23, 18 kDa konnten mittels immunologischer Analyse
eindeutig den fünf Untereinheiten der SH zugeordnet werden (Abbildung 9). Eine visuelle
ERGEBNISSE 53
Äbschätzung der Proteinbandenstärke ergab eine Reinheit des Enzyms von mehr als 95 %.
Aus einer 4-l-Anzucht konnten so hochgerechnet knapp 100 mg heterohexamerer SH
(HoxFUYHI2) gereinigt werden (siehe Tabelle 4). Wurde während der Reinigung ein
Puffersystem mit leicht alkalischem pH und höherer Ionenstärke (150 mM KCl 50 mM
TrisHCl pH 8,0) eingesetzt, führte dies zu einer Dissoziation des HoxI-Homodimers aus dem
SH-Komplex (Abbildung 9), so wie es in der Literatur beschrieben ist (Burgdorf et al. 2005).
Die heterotetramere SH (HoxFUYH) besaß eine Aktivität von 123,1 U/mg nach der
Anreicherung. Für die nachfolgenden Experimente wurde die heterohexamere SH eingesetzt,
falls nicht anderweitig beschrieben.
3.2.4 Größenbestimmung der nativen SH
Zur Größenbestimmung wurde eine Größenausschlusschromatographie durchgeführt. Frisch
gereinigte SH eluierte in einem einzigen Peak. Im Vergleich mit Standardproteinen wurde
eine molekulare Masse von 414 ± 44 kDa berechnet, die einem Dimer bestehend aus zwei
heterohexameren SH-Einheiten entspricht. Reduktionsmittel wie DTT führten zu keiner
Monomerbildung. Jedoch führte das Einfrieren bei -80 °C, mehrmonatiges Lagern und
Auftauen der Proben zu einem Monomeranteil (205 ± 21 kDa) von 25-20 % des
Gesamtproteins. Im Weiteren wird für molekulare Konzentrationsangaben die berechnete
molekulare Masse eines Monomers von 205 kDa angenommen, um die Anzahl der
Kofaktoren pro SH-Einheit zu bestimmen.
Das hier beschriebene Reinigungsprotokoll erlaubte die Reinigung hochaktiver dimerer SH in
großen Mengen für die Analyse der Kofaktoren und Kristallisationsversuche.
3.2.5 Versuche zur Strukturaufklärung der SH
Um die Struktur der SH aufzuklären, wurden Kristallisationsversuche von Dr. Hideaki Ogata
am Max-Planck-Institut für chemische Energiekonversion, Mülheim, durchgeführt. Um das
Elutionsmittel Desthiobiotin aus dem Elutionspuffer nach der Affinitätschromatographie zu
entfernen und die Reinheit weiter zu verbessern, wurde eine
Größenausschlusschromatographie in SH-Lagerungspuffer (5 % Glycerin, 50 mM K-PO4,
pH 7,0) nachgeschaltet und die gereinigte SH anschließend mittels Ultrafiltration auf eine
Proteinkonzentration von 20-100 mg/ml gebracht. Zuvor wurde bereits gezeigt, dass
(NH4)2SO4 die Stabilität und FMN die Aktivität der SH erhöht (Ratzka et al. 2011),
(Schneider und Schlegel 1978), daher wurde auch nach einigen Reinigungen dem SH-
Lagerungspuffer 50 mM (NH4)2SO4, 5 mM FMN und zusätzlich Reduktionsmittel wie 5 mM
DTT oder 1 mM TCEP hinzugefügt. Kristallisationsversuche wurden auch mit Präparationen
54 ERGEBNISSE
heterotetramerer SH-Präparationen durchgeführt. Insgesamts wurden über 500
Kristallisationsbedingungen mit der „sitting drop“- bzw. „counter-diffusion“-Methode
ausgetestet (Stevens 2000). Aggregate und kristallähnliche Strukturen wurden in einigen
Ansätzen festgestellt, allerdings streuten diese im Röntgenstrahl bislang nicht.
3.2.6 Redoxverhalten des [NiFe] Zentrums
Um das Redoxverhalten des aktiven Zentrums der SH zu untersuchen, wurden die SH-
Präparationen mittels FTIR-Spektroskopie durch Marius Horch am Max-Volmer-
Laboratorium für Biophysikalische Chemie an der Technischen Universität Berlin untersucht.
Die unbehandelte SH zeigte einen großen Peak bei 1956 cm-1 und einen Satz von vier
schwachen Banden bei 2098, 2088, 2081 und 2071 cm-1 (Abbildung 10). Dieses Muster
wurde schon zuvor für die oxidierte SH beschrieben (Happe et al. 2000). Dabei war die Bande
in der CN-Region bei 2098 cm-1 am intensivsten.
Nach anaerober Reduktion der präparierten SH mit 5 mM DTT und 1 mM FMN nahmen die
Intensitäten der hoch- und niederfrequenten CN-Banden ab, während die Bandenintensitäten
bei 2089 und 2079 cm-1 zunahmen und bei 1938 cm-1 eine kleine Schulter auftrat (Abbildung
10B). Die CO-Bande bei 1956 cm-1 blieb weitestgehend konstant. Dadurch war nahezu ein
Reinzustand mit nur zwei CN-Banden erkennbar, der bereits in R. eutropha-Zellen durch in
situ-Spektroskopie detektiert wurde (Kapitel 3.1.3). Aufgrund der Bandenpositionen ist er
vergleichbar zum Nir-B-Zustand der Hydrogenase aus D. vulgaris Miyazaki F (Millo et al.
2009). Nach Reduktion der unbehandelten Probe mit dem physiologischen Elektronendonor
NADH (1 mM) traten bei 1946, 1922 und 1914 cm-1 mehre Banden im CO-Bereich auf
(Abbildung 10C), die auch in vorhergehenden spektro-elektrochemischen Experimenten
beobachtet wurden (van der Linden et al. 2006). Eine breite Bande bei 1959 cm-1 hingegen
deutet auf eine Überlappung zweier Einzelbanden hin (Abbildung 9C). Die Behandlung der
SH mit Wasserstoff in Anwesenheit von NADH und FMN führte zu einer
Intensivitätserhöhung der drei niederfrequenten Streckschwingungen des CO-Liganden (1946
1921, 1914 cm-1) sowie der Banden bei 2079, 2069 und 2051 cm-1(Abbildung 10D). Die
breite Bande bei 1959 cm-1 verschob sich um eine Wellenzahl auf 1958 cm-1. Vermutlich
überlagerte eine zweite Bande mit einer Wellenzahl von ungefähr von 1961 cm-1 die Bande
bei 1958 cm-1, was zu einer breiten Bande mit einem Maximum von 1959 cm-1 führte. Die
CO-Streckschwingungen bei 1961, 1946, 1922 und 1914 cm-1 entsprechen den
Redoxzuständen NiaC, NiaS/NiaSR, NiaSR, und NiaSR´´ in Standard-[NiFe]-Hydrogenasen
(De Lacey et al. 2007).
ERGEBNISSE 55
Abb. 10: In vitro-FTIR-Spektren der SH. A: unbehandelte SH direkt nach der Reinigung. B: nach Inkubation mit 5 mM DTT und 1 mM FMN. C: anaerobe Behandlung mit 1 mM NADH. D: 30 min Inkubation mit 1 bar H2 in Anwesenheit von 1 mM NADH und FMN.
Ferner repräsentiert die Bande bei 1958 cm-1 vermutlich eine weitere reduzierte Spezies,
genannt Nia-SR2. Dieses wurde kürzlich auch in der cyanobakteriellen SH aus Synechocystis
sp. PCC 6803 detektiert (Germer et al. 2009). Die vorliegende in vitro-Studie der nativen SH
steht im Einklang mit den in situ-Daten (Kapitel 3.1.3) und belegt, dass das aktive Zentrum
der SH einen „Standardsatz“ anorganischer Liganden enthält.
3.2.7 Analyse der [FeS] Cluster und FMN in der SH
Neben dem aktiven Zentrum besitzt die SH weitere Kofaktoren, deren genaue
Zusammensetzung nicht bekannt ist (Schneider et al. 1979; Schneider et al. 1984; van der
Linden et al. 2006). Eine Metallbestimmung mittels Röntgentotalreflexion (TXRF) wurde in
-ähnlich
-ähnlich
56 ERGEBNISSE
Kooperation mit Dr. Michael Haumann an der Freien Universität Berlin durchgeführt. Diese
ergab die Präsenz von Nickel, Eisen, Chrom, Kupfer und Zink in einem Verhältnis von 1:
19,5: 0,1: 0,2: 0,6 in der isolierten SH. Dies steht im Einklang mit den vier erwarteten
[4Fe4S]-Clustern, einem [2Fe2S]-Cluster und einem Eisen im [NiFe]-Zentrum, d. h. einer
Gesamtmenge von 19 Eisenatomen. Das Vorhandensein von [Fe-S]-Clustern in der SH ist
zusätzlich belegt durch eine breite Absorption zwischen 350-500 nm und Schultern bei
325/380 nm und 420/450/482 nm im zugehörigen UV/vis-Absorptionsspektrum (siehe
Abbildung 11). Die Absorption war nach Reduktion mit Dithionit weit weniger stark
ausgeprägt, wie es typisch für [2Fe-2S]- bzw. [4Fe-4S]-Cluster ist (Ragan et al. 1982; Lippard
und Berg 1994; Braun et al. 1998).
Abb. 11: UV-Vis-Absorptionsspektroskopie an der SH. A: Spektren wurden aufgenommen für gereinigtes, heterohexameres SH-Protein (4,8 μM) (as isolated; schwarze Kurve) und nach Reduktion des Proteins mit Dithionit (400 μM; rote Kurve). B: Differenzspektrum aus reduzierter-minus-oxidierter SH. Die relevanten Absorptionsmaxima sind durch Dreiecke mit jeweiliger Wellenlänge (nm) gekennzeichnet.
Eine Fluoreszenzbestimmung ergab 1,00 ± 0,08 FMN pro heterohexamerem SH-Molekül,
obwohl laut Literatur zwei Flavine erwartet wurden (Schneider und Schlegel 1978). Die
Gegenwart von FMN zeigte sich ebenfalls im UV-Vis Spektrum nach Reduktion mit Dithionit
(Abbildung 11B). Ein schwacher Peak bei 400 nm kam zum Vorschein, der auf die anionische
Semichinonradikalform des FMNs hindeutet (Nöll 2008).
ERGEBNISSE 57
3.3 Das Hydrogenase-Modul der SH
Um die Untersuchung der SH hinsichtlich ihrer Vielzahl an Kofaktoren zu vereinfachen,
sollten Subformen der SH konstruiert und gereinigt werden, die jeweils nur eine begrenzte
Anzahl von Kofaktoren beherbergen. Die SH besteht zum einen aus dem Hydrogenase-
Modul, HoxHY, welches das [NiFe]-Zentrum, ein vermutetes FMN und einen potentiellen
[Fe-S]-Cluster enthält, und zum anderen dem Diaphorase-Modul HoxFU, das eine Serie von
[Fe-S]-Clustern, die NAD(H)-Bindestelle und ein FMN enthält. Während die SH aus
R. opacus bereits beim Fehlen von zweiwertigen Ionen und geringerer Ionenstärke in beide
Module dissoziiert (Schneider et al. 1984), mussten die entsprechenden Module der R.
eutropha SH durch genetische Methoden erzeugt werden. Biochemische Untersuchungen,
Proteinfilm-Voltammetrie und FTIR-, EPR- und XAS-Spektroskopie beider SH-Module
wurden durchgeführt und sollten Fragen zur Sauerstofftoleranz, der
Kofaktorzusammensetzung und der katalytischen Präferenz für entweder die H+-Reduktion
oder die H2-Oxidation klären.
3.3.1 Ein Expressionsplasmid für die Produktion des Hydrogenase Moduls der SH
Die kleinste enzymatisch aktive Hydrogenase-Subform der R eutropha-SH ist das
Hydrogenase-Modul HoxHY. Für die Reinigung dieser Subform wurde ein Plasmid
eingesetzt, das ursprünglich die Gene hoxFUYHWIhypA2B2F2CDEX trug. Ausgehend von
diesem Plasmid wurden die Gene hoxF und hoxU, die für das NADH:Akzeptor-
Oxidoreduktasemodul der SH codieren, deletiert. Zusätzlich wurde das 5´Ende des hoxY-Gens
mit einer Sequenz versehen, die für das Strep-tag II-Peptid codiert. Das Einbringen der
resultierenden Plasmide in den R. eutropha-Stamm HF210 resultierte in dem Stamm R.
eutropha HF788 (mit dem Plasmid pHD), der für die folgenden Experimente verwendet
wurde (Abbildung 5).
3.3.2 Reinigung des HoxHY Moduls und dessen katalytische Eigenschaften
Aufgrund des Fehlens des HoxFU-Moduls der SH war R. eutropha HF788 unfähig,
lithoautotroph zu wachsen. Daher wurde der Stamm heterotroph unter Hydrogenase-
dereprimierenden Bedingungen angezogen, was zu einer Synthese des HoxHY-Moduls führte.
HoxHY wurde anschließend durch Strep-Tactin-Affinitätschromatographie gereinigt. SDS-
PAGE in Kombination mit immunologischer Analyse machten zwei Proteinbanden deutlich,
die als HoxH und HoxY identifiziert wurden (Abbildung 12). Aus 32 g Zellen (Nassgewicht)
wurden routinemäßig 1,2 mg HoxHY mit einem molekularen Gewicht von 67 kDa und einer
spezifischen H2-Produktionsaktivität von 11 ± 1 U/mg mit reduziertem Methylviologen als
58 ERGEBNISSE
Elektronendonor gewonnen. Es ist anzumerken, dass die Wasserstoffproduktionsaktivität des
HoxHY-Moduls weder durch die mikroanerober Anzucht des Stammes R. eutropha HF788 in
FGN*-Medium noch durch eine anaerobe Reinigung von HoxHY und Zusatz von FMN
während der Reinigung verbessert wurde.
Abb. 12: Reinigung des HoxHY-Moduls. Löslicher Extrakt (LE, 20 μg) und gereinigtes HoxHY-Protein (El, 3 μg) wurden in einem 12 % SDS-Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch getrennt, welches anschließend mit Coomassie-Brillant-Blau gefärbt bzw. geblottet wurde. Die Untereinheiten wurden immunologisch mit polyklonalen Antikörpern gegen HoxH und HoxY nachgewiesen. Spur M enthielt Markerproteine mit den angegebenen molekularen Massen in kDa.
Auf die Bestimmung des pH-Optimums wurde verzichtet, da das Standardpotential des
eingesetzten Dithionits stark pH-abhängig ist (Mayhew 1978). Stattdessen wurden hierfür
elektrochemische Methoden eingesetzt (siehe unten). Überraschenderweise wurde für
gereinigtes und unbehandeltes HoxHY keine H2-oxidierende Aktivität mit den
Elektronenakzeptoren FMN, PMS, BV, und MV festgestellt. Dies steht im Gegensatz zu
HoxHY aus R. opacus, welches in isolierter Form H2 in Gegenwart von Benzylviologen oder
Methylenblau oxidiert (Schneider et al. 1984).
Tabelle 5: H2-oxidierende Aktivität von HoxHY unter verschiedenen Bedingungena
Reaktionsbedingung H2-abhängige Reduktion von MV [U x mg-1]
Ohne Vorinkubation <0,05
Vorinkubation mit DT 1,02 ± 0,14
Vorinkubation mit DT und FMN 3,75 ± 0,49aDetails sind im Methodenteil angegeben. Die angegebenen Werte repräsentieren arithmetische Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten.
Interessanterweise zeigte HoxHY von R. eutropha H2-oxidierende Aktivität erst nach
Vorinkubation mit Dithionit (Tabelle 5). Dies weist darauf hin, dass das unbehandelte
HoxHY-Protein zunächst eine reduktive Reaktivierung benötigt. In der nativen SH wird die
reduktive Reaktivierung durch das physiologische Reduktionsmittel NADH bewerkstelligt
(Schneider und Schlegel 1976). Nach Hinzufügen von FMN zu dem Reaktionsansatz, wurde
ERGEBNISSE 59
ein 3-4-facher Anstieg in der Wasserstoffoxidationsaktivität beobachtet (Tabelle 5). Bezogen
auf die molekulare Masse weist das Hydrogenase-Modul eine Wasserstoffproduktions- und
Wasserstoffoxidationsaktivität von 12,2 ± 1 s-1 bzw. 4,2 ± 0,6 s-1 auf. Im Vergleich dazu zeigt
die native SH eine vielfach höhere Wasserstoffproduktions- und
Wasserstoffoxidationsaktivität von 128 ± 35 s-1 bzw. 326 ± 19 s-1. Im Folgenden wurden die
Kofaktoren in HoxHY näher untersucht.
3.3.3 Analyse der Kofaktoren im Hydrogenase Modul
Um zu bestimmen, welche Kofaktoren in HoxHY enthalten sind, wurden spektroskopische
Untersuchungen mit Metallgehaltbestimmungen und Sequenzvergleichen kombiniert. Die
HoxY-Untereinheit aus R. eutropha weist eine 49,3 %-ige Aminosäuresequenzähnlichkeit
bzw. eine 16,2 %-ige Aminosäuresequenzsequenzidentität mit der Untereinheit Nqo6 von Syncy SH ---------------------------MA-----KIRFATVWLAGCSGCH 18 Synco SH ---------------------------MAQETQQKIRFATIWLAGCSGCH 23 T.r. Hox1 -----------------------------MSTPPKITVATTWLDGCSGCH 21 R.e. SH -----MRAPHKDEIASHELPATPMDPALAANREGKIKVATIGLCGCWGCT 45 R.o. SH -----MKHSEKNEIASHELPTTPLDPVLAAGRESKIKVAMIGLCGCWGCT 45 T.r. Hox2 -------------------------------MAEKPRVATASLCGCFGCH 19 T.th. Nqo6 ---MALKDLFERDVQELEREGILFTTLEKLVAWGRSNSLWPATFGLACCA 47 R.e. MBH -----------------------------METKPRTPVLWLHGLECTCCS 20
Syncy SH MSFLDMDEWLIDLAQKVDVVFSPVGSDLKEYPDNVDVCLVEG--AIANEE 66 Synco SH MSFLDLDEFLIELIKYVDVVFSPVGSDVKDYPKNVDVCLIEG--AVANQE 71 T.r. Hox1 MSFLDMDERLIELVQQVDIVYSPL-VDTKTLPDHVDVGILEG--SISSED 68 R.e. SH LSFLDMDERLLPLLEKVTLLRSSL-TDIKRIPERCAIGFVEG--GVSSEE 92 R.o. SH LSFLDMDERLLVLLDKVTLHRSSL-SDIKRITERCAIGFIEG--GVANEE 92 T.r. Hox2 MSLLDIDERILQLVDLVTFDRTPL-TDIK-TLGDCDLGLIEG--GVANAE 65 T.th. Nqo6 IEMMASTDARNDLARFGSEVFR-ASPR------QADVMIVAGRLSKKMAP 90 R.e. MBH ESFIRSAHPLAKDVVLSMISLDYDDTLMAAAGHQAEAILEEIMTKYKGNY 74
Syncy SH NLELALELRQKTKVVISFGDCAVTANVPGMRNMLKGSDPVLRRAYIELGD 116 Synco_SH NLELLEKVRQNTKLLIAFGDCAVTTNVTGIRNQKGDAQTILERGYKELTE 121 T.r. Hox1 DLEKAHAFRKHCKILVSLGDCAVNGNVPAMRNHFKLAD-VVDRAYRDT-- 115 R.e. SH NIETLEHFRENCDILISVGACAVWGGVPAMRNVFELKDCLAEAYVNSATA 142 R.o. SH NIETLEHYRENCDVLISVGACAVWGGVPAMRNVFELKDCLSEVYIDSATS 142 T.r. Hox2 NVEVLREFRRRCKTLVAVGACAVNGGIPAMRNQFSLAECLRESYCD---G 112 T.th. Nqo6 VMRRVWEQMPDPKWVISMGACASSGGMFN--------------------- 119 R.e. MBH FIEQLKYVAKDAKAIISWGSCASWGCVQAAKPNPT--------------- 130
Syncy SH GT--PQLPDEPGIVPPLLDKVIPLHEVIPVDIFMPGCPPDAHRIRATLEP 164 Synco SH EHRLPQQITG-GILPPLLPRVLPIHEVVDIDLFLPGCPPDADRIKAAIAP 170 T.r. Hox1 VTFQPQTPTQ--GVPALLAVVKPIHGVVGVDVFVPGCPPSADAIWYVLSE 163 R.e. SH VPGAKAVVPFHPDIPRITTKVYPCHEVVKMDYFIPGCPPDGDAIFKVLDD 192 R.o. SH VPGAKPVVPFHPDIPRITDKVYPCHEVVKMDYFIPGCPPDADAIFKVLDD 192 T.r. Hox2 VGVHNPGIPNDPEIPLLLNQVHPIHEVVAIDYFLPGCPPSADAIWTFLTE 162 T.th. Nqo6 ----------------NYAIVQNVDSVVPVDVYVPGCPPRPEALIYAVMQ 153 R.e. MBH -----------------QATPVHKVITDKPIIKVPGCPPIAEVMTGVITY 163 Abb. 13: Multipler Sequenzvergleich des N-terminalen Teils von HoxY von R. eutropha mit Untereinheiten von verwandten Hydrogenasen und Nqo6 von Komplex I aus T. thermophilus. Cysteine, die höchstwahrscheinlich in der Koordination des [4Fe4S]-Clusters involviert sind, sind durch eine schwarze Box markiert. Zusätzliche Cysteine, die nur in (mutmaßlich) O2-toleranten bidirektionalen Hydrogenasen zu finden sind, sind rot, das Tandemcystein in Komplex I und in der MBH gelb und die zwei zusätzlich koordinierenden Cysteine des [4Fe3S]-Clusters in der MBH grün hervorgehoben (Goris et al. 2011). Die MBH-Sequenz ist nur in
60 ERGEBNISSE
Teilen dargestellt. Abkürzungen: R.e., Ralstonia eutropha; R.o., Rhodococcus opacus; T.r., Thiocapsa roseopersicina; Syncy, Synecocystis PCC6803; Synco, Synechococcus PCC7002; T.th., Thermus thermophilus.
Komplex 1 aus Thermus thermophilus auf, dessen Kristallstruktur bekannt ist (Sazanov und
Hinchliffe 2006). Der Sequenzvergleich von HoxHY mit verwandten Hydrogenasen und
Nqo6 zeigt, dass drei der vier Cysteine, die potenziell einen [FeS]-Cluster koordinieren, in
HoxY konserviert sind (Abbildung 14). Dagegen fehlt in HoxY eines der Tandem-Cysteine
aus Nqo6, die eine wichtige Rolle in der Protonentranslokation in Komplex I (Berrisford und
Sazanov 2009) spielen. Ein solches Tandem-Cystein-Motiv findet sich auch in der MBH von
R. eutropha und ist dort in der Koordination des außergewöhnlichen [4Fe3S]-Clusters
involviert (Fritsch et al. 2011; Goris et al. 2011). Neben den potenziell kordinierenden
Cysteinen befinden sich in der SH von R. eutropha, wie auch in anderen mutmaßlichen
sauerstofftoleranten bidirektionalen Hydrogenasen weitere Cysteine (Abbildung 13, rot
markiert).
Das gereinigte Hydrogenasemodul wurde einer Metallbestimmung mittels TXRF unterzogen.
In einem HoxHY-Molekül wurden Ni, Fe, Cr, Cu und Zn in enem Verhältnis von 1: 6,2: 0,3:
1,4: 0,4 nachgewiesen, was auf die Anwesenheit eines [4Fe4S]-Clusters neben dem Eisen im
[NiFe]-Zentrum hinweist.
300 400 500 600 700
Abs
orpt
ion
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
300 400 500 600 700-0,3
-0,2
-0,1
0,0
Wellenlänge [nm]
415
Abs
orpt
ions
diffe
renz
394
600
555
384
A B
Abb. 14: UV-Vis-Absorptions-Spektroskopie am Hydrogenase-Modul. A: Absorptionsspektren oxidierter (67,1 μM Hydrogenase-Dimer, schwarze Kurve) und mit Dithionit reduzierter (100 μM DT, rote Kurve) HoxHY-Proben. B: Differenzspektrum aus reduzierter-minus-oxidierter Probe. Die relevanten Absorptionsmaxima sind durch Dreiecke mit jeweiliger Wellenlänge (nm) gekennzeichnet.
Die Anwesenheit eines [FeS]-Clusters im Hydrogenase-Modul wird unterstützt durch das
UV-Vis-Absorptionsspektrum der oxidierten HoxHY-Probe, das eine sehr breite, für [Fe-S]-
Cluster typische Absorption zwischen 350 und 500 nm mit einer Schulter bei 415 nm aufweist
(Abbildung 13 (Ragan et al. 1982; Lippard und Berg 1994; Braun et al. 1998). Die EPR-
Analysen am isolierten HoxHY-Protein bei Temperaturen zwischen 10 K und 80 K, die von
Dr. Miguel Saggu an der TU Berlin durchgeführt wurden, zeigten weder Signale vom
ERGEBNISSE 61
[NiFe]-Zentrum noch von dem [Fe-S]-Cluster in HoxHY. Ebenfalls keine EPR-Signale waren
nach Behandlung mit Dithionit oder H2 nachweisbar.
Das Hydrogenase-Modul bietet ein hervorragendes System, um experimentell zu überprüfen,
ob ein zweites FMN in der SH vorhanden ist. Das UV-Vis-Spektrum des mit 0,1 mM Na-
Dithionit behandelten Hydrogenase-Moduls zeigte distinkte Maxima bei 382 nm und 394 nm
(Abbildung 14B), die charakteristisch sind für die anionische Semichinon-Radikalform des
Flavins, wobei die Schultern bei 555 nm und 600 nm Indizien für neutral geladene
Semichinon-Radikale sind (Massey und Palmer 1966; Nöll 2008; Okafuji et al. 2010). Eine
entsprechende FMN-Fluoreszenz-Bestimmung ergab 0,05 FMN pro HoxHY-Einheit. Die
substöchiometrischen FMN-Mengen in HoxHY sind im Einklang mit den generell zu
geringen mit herkömmlichen Proteinbestimmungsmethoden experimentell bestimmten
Mengen von FMN in der nativen SH. Die erhöhte Wasserstoffoxidationsaktivität nach Zugabe
von FMN und die Ergebnisse der UV-Vis-Spektroskopie sprechen jedoch für ein FMN-
Molekül im Hydrogenase-Modul.
3.3.4 Röntgenabsorptionsspektroskopie am HoxHY Modul
Die Koordination der Eisenatome im [Fe-S]-Cluster und im [NiFe]-Zentrum im oxidierten
HoxHY-Modul wurde von Dr. Michael Haumann (Freie Universität Berlin) mittels
Röntgenabsorptionsspektroskopie, („X-ray Absorption Spectroscopy“, XAS) untersucht und
ausgewertet. Die Röntgenabsorptionsspektroskopie erlaubt Aussagen über lokale
geometrische und elektronische Strukturen von Elementen, wobei die Absorption
monochromatischer Röntgenstrahlung eines Synchrotrons im Bereich einer für das jeweilige
Element (Metall) spezifischen Absorptionskante gemessen wird. Besitzt ein Photon
ausreichend Energie, kann ein Elektron von einem kernnahen Orbital in ein höheres Orbital
angeregt werden, wobei die Absorption der Röntgenstrahlung ansteigt. Dies liefert Auskunft
über unbesetzte Orbitale für das untersuchte chemische Element. Die EXAFS-Spektroskopie
(extended X-ray absorption fine structure, EXAFS) ist ein spezielles XAS-Verfahren zur
Analyse der kantennahen Feinstruktur eines Röntgenspektrums. Mit dieser Methode kann die
Anzahl, Art und Entfernung von Nachbaratomen/Liganden eines bestimmten chemischen
Elements bestimmt werden (Dau et al. 2003).
Das EXAFS-Spektrum des HoxHY-Moduls, welches an der Fe-Kante aufgenommen wurde,
ist in Abbildung 15 gezeigt. Im Gegensatz zu Spektren von lediglich von Schwefelatomen
koordinierten Eisenkomplexen, zeigte sich für das Spektrum von HoxHY ein relativ großes
primäres Maximum, wohingegen die „Vorkante“ (pre-edge) bei etwa 7113 eV gering
ausgeprägt war. Die Kantenform war jedoch ähnlich zu denen von [FeFe]-Hydrogenasen mit
62 ERGEBNISSE
Beiträgen von Fe-S- und Fe-C(=O/N)-Interaktionen aus dem H-Cluster (Stripp et al. 2009;
Stripp et al. 2009). Daher können auch für das HoxHY-Modul ein von C(O/N) und Schwefel
koordiniertes [NiFe]-Zentrum sowie ein Fe-S-Cluster angenommen werden. Zudem lässt sich
ein durch Sauerstoff ligandiertes Eisenatom vermuten. Eine Simulation des EXAFS-
Spektrums wies einen relativen hohen Anteil von kurzen Fe-C(O/N)-Bindungen mit einer
Bindungslänge von 1.84 Å auf (Tabelle 6)
Abb. 15: Eisen-XAS-Analyse am HoxHY-Protein. Die Fourier-Transformation (FT) der EXAFS-Oszillationen (unterer Teilbereich) zeigten Maxima durch Fe-C(O/N)-, Fe-S/O- und Fe-Fe/Ni-Distanzen. Experimentelle Daten sind als offene Kreise, EXAFS-Simulationen mit Parametern in Tabelle 5 sind als durchgehende Linie gezeigt. Das entsprechende Eisenspektrum ist im oberen Teilbereich gezeigt.
Die Koordinationszahl, die die Anzahl der Liganden zu dem entsprechendem Element angibt,
von ca. 0,7 für die Fe–C(oder O/N)-Interaktionen, lag in der Größenordnung von 0,5, die für
ein durch drei diatomare Liganden koordiniertes Eisen im aktiven Zentrum sowie insgesamt
ca. sechs Eisenionen in der Probe zu erwarten gewesen wäre. Simulationen deckten drei
verschiedene Metall-Metall-Abstände auf. Der kürzeste bestimmte Abstand von 2,52 Å wurde
auf die Ni-Fe-Distanz im aktiven Zentrum zurückgeführt. Im Falle der Anwesenheit eines
Eisens im aktiven Zentrum sowie eines zusätzlichen [2Fe-2S]-, [3Fe-4S]- oder [4Fe-4S]-
Clusters werden Koordinationszahlen für Fe-Fe-Abstände von 2,7 Å von ungefähr 0,7, 1,5
bzw. 2,4 erwartet. Für das HoxHY-Modul wurde eine Fe-Fe-Koordinationszahl von 2,1 im
Abstand von 2.7 Å detektiert. Dies ist typisch für einen [4Fe-4S]-Cluster, wie er auch in der
[FeFe]-Hydrogenase von C. reinhardtii gefunden wurde (Stripp et al. 2009). Die EXAFS-
Analyse offenbarte eine geringe Menge von Metall-Metall-Abständen bei 3,37 Å und eine Fe-
ERGEBNISSE 63
O-Bindung von 2,14 Å (Tabelle 6). Wahrscheinlich stammen diese von Fe-O-Fe-Motiven in
oxidativ modifizierten [Fe-S]-Clustern und/oder von unspezifisch gebundenem Eisen in der
Probe. Letzteres würde auch durch das durchschnittliche Fe/Ni-Verhältnis von ungefähr 6
erklärt werden. Ein solcher Beitrag verändert die tatsächliche Koordinationszahl von Fe-Fe-
Abständen bei 2,7 Å und erklärt, dass der entsprechende Wert für N2,7Å nicht vollständig in
Übereinstimmung mit dem erwarteten Wert für einen [4Fe4S]-Cluster ist (N2,7Å = 2,4).
Ebenso war die Koordninationszahl für [Fe-S]-Interaktionen von ca. 3,2 (Tabelle 6) in
Übereinstimmung mit dem Wert von etwa 3,3, der für zwei Fe-S-Bindungen am aktiven
Zentrum, einem [4Fe4S]-Cluster und ca. 6 Eisen in der Probe berechnet wurde.
Tabelle 6: EXAFS-Simulationsparameter für Abbildung 16. Ni: Koordinationszahl; Ri: Metall-Rückstreuungs-Distanz, 2 2
i: Debye-Waller-Parameter (beschreibt die Temperaturabhängigkeit der Intensität der kohärent elastisch gestreuten Strahlung an einem Kristallgitter)
Schale Ni [pro
Metall]
Ri [Å] 2 2i [Å2]
C(O/N) 0,74# 1,84 0,002*
O 1,05# 2,14 0,002
S 3,21# 2,24 0,007*
Ni 0,64 2,52 0,002*
Fe 2,11 2,70 0,005*
(C)O/Nms 0,74 2,98 0,005*
Fe 0,68 3,38 0,005*
#Die Summe der Koordinationszahlen wurde auf 5 begrenzt; * Parameter, die zu physikalisch sinnvollen Werten in den Simulationen korrigiert wurden. Die Koordinationszahl von mehrfachen Streuungen („multiple scattering“, ms) und Anteilen von (C)O/N-Liganden wurde mit denen von Fe-C(O/N) gleichgesetzt
Die EXAFS-Analyse in Kombination mit der Aminosäure-Sequenzanalyse, der
Metallbestimmung und dem UV-Vis-Spektrum weist auf die Präsenz eines [4Fe4S]-Clusters
in HoxHY hin. In einem geringeren Anteil der Probe ist dieser Cluster wahrscheinlich durch
oxidative Modifikation zu einer [4Fe-nS-nO]-Spezies konvertiert.
3.3.5 Elektrochemische Untersuchungen des Hydrogenase Moduls
Die katalytischen Eigenschaften des Hydrogenase-Moduls sollten mittels Proteinfilm-
Voltammetrie charakterisiert werden, bei der das Enzym durch Adsorption auf eine
pyrolytische Graphitelektrode (pyrolytic graphite edge PGE) immobilisiert wird und in der
Lage ist, mit dieser Elektronen auszutauschen. Dies ermöglicht mehrere elektrochemische
Untersuchungen an demselben Proteinfilm ohne künstlichen Elektronenakzeptor. Zudem wird
nur wenig Probenmaterial (0,2-2 μg) benötigt. Über einen Potentiostat wird das Potential der
64 ERGEBNISSE
Elektrode mit dem Proteinfilm eingestellt. Findet H2-Oxidation statt, werden die produzierten
Elektronen direkt auf die Graphitoberfläche abgeleitet. Ereignet sich H+-Reduktion, werden
die benötigten Elektronen von der Elektrode durch die Hydrogenase auf Protonen übertragen.
Beide Prozesse können als sogenannte katalytische Ströme gemessen werden. Änderungen in
der Stromstärke beruhen daher auf Veränderungen in der Enzymaktivität. Die Vorteile der
Elektrochemie sind, dass nur aktives Enzym untersucht wird, verschiedene Gase oder
Gasgemische leicht in den Kopfraum der elektrochemischen Zelle eingebracht werden können
und durch eine schnelle Rotation der Elektrode kaum Konzentrationsgradienten zwischen
Lösung und Elektrodenoberfläche entstehen (Vincent et al. 2007). Ein weiterer Vorteil besteht
in dem hohen Überpotential von Graphit für Sauerstoffreduktion, so dass Experimente zur
Sauerstofftoleranz von Hydrogenasen problemlos bei Potentialen über 0 mV durchgeführt
werden können. Mittels zyklischer Voltammetrie, bei der das elektrische Potential
kontinuierlich über einen weiten Bereich zyklisch verändert und die daraus resultierende
Stromstärke aufgenommen wird, können die katalytische Präferenz („Bias“, die Rate der H2-
Produktion relativ zur H2-Oxidation), das Überpotential (erhöhtes Redoxpotential, an dem
katalytische Ströme auftauchen im Vergleich zum Normalpotential der Redoxpartner) und das
Reaktivierungspotential (Eswitch) des adsorbierten Enzyms bestimmt werden. Mit Hilfe der
Chrono-Amperometrie, bei der ein konstantes elektrochemisches Potential angelegt wird und
zeitabhängig die Stromstärke erfasst wird, können z. B. die Sauerstofftoleranz und
Produktinhibition der Hydrogenasen untersucht werden. Die elektrochemischen Experimente
am Hydrogenase-Modul wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Juan Liu und Dr. Kylie Vincent
(Institute of Chemistry, University of Oxford) untersucht.
3.3.6 Reaktivierung des HoxHY Moduls
Das gereinigte HoxHY-Modul wurde auf eine Graphitelektrode aufgebracht (siehe Material
und Methoden) und zyklische Voltammogramme (engl. “cyclic voltammograms“, im
Folgenden mit CV abgekürzt) wurden bei pH-Werten von 6,0, 7,0 und 8,0 in Gegenwart von
Wasserstoff aufgenommen. Die CVs zeigten, dass das Hydrogenase-Modul nach einem
reduktiven Aktivierungprozess in der Lage war, H2 zu oxidieren und Protonen zu reduzieren
(Abbildung 16ABC). Das Verhalten einer nicht mit Protein beladenen PGE-Elektrode unter
analogen Bedingungen ist ebenfalls gezeigt (graue Kurve). Hier wird der kapazitive
Hintergrundstrom im Vergleich zu dem relativ niedrigen elektrokatalytischen Strom des
Hydrogenase-Heterodimers deutlich. Die Elektrode drehte sich während dieser Experimente
nicht, um eine Destabilisierung des Proteinfilms zu vermeiden. Für das CV in Abbildung 16C
wurde die Elektrode für eine kurze Zeit gedreht (angegeben mit einem Sternchen *), um zu
ERGEBNISSE 65
zeigen, dass der Strom nicht durch Stoffaustausch, in diesem Fall von H2, begrenzt war. Die
zyklischen Voltammogramme in den Abbildungen 16A-C wurden bei einer relativ langsamen
Scan-Rate von 1 mV/s aufgezeichnet, bei 0 V gestartet und in negative Richtung bis -0,7 V
verändert, um die reduktive Aktivierung des isolierten Enzyms zu untersuchen. Im Bereich
von 0 V bis -0,25 V blieb die Stromstärke bei nahe Null, da das unbehandelte (oxidierte)
HoxHY-Modul H2 nicht oxidieren kann. Bei dem CV, das bei bei pH 8,0 aufgenommen
wurde (Abbildung 15A), begann die Stromstärke bei etwa -0,25 V zu steigen. Bei diesem
Potential wurde HoxHY reaktiviert und die H2-Oxidation begann. Dies steht im Einklang mit
der Beobachtung, dass das HoxHY-Modul in Lösung mit dem Reduktionsmittel Dithionit
reaktiviert werden muss (-750 mV bei pH 8,0) (Mayhew 1978). Dieses Ergebnis bestätigt,
dass die Anwesenheit von H2 allein nicht ausreicht, um HoxHY zu aktivieren.
66 ERGEBNISSE
Abb. 16: Reduktive Reaktivierung des HoxHY-Heterodimers. Die zyklischen Voltammogramme (CV) wurden mit einer Scan-Rate von 1 mV/s in K-PO4-Puffer (50 mM) bei den angegebenen pH-Werten, 30 °C und in Gegenwart von 1 bar H2 aufgezeichnet. Die Scans A-C und D wurden 20 s nach dem Einstellen von 0 V bzw. -0,7 V vs. SHE („standard hydrogen electrode“) gestartet. Die Richtung jedes Scans ist durch Pfeilspitzen markiert. Die Position E°´(2H+/H2) (Redoxpotential), ist als gestrichelte vertikale Linie auf jedem CV angegeben und wurde nach der Nernst-Gleichung für die experimentellen Bedingungen korrigiert. Das Signal einer unmodifizierten PGE-Elektrode unter analogen Bedingungen ist als graue Linie dargestellt. In C sind Scans für verschiedene Scanraten gezeigt. Aufgrund des Proteinfilmverlustes als Folge der geringen Scanraten (0,3 mV s-1 und 0,1 mV s-1) ist die katalytische Stromstärke gering und wurde daher um den Faktor 100 vergrößert. Für eine bessere Darstellung wurden die beiden CVs nach unten verschoben. Das Reaktivierungspotential Eswitch ist jeweils als vertikaler Balken angegeben.
Der katalytische Strom wurde geringer, als die thermodynamische Kraft für H2-Oxidation
abnahm und wurde dann negativ, da bei Potentialen, die negativer sind als das Redoxpotenzial
des Paars 2H+/H2, die H+-Reduktion begann. Dadurch erscheint bei den CVs in Abbildung
16A-C ein charakteristischer Reaktionspeak bei der zuerst die Stromstärke positiver wurde
und dann wieder abfiel. Bei der Rückkehr zu höheren Potentialen (positiver als E(2H+/H2))
setzte die H2-Oxidation wieder ein. Wurde der Zyklus unter den gleichen Bedingungen
wiederholt, fehlte der Reaktivierungspeak (nicht dargestellt). Sowohl H2-Oxidation als auch
H+-Reduktion beginnen nahe am Redoxpotential des Protonen-Wasserstoffpaares. Dies
bedeutet, dass HoxHY beide Reaktionen mit lediglich minimalem Überpotential katalysiert.
Die Voltammogramme in Abbildung 16C zeigen, dass sich die Position des
Reaktivierungspeaks für gereinigtes HoxHY-Protein auf positivere Werte verschob, wenn die
Potentialänderungen langsamer stattfanden. Aufgrund der Instabilität der HoxHY-Filme auf
ERGEBNISSE 67
der Elektrode konnte die Scanrate allerdings nicht geringer als 0,1 mV/s eingestellt werden.
Daher ließ es sich nicht feststellen, ob der Reaktivierungspeak sich noch weiter zu positiveren
Potentialen verschiebt. Die Reaktivierungspotentiale in Abbildung 16 beruhen daher sowohl
auf thermodynamischen als auch kinetischen Beiträgen des HoxHY-Enzyms. Das Potential
„Eswitch“ ist ein Parameter, der verwendet wird, um die Reaktivierung von [NiFe]-
Hydrogenasen zu beschreiben. Er definiert das Potential (E), bei dem der stärkste Anstieg des
Stromes während der Hydrogenase-Aktivierung zu beobachten ist. Um Eswitch verlässlich zu
bestimmen, muss die Scanrate im Vergleich zu der Reaktivierungsgeschwindigkeit langsam
sein (Vincent et al. 2006; Vincent et al. 2007). Da die Scanrate nicht noch weiter gesenkt
werden konnte, wurden die ermittelten Eswitch–Werte bei einer bestimmten Scanrate
miteinander verglichen. Sie erlaubten den Vergleich verschiedener Hydrogenasen und geben
einen Hinweis wie unterschiedliche Bedingungen Auswirkungen auf das katalytische
Verhalten der jeweiligen Hydrogenase haben (Fourmond et al. 2010). Das unbehandelte
HoxHY-Protein zeigte bei einer Scanrate von 1 mV/ s und pH-Werten von 8,0, 7,0 und 6,0
Eswitch-Werte von -340 mV, -300 mV bzw. -245 mV. Die pH-Abhängigkeit weist darauf hin,
dass die reduktive Reaktivierung mit Protonierungsreaktionen einhergeht. Die Beobachtung,
dass die Reaktivierung des unbehandelten HoxHY-Proteins bei relativ negativen Potentialen
stattfindet, ist konsistent mit der Reaktivierbarkeit des nativen SH-Enzyms durch NADH,
welches zumindest in geringen Mengen in vivo stets verfügbar ist. (Schneider und Schlegel
1976; Burgdorf et al. 2005).
Elektrochemische Untersuchungen am HoxHY-Modul in Gegenwart von FMN wurden
ebenfalls durchgeführt. Da FMN allerdings selbst stark an Graphit adsorbiert, führt dessen 2-
Elektronen-Oxidation bzw. -Reduktion zu intensiven Strompeaks, die das Voltammogramm
dominieren und die HoxHY spezifischen katalytischen Ströme überdecken (Abbildung S6).
Daher wurden alle weiteren elektrochemischen Experimente in der Abwesenheit von FMN
durchgeführt. Außerdem konnte über die Beladung der Elektrodenoberfläche mit HoxHY-
Protein keine Aussage getroffen werden. Hierfür wäre die Sichtbarkeit von nicht-
katalytischen, kapazitiven Strömen Voraussetzung, hervorgerufen durch Oxidation bzw.
Reduktion von proteingebundenem FMN oder [Fe-S]-Clustern. Solche Ströme, die in
Abwesenheit von Substraten (H2/H+) gemessen werden können, waren allerdings nicht
detektierbar. Dies lässt sich auf eine sehr ginge Proteinbeladung der Elektrodenoberfläche
zurückführen, was bei dem gewählten Versuchsaufbau allerdings die Regel ist.
Die meisten [NiFe]-Hydrogenasen zeigen unter anaeroben Bedingungen eine
charakteristische reversible Inaktivierung bei hohem Potential. Diese Inaktivierung wird mit
68 ERGEBNISSE
der Ausbildung des Nir-B-Zustands in Zusammenhang gebracht (Vincent et al. 2007).
Abbildung 16D zeigt ein zyklisches Voltammogramm für HoxHY, in dessen Verlauf das
Potential mit 1 mV/ s langsam von -700 auf +300 mV angehoben wurde. Bei Potentialen über
0 mV sank die Aktivität zwar deutlich, jedoch war bei der Rückkehr von +300 mV zu
negativen Potenzialen keine reduktive Reaktivierung, d.h. ein Stromanstieg, zu beobachten.
Dies deutet darauf hin, dass HoxHY keinen konventionellen Nir-B-Zustand ausbildet und
bestätigt, dass das isolierte Enzym nur eine einmalige reduktive Aktivierung für die Katalyse
benötigt. Der irreversible Verlust der Aktivität bei hohem Potential ist wahrscheinlich auf
einen potentialabhängigen Verlust des Proteinfilms oder einer Beschädigung des Proteins
zurückzuführen.
3.3.7 Katalytische Präferenz („Bias“)
Die zyklischen Voltammogramme, die mit einem HoxYU-Proteinfilm aufgenommen wurden,
zeigten, dass das Hydrogenase-Modul sowohl die H+-Reduktion als auch die H2-Oxidation
katalysiert (Abbildung 16). Der gemessene katalytische Strom ist proportional zur Aktivität
des Enzyms. Daher wurde der H+-Reduktionsstrom mit dem H2-Oxidationsstrom verglichen,
um daraus ein Maß für die katalytische Präferenz („Bias“) zu bestimmen. In der natürlichen
Umgebung schwankt die Konzentration und damit der Partialdruck von Wasserstoff. Zudem
ändert sich das NAD+/NADH-Verhältnis und somit das intrazelluläre Redoxpotential in
Abhängigkeit von den Wachstumsbedingungen. Physiologisch relevante Potentiale für die
Funktion von HoxHY liegen wahrscheinlich im Bereich des Redoxpotentials von ± 150 mV
für das 2H+/H2-Paar. Bei pH 8,0 und 1 bar H2, war die H+-Reduktionsaktivität bei 150 mV
unterhalb von E(2H+/ H2) nur 1,2-fach größer als die H2-Oxidationsaktivität 150 mV oberhalb
von E(2H+/H2) (Abbildung 16A). Wie zu erwarten war, stieg die relative H+-Reduktion mit
der Verfügbarkeit von Protonen: In Gegenwart von 1 bar H2 betrug die H+-
Reduktionsaktivität sowohl bei pH 6,0 als auch bei pH 7,0 ungefähr das Doppelte der H2-
Oxidationsaktivität (Abbildung 16CB). Dies zeigt, dass das Hydrogenase-Modul der SH in
beide Richtungen funktionieren kann, jedoch mit einer leichten Präferenz zur H+-Reduktion.
ERGEBNISSE 69
3.3.8 Produktinhibition durch Wasserstoff
Als nächstes wurde die H+-Reduktionsaktivität von HoxHY auf Produktinhibition durch H2
untersucht. Das Experiment in Abbildung 17 wurde bei 10 °C durchgeführt, um die Stabilität
des HoxHY-Proteins auf der Elektrode zu verbessern, da die erforderlichen
Gasaustauschschritte über 15 min andauerten. Die H2-Produktion von HoxHY wurde durch
H2 nur zu 30-40 % gehemmt.
Abb. 17: Bestimmung der Produktinhibition von HoxHY durch H2. Die Gase wurden zu angegebenen Zeitpunkten geändert (Flussrate jeweils 1 l/min). Die gestrichelte Linie gibt eine exponentielle Annäherungskurve für den Proteinfilmverlust an. Weitere Bedingungen: 10 °C, pH 7,0, Elektrodenrotationsrate:2000 rpm, Potential: -584 mV.
3.3.9 Sauerstofftoleranz des Hydrogenase Moduls
Die Sauerstofftoleranz der MBH konnte zuvor durch Proteinfilm-Elektrochemie untersucht
werden (Vincent et al. 2005). Daher sollten auch die Auswirkungen von O2 auf HoxHY
bestimmt werden (Abbildung 18). Der HoxHY-Proteinfilm wurde zuerst bei 10 °C reduktiv
aktiviert (pH 7,0, -384 mV) und die Elektrode dann für 90 s auf ein Potential von +210 mV
eingestellt, um die H2-Oxidationasaktivität zu verfolgen. Das Potential ist dabei ausreichend
hoch, um eine direkte Reduktion von O2 an Graphit zu vermeiden. Anschließend wurde der
HoxHY-Proteinfilm mit einem Gasgemisch aus 98% H2 und 2 % O2 inkubiert. Dies führte
dazu, dass die H2-Oxidationsaktivität von HoxHY langsam, aber stetig auf nahezu null
zurückging. Die Stromabfall innerhalb der ersten 35 s nach Inkubation mit O2 lässt sich mit
einer Exponentialfunktion und somit einer chemischen Reaktion erster Ordnung beschreiben
(Abbildung 18A). Die Inaktivierungsgeschindigkeit betrug 0,01 s-1. Für die Inaktivierung bei
30 °C (Abbildung 18A, dunkle Linie, Einschub) war die Auswertung durch eine schlechtere
Proteinfilm-Stabilität etwas komplizierter. Die halblogarithmische Darstellung zeigt, dass die
Inaktivierung durch O2 bei dieser Temperatur etwa doppelt so schnell war. Die Abweichung
70 ERGEBNISSE
von einer Kinetik erster Ordnung, die während der ersten Sekunden nach O2-Inkubation zu
beobachten war, wurde wahrscheinlich durch eine unvollständige Gasmischung
hervorgerufen. Nach dem Entfernen von Sauerstoff durch Spülen mit einem Gemisch aus
98 % H2 und 2 % N2, wurden drei aufeinanderfolgende reduktive Schritte (-384 mV)
durchgeführt.
Abb. 18: O2-Inhibition des Hydrogenase-Moduls. A: Inaktivierung durch Sauerstoff und anschließende reduktive Reaktivierung in Abwesenheit von Sauerstoff. Zuerst wurde der HoxHY-Proteinfilm reduktiv reaktiviert. Die Wasserstoffoxidation wurde anschließend bei +210 mV und 10 °C verfolgt (dicke schwarze Linie). Nach 90 s wurde der HoxHY-Proteinfilm mit einem Gasgemisch aus 2 % O2 und 98% H2 inkubiert. Drei aufeinanderfolgende reduktive Schritte (-384 mV) in Abwesenheit von Sauerstoff wurden anschließend zur Reaktivierung durchgeführt. Die gestrichelte Linie spiegelt ein analoges Experiment bei 30 °C wider. Die gestrichelte schwarze Linie zeigt eine exponentielle Extrapolation für den Proteinfilmverlust. Die breite graue Linie stellt ein Kontrollexperiment ohne Zugabe von O2 dar. Der Einschub in (A) zeigt in einer halblogarithmischen Darstellung den Abfall der Stromstärke durch O2-bedingte Inaktivierung des Proteinfilms. B: Reduktive Reaktivierung in der Gegenwart von Sauerstoff (dicke schwarze Linie). Die dünne schwarze Linie zeigt ein analoges Experiment, in dem jedoch ein katalytisch inaktiver HoxHY-Film eingesetzt wurde, der durch oxidative Inaktivierung bei +0.5 V hergestellt worden war. Dieses Experiment diente der Ermittlung des kapazitiven Betrags der proteinbeladenen Elektrode Die graue Linie repräsentiert das Resultat aus der Subtraktion des inaktiven vom aktiven Proteinfilm dar. Der Einschub in (B) zeigt in einer halblogarithmischen Skalierung den Abfall der Enzymaktivität durch O2-Inaktivierung. Für die in (A) und (B) gezeigten Experimente rotierte dei Elektrode mit 2000 rpm und der Gasstrom betrug 1 l/min. C: Die Inkubation des Proteinfilms mit O2 (2 %) nach vorheriger Reaktivierung führt zu einem neuen Eswitch (gekennzeichnet durch den vertikalen Balken). Die graue Linie repräsentiert das CV aus Abbildung 16C und ist zum Vergleich gezeigt. Weitere Bedingungen waren: 10 °C während der Inaktivierung und 30 °C während des CVs; die Scanrate betrug 1 mV/s.
Die katalytische Stromstärke bei +216 mV (nach jedem reduktiven Schritt) war ein Maß für
die Reaktivierung (Abbildung 18A). Dabei wurde der Rückgang des kapazitiven Stroms
ERGEBNISSE 71
abgewartet, der durch den Potenzialsprung hervorgerufen wurde. Der erste reduktive Schritt
(10 s nach dem Start des Experiments) resultierte in einer deutlichen Erhöhung der H2-
Oxidation. Zwei weitere längere reduktive Schritte (nach 900 s und 1250 s) führten zu keiner
weiteren Erhöhung der Stromstärke. Um die Erniedrigung der H2-Oxidation durch den
"Filmverlust“ abzuschätzen, wurde eine exponentielle Funktion erster Ordnung für die ersten
90 s vor der Einführung von O2 (gestrichelte schwarze Linie) eingeführt. Extrapoliert stimmt
diese mit der H2-Oxidation nach der reduktiven Aktivierung überein. Dies deutet darauf hin,
dass die H2-Oxdiationsaktivität nach der reduktiven Reaktivierung in vollem Umfang
wiederhergestellt wurde. Die Abbildung 18B zeigt, dass inaktives HoxHY sogar in der
Gegenwart von O2 reaktiviert werden kann. Genauso wie zuvor wurde HoxHY zuerst reduktiv
reaktiviert und nach 90 s wurde 2 % O2 hinzugegeben. Nach der Inaktivierung durch O2
wurden kurze reduktive Schritte durchgeführt, wobei diesmal ein kontinuierliches
Gasgemisch von 2 % O2 und 98 % H2 eingesetzt wurde (dicke schwarze Linie). Das Potential
wurde auf +216 mV bei (ii) und (iii) wieder eingestellt, um die HoxHY-Aktivität zu
bestimmen. Die katalytischen Ströme bei (ii) und (iii) sind aus zwei Faktoren
zusammengesetzt. Der Anstieg durch die Restkapazität, der durch den Potentialsprung
hervorgerufen war, ergab einen Hintergrundbeitrag. Ein Kontrollexperiment eines
„toten“ Proteinfilms von HoxHY (dünne schwarze Linie, siehe Material und Methoden für
Details) zeigte diesen Effekt deutlich. Die Subtraktion dieses kapazitiven Stromes von dem
Gesamtstrom (dicke schwarzen Kurve) wurde als graue Kurve wiedergegeben, um einen
Hinweis auf den katalytischen HoxHY-Strom zu geben. Obwohl die Kapazität der Elektroden
mit den unterschiedlichen Proteinfilmen nicht identisch war, macht dieses Experiment
deutlich, dass die HoxHY-Aktivität durch die kurze reduktive Behandlung selbst in
Gegenwart von O2 wiederhergestellt wurde. Der elektrokatalytische Strom sank anschließend
wieder durch O2-Inaktivierung. In der letzten Phase des Experiments wurde 2 % N2, 98 % H2
durch den Kopfraum gespült, um O2 zu entfernen. Die gestrichelte Linie stellt eine
Annäherungskurve für den exponentiellen Abfall des HoxHY-Stroms durch
Proteinfilmverlust dar. Aufgrund signifikanter Reduktion von O2 bei Graphit unter 0 V konnte
keine H2-Oxidation von HoxHY unter aeroben Bedingungen bei Potentialen in der Nähe des
NAD+/NADH-Redoxpotentials (E°=-320 mV) direkt gemessen werden. Jedoch gaben die in
Abbildung 18B dargestellten Experimente einen indirekten Nachweis, dass HoxHY in der
Lage ist, volle Aktivität bei -384 mV in Gegenwart von 2 % O2 zu erreichen, d. h. bei
physiologisch relevanten Potentialen kann HoxHY die H2-Oxidation in der Gegenwart von O2
katalysieren.
72 ERGEBNISSE
Es stellte sich die Frage, ob nach der Inaktivierung durch O2 eine neue Redoxspezies entstand.
Für das Beantworten dieser Frage wurde nach der Inaktivierung durch Sauerstoff und
Wechseln des Gases auf 1 bar H2 das Potential langsam in Richtung negativer Werte
verändert. Dabei wurden potentialabhängige Reaktivierungen untersucht. HoxHY zeigte eine
reduktive Reaktivierung mit einem veränderten Eswitch von -170 mV (siehe Abbildung 18C).
Dies deutet darauf hin, dass die Reaktion mit O2 bei +216 mV einen inaktiven Zustand
erzeugte, der sich von der oxidierten, unbehandelten Probe unterschied (Eswitch= -300 mV).
Die elektrochemischen Experimente bestätigten, dass unter aeroben Bedingungen isoliertes
HoxHY für die H2-Umwandlung eine reduktive Reaktivierung benötigt. Außerdem zeigten
sie, dass HoxHY durch Sauerstoff nur langsam deaktiviert wird. Eine reduktive Behandlung
durch Einstellen eines Redoxpotentials, das im Bereich des Standardpotentials des
NAD+/NADH-Paares (E°´= -320mV) liegt, kann HoxHY wieder reaktivieren.
3.3.10 Redoxverhalten des [NiFe] Zentrums im Hydrogenase Modul
Um das Redoxverhalten des aktiven Zentrums von HoxHY zu charakterisieren, wurden
Heterodimer-Präparationen mittels FTIR-Spektroskopie durch Philipp Hummel, Marius
Horch und Dr. Ingo Zebger am Max-Volmer-Labor für Biophysikalische Chemie an der
Technischen Universität Berlin untersucht.
ERGEBNISSE 73
Abb. 19: FTIR-Spektren des HoxHY-Moduls. Der linke Abschnitt stellt das Redoxverhalten der Präparation I, und der rechte Teilbereich das Redoxpotential der Präparation II dar. Die FTIR-Spektren der unbehandelten Proben sind gezeigt (A und D), sowie die FTIR-Spektren nach Reduktion mit Wasserstoff (B und E; in der Gegenwart von 2 mM FMN) und nach Re-Oxidation durch langsamen Zustrom von O2 (C und F). Die FTIR-Spektren von verschiedenen HoxHY-Reinigungen sind in Abbildung 19 gezeigt.
Das aktive Zentrum des gereinigten, oxidierten HoxHY-Proteins wies zwei Redoxzustände
auf, die als Ni-Ox (oxidiert) und Ni-Ox2 bezeichnet wurden und in unterschiedlichen Mengen
auftraten (Abbildung S7). Die Variation im Verhältnis der beiden Redoxzustände lag
wahrscheinlich an leicht unterschiedlichen O2-Expositionszeiten des Proteins während der
Reinigung. HoxHY-Präparationen, die nach der Reinigung entweder überwiegend im Ni-Ox-
(Präperation I) oder Ni-Ox2-Zustand (Präperation II) vorlagen, wurden hinsichtlich ihrer
Redoxeigenschaften untersucht.
Die Abbildung 19A zeigt ein typisches FTIR-Spektrum von HoxHY, das hauptsächlich im
Ni-Ox-Zustand vorlag. Es weist eine (CO)-Bande bei 1956 cm-1 und zwei (CN)-Banden bei
2087 und 2096 cm-1 auf. Die Lagen der jeweiligen Absorptionsbanden ähneln denen des
oxidierten, inaktiven Niu-A-Zustandes in Standard-[NiFe]-Hydrogenasen, wie z. B. dem
74 ERGEBNISSE
Enzym aus D. vulgaris Miyazaki F (Millo et al. 2009). Im Falle von HoxHY war der oxidierte
Zustand jedoch EPR-inaktiv (Dr. Miguel Saggu, TU Berlin, persönliche Mitteilung). Die
alleinige Inkubation des Proteins mit H2 führte nicht zur Ausbildung von reduzierten
Zuständen, was in Einklang steht mit den entsprechenden elektrochemischen und
photometrischen Daten (Kapitel 3.3.2 und 3.2.6). Reduzierte Zustände waren jedoch zu
beobachten, wenn das Protein mit H2 und FMN inkubiert wurde (Abbildung 19B). Dies deutet
darauf hin, dass FMN für die Reaktivierung notwendig ist. Die reduzierten Spezies wurden
zum einen dem Nia-SR´-Zustand mit CO- und CN-Absorptionen bei 1923 und 2052/2069 cm-
1 und zum anderen dem Nia-SR-Zustand mit identischen CN-Absorptionen, aber einer CO-
Bande bei 1946 cm-1 zugeordnet. Zudem war eine weitere reduzierte Spezies zu beobachten,
die als Nia-SR2 bezeichnet wird und sich durch eine hohe CO-Streckschwingungsfrequenz
auszeichnet ( (CO)=1956 cm-1, (CN)=2052, 2069 cm-1) Diese Spezies wurde kürzlich auch
für die bidirektionale Hydrogenase aus Synechocystis sp. PCC 6803 beschrieben (Germer et
al. 2009). Absorptionsbanden bei 1938, 2069, und 2079 cm-1 spiegeln einen Restanteil des
Ni-Ox2-Zustandes wider, wobei auch eine geringe Population des oxidierten Ni-Ox-
Zustandes mit Absorptionsbanden bei 1956, 2088, und 2096 cm-1 in der Probe vorhanden war.
Dies deutet darauf hin, dass ein Teil des HoxHY-Proteins redoxinaktiv war, womöglich
wurde Flavin nicht vollständig eingebaut bzw. das Protein nicht vollständig reaktiviert. Die
langsame Reoxidation des reduzierten Proteins durch den Austausch von H2 gegen Luft (über
ca. 11 h) führte zu einem Rückgang aller Nia-SR-Spezies und einer Erhöhung der Ni-Ox2-
Population, was eine partielle Reoxidation von HoxHY widerspiegelt (Abbildung 19C).
Die Inkubation der frisch isolierten, oxidierten Probe mit DTT oder TCEP hatte keinen Effekt
auf den Redoxzustand des aktiven Zentrums. Jedoch führte die Inkubation des Enzyms im Ni-
Ox-Zustand mit Dithionit ebenfalls zur Ausbildung von Nia-SR-Zuständen (Abbildung S8).
Dies steht in Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus der in vitro-H2-Produktion und der
Elektrochemie (Kapitel 3.3.2 und 3.3.6). Hier konnte gezeigt werden, dass die Reaktivierung
von HoxHY durch künstliche Elektronendonoren oder durch eine Elektrode nicht
notwendigerweise abhängig ist von der Zugabe von FMN. Diese Beobachtungen deuten auf
unterschiedliche Aktivierungsmechanismen oder verschiedene intramolekulare
Elektronentransferwege hin, da die Reduktion des HoxHY-Proteins mit H2 ein strikt FMN-
abhängiger Prozess in der FTIR-Spektroskopie war.
Die Abbildung 19D zeigt das FTIR-Spektrum einer Probe, die sich vor allem im Ni-Ox2-
Zustand befand. Die Reduktion mit H2 in Gegenwart von FMN ist gekennzeichnet durch
Absorptionen bei 1926, 2054, und 2069 cm-1, die der Nia-SR´-Spezies zugeordnet werden
ERGEBNISSE 75
können (Abbildung 19E). Die zusätzliche Schulter bei 1944 cm-1 ist ein Indikator für den Nia-
SR-Zustand.
Tabelle 7: CO- und CN-Streckschwingungsfrequenzen (in cm-1) aller Redoxzustände, die in SH-haltigen Zellen in situ und für die isolierten SH Derivate (in vitro) beobachtet wurden. Als Vergleich dienten die cyanobakterielle SH aus Synechocystis sp. PCC 6803, die sauerstoffsensitive Standardhydrogenase aus D. vulgaris Miyazaki F und die sauerstofftolerante MBH aus R. eutropha (Germer et al. 2009), (Millo et al. 2009), (Kellers et al. 2009; Saggu et al. 2009). Abkürzungen: n.d. nicht nachgewiesen.
SH-Derivat aus R. eutropha SH aus Synch. MBH aus D. vulgaris Miyazaki F MBH aus R. eutropha
Redox-zustand
(CO) (CN) (CO) (CN) (CO) (CN) (CO) (CN)
Nir-B-ähnlich WT in situ 1957 2079 2089 1957 2076 2088 1955 2081 2090 1944 2079 2090 WT in vitro 1957 2078 2087 HoxHY n.b. n.b. n.b. Nia-C WT in situ 1961 2080 2091 1968 2079 2093 1961 2074 2085 1957 2075 2097 WT in vitro 1961 2080 2090 HoxHY - - - Nia-SR WT in situ 1946 2069 2080 n.d. n.d. n.d. 1948 2061 2074 1948 2068 2087 WT in vitro 1946 2069 2080 HoxHY 1946 - - Nia-SR’ WT in situ 1922 2052 2068 n.d. n.d. n.d. 1932 2052 2066 1926 2049 2075 WT in vitro 1921 2050 2069 HoxHY 1923 2052 2069 Nia-SR’’ WT in situ 1913 2052 2068 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 1919 2046 2071 WT in vitro 1912 - - HoxHY 1914 2050 2069 Nia-SR2 WT in situ 1958 2068 2080 1955 2063 2079 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. WT in vitro 1958 - - HoxHY 1956 2057 2069 Nia-S WT in situ 1946 2080 2091 1947 2078 2093 1943 2074 2086 1936 2075 2093 WT in vitro 1946 2079 2089 HoxHY 1947 2078 2093
Ni-L WT in vitro # 1905 2084 2096 1911
2048 2061 1899 2040 2065
Ni-Ox HoxHY 1956 2087 2096 n.d. n.d. n.d.Niu-A:
1956 2085 2094 n.d. n.d. n.d.
Ni-Ox2 HoxHY 1938 2065 2079 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. Niia-S :
1930 2060 2076
Die größere Amplitude der CN-Absorptionsbanden im Vergleich mit dem Spektrum des
oxidierten Proteins sowie die Verschiebung der niederfrequenten CN-Absorptionsbande um
2 cm-1 zu einer höheren Wellenzahl legt nahe, dass die (CO)-Bande bei 1955 cm-1 auf die
Präsenz des Nia-SR2-Zustandes zurückzuführen ist. Eine Restpopulation der Ni-Ox2-Spezies
wird durch die starke (CO)-Bande bei 1938 cm-1 deutlich. Die zugehörigen CN-
Streckschwingungen sind jedoch aufgrund von Überlagerungen nicht zuzuordnen. Eine
langsame O2-Diffusion (ca. 21 h) in die IR-Messzelle führte zu einer deutlichen Abnahme
aller reduzierten Spezies. Das Wiedererscheinen der Ni-Ox2-Spezies zeigt die Reversibilität
der Prozesse (Abbildung 19F). Die Tabelle 7 zeigt eine Übersicht aller detektierten
Redoxzustände der SH-Derivate im Vergleich zu denen anderer [NiFe]-Hydrogenasen. Die
infrarotspektroskopischen Untersuchungen am HoxHY-Protein, an der gereinigten
heterohexameren SH (Kapitel 3.2.6) und an der SH in ganzen Zellen (Kapitel 3.1.3) machen
deutlich, dass die SH einen Standard-Satz von einem CO- und zwei CN-Liganden besitzt und
76 ERGEBNISSE
nicht wie zuvor angenommen fünf diatomaren Liganden aufweist. Des Weiteren wurde
deutlich, dass FMN für die Reduktion durch H2 eine wichtige Rolle spielt.
3.4 Katalytische Eigenschaften des Diaphorase-Moduls
3.4.1 Funktionalität eines plasmidbasierten Diaphorase Moduls der SH
Im Folgenden sollte das Diaphorase-Modul, welches das Hydrogenase-Modul mit dem
cytoplasmatischen NAD+/NADH-Pool koppelt, näher untersucht werden, um dessen
Kofaktoren, die Reversibilität, die ROS-Produktion sowie die O2-Toleranz zu untersuchen.
Für die Reinigung des Diaphorase-Moduls wurde eine ähnliche Strategie wie für das
Hydrogenase-Modul verwendet. Für die homologe Überproduktion und anschließende
Reinigung von HoxFU wurde ein Plasmid genutzt, welches das gesamte SH-Operon mit den
Genen hoxFUYHWIhypA2B2F2CDEX trägt.
Tabelle 8: Funktionalität des auf pGE553 codierten Diaphorase-Moduls. Die SH-Aktivitäten von mit CTAB permeabilisierten Zellen verschiedener R. eutropha-Derivate wurden gemessen, die zuvor in FGN-Medium angezogen worden waren.
R. eutropha
Stamm
Relevante
Eigenschaften SH-Aktivität [U x mg-1]a
HF798 SH+ 5,7 ± 1,0
HF903 SH- ( hoxFU) < 0,001
HF903 (pGE553) SH+ (hoxStrepFU) 2,8 ± 0,2
a Die H2-vermittelte Reduktion von NAD+ wurde photometrisch verfolgt.
Von diesem Plasmid wurden die Gene hoxY und H, die für das Hydrogenase-Modul codieren,
deletiert und das 5´-Ende von hoxF wurde mit einer den Strep-tag-II-kodierenden Sequenz
ausgestattet. Um zu testen, ob das resultierende Plasmid pGE553 in der Lage ist, funktionelles
HoxFU-Protein zu produzieren, wurde es konjugativ in den Stamm R. eutropha HF903
übertragen, in dem sowohl hoxF als auch hoxU deletiert wurden. eine Die Tabelle 8 zeigt,
dass der rekombinante Stamm in der Tat H2-abhängige, NAD+-reduzierende Aktivität besaß.
Die Beobachtung, dass nur etwa 50 % der Wildtyp-Aktivität erreicht wurden, kann dadurch
erklärt werden, dass die in-trans-Komplementation eine räumliche Trennung der Synthese der
Hydrogenase- und Diaphorase-Module mit sich bringt, die zu einer weniger effizienten
Assemblierung beider Subkomplexe in vivo führt.
3.4.2 Reinigung des Diaphorase Moduls
Für die HoxFU-Reinigung wurde das Plasmid pGE553 in den Stamm R. eutropha HF424
transferiert, der die MBH und die SH nicht synthetisieren kann (Massanz et al. 1998). Die
resultierende Transkonjugante wurde in Standard-FGN-Minimalmedium bis in die späte
ERGEBNISSE 77
stationäre Phase kultiviert. Das HoxFU-Heterodimer wurde aus dem löslichen Zellextrakt
durch Strep-Tactin Affinitäts- und anschließende Größenausschlusschromatographie
gereinigt. Der zweite Reinigungsschritt war notwendig, um eine inaktive HoxFU-Spezies mit
geringerer Größe von ca 90 kDa und ein nicht mit HoxFU assoziiertes Protein von etwa
60 kDa zu entfernen (Abbildung 20). Die Größenbestimmung mittels
Größenausschlusschromatographie ergab eine molekulare Masse von 110 kDa. Aus 32 g
Zellen (Nassgewicht) wurden routinemäßig 0,5 mg HoxFU mit Aktivitäten (NADH: BV) von
bis zu 350 U/mg gereinigt. Die Anzucht in FGN*-Medium führte zu keiner Steigerung der
Aktivität und Ausbeute.
Abb. 20: Reinigung des HoxFU-Moduls aus R. eutropha HF424. Löslicher Extrakt (LE; 20 μg), gereinigtes Protein nach Strep-Tactin Affinitätschromatographie (El; 3 μg) und anschließender Größenausschlusschromatographie (SEC, 3 μg) wurden mittels SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie Blau angefärbt. Die Größen eines Standard-Protein-Markers sind in Spur M in kDa angegeben. Pfeile deuten auf die Laufhöhen von HoxF (67 kDa) und zwei Unterformen des HoxU-Proteins (27 und 23 kDa).
Um HoxFU ohne den Einfluss von HoxI zu untersuchen, wurde während des
Reinigungsprozesses eine höhere Ionenstärke (150 mM KCl) und leicht alkalischen
Bedingungen (pH 8,0) eingesetzt, was zur Dissoziation von HoxI aus dem Komplex führt
(Burgdorf et al. 2005). Die SDS-PAGE-Analyse bestätigte, dass im gereinigten HoxFU-
Protein keine signifikanten HoxI-Anteile vorhanden waren (Abbildung 20). Die beiden
Proteinbanden mit apparenten molaren Massen von ca. 23 und 27 kDa konnten mittels
„Peptide Mass Fingerprinting“ eindeutig der HoxU-Untereinheit zugeordnet werden
(Abbildung 20, Tabelle 9). Dabei enthielten beide Subformen die N-und C-Termini des reifen
Proteins. Dies schloss Proteolyse als Grund für die unterschiedlichen elektrophoretischen
Wanderungseigenschaften aus und deutete auf eine noch nicht identifizierte Protein-
Modifikation hin.
78 ERGEBNISSE
Tabelle 9: Ergebnisse der “Peptide mass fingerprinting”-Analyse des gereinigten HoxFU-Komplexes.
Probe Protein “Score“ von PETIDEMAP
gefundene Peptide
Identifikation als
Abdeckung (%)
Gesamtprotein nach Größenausschluss-chromatographie
1 24,42 11 HoxF 14 2 12,59 6 HoxU 24
Proteinbande bei 27 kDa
1 97,85 14 HoxU 61
Proteinbande bei 23 kDa
1 151,59 18 HoxU 67
aCoomassieblau-gefärbtes Protein wurde aus einem Acrylamid-Gel ausgeschnitten und mit Trypsin nach Angaben des Herstellers verdaut (Promega, Mannheim, Deutschland). In Zusammenarbeit mit Anne Pohlmann wurden die Peptide mit einem Flüssigkeitschromatographen, der mit einer Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometer gekoppelt war, getrennt und der m/z-Wert bestimmt. Das Programm PEPTIDEMAP der Software PROWL (http://prowl.rockefeller.edu) wurde verwendet, um experimentell ermittelte Massen mit in silico berechneten Massen mit einer minimalen Genauigkeit von 0,05 Da zu vergleichen, wobei eine fehlende Spaltstelle erlaubt wurde.
3.4.3 Biochemische Charakterisierung des HoxFU Moduls
Mit dem gereinigtem HoxFU wurden biochemische, spektroskopische und elektrochemische
Untersuchengen durchgeführt, um die NADH:Akzeptor-Oxidoreduktase-Aktivität dieses
Enzyms näher zu charakterisieren. Die NADH:Benzylviologen(BV)-Oxidoreduktase-
Aktivität des gereinigten HoxFU-Proteins wurde bei pH-Werten zwischen 6 und 11 bestimmt
(Abbildung 21). Die maximale Aktivität wurde bei pH 10 erreicht. Das pH-Optimum der H2-
abhängigen NAD+-Reduktion durch die native SH liegt dagegen bei einem pH-Wert von 8,0
(Schneider und Schlegel 1976). Jedoch sinkt bei pH 10 die HoxFU-vermittelte NADH-
Oxidation nach etwa 30 s deutlich, was auf Protein-Instabilität bei diesem
nichtphysiologischen pH-Wert hindeutet (Abbildung 21).
Abb. 21: Bestimmung des pH-Optimums für die NADH-vermittelte Reduktion von Benzylviologen durch HoxFU. Die höchste spezifische Aktivität (297 U/mg) wurde bei pH 10 beobachtet und ist auf 100% gesetzt.
pH6 7 8 9 10 11
spez
. Akt
ivitä
t [%
]
0
20
40
60
80
100
ERGEBNISSE 79
Um die biochemischen Eigenschaften von HoxFU mit denen der nativen SH und Komplex I
zu vergleichen, wurden alle nachfolgenden kinetischen Untersuchungen bei pH 8,0
durchgeführt. Für den künstlichen Elektronenakzeptor BV wurde eine Michaelis-Menten-
Konstante (KM) von 882 μM bestimmt (Abbildung 22A). Die HoxFU-vermittelte Umsatzrate
für die NADH-abhängige BV-Reduktion betrug 639 s-1, wobei der der KM Wert für NADH
bei 56 μM lag (Abbildung 22B). Aufgrund der vergleichbaren Umsatzraten und KM-Werte
von HoxFU und der nativen SH kann davon ausgegangen werden, dass das aktive Zentrum
des Diaphorase-Dimers nicht durch das Entfernen des Hydrogenase-Moduls in
Mitleidenschaft gezogen wurde (Schneider und Schlegel 1976).
Abb. 22: Kinetik der Benzylviologen-Reduktion durch HoxFU mit NADH als Elektronendonor. Die NADH-abhängige BV-Reduktionsaktivität wurde für varierende BV- und NADH-Konzentrationen (A bzw. B) bestimmt. Der KM-Wert wurde durch nicht-lineare Regression (R2 = 0,949 für A bzw R2 = 0,945 für B) bestimmt.
Eine fünfzehnminütige Vorinkubation von HoxFU mit NADH in Konzentrationen, die über
dem KM-Wert lagen, führte zu einer signifikanten Abnahme der Aktivität (Tabelle 10). Dies
lässt sich mit der Freisetzung des HoxFU-gebundenen Flavins erklären, das mittels
Fluoreszenzspektroskopie im Überstand detektiert wurde (Tabelle 10). Die minimale FMN-
Freisetzung in Abwesenheit von NADH ist wahrscheinlich auf die mechanische
Beanspruchung und Temperatur-Änderungen im Zuge der Enzymbehandlung
zurückzuführen. Ein Überschuss an freiem FMN im Test verhinderte die Inaktivierung und
erhöhte sogar die Aktivität des HoxFU-Moduls. Ein ähnlicher Effekt wurde zuvor für die
native SH beobachtet (Schneider und Schlegel 1976; van der Linden et al. 2004).
Benzylviologen [mM]0 2 4 6 8 10 12 14 16
spez
. Akt
ivitä
t [U
/mg]
0
100
200
300
400
500
600
NADH [μM]0 100 200 300 400 500 600
spez
. Akt
ivitä
t [U
/mg]
0
100
200
300
400
500A B
80 ERGEBNISSE
Tabelle 10: Einfluss verschiedener NADH-Konzentrationen auf die Aktivität und FMN-Verlust des HoxFU-Moduls.
NADH FMN-Freisetzung b Spezifische Aktivität [U/ mg]a
[μM] [%] - FMN + FMN
0 16 ± 2 294 ± 8 356 ± 0
25 29 ± 3 297 ± 41 371 ± 6
100 62 ± 3 138 ± 35 356 ± 22
500 96 ± 4 59 ± 10 246 ± 41
a Gereinigtes HoxFU wurde mit verschiedenen NADH-Konzentrationen in der Gegenwart (500 μM) und Abwesenheit von exogenem FMN inkubiert. Nach 15 min wurde Benzylviologen hinzugefügt und die spezifische NADH: BV-Aktivität bestimmt. b Die Freisetzung von FMN aus dem HoxFU-Modul (ohne Zugabe von exogenem FMN) wurde durch Analyse des HoxFU-Filtrats (Konzentrator mit 3 kD Größenausschlussgrenze, Millipore, Bedford, MA, USA, 4 °C, 7 min bei 14000 x g) mittels Fluoreszenzspektroskopie bestimmt.
3.4.4 Kofaktor Analyse des HoxFU Moduls
Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde ein FMN-Gehalt 0,85 ± 0,05 pro HoxFU-
Heterodimer bestimmt. Das im Diaphorase-Modul gebundene FMN zeigte die typischen
Anregungs- und Emissionsspektren (Abbildung S9, S10; Schneider und Schlegel 1976). Der
N-terminale Teil von HoxF zeigt Ähnlichkeiten zu HoxE von bidirektionalen Hydrogenasen
aus Cyanobakterien und zur Nqo2-Untereinheit von Komplex I. Der C-terminale Teil von
HoxF ist dagegen homolog zu cyanobakteriellen HoxF-Proteinen und der Nqo1-Untereinheit
aus Komplex I (Abbildung 23, 24). Diese „Zweiteiligkeit“ lässt vermuten, dass HoxF aus R.
eutropha ein Fusionsprotein aus zwei Untereinheiten von Komplex I darstellt. Die
Abwesenheit von zwei Cysteinresten, die in der Koordination des [2Fe2S]-Clusters in Nqo2
involviert sind, legt nahe, dass HoxF von R. eutropha keinen [2Fe2S]-Cluster enthält
(Abbildung 23).
Durch induktiv gekoppelte Plasma-Emissionsspektrometrie (ICP-OES inductively coupled
plasma optical emission spectrometry) wurden 12 ± 1 Eisenionen pro FMN-Molekül
nachgewiesen. Dieser Wert passt gut zu den 14 Eisenatomen, die auf der Basis konservierter
Reste, die [Fe-S]-Cluster koordinieren können, vorhergesagt wird (Abbildung 23-25).
ERGEBNISSE 81
T.th. Nqo2 -------------MGFFDDKQDFLEETFAKYPPEGRRAAIMPLLRRVQQE 37 R.e. NuoE ------------MTMLSAEALKEIDRAIAKYPADQKQSAVMAALAVAQGE 38 Synco. HoxE MSFET--ITMAISHAVP-ADKRFRVLEVAMKRNQYRQDTLIEILHKAQEV 47 Syncy. HoxE MTVATDRQTVPPSAAHPSGDKRFKVLDATMKRNQFNQDALIEILHKAQEI 50 T.r. Hox1E MSLQQ------AKPPLPSDDKRWKLVNATMRRNGYAGHALIETLHSVQDA 44 R.o. HoxF -------------MSGDIKAILE--------RNGSERTRLIDILWDVQHL 29 R.e. HoxF -------------MDSRITTILE--------RYRSDRTRLIDILWDVQHE 29 T.r. Hox2F -------------MNASATVTVEGFVAESLATHGRDPRHLLQHLIRVQQR 37 * *
T.th. Nqo2 EGWIRPERIEEIARLVGTTPTEVMGVASFYSYYQFVPTGKYHLQVCATLS 87 R.e. NuoE VGWVSPEVMQFVASYLEMPPVWVEEVATFYNMYDTKPVGKFKLAVCTNLP 88 Synco. HoxE FGYLEDEVLEYVARGLKLPLSRVYGVATFYHLFSLKPKGKHTCVVCLGTA 97 Syncy. HoxE FGYLEEDVLLYVARGLKLPLSRVFGVATFYHLFSLKPSGKHTCVVCLGTA 100 T.r. Hox1E FGFLDEGSLRFVASSLDLPLSKVYGVATFYHLFALKPKGRHACVVCTGTA 94 R.o. HoxF YGHIPDEVLPQLADELNLSPLDILETASFYHFFHRKPSGKYRIYLSDTVI 79 R.e. HoxF YGHIPDAVLPQLGAGLKLSPLDIRETASFYHFFLDKPSGKYRIYLCNSVI 79 T.r. Hox2F FSYVPDAAVEALSVALDVTRTQVRAAIAFYAFLHDRPRGAFEIRFSDNIT 87 ** * *
T.th. Nqo2 CKLAGAEELWDYLTETLGIG------PGEVTPDGLFSVQKVECLGSCHTA 131 R.e. NuoE CALSGGERAGEYLKRKLGID------YNETTADGCFTLKEGECMGACGDA 132 Synco. HoxE CYVKGSQELLDKIDETLHIK------PGETTPDDQISLVTARCIGACGIA 141 Syncy. HoxE CYVKGAGDLLKTLDQEVHLK------PGETTEDGQMSLVTARCIGACGIA 144 T.r. Hox1E CYIKGAGGLVERLQERYDIN------PGETTEDDRLSLLTARCVGACGLA 138 R.o. HoxF AKMNGYQAVHDSLERETGAR----FG--GTDKTGMFGLFETPCIGLSDQE 123 R.e. HoxF AKINGYQAVREALERETGIR----FG--ETDPNGMFGLFDTPCIGLSDQE 123 T.r. Hox2F DRMLGSRRLIRLLIERLGLTGLPAWGRDLVRPDGRASVGLASCTGMCDQG 137 * * *
T.th. Nqo2 PVIQVNDEPYVECVTRARLEALLAGLRAGKRLEEIELPGKCGHHVHEVEV 181 R.e. NuoE PVMIVNNTRMCSFMSDDKLDALVDELKA-----EAAKGGK---------- 167 Synco. HoxE PAVVYDDEVCGKQNADHLMARLRQLSEGS--------------------- 170 Syncy. HoxE PAVVYDGKVLGKQNDEAVLAAIQPWLSNS--------------------- 173 T.r. Hox1E PAIVIDGDVLGKLDSESLIAKLEELT------------------------ 164 R.o. HoxF PAMLIDNVVFTRLRPGTIVDIITQLRQGRSPEDIANPAGLPSDDVAYVDG 173 R.e. HoxF PAMLIDKVVFTRLRPGKITDIIAQLKQGRSPAEIANPAGLPSQDIAYVDA 173 T.r. Hox2F PALLVNGQAVTNLDAQRVDRIADLVQEG-----------IPLERWPGEFF 176 *Abb. 23:Multipler Sequenzvergleich des N-terminalen Teils von HoxF aus R. eutropha mit Untereinheiten aus verwandten Hydrogenasen und der Komplex I-Untereinheit NuoE aus R. eutropha und Nqo2 aus T. thermophilus. Cysteinreste involviert in der Koordination des [2Fe2S]-Clusters in Nqo2 sind durch schwarze Kästen angegeben (Sazanov und Hinchliffe 2006). Abkürzungen: R.e., Ralstonia eutropha, R.o., Rhodococcus opacus, T.r., Thiocapsa roseopersicina; Syncy., Synechocystis PCC 6803; Synco., Synechococcus PCC 7002; T.th., Thermus thermophilus. Aminosäurereste, die in allen Proteinen konserviert sind, sind mit einem * gekennzeichnet.
82 ERGEBNISSE
T.r. Hox1F KIVLENAGIIDPDSFKGYVAVGGYSALIRALSEMTP---ADVLREVTDSGLRGRGGGGYP 180 Al.v. HoxF RIVLEHSGLIDPDSLRGYIAVGGYAALVRALTEMTP---ADVLREVTTSGLRGRGGGGYP 181 Synco. HoxF PVVLENSGKIDPERIEAYIARGGYRSLHQVLEDLTP---MAVVEEITQSGLRGRGGGGYP 176 Syncy. HoxF NIALENSGRIDPESIDEYIALGGYEQLHKVVYEMTP---EEVIVEMNKSGLRGRGGGGYP 178 An.v. HoxF PIVLENSGKIDPERIQAYIAAQGYQALYQVLREMTP---AGVVDSVNRSGLRGRGGAGYP 180 R.e. FdsB RLTFARVGITDPLSLDDYRAHEGFAGLERAL-AMQP---AEIVQEVTDSGLRGRGGAAFP 161 R.e. NuoF QPLILAGLDGKNWHLEDYVKRGGYQQLKRILTEKIPP--EQVIADVKASGLRGRGGAGFP 67 T.th. Nqo1 RTLYAHVGKEGSWTLDYYLRHGGYETAKRVLKEKTP---DEVIEEVKRSGLRGRGGAGFP 71 R.e. HoxF DIAYVDAMVESNVRTKGPVFFRGRTDLRSLLDQCLLLKPEQVIETIVDSRLRGRGGAGFS 226 R.o. HoxF DVAYVDGVVESNVRTKGPVFFRGLTDYGRLLELCLALRPEQIIDRIIESKLRGRGGAGFS 226 T.r. Hox2F RWPGEFFRVENNIRRRGLLLGNPATDG-AAVRRLLDAGAEAALAEVERSGLRGRGGAGFT 228 * ******
T.r. Hox1F TGLKWSTVAKMPATQKYVICNADEGDPGAFMDRAILESDPHRVLEGMAIAAYAIGANKAY 240 Al.v. HoxF TGLKWSTIAKMPPGQKYVVCNADEGDPGAFMDRAVLESDPHRVLEGMAIAAYAVGASKGY 241 Synco. HoxF TGLKWATVAKMPGDQKYVVCNADEGDPGAFMDRAVLESDPHRVLEGMAIAGYAVGANHGY 236 Syncy. HoxF TGLKWATVAKMPGQQKYVICNADEGDPGAFMDRSVLESDPHRILEGMAIAAYAVGANHGY 238 An.v. HoxF TGLKWATVAKAKGERKFVICNADEGDPGAFMDRSVLESDPHRVLEGMAIAAYAVGASQGY 240 R.e. FdsB TGIKWKTVLGAQSAVKYIVCNADEGDSGTFSDRMVMEDDPFMLIEGMTIAALAVGAEQGY 221 R.e. NuoF TGLKWSFMPRTFPGQKYLVCNTDEGEPGTFKDRDIIRYNPHSLIEGMAIGAYAMGITVGY 127 T.th. Nqo1 TGLKWSFMPKDDGKQHYLICNADESEPGSFKDRYILEDVPHLLIEGMILAGYAIRATVGY 131 R.e. HoxF TGLKWRLCRDAESEQKYVICNADEGEPGTFKDRVLLTRAPKKVFVGMVIAAYAIGCRKGI 286 R.o. HoxF TGLKWQLCRTAVSDDKYIICNADEGEPGTFKDRVLLTRSPKKVFMGMIIAARAIGSRNGI 286 T.r. Hox2F TALKWRFCREAPGTDRYVVCNADEGEPGTFKDRVLLTDYTDLVIEGMTVCAGVIGARRGF 288 * ** ** ** * * ** **
T.r. Hox1F VYVRAEYPLAVERLQTAIRKAKRSGLLGNKIGD-TQFSLEVEIRLGAGAFVCGEETALMA 299 Al.v. HoxF VYVRAEYPLAVERLETAIRKAKRAGFLGAKVAD-TQFAFEVEIRLGAGAFVCGEETALMA 300 Synco. HoxF IYIRAEYPLAIQRLEKAIKQAKSKGLLGSQIFN-SPFNFTIDIRIGAGAFVCGEETALIA 295 Syncy. HoxF IYVRAEYPLAIQRLQKAIQQAKRYGLMGTQIFD-SPIDFKIDIRVGAGAFVCGEETALIA 297 An.v. HoxF IYVRAEYPIAIKRLQTAIHQAQRLGLLGSNIFE-SPFDFKIDIRIGAGAYVCGEETALMA 299 R.e. FdsB IYCRSEYPHAIAVLESAIGIANAAGWLGDDIRG-SGKRFHLEVRKGAGAYVCGEETALLE 280 R.e. NuoF NYIHGEIWNEYKIFEEALEEARAAGFLGDNILG-SGFDFQLHAHHGYGAYICGEETALLE 186 T.th. Nqo1 IYVRGEYRRAADRLEQAIKEARARGYLGKNLFG-TDFSFDLHVHRGAGAYICGEETALMN 190 R.e. HoxF VYLRGEYFYLKDYLERQLQELREDGLLGRAIGGRAGFDFDIRIQMGAGAYICGDESALIE 346 R.o. HoxF LYLRWEYIYLKDYLERQLQELRDEGLLGARIGGQSGFDFDIRIQMGAGAYICGDESALIE 346 T.r. Hox2F LYLRGEYRYLLPHLESVLQRRRAEGLLGTRILGADGFDFDIEIHLGAGAYICGEESALIE 348 * * * * * ** ** * **
T.r. Hox1F SIEGLRGQPRPRPPYPAEAGLWGYPTLINNVETFANIAPIVREGGDWFASIGTERSKGTK 359 Al.v. HoxF SIEGLRGQPRPRPPYPAESGLWGCPTLINNVETFANIAPIIREGGDWFAAIGTEGSKGTK 360 Synco. HoxF SIEGGRGTPRPRPPYPAQSGLWGHPTLINNVETYANIVPIIREGADWFSSIGTEKSKGTK 355 Syncy. HoxF SVEGKRGTPRPRPPYPAQSGLWQSPTLINNVETYANVVPIIREGGDWYGSIGTEKSKGTK 357 An.v. HoxF SIEGKRGVPHPRPPYPAESGLWGYPTLINNVETFANIAPIIRKGADWFASIGTAKSKGTK 359 R.e. FdsB SLEGRRGVVRAKPPLPALQGLFGKPTVINNVISLATVPVILARGAQYYRDYGMGRSRGTL 340 R.e. NuoF SLEGKKGQPRFKPPFPASFGLYGKPTTINNTETFAAVPFLLAVGPENYLKLGKPNNGGTK 246 T.th. Nqo1 SLEGLRANPRLKPPFPAQSGLWGKPTTINNVETLASVVPIMERGADWFAQMGTEQSKGMK 250 R.e. HoxF SCEGKRGTPRVKPPFPVQQGYLGKPTSVNNVETFAAVSRIMEEGADWFRAMGTPDSAGTR 406 R.o. HoxF SCEGKRGTPRVKPPFPVQEGYLGKPTCVNNVETFAAAARIMEEGPNWFRALGTPESTGTR 406T.r. Hox2F SLEGKRGVTRKRPPFPVTSGFDDQPTVVNNVETFLAAARVVQWGGYWLRGEGTDQSAGSK 408 * ** ** * * ** ** * * *
T.r. Hox1F VFALAGTITNTGLIEVPMGTSLRDIIEVIGGGIPGGKAFKAVQTGGPSGGCIPA--QHLD 417 Al.v. HoxF VFALAGKIKNTGLIEVPMGTSLRDIIEVIGGGIPDGRAFKAVQTGGPSGGCIPR--RHLD 418 Synco. HoxF VFALTGKVKNNGLIEVPMGTPVRQIVEQMGGGIPDSGTVKSVQTGGPSGGCIPA--DYLD 413 Syncy. HoxF VFALTGKVENAGLIEVPMGTTVRQVVEEMGGGVPNGGQVKAVQTGGPSGGCIPA--DKLD 415 An.v. HoxF VFALAGKIRNTGLIEVPMGTSLRQIVEQMGGGIPDGGVAKAVQTGGPSGGCIPA--SAFD 417 R.e. FdsB PFQLAGNIKQGGLVEKAFGVTLRELLVDYGGGTRSGRAIRAVQVGGPLGAYLPE--SRFD 398 R.e. NuoF IFSISGDVERPGNYEIPLGTPFAKLL-ELAGGMRGGKRIKAVIPGGSSAPVVPG-DLMMA 304 T.th. Nqo1 LYQISGPVKRPGVYELPMGTTFRELIYEWAGGP--LEPIQAIIPGGSSTPPLPFTEEVLD 308 R.e. HoxF LLSVAGDCSKPGIYEVEWGVTLNEVLAMVG-----ARDARAVQISGPSG-------ECVS 454 R.o. HoxF LLSVAGDCSRPGIYEVEWGVTLNEVLTTVG-----ARDARAVQISGPSG-------QCVS 454 T.r. Hox2F ILSVSGDCARPGIYEYPFGTPVHQVLSDCG-----AENTQAVQISGAAG-------ATLS 456 * * * * *
T.r. Hox1F IAVDYDSLKTLGTMMGSGGMIVMDETSSMVDVARYFMEFCMTESCGKCIPCRTG-TQQMH 476 Al.v. HoxF IPVDYDSLKTLGTIMGSGGLIVMDETSCMVDVAR-FMEFCMSESCGKCIPCRAG-TWQMH 476 Synco. HoxF TPIEYDSLIKLGTMMGSGGMIVMDEATNMVDVAKFYMEFCQCESCGKCIPCRAG-TVQMS 472 Syncy. HoxF TPIEYDTLLALGTMMGSGGMIVMDESTNMVDVAQFYMDFCKSESCGKCIPCRAG-TVQLY 474 An.v. HoxF TPVDYESLTNLGSMMGSGGMIVMDDTTNMVDVARFFMEFCMDESCGKCIPCRVG-TVQLH 476 R.e. FdsB VPLDYEAYAAFGGVVGHGGIVVFDETVDMAKQARYAMEFCAIESCGKCTPCRIG-STRGV 457 R.e. NuoF SDMDYDSIAKAGSMLGSGAVIVMDETRCMVRSLLRLSYFYFEESCGQCTPCREG-TGWLY 363 T.th. Nqo1 TPMSYEHLQAKGSMLGTGGVILIPERVSMVDAMWNLTRFYAHESCGKCTPCREGVAGFMV 368 R.e. HoxF VAKDGERKLAYEDLSCNGAFTIFNCKRDLLEIVRDHMQFFVEESCGICVPCRAG-NVDLH 513 R.o. HoxF VAEDGERRMAYEDISCNGAFTIFNTERDLLEIVKDFMQFFVDESCGICVPCRVG-NIDLH 513 T.r. Hox2F PA-DFDRIIAFEDLPTAGSFMIFDHSRDLLDMVRNFAAFFAHESCGFCTPCRVG-GALLR 514 * * **** * *** *
ERGEBNISSE 83
T.r. Hox1F SILDRLAKSQATRAELTLLEELCEVVQATSLCGLGQTAPNPVLSTMRYFRDEYEAKLGEV 536 Al.v. HoxF ALLDTLTKAEGTRADLALLEDLCDVVRATSLCGLGQTAPNPVLSTLRYFRDEYEAKLGWE 536 Synco. HoxF GLLSKMLKGQAEPKDIELLEQLCHMVKEASLCGLGQSAPNPILSTLRYFRAEYDALVGSN 532 Syncy. HoxF DLLTRFLEGEATQEDLIKLENLCHMVKETSLCGLGMSAPNPVISTLRYFRHEYEELLKV- 533 An.v. HoxF GLLSKIREGKASFADLELLEELCDMVKNTSLCGLGQSAPNPVFSTLRYFRDEYLALIAE- 535 R.e. FdsB EVMDRIIAGEQPVKHVALVRDLCDTMLNGSLCAMGGMTPYPVLSALNEFPEDFGLASNPA 517 R.e. NuoF RMVNRIEHGEGRQEDLDLLNNVAENIMGRTICALGDAAAMPVRGMLKHYWKEFEYHVEHK 423 T.th. Nqo1 NLFAKIGTGQGEEKDVENLEALLPLIEGRSFCPLADAAVWPVKGSLRHFKDQYLALAREK 428 R.e. HoxF RKVEWVIAGKACQKDLDDMVSWGALVRRTSRCGLGATSPKPILTTLEKFPEIYQNKLVRH 573 R.o. HoxF KKVELVIAGKACQKDLDDVVSWGALVKKTSRCGLGATSPNPILTTLDKFPEIYTKRLRKQ 573 T.r. Hox2F NLVEKVAAGQGSEYDLSEMRRIGTVMRRASYCGLGHTAPNHVVNTLDKFPLIYGRRLARA 574 *
T.r.Hox1F ---------------------------------------- Al.v.HoxF TA-------------------------------------- 538 Synco.HoxF AD-------------------------------------- 534 Syncy.HoxF ---------------------------------------- An.v.HoxF ---------------------------------------- R.e.FdsB KAA------------------------------------- 520 R.e.NuoF QCMVPAYI-------------------------------- 431 T.th.Nqo1 RPVPRPSLWR------------------------------ 438 R.e.HoxF EG-PLLPSFDLDTALGGYEKALKDLEEVTR---------- 602 R.o.HoxF KKEALLLSFDLDAALGGYEKALEGLAKEEIK--------- 604 T.r.Hox2F SH---TPSFDLDAALS-QARALTGRDDIGAHIGDGSEVSA 610
Abb. 24: Multipler Sequenzvergleich des C-terminalen Teils von HoxF aus R. eutropha mit Untereinheiten aus verwandten Hydrogenasen, mit der FdsB Untereinheit der NAD+-abhängigen Formiat-Dehydrogenase aus R. eutropha und den Komplex I-Untereinheiten NuoF aus R. eutropha und Nqo1 aus T. thermophilus. Konservierte Cysteinreste, die in der Koordination des [4Fe4S]-Clusters in Nqo1 von T. thermophilus und in allen anderen Proteinen beteiligt sind, sind schwarz eingerahmt. Für die Bindestellenumwandlung zu NADP+ wurden die die blau und rot hervorgehobenen Aminosäuren ausgetauscht. Aspartat (D340) und Glutamat (E341) (blau umrahmt) bilden vermutlich Wasserstoffbrücken zu der Ribose der Adenosin-Einheit des NADs aus, an der sich bei NADPH eine zusätzliche Phosphatgruppe befindet (Sazanov und Hinchliffe 2006). Zudem wurden zwei fernab der NAD-Bindestelle exponierte Aspartate durch Serin (D467S) und Lysin (D401K) ersetzt, wie sie in bidirektionalen Hydrogenasen aus Cyanobakterien vorgefunden werden (grün). Abkürzungen: Re, Ralstonia eutropha, Ro, Rhodococcus opacus, Tr, Thiocapsa roseopersicina; Syncy, Synechocystis PCC 6803; Synco, Synechococcus PCC 7002; T.th., Thermus thermophilus; Al.v Allochromatium vinosum; An.v.Anabaena variabilis ATCC 29413. Aminosäurereste, die in allen Proteinen konserviert sind, sind mit einem * gekennzeichnet.
R.e. HoxU -----------------MSIQITIDGKTLTTEEGRTLVDVAAENGVYIPT 33 R.o. HoxU -----------------MSIEIEIDGVTVTTEESRTLVDVAAEAGVYIPT 33 T.r. Hox2U -----------------MSKTFKLDGREIPFETGQTIMDAALAAGVYIPH 33 Synco. HoxU ----------------MAVKTLTINDQLISARAGETILEAARDAGIHIPT 34 Syncy. HoxU ----------------MSVVTLTIDDKAIAIEEGASILQAAKEAGVPIPT 34 T.r. Hox1U -------MPLPAKQPNVRVVTLNIDGRDLSAREDETIIEVCRENQIPIPS 43 R.e. FdsA MNARNEIDFGTPASPSTELVTLEVDGVSVTVPAGTSVMRAAMEAQIAVPK 50 T.th. Nqo3 ------------------MVRVKVNDRIVEVPPGTSVMDAVFHAGYDVPL 32 R.e. NuoG ------------------MVELEIDGKKVEVAEGSLVMEAARKLGTYIPH 32 *
R.e. HoxU LCYLKDKPCLGTCRVCSVKVNGN-----------------------VAAA 60 R.o. HoxU LCYLKGKPSLGTCRVCSVKLNGT-----------------------VVAA 60 T.r. Hox2U LCHNPEFAPHGSCRVCVVDIGGR-----------------------QVSA 60 Synco. HoxU LCHLEGVSDVGACRLCLVEIEGSNK---------------------LQPA 63 Syncy. HoxU LCHLEGISEAAACRLCMVEVEGTNK---------------------LMPA 63 T.r. Hox1U LCYLEGLSVWGACRLCLVELSGQGR---------------------LLAA 72 R.e. FdsA LCATDSLRNFGSCRLCLVEIEGRRG---------------------YPAS 79 T.th. Nqo3 FCSEKHLSPIGACRMCLVRIGLPKKGPDGKPLLNEKGEPEIQWQPKLAAS 82 R.e. NuoG FCYHRKLSIAANCRMCLVEVEKAPK---------------------ALPA 61 * ** * *
R.e. HoxU CTVRVSKGLNVEVNDPELVDMRKALVEFLFAEGNHNCPSCEKSGRCQLQA 110 R.o. HoxU CTIRVANGMKIEVDEPEVVDMRKANVELLFAEGNHNCPSCEKSGRCKLQA 110 T.r. Hox2U CTAAASEGLEVDNSSEAIQETRRAILQMLFVEGNHVCPACEKSGACQLQA 110 Synco. HoxU CVTEVMEGMVVQTHTEKLEEYRRMTVELLFAEGNHVCAVCVANGNCELQD 113 Syncy. HoxU CVTAVSEEMVVHTNTEKLQNYRRMTVELLFSEGNHVCAICVANGNCELQD 113 T.r. Hox1U CSTRVTEGMQIQTNTEKLQRYRRTIVELLFAERNHVCSVCVSNGHCELQH 122 R.e. FdsA CTTPVEAGMKVKTQSDKLADLRRGVMELYISDHPLDCLTCPTNGNCELQD 129 T.th. Nqo3 CVTAVADGMVVDTLSDVVREAQAGMVEFTLLNHPLDCPTCDKGGACELQD 132 R.e. NuoG CATPVTPGMKVFTNSEKAVKAQKSVMEFLLINHPLDCPICDQGGECQLQD 111 * * * * * **
84 ERGEBNISSE
R.e. HoxU VGYEVDMMVSRFPYRFPVRV--------------VDHASEKIWLERDRCI 146 R.o. HoxU VGYEVDMMVSRFQYRFPERV--------------QDHASETIWLERDRCI 146 T.r. Hox2U VAYYTGMLAPHFTHFFPRRS--------------VDASHPDVVIDFNRCI 146 Synco. HoxU MAVEVGMDHSRFPYQYPKRE--------------VDISHKQFGIDHNRCI 149 Syncy. HoxU MAITVGMDHSRFKYQFPKRE--------------VDLSHPMFGIDHNRCI 149 T.r. Hox1U MAQKCGVDHVRVPYRQASYP--------------VDSSHEMFRLDHDRCI 158 R.e. FdsA MAGVVGLREVRYNDGGPERAPIATHTQM-----KKDESNPYFTYDPSKCI 174 T.th. Nqo3 RTVEYGLYEKYYQKGPLELPVYTRFEFTRRHVDKHHPLSPFVILDRERCI 182 R.e. NuoG LAVGYGASESRYKEEKRVVFH-------------KNVGPLISMEEMTRCI 148 **
R.e. HoxU FCQRCVEFIRDKASGRKIFSISHRGPESRIEID--AELANAMPPEQVKEA 194 R.o. HoxU FCQRCVEFVRDKATGKKIFSISNRGGDSRIEID--ADLANAMPPEQVREA 194 T.r. Hox2U LCELCVRASRDHD-GKRVFAISGRGLESHLVIDSHSGLLGDSSFAATDKA 195 Synco. HoxU LCTRCVRVC-DEIEGAHVWDVSNRGGESKIVSGLNQPWGAVDACTSCGKC 198 Syncy. HoxU LCTRCVRVC-DEIEGAHVWDVAYRGAECKIVSGLNQPWGTVDACTSCGKC 198 T.r. Hox1U LCTRCVRVC-DEIEGAHTWDVMGRGSDCRVITDMAQPWGESDTCTSCGKC 207 R.e. FdsA VCNRCVRAC-EETQGTFALTISGRGFDSRVSPGTSQSFMES-DCVSCGAC 222 T.th. Nqo3 HCKRCVRYF-EEVPGDEVLDFIERG-----VHTFIGTMDFGLPSGFSGNI 226 R.e. NuoG HCTRCVRFG-QEVAGVMELGMLGRGE----HSEITTFVGKTVDSELSGNM 193 * ** * **
R.e. HoxU VAICPVGTILE------------------------------KRVGYDDPI 214 R.o. HoxU VAICPVGTIIE------------------------------KRVGYDDPI 214 T.r. Hox2U AHVCPTGAILP------------------------------KGRGYETPI 215 Synco. HoxU VDACPTGSIFR------------------------------KGATVGSKL 218 Syncy. HoxU VDACPTGSIFH------------------------------KGETTAEKI 218 T.r. Hox1U VQVCPTGALVK------------------------------QGTSVGEMV 227 R.e. FdsA VQACPTATLTETSVIKFGQPSHSTVTTCAYCGVGCSFKAEMKGNKVVRMV 272 T.th. Nqo3 TDICPVGALLDLTAR-------------------------FRARNWEMEE 251 R.e. NuoG IDLCPVGALTSKPFR-------------------------YSARTWELAR 218 **R.e. HoxU GRRK-----------------------YEIQSVRAR--ALEGEDK----- 234 R.o. HoxU GRRK-----------------------YEIETVRAR--ALGGEEE----- 234 T.r. Hox2U GERL-----------------------YDREPISIVGDVRAHEEEVV--- 239 Synco. HoxU GDR------------------------QKLEFLITARTKGEWTR------ 238 Syncy. HoxU GDR------------------------RKVEFLATARKEKEWVR------ 238 T.r. Hox1U KDQ------------------------HFLPILARRRHSQ---------- 243 R.e. FdsA PYKDGKANEGHACVKGRFAWGYATHKDRILKPMIRAKITDPWREVSWEEA 322 T.th. Nqo3 TPTTCALCPVGCG---------ITADTRSGELLRIRAREVPEVNEIWICD 292 R.e. NuoG RKSVSPHDGLGAN---------LVVQTKNQRVMRVLPLENEDINECWISD 259
Abb. 25: Multipler Sequenzvergleich von HoxU aus R. eutropha mit Untereinheiten aus verwandten Hydrogenasen und mit dem N-terminalen Teil der Komplex I-Untereinheiten NuoG aus R. eutropha und Nqo3 aus T. thermophilus, sowie mit der FdsA-Untereinheit der NAD+-reduzierenden Formiat-Dehydrogenase aus R. eutropha. Cystein- und Histidinreste, die in der Koordination des [2Fe2S]-Clusters (schwarz) und den beiden [4Fe4S] Cluster (Rot und Blau) in Nqo3 beteiligt sind, sind hervorgehoben (Sazanov und Hinchliffe 2006). Abkürzungen: R.e., Ralstonia eutropha, R.o., Rhodococcus opacus, T.r., Thiocapsa roseopersicina; Syncy., Synechocystis PCC 6803; Synco., Synechococcus PCC 7002; T.th., Thermus thermophilus. Aminosäurereste, die in allen Proteinen konserviert sind, sind mit einem * gekennzeichnet.
Weiterhin wurden die Kofaktorenzusammensetzung und die Redoxeigenschaften des HoxFU-
Proteins durch UV-Vis-Spektroskopie analysiert (Abbildung 26). Für frisch isoliertes HoxFU-
Protein waren breite Schultern bei etwa 380 nm und 450 nm zu beobachten (Abbildung 26A),
die dem oxidierten FMN zugeordnet werden können (Zhao et al. 2001; Kohlstadt et al. 2008).
Zusätzliche Schultern bei 322/380 nm und 421/480 nm sind indikativ für das Vorhandensein
von [2Fe-2S]- bzw. [4Fe-4S]-Clustern (Ragan et al. 1982; Lippard und Berg 1994; Braun et
al. 1998). Auf Grundlage der UV-Vis-Analyse, der Kofaktorbestimmung sowie der
Homologie zu den Nqo1-, Nqo2- und Nqo3-Untereinheiten von Komplex I aus
T. thermophilus befinden sich im HoxFU-Modul sehr wahrscheinlich ein FMN-Molekül, ein
[2Fe-2S]-Cluster und drei [4Fe4S]-Cluster.
ERGEBNISSE 85
Abb. 26: UV-Vis-Spektren von isoliertem (as isolated) und reduziertem HoxFU. A zeigt das Spektrum der unbehandelten (4,8 μM) sowie der mit Dithionit (330 μM) reduzierten Probe. Peaks und Schultern sind durch Pfeile angedeutet (siehe Text für die Zuordnung). B zeigt das Differenzspektrum von der mit Dithionit reduzierten und der oxidierten Probe.
Nach Reduktion des HoxFU-Moduls mit Dithionit waren Schultern bei 553, 605 und 665 nm
(Abbildung 26B) zu beobachten, die Indizien sind für die neutral geladene Semichinon-
Radikal-Form des FMNs oder für „Charge Transfer“-Komplexe (Johnson und Srivastava
1993). Beiträge von [Fe-S]-Clustern sind nicht komplett auszuschließen. Allerdings sollten sie
aufgrund der niedrigen Extinktionskoeffizienten von reduzierten [2Fe-2S]- und [4Fe-4S]-
Clustern eher gering sein. Die zusätzlichen Signale bei 370, 388 und 399 nm können auf die
anionische Semichinonradikalform zurückgeführt werden (Massey und Palmer 1966;
Abramovitz und Massey 1976; Nöll 2008). Bislang wurde die neutral geladene
Semichinonform des Flavins weder für die native SH aus R. eutropha noch für das
Hydrogenase-Modul aus R. opacus beobachtet (Schneider et al. 1984). Dies deutet darauf hin,
dass dieser Redoxzustand nur im isolierten HoxFU-Protein bei niedrigen Potentialen
ausgebildet werden kann. Unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von
12.500 M-1 cm-1 für FMN bei 450 nm (der Wert repräsentiert den Durchschnitt der
Extinktionskoeffizienten für gebundenes FMN in verschiedenen Proteinen, die zwischen
10.500 und 15.400 M-1 cm-1 liegen) ergibt sich aus dem Differenz-Spektrum ein FMN-Gehalt
von 0,9 FMN pro HoxFU-Molekül. Dies belegt auch, dass das FMN in HoxFU quantitativ
durch Dithionit reduziert werden kann.
3.4.5 Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies
Es ist bekannt, dass Flavoenzyme wie Komplex I (Kussmaul und Hirst 2006) oder die native
SH reaktive Sauerstoffspezies wie z. B. Superoxid produzieren. Studien an der nativen SH
haben zuvor gezeigt, dass deren Produktion von Superoxid mit der gleichzeitigen
Inaktivierung des Enzyms korreliert (Schneider und Schlegel 1981). Daher sollte untersucht
werden, ob das Diaphorase-Modul ebenfalls Superoxid erzeugt.
Wellenlänge [nm]
300 400 500 600 700
-0,04
0,00
0,04
0,08
300 400 500 600 7000,0
0,1
0,2
0,3
Abs
orpt
ions
diffe
renz
A BA
bsor
ptio
n 553388
399
370605
665
480
450421
380
322
86 ERGEBNISSE
Für die Quantifizierung der Superoxidproduktion durch HoxFU mit NADH und O2 wurde ein
etablierter Assay eingesetzt, der die superoxidabhängige Oxidation von Hydroxylamin zu
Nitrit nutzt (Schneider und Schlegel 1981). Um die FMN-Freisetzung durch HoxFU aufgrund
hoher NADH-Konzentrationen zu vermeiden, wurden die Messungen in Gegenwart von
25 μM NADH durchgeführt, was deutlich unterhalb des KM-Wertes liegt (Kapitel 3.4.3). Das
HoxFU-Modul produzierte in Gegenwart von 300 μM O2 53,5 nmol mg-1 x min-1 Superoxid
(Tabelle 11). Dies entspricht einer Umsatzrate von 5,9 min-1 und ist etwa 10-fach höher als
die entsprechende Umsatzrate der nativen SH (0,5 min-1) (Schneider und Schlegel 1981). Die
HoxFU-vermittelte O2-Reduktions Aktivität war allerdings mehr als 6500-fach geringer als
die BV-Reduktionsaktivität (349 μmol x min-1 x mg-1). In O2-gesättigtem Puffer (1,4 mM O2)
erhöhte sich die Superoxid-Produktion um das 8- bis 9-Fache. Die Zugabe von
Superoxiddismutase führte zu einer starken Erniedrigung der Superoxid-Produktion und
bestätigte somit die Spezifität des Tests (siehe Tabelle 11). Aufgrund der gemessenen
Superoxid-Umsatzraten kann davon ausgegangen werden, dass HoxFU die Hauptquelle der
Superoxid-Produktion des nativen Enzyms ist.
Tabelle 11: NADH-vermittelte Produktion von Superoxid durch HoxFU in Gegenwart von O2a
Superoxid Produktion
O2-Konzentration im
Reaktionsansatz [μM]
Spezifische Aktivität
[nmol x mg-1 x min-1]
Umsatzrate
[min-1]
300 μM (luftgesättigt) 53,5 ± 7,4 5,9 ± 0,8
1428 μM (100 % O2) 465,0 ± 23,9 51,2 ± 2,6
1428 μM (100 % O2)
+ 650 Units SODb 13,0 ± 4,9 1,4 ± 0,5 aHoxFU (4,9 pmol) wurde mit 25 μM NADH in zwei verschiedenen O2-Konzentrationen bei 25°C inkubiert. Superoxid-Produktion wurde spektrophotometrisch auf der Basis der Hydroxylamin Oxidation gemessen. Eine Einheit (Unit) von Superoxiddismutase (SOD) ist definiert als die Menge, die von SOD erforderlich ist, um die Rate der Xanthinoxidase-vermittelten Reduktion von Cytochrom c um 50 % zu hemmen. Die Werte stellen das arithmetische Mittel und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten dar.
3.4.6 Elektrochemische Untersuchung des HoxFU Moduls
Die katalytischen Eigenschaften des Diaphorase-Moduls wurden mittels Proteinfilm-
Voltametrie in Zusammenarbeit mit Dr. Zul Idris und Dr. Kylie Vincent am Department of
Chemistry/ Inorganic Chemistry Labratory der Universität Oxford charakterisiert. Es sollten
Fragen zur katalytischen Präferenz („Bias“), zur Inhibition durch die Endprodukte und zur
Sauerstofftoleranz geklärt werden.
ERGEBNISSE 87
3.4.7 Katalytische Präferenz ( „Bias“) des Diaphorase Moduls
Das Diaphorase-Modul kann sowohl die NAD+-Reduktion als auch die NADH-Oxidation
katalysieren (Abbildung 27). Die Elektrode wurde dabei mit 2500 rpm (Umdrehungen per
Minute) gedreht, um die effiziente Versorgung des Proteins mit Substrat sowie die rasche
Entfernung von Produkten von der Elektrodenoberfläche zu gewährleisten. Für die nicht mit
Protein beladene Elektrode wurde in Gegenwart von NAD+ und NADH über dem
experimentellen Potentialbereich von -600 bis +250 mV kein faradayscher Strom beobachtet
(Abbildung 27). Demnach werden NAD+ und NADH unter den Versuchsbedingungen nicht
direkt über die Elektrode reduziert bzw. oxidiert.
Die Untersuchung des auf der Elektrode immobilisierten HoxFU-Proteins wurde in
Gegenwart verschiedener Mischungsverhältnisse von NAD+ und NADH vorgenommen. Die
Gsamtkonzentration beider Pyridinnukleotid-Formen lag dabei bei 2 mM, was in etwa der
physiologischen Konzentrationen von NAD+ und NADH im Cytoplasma von E. coli
entspricht (Bennett et al. 2009). In Gegenwart von 2 mM NAD+ startete die HoxFU-
vermittelte Reduktion von NAD+ bei etwa -280 mV und erreichte bei -550 mV ihr Maximum
(Abbildung 22A). Die Oxidation von NADH (in Gegenwart von 2 mM NADH), begann bei
ca. -450 mV (Abbildung 27B) und stieg dann bis +300 mV kontinuierlich an. Der Rückgang
der katalytischen Ströme zwischen dem jeweils ersten und zweiten Messzyklus (Abbildung
27A, B) liegt vermutlich an der langsamen Dissoziation des Proteinfilms von der Elektrode,
könnte aber auch auf Protein-Denaturierung oder Verlust der Aktivität durch Freisetzung des
FMN-Kofaktors zurückzuführen sein.
88 ERGEBNISSE
Abb. 27: Katalytische Präferenz des HoxFU-Moduls. Zyklische Voltammogramme (CV) für eine HoxFU-modifizierte Elektrode in Gegenwart verschiedener Verhältnisse von NAD+ und NADH im Reaktionspuffer. A: 2 mM NAD+ B: 2 mM NADH, C: Konzentrationen wie angegeben. In A und B ist der erste Zyklus schwarz und der zweite grau gekennzeichnet. Weitere Bedingungen: Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 8,0) 30 °C, "Scan"-Rate 10 mV/s, Elektrodenrotation: 2500 min-1, weitere Details im Text. In Teilabbildung C zeigt der graue Balken den Potentialbereich für E(2H+/H2) für H2-Konzentrationen zwischen 100 nM und 10 μM H2 bei pH 8,0 und 30 °C . Die zyklische Voltammogramme in A und C wurden bei -440 mV gestartet, in B bei -550 mV. Das Potential wurde zunächst in Richtung positiver Werte verändert. D: Die Stromstärke bei 140 mV ober- und oberhalb von E(NAD+/NADH) wurde ins Verhältnis zur Substratkonzentrationen gesetzt (Gesamtkonzentration für NAD+ und NADH: 2 mM)
Abbildung 27C zeigt Voltammogramme, die mit verschiedenen NAD+-NADH-Mischungen
aufgenommen wurden. In allen Fällen schneidet das Signal des katalytischen Stroms die
Stromstärkeachse in der Nähe des thermodynamischen Potentials für E(NAD+/NADH)
(grauer Balken, mit jeder Dekadenveränderung in der [NAD+/NADH]-Konzentration
verschiebt sich das Potential um ~30 mV), was auf ein lediglich minimales Überpotential
hindeutet. Die thermodynamisch effiziente Katalyse von NAD+ -Reduktion und NADH-
Oxidation im HoxFU-Modul optimiert die treibenden Kräfte für die Kopplung dieser
Reaktionen mit der H2-Oxidation bzw. H+-Reduktion im Hydrogenase-Modul des nativen
Enzyms. Jedes Voltammogramm in Abbildung 27C wurde mit einem neuen HoxFU-
Proteinfilm aufgenommen. Variationen in der Proteinbeschichtung der Elektrode sorgen
ERGEBNISSE 89
dafür, dass die Stärke des Stroms kein verlässlicher Indikator für die absolute Aktivität bei der
jeweiligen Substratkonzentration ist. Um die katalytische Präferenz („Bias“) des Enzyms bei
unterschiedlichen NAD+/NADH-Konzentrationen zu bestimmen, wurde daher der relative
Strom als Verhältnis aus NAD+-Reduktion und NADH-Oxidation jeweils 140 mV oberhalb
und unterhalb des Null-Strom-Potentials bestimmt. Bei allen untersuchten NAD+/NADH-
Verhältnissen war die NAD+-Reduktion höher als die NADH-Oxidation. Demnach liegt die
katalytische Präferenz („Bias“) des HoxFU-Moduls der SH auf Seiten der NADH-Produktion. .
3.4.8 Das HoxFU Modul setzt in Abwesenheit von Substrat FMN frei
Zyklische Voltammogramme des HoxFU-Moduls, die in Abwesenheit von Substrat
(NAD+/NADH) aufgenommen wurden, zeigten eine markante Erhöhung des Stroms bei etwa
-280 mV. Die gleiche Beobachtung wurde für eine unbeladene Elektrode in Gegenwart von
2 μM FMN gemacht, jedoch nicht für eine mit HoxFU beladene Elektrode in Anwesenheit
von NAD+ und/oder NADH (Abbildung 28). Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass die
Signale von freigesetztem FMN stammen, das das HoxFU-Modul infolge der Reduktion
verlassen hat und auf der Elektrodenoberfläche adsorbierte. Dies steht in Einklang mit der
Freisetzung von FMN durch das in Lösung befindliche HoxFU-Protein nach Reduktion mit
NADH (Kapitel 3.4.3).
Abb. 28: Zyklische Voltammogramme für eine PGE-Elektrode mit 2 μM FMN (schwarz) und R. eutropha HoxFU (grau). Beide wurden bei 100 mV/ s in einer Lösung von 50 mM Tris-HCl pH 8,0-Puffer aufgezeichnet.
3.4.9 Inaktivierung von HoxFU bei niedrigen Potentialen
Wurde das Potential während der zyklischen Voltammetrie nur langsam geändert (1 mV/s), so
führte die NAD+-Reduktion bei niedrigen Potentialen zu einem irreversiblen Verlust der
Enzymaktivität (Abbildung 29).
90 ERGEBNISSE
Abb. 29: Irreversible Inaktivierung von HoxFU bei niedrigen Potentialen. Die Scan-Rate betrug 1 mV/s, die Elektrodenrotation 2500 rpm in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 30 °C. Der erste Zyklus ist als dicke, schwarze Linie gezeigt, der zweite als dünne, graue Linie. Die Pfeile zeigen die Richtung der Potentialveränderung. Der Einschub in A zeigt ein zyklisches Voltammogramm, bei dem bereits bei -0,4 V wieder zu höherem Potential verändert wurde.
Dieser Effekt wird entweder durch Dissoziation des Proteins von der Elektrode oder durch
Protein-Denaturierung hervorgerufen und ist bei geringen NAD+-Konzentrationen besonders
ausgeprägt (Abbildung 29B). Hier war eine deutliche Verminderung des Stroms, d.h. der
HoxFU-Aktivität, bei Potentialen niedriger als -0,4 V zu beobachten. Dass diese Inaktivierung
nur bei niedrigen Potentialen auftritt, zeigt das zyklische Voltammogramm, bei dem das
Potential bereits bei -400 mV wieder in positive Richtung verändert wurde (Abbildung 29A,
Einschub).
3.4.10 Affinität des HoxFU Moduls für NAD(H)
Mit Hilfe von elektrochemischen Experimenten wurden die KM-Werte für NADH und NAD+
bestimmt. Für die KM-Bestimmung für NADH wurde das Potential der mit HoxFU
beschichteten Elektrode auf +262 mV eingestellt, die NADH-Konzentration im
Reaktionsraum variiert und der resultierende Katalysestrom gemessen. Der aus den
Messdaten erstellte Hanes/Woolf-Plot ergab einen KM-Wert für NADH von 58 ± 18 μM
(Abbildung 30A) der vergleichbar ist mit dem Wert von 56 μM, der aus den mit BV
durchgeführten Aktivitätsmessungen ermittelt wurde (Kapitel 3.4.3). Zur Bestimmung des
KM(NAD+) wurde in einem analogen Experiment das Elektrodenpotential bei -412 mV
gehalten und die Konzentration von NAD+ verändert. Aus diesem Experiment ergab sich ein
KM(NAD+)-Wert von 197 ± 28 μM (Abbildung 30B).
ERGEBNISSE 91
Abb. 30: KM-Wert-Bestimmung für NAD(H) mittels Elektrochemie. A: Die NADH-Oxidation wurde bei +262 mV und verschiedenen NADH-Konzentrationen verfolgt. B: Die NAD+-Reduktion wurde bei -412 mV und verschiedenen NAD+-Konzentrationen verfolgt Weitere Bedingungen: Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 8,0), 30 °C, Elektrodendrehrate: 2500 rpm. Die Einschübe zeigen Hanes/Woolf-Auftragungen zur Bestimmung der KM -Werte; Werte in (B) wurden korrigiert für einen nicht-faradayischen Strom, der bei Abwesenheit von Substrat auftrat.
3.4.11 Endproduktinhibition von HoxFU durch NAD(H)
Wird die Diaphorase-Aktivität von HoxFU durch die Endprodukte inhibiert? Dafür wurde das
jeweilige Produkt (NAD+ oder NADH) während der HoxFU-vermittelten NADH-Oxidation
bzw. NAD+-Reduktion hinzugegeben. Die Ergebnisse in Abbildung 31A zeigen, dass die
HoxFU-vermittelte NADH-Oxidation durch das Produkt NAD+ gehemmt wird. Zuerst wurde
NADH in einer Konzentration von 50 μM hinzugegeben und der resultierende Strom
gemessen. Dies erfolgte, um die Ergebnisse, die mit verschiedenen Proteinfilmen erzielt
wurden, später zu normalisieren. Durch eine weitere Injektion wurde die NADH-
Konzentration auf 100 μM angehoben, um die Inhibition durch NAD+ bei der Anwesenheit
von 100μM NADH zu verfolgen. Danach erfolgten Injektionen verschiedener Mengen einer
NAD+-Stammlösung (100 mM NAD+, 100 μM NADH).
92 ERGEBNISSE
Abb. 31: Produkthemmung des HoxFU-Moduls. Die NADH-Oxidation wurde bei -62 mV (A) und NAD+-Reduktion bei -412 mV (C) und 50 μM und 100 μM NAD(H) verfolgt. Verschiedene Konzentrationen von NAD+ und NADH wurden zu dem Reaktionsansatz hinzugegeben und die HoxFU-vermittelte Aktivität bestimmt (siehe Text für Details). Analoge Experimente für verschiedene Substratkonzentration von NAD+ und NADH wurden durchgeführt und Dixon-Plots für die KI Bestimmung (Abbildungen B und D) erstellt. Die Experimente wurden bei 30 °C mit einer rotierenden Elektrode (2500 Umdrehungen per Minute) durchgeführt.
Dies führte jeweils zu einem definierten Rückgang des Stroms. In dem Fall, dass das HoxFU-
Protein keiner Produktinhibition unterliegt, sollte die Zugabe NAD+ bei einem konstanten
Potential lediglich zu einem geringen Abfall des katalytischen Stroms führen, da sich die
treibende Kraft für die NADH-Oxidation in Bezug auf E (NAD+/NADH) leicht erniedrigt.
Die beobachteten Stromabfälle nach jedem Hinzufügen von NAD+ waren allerdings zu groß,
um nur durch Änderung in der treibenden Kraft erklärt werden zu können. Daraus folgend
wurde die Inhibitionskonstante für NAD+ (KI (NAD+) bestimmt, indem das Experiment mit
verschiedenen NADH-NAD+-Verhältnissen wiederholt wurde. Die resultierenden Ströme
wurden durch den Strom bei 50 μM NADH dividiert und dadurch normalisiert. Die
Auswertung über einen „Dixon Plot“ ergab einen KI für NAD+ von ca. 0,1-0,3 mM
(Abbildung 31B). Analoge Experimente zur Inhibition der NAD+-Reduktion ergaben einen
KI (NADH) von ca. 0,2-0,3 mM (Abbildung 31CD).
ERGEBNISSE 93
3.4.12 Die Sauerstofftoleranz des Diaphorase Moduls
Um die Sauerstofftoleranz des HoxFU-Moduls zu untersuchen, wurde zuerst die NADH-
Reduktionsrichtung betrachtet (Abbildung 32A). Um die direkte Reduktion von O2 an der
Graphit-Elektrode zu vermeiden, wurde die NADH-Reduktion bei einem Potential von
+243 mV verfolgt. In Gegenwart von 2 mM NADH wurde ein langsamer Verlust des Stromes
beobachtet, der durch Instabilität des Enzymfilms erklärbar ist.
Abb. 32: Sauerstofftoleranz des HoxFU-Moduls. A: Die Sauerstofftoleranz der NADH-Oxidation wurde bei einem Potential von +243 mV getestet. Nach 25 s wurde Sauerstoff gesättigter Puffer hinzugegeben und die Enzymaktivität verfolgt. B-D: Tests zur Sauerstofftoleranz der NAD+-Reduktion. B: Inhibition der NAD+-Reduktion durch Injektionen von ADP-Ribose in Abwesenheit von Sauerstoff und bei -412 mV . C zeigt O2-Reduktion durch eine unmodifizierte Elektrode in Gegenwart von ADP-Ribose (bei -412 mV) und bestätigt, dass Injektionen von ADP-Ribose keinen Einfluss auf die O2-Reduktion haben. D zeigt ein analoges Experiment mit einem Proteinfilm von HoxFU. Bei den Experimenten wurde 0,14 mM NAD+ und 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,0 verwendet.
Nach 25 s wurde O2-gesättigter Puffer mit 2 mM NADH in die Zelle injiziert und so die O2-
Konzentration auf ca. 0,33 mM eingestellt. Es wurde keine Erniedrigung des katalytischen
Stroms festgestellt, was darauf hinweist, dass die von HoxFU katalysierte NADH-Oxidation
nicht durch O2 gehemmt wird. Anschließend wurde die Empfindlichkeit der NAD+-
Reduktionsaktivität gegenüber O2 getestet, wobei eine von Armstrong und Mitarbeitern
etablierte Methode verwendet wurde. Dabei wird ein Inhibitor eingesetzt, um die
Enzymaktivität von der Sauerstoffreduktion zu unterscheiden, die bei einer unmodifizierten
Gaphitelektrode bei einem Potenital von -412 mV bereits erheblich ist. Nur die
94 ERGEBNISSE
Enzymaktivität wird durch den Inhibitor gehemmt, die Sauerstoffreduktion auf der
Gaphitelektrode bleibt jedoch unverändert. (Goldet et al. 2008). Die Abbildung 32B zeigt,
dass ADP-Ribose ein Inhibitor der NAD+-Reduktion durch HoxFU ist. Auf die O2-Reduktion
einer unmodifizierten Elektrode hat ADP-Ribose keinen Einfluss, siehe Abbildung 32C. Bei
einem analogen Experiment mit einem Proteinfilm von HoxFU in Gegenwart von Sauerstoff
führten Injektionen von ADP-Ribose nun zu einem Abfall der Stromstärke. Dies bestätigt,
dass HoxFU in Gegenwart von O2 aktiv ist, also durch ADP-Ribose gehemmt werden kann
und mit einem elektrokatalytischen NAD+-Reduktionsstrom zu dem Gesamtstrom beiträgt.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass das HoxFU-Modul in Gegenwart von O2 sowohl
die NADH-Oxidation als auch die NAD+-Reduktion katalysiert. Beide Katalyserichtungen
unterliegen der Produktinhibition durch NAD+ bzw. NADH.
3.5 Untersuchungen zur Sauerstofftoleranz der SH
In dem Kapitel 3.3.9 wurde gezeigt, dass das [NiFe]-Zentrum der SH reversibel durch O2
inaktiviert wird. Oxidiertes SH-Enzym kann durch Zugabe von NADH reaktiviert werden
(Schneider et al. 1976). Die Inkubation von katalytisch aktivem HoxHY-Protein mit O2 führte
zu einer langsamen Inaktivierung. Durch Anlegen eines niedrigen Potentials konnte die
Aktivität jedoch in Sekundenschnelle wiederhergestellt werden (Kapitel 3.3.9). Des Weiteren
ist bekannt, dass die SH neben Wasserstoff auch Sauerstoff reduzieren kann (Schneider und
Schlegel 1976). Von Cracknell und Mitarbeitern wurde die Hypothese aufgestellt, dass
sauerstofftolerante Hydrogenasen im Rahmen der H2-Oxidation einen Teil der Elektronen für
die Reduktion von O2 verwenden und bei diesem Prozess kontinuierlich Wasser produziert
wird (Cracknell et al. 2009). Bislang konnte diese Hypothese noch nicht experimentell
überprüft werden. Die SH bietet hierfür ein hervorragendes Testsystem, da die SH 100% aktiv
in ihrer H2-abhängigen NAD+-Reduktionsaktivität in Gegenwart von atmosphärischen
Sauerstoffkonzentrationen bleibt (Schneider 1981). Außerdem repräsentiert die SH ungefähr
5 % der cytoplasmatische Proteine in R. eutropha und kann in großen Mengen gereinigt
werden (Kapitel 3.2).
3.5.1 Eingesetzte Derivate für die Experimente zur Sauerstofftoleranz der SH
Um die Produkte der reduktiven Reaktivierung des oxidierten aktiven Zentrums zu
identifizieren, wurde zum einen die gereinigte, native heterohexamere SH eingesetzt. Für die
Fragestellung, ob die H2-Oxidation für die O2-Reduktion notwendig ist, wurde das SHI64A-
Derivat verwendet, das einen Austausch von Isoleucin zu Alanin an Position 64 der HoxH-
Untereinheit besitzt. SHI64A zeigte nur Spuren von H2-Oxidation- und H/D-Austausch-
Aktivität, jedoch weist es ein komplett assembliertes [NiFe]-Zentrum auf (Burgdorf et al.
ERGEBNISSE 95
2002; Burgdorf et al. 2005). Für die Produktion von SHI64A wurde ein Plasmid verwendet,
welches die Gene hoxFUYWIhypA2B2F2CDEXA unter dem nativen SH-Promoter trägt. Das
hoxH-Gen trägt eine Mutation, die zur Synthese von HoxHI64A führt. Zudem codiert das
Plasmid eine mit einem N-terminalen Strep-tag-II versehene HoxF-Untereinheit. Die
Kultivierung des trankonjuganten Stammes und die Reinigung des SHI64A–Proteins erfolgte
analog zum nativen Enzym. Aus 10 g Zellen (Nassgewicht) wurden ungefähr 60 mg SHI64A
gereinigt mit einer spezifischen H2-Oxidationsaktivität von lediglich 0,38 ± 0,01 U/mg
Protein, wobei NAD+ als Elektronenakzeptor diente. Die NADH:Benzylviologen (BV)-
Oxidoreduktase-Aktivität lag dagegen mit 91,9 ± 4,4 U/mg auf dem Niveau des
Wildtypenzyms (104,2 ± 6,2 U/mg). Die deutet darauf hin, dass der Aminosäureaustausch im
SHI64A-Derivat zwar die H2-Oxidation nahezu zum Erliegen bringt, das HoxFU-Diaphorase-
Modul jedoch funktionell ist. Als weiteres SH-Derivat zur Analyse der O2-Toleranz kam das
isolierte HoxFU-Diaphorase-Modul zum Einsatz, dessen Eigenschaften in Kapitel 3.4
beschrieben sind.
3.5.2 Reduktionsmittel und FMN erhöhen die SH Aktivität
Um eine möglichst hohe und stabile SH-Aktivität zu erreichen, wurden verschiedene
redoxaktive Zusätze im Reaktionsansatz für die SH-Aktivitätsmessungen getestet. Wie schon
zuvor in der Literatur beschrieben wurde (Schneider und Schlegel 1978), führte die Zugabe
von FMN zur einer Erhöhung der wasserstoffabhängigen NAD+-Reduktionsaktivität um den
Faktor zwei (Tabelle 12). Außerdem wurde festgestellt, dass die Reduktionsmittel DTT oder
TCEP-HCl die Aktivität der gereinigten SH ebenfalls um den Faktor zwei erhöhten (Tabelle
12).
Tabelle 12: Positiver Effekt von FMN und DTT/TCEP auf die wasserstoffabhängige NAD+-Reduktion (U/ mg) der SH. Die Konzentration von FMN, DTT und TCEP betrug 1 μM, 1 mM bzw. 1 mM. Die Reaktion wurde mit 2-5 μg SH gestartet.
Ohne Zusatz FMN TCEPa DTTa FMN/ TCEP FMN/ DTT
50,4 ± 6,6 105,3 ± 6,0 107,8 ± 0,6 93,3 ± 4,1 111,0 ± 4,4 131,6 ± 14,7a Ohne H2 findet durch die Reduktionsmittel TCEP oder DTT keine SH-vermittelte NAD+-Reduktion statt. Die Werte repräsentieren das arithmetische Mittel sowie Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten.
Außerdem war die lineare Phase der Enzymreaktion verlängert, so dass NAD+ vollständig zu
NADH reduziert werden konnte. Ohne TCEP oder DTT betrug die lineare Phase 30- 90 s und
nur ungefähr 50% der eingesetzten NAD+-Moleküle wurden zu NADH umgesetzt. Allerdings
ergab der kombinierte Einsatz von FMN und Reduktionsmitteln keinen additiven Effekt, was
auf den gleichen Wirkungsort hindeutet. Die stimulierende Wirkung von FMN und DTT war
nur im Falle der gereinigten SH zu beobachten; die SH-Aktivität in permeabilisierten Zellen
96 ERGEBNISSE
und löslichen Extrakten wurde nicht beeinflusst. Sofern nicht anderweitig beschrieben, wurde
in den nachfolgenden Experimenten TCEP-HCl (1 mM), das gegenüber Luftoxidation
unempfindlich ist, in Kombination mit FMN (1 μM) eingesetzt.
3.5.3 Sauerstofftoleranz der nativen SH
Hydrogenase-Aktivitätsmessungen werden meist mit artifiziellen Elektronenakzeptoren wie
Methylenblau oder Methylviologen durchgeführt, deren reduzierte Formen leicht durch O2
reoxidiert werden können. Untersuchungen zur Sauerstofftoleranz der nativen SH mit NAD+
als Elektronenakzeptor haben den Vorteil, dass NADH nicht durch Sauerstoff reoxidiert wird
und dadurch Experimente in Gegenwart von Sauerstoff leicht durchgeführt werden können.
Um den Einfluss von Sauerstoff auf die SH während der Katalyse zu testen, wurde die
wasserstoffabhängige NAD+-Reduktionsaktivität in der Gegenwart von verschiedenen
Sauerstoffkonzentrationen gemessen. Tabelle 13: SH-Aktivität in der Anwesenheit von Sauerstoff. Für jeden Ansatz wurden verschiedene Anteile von mit Sauerstoff gesättigtem Puffer eingesetzt und diese mit Wasserstoff gesättigtem Puffer aufgefüllt. Die Gasphase enthielt entsprechende Gasmixturen.
O2 [% v/v] O2 [mM] SH-Aktivität [%]
0 0 100
20 0,23 98,4
40 0,47 84,5
60 0,70 81,5
80 0,93 79,0
Die wasserstoffabhängige NAD+-Reduktionsaktivität in Abwesenheit von O2 wurde als 100 % gesetzt. Die maximalen Raten wurden nach einer 0,5-1,5 minütigen lag-Phase erreicht und blieben für 1-2 min konstant.
Nach dem Equilibrieren des Reaktionsansatzes auf eine O2-Konzentration von 20 % (v/v)
wurde keine signifikante Inhibition der H2-Oxidation detektiert. Die H2-Umsatzrate blieb in
Abwesenheit und Gegenwart von 20% O2 konstant bei 480 s-1. Eine Erhöhung der
Sauerstoffkonzentration auf 40, 60 bzw. 80 % führte zu einer Erniedrigung der
Wasserstoffoxidationsaktivität um lediglich 15, 19 und 21% (Tabelle 13), was im Einklang
mit Literaturdaten steht (Schneider und Schlegel 1981). Bei O2-Konzentrationen von 40 %
und größer verlängerte sich die die lag-Phase von ca. 0,5 min auf 1,5 min.
3.5.4 Der Sauerstoffreduktions Aktivität der SH
Die O2-Reduktionsaktivität der SH wurde mit einer Clark-Elektrode quantifiziert. Im
Gegensatz zu den langen linearen H2-abhängigen NAD+-Reduktionsaktivitäten, sank die O2-
Reduktionsrate nach einigen Minuten. Um die kontinuierlich gemessenen O2-Reduktionsraten
mit den Punktmessungen der reduzierten Sauerstoffspezies zu vergleichen, wurde dieselbe
ERGEBNISSE 97
Zeitspanne für die Ratenbestimmungen gewählt (Abbildung 33). In Gegenwart von 40 % O2
zeigte das SHWT-Protein eine H2-abhängige O2-Reduktionaktivität von 109 ± 18,8 min-1
(Tabelle 14). Das Verhältnis zwischen den Umsatzraten der wasserstoffabhängigen NAD+-
Reduktion (22755 min-1) und Sauerstoffreduktion (109 min-1) lag bei 209:1, d. h., dass ein
Teil der Elektronen, die aus der H2-Oxidation gewonnen werden, für die Reduktion von
Sauerstoff verwendet werden.
Abb. 33: Vergleich der Superoxid-, Wasserstoffperoxid- und Wasser-Produktionsaktivität mit der O2-Reduktionsaktivität während der NADH-Oxidation (in Anwesenheit von FMN). Rauten stellen Superoxid-, Dreiecke Wasser- und Quadrate Wasserstoffperoxid-Stoffmengen dar. Die Sauerstoff-Stoffmenge wurde kontinuierlich gemessen und ist als schwarze Linie gezeigt. Die produzierte Stoffmenge der reduzierten Sauerstoffspezies wurde normiert auf die eingesetzte SH-Proteinmenge, die für die O2-Reduktionmessung (m = 39 g SHwt) eingesetzt wurde. Die NADH-abhängige O2-Reduktionsaktivität zeigte eine kontinuierliche, zeitliche Abnahme.
Mit NADH als Elektronendonor zeigten die SH-Varianten SHwt, SHI64A und SHFU
Sauerstoffreduktionsaktivitäten von 94 ± 17, 130 ± 5 und 31 ± 2min-1. Im Gegensatz dazu
betrug die NADH-abhängige H2-Produktionsrate nur 6,8 min-1 und lag somit in der
Größenordnung früherer Studien (Schneider und Schlegel 1976). Die H2-Produktionsrate ist
also um den Faktor 3300 geringer als die H2-Oxidationsrate der SH.
3.5.5 Superoxid Produktion durch die SH
Um zu ermitteln, welche Produkte im Rahmen der O2-Reduktion der SH entstehen, wurde
zunächst die Produktion von Superoxid überprüft. In den nachfolgenden Experimenten wurde
eine initiale Sauerstoffkonzentration von 40 % verwendet. Die Bildung von Superoxid wurde
in einem etablierten Reaktionsansatz verfolgt, der die superoxidabhängige Oxidation von
Hydroxylamin ausnutzt und bei der das gebildete Nitrit colorimetrisch bestimmt wird
Zeit [min]0 2 4 6 8 10 12 14 16
O2-
, H2O
2 [n
mol
]
0
5
10
15
20
25
30
H2O
[nm
ol]
0
50
100
150
200
250
300
O2
[nm
ol]
0650
700
750
800
850
900
950
1000SHWT
O 2- , H
2O2
[nmol]
98 ERGEBNISSE
(Schneider und Schlegel 1981). Im Falle der Verwendung von H2 als Elektronendonor und
NAD+ sowie O2 als Elektronenakzeptoren wurde für das SHwt-Protein eine
Superoxidproduktionsrate von 1,1 min-1 ermittelt (Tabelle 14). Diese liegt in der gleichen
Größenordnung wie der Literaturwert von 0,5 min-1 (Schneider und Schlegel 1981).
Tabelle 14. Netto O2-Reduktionsraten im Vergleich zu den individuellen Produktionsraten für Superoxid, Wasserstoffperoxid und Wasser für SH-Varianten unter verschiedenen Reaktionsbedingungen.
Protein
O2-Reduktionsrate (min-1) a
O2--
Produktionsrate (min-1)
H2O2-Produktionsrate (min-1)
H218O-
Produktionsrate (min-1)
detektierte Sauerstoffatome [%]b
H2 NAD+/ (18)O2 SHwt 109 ± 19 1,1 ± 0,1 55 ± 7 122 ± 8 107
SHI64A < 10 0,25 ± 0,02 < 0,04 < 0,1 - NADH H+/ (18)O2 SHwt 94 ± 17 0,45 ± 0,11 5,8 ± 0,6 116 ± 9 68
SHI64A 130 ± 5 0,31 ± 0,04 16 ± 5 124 ± 22 82
SHFU 31 ± 2 0,46 ± 0,04 0,2 ± 0,1 67 ± 10 110 a Reduktions-/Produktionsraten wurden in Anwesenheit von 40 % O2 gemessen, wie in Material und Methoden beschrieben. Die Werte entsprechen arithmetischen Mitteln und entsprechende. Keine H2
18O Produktion wird mit 16O2 anstatt mit 18O2 detektiert. Ebenso wurde keine H2
18O Produktion in der Abwesenheit von NADH gemessen. b Angegeben ist der Anteil der in den Produkten gefundenen Sauerstoffatome (wurde aus den Mittelwerten bestimmt) im Verhältnis zur Gesamtheit der reduzierten Sauerstoffatome.
Das SHI64A-Protein zeigte mit 0,25 ± 0,02 eine vierfach geringere Rate als das Wildtyp-
Protein. Für die reverse Reaktion, d. h. die NADH-abhängige O2-Reduktion, wurden für die
SH-Varianten SHWT, SHFU und SHI64A Superoxid Produktionsraten von 0,31, 0,46 und
0,45 min-1 gemessen (siehe Tabelle 14). Bemerkenswerterweise waren diese Werte etwa
30-mal niedriger als die in Kapitel 3.4.5 beschriebene Superoxid-Produktionsrate des SHFU-
Moduls. Während bei den in Kapitel 3.4.5 beschriebenen Superoxidproduktionsmessungen
nur 25 μM NADH eingesetzt wurden, wurden hier 1000 μM eingesetzt. Diese Konzentration
ist weit höher als der KM-Wert des Diaphorase-Moduls (56 μM NADH). Das bedeutet, dass
im Fall der höheren NADH-Konzentration die NADH-Bindestelle häufiger durch das Substrat
NADH okkupiert ist und so Sauerstoff seltener durch Elektronen des reduzierten FMN
reduziert werden kann. Dies könnte die verminderte Superoxidproduktionsrate erklären. .
3.5.6 Produktion von Wasserstoffperoxid durch die SH
Die Superoxid-Produktionsrate des SHWT-Enzyms ist um zwei Größenordnungen kleiner als
die O2-Reduktions-Aktivität. Dies impliziert, dass andere reduzierte Sauerstoffspezies als
Hauptprodukte im Rahmen der O2-Reduktion freigesetzt werden. Deshalb wurde die
Fähigkeit der SH untersucht, Wasserstoffperoxid zu produzieren, das durch die Zwei-
Elektronen-Reduktion von Sauerstoff erzeugt wird. Die H2O2-Produktion wurde durch die
ERGEBNISSE 99
Meerrettich-Peroxidase-vermittelte Oxidation von AmplexTM Red quantifiziert. Die H2-
abhängige H2O2-Produktion des SHWT–Enzyms in Gegenwart von NAD+ und O2 betrug
267 mU/ mg. Dieser Wert entspricht einer Umsatzrate von 55 min-1, die etwa 50-mal höher
als die entsprechende Superoxidproduktionsrate ist (Tabelle 14). Es ist wichtig zu erwähnen,
dass Superoxid schnell mit einem weiteren Superoxidmolekül reagiert und zu
Wasserstoffperoxid zerfällt, so dass die Wasserstoffperoxidmessungen durch das Amplex
RedTM-System die Superoxidproduktion beinhalten (Kussmaul und Hirst 2006). Wie erwartet
zeigte die SHI64A-Variante im Falle der H2-Oxidation keine Wasserstoffperoxidproduktion in
nachweisbaren Mengen, was im Einklang mit der sehr niedrigen Hydrogenaseaktivität des
Enzyms (Kapitel 3.5.1) steht.
Die H2O2-Produktionsraten aller drei SH-Varianten wurden auch in der NADH-
Oxidationsrichtung gemessen (Tabelle 14). Für die SHWT- und SHI64A-Varianten wurden
Raten von 6 und 16 min-1 bestimmt, was zeigt, dass Wasserstoffperoxid auch durch reversen
Elektronenfluss erzeugt wird. Interessanterweise besaß die SHFU-Variante nur eine sehr
geringe H2O2-Produktionsrate von 0,2 min-1. Sie ist 29-fach geringer als die des
Wildtypenzyms und liegt damit in der Größenordnung der Superoxidproduktionsrate. Es ist
daher wahrscheinlich, dass die Wasserstoffperoxidproduktion auf den spontanen Zerfall des
im SHFU-Modul produzierten Superoxids zurückzuführen ist. Dies deutet umgekehrt darauf
hin, dass das Hydrogenase-Modul die Hauptquelle der H2O2-Produktion ist.
3.5.7 Wasserproduktion durch die SH
Unter den reduzierten Sauerstoffspezies ist Wasser eindeutig das am wenigsten schädliche
Produkt. Um zu testen, ob Wasser ein Produkt der O2-Reduktion der SH ist, wurde eine
zuverlässige Detektion und Quantifizierung von H218O als Produkt der Reduktion von 18O2
durch die SH etabliert. Hierfür wurde ein Reaktionsansatz mit einem Volumen von 30-100 μl
in ein gasdichtes Reaktionsgefäß (5,2 ml) verbracht. Der Ansatz enthielt 50-1000 μg SH und
1 mM NAD+; die verbliebene Gasphase wurde mit 40 % (v/v) 18O2 und 60 % (v/v) H2 gefüllt.
Bei Verwendung von NADH als Elektronendonor wurde die gleiche Enzymmenge mit
100 mM NADH unter einer Gasatmosphäre von 40 % 18O2 und 60 % N2 inkubiert. Zu
verschiedenen Zeitpunkten wurden jeweils 10 μl des Reaktionsansatzes entnommen und die
Reaktionsprodukte - wie in "Material und Methoden" - beschrieben massenspektrometrisch
erfasst. Mit reinem H218O als Standard ermöglicht diese Methode die zuverlässige Erkennung
von Konzentrationsänderungen von 1,8 mM H218O (siehe Abbildung 34) in Gegenwart von
111 mM H218O, die durchschnittlich in natürlichem Wasser vorhanden sind (Coplen 2002).
100 ERGEBNISSE
Abb. 34: H2
18O Produktion der SH im Laufe der H2-Oxidation in Gegenwart von 18O2. Eine Proteinmenge von 90 ug SHWT (Dreiecke) und SHI64A (Kreise) wurde in einem 100 μl Reaktionsansatz in einem geschlossenen Gefäß mit H2 und 18O2 inkubiert. Die H2
18O-Konzentration in der Reaktionsmischung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten durch Massenspektrometrie bestimmt (siehe Materialien und Methoden). Der Einschub zeigt die Kalibrierungsgerade mit H2
18O (R² = 0,9991).
Im Falle der H2-Oxidation in Gegenwart von NAD+ und 18O2 zeigte das SHWT-Enzym mit
0,60 ± 0,04 U pro mg Protein eine beträchtliche H218O-Produktion (Abbildung 34). Dieser
Wert entspricht einer Umsatzrate von 122 min-1 (Tabelle 13). Die Zuverlässigkeit und
Empfindlichkeit der Nachweismethode von H218O wurde durch den Einsatz der SHI64A-
Variante bestätigt, die in der H2-Oxidation beeinträchtigt ist und H218O in nicht
nachweisbaren Mengen produzierte (Abbildung 34). Dabei war die H218O-Produktionsrate der
Wildtyp-SH etwa 2,2-fach bzw. 110-fach höher als die entsprechenden Produktionsraten für
H2O2 und Superoxid.
Tabelle 15: Netto O2-Umsatzrate der Xanthin-Oxidase verglichen mit den jeweiligen Produktionsraten für Superoxid, Wasserstoffperoxid und Wasser.a
Netto-O2-Reduktionsrate
(mU/mg)
O2–-
Produktionsrate (mU/mg)
H2O2-Produktionsrate
(mU/mg)
H218O-
Produktionsrate (mU/mg)
504 ± 62 23 ± 4 265 ± 10 85 ± 4 a O2-Reduktion, Superoxidproduktion, Wasserstoffperoxid-Produktion und Wasser-Produktionsaktivitäten der Xanthinoxidase (aus Kuhmilch, Sigma) wurden wie in den Methoden zur SH beschrieben gemessen. Die Superoxid- und Wasserstoffperoxidmessungen wurden mit 30 μg/ml Xanthinoxidase und 3,3 mM Xanthin durchgeführt. Im Falle der H2O2-Produktionsmessungen wurde die Reaktion durch Ultrafiltration mit einem Microcon-Konzentrator (Ausschlussgröße 3 kDa, Merck Millipore, Deutschland) bei 4°C gestoppt. Der Durchfluss wurde anschließend hinsichtlich der Anwesenheit von H2O2 analysiert. Für die Wasserproduktionsmessungen wurden 732 μg Xanthin-Oxidase und 12,5 mM Xanthin (gesättigte Suspension) in 100 μl eingesetzt.
ERGEBNISSE 101
In einem weiteren Versuch wurde die NADH-vermittelte H218O-Produktion der SH-Varianten
in Gegenwart von 18O2 getestet. Für die SHwt- und SHI64A-Proteine wurden dabei mit
116 min-1 und 124 min-1 vergleichbare Umsatzraten ermittelt (Tabelle 14). Diese Raten sind
der des SHWT-Enzyms sehr ähnlich, die im Rahmen der H2-Oxidation in Gegenwart von
NAD+ und 18O2 gemessen wurden.
Das von der SH produzierte H218O könnte Anteile erhalten, die aus der thermischen
Zersetzung von Superoxid und H2O2 infolge der Messbedingungen (SH-Inaktivierung bei
100°C und Verdampfung des Reaktionsansatzes bei 160°C) entstehen. Allerdings war die
NADH-abhängige H218O-Produktionsrate der Wildtyp-SH etwa 20- bzw. 258-fach höher als
die entsprechenden Produktionsraten für H2O2 und Superoxid. Dieses Ergebnis zeigt, dass
H218O neben H2O2 das wichtigste Nebenprodukt im Zuge der H2-abhängigen NAD+-
Reduktion in Gegenwart von O2 ist. Um zu testen, ob der thermische Zerfall von H2O2 und
Superoxid während der H2O-Messung eine Rolle spielt, wurden die reduzierten
Sauerstoffspezies-Produktionsraten durch das etablierte, ROS-produzierende Enzym
Xanthinoxidase bestimmt (Tabelle 15). Die Wasserproduktionsrate war dreimal niedriger als
die gesamte ROS-Produktion. Dies deutet darauf hin, dass der thermische Zerfall der ROS
keine signifikante Rolle bei der Wasserdetektion spielt.
Um einen Hinweis auf den Ort der H218O-Freisetzung zu erlangen, wurde auch die SHFU-
Variante in die Messungen einbezogen. Tatsächlich zeigten alle drei SH-Varianten ähnliche
H218O-Produktionsaktivitäten (567, 607 und 686 μmol min-1 mg-1für SHWT, SHI64A und
SHFU). Werden jedoch die Unterschiede der molekularen Massen der eigesetzten Proteine
berücksichtigt (205 kDa für SHWT, SHI64A und 110 kDa für SHFU), besaß die SHFU-Variante
mit 67 min-1 etwa die halbe H218O-Produktionsrate des Wildtyp-Proteins (116 min-1). Diese
Ergebnisse legen nahe, dass die NADH-abhängige H218O-Produktion sowohl im
Hydrogenase- als auch im Diaphorase-Modul der SH erfolgt. Anschließend wurde die Menge
der reduzierten Sauerstoffatome infolger der O2-Reduktion mit der Anzahl der in den
Reduktionsprodukten gefundenen Sauerstoffatome bestimmt. Molekularer Sauerstoff,
Wasserstoffperoxid und Superoxid besitzen im Vergleich zu Wasser die doppelte Anzahl von
Sauerstoffatomen. Dies berücksichtigend wurden 68-100% der reduzierten Sauerstoffatome in
den Produkten detektiert (siehe Tabelle 14).
3.5.8 Orte der H2O2 und H2O Produktion in der SH
Die oben gezeigten Experimente deuten darauf hin, dass Wasserbildung als Folge der O2-
Reduktion in beiden SH-Modulen stattfindet. Die Superoxidproduktion wird offensichtlich
nahezu ausschließlich durch das Diaphorase-Modul katalysiert, während Wasserstoffperoxid
102 ERGEBNISSE
in erster Linie innerhalb des Hydrogenase-Moduls freigesetzt wird. Es ist bekannt, dass
reduzierte Flavine die Quelle für ROS einschließlich H2O2 sind (Massey 1994). Allerdings
enthielt gereinigtes SHWT-Enzym nur 1,00 ± 0,08 statt zwei FMN-Moleküle, und das
gereinigte Hydrogenase-Modul wies nur geringste Mengen von FMN auf (Kapitel 3.2.7 und
3.3.3). Um zu testen, ob das FMN-a-Molekül im Hydrogenase-Modul der SH für die Bildung
von Wasserstoffperoxid verantwortlich ist, wurde die NADH-abhängige H2O2-
Produktionsaktivität in Gegenwart und Abwesenheit von extern appliziertem FMN bestimmt. Tabelle 16: H2O2- und H2O-Produktion als Folge der NADH-abhängigen O2-Reduktion in An- bzw. Abwesenheit von extern appliziertem FMN.
Protein Netto-O2-Reduktion (min-1) H2O2-Produktion (min-1) H218O-Produktion (min-1)
SHWT -FMN 49 ± 10 14,2 ± 0,2 31,4 ± 7,0
SHWT +FMN 94 ± 17 5,8 ± 0,6 122 ± 8
Reduktions-/Produktionsraten wurden in Anwesenheit von 40 % O2 gemessen, wie in Material und Methoden beschrieben. Die Werte entsprechen den arithmetischen Mitteln von drei unabhängigen Experimenten. Ebenso sind Standardabweichungen angegeben.
Überraschenderweise sank die H2O2-Produktionsrate von 14,2 min-1 in Abwesenheit von
FMN auf 5,8 min-1 in Gegenwart von 1 μM FMN. Die Abnahme der H2O2-Produktionsrate in
Gegenwart von FMN wurde begleitet von einer signifikanten Zunahme der Produktionsrate
von H218O (Tabelle 16). Die O2-Reduktionsrate erhöhte sich in der Anwesenheit von
externem FMN auf den doppelten Wert (Tabelle 16). Diese Beobachtungen legen nahe, dass
die Anwesenheit von FMN-a das Produktionsverhältnis von H2O:H2O2 des Hydrogenase-
Moduls der SH in Richtung Wasser verschiebt.
3.6 Umwandlung der NAD+- in eine NADP+-Bindestelle
Für die rationale Mutagenese, wurde zunächst ein Homologiemodell der NAD+-Bindetasche
erstellt. Das Diaphorase-Modul der SH weist Ähnlichkeit zu Untereinheiten (Nqo1 und Nqo2)
des peripheren Teils von Komplex I aus Thermus thermophilus auf, dessen Kristallstruktur
bereits bekannt ist (Sazanov und Hinchliffe 2006; Berrisford und Sazanov 2009). Die
Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit bzw. -Identität von Nqo1 zu dem N-terminalen Bereich von
HoxF, der die NAD+-Bindestelle enthält, betragen dabei 55% bzw. 39%. Diese Struktur (pdb-
Zugangscode: 2FUG) diente als Vorbild für die Erstellung eines Homologiemodelles
(Abbildung 35). Das Modell wurde mit dem automatischen Modus des SWISS-MODEL-
Programms erstellt (Arnold et al. 2006). Der Qualitätsfaktor „Z-Score“ liegt mit -4.026 in
einem für Homologiemodelle, die knapp 400 Aminosäuren umfassen, vertretbaren Bereich
(Benkert et al. 2011). Das resultierende Homologiemodell für HoxF unterscheidet sich von
seinem Vorbild Nqo1 nur in einigen Schleifenregionen und kurzen Teilstücken von -Helices.
Dabei ist die NAD+-Bindetasche konserviert (siehe Abbildung 35A). Zur Verdeutlichung der
ERGEBNISSE 103
Substratbindung in der kombinierten FMN/NAD(H)-Bindestelle, die sich ihrerseits in einer
außergewöhnlichen „Rossmann“-Falte befindet (Sazanov und Hinchliffe 2006), wurden die
die kokristallisierten Kofaktoren aus der pdb-Struktur 3IAM übernommen sowie die
Wasserstoffbrücken zwischen NAD+ und der Proteinmatrix des Homologiemodell durch das
Programm Pymol berechnet (Abbildung 35BC). Es ist zu erkennen, dass der Isoalloxazin-
Ring des FMN den Nikotinamidring des NAD+ direkt überlagert und so eine
Hydridübertragung ermöglicht (Sazanov und Hinchliffe 2006). Bei der Bindung von NAD(H)
in die Bindetasche von HoxF interagiert der Tryptophanrest W336 des Proteins mit der
Carbonsäureamidgruppe von NAD(H), das Phenylalanin F361 durch „ -stacking“ mit dem
Adeninring und die glycinhaltige Schleife (Loop 221-224) mit den Phosphatgruppen von
NAD(H) (Sazanov und Hinchliffe 2006).
Abb. 35: Homologiemodell der NAD(H)/FMN-Bindestelle in HoxF. A: HoxF (gelb) wurde auf der Basis der Kristallstruktur von Nqo1 (blau, pdb: 2FUG) modelliert. B: Homologiemodell von HoxF mit den Kofaktoren NAD(H) und FMN (von pdb: 3IAM). Die Kohlenstoffatome des NADH sind magenta und die von FMN in türkis eingefärbt, Sauerstoffatome besitzen rote, Stickstoffatome blaue und Phosphoratome orange Farbe. Der [4Fe4S]-Cluster ist in roten (Fe) und gelben (S) Sphären darstellt. Die Proteinoberfläche ist grau dargestellt C: Vergrößerte Darstellung der NADH/FMN-Bindestelle mit den vermutlich an der NADH-Bindung beteiligten Aminosäuren (grün) (Sazanov und Hinchliffe 2006). Wasserstoffbrücken sind durch schwarze, gestrichelte Linien dargestellt. Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht der für das HoxF-Protein. Der schwarze Pfeil markiert die Position von NAD(H), bei der sich im Falle von NADP(H) eine zusätzliche Phosphatgruppe befindet. D: Die für die Bindestellenumwandlung ausgetauschten Aminosäuren sind rot markiert.
In der Kristallstruktur von Nqo1 bildet das Glutamat E185 Wasserstoffbrücken mit der Ribose
der Adenosin-Einheit des NAD+ aus, an der sich im Fall von NADP+ eine zusätzliche
104 ERGEBNISSE
Phosphatgruppe befindet (siehe Abbildung 35C, schwarzer Pfeil). Für das benachbarte
Glutamat E184 wird ebenfalls ein Beitrag zu der genannten Wasserstoffbrücke vorgeschlagen.
Es wird davon ausgegangen, dass die negative Ladung und die Größe dieser beiden Reste, die
an analoger Position ebenfalls in der SH präsent sind (D340 und E341), die Bindung von
NADP(H) mit seiner negativ geladenen Phosphatgruppe erschweren (Sazanov und Hinchliffe
2006; Berrisford und Sazanov 2009). Um eine bessere Bindung von NADP(H) in der SH zu
ermöglichen, sollte daher das Glutamat E341 sowie Aspartat D340 in HoxF durch
Mutagenese jeweils durch Alaninreste ersetzt werden.
Aminosäureaustausche in einer Monooxygenease fernab der NAD+-Bindetasche führten zu
einer starken Veränderung in der Substratselektivität (Wu et al. 2010). Die gereinigte
bidirektionale Hydrogenase aus Synechocystis sp. PCC 6803 kann sowohl NADH als auch
NADPH zur Wasserstoffproduktion benutzen (Schmitz et al. 2002). Um die katalytische
Effizienz der wasserstoffabhängigen NADP+-Reduktion der SH zu verbessern, wurden daher
zwei negativ geladene, exponierte Aminosäuren in der Nachbarschaft der NAD(H)-
Bindestelle gegen Lysin (D401K) und Serin (D467S) ausgetauscht (Abbildung 35D,
Sequenzvergleich Abbildung 23). Diese befinden sich in den bidirektionalen Hydrogenasen
des Cyanobakterien an äquivalenter Position.
3.6.1 Konstruktion der HoxF Derivate und Funktionalitätstest
Für die Produktion und Reinigung der SH-Varianten mit Aminosäureaustauschen in der
NAD(H)-Bindetasche wurde ein Plasmid eingesetzt, das die Gene
hoxFUYHWIhypA2B2F2CDEXA unter der Kontrolle des nativen SH-Promotors trägt. In
diesem Fall wurde das 5‘-Ende des hoxY-Gens mit einer den Strep-tag II codierenden Sequenz
ausgestattet, um eine mögliche Interferenz des Strep-tag II mit der Bindung von NAD(P)(H)
in HoxF zu minimieren. Die entsprechenden Mutationen wurden - wie in "Material und
Methoden" beschrieben - über die QuikChange-Strategie in die hoxF-Sequenz eingebracht.
Die resultierenden hoxF-Allele codieren für die Proteine HoxFD467S, HoxFD401K,
HoxFD340A/D401K, sowie HoxFE341/D467S. Die entsprechenden SH-Derivate wurden demzufolge
SHD467S, SHD401K, SHD340A/D401K sowie SHE341/D467S genannt. Die aus der Mutagenese
resultierenden Plasmide wurden konjugativ in den R. eutropha-Stamm HF210 übertragen. Um
die Funktionalität der resultierenden SH-Derivate zu testen, wurden die Transkonjuganten
zunächst auf ihre Fähigkeit untersucht, lithoautotroph, d. h. auf festem Minimalmedium mit
einem Gasgemisch aus H2/O2/CO2 zu wachsen. Als Kontrollstämme dienten R. eutropha-
HF210-Derivate die zum einen ein analog konstruiertes Überexpressionssysplasimid mit der
hoxF-Wildtypsequenz (Positivkontrolle) und zum anderen kein Plasmid (Negativkontrolle)
ERGEBNISSE 105
enthielten. Die Stämme, die die Proteine SHD467S und SHD400K synthetisieren, wuchsen
vergleichbar schnell wie die Wildtypkontrolle, der SHD340A-Stamm wuchs verlangsamt
(Abbildung 36). Die anderen Mutantenstämme waren dagegen nicht in der Lage,
lithoautotroph zu wachsen. Auch die Doppelmutante, die das SHD401K/D467S-Protein kodiert,
war ebenfalls nicht mehr in der Lage, unter diesen Bedingungen zu wachsen.
Abb. 36: Lithoautotrophes Wachstum der R. eutropha -Stämme mit SH-Derivaten nach 7 Tagen. Als Negativkontrolle (SH-) diente R. eutropha HF210 und als Positivkontrolle (WT) R. eutropha HF210 mit pGE750. Die SH-Derivate mit angegebenen Aminosäureaustauschen in HoxF wurden auf einem analogen Plasmid codiert und ebenfalls in R. eutropha HF210 konjugativ übertragen.
3.6.2 Reinigung der SH Derivate und Bestimmung der Affinität für NAD(P)(H)
Um die SH-Derivate hinsichtlich ihrer Fähigkeit zu untersuchen, NAD(P)+ mit H2 zu
reduzieren bzw. NAD(P)H zu oxidieren, wurden die entsprechenden R. eutropha-Mutanten in
FGN-Medium kultiviert und die SH-Proteine anschließend mittels Strep-Tactin-
Affinitätschromatographie gereinigt. Um einen Einfluss der HoxI-Untereinheit, für die eine
potenzielle NADPH-Bindung angenommen wurde (Burgdorf et al. 2005), zu vermeiden,
wurden die SH-Derivate durch Einsatz einer höheren Ionenstärke und leicht alkalischem pH
im Verlauf der Reinigung in ihrer heterotetrameren Form, d. h. ohne HoxI-Untereinheiten,
isoliert (Abbildung 37). Die Proteine SHWT, SHD467S, SHD401K, SHD340A/D401K sowie
SHE341/D467S wurden bis zur Homogenität gereinigt. Die Ausbeute entsprach derjenigen, die
mit dem SH-Derivat erzielt wurde, welches den Strep-tag II am N-terminus von HoxF trägt
(Tabelle S2). Das Derivat SHD401K/D467S konnte jedoch nicht gereinigt werden. Vermutlich
führt der Doppelaustausch zu instabilem Protein, was auch die Unfähigkeit des zugehörigen
Stammes erklärt, lithoautotroph zu wachsen. Im Gegensatz zu den Proteinen SHWT, SHD467S,
SHD401K, SHD340A/D401K und SHE341/D467S, die auf dem Weit-Wirtsbereich-Plasmid pEDY309
kodiert sind, wurden die Derivate SHD340A, SHE341A und SHD340A/E341A auf der Basis von
pCM62 konstruiert, welches ein verkleinertes Derivat von des RK2-Abkömmlings pEDY309
darstellt (Marx und Lidstrom 2001). Das Plasmid pCM62 besitzt offensichtlich eine geringere
Stabilität als pEDY309 (O. Lenz, persönliche Mitteilung), was zu einer geringeren
106 ERGEBNISSE
Proteinausbeute (Tabelle S2) und einer erhöhten Präsenz von kontaminierenden Proteinen
(Abbildung 37) führte.
Abb. 37: Reinigung von SH-Derivaten mit Aminosäuresubstitutionen in HoxF. Die Auftrennung (jeweils 5 μg) erfolgte in 12 %-igen SDS-PAGE-Gelen und die Färbung mit Coomassie-Blau. Die Größen eines Standard-Protein-Markers ist in Spur M in kDa angegeben. Pfeile deuten auf die Laufhöhen von HoxF, H, U und Y hin.
Anschließend wurden die kinetischen Enzymparameter bestimmt (Abbildung 38, Tabelle 17).
Die Bestimmung der KM- und kcat-Werte für NAD+ und NADP+ beruhte auf der
wasserstoffabhängigen Reduktion der Substrate, die photometrisch verfolgt wurde. Die
entsprechenden Parameter für NAD(P)H basierten auf der NAD(P)H-abhängigen Reduktion
von Benzylviologen, die ebenfalls photometrisch erfasst wurde. Eine exemplarische
Messreihe zur Bestimmung der Enzymparameter für die vier Substrate NAD+, NADP+,
NADH und NADPH ist in Abbildung 38 gezeigt. Zunächst wurden die SH-Derivate auf ihre
Aktivität hinsichtlich der physiologischen Substrate NAD+ und NADH überprüft. Das mit
einem Strep-Tag II an HoxY versehene SHWT-Protein wies dabei vergleichbare
Enzymparameter auf, wie das SHWT-Protein mit Strep-tag II an HoxF und Wildtyp-SH. Die
Derivate SHD340A/D401K und SHD467S wiesen eine um die Hälfte geringe NAD+-Reduktions-
Aktivität als der Wildtyp auf, die Aktivität des SHE341A-Proteins war sogar um das 250-fache
geringer (siehe Tabelle 17). Es fiel auf, dass der KM(NAD+) des SHD340A-Derivats mit 0,07
mM um den Faktor acht niedriger war als der des Wildtypproteins (0,55 mM). Das
Mutantenprotein HoxFD340A/E341A zeigte keine messbare NAD+-Reduktionsaktivität, allerdings
war die NADH-Oxidationsaktivität noch zu etwa 20% vorhanden. Im Falle der NADH-
Oxidation betrug der kcat der Derivate SHD340A und SHE341A nur etwa 15% der Wildtyp-
Umsatzrate.
ERGEBNISSE 107
Abb. 38: Bestimmung der enzymkinetischen Parameter für das SHD401K-Protein. Die Substratkonzentration wurde variiert und die spezifische SH-Aktivität bestimmt. Die Bestimmung der kcat- und KM- Werte (Tabelle 15) wurden durch nicht-lineare Regression durchgeführt. Das Bestimmtheitsmaß (R2)für die Angleichungskurve mit NAD+, NADH, NADP+ bzw. NADPH als Substrat betrug 0,952, 0,991, 0,815 und 0,969.
Im Anschluss wurden die enzymkinetischen Parameter für NADP+ sowie NADPH bestimmt.
Bemerkenswerterweise stieg die Affinität für NADPH der SHE341A- und SHD467S-Derivate auf
das 21- bzw. 33-fache der Affinität für das Wildtypprotein (7,0 mM). Die Kombination dieser
beiden Austausche im SHE341A/D467S-Protein führte jedoch zu keiner weiteren Erhöhung der
Affinität. Dagegen resultierte die Kombination der Substitutionen D340A und E341A in einer
mehr als 200-fach verbesserten Affinität für NADPH bei einer nur um 70 % reduzierten
Umsatzrate. Der synergetische Effekt dieser beiden Austausche führt somit zu einer 70-fach
höheren katalytischen Effizienz des SHD340A/E341A-Proteins, verglichen mit dem Wildtyp-
Enzym.
NADPH [mM]
0 2 4 6 8 10 12 14 16
spez
. Akt
ivitä
t [U/
mg]
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2NAD+ [mM]
0 1 2 3 4 5 6
spez
. Akt
ivitä
t [U/
mg]
0
20
40
60
80
100
NADH [mM]
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
spez
. Akt
ivitä
t [U/
mg]
0
20
40
60
80
100
NADP+ [mM]
0 2 4 6 8 10 12 14 16
spez
. Akt
ivitä
t [U/
mg]
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
108 ERGEBNISSE
Tabelle 17: Umsatz von und Affinität für NADP(H) der gereinigten SH-Derivate.
NADH NADPH
SH-Derivata KM
(mM) kcat
(s-1) kcat/KM
[mM-1 s-1] SH-Derivata KM
[mM]kcat
[s-1] kcat/KM
[mM-1 s-1]SHStrep HoxY 0,129 563,0 4360 SHStrep HoxY 7,06 8,9 1,3SHE341A 0,042 77,1 1840 SHE341A 0,21 8,7 59,0SHD340A 0,083 87,0 1050 SHD340A 5,43 10,0 1.8SHD340A/E341A 0,086 87,0 1011 SHD340A/E341A 0,03 2,6 92,3SHD401K 0,038 293,7 7730 SHD401K 1,95 3,3 1,7SHD467S 0,068 385,5 5670 SHD467S 0,33 1,6 5,0SHD401K/D340A 0,056 111,0 1970 SHD401K/D340A 0,83 9,0 10,8SHE341A/D467S 1,000 156,8 110 SHE341A/D467S 0,21 3,8 18,6SH Strep SH 0,074 390 5270 SH Strep SH 5,41 8,5 1,6 NAD+ NADP+
SH-Derivata Km
[mM] kcat
[sec-1] kcat/Km
[mM-1 sec-1] SH-Derivata Km
[mM]kcat
[sec-1] kcat/Km
[mM-1 sec-1]SHStrep HoxY 0,55 689 1253 SHStrep HoxY >20 <0,1 -SHE341A 0,68 2,7 4,0 SHE341A 16,3 8,8 0,5SHD340A 0,07 13,5 13,8 SHD340A 4,4 6,4 1,5SHD340A/E341A >20 <0,1 - SHD340A/E341A >20 <0,1 -SHD401K 0,202 269,1 1332,2 SHD401K 4,5 9 2SHD467S 0,405 219,9 543,0 SHD467S 8,6 8,5 1,0SHD340A/D401K 0,121 218 1801,0 SH D340A/D401K 7,3 4,1 0,6SHE341A/D467S 0,2 86,2 260 SHE341A/D467S 7,8 7,7 1
SHStrep HoxF 0,56 540 964 SHStrep HoxF >20 <0,1 -a Für die NAD(P)+-Reduktion diente Wasserstoff als Elektronendonor, für die NAD(P)H-Oxidation wurde Benzylviologen als Elektronenakzeptor eingesetzt. Mit Ausnahme des SHStrepHoxF-Enzyms tragen alle SH- Derivate tragen einen Strep-tag II am N-terminalen Ende von HoxY.
Für die Kofaktorregneration sind besonders die enzymatischen Parameter für den Umsatz von
NADP+ interessant. Das Wildtypenzym zeigte keine H2-vermittelte NADP+-
Reduktionsaktivität. Deutlich messbare Umsatzraten mit Werten zwischen 4.1 und 9.0 s-1
wurden dagegen für die die SH-Derivate SHD340A, SHE341A, SHD401K und SHD467S,
SHD340A/D401K und SHE341A/D467S gemessen. Die KM-Werte für NADP+ (4,4 – 16,3 mM) waren
dabei um eine Größenordnung höher als der KM(NAD+) für die Wildtyp-SH (0,550 mM). Die
katalytische Effizienz für NAD+ bzw. NADH des SHE341A/D467S-Derivates erniedrigte sich im
Vergleich zur SH-Wildtyp um den Faktor 4 bzw. 60, während sich die katalytische Effizienz
für NADPH um den Faktor 14 erhöhte und die für NADP+ auf von unter 0,01 mM-1s-1 auf
1 mM-1s-1 anstieg . Dies verdeutlicht eine Präferenzverschiebung von NAD(H) zu NADP(H).
3.7 Heterologe SH-Produktion in Pseudomonas putida
Für die wasserstoffabhängige in vivo-Kofaktorregeneration in P. putida KT2440 wurde das
SH-Expressionsplasmid pLL1 konstruiert, das die heterologe SH-Synthese erlaubt.
ERGEBNISSE 109
Abb. 39: Immunologischer Nachweis der heterolog produzierten SH-Untereinheiten HoxF und HoxH in P. putida. Rekombinante P. putida Stämme wurden bei einer OD600nm von 4 mit DCPK induziert und die SH-Produktion wurde durch einen immunologischen Nachweis verfolgt. Eingesetzt wurden Antiseren gegen HoxH und HoxF. Löslicher Extrakt und Gesamtprotein (gekochte Zellen; jeweils 20 μg Protein) wurden zuvor in einem 4-20 % SDS-PAGE- Gel getrennt.
Die Gene hoxFUYHWIhypA2B2F2CDEX auf pEDY309 wurden unter die Kontrolle des alkB-
Promotors gesetzt, um die SH-Genexpression durch n-Alkane oder durch das
nichtmetabolisierbare Alkan-Analogon Dicyclopropylketon (DCPK) induzieren zu können.
Das Plasmid pLL1 wurde konjugativ in einen P. putida KT2440-Stamm transferiert, der ein
weiteres Plasmid enthielt, welches die Monooxygenase CYP153 aus Polaromonas sp. Stamm
JS666 codiert. Diese Monooxygenase katalysiert die Oxidation von n-Octan zu Octanol
(Scheps et al. 2011). Nach Wachstum des transkonjuganten Stammes in Glukose-Glycerin-
Minmalmedium bis zu einer OD600 von ungefähr 4 wurde die SH-Synthese durch Zugabe von
DCPK induziert. 2 h nach Induktion konnten die großen Untereinheiten des SH-
Hydrogenasemoduls (HoxH) sowie des Diaphorase-Moduls (HoxF) im löslichen Extrakt
immunologisch eindeutig nachgewiesen werden (Abbildung 39). Die entsprechenden Signale
blieben bis zum Ende des Experiments (24 h Induktionsdauer) sichtbar.
Tabelle 18: Spezifische SH-Aktivität (H2: NAD+ in μmol x min-1x mg-1) in der löslichen Fraktion von P. putida nach Induktion mit DCPK. Löslicher Extrakt (LE) nach Zellaufschluss und anschließender Ultrazentrifugation.
Induktionszeit [h] 0 2 4 6 8 24
OD600 4,6 ± 0,7 7,3 ± 0,6 8,2 ± 0,2 8,5 ± 0,8 10,5 ± 1,2 6,0 ± 1,5
SH-Aktivität 0,18 ±0,06 0,37 ±0,03 0,40 ±0,05 0,24 ±0,10 0,32 ±0,05 0,03 ±0,01
Die spezifische SH-Aktivität, die über die H2-abhängige NAD+-Reduktion im löslichen
Extrakt ermittelt wurde, stieg 2 h nach Induktion auf das Doppelte des Ausgangswertes von
0,18 U/mg an und blieb dann für weitere 6 h nahezu konstant bei ca. 0,4 U/mg (Tabelle 18).
Der plasmidfreie Stamm zeigte im selben Zeitraum keine messbare SH-Aktivität. Nach 24 h
sank die Hydrogenase-Aktivität auf etwa 7% der Maximalaktivität von 4 h nach Induktion.
Dennoch blieben HoxF und HoxH unverändert detektierbar. Der Abfall der optischen Dichte
zwischen 8 und 24 h nach Induktion lässt sich mit der Absterbephase erklären, die
wahrscheinlich mit der Bildung inaktiver SH-Proteine einherging.
110 ERGEBNISSE
Die Synthese aktiver SH in P. putida stellt einen entscheidenden Schritt für die H2-abhängige
in vivo-Kofaktorregenerierung im Rahmen von NADH-abhängigen Biotransfomationen dar.
DISKUSSION 111
4. Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurden SH-Derivate mit biochemischen, spektroskopischen und
elektrochemischen Methoden mit dem Ziel charakterisiert, die Sauerstofftoleranz der SH zu
erklären. Es konnte das damalige Modell der Sauerstofftoleranz der SH mit zwei zusätzlichen
CN--Liganden am aktiven Zentrum durch spektroskopische Studien in ganzen Zellen
widerlegt werden. Um die komplexen Reaktionsmechanismen der SH in überschaubare
Teilreaktionen zu zerlegen, wurden Subkomplexe der SH getrennt voneinander untersucht.
Das Zusammenspiel des Hydrogenase- mit dem Diaphorase-Modul erlaubt die Kopplung der
Wasserstoffoxidation mit der Reduktion des cytoplasmatischen NAD+. Dabei sind die
Aktivitäten beider Module fein aufeinander abgestimmt. Die Analyse reduzierter
Sauerstoffspezies ermöglichte das Aufstellen eines neuen Modells zur Sauerstofftoleranz der
SH. Aufgrund der außergewöhnlichen Sauerstofftoleranz wurden für den biotechnologischen
Einsatz der SH in der Kofaktorregenerierung die Substratspezifität zu NADP(H) erweitert und
die SH heterolog in Pseudomonas putida produziert, um ein zellbasiertes Kofaktorrecycling
zu erlauben.
4.1 Optimierung der SH-Produktion und Reinigung
Ein neues SH-Überexpressionssystem sowie eine optimierte Kultivierung und Reinigung der
SH über Strep-Tactin-Affinitätschromatographie wurde erfolgreich in dieser Studie etabliert,
um hochaktive, homogene SH-Präparationen in großen Mengen für biochemische und
spektroskopische Analysen und für den späteren Einsatz in der Kofaktorregenerierung zu
erhalten. Ein Plasmid mit allen SH-Strukturgenen und einer für den Strep-tag II codierende
Sequenz am 5´-Ende von hoxF wurde dafür eingesetzt. Zudem enthielt es das für die
Biosynthese der SH notwendige minimale Set aus den 14 Genen
hoxFUYHWIhypA2B2F2CDEXhoxA, die aus dem SH- und dem MBH-Operon
zusammengesetzt wurden und für die Struktur, Maturation sowie Regulation der
Transkription notwendig sind (Abbildung 4,5). Eine mikroanaerobe Kultivierung in
Minimalmedium, die Reinigung unter oxidierenden Bedingungen sowie der Reinigungspuffer
mit neutralem pH und geringer Ionenstärke (5 % Glycerin, 50 mM K-PO4, pH 7.0) führten zur
Isolierung hochaktiver und heterohexamerer SH. Im Durchschnitt wurden 65 mg SH aus 10 g
Zellen (Nassgewicht) erhalten. Die Reinigung erfolgte innerhalb von 4 bis 6 h im Vergleich
zu einer 2 bis 3-tägigen Reinigung nach dem klassischen Protokoll mit verschiedenen
Chromatographie- und Fällungsschritten (Schneider und Schlegel 1976; van der Linden et al.
2006). Die Ausbeute war zudem mehr als 10-fach höher als zuvor für die SH beschrieben
112 DISKUSSION
(Schneider und Schlegel 1976; van der Linden et al. 2006). Außerdem sind die Ausbeuten
mehr als 20-fach höher als die Ausbeuten, die für die bidirektionale Hydrogenas aus
Synechocystis PCC 6803, für SH1 aus Pyrococcus furiosus oder die MBH aus R. eutropha
erzielt wurden (Germer et al. 2009; Chandrayan et al. 2011; Goris et al. 2011). Außerdem
konnte die heterotetramere Form der SH gereinigt werden (Kapitel 3.2.3), durch eine höhere
Ionenstärke und leicht alkalischen pH-Werts des Reinigungspuffers konnte HoxI2 vom SH-
Holoenzym entfernt werden, wie es bereits in der Literatur gezeigt wurde (Burgdorf et al.
2005).
Die folgenden drei Punkte führten zu einer gesteigerten SH-Produktion durch Induktion des
nativen SH-Promotors: (1) Das Wachstum mit einer schlechten Kohlenstoffquelle wie
Glycerin führte dazu, dass die SH-Gentranskription dereprimiert wurde und dadurch SH
produziert wurde (Friedrich 1982; Schwartz et al. 1998). (2) Das Gen, für den
Transkriptionsaktivator HoxA wurde in das SH-Überproduktionsplasmid eingebaut und somit
ein Gendosis-Effekt erzeugt (Lenz und Friedrich 1998). (3) Es wurde eine mikroaerobe
Kultivierung durchgeführt. Dabei ist anzumerken, dass mittels „in silico“-Methoden im
Bereich des SH-Promotors Bindesstellen des globalen, O2-sensierenden
Transkriptionsregulators FNR identifiziert wurden (Anne Pohlmann, persönliche Mitteilung).
Die volumetrische SH-Ausbeute von 19,5 mg/l liegt in der Größenordnung von heterologen
E. coli Batch-Expressionssystemen für Standardproteine (Siurkus et al. 2010), jedoch fällt
aufgrund der langen Kultivierung von 168 h die Raum-Zeit-Ausbeute mit 0,11 mg/l/h sehr
gering aus . Die spezifische Aktivität (H2:NAD+) der gereinigten SH betrug im Durchschnitt
137 U/mg und liegt damit doppelt so hoch wie bei früheren Reinigungen (Schneider und
Schlegel 1976). Das gereinigte Enzym wies eine „lag-Phase“ auf (Schneider und Schlegel
1976). Erst nach autokatalytischer Reaktivierung zeigt die SH eine wasserstoffabhängige
NAD+-Reduktionsaktivität. Zu Beginn produziert vermutlich eine aktive Enzympopulation
wasserstoffabhängig NADH, welches für die Reaktivierung von inaktiven Enzymmolekülen
verantwortlich ist (Schneider und Schlegel 1976). Für die hier durchgeführten SH-
Aktivitätsbestimmungen wurde NAD+ in einer Konzentration von 1 mM eingesetzt. Höhere
NAD+-Konzentrationen führen zu einer längeren „lag-Phase“, da das autokatalytisch
produzierte NADH verdünnt wird (Schneider und Schlegel 1976). Allerdings führt eine
höhere Konzentration von NAD+ zu gesteigerten Aktivitäten, da die Affinität für NAD+ (Km-
Wert von 0,5 mM) gering ist. In der Studie von van der Linden et al. 2006 wurden für die SH-
Aktivitätsmessung 5mM NAD+ eingesetzt und damit SH-Aktivitäten von 150-185 U/mg
erzielt, die der Michaelis-Menten-Kinetik folgend nahe an „vmax“ liegen. Der Einsatz von 5
DISKUSSION 113
mM NAD+ im Gegensatz von 1 mM NAD+ führte zu ungefähr 50% höheren Aktivitäten und
erklärt somit die gesteigerten Aktivitäten in der Studie von van der Linden et al. 2006 im
Gegensatz zu den hier gemessenen Aktivitäten von 137 U/mg mit NAD+ (Kapitel 3.2.3).
4.2 Kofaktorzusammensetzung
Wie bereits in der Literatur beschrieben, wurde die Aktivität der homolog produzierten SH
bei einer Sauerstoffkonzentration von 60 % nur um ca. 20 % inhibiert (Kapitel 3.5.3;
Schneider und Schlegel 1981). Entsprechend der Metallbestimmung, den Sequenzvergleichen
und den spektroskopischen Untersuchungen (UV-Vis und EXAFS) der nativen SH und ihrer
Submodule besitzt die SH vier [4Fe4S]-Cluster und einen [2Fe2S]-Cluster (Kapitel 3.2.7;
3.3.3.; 3.4.4). Das Enzym wies eine Fe-S-Cluster-Zusammensetzung auf, wie sie von Albracht
und Hedderich 2000 prognostiziert wurde. Für die SH konnte ein FMN bestimmt werden
(Kapitel 3.2.7). Dies stimmt mit den Literaturdaten überein (Schneider und Schlegel 1976).
Allerdings zeigten Rekonstitutionsexperimente, dass die SH zwei FMN-Moleküle binden
kann (Schneider und Schlegel 1978). Dabei bindet das Diaphorase-Modul das FMN-b-
Molekül (Kapitel 3.4.4; Schneider und Schlegel 1978). Das zweite FMN (FMN-a) geht
vermutlich während der Reinigung leicht verloren (van der Linden et al. 2004). In dieser
Arbeit wurde aus den folgenden Resultaten erstmals geschlussfolgert, dass sich FMN-a im
Hydrogenase-Modul befindet: (1) FMN wurde darin in substöchiometrischen Mengen
detektiert. (2) FMN steigerte die H2-Oxidationsaktivität des Hydrogenase-Moduls, (3) die
Semichinonform des FMN konnte nach Reduktion mit Dithionit durch UV-Vis-Spektroskopie
nachgewiesen werden und (4) zugefügtes FMN hatte zudem einen stabilisierenden Effekt auf
das [NiFe]-Zentrum, was durch FTIR-Spektroskopie gezeigt wurde.
Der Nachweis von Kupfer (1,4 pro Enzym) im Hydrogenase-Modul der SH aus R. eutropha
steht in Übereinstimmung mit den 0,63 Kupferatomen, die zuvor im Hydrogenase-Modul der
nah verwandten SH aus Rhodococcus opacus ermittelt wurden (Schneider et al. 1984). Die
vergleichsweise starke Bindung von Kupfer durch das isolierte Hydrogenase-Modul ist
wahrscheinlich auf die Exposition von metallbindenden Aminosäuren als Resultat des
Entfernens des Diaphorase-Moduls zurückzuführen. Tatsächlich beinhaltet HoxY zusätzlich
zu den vier Cysteinen, die vermutlich den [4Fe4S]-Cluster koordinieren, fünf weitere
Cysteine sowie fünf Histidin-Reste (Abbildung 13). Die UV-Vis-Spektren des Diaphorase-
Moduls weisen nach Reduktion mit Dithionit Signale auf, die sowohl auf neutrales als auch
anionisches Semichinon deuten. Dieses könnte mittels EPR-Spektroskopie untermauert
werden, für die jedoch die Ausbeute des HoxFU-Proteins gesteigert werden müsste.
114 DISKUSSION
Eine neue Entdeckung ist, dass die native SH nach der Affinitätschromatographie als
Homodimer vorliegt. Die verschiedenen Fällungs- und Chromatographieschritte während der
klassischen Reinigung könnten zu einer Monomerbildung geführt haben (van der Linden et
al. 2004). Mit der in dieser Arbeit verwendeten Kultivierungs- und Reinigungsmethode
wurden reine, homogene und konzentrierte Enzymproben für die biochemischen und
infrarotspektroskopischen Untersuchungen präpariert. Darüber hinaus erlaubte die Reinigung
über die Strep-Tactin-Affinitätschromatographie unter Verwendung des hier etablierten
Protokolls eine schnelle Reinigung verschiedener Derivate mit Aminosäureaustauschen in
kleinem Maßstab.
4.3 Kontrovers diskutierte Ergebnisse zur Struktur des [NiFe]-Zentrums der SH
Aufgrund der Tatsache, das gereinigte SH im IR-Spektrum eine CO- und vier CN-
Absorptionsbanden aufwies und die chemische Cyanidbestimmung vier Cyanide für die SH
ergaben, wurde für das [NiFe]-Zentrum der SH eine modifizierter Struktur im Vergleich zu
Standard-[NiFe]-Hydrogenasen angenommen (Happe et al. 2000; Bleijlevens et al. 2004;
Burgdorf et al. 2005; van der Linden et al. 2006). Dies wurde damit erklärt, dass im
Gegensatz zu Standard-[NiFe]-Hydrogenasen jeweils ein zusätzliches Cyanid am Eisen und
am Nickel gebunden ist. Letzteres wurde für die Sauerstofftoleranz der SH verantwortlich
gemacht. Einige Zweifel kamen jedoch bei der Interpretation der älteren Experimente auf. Die
Annahme, eines permanent redoxinaktiven Ni(II) steht im Widerspruch zu dem
paramagnetischen Nia-C, das nach Inkubation mit NADH detektiert wurde (Erkens et al.
1996). Außerdem wurden im Rahmen spektroelektrochemischer Messungen Nia-SR-Zustände
beobachtet, die auch in Standardhydrogenasen vorliegen. Diese Nia-SR-Zustände nach
Reduktion wurden auf den Verlust der zusätzlichen Cyanid-Liganden zurückgeführt
(Burgdorf et al. 2005; van der Linden et al. 2006). Dies ist jedoch unwahrscheinlich, da das
Reduktionsmittel NADH ein natürliches Substrat der SH darstellt und ein ähnliches
Redoxpotential aufweist wie es für Detektion der Nia-C und für die verschiedenene Nia-SR-
Zusände während der spektroelektrochemischen Messungen verwendet wurde (van der
Linden et al. 2006) . Zudem weisen Cyanide, die an Eisen ligandiert sind, eine starke
Bindungsenergie auf. Somit ist es eher unwahrscheinlich, dass sie durch die Einstellung
milder Reduktionsbedingungen selektiv von dem [NiFe]-Zentrum im Proteininneren
dissoziieren. Des Weiteren war die von van der Linden et al. (2004) angestellte Interpretation
zur partialen Markierung der Cyanide in der SH mit 15N lückenhaft, was in Horch et al. 2012
näher ausgeführt wurde.
DISKUSSION 115
Zudem wurde angenommen, dass die IR-Bande bei 2098 cm-1, die dem Nickel-gebundenen
Cyanid zugeordnet wurde, als einzige sensitiv auf strukturelle und potentialabhängige
Änderungen während der Reaktivierung und der H2 Katalyse reagiert (van der Linden et al.
2004; Burgdorf et al. 2005; van der Linden et al. 2006). Jedoch wiesen die experimentellen
IR-Spektren redoxabhängige Intensitätsänderungen in der ganzen Cyanidregion von 2100-
2050 cm-1 auf, was darauf hindeutet, das nicht nur das Nickel-gebundene Cyanid, sondern
mehrere Cyanidliganden ihre Schwingungseigenschaften änderten. Berechnete IR-Spektren
der SH unterstützen diese Hypothese (Horch et al. 2012). Infolge der Sechsfach-Koordination
durch den zusätzlichen Cyanid-Liganden wäre das Eisen nicht mehr in der Lage, an der
Bindung eines Brückenliganden im aktiven Zentrum zu partizipieren. Somit kann es auch
nicht als initialer Wasserstoffakzeptor agieren, wie es von Kubas 2007 postuliert wurde. Um
diese hier aufgeführten Widersprüche zum bisher bestehenden Modell aufzuklären, wurde die
SH erneut spektroskopisch untersucht.
4.4 Die SH besitzt einen Standard-Satz von zwei CN-- und einem CO-Liganden
Die SH wurde in einem kombinierten IR-und EPR-spektroskopischen Ansatz untersucht. Im
Gegensatz zu vorherigen Untersuchungen an gereinigter SH wurde diese Studie in der
physiologischen Umgebung der SH, d. h. als Bestandteil des Cytoplasmas durchgeführt.
Dafür wurden ganze Zellen des R. eutropha-Derivats HF798 eingesetzt, das lediglich die SH
synthetisiert und keine RH und MBH mehr bildet (Kapitel 3.1.1). Durch in vivo EPR-
Spektroskopie wurde gezeigt, dass die SH in Zellen, die in Abwesenheit von H2 gezogen
wurden, vorwiegend im paramagnetischen Nia-C-Zustand vorliegt, der durch ein Hydrid
zwischen Nickel und Eisen im aktiven Zentrum gekennzeichnet ist (Kapitel 3.1.2). Bei
kryogenen Temperaturen wurde das Proton durch Weißlichtbestrahlung reversibel aus seiner
Brückenposition entfernt, wobei sich der Ni-L-Zustand einstellte (Brecht et al. 2003). Die
FTIR-spektroskopischen Untersuchungen an den identisch behandelten Proben führten zur
Identifizierung der reduzierten Nia-SR-Zustände (Kapitel 3.1.3), die auch in Standard-
Hydrogenasen bekannt sind und sich in ganzen Zellen nach Inkubation mit Wasserstoff
einstellten. Aerobe wie auch anaerobe Oxidation der Zellen mit NAD+ führte dagegen zu
einem nahezu homogenen Zustand der SH, der dem Nir-B-Zustand in Standard-[NiFe]-
Hydrogenasen ähnelt, jedoch im Falle der SH EPR-inaktiv war. Es bleibt noch zu klären, ob
dieser Nir-B-ähnliche Zustand aufgrund von Spinkopplungen mit einem weiteren
paramagnetischen Zentrum EPR-inaktiv ist oder ob es sich lediglich um eine „Nir-B-artige“-
Spezies mit einem formalen Ni(II)-Zustand handelt. Die Reversibilität aller Übergänge
zwischen den detektierten Redoxzuständen belegen ein intaktes katalytisches Zentrum. Das
116 DISKUSSION
Verschwinden des Nia-C-Signals frisch geernteter Zellen nach Reduktion bzw. nach
Oxidation zeigt, dass das Nickel-Atom der SH unter physiologischen Bedingungen redox-
aktiv ist und zwischen NiII und NiIII wechselt. Diese Daten belegen, dass das [NiFe]-Zentrum
der SH einen „Standardsatz“ von einem CO- und zwei CN–-Liganden enthält und
diesbezüglich der Struktur des aktiven Zentrums von [NiFe]-Standardhydrogenasen gleicht.
Das bisherige Modell, welches zwei zusätzliche CN—Liganden postuliert, kann somit
verworfen werden. Die Notwendigkeit spektroskopische Untersuchungen an Enzymen in der
nativen Umgebung, also innerhalb der Zelle, durchzuführen, wurde in dieser Analyse
besonders deutlich. Weiterhin demonstriert diese Studie, dass die Zusammensetzung des
Cytoplasmas einen deutlichen Einfluss auf den Redoxzustand des [NiFe]-Zentrums der SH
hat. Die SH besitzt in HoxF eine NAD(H)-Bindestelle, über die die SH mit dem
cytoplasmatischen NAD+/NADH-Pool interagieren kann (Kapitel 3.4). Außerdem kann das
das [NiFe]-Zentrum der SH mit Wasserstoff und Sauerstoff interagieren (Kapitel 3.3.9 und
Kapitel 3.5). In zukünftigen Experimenten könnte die cytoplasmatische NAD+- und NADH-
Konzentration durch HPLC-MS quantifiziert werden und gleichzeitig durch FTIR der
Redoxzustand des [NiFe]-Zentrums bestimmt werden. Bei Kenntnis der Redoxpotentiale der
FTIR-detektierten Zustände könnte die SH als Redoxsensor des intrazellulären NAD+/NADH-
Pools eingesetzt werden (siehe Abbildung 42D).
4.5 Der katalytische Zyklus am Nickel-Eisen-Zentrum der SH
Stabile Intermediate der Wasserstoffumwandlung am [NiFe]-Zentrum können mittels EPR-
und IR-spektroskopischer Untersuchungen verfolgt werden. Die Ergebnisse der IR-
Untersuchungen an der gereinigten SH sowie dem Hydrogenase-Modul zeigten, dass das
[NiFe]-Zentrum der SH nahezu alle redoxaktive Zustände aufweist, die für O2-sensitive
Standardhydrogenasen bekannt sind (Kurkin et al. 2004). Dies ist konsistent mit einem
Standardsatz von zwei CN-- und einem CO-Liganden. Jedoch gibt es auch einige
Besonderheiten, auf die im Folgenden eingegangen werden soll. Die reduzierten Zustände des
HoxHY-Subkomplexes (Kapitel 3.3.10) waren weitgehend ähnlich zu denen der nativen SH
in ganzen Zellen (Kapitel 3.1.3), obwohl das NiaC-Intermediat nicht detektiert werden konnte.
Diese Unterschiede sind wahrscheinlich mit dem fehlenden FMN und dem Fehlen des
Diaphorase-Moduls zu erklären, das anscheinend einen starken Einfluss auf das
Redoxverhalten des [NiFe]-Zentrums hat, indem es den Elektronentransportweg regelt und
die Kopplung mit dem NAD+/NADH-Pool herstellt.
Im Gegensatz zu Standardhydrogenasen führte die Inkubation der SH allein mit Wasserstoff
zu keiner Reduktion des [NiFe]-Zentrums. Dies bestätigen bereits ältere Studien (Schneider
DISKUSSION 117
und Schlegel 1976; Schneider et al. 1979). Dagegen führte die Reduktion mit Wasserstoff in
Anwesenheit von FMN (im Falle des Hydrogenase-Moduls) und NADH (im Falle der nativen
SH) zu der Ausprägung der Nia-SR-, Nia-SR´-, und Nia-SR´´-Zustände (Abbildung 3E,
Kapitel 3.2.6 und Kapitel 3.3.10). Ebenso bestätigen die elektrochemischen Experimente mit
dem Hydrogenase-Modul, dass eine Reaktivierung des isolierten Enzyms notwendig ist
(Kapitel 3.3.6). Ein möglicher katalytischer Zyklus nach Siegbahn et al. 2007 ist in
Abbildung 3 und Abbildung 31 gezeigt. In frisch geerntete Zellen wurden die reduzierten
Redoxzustände NiaC, NiaSR´ und NiaSR´´ der SH detektiert (Kapitel 3.1.3). Außerdem konnte
der NiaS-Zustand festgestellt werden, der eine freie Bindestelle für Wasserstoff aufweist
(Abbildung 3C; Lubitz et al. 2007)). Nach Reduktion mit H2 befand sich das [NiFe]-Zentrum
der SH im Nia-SR2-Zustand (Kapitel 3.1.3 und 3.2.6), der bisher ausschließlich in der
bidirektionalen [NiFe]-Hydrogenase von Synechocystis sp. PCC 6803 gefunden wurde
(Germer et al. 2009). Im Vergleich zu den Nia-SR-Redoxzuständen in Standard-[NiFe]-
Hydrogenasen, weist die Nia-SR2-Spezies mit 1958 cm-1 eine ungewöhnlich hohe CO-
Streckschwingung auf. Eine formale NiIII-Spezies wie beim Nia-C oder dem vermeintlichen
Nia-X-Zustand im Modell der oxidativen Addition (siehe Kapitel 1.4; Lill und Siegbahn 2009)
können ausgeschlossen werden, da mit dem Auftreten des Nia-SR2-Zustandes kein EPR-
Signal des Nickels detektiert wurde (Kapitel 3.1.3 und Kapitel 3.2.6). Eine NiII-Spezies, bei
der der austauschbare Ligand zwischen Nickel und Eisen in “trans“-Position zu dem CO-
Liganden einen starken Effekt auf die Streckschwingung des CO-Liganden ausübt, ist eher
wahrscheinlich (Horch et al. 2012). Ein „Trans-Effekt“ taucht u. a. auf, wenn sich zwei
Liganden ein Metallorbital teilen (Cotton und Wilkinson 1988). In [NiFe]-Hydrogenasen
würde sich ein verbrückender Ligand das dz2-Orbital des Eisens mit dem CO teilen. Das
Hydrid in Nia-C fungiert als guter „Sigma-Donor“, schwächt die Fe-CO Bindung und stärkt
somit die Dreifachbindung des CO. Daher liegt die CO-Streckschwingung des Nia-C-
Zustandes im Vergleich zu der vom Nia-S bei höheren Wellenzahlen (Volbeda und Fontecilla-
Camps 2005). Für den Nia-SR-Zustand wurde im Rahmen von DFT-Berechnungen ebenfalls
ein Hydrid als Brückenligand vorgeschlagen (Siegbahn et al. 2007). Eine Protonierung des
verbrückenden Hydrides von Nia-SR oder die Reaktion von Nia-S mit Wasserstoff würde zu
einem H2-Sigmakomplex am Eisen als Intermediat führen (siehe Abbildung 3D). Dabei
vermitteln die zwei Elektronen der (H-H)-Bindung gleichzeitig die Bindung zum Eisen.
Dadurch wird die Fe-CO-Bindung geschwächt und die Wellenzahl der CO-Streckschwingung
steigt (Niu et al. 1999; Kubas 2007). Die Erhöhung der Frequenz der Streckschwingung des
CO-Liganden von 1946 cm-1 im Nia-SR-Zustand auf 1958 cm-1 im Nia-SR2-Zustand spricht
118 DISKUSSION
entweder ebenfalls für ein Hydrid als Brückenligand (Siegbahn et al. 2007) oder für einen H2-
Sigmakomplex am Eisen (Horch et al. 2012). Das gebundene H2-Molekül des H2-
Sigmakomplexes würde dann heterolytisch am [NiFe]-Zentrum gespalten werden (siehe
Abbildung 3D zu 3E), wobei Nickel die redoxaktive Spezies ist und sich die Oxidationsstufe
des „low-spin“ FeII nicht ändert. Reversible H2-Sigmabindungen, bei denen sich der
Redoxzustand des Übergangsmetalls nicht ändert, konnten auch für Ruthenium-Komplexe
beobachtet werden. (Grellier et al. 2007; Perutz und Sabo-Etienne 2007). Entsprechend dem
Modell von Siegbahn und Kollegen würde nach heterolytischer Wasserstoffspaltung des H2-
Sigmakomplexes das Hydrid als Brückenligand zwischen Nickel und Eisen vorliegen und ein
Proton auf das terminale Cystein des Nickels übertragen werden. Dieser Zustand wird als Nia-
SR bezeichnet (Abbildung 3E; Siegbahn et al. 2007). Anschließend würde das Proton an das
benachbarte Glutamat (Glu14 im Falle von HoxH) und ein Elektron auf die FeS-Cluster
übertragen werden (Abbildung 3F/G). Für die Nia-SR-, Nia-SR´- und Nia-SR´´-Spezies bleibt
die Frage offen, ob sie sich in der Protonierung, Konformation oder zusätzliche H2- oder H--
Liganden unterscheiden (Volbeda et al. 2005; Fichtner et al. 2006; Ogata et al. 2009).
Die isolierte heterohexamere SH zeigte nach Reduktion mit einem Überschuss von NADH
vorwiegend den Nia-C-Zustand (Kapitel 3.2.6), der ein Hydrid als Brückenligand aufweist
(Abbildung 3H). Nach weiterer Reduktion mit Wasserstoff verschwand dieser wieder (Kapitel
3.2.6). Der EPR-aktive Nia-C-Zustand tritt nur in einem kleinen Redoxpotentialfenster von -
290 bis -325 mV auf (Erkens et al. 1996). Dies erklärt, dass dieser Zustand in vorherigen
Untersuchungen leicht übersehen werden konnte (Happe et al. 2000; van der Linden et al.
2004; Löscher et al. 2005; van der Linden et al. 2006). Für den Übergang von Nia-C mit NiIII
zu Nia-S mit NiII wurde ein NiI Intermediat postuliert, das als Nia-R* bezeichnet wurde (Lill
und Siegbahn 2009). Laut dem Modell von Lill und Mitarbeitern würde das Hydrid von der
verbrückenden Position im Nia-C als Proton auf ein terminales Cystein transferiert werden.
Die verbleibenden zwei Elektronen vom Hydrid würden dadurch das NiIII zu NiI reduzieren
(Abbildung 3H zu Abbildung 3I). Entweder scheint Nia-R* sehr kurzlebig zu sein, so dass es
bis jetzt spektroskopisch noch nicht detektiert wurde, oder Nia-R* könnte ähnlich zu Ni-L
sein. Bei der SH wurde ebenfalls ein Ni-L-Zustand detektiert, der durch Belichtung mit
Weißlicht bei kryogenen Temperaturen induziert wurde, so wie auch bei fast allen anderen
bislang untersuchten Hydrogenasen (Lubitz et al. 2007). Bei einigen Hydrogenasen taucht ein
Ni-L-Zustand sogar bei weit höheren Temperaturen auf. Ein dem Ni-L ähnlicher Zustand
erscheint bei der „Uptake“ Hydrogenase aus Acidithiobacillus ferrooxidans und bei früheren
MBH-Präperationen bei Raumtemperaturen und bei der RH bei 200 K (Schröder et al. 2007;
DISKUSSION 119
Saggu et al. 2009; Brecht et al. 2003). Zukünftige spektroskopische Studien müssten klären,
ob ein NiI-Zustand tatsächlich Teil des katalytischen Zyklus ist. Nach Weiterleiten eines
Elektrons auf die Fe-S-Cluster und des Protons auf das Glutamat würde wieder der Nia-S
ausgebildet werden, der ein Wasserstoffmolekül abermals binden könnte (Abbildung 3I/J/C).
4.6 Katalytische Eigenschaften der SH
Das Hydrogenase- und das Diaphorase-Modul wurden getrennt voneinander untersucht, um
die katalytischen Reaktionen der Wasserstoffumwandlung am [NiFe]-Zentrum und der
NAD(H)-Redoxreaktionen in HoxF unabhängig voneinander zu erforschen. Der gereinigte
Diaphorase-Subkomplex katalysierte die Übertragung von Elektronen von NADH auf
Benzylviologen und wies elektrokatalytische NADH-Oxidations- und NAD+-Reduktions-
Aktivität auf (Kapitel 3.4.3 und Kapitel 3.4.6). Dies erlaubte die Charakterisierung des
Diaphorase-Modules hinsichtlich der katalytischen Präferenz (Kapitel 3.4.7), der Fähigkeit in
Gegenwart von O2 zu funktionieren (Kapitel 3.4.12), und der Produktion von ROS unter
aeroben Bedingungen (Kapitel 3.4.5). Zur Interpretation dieser Ergebnisse sind die Daten der
nativen SH und des Hydrogenase-Moduls hinzugezogen worden. Zudem wurde die
physiologische Rolle des Enzyms und die Ähnlichkeit zu Komplex I berücksichtigt.
4.6.1 NAD(P)(H) Umwandlung des Diaphorase Moduls
Das Diaphorase-Modul der SH katalysierte die reversible Reduktion von NAD+ zu NADH.
Bislang ist keine Kristallstruktur für eine NAD+-reduzierende Hydrogenase vorhanden,
allerdings weist HoxFU ein hohe Ähnlichkeit zu der löslichen Domäne von Komplex I auf
(Kapitel 3.6). Eine Kristallstruktur von Komplex I aus T. thermophilus zeigt, dass das
mitkristallisierte NADH so zu FMN in der NAD(H)-Bindestelle orientiert ist, dass ein
direkter Hydridtransfer von NADH auf FMN möglich ist (Berrisford und Sazanov 2009). Es
ist aufgrund der Homologie des Diaphorase-Moduls zu Komplex I sehr wahrscheinlich, dass
die Oxidation von NADH in der SH auch über einen direkten Hydridtransfer zum FMN
verläuft. Elektronen müssten dann in Ein-Elektronenschritten von dem reduzierten FMN zu
den [FeS]-Clustern oder zu künstlichen Elektronenakzeptoren übertragen werden. Das HoxF-
Homologiemodell, das auf der Komplex I-Kristallstruktur aus Thermus thermophilus mit
gebundenem NADH basiert (Abbildung 30), macht deutlich, dass die Bindung von NADH die
Wechselwirkungen vermutlich beider Hydroxylgruppen der Riboseeinheit des Adenosins mit
dem Aspartat 340 und Glutamat 341 umfasst (Sazanov und Hinchliffe 2006; Berrisford und
Sazanov 2009). Im Falle von NADPH befindet sich eine zusätzliche Phosphatgruppe an der
Position C2' des Riboseteils (Abbildung 30C, schwarzer Pfeil). Die Verbesserung der
120 DISKUSSION
katalytischen Effizienz für die wasserstoffabhängige NADP+-Reduktion durch die
Aminosäuresubstitutionen D340A und E341A macht deutlich, dass die Bindung von NADP+
in der nativen SH wahrscheinlich durch sterische Hinderung und elektrostatische Abstoßung
verhindert wird und NADP(H) somit ein schlechtes Substrat für die SH darstellt. Kürzlich
veröffentlichte Ergebnisse an Komplex 1 zeigten, dass das negative geladene Glutamat 183
(entspricht dem Aspartat 340 in HoxF) verantwortlich für die selektive NADH-Bindung in
Komplex I ist (Morina et al. 2011). Nicht nur die in der Kristallstruktur des Komplex I für die
Bindung von NAD(H)-involvierten Aminosäuren scheinen für die Selektivität von NAD+ und
NADP+ wichtig zu sein, sondern auch Aminosäuren in der Umgebung. Daher wurden
Aminosäuren in der Umgebung der NAD(H)-Bindestelle der SH ausgetauscht, so dass sie den
Aminosäuren glichen, die in cyanobakteriellen bidirektionalen Hydrogenasen vorkommen.
Die cyanobakteriellen bidirektionalen Hydrogenasen können sowohl NADH als NADPH als
Reduktionsmittel benutzen (Schmitz et al. 2002; Aubert-Jousset et al. 2011). Die negativ
geladenen Aspartatreste D401 und D467 wurden durch positiv geladenes Lysin bzw. polares
Serin ersetzt. Die Aminosäureaustausche D401K und D467S verbesserten die NADP+-
Reduktionsaktivität der SH vermutlich als „Zugangsaminosäuren“ für NADP+ zur
„Rossmann-Falte“ (Abbildung 30).
Während des Wachstums von R. eutropha mit H2, CO2 und O2 katalysiert die SH die
wasserstoffabhängige NAD+-Reduktion. Der Hauptanteil des produzierten NADHs wird in
der Atmungskette für den Aufbau eines Protonengradienten verwendet, der u. a. zur ATP-
Synthese genutzt wird. Ein anderer Teil wird für die CO2-Fixierung verwendet. Außerdem
wird NADH durch Transhydrogenasen in NADPH umgewandelt, das für anabole
Stoffwechselprozesse erforderlich ist (Cramm 2009). Es wurde gezeigt, dass die SH in vivo
auch die reverse Richtung, d. h. die NADH-abhängige H+-Reduktion katalysiert. Insbesondere
eine kurzzeitige NADH-Oxidation könnte wichtig sein, um den NAD+/NADH-Pool
auszubalancieren, wenn R. eutropha von aeroben zu anaeroben Wachstumsbedingungen
wechselt (Kuhn et al. 1984). Analog dazu kann in Komplex I, bei dem die typische Funktion
die NADH-Oxidation ist, der reverse Elektronenfluss ablaufen, um NAD+ zu reduzieren
(Hirst 2010). Zusätzlich ist die Fähigkeit der SH, Elektronen von NADH zu dem aktiven
[NiFe]-Zentrum des Hydrogenase-Moduls zu transferieren wichtig, um oxidierte, inaktive
Zustände des [NiFe]-Zentrums zu reaktivieren. Das Diaphorase-Modul weist eine
bidirektionale Aktivität auf, allerdings wird die NAD+-Reduktion mit einer höheren Rate
katalysiert als die NADH-Oxidation (Kapitel 3.4.7). Ebenso liegt die katalytische Präferenz
der nativen SH auf Seiten der wasserstoffabhängigen NADH-Produktion (Schneider und
DISKUSSION 121
Schlegel 1976). Auch das Hydrogenase-Modul der SH ist in beide Richtungen aktiv. Es
betreibt H+-Reduktion und zeigt H2-Oxidationsaktivität. Während die native SH und das
Diaphorase-Modul die NAD+-Reduktion bevorzugt katalysieren, zeigt das isolierte
Hydrogenase-Modul eine leichte Präferenz für die Reduktion von Protonen. Da hier im
Vergleich zur tetrameren SH jedoch beide Aktivitäten stark herabgesetzt sind, kann keine
sichere Schlussfolgerung über die bevorzugte Katalyserichtung dieses Moduls getroffen
werden. Im Gegensatz dazu zeigte das Diaphorase-Modul katalytische Aktivitäten, die mit
denen der nativen SH vergleichbar sind.
4.6.2 Regulationsmechanismen der SH Aktivität
Die Aktivität der SH ist wie die meisten Enzyme im Metabolismus fein reguliert. Die stark
unterschiedlichen Affinitätskonstanten für NADH und NAD+ im Zusammenspiel mit der
Produkthemmung (NADH und NAD+) könnten als Regulationsmechanismen für die SH-
Aktivität bei schwankendem NAD+ und NADH-Konzentrationen dienen. Ein aktuelles SH-
Modell, das alle Reaktionen und Produktinhibitionen zusammenfasst, ist in Abbildung 40
dargestellt.
Abb. 40: Aktuelles SH-Modell mit einzelnen Kofaktoren und katalysierten Reaktionen. Die vermutlichen Quellen sowie die verschiedenen reduzierten Sauerstoffspezies sind dargestellt. Sauerstoff inaktiviert langsam das Hydrogenase-Modul, das aber schnell wieder reaktiviert werden kann. Die Elektronen des NADH, verantwortlich für eine schnelle Reaktivierung des oxidierten aktiven Zentrums, werden durch die FMN-Kofaktoren und [FeS]-Cluster transferiert (grüne gestrichelte Linie). Die CN--Liganden und der CO-Ligand des [NiFe]-Zentrums sind grün bzw. rot gekennzeichnet. Aus Gründen der Klarheit ist das Hydrogenase- vom Diaphorase-Modul separat gezeichnet. Die wichtigsten physiologischen Reaktionen sind in fetten Linien und Schrift gezeigt. „R“ steht für „unter reduzierenden Bedingungen“, „ “ für „Produkt-Hemmung“. Für Details siehe Text und Referenzen (Schneider und Schlegel 1976; Albracht und Hedderich 2000; van der Linden et al. 2004; Burgdorf et al. 2005)
2
O2-.
O2
NAD +
NADH
O2
R Abgabe FMN-bFMN-b
FeNi
FMN-b
R Abgabe
FMN-a
FMN -a
-
-H2
-
DiaphoraseHydrogenase
HoxH
HoxYHoxFHoxU
HoxI
H2O2, H2O
H2O
2H+
O2
e- fürReaktivierung
122 DISKUSSION
Für die NADH-Oxidation durch HoxFU betrug der KM-Wert 56 μM NADH, der in der
gleichen Größenordnung wie der KM-Wert von Komplex I aus Rinderherzmitochondrien
(90 μM) liegt (Gavrikova et al. 1995). Die Standardredoxpotentiale von NAD+/NADH und
von 2H+/H2 betragen -320mV bzw. -421 mV. Wie im Folgenden beschrieben, führen die die
tatsächlichen Konzentrationsverhältnisse von NAD+/NADH in der Zelle sogar zu zu höheren
Potenzialen, die the NADH-abhängige H2-Produktion verhindern . In E.coli liegt bei
exponentiellem Wachstum mit unterschiedlichen Kohlenstoffquellen die NADH-
Konzentration unter 150 μM (Bennett et al. 2009). Unter der Annahme, dass das
NAD+/NADH-Verhältnis unter aeroben Bedingungen in R. eutropha etwa 10:1 ist, wie es
zuvor für E. coli ermittelt werden konnte, folgt nach der Nernst-Gleichung: E = E°`+ 29,5
mV*lg[NAD+]*[NADH]-1 , ein Redoxpotential für das NAD+/NADH-Paar von E´ = -
290 mV. Daher ist die NADH-abhängige H+-Reduktion unter aeroben Bedingungen
thermodynamisch ungünstig. Aufgrund der Produkt-Hemmung durch NAD+ (KI(NAD+) = 100 -
300 μM) bei einer physiologisch relevanten Konzentration von ca. 1 mM ist die katalytische
NADH-Oxidation durch die SH zusätzlich erschwert (Kapitel 3.4.11). Beide Faktoren stellen
einen Kontrollmechanismus dar, um den Verlust von Reduktionskraft in Form von leicht
entweichendem H2 zu vermeiden. Bei einem Wechsel von aeroben zu anaeroben
Wachstumsbedingungen fehlt der terminale Elektronenakzeptor Sauerstoff, so dass die
Konzentration von NADH steigt. Dadurch erniedrigt sich das Redoxpotential des
NAD+/NADH-Paares (für eine Dekadenabnahme von [NAD+]*[NADH]-1 um -29,5 mV). Bei
einem NAD+/NADH-Verhältnis von 1:100 beträgt das Potential demnach -379 mV. Ist die
Wasserstoffkonzentration niedrig (100 nM H2, pH 8,0, E= -370mV), so ist die NADH-
abhängige Wasserstoffproduktion thermodynamisch möglich.
Die Protonenreduktion vieler membranständiger Hydrogenasen - wie z. B. die MBH aus
R. eutropha - wird durch das Produkt Wasserstoff inhibiert.. Eine H+-Reduktion unter einer
H2-Atmosphäre ist daher meist kaum nachweisbar (Vincent et al. 2005). Wie es für
ein bidirektionales Enzym zu erwarten ist, war das Hydrogenase-Modul der SH allerdings
auch in Gegenwart von 100 % H2 noch aktiv (Kapitel 3.3.5). Dadurch kann die
SH die Wasserstoffproduktion in ganzen Zellen beim Wechsel von aeroben zu
anaeroben Bedingungen katalysieren, wie bereits von Kuhn et al. 1984 gezeigt wurde.
Sowohl die NADH-Oxidations- als auch die NAD+-Reduktionsaktivität der SH sind durch
kinetische Parameter reguliert. Während des Wachstums hält der kontinuierliche Verbrauch
des von der SH produzierten NADH durch Komplex I, Transhydrogenasen oder der CO2-
Fixierung den NAD+/NADH Pool relativ oxidiert, so dass die wasserstoffabhängige NAD+-
DISKUSSION 123
Reduktion thermodynamisch bevorzugt ist (siehe oben). Das isolierte Diaphorase-Modul
zeigte im Falle der NAD+-Reduktion einen KM-Wert von 197 μM für NAD+ auf (Kapitel
3.4.10), was ca. 2,5 x niedriger ist als der KM-Wert der nativen SH von 500 μM (Schneider
und Schlegel 1976). Allerdings sind beide Werte deutlich höher als der KM (NAD+) von 7 μM
von Komplex I aus Rindermitochondrien (Gavrikova et al. 1995).
Wenn das Wachstum von R. eutropha von aeroben in anaerobe Bedingungen übergeht und
der NAD+/NADH-Pool stärker reduziert vorliegt (Kuhn et al. 1984), steigt die Konzentration
von NADH. Die relativ geringe Affinität der SH für NAD+ und die signifikante
Produktinhibition der NAD+-Reduktion durch NADH (KI(NADH) von ca. 200 bis 300 μM)
würden neben themodynamischen Gesichtpunkten die wasserstoffabhängige NAD+-
Reduktionsaktivität verlangsamen. Durch das Verhindern der wasserstoffabhängigen NAD+-
Reduktionsaktivität bei reduziertem NAD+/NADH-Pool wird daher die Rückreaktion, die
NADH-abhängige Wasserstoffproduktion, unterstützt. Die kinetischen Parameter (KM- und
KI-Werte) der SH unterstützen offensichtlich die thermodynamisch günstigere
Reaktionsrichtung. Elektrochemische Experimente an HoxFU zeigten, dass sowohl die
NAD+-Reduktion als auch die NADH-Oxidation nahe dem Standardpotential des
NAD+/NADH-Paares ablaufen (Kapitel 3.4.6). HoxFU arbeitet also ebenso wie das
Hydrogenase-Modul in beide Katalyserichtungen mit nur minimalem Überpotential (Kapitel
3.3.5). Ein geringes Überpotential für die Wasserstoffumwandlung konnte kürzlich für die
cyanobakterielle, NAD(P)+-reduzierende Hydrogenase aus Synechocystis sp. PCC 6803
bestätigt werden (McIntosh et al. 2011). Beide Module der SH katalysieren elektrochemische
Reaktionen, die bislang durch synthetische Katalysatoren nur träge und mit einem großen
Überpotential verlaufen. Redoxenzyme, die ebenfalls nur geringe Überpotentiale aufweisen,
sind die CO-Dehydrogenase, Komplex I, die Standardhydrogenasen und die Formiat-
Dehydrogenase (Armstrong und Hirst 2011). Ein Überpotential von mehr als 80 mV für die
H2-Oxidation weisen jedoch die bislang untersuchten sauerstofftoleranten, membranständigen
Hydrogenasen aus R. eutropha, Aquifex aqueous und E. coli auf (Vincent et al. 2005),
(Pandelia et al. 2010), (Lukey et al. 2010). Daher demonstriert die Fähigkeit von HoxHY
nahe dem E(2H+/H2) zu funktionieren, dass ein Überpotential für die O2-Toleranz nicht
unbedingt erforderlich ist. Ein nur minimales Überpotential ist besonders für die Funktion der
SH wichtig, da sich E°`(2H+/H2) = -413 mV nur um 100 mV von E°`(NAD+/NADH) = -
320 mV unterscheidet und daher nur eine geringe treibende Kraft für die H2- bzw. NADH-
Oxidation zur Verfügung steht.
124 DISKUSSION
4.6.3 Potential abhängige Effekte auf die Aktivität der SH
In der NAD(H)-Bindestelle der SH spielt das FMN-b für die Zwei-zu-Ein-Elektronen-
Konversion und die Weiterleitung auf die [FeS]-Cluster in eine wichtige Rolle. Hirst und
Mitarbeiter (2007) untersuchten einen Subkomplex von Komplex I aus bovinen
Mitochondrien, der Ähnlichkeiten zu HoxF aus R. eutropha besitzt. Bei Potentialen unterhalb
von -400 mV unterlag der Subkomplex einer reversiblen reduktiven Inaktivierung (Barker et
al. 2007). Um die Inaktivierung zu erklären, wurden zwei Modelle aufgestellt. Zum einen
wurde ein Modell vorgeschlagen, bei dem die semireduzierte Form des Flavins die Aktivität
des Komplex I verstärkt und zum anderen eines, das die Auswirkungen des Redoxzustandes
des in der Nähe befindlichen [2Fe-2S]-Clusters in der „24 kDa-Untereinheit“ (analog zu
Nqo2) berücksichtigt. Für beide Modelle wurden Voltammogramme simuliert, die beide im
Einklang mit den experimentellen Daten standen. Es wurde vorgeschlagen, dass die
Inaktivierung bei niedrigen Potentialen eine physiologische Rolle bei der Verlangsamung des
rückläufigen Elektronentransports (Ubiquinol zu NAD+) spielen könnte (Barker et al. 2007).
Für das HoxFU-Modul der SH konnte bei NAD+-Konzentrationen oberhalb des KM für NAD+
in einem Potentialbereich -0,1 V bis -0.6 V keine plötzliche Inaktivierung bei festgestellt
werden (Kapitel 3.4.9). In HoxFU fehlt ein Pendant zum [2Fe2S]-Cluster der „24 kDa-
Untereinheit“ von Komplex I, was vermuten lässt, dass dieser in der reversiblen Inaktivierung
von Komplex I involviert sein könnte. Bei negativen Potentialen wurde allerdings ein
langsamer Verlust von HoxFU-Aktivität bei NAD+-Konzentrationen beobachtet, die deutlich
unter dem KM(NAD+)-Wert lagen. Es gab keine Anzeichen für eine Reaktivierung, wenn das
Elektrodenpotential wieder zu positiveren Werten verschoben wurde, was wahrscheinlich auf
eine irreversible Schädigung des Proteins zurückzuführen ist. Außerdem verschob sich der
Beginn der katalytischen NAD+-Reduktion zu negativeren Potentialen. Beide Sachverhalte
legen nahe, dass die verbleibende Aktivität mit einer geschädigten Fraktion des Enzyms
verbunden ist. Es wurde bereits beschrieben, dass reduzierende Bedingungen zu dem Verlust
des FMN-a in der SH oder des entsprechenden Flavins in Komplex I führen, insbesondere in
der Abwesenheit von NAD+ (van der Linden et al. 2004), (Sled und Vinogradov 1993).
Ebenso erforderten die simulierten Voltammogramme des Komplex I (siehe oben) die
Berücksichtigung des FMN-Verlustes aus dem Enzym und die Inaktivierung bei niedrigen
Potentialen (Barker et al. 2007). Für Komplex I konnte das Redoxpotential für FMN mit ca. -
400mV (pH 8,0) durch Auftauchen von nichtkatalytischen Strömen in Abwesenheit von
Substrat bestimmt werden. Das Potential für FMN in HoxFU konnte leider nicht bestimmt
werden, da keine nichtkatalytischen Signale zu detektieren waren. Wahrscheinlich liegt das
DISKUSSION 125
Redoxpotential des FMN-b wie in Komplex I bei etwa -400 mV. Bei diesem Reodoxpotential
konnte eine Inaktivierung der HoxFU-Aktivität bei gleichzeitiger niedriger
Substratkonzentration beobachtet werden. Bei NAD+-Konzentrationen deutlich unter dem KM
(NAD+) liegt die NAD(H)-Bindestelle wahrscheinlich längere Zeit unbesetzt vor. Wenn nun
ein geringes Potential (~-400 mV) eingestellt wird, wird das FMN-b reduziert und kann wie in
Komplex I leicht aus dem Enzym verloren gehen, da die Dissoziationskonstante von
reduziertem FMN 60000-mal geringer ist als für oxidiertes FMN (Barker et al. 2007). Bei
Experimenten mit HoxFU in Lösung führten hohe NADH-Konzentrationen (1 mM) ebenfalls
zum Verlust der NADH-abhängigen BV-Reduktionsaktivität und einer Freisetzung von FMN
(Kapitel 3.4.4). Dies kann durch das niedrige Redoxpotential einer reinen NADH-Lösung (E=
-408,5mV bei [NAD+]*[NADH]-1=0,001) erklärt werden. Weitere Arbeiten, in denen die
Redoxpotentiale der Redoxzentren in HoxFU mit EPR-Redoxtitrationen bestimmt werden,
wären notwendig, um das Zusammenspiel des FMN mit den [Fe-S]-Clustern besser zu
verstehen. Dafür wäre jedoch ein besseres Produktionssystem nötig, um HoxFU in
Milligramm-Mengen zu reinigen.
4.6.4 HoxFU produziert Superoxid
Reaktive Sauerstoffspezies wie Superoxid oder Wasserstoffperoxid gelten als Hauptquelle
von oxidativem Stress in Zellen. In Komplex I wurden reduziertes Flavin und der [4Fe4S]-
Cluster in Nqo6 als Orte der Superoxid-Produktion vorgeschlagen. Die Superoxidproduktion
erhöhte sich, wenn der NAD+/NADH-Pool reduziert vorlag (Kussmaul und Hirst 2006;
Berrisford et al. 2008; Hirst 2010). Im Falle der SH wird FMN-b vermutlich durch direkten
Hydridtransfer vom Substrat NADH reduziert. Die Ein-Elektronenübertragung zu den [FeS]-
Clustern führt zu den Semichinonradikalformen des Flavins, die auch bei der Reduktion des
FMN-b in HoxFU durch Dithionit zu beobachten war (Kapitel 3.4.4). In Anwesenheit von
NADH und O2 weist HoxFU eine Superoxid-Umsatzrate von 0,46 min-1 auf, die vergleichbar
ist mit der entsprechenden Rate für das SH-Holoenzym (0,31 min-1) (Kapitel 3.5.5). Daher
kann HoxFU als Hauptort der Superoxidproduktion in der SH angesehen werden. Die
Superoxidproduktion der SH liegt in derselben Größenordnung wie die der Glutathion-
Reduktase (0,8 min-1), aber geringer im Vergleich zur Succinat-Dehydrogenase (13 min-1), zu
Komplex I aus Bos taurus (40 min-1) und der Fumarat-Reduktase (1.600 min-1) (Kussmaul
und Hirst 2006; Imlay 1995). Für Komplex I aus Bos taurus wurde vornehmlich die Bildung
von Superoxid gezeigt, jedoch kein Wasserstoffperoxid (Kussmaul und Hirst 2006). Im
Gegensatz zum Komplex I aus Bos taurus, produziert Komplex I aus E. coli hauptsächlich
Wasserstoffperoxid (Esterhazy et al. 2008). Es wurde vorgeschlagen, dass der [2Fe2S]-
126 DISKUSSION
Cluster in der „24 kDa-Untereinheit“ die Lebensdauer des reduzierten Flavins durch
vorübergehende Aufnahme eines Elektrons minimieren kann (Esterhazy et al. 2008). Das
Fehlen eines analogen Clusters in HoxFU und die geringere Rate der Produktion von
Superoxid als in Komplex I unterstützt diese Hypothese jedoch nicht.
4.6.5 Weitere Reaktionen des Diaphorase Moduls mit Sauerstoff
Die SH katalysiert in vivo die H2-vermittelte NAD+-Reduktion auch in der Anwesenheit von
O2 (Schneider und Schlegel 1976). Dabei stellt sich die Frage, welche molekularen
Mechanismen in der SH für die Sauerstofftoleranz verantwortlich sind. Elektrochemische
Experimente am isolierten HoxFU zeigten, dass beide Katalyserichtungen, d. h. die NAD+-
Reduktion sowie die NADH-Oxidation auch in Gegenwart von O2 ablaufen. Im Verlaufe der
NAD(H)-Umwandlung wurden jedoch einige Elektronen für die Reduktion von Sauerstoff
genutzt, wobei Superoxid und Wasser freigesetzt wurden. Allerdings waren die Superoxid-
und Wasserproduktionsraten 6500- bzw. 509-fach geringer als die NADH-Umsatzrate. Die
Superoxidproduktion findet dabei wahrscheinlich am FMN-b statt (siehe Kapitel 3.5.5),
wohingegen Ort und Mechanismus der Wasserproduktion unklar sind.
Ähnlich wie Komplex I enthält HoxFU ein Flavin und mehrere [Fe-S]-Cluster. Die
Wasserproduktion als Folge der O2-Reduktion wurde für den isolierten Komplex I bislang
nicht gezeigt. Für HoxFU wären zwei Elektronen vom reduzierten FMN-b und zwei weitere
Elektronen von [Fe-S]-Clustern ausreichend, um O2 vollständig zu Wasser zu reduzieren. Von
Flavin-abhängige Monooxygenasen ist es z.B. bekannt, dass sie die O=O Bindung über das
Flavin spalten, ein Sauerstoffatom auf das Substrat übertragen und das andere Sauerstoffatom
zu Wasser reduzieren (Massey 1994). Eine andere Möglichkeit wäre Wasserproduktion an
einem Metallcluster, der als Folge der Ablösung von HoxHY vom HoxFU-Modul der
umgebenden Lösung ausgesetzt ist. Aufgrund der räumlichen Anordnung der Fe-S-Cluster,
wäre der wahrscheinlichste Kandidat der distale [4Fe-4S]-Cluster in HoxU, der dem Cluster
N5 in Komplex I entspricht (Albracht und Hedderich 2000; Sazanov und Hinchliffe 2006). Es
ist wichtig zu erwähnen, dass kein Eisen-Schwefel-Cluster bekannt ist, der die Reduktion von
O2 zu H2O katalysieren kann.
Allerdings sind Metallkofaktoren nicht unbedingt für die NADH-abhängige Produktion von
H2O über O2 erforderlich. In der H2O-bildenden NAD(P)H-Oxidase aus Lactobacillus
sanfranciscensis wird das im Enzym gebundene FAD durch eine Hydridübertragung von
NAD(P)H reduziert (Lountos et al. 2006). Anschließend wird O2 zu H2O reduziert, wobei
zunächst ein Wasser-Molekül freigesetzt wird, während das verbleibende Sauerstoffatom an
einen konservierten Cysteinrest gebunden wird, so dass Cys-SOH als Zwischenprodukt
DISKUSSION 127
entsteht. Mit Hilfe eines zweiten NAD(P)H-Moleküls wird das Cys-SOH-Derivat wieder zu
einem Thiolat reduziert und ein zweites H2O-Molekül freigesetzt. In dem aerotoleranten
Anaerobier L. sanfranciscensis wird über diesen Mechanismus Sauerstoff „entsorgt“ und so
oxidativer Stress vermieden. Außerdem kann durch die NADH-Oxidase NAD+ für die
Glykolyse regeneriert werden. Die NADH-Peroxidase aus Enterococcus faecalis scheint über
einen vergleichbaren Mechanismus mit einem redoxaktiven Cystein Wasserstoffperoxid zu
Wasser zu reduzieren (Poole und Claiborne 1989). Es ist denkbar, dass in HoxFU ein
ähnlicher Mechanismus für die H2O-Produktion über den FMN-b-Kofaktor verantwortlich ist.
Jedoch kommt in der kombinierten FMN/NAD(H)-Bindetasche der SH kein Cystein vor
(Abbildung 30), das als H2O2-Akzeptor von dienen könnte. Daher bleiben Ort und
Mechanismus der H2O-Freisetzung durch HoxFU unbekannt.
4.6.6 Reaktionen des Hydrogenase Moduls mit Sauerstoff
Im Gegensatz zum Diaphorase-Modul wird das Hydrogenase-Modul langsam durch O2
inaktiviert. Die Sauerstoffinaktivierung von HoxHY (ca. 0,02 s-1 bei 30 °C, +216 mV und 2 %
O2) erfolgt deutlich langsamer als bei der [NiFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio
desulfuricans (ca 0,8 s-1 unter ähnlichen Bedingungen; Liebgott et al. 2010). Von der
Hydrogenase aus D. fructosovorans existieren O2-tolerante Varianten mit verändertem
Gaskanal, die allerdings immer noch fünfmal schneller durch Sauerstoff inaktiviert wurden
als das HoxHY-Modul (0,1 s-1 für die V74Q-Variante; Liebgott et al. 2010). Die
Sauerstoffinaktivierungsrate ist ebenfalls geringer als die der meisten [FeFe]-Hydrogenasen,
jedoch ähnlich der der Hydrogenase aus Clamydomonas reinhardtii (Liebgott et al. 2010),
(Goldet et al. 2009). Die O2-tolerante, membrangebundene [NiFe]-Hydrogenase aus Aquifex
aeolicus reagiert ebenfalls nur langsam mit O2 (Pandelia et al. 2010). Daher stellt sich die
Frage, wie die Sauerstofftoleranz der SH vermittelt wird, wenn das [NiFe]-Zentrum durch O2
langsam inaktiviert wird. Die elektrochemischen Studien zeigten, dass HoxHY eine
Halbwertszeit von etwa 1 min bei 10 °C, +216 mV und 2 % O2 aufwies, allerdings wurde die
Aktivität bei niedrigeren Potentialen schnell wiederhergestellt (vollständig innerhalb von 10 s
bei -384 mV). Die Reaktivierung fand sogar in Gegenwart von O2 statt (Kapitel 3.3.9). Das
Reaktivierungspotential von Eswitch= -170 mV für HoxHY-Spezies, die zuvor durch Sauerstoff
inaktiviert wurden, weist darauf hin, dass die Reaktivierung der nativen SH durch das
Redoxpotential des cytoplasmatischen NAD+/NADH-Pools (ca. E=-290 mV) gewährleistet
sein sollte. Demzufolge ist die kontinuierliche aerobe H2-Oxidation bei Potentialen nahe
E(2H+/H2) möglich.
128 DISKUSSION
Das isolierte Hydrogenase-Modul war zunächst inaktiv und benötigte eine Reaktivierung
(Kapitel 3.3.2 und Kapitel 3.3.6). Es konnte in Lösung entweder durch Dithionit oder
immobilisiert auf einer Elektrode durch ein geringes Potential reaktiviert werden.
Vergleichbar dazu ist für die gereinigte native SH eine „autokatalytische“ Reaktivierung
durch NADH notwendig (Schneider et al. 1976).
Das gereinigte HoxHY-Modul wies bei pH-Werten von pH 8,0, 7,0 und bzw. 6,0 Eswitch-Werte
von -340 mV, -300 mV bzw. -245 mV reduktive
Reaktivierung mit einem Protonen-Transfer einher geht. Nach Reduktion einer
Sauerstoffspezies im aktiven Zentrum und Protonenübertragung im HoxHY-Modul könnte z.
B. Wasserstoffperoxid oder Wasser freigesetzt werden, siehe Schema 1.
O2 + e- O2–
O2 +2 e- +2 H+ H2O2
O2 +3 e- +3 H+ H2O + ·OH
O2 +4 e- +4 H+ 2 H2O Schema 1: Produzierte Sauerstoffspezies nach Reduktion von Sauerstoff
Außerdem wurde nach erneuter Sauerstoffinaktivierung des zuvor reaktivierten HoxHY-
Proteins ein zweites Reaktivierungspotential (Eswitch= -170 mV bei pH 7,0) festgestellt, das
höher war als das Reaktivierungspotential des frisch isolierten HoxHY-Proteins (Eswitch= -
300 mV bei pH 7,0). Dies deutet auf zwei unterschiedliche durch Sauerstoff inaktivierte
Spezies hin. Der erste Eswitch-Wert von -300mV steht in guter Übereinstimmung mit dem
Redoxpotential des zu 10 bis 20 % reduzierten NAD+/NADH-Pools in E .coli-Zellen, das
auch in R. eutropha zu erwarten ist. Das zweite Reaktivierungspotential (Eswitch= -170 mV)
stimmt mit dem Redoxpotential des SH-Kofaktors FMN-a (-170 mV) überein (Erkens et al.
1996; Bennett et al. 2009), (van der Linden et al. 2006). Für die bidirektionale Hydrogenase
aus Synechocystis sp. PCC 6803 wurden ebenfalls zwei unterschiedliche
Reaktivierungspotentiale (-372 mV und ca. -100mV) detektiert (McIntosh et al. 2011). Die
oxidativ inaktivierte MBH aus R. eutropha weist mit +115 mV bei pH 6,0 einen sehr viel
positiveren Eswitch–Wert auf (Vincent et al. 2005) als das inaktive HoxHY-Modul, das zwei
verschiedene Reaktivierungspotentiale besitzt (Eswitch= -245 mV bei pH 6.0,
zweiter Eswitch= -170 mV bei pH 7,0). Dies kann mit der Kopplung der MBH mit dem Chinon-
Pool in der cytoplasmatischen Membran erklärt werden, dessen Potential bei etwa +90 mV
liegt (Bernhard et al. 1997). Auch die Eswitch-Werte der beiden membranständigen
Hydrogenasen, Hyd-1 und Hyd-2, aus E. coli sind mit +150 bzw. -85 mV (pH 6,0) deutlich
positiver (Lukey et al. 2010) als die von HoxHY.
DISKUSSION 129
Das Hydrogenase-Modul ist in der nativen SH über eine Elektronentransportkette mit dem
Diaphorase-Modul verbunden, so dass die Wasserstoffoxidation direkt an die NAD+-
Reduktion gekoppelt ist. Falls das [NiFe]-Zentrum durch Sauerstoff oxidiert wird, können
demzufolge Elektronen aus NADH durch reversen Elektronentransfer das [NiFe]-Zentrum
reaktivieren. Die in der CV beobachteten hohen NAD+/NADH- und 2H+/H2-Umsatzraten über
einen weiten Potentialbereich bei nur minimalem Überpotential erlaubten sowohl
Wasserstoffoxidation als auch Wasserstoffproduktion unter physiologischen Bedingungen.
Dadurch kann R. eutropha mit Wasserstoff als Energiequelle wachsen und bei einem Wechsel
von aeroben zu anaeroben Wachstumsbedingungen überschüssige Reduktionsequivalente in
Form von Wasserstoff entsorgen.
4.7 Durch Sauerstoff hervorgerufene Redoxzustände in der SH
Von welcher Natur sind die Sauerstoffmodifikationen des [NiFe]-Zentrums der SH? Die
spektroskopischen Untersuchungen an der isolierten nativen SH und dem Hydrogenase-
Modul deckten oxidierte, inaktive Redoxzustände auf, die jedoch schnell reaktiviert werden
können (Kapitel 3.2 und Kapitel 3.3). Im Gegensatz zu den O2-sensitiven Standard-
Hydrogenasen trat jedoch kein inaktiver, nur langsam reaktivierbarer Niu-A-Zustand auf
(Fernandez et al. 1985;
Kurkin et al. 2004). Die Reaktivierung der SH ist ein schneller Prozess, der sogar in
Gegenwart von Sauerstoff stattfinden kann (siehe Kapitel 3.3.9). Die FTIR-Analyse des
HoxHY-Subkomplexes zeigte zwei oxidierte Zustände (Ni-Ox und Ni-Ox2), die bei der in
situ-Spektroskopie der nativen SH nicht gefunden wurden. IR-Daten vom HoxHY-
Subkomplex der bidirektionalen Hydrogenase aus dem Schwefelpupurbakterium
Allochromatium vinosum deckten ebefalls eine Mischung von Redoxzuständen auf (Long et
al. 2007), die auch bei der SH und der bidirektionalen Hydrogenase aus Synechocystis
detektiert wurden. Der am stärksten oxidierte Zustand des HoxHY-Moduls ist Ni-Ox, der zu
dem ebenso inaktiven Ni-Ox2 umgewandelt werden kann. Das frisch isolierte Hydrogenase-
Modul, das für die elektrochemischen Experimente eingesetzt wurde (Kapitel 3.3.6), befand
sich vorwiegend im Ni-Ox-Zustand (Kapitel 3.3.10). Daher ist der niedrige Eswitch-Wert von -
300 mV des gereinigten Hydrogenase-Moduls wahrscheinlich auf die Umwandlung des Ni-
Ox-Zustandes in die verschiedenen reduzierten Nia-SR-Zustände zurückzuführen. Ein zweites
Reaktivierungsspotential bei -170 mV wurde nach der O2-Exposition des aktiven Enzyms
festgestellt. Es ist jedoch nicht klar, wie dieser Reaktivierungsschritt mit den spektroskopisch
beobachteten Zuständen in Verbindung steht. Weitere spektroelektrochemische
Untersuchungen sind erforderlich, um die Reaktivierung des [NiFe]-Zentrums von HoxHY zu
130 DISKUSSION
verstehen. Für das Hydrogenase-Modul konnte durch elektrochemische Untersuchungen
gezeigt werden, dass keine anaerobe oxidative Inaktivierung bei hohem Redoxpotential
stattfand (Kapitel 3.3.6). Dies ist in Übereinstimmung mit der elektrochemischen
Charakterisierung der bidirektionalen Hydrogenase aus Synechocystis sp. PCC 6803
(McIntosh et al. 2011). Eine reversible Inaktivierung bei hohem Redoxpotential unter
anaeroben Bedingungen ist typisch für die Ausbildung des Nir-B-Zustandes mit einer
Hydroxylgruppe als Brückenligand zwischen Nickel und Eisen im aktiven Zentrum der
membranständigen Hydrogenasen (Vincent et al. 2007). Das deutet darauf hin, dass sich die
oxidierten Zustände der SH von den oxidierten Redoxzuständen der membranständigen
Hydrogenasen unterscheiden.
Die SH zeigt im gereinigten, oxidierten Zustand ein außergewöhnliches IR-Spektrum mit vier
CN-- und einem CO-Liganden. Die damalige Interpretation war, dass zwei zusätzliche CN--
Liganden am [NiFe]-Zentrum vorhanden sind (van der Linden et al. 2004). In der
vorliegenden Studie konnte diese Hypothese jedoch widerlegt werden (Kapitel 3.1). Es stellt
sich allerdings die Frage, wie dieses Bandenmuster zustande kommt. Zusammen mit Marius
Horch wurde die Hypothese aufgestellt, dass die isolierte SH reversible
Sauerstoffmodifikationen an den verbrückenden Cysteinen des [NiFe]-Zentrums trägt, die
leicht durch Reduktion mit NADH entfernt werden können. Die Simulation der CN-- und CO-
Streckschwingungen, bei denen jeweils eines der verbrückenden Cysteine eine
Sauerstoffmodifikation besitzt, führte zu Spektren, die dem komplexen Bandenmuster der
gereinigten SH sehr ähnlich sind (persönliche Mitteilung Marius Horch). Die einfachste
Erklärung des außergewöhnlichen IR-Spektrums der isolierten ist eine Überlagerung
verschiedener Redoxzustände, die alle dieselben CO-Streckschwingungen besitzen.
Nach Behandlung der isolierten SH mit vier CN--Banden mit dem Reduktionsmittel DTT
halbierte sich die Anzahl der CN--Banden und es entstand ein IR-Spektrum, welches dem
NirB-ähnlichen Zustand zugeordnet werden konnte (Kapitel 3.2.6). Ein Nir-B-ähnlicher
Zustand konnte auch für die bidirektionale Hydrogenase aus Synechocystis sp. PCC 6803
detektiert werden (Germer et al. 2009). Reduktionsmittel wie DTT, Mercaptoethanol oder
TCEP sind dafür bekannt, Disulfidbrücken oxidierter Cysteine zu reduzieren sowie
Enzyminaktivierung, die durch Oxidation von Thiol-Gruppen hervorgerufen wird, zu
verhindern (Luo et al. 2012; Seefeldt et al. 2012). Außerdem verdoppeln Reduktionsmittel
wie DTT oder TCEP die H2:NAD+-Oxidoreduktaseaktivität der SH. Ein ähnlicher Effekt
wurde mit FMN erzielt, was auf einen ähnlichen Reaktionsmechanismus hinweist. Daher ist
es wahrscheinlich, dass die genannten Reduktionsmittel durch einen bislang unbekannten
DISKUSSION 131
Mechanismus die Entfernung oxidativer Modifikationen des aktiven Zentrums der SH
erlauben. Frühere XAS-Studien deckten auf, dass das Nickel der gereinigten SH im
Gegensatz eine im Vergleich zu anderen [NiFe]-Hydrogenasen auffällige N/O-Koordination
aufweist (Gu et al. 1996; Müller et al. 1997; Burgdorf et al. 2005). Nach Reduktion der SH
mit NADH und H2 zeigte sich eine signifikante strukturelle Änderung, wobei das Nickel
hauptsächlich S-Liganden aufwies, was auf die reversible Entfernung von Sauerstoffspezies
(oder Stickstoff) hinweist. Die Reversibilität der Sauerstoff-Modifikation von Nickel-
Thiolaten in NiN2S2-Modellkomplexen konnte schon von Darensbourg und Mitarbeitern
gezeigt werden und deutet auf die generelle Möglichkeit der reversiblen Reduktion von S=O
Spezies an Nickel hin (Farmer et al. 1994; Darensbourg und Grapperhaus 1998).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die oxidierte SH höchstwahrscheinlich
Sauerstoffmodifikationen an den koordinierenden Cysteinen trägt (Abbildung 41B). Diese
können durch ein geringes Potential, wie es durch NADH physiologisch erreicht wird, wieder
reduziert werden.
4.8 Modell der Sauerstofftoleranz der SH
Die SH ist in der Lage in Gegenwart von Sauerstoff, Wasserstoff zu oxidieren. Bei einer O2-
Konzentration von 0,47 mM (40% Sättigung), verringerte sich die Aktivität von 480 s-1 nur
um 15 % auf 408 s-1. Unter den gleichen Bedingungen wurde eine O2-Reduktionsaktivität von
1,8 s-1 bestimmt. Dies zeigt, dass die SH kontinuierlich sowohl mit H2 als auch O2 reagiert.
Somit erfolgt bei der Oxidation von etwa 200 H2-Molekülen die Reduktion eines O2-
Moleküls.
Es ist wichtig anzumerken, dass die NADH-abhängige O2-Reduktionrate (1,6 s-1) der SH 15-
fach höher war als die H2-Freisetzung über die NADH-abhängige Protonenreduktion
(0,11 s-1). Dies ist in Übereinstimmung mit dem Modell, bei dem H+ und O2 am [NiFe]-
Zentrum um die Elektronen konkurrieren (Abbildung 41). Aus thermodynamischen Gründen
wird O2 deutlich bevorzugt. Zuvor wurde gezeigt, dass die SH als H2-produzierendes Redox-
Ventil in R.eutropha-Zellen dient, die von aeroben zu anaeroben Wachstumsbedingungen
wechseln (Kuhn et al. 1984).
Hydrogenasen, die mit dem Photosystem gekoppelt sind, stellen ein vielversprechendes
System zur lichtgetriebenen H2-Produktion dar. Die SH weist eine hohe Sauerstofftoleranz
auf, die für eine Verknüpfung mit der oxygenen Photosynthese notwendig ist, bei der
Sauerstoff freigesetzt wird (siehe Abbildung 42GI und GII für zwei verschiedene Ansätze für
die Kopplung mit dem Photosystem). Allerdings weist die SH nur eine sehr geringe anaerobe
132 DISKUSSION
NADH-vermittelte H2-Produktionsaktivität (0,11 s-1) auf. Außerdem ist die O2-Reduktionsrate
in Gegenwart von 40% O2 15-mal höher als die H2-Produktionsrate.
Abb. 41: Reduktion von O2 am aktiven [NiFe]-Zentrum der SH. Während der H2-Umwandlung wird das Nia-C-Intermediat gebildet. In Anwesenheit von O2 unterliegt die aktive SH aerober Inaktivierung. Vermutlich wird ein Peroxid-Ligand gebildet, der schnell durch die Freisetzung von Wasserstoffperoxid reaktiviert werden kann. Ferner ermöglicht eine FMN-abhängige Reaktion die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser über ein Cys-SO-Intermediat. Allerdings ist es fraglich, welches der vier koordinierenden Cysteine die Sauerstoffmodifikation trägt.
Die meisten Reduktionsäquivalente werden für die O2-Reduktion genutzt und stehen deshalb
nicht für die Reduktion von Protonen zu H2 zur Verfügung. Daher ist die SH kein geeignetes
Enzym für den Einsatz in der lichtgetriebenen H2-Produktion.
Es stellt sich die Frage, wie die Reduktion der oxidierten Cysteine in der SH katalysiert wird.
Für sauerstofftolerante, membranständige Hydrogenasen wurde die Reduktion von Sauerstoff
zu Wasser am katalytischen Zentrum über einen reversen Elektronentransport postuliert
(Cracknell et al. 2009). Es wurde weiterhin vorgeschlagenen, dass Wasser über einen
Wasserkanal vom aktivem Zentrum zur Proteinoberfläche gelangt, wie es für die MBH als
auch für Laccasen und Cytochrom-c-Oxidasen gezeigt wurde (Bento et al. 2005; Fritsch et al.
DISKUSSION 133
2011; Tiefenbrunn et al. 2011). Die vorliegende Studie bringt den ersten experimentellen
Beweis für die Hypothese der Wasserproduktion. Die native SH reduzierte mit Hilfe von
Wasserstoff Sauerstoff zu Superoxid, Wasserstoffperoxid und Wasser (Kapitel 3.5).
Allerdings wurden bei der NADH-abhängigen O2-Reduktion nur 68-82% der
Sauerstoffatome als Reduktionsprodukte detektiert. Das geringe Sauerstoffatom-
Ungleichgewicht wurde wahrscheinlich durch gewisse Ungenauigkeiten der komplexen
Messsysteme verursacht. Superoxidproduktion wurde, wie in Kapitel 3.5.5 beschrieben, dem
FMN-b zugeordnet. Die Wasserstoffperoxid-Produktion der nativen SH war etwa 50-mal
höher als die Superoxidproduktionsrate. Dabei zeigte das Diaphorase-Modul nur eine sehr
geringe H2O2-Produktionsrate, die auf den spontanen Zerfall des produzierten Superoxids
zurückzuführen ist. Dies deutet darauf hin, dass das Hydrogenase-Modul die Hauptquelle der
H2O2-Produktion ist (Kapitel 3.5.6). Die NADH-abhängige Wasserstoffperoxidproduktion
durch die Wildtyp-SH und das SHI64A-Derivat zeigt, dass der rückläufige Elektronenfluss von
der NADH-Bindungsstelle im Diaphorase-Modul zu entweder dem [NiFe]-Zentrum, dem
FMN-a oder dem [4Fe-4S]-Cluster im Hydrogenase-Modul eine wichtige Rolle in der der
H2O2-Freisetzung spielt. Bislang wurde kein herkömmlicher Eisen-Schwefel-Cluster als
Quelle von H2O2 identifiziert, während FMN ein bekannter Kofaktor für die H2O2-Produktion
ist (Massey 1994). Tatsächlich war die H2O2-Produktion des SHwt-Enzyms deutlich von der
Anwesenheit von FMN in dem Reaktionsansatz abhängig, jedoch anders als erwartet.
Bisherigere Studien zeigten, dass FMN-a nur lose an das Enzym gebunden ist und die SH mit
geringem FMN-a-Gehalt durch Zusatz von externem FMN rekonstituiert werden kann
(Schneider und Schlegel 1978; van der Linden et al. 2004). Das SHwt-Enzym mit geringem
FMN-a-Gehalt zeigte eine zweifach höhere H2O2-Produktionsrate als SH-Protein in
Gegenwart von extern appliziertem FMN. Unter Annahme, dass das externe FMN in die
FMN-a-Bindetasche der SH eingebaut wird, deutet dies darauf hin, dass Wasserstoffperoxid
am [NiFe]-Zentrum statt am FMN-a erzeugt wird (Abbildung 41A zu C, rechts). Die SH ist
erstaunlich stabil in Gegenwart von H2O2, solange sie keine H2-Katalyse betreibt. Nach 24-
stündiger Inkubation mit 10 mM H2O2 verringerte sich die wasserstoffabhängige NAD+-
Reduktionsaktivität nur um 15 % (Schneider und Schlegel 1981). Darüber hinaus werden
cytoplasmatische Peroxidasen und Katalasen, die bei H2-getriebenem, lithoautotrophem
Wachstum verstärkt synthetisiert werden (Kohlmann et al. 2011), wahrscheinlich die schnelle
Zersetzung von H2O2 in H2O vorantreiben. Für die Reduktion von Sauerstoff zu
Wasserstoffperoxid sind nur zwei Elektronen und zwei Protonen notwendig (Schema 1). Es
stellt sich die Frage, in welchem Redoxzustand das [NiFe]-Zentrum mit Sauerstoff reagiert.
134 DISKUSSION
Entweder könnte das reduzierte [NiFe]-Zentrum im Nia-C-Zustand mit einem Hydrid in der
verbrückenden Position zwischen Eisen und Nickel (Abbildung 41D) oder das [NiFe]-
Zentrum im Nia-S-Zustand ohne Bückenligand (Abbildung 41C) mit Sauerstoff reagieren. Die
beiden Elektronen, die für die Produktion eines Wasserstoffperoxidmoleküls benötigt werden,
könnten entweder beide vom Hydrid stammen oder von den [Fe-S]-Clustern und dem Nickel
im Oxidationszustand +II geliefert werden (Abbildung 41). Interessanterweise wurde die
Insertion von molekularem Sauerstoff in Übergangsmetall-Hydridbindungen und die damit
einhergehende Bildung von Metall-Hydroperoxid für mehrere, insbesondere
nickelhydridhaltige Modellkomplexe gezeigt (Schlangen und Schwarz 2008). Dies unterstützt
das Modell, dass die zwei Elektronen von dem Hydrid der SH im Nia-C-Zustand stammen.
Ein Modell des Schutzes des [NiFe]-Zentrums der SH vor Sauerstoff ist in Abbildung 41
dargestellt. Nach Reaktion des Hydrids mit Sauerstoff würde ein Hydroperoxidligand als
Intermediat am NiIII entstehen (Abbildung 41A) Allerdings wurde bislang mittels EPR-
Spektroskopie kein paramagnetisches NiIII im aktiven Zentrum der oxidierten SH festgestellt
(Kapitel 3.1.3). Entweder ist der Zustand zu kurzlebig, so dass er noch nicht nachgewiesen
wurde, oder es existiert eine antiferromagntische Kopplung zu einem benachbarten
Redoxzentrum, die zur EPR-Inaktivität führt. Nach der Reduktion des einen
Hydroperoxidliganden tragenden [NiFe]-Zentrums (Abbildung 41A), und gleichzeitiger
Übertragung eines Protons, wird Wasserstoffperoxid freigesetzt. Dadurch wird der Nia-S-
Zustand (Abbildung 41C) regeneriert, der wieder mit Wasserstoff reagieren kann.
Erstaunlicherweise förderte in die SH rekonstituiertes FMN-a die Wasserproduktion (Kapitel
3.5.8). Im Falle flavinhaltiger NADH-Peroxidasen läuft die Reduktion von
Wasserstoffperoxid zu Wasser über die Bildung eines Cys-SOH-Derivats ab. Das Cys-SOH-
Derivat wird vom reduzierten Flavinkofaktor durch zweifache Elektronenübertragung
reduziert, sodass Wasser freigesetzt wird (siehe Details in Kapitel 4.6.5; Poole und Claiborne
1989; Yeh et al. 1996). Ein ähnlicher Mechanismus ist für die Wasserproduktion am [NiFe]-
Zentrum denkbar (Abbildung 41). Durch Zwei-Elektronenübertragung von FMN-a auf ein
Cys-SO(H)-Derivat (Abbildung 41B) würde der Sauerstoff mit Hilfe zweier Protonen zu
Wasser reduziert werden. Das niedrige Redoxpotential von NADH (E°`(NAD+/NADH)= -320
mV) ist notwendig für die Reduktion der Sauerstoffmodifikationen an Cysteinen. Das weit
höhere Redoxpotential des Chinonpools (+90 mV) ist dagegen vermutlich nicht ausreichend,
um das [NiFe]-Zentrum in membrangebundenen Hydrogenasen vor Sauerstoff in gleicher
Weise zu schützen. Nach dem aktuellen Modell der Sauerstofftoleranz der MBH (Goris et al.
2011) werden für die schnelle Reduktion von O2 zu einem Wassermolekül vier Elektronen
DISKUSSION 135
benötigt. Das zweite Sauerstoffatom wird dabei als Hydroxylligand zwischen dem Eisen und
dem Nickel im aktiven Zentrum (NirB) gebunden. Zwei der drei benötigten Elektronen für die
Sauerstoffreduktion stammen dabei wahrscheinlich von dem außergewöhnlichen proximalen
[4Fe-3S]-Cluster der MBH. Nach Protonierung des Hydroxylliganden wird dieser alsWasser
freigesetzt. Anschließend muss ein weiteres Elektron übertragen werden, um das Nickel im
aktiven Zentrum zu Ni zurück zur Oxidationsstufe +II zu reduzieren.
Die oxidierte SH ist allerdings EPR-inaktiv. Ein typischer Nir-B-Zustand wird nicht
ausgebildet (Kapitel 3.1.3). Die Kernresonanz-Schwingungsspektroskopie („nuclear
resonance vibrational spectroscopy” NRVS) wäre eine geeignete Technik, um die oxidierte
SH zu untersuchen. Die Synchrotron-basierte Schwingungsspektroskopie für das Mössbauer-
aktive Isotop 57Fe liefert im Idealfall Informationen über sämtliche Schwingungsmoden des
Eisens und seiner Liganden. Da nur 57Fe angeregt bzw. betrachtet wird, besitzt NRVS, ähnlich
wie die Raman-Spektroskopie, eine ausgezeichnete Element-Selektivität, hat aber den Vorteil,
nicht den gleichen optischen Selektionsregeln der Raman- oder der Infrarot-Spektroskopie zu
unterliegen. Außerdem können quantitative Aussagen über Schwingungsamplituden getroffen
werden. Allerdings ist die Frequenzauflösung etwas geringer als bei der Raman- oder IR-
Spektroskopie (Zeng et al. 2007). NRVS an der SH könnte die Detektion aller Schwingungen
der Eisen-Liganden, inklusive der vorgeschlagenen Sauerstoffliganden (Fe-O), erlauben. Für
die eindeutige Zuordnung der Schwingungen zu den Sauerstoffliganden könnte eine
Isotopenmarkierung durchgeführt werden. Dafür müsste die frisch isolierte, oxidierte SH
zunächst reaktiviert werden. Die Inkubation von reaktivierter SH mit dem Isotop 18O2 würde
dann zum Einbau von 18O in das aktive Zentrum erlauben, was wiederum zu markanten
Änderungen der Fe-O-Schwingungsmoden führen würde.
Für die Reaktivierung des [NiFe]-Zentrums mit einer Sauerstoffmodifikation an einem
verbrückenen Cystein ( Abbildung 41B) werden zwei weitere Elektronen benötigt, die den
Daten in dieser Arbeit zufolge wahrscheinlich über FMN-a transferiert werden. Eine
alternative Quelle wäre ein Elektron vom proximalen Cluster in HoxY und ein weiteres
Elektron von einem anderen [Fe-S]-Cluster. Der proximale Cluster der SH weist in der
näheren Umgebung zusätzliche Cysteine auf. Die XAS-Experimente lassen allerdings
vermuten, dass es sich bei diesem Kofaktor um einen konventionellen [4Fe-4S]-Cluster
handelt. Im Gegensatz zu diesem Kofaktor kann der außergewöhnliche proximale [4Fe3S]-
Cluster der MBH, der durch sechs Cysteine koordiniert wird, drei Redox-Zustände bei
physiologischen Redoxpotentialen einnehmen, um zwei Elektronen zur Verfügung zu stellen
(Fritsch et al. 2011; Goris et al. 2011).
136 DISKUSSION
Die SH katalysiert zwei verschiedene Reaktionen am [NiFe]-Zentrum, einerseits die
reversible H2-Oxidation zu Protonen und Elektronen als Hauptreaktion und andererseits die
O2-Reduktion zu Wasserstoffperoxid und Wasser als Nebenreaktion. Die Fähigkeit eines
Enzyms, mehrere Reaktionen an demselben aktiven Zentrum zu katalysieren, wird als
katalytische Promiskuität bezeichnet (O'Brien und Herschlag 1999). Ein Beispiel stellt die
Pyridoxalphosphat-abhängige Racemase aus Geobacillus stearothermophilus dar, die auch
eine sehr geringe Aldolaseaktivität zeigt. Durch einen Aminosäureaustausch konnte die
Aldolaseaktivität allerdings um das 2x105fache gesteigert werden (Seebeck und Hilvert 2003).
Die Eigenschaft der katalytischen Promiskuität ermöglicht der SH in Gegenwart von 40%
Sauerstoff bis zu zwei Prozent der Elektronen aus der H2-Oxidation für die reduktive
Entgiftung von O2 zu nutzen.
4.9 Einsatz der SH in der Kofaktorregeneration
Die H2-abhängige NAD+-Reduktion wird in Gegenwart atmosphärischer O2-Konzentrationen
kaum merklich beeinträchtigt. Aufgrund der Sauerstofftoleranz, ist die SH ein
vielversprechendes Enzym für die biotechnologische NADH-Regeneration. Die direkte
elektrochemische Reduktion von NADH ist von Nachteil, da bioinaktive Nebenprodukte
erzeugt und hohe Überpotentiale benötigt werden. Daher ist ein enzymbasiertes System mit
hoher Selektivität und milden Reaktionsbedingungen attraktiv. Eine weit verbreitete Methode
der NADH-Regeneration ist die Kopplung der NAD+-Reduktion mit der Oxidation von
Formiat zu CO2 durch die Formiat-Dehydrogenase. Außerdem wird die Glucose-6-Phosphat-
Dehydrogenase für die Regeneration sowohl von NADH als auch NADPH verwendet. Ebenso
wurden verschiedene andere Dehydrogenasen einschließlich der Phosphit-Dehydrogenasen
für die Kofaktorregenerierung getestet (Weckbecker et al. 2010; Hall und Bommarius 2011).
In diesem Zusammenhang bietet die Verwendung einer NAD+-reduzierenden Hydrogenase in
der Kofaktorregenerierung den Vorteil, dass außer Protonen keine weiteren Nebenprodukte
entstehen. Die Protonen werden in dem gekoppelten Enzymsystem wieder verwendet,
weshalb die Atomeffizienz bei 100 % liegt (siehe Abbildung 42A).
DISKUSSION 137
Abb. 42: Biotechnologische Anwendungen der SH. A: NADH-Regeneration zur gekoppelten Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol durch eine Carbonylreduktase (CPCR). Gezeigt ist ebenfalls die Stabilitätsverbesserung durch kovalente Verknüpfung an Harzperlen (nicht gezeigt ist die Stabilisierung durch PEG-Modifikation) (Ratzka et al. 2011; Ratzka et al. 2012) . B: Umwandlung der NAD(H)- in eine NADP(H)-Bindestelle für die NADPH-Regeneration C Zellbasierte NADH-Regenerierung für die Monooxygenase-abhängige Biotransformation von n-Octan zu 1- Octanol. Schwarze Pfeile repräsentieren Diffusion der Substrate/Produkte durch die Zellhülle. D Spektroskopische Detektion des zellulären Redoxzustandes durch die Interaktion (rote Pfeile) der SH mit dem cytoplasmatischen NAD+/NADH-Pool und H2/O2 über das Diaphorase- bzw. das Hydrogenase-Modul. z E Modularer Ansatz bestehend aus dem HoxFU-Komplex und einer Hydrogenase oder Platin entsprechend den gewünschten Reaktionsbedingungen (Reeve et al. 2012) F: Bestimmung der H2-Konzentrationen über SH-abhängige Benzylviologen-Reduktion. Das reduzierte Benzylviologen kann anschließend durch Oxidation an einer Elektrodenoberfläche chronoamperometrisch nachgewiesen werden. Die detektierte Stromstärke ist dabei proportional zur H2-Konzentration (Lutz et al. 2005). G: Zwei Ansätze zur lichtgetriebenen Wasserstoffproduktion GI: Kopplung der SH zum Photosystem über NADPH, siehe Ansatz I GII: über ein Fusionsprotein bestehend aus Photosystem I und SH (mit roter Umrandung) z. B. über die Untereinheiten PsaE mit HoxY. Zur Vereinfachung wurde Cytochrom b6f und Ferredoxin und die Etablierung des Systems in Cyanobakterien nicht abgebildet. Abkürzungen: CYP, Cytochrom-P450-Monooxygenase; Fd, Ferredoxin; PS1, PS2, Photosystem I+II; FNR/FRN, Ferredoxin-NAD(P)H-Reduktase; LDH, Laktat-Dehydrogenase; Ph, Phenyl; BV, Benzylviologen; red, reduziert; ox, oxidiert.
Zudem lässt sich die SH in großen Mengen reinigen und dissoziiert nicht in die Submodule
(Kapitel 3.2), wie es die bidirektionalen Hydrogenasen aus R. opacus oder A. vinosum tun
(Schneider et al. 1984; Long et al. 2007). Die Anwendung der nativen SH in der Regeneration
von NADH wurde bereits in mehreren Studien beschrieben (Payen et al. 1983; Okura et al.
1990; Hasumi et al. 1996; Andersson et al. 1998; Rundback et al. 2012).
138 DISKUSSION
Neben NADH dient auch NADPH als Kofaktor vieler biotechnologisch relevanter
Oxidoreduktasen. Außerdem ist der Preis für NADPH etwa zehnfach höher als der für NADH
(Sigma Aldrich 2012). Im Rahmen der Dissertationsarbeit konnte die Umwandlung der
NAD(H)-Bindestelle der SH in eine NADP(H)-Bindetasche vorangetrieben werden
(Abbildung 42B; Kapitel 3.6). Die Verbesserung der katalytischen Effizienz für die
wasserstoffabhängige NADP+-Reduktion als Folge der Aminosäureaustausche D340A und
E341A in HoxF spricht für sterische Hinderung und elektrostatische Abstoßung von NADP+
in der nativen NAD(H)-Bindetasche. Des Weiteren verbesserten die Aminosäureaustausche
D401K und D467S die H2-getriebene NADP+-Reduktion. Die Proteinausbeute der meisten
SH-Derivate lag in der Größenordnung der nativen SH. Die Ausbeute und der Reinheitsgrad
der SH-Derivate mit HoxFD340A, HoxFE341A und HoxFD340A E341A könnte durch Umklonierung
der entsprechenden SH-Gene von dem Weit-Wirtsbereich-Plasmid pCM62 in das Plasmid
pEDY309 vermutlich noch gesteigert werden, da das letztere Plasmid in R. eutropha
offensichtlich eine größere Stabilität ausweist (O. Lenz, persönliche Mitteilung). .
Das HoxFE341A,D467S-Derivat wies eine deutliche Präferenzverschiebung von NAD+ zu NADP+
auf. Zwar erreichte die wasserstoffabhängige NADP+-Reduktionsaktivität dieses Derivats nur
ungefähr 1 % der Wildtypaktivität für NAD+, dennoch war sie mit 1,3 U/mg vergleichbar mit
der Aktivität des „besten“ FDH-Derivats, welches NADP+reduziert (2,5 U/mg) (Tishkov und
Popov 2006). Die hohe spezifische Aktivität der NADP+-abhängigen Glucose-Dehydrogenase
(20–100 U/mg) ist der dem SH-Derivat allerdings klar überlegen. Jedoch entsteht bei der
Kofaktorregeneration durch die Glukose-Dehydrogenase aus Glukose Glukonsäure, die
aufwändig aus dem gewünschten Endprodukt entfernt werden muss.
Jedoch sind weitere Arbeiten notwendig, um die katalytische Effizienz für die
wasserstoffabhängige NADP+-Reduktion zu steigern. Das fehlende lithoautotrophe Wachstum
des SHE341A,D467S-Stammes macht ihn zu einem ausgezeichneten Ausgangspunkt für weitere
Verbesserungen durch gerichtete Evolution. Durch ungerichtete Mutagenese der „Rossmann-
Falte“ und anschließende Selektion auf die Fähigkeit, wieder lithoautotroph zu wachsen,
könnte die katalytische Effizienz der H2-abhängigen NADP+-Reduktion weiter verbessert
werden. Allerdings könnten Revertanten entstehen, die wieder die wasserstoffabhängige
NAD+-Reduktion der Wildtyp-SH zeigen. Nach einer weiteren Verbesserung in Richtung der
NADP(H)-Präferenz wäre es interessant herauszufinden, ob sich das pH-Wertoptimum durch
die eingebrachten Aminosäuresubstitutionen verschiebt. Der pKS-Wert einer Aminosäure gibt
Aufschluss über die Protonierung bei einem bestimmten pH-Wert. Dabei ist der pKS-Wert
einer Aminosäure auch abhängig von der Proteinumgebung (Kieseritzky und Knapp 2008).
DISKUSSION 139
Durch die Substitution zweier negativ geladener Aminosäuren zu ungeladenen Aminosäuren
in dem SHE341A D467S –Derivat könnte sich das pH-Optimum für die wasserstoffabhängige
NAD+ bzw. für die NADP+ verändert haben.
In Zusammenarbeit mit Dr. Juliane Ratzka aus der Gruppe von Prof. Marion Ansorge-
Schumacher an der Technischen Universität Berlin wurde die native SH in einer gekoppelten
Enzymreaktion mit der Carbonyl-Reduktase aus Candida parapsilosis eingesetzt
(Abbildung 42A). Es konnte gezeigt werden, dass eine nahezu quantitative Umwandlung des
Substrates Acetophenon stattfand und dieses System eine weit höhere Gesamtumsatzrate im
Vergleich zur weit verbreiteten FDH aufwies (Ratzka et al. 2011). Ein Problem für die SH-
Stabilität stellen allerdings die in der organischen Synthese eingesetzten Lösungsmittel dar.
Durch Modifikation der SH mit mPEG konnte die SH-Halbwertzeit (wasserstoffabhängige
NAD+-Reduktion) in Gegenwart von 10 % (v/v) Isopropanol von 0,1 auf 0,5 h verbessert
werden. Allerdings wurde die Stabilität in wässriger Lösung nicht weiter verbessert (Ratzka et
al. 2012). Im Rahmen der Zusammenarbeit wurde die SH darüber hinaus sowohl durch
adsorptive als auch kovalente Bindung an das makroporöse Harz „Amberlite™
FPA54“ immobilisiert (Abbildung 42A). Die Halbwertzeit der SH wurde durch die kovalente
Immobilisierung in wässriger Lösung von 5,3 h um den Faktor 3,6 auf 19 h erhöht (Herr et al.
2013). Bei mechanischer Beanspruchung der SH erhöhte sich die Halbwertszeit von 1,9 h
durch die Immobilisierung um den Faktor sechs. In drei verschiedenen organischen
Lösungsmittelgemischen (jeweils 10 % v/v) bewirkte die Immobilisierung sogar eine bis zu
159-fache Stabilitätserhöhung. Somit wurde ein Enzympräparat mit hoher Stabilität und
Aktivität entwickelt. Es entspricht somit den industriellen Anforderungen für eine
ökonomische NADH-Regenerierung.
Das isolierte Diaphorase-Modul der SH stellt aufgrund seiner hohen Umsatzraten und der
katalytischen Aktivität über einen weiten Potentialbereich ein vielversprechendes System für
die elektrochemische Regeneration von NAD+ und NADH dar (Kapitel 3.4). In
Zusammenarbeit mit der Gruppe von Dr. Kylie Vincent (Oxford University) wurde der
Diaphorase-Subkomplex der SH in einen modularen Ansatz für die Kofaktorregeneration
eingesetzt. Dabei wurde sowohl das Diaphorase-Modul als auch eine Hydrogenase an
pyrolitsche Graphitpartikeln adsorbiert, so dass beide elektrisch verbunden waren (Abbildung
42E; Reeve et al. 2012). Das System kann durch Auswahl geeigneter Hydrogenasen an
unterschiedliche Reaktionsbedingungen angepasst werden und ist daher komplett modular.
Viele verschiedene Hydrogenasen, die sich jeweils leicht in ihrem pH- und
Temperaturoptimum, und ihrer O2-Toleranz unterscheiden, wurden bereits isoliert und
140 DISKUSSION
elektrochemisch untersucht, (Vincent et al. 2005; Vignais und Billoud 2007; Pandelia et al.
2010). Mittels der Laktat-Dehydrogenase, die zusammen mit Hyd-2 aus E.coli und HoxFU
aus R. eutropha auf Graphitpartikel wurde, konnte die erfolgreiche Substratumwandlung am
Beispiel der Pyruvat-Reduktion demonstriert werden (Reeve et al. 2012). Ein weiterer Vorteil
der Immobilisierung an Graphitpartikeln ist, dass sie durch Zentrifugation nach dem Ende
einer Reaktion einfach abgetrennt und so für eine erneute Reaktion wiederverwendet werden
können. Das modulare Graphit-Partikel-System wurde im Rahmen der Doktorarbeit zur
Patentierung angemeldet.
Für den biotechnologischen Einsatz werden heutzutage immer noch größtenteils isolierte
Enzyme eingesetzt (Weckbecker et al. 2010). Allerdings ist die Reinigung von Enzymen teuer
und zeitaufwändig. Aus diesem Grund ist die Etablierung von Ganzzellsystemen für die
Biotransformation sehr attraktiv (Berman et al. 2000). Zuvor konnte bereits die Produktion
einer bidirektionalen Hydrogenase aus dem Aktinomyceten Rhodococcus opacus in
R. eutropha gezeigt werden (Porthun et al. 2002). Allerdings wurden nur die vier
Strukturproteine der Hydrogenase mit der dazugehörigen Endoprotease heterolog
synthetisiert, der Maturationsapperat des [NiFe]-Zentrums stammte aus R. eutropha. Für die
wasserstoffabhängige In-vivo-NAD+-Regeneration wurde die SH heterolog in dem nicht-
pathogenen Stamm, P. putida KT2440, produziert (Kapitel 3.7 und Abbildung 42C), der für
Biotransformationen häufig verwendet wird und sich durch seine Lösungsmittelresistenz
auszeichnet (Ramos et al. 2002; Niewerth et al. 2011). Für die heterologe SH-Produktion in
P. putida wurde ein 13 Gene umfassendes Expressionplasmid eingesetzt. Der native SH-
Promotor wurde dabei gegen den alkB-Promoter, der durch Alkane induzierbar ist,
ausgetauscht. Der komplexe SH-Biosyntheseapparat führte im hydrogenasefreien -
Proteobakterium P. putida zu vollständig assembliertem und funktionalem SH-Protein.
Die funktionelle Expression von Genen in heterologen Wirten wird häufig durch ineffiziente
oder unvollständige Transkription großer Genregionen, den Verlust der Funktion nativer
Promotoren, das Vorhandensein von Transkriptionsterminationsregionen oder Fehler bei der
Initiation der Translation im Falle von polycistronischen Transkripten beeinträchtigt (Arvani
et al. 2012) (McCrory et al. 2012). Die heterologe Produktion aktiver SH in P. putida, bei der
die Synthese von 13 funktionellen Proteinen notwendig ist, zeigt, dass sich R. eutropha und P.
putida hinsichtlich der Transkription von Operons und des Kofaktoreinbaus ähneln. In
Kooperation mit der Gruppe von Prof. Bernhard Hauer (Universität Stuttgart) ist auf diese
Ergebnisse aufbauend geplant, die wasserstoffabhängige Kofaktorregeneration in ganzen
Zellen für die Umwandlung von n-Octan zu 1-Octanol durch die herterolog produzierte SH in
DISKUSSION 141
Verbindung mit einer rekombinanten Monooxygenase zu untersuchen. Insbesondere die
Synthese von höherwertigen Produkten aus einfachen Kohlenstoffverbindungen wie Alkanen,
CO2, oder Glycerin mit H2 als Reduktionsmittel kann sich wirtschaftlich und ökologisch
lohnen. Zudem ist bei dem Einsatz der SH keine Produkttrennung von kohlenstoffhaltigen
Abfällen, die bei anderen Kofakorregenerationssystemen entstehen, notwendig. Außerdem
ermöglicht die O2-Toleranz der SH ihre Verwendung in gekoppelten enzymatischen
Reaktionen, in denen O2 erforderlich ist (z. B. Monooxygenasen). Ein breiteres Spektrum von
Machbarkeitsstudien sind nun notwendig, um die Anwendbarkeit der SH in Kombination mit
unterschiedlichen NADH-abhängigen Oxidoreduktasen zu demonstrieren. Außerdem müsste
die Übertragung der Laborergebnisse auf einen großtechnischen Maßstab getestet werden.
Weitere Verbesserung der katalytischen Eigenschaften der SH (Optimierung der katalytischen
Effizienz für die NADP+-Reduktion, Veränderung des pH- und Temperaturoptimums) durch
molekularbiologische Methoden könnten den Effizienz der SH in der Kofaktorregneration
weiter steigern.
142 LITERATUR
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ANHANG 159
6. Anhang
Abb. S1: Untersuchung verschiedener R .eutropha-Stämme auf Hydrogenaseaktivität mittels Aktivitätsfärbung. Spur 1: löslicher Extrakt (LE) von H16 (MBH+, RH+, SH+), Spur 2: LE von HF798 (MBH-, RH-, SH+), Spur 3: LE von HF500 (MBH-, RH-, SH-) A: RH- und MBH-spezifische Aktivitätsfärbung (Reaktion H2 : PMS/NBT in 50 mM K-PO4, pH 5,5; 4% -15% natives PAGE-Gel, 150 μg löslicher Extrakt pro Spur, 2 h, 37 °C) B: SH spezifische Aktivitätsfärbung (Reaktion H2: NAD+/NBT in 50 mM TrisHCl, pH 8,0; 4 % -15% natives PAGE-Gel, 100 μg Protein pro Spur, 2 h, 37 °C;) X: unbekannte Spezies, die auch ohne Wasserstoffbegasung auftritt.
Abb. S2: Vergleich der absoluten Absorption mit der zweiten Ableitung von zwei beispielhaften Datensätze. Aufgrund der niedrigen SH-Konzentrationen in ganzen R. eutropha-Zellen sind die Bandenintensitäten in der FTIR-Spektroskopie relativ gering. Aus Gründen der besseren Sichtbarkeit sind alle Spektren der in situ-Studie als zweite Ableitung gezeigt. Dabei erscheinen Absorptionsbanden als negative Peaks. Absolute Absorption (A und C) und 2. Ableitung (F und D) der „in situ“-FTIR-Spektren von frisch geernteten (A und B) und oxidierten Zellen (anaerob mit NAD+) (C und D).
A B
160 ANHANG
Abb. S3: Reversibilität der Reduktion und Re-Oxidation der SH in ganzen Zellen. A: frisch geernteten Zellen, B: nach 30 min Inkubation mit 1 bar H2 und C: anschließende Inkubation (12 h) mit N2. D: Differenzspektrum (C minus B). Pfeile zeigen eine Intensivitätsveränderung an.
Abb. S4: Reversibilität der Redoxreaktion zwischen oxidiertem und reduziertem [NiFe]-Zentrum. Die in situ-FTIR Spektren von SH in ganzen Zellen (A) und nach drei aufeinanderfolgende Gefrier-Auftau-Zyklen unter aeroben Bedingungen (oxidiert, B) sind gezeigt. Die NiaC-CO-Bande (1961 cm-1), sowie alle Absorptionen der reduzierten Zustände der frisch geernteten Zellen sanken auf Kosten der CO Streckschwingung des Nir-B-ähnlichen Zustandes (1957 cm-1). Die erneute Reduktion durch 1 bar H2 (30min) führte zu einer Intensivitätssteigerung der reduzierten Zustände (C).
ANHANG 161
Abb. S5: Reversibilität zwischen oxidiertem und reduziertem Zustand von lithoautotroph gewachsenen Zellen. In-situ-FTIR Spektren von ganzen Zellen (A) nach Inkubation mit O2 in luftgesättigten Puffer (B) und nach anschließender Gasaustausch durch Spülen mit N2 (C). Das Differenzspektrum (C minus B) ist in D gezeigt. Im Gegensatz zu heterotrophen Wachstumsbedingungen, unter dem die SH synthetisiert wird, aber nicht zur Energieversorgung beiträgt, dient die SH während lithoautotrophen Wachstum mit H2 als alleinige Energie-konservierende Hydrogenase. Der kontinuierliche Umsatz führt zu Proteinschäden, die durch nicht-gekennzeichnete starke IR-Absorptionsbanden deutlich werden. Diese Interpretation wird durch die Tatsache unterstützt, dass diese speziellen Absorptionsbanden nicht im Differenzspektrum erscheinen. Die Exposition der Zellen mit luftgesättigten Puffer (B) führt zu Nir-B-ähnlichen Banden. Gleichzeitig verringerten sich die Nia-C-assoziierten Absorptionen. Nach Spülung mit N2 tauchen diese wieder auf (C). Zusätzlich sind Absorptionen der reduzierten Zustände zu identifizieren.
Abb. S6: Elektrochemie mit HoxHY und externem FMN. Zyklische Voltammogramme wurden für HoxHY auf einer PGE-Elektrode aufgezeichnet. (10 mV/ s in TrisHCl Puffer (50 mM pH 8,0) bei 25 º C, 1 bar H2). Die Position von E (2H+/ H2) ist als gestrichelte vertikale Linie gezeigt (korrigiert für die experimentellen Bedingungen). Der CV für einen Proteinfilm von HoxHY (12 μM), der mit FMN (~50 μM) vorbehandelt wurde, ist als dicke schwarze Linie gezeigt. Ein Kontrollexperiment für HoxHY unter analogen Bedingungen ist als graue Linie dargestellt. Ein Voltammogramm für eine unmodifizierte PGE ist als dünne schwarze Linie gezeigt.
162 ANHANG
Abb. S7: Variierenden Mengen der beiden oxidierten Redoxzustände in Präparationen von HoxHY. In (A) ist eine Probe überwiegend in dem Ni-Ox-Zustand, in (B) ist eine Probe mit einer Mischung aus den Ni-Ox und Ni-Ox2-Zuständen und in (C) ist eine Probe bevorzugt in dem Ni-Ox2-Zustand gezeigt. Die Variation im Verhältnis der beiden Redoxzustände könnte mit leicht unterschiedlichen Expositionszeiten mit O2 während der Reinigung zusammenhängen.
Abb. S8: Behandlung von HoxHY mit artifiziellen Reduktionsmitteln führte zur partiellen Reduktion des [NiFe]-Zentrums. A: Nach Reduktion mit Dithionit B: Nach Reduktion mit Dithionit und Methylviologen C: Nach Reduktion mit Dithionit und Methylviologen in Gegenwart von 1 bar H2.
ANHANG 163
Abb. S9: Emissionsspektrum von HoxFU (4.5 M), angeregt bei 430nm. Das Spektrum ist typisch für FMN. RFU: relative Fluoreszenz-Einheit (Units).
Abb. S10: Anregungsspektrum von HoxFU (4,5μM), aufgenommen bei 525 nm. Das Spektrum ist typisch für FMN. RFU: relative Fluoreszenz-Einheit (Units).
Wellenlänge [nm]450 500 550 600 650
RFU
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Wellenlänge [nm]250 300 350 400 450 500
RFU
0
50
100
150
200
250
300
350
164 ANHANG
Tabelle S1: Reinigungsverlauf der SH-Bindestellen-Derivate. LE: löslicher Extrakt, El: Eluate nach Affinitätschromatographie
Volumen Protein Gesamt spez. Aktivität Gesamt Anreicher Ausbeuteprotein H2: NAD+ aktivität ungsfaktor
[ml] [mg/ml] [mg] [U/mg] [U] [%]
HoxFE341A LE 5 17,1 85,5 0,05 4,3 1,0 100,0HoxFE341A El 1 0,4 0,4 0,86 0,34 17,3 7,9
HoxFD340A LE 5 18,8 94,0 0,4 37,6 1,0 100,0HoxFD340A El 0,25 0,72 0,18 6,7 1,2 16,8 3,2
HoxFD401K LE 20 15,1 302,4 10,3 3116,4 1,0 100,0HoxFD401K El 10 0,82 8,2 77,0 632,9 7,5 20,3
HoxFD467S LE 20 22,2 444,1 4,1 1827,9 1,0 100,0HoxFD467S EL 7,5 1,17 8,8 54,6 480,3 13,3 26,3
HoxFD340A E341A LE 5 19,2 96,0 n.d. n.d. n.d. n.d.HoxFD340A E341A El 0,20 0,30 0,06 n.d. n.d. n.d. n.d.
HoxFD340A D401K LE 12 39,3 471,6 1,4 656,7 1 100HoxFD340A D401K El 4 0,78 3,1 44,7 139,4 32,1 21,2
HoxFE341A D467S LE 12 27,2 326,4 1,7 552 1 100HoxFE341A D467S El 6 0,58 3,48 25,6 89,1 15,1 16,1
165
DanksagungMein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Bärbel Friedrich für die Überlassung des Themas
sowie ihre Unterstützung und konstruktive Kritik.
Ganz herzlichen Dank an Dr. Oliver Lenz für seine Hilfe, seine wertvollen Kommentare und
für alle konstruktiven Diskussionen im Verlauf meiner Arbeit.
Diese Arbeit wäre nicht möglich gewesen ohne die Kooperationspartner im
spektroskopischen und elektrochemischen Bereich: Vielen Dank an Dr. Kylie Vincent für die
großartigen wissenschaftlichen Diskussionen an den erstaunlichsten Orten und vor allen
Dingen am Institut für Anorganische Chemie an der University of Oxford. Weiterhin möchte
ich mich bei Dr. Juan Liu, Dr. Zul Idris, Holly Reeve und Dr. Philip Ash bedanken, ohne die
ein Großteil der hier präsentierten Ergebnisse nicht erlangt worden wäre.
Dr. Ingo Zebger, Marius Horch, Dr. Miguel Saggu und Prof. Dr. Peter Hildebrandt vom Max-
Volmer-Laboratorium für biophysikalische Chemie der TU Berlin sei für die hervorragende
Kooperation im Bereich der IR- und EPR-Spektroskopie und für viele fruchtbare
Diskussionen gedankt.
Weiterhin möchte ich mich bei allen Kooperationspartnern bedanken, die zu den Ergebnissen
dieser Arbeit beigetragen haben, namentlich bei Dr. Juliane Ratzka, Nicole Herr, Prof. Dr.
Marion Ansorge-Schumacher, Dr. Friedhelm Lendzian, Dr. Christian Teutloff, Prof. Dr.
Robert Bittl, Dr. Michael Haumann, Prof. Dr. Wolfgang Kroutil, Prof. Dr. Wolfgang Lubitz,
Dr. Hideaki Ogata, Dr. Sumire Honda, Dr. Bettina Nestl, Prof. Dr. Bernhard Hauer, und Prof
Dr. Silke Leimkühler.
Für Unterstützung bei der praktischen Laborarbeit danke ich vielmals Josta Hamann, Janna
Schoknecht und Angelika Strack. Ich danke allen Arbeitskollegen für die angenehme und
freundliche Arbeitsatmosphäre. Danken möchte ich im Besonderen Dr. Stefan Frielingsdorf,
Dr. Johannes Fritsch, Dr. Ingmar Bürstel, Katja Karstens, Olivia Neubauer, Franziska Kirsch,
Dr. Stefanie Ganskow, Caspar Schäfer, Dr. Edward Schwartz, Prof. Dr. Thomas Eitinger für
die ständigen wissenschaftlichen Diskussionen. Dabei nicht zu vergessen sind die tüchtigen
Praktikanten Christina Lehning, Olivia Herczynski sowie Eric Manteufel, der als
Bachelorstudent in unserem Labor tätig war. Mein besonderer Dank für eine ausgezeichnete
Diplomarbeit und die Fähigkeit als Labor-DJ ist an Janina Preißler gerichtet. Außerdem ein
großer Dank an Dr. Jean-Philippe Lonjaret und alle Doktoranden des BIG-NSE-
Graduiertenkollegs für inspirierende Diskussionen. Die hier vorliegende Arbeit wäre nicht
möglich gewesen ohne die kontinuierliche Unterstützung in allen Lebenslagen durch meine
Eltern sowie durch Sarah Stehr, Arne Wilmanns und Maria Seefeld.