die mechanismen des chlorideinstroms der … · kaliumpermeabilität der luminalen membran und das...

Aus dem Physiologischen Institut

(Geschäftsführender Vorstand: Professor Dr. med. Markus Bleich)

der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

DIE MECHANISMEN DES CHLORIDEINSTROMS DER

BELEGZELLE WÄHREND DER MAGENSÄURESEKRETION

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

vorgelegt von

ORTRUD KOSIEK

aus Nürtingen

Kiel 2007

1. Berichterstatter: Prof. Dr. Bleich

2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. Kiehne

Tag der mündlichen Prüfung: 30. August 2007

Zum Druck genehmigt, Kiel, den: 30. August 2007

gez.: Prof. Dr. Siebert

(Vorsitzender der Prüfungskommission)

III Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS........................................................................................... III

1 EINLEITUNG....................................................................................................... 1

1.1 Klinischer Hintergrund.......................................................................................................................... 1

1.2 Funktionelle Anatomie der Magenschleimhaut ................................................................................... 1

1.3 Transportmechanismen bei der Magensäuresekretion ....................................................................... 4

1.4 Regulationsmechanismen und intrazelluläre Signalweiterleitung...................................................... 9

1.5 Fragestellung......................................................................................................................................... 12

2 MATERIAL UND METHODEN.......................................................................... 13

2.1 Lösungen und Substanzen.................................................................................................................... 13

2.2 Tiere ....................................................................................................................................................... 16

2.3 Isolierung der Magendrüsen................................................................................................................ 17

2.4 Meßanordnung...................................................................................................................................... 18

2.5 Versuchsdurchführung ........................................................................................................................ 20 2.5.1 Intrazelluläre pH-Messung................................................................................................................. 20 2.5.2 Intrazelluläre Chlorid-Messung ......................................................................................................... 24

2.6 Auswertung und Statistik..................................................................................................................... 26

3 ERGEBNISSE................................................................................................... 27

3.1 Der H+-Export aus der Belegzelle unter Histaminstimulation.......................................................... 27

3.2 Untersuchung des AZD0865-hemmbaren Anteils des H+-Exportes der Belegzelle......................... 29

3.3 Untersuchung des HCO3--Exportes..................................................................................................... 31

3.4 Untersuchung der intrazellulären Cl--Konzentration ....................................................................... 33

4 DISKUSSION .................................................................................................... 36

4.1 Die Technik und Vorgehensweise in den Experimenten ................................................................... 36 4.1.1 Das Präparat und die Meßanordnung................................................................................................. 36 4.1.2 Die pHi-Messung mit BCECF............................................................................................................ 37 4.1.3 Die [Cli]-Messung mit MQAE........................................................................................................... 38

IV Inhaltsverzeichnis

4.1.4 Zwei funktionelle Zustände: azidotisch und alkalotisch .................................................................... 39

4.2 Die einzelnen Funktionsproteine ......................................................................................................... 39 4.2.1 Die H+-Exporter H+/K+-ATPase und Na+/H+-Austauscher ................................................................ 39 4.2.2 Der Cl-/HCO3

--Austauscher AE2....................................................................................................... 40 4.2.3 Der Cl-/HCO3

--Austauscher SLC26A7 .............................................................................................. 40 4.2.4 Der Na+-2Cl--K+-Cotransporter NKCC1............................................................................................ 42

4.3 Mögliche medikamentöse Therapieansätze und weitere Forschung als Ausblick .......................... 43

5 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................... 45

6 LITERATUR ...................................................................................................... 47

7 DANKSAGUNG ................................................................................................ 53

8 LEBENSLAUF .................................................................................................. 54

1 Einleitung

1 Einleitung

1.1 Klinischer Hintergrund

Die Pharmakotherapie hat heutzutage einen sehr hohen klinischen Stellenwert bei

Erkrankungen wie Gastritis, Refluxösophagitis (GERD) und Ulcera in Magen oder

Duodenum. Diesen liegt eine pathologische Magensäuresekretion zugrunde. Daher sind

genaue Kenntnisse der Mechanismen der Säureproduktion und ihrer Steuerung

Vorraussetzung für eine erfolgreiche Therapie. Gerade bei den genannten Ulcera spielen

allerdings noch weitere Faktoren wie die bakterielle Besiedelung mit Helicobacter pylori oder

der Reflux von Duodenalflüssigkeit eine Rolle. Mit der fortgeschrittenen Erforschung dieser

Krankheitsbilder und ihrer Hintergründe hat sich die Behandlung, deren Ziel die Verringerung

der Magensäuresekretion ist, in den letzten Jahrzehnten entsprechend weiter entwickelt. Statt

chirurgisch durch eine Vagotomie einzugreifen, steht heute klar die medikamentöse Therapie

mit Protonenpumpenblockern (z.B. Omeprazol) und/oder selektiven Histamin-H2-

Rezeptorenblockern (z.B. Ranitidin) an erster Stelle. Bei nachgewiesener Helicobacter pylori-

Infektion wird eine Eradikationstherapie als Kombination von Protonenpumpenblockern und

Antibiotika empfohlen (49).

1.2 Funktionelle Anatomie der Magenschleimhaut

Aufgrund der Fähigkeit, seinen Inhalt durch Salzsäureproduktion bis auf pH-Werte von 1 zu

senken, nimmt der Magen auch unter den Verdauungsorganen eine außerordentliche Stellung

ein. Er schafft es auf beeindruckende Art und Weise, nicht nur diese niedrigen pH-Werte zu

erzeugen, sondern sich zur gleichen Zeit auch vor deren aggressivem Charakter zu schützen.

Säuresekretion auf der einen Seite und zelluläre Schutzmechanismen auf der anderen Seite

müssen sehr gut aufeinander abgestimmt sein. Hierfür steht eine ganze Reihe von

Mechanismen zur Verfügung, die wiederum durch eine Vielzahl von Regulationsfaktoren

gesteuert werden. Darüber hinaus ist die zelluläre Ausstattung und Architektur der

Magenschleimhaut besonders dafür ausgelegt.

Die Magenschleimhaut ist klar funktionell gegliedert (Abbildung 1). Am Mageneingang, der

Kardia, genauso wie am Ausgang, der Pars pylorica, wird unter anderem zum Schutze der

angrenzenden Regionen des Ösophagus und Dünndarmes nur schützender Schleim und

2 Einleitung

praktisch keine Salzsäure produziert. Die HCl-Erzeugung erfolgt fast ausschließlich im

Fundus und Corpus. Diese Funktionsaufteilung spiegelt sich auch in der feinbaulichen

Architektur wider.

Abbildung 1: Makroskopischer Aufbau des Magens. Die Erzeugung der Magensäure findet fast ausschließlich im Fundus und Corpus statt. Aus diesem Grund wurde für die Experimente nur Gewebe aus der Corpus-Region, hier eingefärbt dargestellt, entnommen.

Die gesamte Magenoberfläche ist von einem einschichtigen, hochprismatischen Epithel

bedeckt, das zum Schutz vor Selbstverdauung eine Schleimbarriere gegen Salzsäure und die

Verdauungsenzyme bildet. Hauptbestandteile dieses Schleimes sind Wasser, Muzine sowie

Natrium- und Bikarbonationen (Na+ und HCO3-). Die Schutzfunktion des Schleimes entsteht

durch die Behinderung der freien Diffusion von Stoffen und der Bindung von HCO3-, welches

von bestimmten Epithelzellen als Puffer in den Schleim sezerniert wird. Hierdurch entsteht

eine Barriere mit einem stehenden pH-Gradienten, der, ausgehend von einem sehr sauren

Lumen, wieder physiologische Werte auf der Zelloberfläche annimmt. Inmitten dieses

Oberflächenepithels lassen sich bei Betrachtung in Lupenvergrößerung die Mündungen der

Magendrüsenausgänge (foveolae gastricae) erkennen, die als kleine punkt- oder

schlitzförmige Grübchen imponieren. Die Kardiadrüsen sind tubuläre Drüsen mit

gewundenen, verzweigten Epithelschläuchen, die aus nur einer Zellart, den mukoiden

Drüsenzellen für die Schleimproduktion, bestehen. Im Fundus und Corpus finden sich

röhrenartig-tubuläre Drüsen, die sich in drei Abschnitte einteilen lassen: das Halsstück, das

Mittelstück (den eigentlichen Drüsenkörper) und den Drüsengrund. Es herrschen drei

3 Einleitung

Zellarten vor (Abbildung 2). Die schleimbildenden Nebenzellen dienen als Regenerationspool

für Oberflächen- und Drüsenepithel. Die säurebildenden Belegzellen erzeugen unter starker

Stimulation ein Volumen von bis zu 200 ml pro Stunde und erreichen eine HCl-Konzentration

von bis zu 160 mmol/l (16). Die Hauptzellen sind schließlich für die Erzeugung von

Pepsinogen, Kathepsin und Magenlipase zuständig. Neben diesen prominenten Zelltypen

kommen besonders im Fundus noch hormonsezernierende Zellen vor, die z.B. Histamin

enthalten und freisetzen. In der Pylorusregion, die rund 20% des Magens ausmacht, findet

man „basal-gekörnte“ Zellen für die Hormonproduktion. In diesem Fall handelt es sich um G-

Zellen, die Progastrin bilden, das nach Aktivierung als Gastrin seine Wirkung über die

Blutbahn entfaltet.

BZ

HZ

OE

NZ

30µm

BZ

HZ

OE

NZ

30µm

Abbildung 2: Mikroskopischer Aufbau der Magenschleimhaut. Eosin-Cresyl-Violet-Färbung eines Rattenmagenpräparates. Freundlicherweise von C. Lytle zur Verfügung gestellt. OE = Oberflächenepithel, NZ = Nebenzelle, BZ = Belegzelle, HZ = Hauptzelle.

Die Belegzellen spielen also die herausragende Rolle für die Erzeugung des sauren

Magenmilieus. Diese hochspezialisierten Zellen des Magendrüsenepithels zeigen einige

morphologische Eigenarten, die sich direkt aus ihrer Funktion ableiten lassen. Belegzellen

gehören aufgrund des hohen Energiebedarfes der Transportprozesse zu den

mitochondrienreichsten Zellen des Körpers. Gerade der über die Protonenpumpe laufende

Ausstoß von H+ ist direkt auf die Bereitstellung von ATP als Energielieferant angewiesen.

4 Einleitung

Die apikale Membran weist als Besonderheit eine enorme Oberflächenvergrößerung auf (21;

45). Dies wird einerseits über Invaginationen der Zellmembran erreicht, die sich als kleine

Kanälchen, sogenannte Kanaliculi, in das Zytoplasma hineinstülpen und auch untereinander

zahlreiche Verbindungen und Verzweigungen aufweisen. Andererseits besitzt die Belegzelle

zusätzlich einen dichten Besatz an Mikrovilli, die diese Kanaliculi säumen. Im Zytoplasma

findet sich zudem ein dichtes Netz von membranösen Strukturen in vesikulären und tubulären

Formen, die zumeist als Tubulovesikel bezeichnet werden. Sie sind reich an Protonenpumpen,

die zur Säuresekretion bereitstehen (21; 62).

Die Morphologie der Zelle ist abhängig von ihrem Funktionszustand. In der ruhenden

Belegzelle liegen die Tubulovesikel verstreut im Zytoplasma vor, und die sie enthaltenden

Protonenpumpen sind in einem deaktivierten Zustand, sezernieren also keine Protonen. Bei

erfolgter Stimulierung zur Säuresekretion findet eine morphologische Transformation statt.

Die Tubulovesikel wandern durch einen über Zytoskelettbestandteile vermittelten Prozeß hin

zur apikalen (kanalikulären) Membran und verschmelzen dort mit ihr (62). Auf diese Weise

werden die für die Säuresekretion essentiellen Protonenpumpen in die Membran rekrutiert

und stehen nun für die Säureabgabe bereit. Sobald der Bedarf an Magensäure sinkt, läuft

dieser Umformungsprozeß in umgekehrter Reihenfolge ab: die Protonenpumpe wird

internalisiert, und es bilden sich wieder vermehrt intrazelluläre Tubulovesikel. Diese Prozesse

werden von einigen Autoren als Membran-Recycling-Hypothese bezeichnet (21).

1.3 Transportmechanismen bei der Magensäuresekretion

Die Magensäuresekretion beruht letztlich auf dem Zusammenwirken von

Ionentransportmechanismen. Eine heute weitgehend bekannte Anzahl von Transportproteinen

steht im Dienste der Belegzelle, um den konstanten Fluß von Ionen aufrechtzuerhalten, der

die HCl-Produktion im Magen ermöglicht. Das Zellmodell in Abbildung 3 gibt einen

Überblick über die in diesem Zusammenhang wichtigsten Proteine. Eine dominierende Rolle

bei der Säuresekretion nimmt die Protonenpumpe in der luminalen Membran der Belegzellen

ein. In enger Nachbarschaft zur H+/K+-ATPase sind außerdem sowohl Cl-- als auch K+-

Kanäle in der luminalen Membran notwendig. Um den luminalen Ausstrom von H+ und Cl--

Ionen auszugleichen, benötigt die Belegzelle an der basolateralen Seite entsprechende

Transporter. Diese transmembranäre Bewegung von Cl- und HCO3- wurde im klassischen

Modell der Magensäuresekretion bisher fast ausschließlich einem einzigen Cl¯/HCO3--

5 Einleitung

Austauscher, dem Typ AE2, zugeschrieben (15; 23; 47). Daneben wurde in Belegzellen das

Vorkommen sowohl des Na+-2Cl--K+-Cotransporters 1 (NKCC1) als auch des

Transportproteins SLC26A7 nachgewiesen. SLC26A7 ist ebenfalls ein Cl-/HCO3--

Austauscher (33; 43).

Cl-

K+

H2O

Na+ATP

ATP

K+

H+

H+

Na+

AE2Cl-

HCO3-

CAHCO3

-

K+

HCO3-

Cl-

Na+

K+2Cl-

SLC 26A7

Luminal Basolateral

Cl-

K+

H2O

Na+ATPATP

ATP

K+

H+

H+

Na+

H+

Na+

AE2Cl-

HCO3-

AE2Cl-

HCO3-

CAHCO3

-

K+

HCO3-

Cl-

Na+

K+2Cl-Na+

K+2Cl-

SLC 26A7

Luminal Basolateral

Abbildung 3: Schematische Übersicht über die wichtigsten, an der Magensäuresekretion beteiligten Transportproteine der Belegzelle. CA = Carboanhydrase.

Bei der H+/K+-ATPase handelt sich um eine ATPase vom P-Typ, die in den Belegzellen des

Magens als Protonenpumpe arbeitet. Sie ist darüber hinaus nur noch in der Niere zu finden.

Die H+/K+-ATPase bewirkt den elektroneutralen Austausch von intrazellulären Protonen

gegen extrazelluläre K+-Ionen und erzeugt so den nötigen Protonengradienten. Hierfür ist

unter anderem auch eine entsprechende K+-Konzentration im extrazellulären, luminalen

Raum wichtig, auf den die Protonenpumpe funktionell angewiesen ist. Als spezifischer

Hemmstoff der H+/K+-ATPase steht der Wirkstoff AZD0865 zur Verfügung (26).

In der ruhenden, nicht-aktivierten Belegzelle befindet sich die Protonenpumpe in

Tubulovesikel verpackt im Zytoplasma der Belegzelle, und zwar im inaktiven Zustand, der

wahrscheinlich auf die fehlende Kaliumleitfähigkeit der Vesikelmembran zurückzuführen ist

(57). Nach erfolgter Aktivierung wandern die Tubulovesikel zur luminalen Belegzellmembran

und verschmelzen dort mit ihr. Die Membran ist entweder schon von vornherein leitfähig für

K+- und Cl--Ionen oder wird nun erst leitfähig und ermöglicht so die aktive HCl-Sekretion. Es

wurden Hinweise gefunden, daß sowohl die Kanäle für K+- als auch für Cl--Ionen, die hierbei

eine Rolle spielen, ebenso wie die H+/K+-ATPase-Proteine bei Inaktivität internalisiert und

6 Einleitung

wiederverwertet werden (22). Bei der Translokation der Tubulovesikel kommt dem

Zytoskelett und mit ihm assoziierten Proteinen wie z.B. Ezrin, Syntaxinen, VAMP-2 und

Rab-Proteinen, die an den Membranverschmelzungsvorgängen beteiligt sind, eine wichtige

Rolle zu (3; 21; 23).

Ist die H+/K+-ATPase in die luminale Zellmembran der Belegzelle integriert, hängt die

Säuresekretion nach dem Schema von Abbildung 3 von vier Faktoren ab: der Verfügbarkeit

von ATP, der Bildung von H+ und HCO3- durch die Carboanhydrase, der luminalen

Permeabilität für K+ und Cl- sowie dem basolateralen Austausch von Cl- und HCO3-.

Damit die Protonenpumpe ihre Funktion erfüllen kann, ist sie also auf eine gewisse K+-

Konzentration im Lumen der Kanaliculi angewiesen. Der ständige Einwärtstransport durch

die H+/K+-ATPase und damit die luminale Verarmung an K+ wird durch K+-Kanäle

ausgeglichen. Zum jetzigen Zeitpunkt wurden drei verschiedene K+-Kanäle in der apikalen

Membran von Belegzellen identifiziert, die alle die unerläßliche Eigenschaft besitzen, auch

bei äußerst niedrigen luminalen pH-Werten den K+-Ausstrom zu gewährleisten. Bei dem

funktionell wichtigsten K+-Kanal in Belegzellen handelt es sich um ein zusammengesetztes

Transportprotein. Die eigentliche porenbildende Untereinheit KCNQ1 ist im Magengewebe

hauptsächlich mit der regulierenden Untereinheit KCNE2 (=MiRP1) gekoppelt, die unter

anderem die elektrophysiologischen Eigenschaften bestimmt (11; 18; 20). Die anderen beiden

K+-Kanäle, Kir4.1 und Kir2.1, gehören zur Familie der Kir (inward rectifying) Kanäle (14;

35).

Die für die HCl-Bildung notwendigen Cl--Ionen verlassen die Belegzelle ebenfalls über

Ionenkanäle. Entgegen dem Cl--Konzentrationsgradienten überwiegen die elektrischen

Triebkräfte für den Ausstrom ins Lumen der Kanaliculi. Diese werden über die

Kaliumpermeabilität der luminalen Membran und das damit generierte Potenzial erzeugt.

Bislang konnten für nur einen luminalen Cl--Kanal, den ClC-2 Kanal, konkrete Hinweise

gefunden werden (52). ClC-2 ist spannungsabhängig und wird sowohl durch niedrige pH-

Werte als auch cAMP-abhängige PKA-Phosphorylierung aktiviert (34). Zur Hemmung von

ClC-2 kann neben anderen Wirkstoffen der Cl--Kanal-Blocker NPPB eingesetzt werden. Die

eindeutige Rolle von ClC-2 für die Magensäuresekretion bleibt allerdings umstritten, denn in

einer anderen Studie wurde weder in Rattengewebe noch in menschlichen Magenproben eine

signifikante Expression dieses Kanalproteines in Belegzellen festgestellt (22).

Der während der Säuresekretion durch luminalen Ausstrom entstehende Verlust an Cl--Ionen

muß durch den entsprechenden Nachschub von der basolateralen Seite wieder aufgefüllt

7 Einleitung

werden. Im klassischen Modell steht dafür ein Cl¯/HCO3--Austauscher (AE2), der zur selben

Zeit das vermehrt entstehende HCO3- aus der Belegzelle transportiert, zur Verfügung. Starke

AE2-Expression konnte in den Belegzellen nachgewiesen und mit Hilfe

immunhistochemischer Methoden genau in der basolateralen Membran lokalisiert werden.

Die Intensität der AE2-Expression ist hierbei im Vergleich zu den anderen Zellen des

Magenepithels um ein Vielfaches höher, scheint also besonders mit den Funktionen der

Belegzelle verknüpft zu sein.

AE2 kommt ubiquitär vor und gehört zur Familie der SLC4A-codierten Transportproteine, zu

denen neben anderen Typen von AE auch Na+-HCO3--Cotransporter gehören (2). Allein in

Belegzellen wurden drei verschiedene Subtypen von AE2 gefunden. Die Anionenaustauscher

erfüllen allgemein verschiedene Aufgaben. Sie sind unter anderem an der Regulation des

intrazellulären pH-Wertes, der intrazellulären Cl--Ionenkonzentration, des Zellvolumens und

des Zelltonus beteiligt. Der in die Membran integrierte Teil des Transportproteins, die

sogenannte transmembranäre Domäne, enthält wahrscheinlich einen pH-empfindlichen

Bereich, der als pH-Sensor fungieren kann (54). Charakteristische Merkmale des AE2 sind

seine äußerst hohe Transportkapazität sowie die spezifische Inhibition durch 4,4’-diiso-

thiocyanostilbene-2,2’-disulfonsäure (DIDS) in einer niedrigen Konzentration (IC50 = 3.2

µM) (12). Eine weitere Möglichkeit, die Funktion von AE2 zu hemmen, besteht indirekt über

den Einsatz des Carboanhydrasehemmstoffes Azetazolamid, der die notwendige schnelle

Bereitstellung von endogenem HCO3- unterbindet. Für die Steuerung der AE2-Aktivität

werden grundsätzlich zwei unterschiedliche Möglichkeiten in Betracht gezogen. Zum einen

können über Phosphorylierung und gleichzeitige Änderung der Affinität der Bindungsstellen

die kinetischen Eigenschaften verändert werden. Zum anderen wirken niedrige Cl--

Konzentration und hohe HCO3-Konzentrationen intrazellulär aktivierend. Hierdurch besteht

eine Abhängigkeit vom herrschenden intrazellulären pH-Wert (pHi), der bei Werten unter 7.0

zu einer Deaktivierung führt (41; 51; 54).

Erst kürzlich wurde ein nur in Magen und Niere vorkommendes Transportprotein aus einer

anderen SLC-Anionenaustauscherfamilie identifiziert. Es handelt sich um SLC26A7. Sein

Vorkommen ist ausschließlich auf die basolaterale Membran von Belegzellen bzw. von

Schaltzellen in den äußeren medullären Sammelrohren der Niere beschränkt. Im Gegensatz zu

AE2 funktioniert der elektroneutrale Austausch von extrazellulärem Cl- gegen intrazelluläres

HCO3- auch bei pHi-Werten deutlich unter 7.0. Mit einer IC50 von 126μM 4,4’-diiso-

thiocyanostilbene-2,2’-disulfonsäure (DIDS) ist für die Inhibition eine bedeutend höhere

8 Einleitung

Konzentration nötig als bei AE2 (2; 43). Zudem konnten wir in zusätzlichen Versuchen in

Zusammenarbeit mit Prof. Muallem, Texas, NPPB als Inhibitor von SLC26A7 nachweisen.

An Xenopus Oozyten, die das SLC26A7-Protein überexprimierten, führte SLC26A7 zu Cl--

Strömen. Wir fanden eine konzentrationsabhängige Blockade dieser Cl--Ströme durch NPPB

(unveröffentlichte Daten). Bei NPPB handelt es sich um einen unspezifischen Inhibitor von

Cl--Kanälen, so daß NPPB potenziell sowohl luminal als auch basolateral an der Belegzelle

wirken kann.

Einen weiteren Mechanismus, der für den benötigten Cl--Einstrom basolateral zur Verfügung

steht, repräsentiert ein Cotransporter für Natrium-, Kalium- und Chloridionen (NKCC).

Elektroneutral transportiert dieses Transportprotein vier Ionen über die Zellmembran, jeweils

ein Na+-, ein K+- und zwei Cl--Ionen. NKCC-Proteine sind in vielen verschiedenen Zellen und

Gewebearten nachweisbar, darunter in absorbierenden und sezernierenden Epithelien,

Muskelzellen, Nervenzellen, Endothelien, Fibroblasten und Blutzellen. Allgemein scheint

NKCC eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Zellvolumens sowie der Aufrechterhaltung

von Ionengradienten zu spielen. Besonders in Epithelverbänden sorgt NKCC gemeinsam mit

Cl-- und K+-Kanälen sowie der Na+-K+-Pumpe für transepithelialen Transport von NaCl und

daran anschließend von Wasser (19). NKCC-Proteine lassen sich weiter einteilen in zwei

verschiedene Isoformen. NKCC1 ist die weitverbreitete, epithelial sekretorische Isoform,

während NKCC2 nur im dicken aufsteigenden Ast der Henleschen-Schleife nachgewiesen

wurde, wo NaCl resorbiert wird (33). NKCC-Aktivität läßt sich charakteristischerweise mit

den Schleifendiuretika Bumetanid und Furosemid hemmen (37). Letztlich reguliert wird das

NKCC-Protein über seinen Phosphorylierungszustand. Hierbei spielen Kinasen (PKA) und

Phosphatasen eine Rolle, indem sie auf Änderungen des intrazellulären Cl--Gehaltes oder des

Zellvolumens reagieren (31; 32).

Die Belegzelle besitzt außerdem Austausch-Proteine für Na+-Ionen und Protonen (NHE). In

den Belegzellen ist dies basolateral die Isoform 2. Sie spielt für die pH-Homöostase der Zelle

eine wichtige Rolle. Hemmbar sind die NHE-Proteine mit dem spezifischen Hemmstoff

Amilorid. Abbildung 4 zeigt die wichtigen Transporter mit den entsprechenden Hemmstoffen

im Transportschema der Belegzelle.

9 Einleitung

Cl-

K+

H2O

Na+ATP

ATP

K+

H+

H+

Na+

AE2Cl-

HCO3-

CAHCO3

-

H+

K+

HCO3-

SLC 26A7Cl-

DIDS = 10µM

NPPBDIDS = 150µM

AmiloridAZD0865

Na+

K+2Cl-

Bumetanid

Luminal Basolateral

Cl-

K+

H2O

Na+ATPATP

ATP

K+

H+

H+

Na+

AE2Cl-

HCO3-

CAHCO3

-

H+

K+

HCO3-

SLC 26A7Cl-

DIDS = 10µM

NPPBDIDS = 150µM

AmiloridAZD0865

Na+

K+2Cl-Na+

K+2Cl-

Bumetanid

Luminal Basolateral

Abbildung 4: Zusammenfassung der Transportproteine und ihrer Hemmstoffe.

1.4 Regulationsmechanismen und intrazelluläre Signalweiterleitung

Die Säuresekretion durch die Belegzellen ist physiologischerweise ein sehr genau regulierter

Vorgang. Verschiedene Ligand-Rezeptor-Interaktionen spielen dabei eine Rolle. An

vorderster Stelle sind hierbei Acetylcholin, Gastrin und besonders Histamin zu nennen, die

parakrin und endokrin Einfluß nehmen (Abbildung 5).

Acetylcholin, aufgrund zentraler Impulse aus den vagalen Nervenendigungen freigesetzt,

greift über verschiedene Wege in die Magensäuresekretion ein. Zum einen hat es über

muskarinerge Rezeptoren vom Typ 3 (M3), einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor, direkt

aktivierenden Einfluß. Stimulation führt über Aktivierung von Phospholipase C zu einem

Anstieg von Inositol-triphosphat (IP3), welches als Botenstoff dafür sorgt, daß Kalzium aus

seinen intrazellulären Speichern freigesetzt wird (56). Eine weitaus wichtigere Rolle scheinen

quantitativ die Acetylcholinwirkungen zu spielen, die ihren Angriffspunkt nicht direkt an der

Belegzelle haben. Sowohl die Histaminfreisetzung aus den ECL-Zellen im Magenfundus als

auch die Freigabe von Gastrin aus den G-Zellen des Antrums werden über

Acetylcholinrezeptoren gesteigert.

10 Einleitung

Luminal

M3

H2

Gastrin

Acetylcholin

Histamin

Gαq, PLC, DAG, IP3, Ca2+, PKC

Gαs, AC, cAMP, PKA

H+

R Prostaglandin, Somatostatin

Gαi

G

GRP

GIP, CCKSomatostatin

H+

BasolateralCaSR Ca2+

ECL

CCKB

Luminal

M3

H2

Gastrin

Acetylcholin

Histamin

Gαq, PLC, DAG, IP3, Ca2+, PKC

Gαs, AC, cAMP, PKA

H+

R Prostaglandin, Somatostatin

Gαi

G

GRP

GIP, CCKSomatostatin

H+

BasolateralCaSR Ca2+

ECL

CCKB

Abbildung 5: Regulation der Säuresekretion. G = G-Zelle, ECL = Histamin-speichernde ECL-Zelle, GIP = Gastric-inhibitory-peptide, CCK = Cholecystokinin, GRP = Gastrin-releasing-peptide, PLC = Phospholipase C, DAG = Diacylglycerin, PKC = Proteinkinase C, PKA = Proteinkinase A, AC = Adenylatcyclase, IP3 = Inositoltriphosphat, Gαq,s,i = G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, CaSR = Calcium-sensing-receptor, M3 = muskarinerger Rezeptor Subtyp 3, CCKB = Gastrin/Cholecystokinin-B-Rezeptor, H2 = Histaminrezeptor Typ 2.

Gastrin entfaltet seine Wirkung an den Belegzellen in einer sehr ähnlichen Art und Weise wie

Acetylcholin über den Gastrin/Cholecystokinin-B-Rezeptor (CCKB). Über ein G-Protein,

aktivierte Phospholipase C und IP3 erhöht es ebenfalls die intrazelluläre Ca2+-Konzentration.

Gastrin wird über die Vorstufe Progastrin in antralen und duodenalen G-Zellen gebildet. Die

Freisetzung unterliegt mehreren regulatorischen Mechanismen. Sie wird erhöht durch

Acetylcholin, Gastrin-releasing-peptide (GRP), Aminosäuren und Protonen. Letzteres ist

möglich, da die G-Zelle ebenfalls direkten Kontakt zum Drüsenlumen hat und der pH-Wert

sie so direkt beeinflussen kann. Liegt der pH-Wert über 3, wird vermehrt Gastrin abgegeben,

während ein Wert unter 3 zu einer Verminderung der Abgabe führt. Diese Koppelung an den

vorherrschenden pH-Wert scheint die wichtigste regulierende Rolle für die G-Zelle zu

spielen. Ebenso wie der niedrige pH-Wert hemmen Somatostatin, Cholecystokinin und

Gastric-inhibitory-peptide die Gastrinsekretion. Neben dem oben erwähnten direkten Effekt

auf die Belegzelle nimmt Gastrin ebenfalls Einfluß über Gastrinrezeptoren an den ECL-Zellen

und somit über den sich anschließenden Histaminpfad. Es ist Gegenstand laufender

Diskussionen, welche Wirkung entscheidender ist. Unter einer Blockade von Histamin-

Rezeptoren (H2) läßt sich keine gastrininduzierte Säuresekretion messen. Die Anwesenheit

von Histamin und seine Wirkung scheinen somit eine Vorbedingung für die Gastrinwirkung

11 Einleitung

zu sein. Auf der anderen Seite verliert Histamin seine stimulierende Wirkung fast vollständig

bei gentechnisch mutierten Mäusen ohne Gastrinproduktion oder ohne den Gastrinrezeptor

CCKB (50).

Die weitaus größte Bedeutung bei der Magensäuresekretion, gerade was die direkte

Stimulation der Belegzelle betrifft, kommt dem Histamin aus den ECL-Zellen zu. Diese

kleinen Zellen finden sich in den säureproduzierenden Anteilen des Magens in unmittelbarer

Nähe zu den Histaminzielzellen, den Belegzellen. Im Zytoplasma der ECL-Zellen lassen sich

mit Hilfe der Elektronenmikroskopie dichte Vesikel nachweisen, die Histamin enthalten.

Somit steht es in dieser Speicherform für eine schnelle Freisetzung zur Verfügung. Die

Kontrolle dieser Histaminausschüttung, ebenso wie die Synthese des Histamins, wird stark

von der Gastrinkonzentration beeinflußt. Eine etwas weniger bedeutende Rolle bei der

Stimulierung der Histaminfreisetzung aus den ECL-Zellen spielen außerdem Acetylcholin

und β-Sympathomimetika. Eine Inhibition der ECL-Zellen findet man unter dem Einfluß von

Somatostatin (46). Die für die Magensäuresekretion entscheidenden Histaminrezeptoren (H2)

finden sich an der basolateralen Membran der Belegzellen. Die Bindung von Histamin an

seinen G-Protein-gekoppelten Rezeptor aktiviert die Adenylatzyklase, wodurch mehr cAMP

bereitgestellt wird, welches die Proteinkinase A (PKA) aktivieren kann. Experimentell wie

auch in der klinischen Praxis ist eine selektive Inhibition des H2-Rezeptors möglich, die zu

einer Drosselung der Säuresekretion führt. Auch die durch Gastrin und Acetylcholin

ausgelöste Stimulation wird durch H2-Antagonisten vermindert, was für eine

Histaminabhängigkeit dieser Vorgänge spricht oder eventuell eher auf indirekte Stimulation

der ECL-Zellen durch Gastrin und Acetylcholin deutet.

Die Aktivierung der Belegzelle zur Säuresekretion über Histamin, Gastrin und Acetylcholin

mündet letztlich in einer gemeinsamen Endstrecke: der Verschmelzung der H+/K+-ATPase-

enthaltenden Vesikel mit der luminalen Zellmembran und der Bereitstellung der

Transportwege für K+, Cl- und HCO3-. Wegen seiner zentralen Bedeutung bei der Aktivierung

der Belegzelle wurde Histamin für die Experimente im Rahmen dieser Arbeit als Mittel zur

Stimulation gewählt.

Neben diesen klassischen Stimulations- und Regulationsmechanismen gibt es eine Reihe

weiterer Elemente, für die gerade in letzter Zeit eine Einflußnahme auf die Sekretion von

Magensäure nachgewiesen wurde. Somatostatin, einem parakrin-wirkenden Stoff aus den D-

Zellen des Magens, wird unter anderem zugeschrieben, daß es die Synthese und Sekretion von

Gastrin hemmt, einen hemmenden Einfluß auf die Histaminabgabe der ECL-Zellen ausübt

12 Einleitung

und daneben direkt negativ auf die Magensäuresekretion der Belegzellen wirkt. Vermittelt

werden diese Funktionen meist über den Somatostatinrezeptor vom Subtyp 2 (sst2), der auf

ECL- und Belegzellen nachgewiesen wurde (29; 36). Der sogenannte „Calcium-sensing

receptor“ (CaSR) stellt eine Art Biosensor für zwei- und dreiwertige Kationen dar. Er wurde

sowohl stark exprimiert in Belegzellen des Magens gefunden, wo er unabhängig von anderen

Mechanismen die Säuresekretion fördert, als auch in G-Zellen nachgewiesen, wo er Einfluß

auf die Gastrinabgabe hat (8; 17; 50). Der CaSR ist in seiner Funktion unter anderem durch

Aminosäuren, insbesondere L-Phenylalanin, allosterisch aktivierbar (8). Aminosäuren sind

aber auch unabhängig vom CaSR an der Regulation der Magensäuresekretion beteiligt. Dies

geschieht über spezielle Aminosäurentransporter in Belegzellen (27). Wie der Weg von

erhöhten Aminosäurenkonzentrationen im Blut über diese Transporter hin zu verstärkter

Magensäuresekretion verläuft, ist noch nicht genau bekannt.

1.5 Fragestellung

Belegzellen verfügen über drei mögliche Cl--Einstrommechanismen in der basolateralen

Membran: AE2, SLC26A7 und NKCC1. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Beteiligung

dieser verschiedenen Cl--Transporter an der Cl--Aufnahme während der stimulierten

Säuresekretion funktionell zu untersuchen. Die mikrofluorimetrischen Messungen des pHi-

Wertes und der intrazellulären Cl--Ionenkonzentration an handisolierten Magendrüsen

erfolgten unter Anwendung pharmakologischer Hemmstoffe, unter Modulation des pH-

Wertes sowie Veränderungen der Ionenkonzentrationen. Mit diesen Experimenten sollte die

Bedeutung der einzelnen Transporter bestimmt und ihr Beitrag zur Magensäuresekretion

eingeschätzt werden.

13 Material und Methoden


2.1 Lösungen und Substanzen

Für die Perfusion bei den Experimenten sowie bei der Präparation der einzelnen Magendrüsen

wurde HEPES-Ringer-Lösung (Standard) verwendet. Sie wurde je nach Anforderung der

einzelnen Versuchsreihen in ihrer Zusammensetzung variiert. HEPES (Hydroxymethyl-

aminomethan-N-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethan-sulfonat; pKs 7.4) diente hierbei als Puffer.

Tabelle 1: Zusammensetzung der Lösungen. Alle Angaben in mmol/l. (37°C; pH = 7,4)

Standard Na+-frei Na+-frei +NH4Cl Cl--frei Na+/Cl--frei

NaCl 115 - - - -

NMDG+-Cl- - 132.8 132.8 -

NMDG+-SO42- - - - - 132.8

NH4Cl - - 20 - -

KCl 5 5 5 - -

MgSO4 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

CaCl2 1 1 1 - -

K+-Gluconat - - - 5 3

Na+-Gluconat - - - 120 -

Ca2+-Gluconat - - - 2 -

Ca2+-Cyclamat - - - - 2

Mannitol - - - - 10

Glucose 10 10 10 10 10

HEPES 32.2 32.2 32.2 32.2 32.2

Bei NMDG handelt es sich um N-Methyl-D-Glucamin, das zur Substitution in den Na+-freien

Lösungen eingesetzt wurde.

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, wurden alle verwendeten Lösungen bei einer mittels

Thermosonde in der Lösung gemessenen Temperatur von 37°C auf einen pH-Wert von 7.4

eingestellt. Um den normalen physiologischen Verhältnissen so gerecht wie möglich zu


werden, wurden alle Experimente bei derselben Temperatur von 37°C durchgeführt, was

durch Beheizung des Zulaufs und des Objekttisches am Mikroskop möglich war. Für die

genaue Titration des pH-Wertes kamen je nach Lösung Salzsäure, Schwefelsäure, NaOH oder

KOH zum Einsatz.

Mit Hilfe eines Gefrierpunkt-Osmometers (Precision Systems, Inc.; Natick, MA, USA)

erfolgte vor Einsatz der Lösungen eine Kontrolle der Osmolarität, die bei allen Lösungen 295

± 5 mosmol/L betrug. Alle HEPES-Lösungen wurden jeweils frisch hergestellt, bei

Nichtgebrauch unter 4°C gelagert und nach maximal drei Tagen verworfen. Den Lösungen

wurde kein CO2 zugeführt, sie waren folglich HCO3--frei.

Andere verwendete Substanzen

Alle Substanzen wurden von der Firma SIGMA (St. Louis, USA) bezogen, mit Ausnahme des

Protonenpumpeninhibitors AZD0865, der eine freundliche Gabe der Firma Astra Zeneca

(Moelndal, Schweden) war. Die Farbstoffe MQAE und BCECF stammten von Molecular

Probes. Die verwendeten Substanzen wurden als frische Stammlösungen angesetzt und zu den

Experimentierlösungen pipettiert, um die notwendigen Endkonzentrationen zu erreichen. Die

Stammlösungen wurden aliquotiert und bei -20°C tiefgefroren aufbewahrt.

Nigericin und BCECF wurden in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst, wobei die

Endkonzentration von DMSO bei ≤0,1% lag.

Tabelle 2: Substanzen und Pharmaka.

Substanz Nomenklatur Strukturformel

Histamin

MQAE N-(methoxycarbonylmethyl)-

6-methoxyquinolinium-bromid

Cimetidin


BCECF 2’,7’-bis-(carboxyethyl)-5-(6)-

carboxyfluorescein

Nigericin

NPPB 5-Nitro-2-(3-phenylpropyl-

amino)benzoic acid

Azetazolamid


Bumetanid

Amilorid

DIDS 4,4’-Diisothiocyanato-

stilbene-2,2’-disulfonic acid

AZD0865 Protonenpumpenhemmstoff der Firma Astra Zeneca; zur Zeit

noch nicht offengelegt

Celltak biologisches Adhesiv zur Fixierung der Drüsen auf dem Objektträger

2.2 Tiere

Bei den verwendeten Tieren handelte es sich um Sprague-Dawley Ratten aus den Charles

River Laboratories, Wilmington, MA, USA. Die Tiere wurden unter normalem Tag- und

Nachtrhythmus sowie gleichbleibenden, kontrollierten Klimabedingungen gehalten und hatten

jederzeit freien Zugang zu Standardfutter und Wasser, wie es den Tierhaltungsregelungen des

Yale Animal Care and Use Committee der Yale-Universität entsprach. Zum Zeitpunkt der

Magenentnahme wogen die Tiere ca. 150 bis 250 g. Jeweils zwölf Stunden vor den

Experimenten bekamen die Ratten kein Futter mehr, um gleiche Ausgangsbedingungen zu

schaffen und die gastrische Magensäuresekretion, soweit es möglich war, auf ein Minimum

herabzusetzen.


2.3 Isolierung der Magendrüsen

Für die Darstellung einzelner Magendrüsen wurde die Präparation von Hand unter

mikroskopischer Aufsicht gewählt, um die größtmögliche Stabilität und Unversehrtheit der

gesamten Drüse zu erreichen. Zu diesem Zwecke wurden die Ratten mit Äther anästhesiert

und nach zervikaler Dislokation wurde durch eine Laparotomie der gesamte Magen

entnommen. In auf Eis gekühlter Standard-Lösung wurde der Magen sodann eröffnet und in

der gleichen Lösung unter mehrmaligem Austauschen der Lösung gründlich gewaschen, so

daß der größte Teil des Mageninhalts entfernt wurde, der trotz Fasten noch vorhanden war.

Für die Versuche wurden nur Teile aus dem Corpusbereich entnommen, da dort die

säuresezernierenden Magendrüsen am zahlreichsten auftreten. Das Gewebe wurde daraufhin

in ca. 0.3-0.5 cm2 große Stücke zurechtgeschnitten.

Unter Beibehaltung der Kühlkette wurden die Gewebestücke unter ein Stereomikroskop

(Zeiss) überführt, wo bei 50facher Vergrößerung mit geschliffenen Pinzetten zuerst die

Muscularis mucosae und übrige Gewebereste entfernt und danach Einzeldrüsen isoliert

wurden.

Die Drüsen wurden in einem nächsten Schritt aus der gekühlten Standard-Lösung mittels

einer feinen Pasteur-Glaspipette auf den mit Celltak, einem biologischen Klebstoff aus

Fibronectin, vorbereiteten Objektträger überführt. Dort wurden die Drüsen, wiederum unter

mikroskopischer Sicht, vorsichtig mit Pinzetten fixiert. Zuletzt wurde die Perfusionskammer

mit Hilfe eines abdichtenden Gels auf dem Objektträger befestigt und sofort im Anschluß die

Perfusion gestartet, um die Zellen in ihrer Lebens- und Funktionsfähigkeit so wenig wie

möglich zu beeinträchtigen.

Die Belegzellen wurden anhand ihrer charakteristischen Morphologie identifiziert (Abbildung

6). Die Belegzelle hat eine typische Form, ist relativ groß und im Vergleich zu benachbarten

Hauptzellen konisch geformt. Eine Kontrolle erfolgte über den Einsatz eines mitochondrialen

Markerfarbstoffes, dessen Intensität erwartungsgemäß in den Belegzellen als

mitochondrienreichsten Zellen des Organismus am weitaus stärksten war.


Abbildung 6: Aufnahme einer handisolierten Rattenmagendrüse. Auf der linken Seite die Fluoreszenzaufnahme, rechts das Nativbild unter normaler Durchleuchtung. Die Belegzellen sind an ihrer charakteristischen Form zu erkennen (Pfeil). Vergrößerung: 600x.

Im Durchschnitt wurden je Experiment ungefähr acht Zellen in einer Drüse markiert. Alle

Daten und Bilder wurden nach Ende eines Experimentes auf dem Computer gespeichert, bis

sie zu einem späteren Zeitpunkt sorgfältig ausgewertet wurden. Ebenso wurde während jeder

Messung die Hintergrundemission registriert. Diese war jedoch nie größer als maximal 2%.

Bei jedem Experiment wurde außerdem die Autofluoreszenz des Gewebes überprüft.

Sämtliche Experimente wurden an verschiedenen Magendrüsen von mindestens drei

verschiedenen Tieren und an unterschiedlichen Tagen wiederholt, wobei mit „n“ die absolute

Zahl der gemessenen Zellen angegeben ist.

2.4 Meßanordnung

Nachdem die Drüsen isoliert und je nach Experiment mit Fluoreszenzfarbstoff inkubiert

worden waren, wurde der Objektträger mit der Perfusionskammer auf dem Tisch eines

inversen Mikroskops (Olympus IX50, Olympus, USA) fixiert. Während der Versuche fand

eine kontinuierliche Perfusion mit rund 5ml/min statt, wobei das Kammervolumen ungefähr

180µl betrug. Über ein elektronisch rückgekoppeltes Heizsystem, das sowohl die Kammer als

auch die zuführenden Leitungen einschloß, wurde die Temperatur konstant bei 37°C ± 0.5°C

gehalten und durch Kontrollmessungen sichergestellt.


Das Mikroskop war mit einer 175 Watt-Xenonlampe und einem 60fachen

Vergrößerungsobjektiv ausgestattet. Der prinzipielle Aufbau der Mikrofluorimetrie ist in

Abbildung 7 dargestellt. Durch den Einsatz entsprechender Filter durch einen Monochromator

wurde die benötigte Wellenlänge des Lichtes bestimmt. Die größte Bedeutung hatte die

Trennung des Exzitationslichtes von der emittierten Fluoreszenz. Hierzu diente ein

dichroischer Spiegel, da das vom Fluoreszenzfarbstoff emittierte Licht immer langwelliger,

d.h. weniger energiereich ist als das Exzitationslicht. Da nur ein kleiner Bruchteil des von der

jeweiligen Magendrüse ausgesandten Fluoreszenzlichtes letztlich durch das Objektiv fällt,

muß für eine möglichst maximale Kollektion gesorgt werden. Diese gewünschte

Maximierung geht allerdings auf Kosten der Bildqualität im normalen

Durchleuchtungsmodus.

CCD -Kamera

Con trol ru n wi th c holeratoxin (10 m in. inc ub ate d) - 090501 CHOLERA1.X LS

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

126,85

231,8

5

336,8

544

1,8554

6,8565

1,85

756,85

861,8

5

966,8

5

1071

,85

1176,8

5

1281

,85

1386

,85

1491

,85

1596

,85

1701,8

5

1806

,85

1911,8

5

2016

,85

2121

,85

2226

,85

2331,8

5

2436

,85

2541,8

5

2649

,88

2754

,88

2859

,88

2964

,88

3069,8

8

3174

,88

3279,8

8

3384

,88

3489

,88

3594

,88

3699

,88

time

cou

nts

HEPES (low divalent)

OCl HEPES (low divalent)



calibrationEmissionsfilter

Computer

Objektiv

Exzitationsfilter

Dichroischer Spiegel

DigitaleBildbearbeitung

GraphischeAuswertung

Spiegel

350 nm

460 nm

Lichtquelle

Flüssigkeit

Perfusionskammer

Drüse

x/y -Tisch

37°C

CCD -Kamera


1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

126,85

231,8

5

336,8

544

1,8554

6,8565

1,85

756,85

861,8

5

966,8

5

1071

,85

1176,8

5

1281

,85

1386

,85

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,85

1596

,85

1701,8

5

1806

,85

1911,8

5

2016

,85

2121

,85

2226

,85

2331,8

5

2436

,85

2541,8

5

2649

,88

2754

,88

2859

,88

2964

,88

3069,8

8

3174

,88

3279,8

8

3384

,88

3489

,88

3594

,88

3699

,88

time

cou

nts






Computer

Objektiv

Exzitationsfilter




Spiegel

350 nm

460 nm

Lichtquelle

Flüssigkeit

Perfusionskammer

Drüse

x/y -Tisch

37°C

CCD -Kamera


1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

126,85

231,8

5

336,8

544

1,8554

6,8565

1,85

756,85

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,85

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5

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,85

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2226

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5

2436

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2541,8

5

2649

,88

2754

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2964

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8

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8

3384

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3594

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,88

time

cou

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calibration


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1500

2000

2500

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4500

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231,8

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1,85

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5

2016

,85

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2226

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2436

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time

cou

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calibration


1000

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2754

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2859

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2964

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8

3174

,88

3279,8

8

3384

,88

3489

,88

3594

,88

3699

,88

time

cou

nts






Computer

Objektiv

Exzitationsfilter




Spiegel

350 nm

460 nm

Lichtquelle

Flüssigkeit

Perfusionskammer

Drüse

x/y -Tisch

37°C

Abbildung 7: Schematischer Aufbau der Mikrofluorimetrie. Ausgehend von der Xenonlampe als Lichtquelle wird z.B. die für Cl--Messungen benötigte Wellenlänge von 350 nm durch das Exzitationsfilter (Bandpass) herausgefiltert. Der dichroische Spiegel reflektiert diese Wellenlänge, während er gleichzeitig das von der Drüse emittierte längerwellige Licht durchläßt. Das Emissionsfilter hinter dem dichroischen Spiegel sorgt dafür, daß nur die gewünschte Wellenlänge weiter zur Kamera (CCD-Kamera = Charged-Coupled-Device-Kamera) und zur weiteren Bearbeitung gelangt.


2.5 Versuchsdurchführung

2.5.1 Intrazelluläre pH-Messung

BCECF (2’,7’-bis-(carboxyethyl)-5-(6)-carboxyfluorescein) ist ein häufig verwendeter

Fluoreszenzindikator für die Messung des intrazellulären pH-Wertes. Im Gegensatz zu

MQAE handelt es sich hierbei nicht um einen Einwellenlängen-Farbstoff. Zur Exzitation

kommen zwei verschiedene Wellenlängen (440 nm und 490 nm) zur Anwendung, die

Emission wird dann in beiden Fällen bei einer Wellenlänge von 535 ± 10 nm aufgezeichnet.

Bei der Exzitationswellenlänge von 440 nm ist die Fluoreszenz relativ pH-unempfindlich. Bei

490 nm dagegen reagiert die Indikatorsubstanz sehr pH-empfindlich. Der pKa-Wert dieses

Stoffes beträgt 7.0 und liegt damit im Bereich des zytoplasmatischen pH während der

durchgeführten Experimente. Das Acetylmethylester-Derivat von BCECF weist eine hohe

Membrangängigkeit auf. Die Verwendung eines lipophilen Esterderivates stellt eine elegante

Methode der Indikatorbeladung von Zellen dar. Intrazellulär wird das nicht-fluoreszierende

Derivat durch unspezifische Esterasen hydrolysiert und so in die fluoreszierende Form

überführt. Der fluoreszierende Indikator kann aufgrund seiner Ladung die Zellmembran nicht

mehr durchdringen. Bei einem pH von 7.0-8.0 hat BCECF 4-5 negative Ladungen, die die

intrazelluläre Retention bewirken. In den Experimenten kam eine Konzentration von 10µM

des BCECFs zur Anwendung, welches zuvor in DMSO gelöst wurde. Das Gewebe wurde bei

Raumtemperatur für rund 15 Minuten inkubiert.

Aus den Meßwerten errechnete der Computer automatisch das Verhältnis (ratio) 490/440 der

Emissionsintensitäten bei den entsprechenden Exzitationswellenlängen. Mit Hilfe der

Nigericinkalibrierung wurden die gemessenen Fluoreszenzquotienten im Anschluß in absolute

pH-Werte konvertiert (55). Nigericin wurde als Protonen-Ionophor bzw. K+/H+-Austauscher

für diesen Zweck mit einer speziellen K+-reichen Kalibrierungslösung kombiniert. Dies führte

zu einem Angleichen der pH-Werte von intra- und extrazellulärem Raum. Der hohe K+-

Ionengehalt (105mM; siehe Tabelle 3) der Kalibrierungslösung führte während der Perfusion

zu einem Ausgleich der transmembranären K+-Konzentration, daher zu einer vollständigen

Depolarisation des Membranpotentials und erlaubte auf diese Weise zusammen mit dem

Nigericin die Einstellung des Protonengleichgewichtes.


Tabelle 3: Zusammensetzung der Kalibrierlösung bei pH-Wert 7.4.

Substanz mmol/l

NMDG 32.8

HEPES 32.2

KCl 105

CaCl2 1

MgSO4 1.2

Nigericin 0.01

Da BCECF einen sogenannten gewebespezifischen pKa-Wert hat, der bedingt wird durch das

jeweilige Gewebe und den Zelltyp sowie außerdem durch die Untersuchungsbedingungen

beeinflußt wird, muß jeweils eine Kalibrierung durchgeführt und eine Eichkurve erstellt

werden. Für die vorliegenden Versuche wurde daher eine Kalibrierungskurve in den

Belegzellen des Rattenmagens für den pH-Bereich 5.5 bis 8.5 erstellt und der dabei

gewonnene pKa-Wert für die Analyse aller Versuche verwendet. Dabei ergab sich für das

Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei den Wellenlängen 440 nm und 490 nm sowie dem

extrazellulären pH-Wert eine sigmoidale Funktion mit annähernd linearem Verlauf zwischen

pH 6.4 und 7.8. Der errechnete pKa-Wert für die Rattenbelegzellen betrug 7.34 ± 0.16.

Im einzelnen wurde zunächst eine Magendrüse isoliert und für 15 Minuten mit BCECF in

Standard-HEPES bei Raumtemperatur inkubiert. Vor dem Start der

Fluoreszenzaufzeichnungen wurde die Perfusionskammer mit Standard-Lösung gespült, um

die nicht aufgenommene Indikatorsubstanz zu entfernen. Außerdem wurde, wie bei jedem

folgenden Experiment, gewartet, bis sich ein konstanter Ausgangsfluoreszenzquotient

eingestellt hatte. Darauf folgte die Perfusion mit den verschiedenen Kalibrierungslösungen,

die jeweils für einen pH-Wert zwischen 5.5 und 8.5 in 0.5-Punkteabständen auf den

jeweiligen pH-Wert bei 37°C titriert worden waren. Die Nigericinkonzentration betrug in

allen Lösungen 10µM. Hatte sich ein konstanter Meßwert für einen pH-Wert eingestellt,

wurde zur nächsthöheren bzw. -niederen Kalibrierungslösung geschaltet (Abbildung 8).


0

1

2

3

4

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Zeit (s)

Rat

io 4

90/4

40

Kontr pH 7.0 7.5 8.0 8.5 7.0 6.5 6.0 5.5 7.0

0

1

2

3

4

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Zeit (s)

Rat

io 4

90/4

40

Kontr pH 7.0 7.5 8.0 8.5 7.0 6.5 6.0 5.5 7.0

Abbildung 8: Originalaufzeichnung des Verlaufs des Fluoreszenzquotienten (ratio 490/440) während der Perfusion mit den Nigericinkalibrierungslösungen verschiedener pH-Werte. Kontr = Standard-Lösung bei pH = 7.4.

Belegzellen weisen zahlreiche Regulationsmechanismen des intrazellulären pH-Wertes (pHi)

auf. Neben den zelleigenen Puffersystemen besitzen die Zellen die beschriebenen Cl-/HCO3--

Austauschproteine in ihren Membranen, die unter physiologischen Bedingungen Cl--Ionen in

die Zelle hinein- und HCO3--Ionen aus der Zelle heraustransportieren und so den pHi-Wert

beeinflussen. Werden im Experiment die Bedingungen geändert, z.B. durch Einsatz von Cl--

freier Lösung, können diese Austauscher ebenso in der umgekehrten Richtung funktionieren.

Um diesen Einfluß in den Versuchen so gering wie möglich zu halten, wurden

bikarbonationenfreie Lösungen eingesetzt.

Für die Messungen im azidotischen pHi-Bereich wurden die Belegzellen zu Beginn mit dem

Ammonium-Puls-Verfahren angesäuert, um so die darauf folgende Säuresekretion durch die

Protonenpumpe, die nur bei pH-Werten unter 7.0 arbeitet, darstellen zu können (59). Bei

diesem Verfahren nutzt man die unterschiedliche Membranpermeabilität der Komponenten

NH3 und NH4+ des Puffersystems. Die NH3-Moleküle aus der Perfusionslösung gelangen

dabei durch Diffusion, die NH4+-Moleküle aufgrund ihres hydrophilen Charakters nur über

Transportproteine wie NKCC1 in die Zelle. Abhängig von der Permeabilität für NH4+ kommt

es nach Äquilibrierung von NH3 zu einer Änderung des pHi. Bei Rückkehr zur

Standardlösung ohne NH4Cl diffundiert das NH3 passiv nach extrazellulär und verschiebt so

die Gleichgewichtsreaktion NH4 ↔ NH3 + H+ weiter zu vermehrtem Anfall von Protonen und

Ammoniak. Durch die aktivierte Sekretion von Protonen über die H+/K+-ATPase oder in


Anwesenheit von Na+ durch den Na+/H+-Austausch folgt eine intrazelluläre Realkalisierung,

die durch die proportionale Änderung des Fluoreszenzquotienten direkt meßbar wird.

Die verschiedenen Isoformen des Natrium/Protonen-Austauschers (NHE), die fast ubiquitär

vorkommen, spielen eine prominente Rolle. Im Vordergrund steht hier die Isoform 2. Um

diesen Anteil des Protonenexportes zu hemmen, wurden in den entsprechenden Experimenten

sowohl zur Ansäuerung eine Na+-freie Ammonium-Chlorid-Lösung als auch darauffolgend

Na+-freie Lösung verwendet. Unter diesen Bedingungen und in Abwesenheit von HCO3-

hängt die beobachtete Alkalisierung der Zellen in der Na+-freien Lösung vom

Protonenausstoß über die aktivierte H+/K+-ATPase ab. Entsprechend kam in den Versuchen

zur Untersuchung der Na+-abhängigen Protonensekretion Amilorid zur Hemmung des

Natrium/Protonen-Austauschers zum Einsatz. Abbildung 9 zeigt eine Originalaufzeichnung

zur Veranschaulichung. Die Berechnung der Alkalisierungsrate (ΔpHi/min) erfolgte über

einen Zeitraum von fünf Minuten, indem ein Steigungsdreieck angelegt wurde.

7.5

6.5

6.6

6.7

6.8

6.9

7

7.1

7.2

7.3

7.4

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Zeit (s)

pHi

+Na0Na + NH4Cl0Na

7.5

6.5

6.6

6.7

6.8

6.9

7

7.1

7.2

7.3

7.4

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Zeit (s)

pHi

+Na0Na + NH4Cl0Na

Abbildung 9: Originalaufzeichnung der Histamin-stimulierten Säuresekretion. Nach Ansäuerung der Belegzelle erfolgt eine allmähliche Erholung des pH-Wertes durch Protonenausstoß über die H+/K+-ATPase in der Na+-freien Lösung (gestrichelter Abschnitt). Nach Rückgabe der Na+-Ionen erfolgt eine schnelle Alkalisierung zusätzlich durch Natrium/Protonen-Austauscher.

Die Messungen bei physiologischem pH-Wert zur Untersuchung der Cl-/HCO3--Austauscher

wurden ohne das Ammoniumpuls-Verfahren durchgeführt. Ausgehend von einem stabilen

pH-Ausgangswert von 7.2-7.3 wurde die Zelle unter Cl--Ionenentzug alkalisiert, da nun

HCO3- die Zelle nicht mehr durch den Austauscher verlassen konnte und intrazellulär


akkumulierte. Bei Rückgabe der Cl--Ionen fand entsprechend eine Azidifizierung statt, wie in

Abbildung 10 in einer Originalaufzeichnung dargestellt. Diese Azidifizierung wurde als

Ausdruck der Cl-/HCO3--Austauscheraktivität als Änderung des pH-Wertes in der ersten

Minute berechnet und als ΔpHi/min dargestellt.

0Cl

6.9

7

7.1

7.2

7.3

7.4

7.5

7.6

7.7

0 200 400 600 800 1000 1200

Zeit (s)

pHi

+Cl

H+

Na+

Cl-HCO3

-

CO2 H+ + HCO3-

0 Cl-

pH

CA

0Cl

6.9

7

7.1

7.2

7.3

7.4

7.5

7.6

7.7

0 200 400 600 800 1000 1200

Zeit (s)

pHi

+Cl

H+

Na+

Cl-HCO3

-

CO2 H+ + HCO3-

0 Cl-

pH

CA

Abbildung 10: Originalkurve des intrazellulären pH-Wertes. Unter Histaminstimulierung (100μM) führt Cl--Ionenentzug zu einer Alkalisierung und nachfolgender Plateaubildung auf einem höheren pH-Wert als zu Beginn des Experimentes. Der Mechanismus ist rechts im Zellmodel schematisch dargestellt. Bei Rückgabe der Cl--Ionen findet eine Azidifizierung durch den Export von HCO3

- und Rückkehr zum Ausgangswert statt. Der gestrichelte Abschnitt stellt die im nachfolgenden berechnete Azidifizierung mit dem Steigungsdreieck dar.

2.5.2 Intrazelluläre Chlorid-Messung

Für die Messung der intrazellulären Cl--Konzentration wurde der Cl--empfindliche Farbstoff

MQAE (N-(methoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium-bromid) von Molecular Probes

(Eugene, OR, USA) verwendet. Da es sich um einen Einwellenlängen-Farbstoff handelt, fand

die Anregung bei einer Wellenlänge von 340 ± 10 nm statt. Die erfolgende Emission wurde

bei einer Wellenlänge von 460 ± 10 nm gemessen und aufgezeichnet. MQAE besitzt eine

heterozyklische Ringstruktur mit einem positiven vierwertigen Stickstoffatom. Sein

Molekulargewicht beträgt 326. Auch MQAE liegt zur Inkubation als Ester vor. Es diffundiert

passiv in das Zellinnere, wo durch unspezifische Esterasen die Esterbindung an der N-

Position gespalten wird. Das daraufhin in hydrophiler Form vorliegende Molekül ist in der


Zelle gefangen und kann nicht wieder über die Membran austreten. Mit MQAE wurden die

präparierten Drüsen bei Raumtemperatur in einer Konzentration von 20 mM für 30 Minuten

inkubiert. Unmittelbar vor Beginn der Messung wurden die Drüsen vorsichtig mit Standard-

Lösung gespült, um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen.

Bei MQAE handelt es sich um eine sogenannte „quenching dye“. Dieser Farbstoff zeichnet

sich durch eine hohe Affinität für Cl--Ionen aus, die sich den Farbstoffmolekülen anlagern.

Die meßbare Fluoreszenz wird direkt durch die Konzentration von freien Cl--Ionen im

Zytoplasma bestimmt. Sie nimmt durch die Anlagerung von Cl--Ionen ab. Je mehr Cl--Ionen

also über die verschiedenen Cl--Transporter in die Zelle gelangen, intrazellulär zur Verfügung

stehen und sich an die Indikatormoleküle anlagern, desto weniger Fluoreszenzemission findet

statt. Umgekehrt führt jeder Abfall der intrazellulären Cl--Ionenkonzentration zu einer

Verstärkung der Fluoreszenzintensität. Da die Messung nur bei einer Wellenlänge stattfindet,

geht auch der Farbstoffverlust durch Ausbleichen („photo bleaching effect“) in die Messung

der Intensität ein. Da es sich um einen konstanten Abfall der Intensität über den Verlauf des

gesamten Experimentes handelt, wurde der Absolutwert dieses Signalverlustes in den

Berechnungen vernachlässigt.

Die Fluoreszenzintensität wurde als willkürliche Einheiten (AFU = arbitrary fluorescence

unit) aufgezeichnet und über dem entsprechenden Zeitraum als AFU-Veränderung pro Minute

(ΔAFU/min) wiedergegeben. Die emittierte Fluoreszenz wurde jeweils über markierten

Flächen (regions of interest), die einzelnen Belegzellen entsprachen, durch die Messung der

Pixelwerte berechnet. Dabei ist zu beachten, daß abnehmende Fluoreszenzintensität einer

Zunahme der intrazellulären Cl--Konzentration entspricht ( = Einstrom), während eine

Zunahme der Intensität einen sinkenden Cl--Ionengehalt ( = Ausstrom) der Zelle anzeigt. Zur

Charakterisierung der Transportproteine wurde die Fluoreszenzintensität unter verschiedenen

Bedingungen betrachtet. Ausgehend von Cl-- und Na+-Ionen-freier Lösung wurden zunächst

nur Cl--Ionen zurückgegeben, um so den Na+-unabhängigen Anteil der Cl--Aufnahme, z.B.

über Cl-/HCO3- Austauscher, zu bestimmen, während anschließend in Anwesenheit von Na+-

Ionen der Na+-abhängige Einstrom beobachtet wurde. Diese Messungen wurden alle in

Anwesenheit des Cl--Kanalblockers NPPB in einer Konzentration von 100μM durchgeführt,

der den Einstrom über luminale Cl--Kanäle, aber auch über SLC26A7 hemmt. In Abbildung

11 ist zur Veranschaulichung der Experimente die Originalaufzeichnung einer Messung

exemplarisch dargestellt.


0

10

20

30

40

50

60

200 400 600 800 1000

Zeit (s)

AFU

0Cl-/0Na+

+Cl-/0Na+

+Cl-/+Na+

T1

T2

0

10

20

30

40

50

60

200 400 600 800 1000

Zeit (s)

AFU

0Cl-/0Na+

+Cl-/0Na+

+Cl-/+Na+

T1

T2

Abbildung 11: Repräsentative Darstellung der Änderung der Fluoreszenzintensität von MQAE als Maß für die [Cl-

i] in AFU. Während die alleinige Zugabe von Cl--Ionen nur eine geringe Fluoreszenzänderung bewirkt, ist nach Wechsel zu einer Cl-- und Na+-haltigen Lösung ein starker Konzentrationsanstieg von Cl--Ionen in der Zelle zu sehen, der durch die stark sinkende Fluoreszenzintensität des MQAEs widergespiegelt wird. Die Wegnahme von Na+- und Cl--Ionen kehrt den Vorgang um. Die für die Berechnung zugrunde gelegte Steigung ist durch die angelegte Gerade dargestellt.

Der Vergleich der Daten erfolgte anhand der Veränderung der absoluten Fluoreszenzeinheiten

über eine Minute (ΔAFU pro Minute). Das Steigungsdreieck für die Berechnung der

Fluoreszenzänderung wurde dabei so angelegt, daß die Steigung vom Zeitpunkt T1 des

Beginns des signifikanten Fluoreszenzabfalls nach Umschalten zur nächsten Perfusionslösung

über die folgenden 60 Sekunden bis zum Zeitpunkt T2 (= T1 + 60 s) gelegt wurde.

2.6 Auswertung und Statistik

Bei allen Experimenten wurde die digitale Bildsoftware MetaFluor 5.0 der Universal Imaging

Corp. in Lizenz für das Physiologische Institut der Universität Yale benutzt. Die

Tabellenkalkulation und Grafiken wurden mit den Programmen EXCEL und GraphPad Prism

4.0 erstellt. Alle Werte sind als arithmetisches Mittel (Mean) ± dem Standardfehler des

Mittelwertes (Standard error of the mean, SEM) wiedergegeben. Die Signifikanz wurde

anhand des ungepaarten Student-t-Tests überprüft. Nur Werte mit p<0.05 wurden als

signifikant betrachtet. Die Gleichheit der Varianzen und die Normalität der Stichproben

wurden dabei vorausgesetzt.

27 Ergebnisse

3 Ergebnisse

3.1 Der H+-Export aus der Belegzelle unter Histaminstimulation

Der Belegzelle stehen grundsätzlich zwei Mechanismen zur Verfügung, um Protonen von

intra- nach extrazellulär zu schaffen. Es handelt sich basolateral um den Natrium-Protonen-

Austauscher (NHE) und apikal um die Protonenpumpe, die beide elektroneutral arbeiten. Um

die Funktion dieser beiden Proteine zu untersuchen, wurde die Messung des intrazellulären

pH-Wertes mit BCECF durchgeführt, und anhand einer Eichkurve wurden die

Fluoreszenzdaten in zytosolische pH-Werte (pHi) umgerechnet. Das gesamte Experiment fand

unter Histaminstimulation der Säuresekretion statt. Nach der erfolgten Ansäuerung durch den

Ammoniumpuls erholte sich der pHi-Wert in Gegenwart von Na+- und Cl--Ionen schnell mit

einer Rate von 0.259 ± 0.011 ∆pHi/min (n = 14). Diese Rate stellt eine Kombination von

NHE- und Protonenpumpenaktivität dar. Durch den NHE-Hemmstoff Amilorid (1mM)

verringerte sich diese Rate auf 0.117 ± 0.006 ∆pHi/min (n = 31). Um die H+/K+-ATPase-

abhängige H+-Sekretion zu erfassen, kam zusätzlich der Protonenpumpeninhibitor AZD0865

(10μM) zur Anwendung. Unter seinem Einfluß verringerte sich die Alkalisierung in

Gegenwart von 1mM Amilorid auf 0.082 ± 0.005 ∆pHi/min (n = 26). Da die

Protonensekretion luminal im Prinzip als HCl erfolgt, wurde untersucht, ob die Cl--Aufnahme

über das NKCC1-Protein limitierend dafür ist. In Gegenwart von 1mM Amilorid bewirkte die

Zugabe des NKCC-Hemmers Bumetanid in einer Konzentration von 100μM keine

signifikante Reduktion der Alkalisierungsrate. Sie war mit 0.109 ± 0.004 ∆pHi/min (n = 23)

nicht unterschiedlich von der Rate unter Amilorid. Abbildung 12 veranschaulicht den

Versuchsablauf und zeigt diese Ergebnisse in der Zusammenfassung.

28 Ergebnisse

6,5

6,7

6,9

7,1

7,3

7,5

7,7

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Zeit (s)

pHi

+Na+

0Na+ + NH4Cl0Na+

100µM Histamin100µM Histamin + 1mM Amilorid100µM Histamin + 1mM Amil + 100µM BUM100µM Histamin + 1mM Amil + 10µM AZD

A

100µM Histamin

Inhibitoren

6,5

6,7

6,9

7,1

7,3

7,5

7,7

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Zeit (s)

pHi

+Na+

0Na+ + NH4Cl0Na+

+Na+

0Na+ + NH4Cl0Na+



A

100µM Histamin

Inhibitoren

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

ΔpH

i/min

100µM Histamin

100µM Histamin + 1mM Amilorid100µM Histamin + 1mM Amilorid + 10µM AZD0865

100µM Histamin + 1mM Amilorid + 100µM Bumetanid

n = 14 n = 31 n = 26 n = 23

B

$**

*

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

ΔpH

i/min

100µM Histamin

100µM Histamin + 1mM Amilorid100µM Histamin + 1mM Amilorid + 10µM AZD0865

100µM Histamin + 1mM Amilorid + 100µM Bumetanid

n = 14 n = 31 n = 26 n = 23

B

$**

*

Abbildung 12: Na+- und Cl--abhängige Alkalisierung. A) Übereinanderprojektion von Originalaufzeichnungen anhand von beispielhaften Einzelmessungen. Der Abschnitt von 0-520s ist nur für ein Experiment dargestellt. Die Kurven der weiteren Experimente sind nahezu deckungsgleich und deshalb zur Übersichtlichkeit ausgeblendet. B) Zusammenfassung der Ergebnisse: Die hohe Alkalisierungsrate unter Histaminstimulation verringert sich unter NHE-Inhibition mit Amilorid sehr deutlich. Wird zusätzlich die Protonenpumpe mit AZD0865 gehemmt, verringert sich die Rate noch weiter, im Gegensatz zum Einsatz des NKCC-Hemmstoffes Bumetanid, der keinen Einfluß nimmt (* p<0.05 vs Histamin; $ p<0.05 vs Histamin + Amilorid).

Der Protonenexport unter Histaminstimulation hat also mindestens zwei Komponenten. Eine

Komponente ist der mit Amilorid hemmbare Na+/H+-Austausch, die zweite Komponente die

durch AZD0865 hemmbare H+/K+-ATPase. Der Cl--Import durch NKCC1 ist für die

Protonensekretion durch die Protonenpumpe offensichtlich nicht notwendig.

29 Ergebnisse

3.2 Untersuchung des AZD0865-hemmbaren Anteils des H+-Exportes der Belegzelle

In den folgenden Experimenten zur weiteren Untersuchung des Protonenexportes durch die

H+/K+-ATPase-Aktivität wurde der Na+/H+-Transport durch den Gebrauch einer Na+-freien

Lösung gehemmt. Der Protonenausstoß über die Protonenpumpe war stark durch Histamin

stimulierbar. Unter Kontrollbedingungen ohne Histaminstimulation ergab sich eine

Alkalisierungsrate von 0.011 ± 0.002 ∆pHi/min (n = 29 Zellen). Nach Stimulation mit 100

µM Histamin betrug die Rate 0.059 ± 0.006 ∆pHi/min (n = 30 Zellen). Dieser zusätzliche

Protonenausstoß war mit dem spezifischen Protonenpumpeninhibitor AZD0865 vollständig

hemmbar und führte zu einer Reduktion der Rate auf 0.013 ± 0.003 ΔpHi/min (n = 22 Zellen).

Dann wurde die Abhängigkeit der Protonensekretion (luminale HCl-Sekretion) von den

beiden basolateralen Cl--Aufnahmesystemen, den Cl-/HCO3--Austauschern AE2 und

SLC26A7, untersucht. Während auf der einen Seite AE2 schon bei sehr geringen

Konzentrationen wie 10μM des Cl-/HCO3--Austauscher-Hemmstoffes DIDS inhibiert wird

(IC50 = 3,2µM), wird das SLC26A7-Protein erst bei höheren DIDS-Konzentrationen (IC50 =

126μM) gehemmt. Die Zugabe von 10μM DIDS hatte keinen merklichen Einfluß auf die

Alkalisierungsrate (0.057 ± 0.005 ∆pHi/min; n = 58 Zellen). Dagegen wurde die stimulierte

Protonensekretion durch 250μM DIDS fast völlig gehemmt (0.016 ± 0.002 ∆pHi/min; n = 70

Zellen). Auch in Anwesenheit von 100μM NPPB war so gut wie keine Alkalisierung meßbar

(0.008 ± 0.004 ∆pHi/min; n = 48 Zellen). NPPB wurde gewählt, da wir in zusätzlichen

Versuchen NPPB als Inhibitor von SLC26A7 nachweisen konnten. Die Ergebnisse sind in

Abbildung 13 zusammenfassend dargestellt.

30 Ergebnisse

6.5

6.66.76.86.9

77.17.27.37.4

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Zeit (s)

pHi

7.5

+Na+

0Na+ + NH4Cl0Na+

100µM Histamin100µM Histamin + 10µM DIDS100µM Histamin + 250µM DIDS100µM Histamin + 100µM NPPB

A

6.5

6.66.76.86.9

77.17.27.37.4

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Zeit (s)

pHi

7.5

+Na+

0Na+ + NH4Cl0Na+



A

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

ΔpH

i/min

Kontrolle100µM Histamin100µM Histamin + 10µM AZD100µM Histamin + 10µM DIDS100µM Histamin + 250µM DIDS100µM Histamin + 100µM NPPB

n = 29 n = 30 n = 22 n = 58 n = 70 n = 48

B

**

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

ΔpH

i/min

Kontrolle100µM Histamin100µM Histamin + 10µM AZD100µM Histamin + 10µM DIDS100µM Histamin + 250µM DIDS100µM Histamin + 100µM NPPB

n = 29 n = 30 n = 22 n = 58 n = 70 n = 48

B

**

Abbildung 13: Na+-unabhängige, Cl--abhängige Erholung des pHi. A) Beispielhafte Darstellung einiger Einzelmessungen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde der Abschnitt 0 - 400s nur für eines der Experimente dargestellt. B) Zusammenfassung der Ergebnisse: Nach Ansäuerung ist die Alkalisierung der Zellen durch Protonenausstoß über die Protonenpumpe auf Stimulation durch Histamin angewiesen und durch AZD0865 hemmbar. Der Cl-/HCO3

--Austauscherblocker DIDS hatte nur in hoher Konzentration von 250 μM, und nicht bei 10μM einen Effekt. NPPB (100µM) hemmte die Alkalisierung so gut wie vollständig (p<0.05 vs Kontrolle).

Die Ergebnisse legen nahe, daß die mit Histamin stimulierte H+-Sekretion durch die H+/K+-

ATPase vom basolateralen Cl--Transport abhängt und daß hierfür ein mit NPPB und hohen

31 Ergebnisse

DIDS-Konzentrationen hemmbarer Transporter (SLC26A7) notwendig ist. Unter den

gewählten funktionellen Bedingungen einer Azidose scheint der DIDS-empfindliche AE2

gehemmt zu sein. Aus diesem Grund wurde die Messung der Aktivität der beiden Cl--

Importsysteme unter den Bedingungen eines normalen, leicht-alkalischen pHi durchgeführt.

3.3 Untersuchung des HCO3--Exportes

Durch die endogene HCO3--Produktion der Belegzelle bei laufendem Protonenexport

(Na+/H+-Austauscher) stellt sich abhängig vom Cl-/HCO3--Austausch ein bestimmter pHi ein.

Die Hemmung des Cl-/HCO3--Austausches durch Pharmaka oder durch Wegnahme von Cl--

Ionen führt zu einer Alkalisierung der Zelle. Die Experimente wurden aus diesem Grund in

Anwesenheit von Na+-Ionen durchgeführt. Nach Histaminstimulation in Anwesenheit von Cl-

-Ionen stellte sich ein pHi von 7.2 ein. Wegnahme von Cl--Ionen führte zu einer

Alkalinisierung der Zelle, die sich nach erneuter Zugabe von Cl--Ionen in Abhängigkeit vom

dann stattfindenden Cl-/HCO3--Austausch wieder normalisierte.

Das geschilderte experimentelle Protokoll wurde in Gegenwart verschiedener DIDS-

Konzentrationen durchgeführt, und zwar von 10μM, 20μM und 150μM, die in allen

Lösungen vorlagen. 10μM stellten eine ausreichend hohe Konzentration zur Hemmung der

AE2-Transporter dar, und mit der gewählten Konzentration von 150μM sollte SLC26A7

gehemmt werden. Die Zugabe von DIDS führte per se zu einer Alkalinisierung der Zellen.

Die anschließende vollständige Hemmung des Cl-/HCO3--Austausches durch Cl--Wegnahme

führte zur maximalen Alkalinisierung, die bei der höchsten DIDS-Konzentration bereits vor

der Cl--Wegnahme erreicht war.

Die Veränderung des intrazellulären pH-Wertes (∆pHi) wurde pro Minute berechnet.

Abbildung 14 faßt die konzentrationsabhängige Wirkung von DIDS zusammen. Während nur

unter Histaminstimulierung ohne DIDS bei Cl--Rückgabe ein Abfall des intrazellulären pH-

Wertes um -0.094 ± 0.029 ∆pHi/min (n = 92 Zellen) erfolgte, verringerten 10μM DIDS diesen

sehr deutlich auf -0.034 ± 0.031 ∆pHi/min (n = 83). 20μM DIDS verringerten diese Rate

nochmals auf -0.027 ± 0.004 ∆pHi/min (n = 29), und unter 150μM DIDS war fast keine

Azidifizierung mehr meßbar: -0.004 ± 0.019 ∆pHi/min (n = 53).

32 Ergebnisse

+Cl-0Cl-

6.9

7

7.1

7.2

7.3

7.4

7.5

7.6

7.7

0 200 400 600 800 1000 1200

Zeit (s)

pHi

100µM Histamin + 150µM DIDS100µM Histamin + 10µM DIDS100µM Histamin

A

+Cl-0Cl-

6.9

7

7.1

7.2

7.3

7.4

7.5

7.6

7.7

0 200 400 600 800 1000 1200

Zeit (s)

pHi

100µM Histamin + 150µM DIDS100µM Histamin + 10µM DIDS100µM Histamin

A

6.5

6.66.76.86.9

77.17.27.37.4

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Zeit (s)

pHi

7.5

+Na+

0Na+ + NH4Cl0Na+


A

6.5

6.66.76.86.9

77.17.27.37.4

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Zeit (s)

pHi

7.5

+Na+

0Na+ + NH4Cl0Na+



A

Abbildung 14: Konzentrationsabhängige Hemmung der Cl-/HCO3

--Austauscher-Aktivität durch DIDS bei neutralem pH-Wert. A) Einzelmessung zur Veranschaulichung übereinanderprojeziert. Der initiale pH-Wert der einzelnen Messungen unterscheidet sich deutlich. Bei einer DIDS-Konzentration von 150µM sind die Zellen schon zu Beginn der Messung maximal alkalisiert. B) Zusammenfassung der Ergebnisse: Rückgabe von Cl--Ionen führt unter Histaminstimulierung zu einem Abfall des intrazellulären pH-Wertes. Dieser pH-Abfall ist konzentrationsabhängig mit DIDS hemmbar (* p<0.05 vs Histamin; $ p<0.05 vs Histamin + 20µM DIDS).

33 Ergebnisse

Die Messungen legen nahe, daß unter den gewählten Bedingungen einer funktionellen

Alkalose sowohl AE2 als auch SLC26A7 aktiv sind. AE2 scheint dabei einen prozentual

größeren Anteil zu haben.

Aus den bisherigen Messungen ergab sich die Hypothese, daß der Cl-/HCO3--Austausch

während der Protonensekretion, abhängig vom pHi, von den beiden Transportern AE2 und

SLC26A7 in unterschiedlichen Anteilen bewerkstelligt wird. Bei funktioneller Alkalose

wesentlich durch AE2, bei funktioneller Azidose durch SLC26A7. Diese Hypothese wurde

mit Messungen der intrazellulären Cl--Konzentration als Spiegelbild des Cl--Importes

überprüft.

3.4 Untersuchung der intrazellulären Cl--Konzentration

Um die Rolle der einzelnen Chloridtransporter an der basolateralen Membran beurteilen zu

können, wurde die Cl--Konzentration der Belegzellen mit Hilfe des Cl--empfindlichen

Fluoreszenzfarbstoffes MQAE untersucht. Aufgrund des „quenching dye“-Charakters von

MQAE bewirkte eine vermehrte Cl--Aufnahme in die Zelle eine abnehmende

Fluoreszenzintensität (AFU). Die initiale Änderung der Fluoreszenz ist dabei proportional

zum Cl--Transport über die Zellmembran.

Die Untersuchung wurde zunächst in Abwesenheit von Na+- und Cl--Ionen gestartet. Unter

diesen Bedingungen nimmt die Zelle aufgrund der fehlenden bzw. inversen Aktivität des

Na+/H+-Austauschers wiederum eine azidotische Ausgangslage ein. Zusätzlich wurde

SLC26A7 durch NPPB (100µM) gehemmt. Alleinige Zugabe von Cl--Ionen unter diesen

Bedingungen hatte unabhängig von der Histaminstimulation praktisch keinen Abfall der

Fluoreszenzintensität bzw. somit keinen Anstieg von [Cli] zur Folge (0Na Kontrolle: -3.33 ±

0.33 ∆AFU/min (n = 31) vs 0Na + 100µM Histamin: -3.95 ± 0.55 ∆AFU/min (n = 55)). Es

war also keine AE2-Aktivität meßbar.

Gleichzeitige Zugabe von Na+- und Cl--Ionen führte abhängig von der Histaminstimulation

der Drüse zu einem deutlichen [Cli]-Anstieg der Zelle. Gegenüber der Änderungsrate von

-2.74 ± 0.32 ∆AFU/min (n = 31) unter nichtstimulierten Bedingungen resultierte die

Histaminstimulierung in einer Rate von -14.06 ± 0.47 ∆AFU/min (n = 52). Dieser [Cli]-

Anstieg war teilweise durch Azetazolamid hemmbar, hier lag die Fluoreszenzänderung bei -

8.31 ± 0.38 ∆AFU/min (n = 129). Die Ergebnisse sind in Abbildung 15 zusammenfassend

34 Ergebnisse

dargestellt. Die Zugabe von Na+-Ionen ermöglichte so die Cl--Aufnahme über NKCC1,

darüberhinaus aber auch die Realkalisierung der Zellen und damit die Aktivität von AE2.

0

10

20

30

40

50

60

200 400 600 800 1000

Zeit (s)

AFU

+Na+ Kontrolle0Na+

+Na+: 100µM Histamin + 100µM Azetazolamid+Na+: 100µM Histamin

A

0Na+ 0Cl-+Cl-

100µM NPPB

0

10

20

30

40

50

60

200 400 600 800 1000

Zeit (s)

AFU

+Na+ Kontrolle0Na+


+Na+ Kontrolle0Na+


A

0Na+ 0Cl-+Cl-

100µM NPPB

-15

-10

-5

0

+Na+ + 100µM Histamin

+Na+ + 100µM Histamin + 100µM Azetazolamid

+Na+ Kontrolle

0Na+ + 100µM Histamin

0Na+ + 100µM Histamin + 100µM Azetazolamid

0Na+ Kontrolle

ΔA

FU/m

in

n = 31 n = 52 n = 129 n = 31

n = 31

n = 55 n = 110

B

*

*$

-15

-10

-5

0



+Na+ Kontrolle



0Na+ Kontrolle



+Na+ Kontrolle



0Na+ Kontrolle

ΔA

FU/m

in

n = 31 n = 52 n = 129 n = 31

n = 31

n = 55 n = 110

B

*

*$

Abbildung 15: Zusammenfassung der Cl--Aufnahmemessungen. A) Einige der beispielhaften Einzelmessungen sind zur Veranschaulichung übereinanderprojeziert. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde der Abschnitt 0 - 600s nur für eines der Experimente dargestellt. B) Zusammenfassung der Ergebnisse: In Gegenwart von Na+-Ionen in der Perfusionslösung ist die Fluoreszenzänderung durch Histamin (100 µM) stimulierbar. Der Karboanhydrasehemmer Azetazolamid führt zu einer signifikanten Verringerung, d.h. ca.

35 Ergebnisse

40% der Na+-abhängigen Fluoreszenzänderung hängen von der Verfügbarkeit von endogenem HCO3

- ab. Unter Na+-freien Bedingungen hat die Stimulation durch Histamin keinen signifikanten Einfluß auf die Fluoreszenzintensität (* p<0.05 vs +Na Kontrolle; $ p<0.05 vs +Na + Histamin). Nach den durchgeführten Messungen der intrazellulären Cl--Konzentration lassen sich zwei

histaminstimulierbare Cl--Aufnahmemechanismen ableiten. Zum einen ein Na+-abhängiger

Transportweg, der durch Azetazolamid beeinflußbar ist. Und zum anderen ein Na+-

abhängiger Mechanismus, der nicht durch den Gehalt an intrazellulärem, endogenem HCO3-

beeinflußt wird. Beide Aufnahmemechanismen werden unter Histaminstimulation in ihrer

Aktivität verstärkt und können in Abwesenheit von Na+-Ionen nicht ablaufen. Dies läßt sich

darauf zurückführen, daß AE2 aufgrund der Absenkung des intrazellulären pH-Wertes durch

den Einsatz der Na+-freien Lösung inaktiviert wird, das NKCC1-Protein ohne zur Verfügung

stehende Na+-Ionen keine Cl--Ionen nach intrazellulär transportieren kann und SLC26A7 als

weiterer potenzieller Aufnahmemechanismus durch das NPPB gehemmt ist.

36 Diskussion

4 Diskussion

4.1 Die Technik und Vorgehensweise in den Experimenten

4.1.1 Das Präparat und die Meßanordnung

Bei der Vorbereitung und Durchführung der Experimente wurde bei jedem Schritt versucht,

zu standardisieren und Störfaktoren auf die Ergebnisse zu vermeiden. So wurden als

Versuchstiere nur männliche Ratten mit einem Gewicht zwischen 150 - 250 g benutzt. Um

von einem einheitlichen Zustand der stimulierten Säuresekretion ausgehen zu können,

bekamen die Tiere in den letzten 12 h vor dem Experiment kein Futter mehr.

Für die vorliegende Arbeit wurde die Präparation der Magendrüsen per Handdissektion

gewählt. Die enzymatische Auftrennung zur Isolierung einzelner Drüsen stellt eine alternative

Methode zur Gewebegewinnung dar (42). Obwohl technisch anspruchsvoller, ist bei der

manuellen Präparation die Intaktheit und Unversehrtheit der Drüse besser erhalten, und

deswegen wurde diesem Verfahren hier der Vorrang gegeben. Zur Untersuchung wurde nur

Gewebe benutzt, welches nicht älter als 4 h nach Entnahme des Rattenmagens war.

Zellkulturen kamen für die Untersuchung nicht in Frage, weil besonderer Wert auf eine so

weit wie möglich erhaltene Funktion der gesamten Drüse gelegt wurde. Bei der Arbeit mit

Zellkulturen fehlt dieser physiologische Verband offensichtlich. Dies resultiert auch in

unterschiedlichem Verhalten in Gegenwart oder Abwesenheit von physiologischen

Wachstumsfaktoren und kann sich in unterschiedlichen Versuchsergebnissen äußern (1; 9).

Um den Bedingungen in-vivo so gerecht wie möglich zu werden, wurden die Versuche unter

physiologischen Temperaturen durchgeführt, was über die Beheizung der Versuchsanlage wie

beschrieben ermöglicht wurde. Alle benutzten Lösungen hatten zudem einen pH-Wert von

7.4, der regelmäßig kontrolliert wurde. Um eine Zersetzung der Lösungen zu verhindern,

wurden diese bei 4°C aufbewahrt und in kurzen zeitlichen Abständen frisch angesetzt.

Lichtempfindliche Substanzen wurden nur unter Lichtschutz verwendet und aufbewahrt.

Die Versuche im Rahmen dieser Arbeit wurden sämtlich unter HCO3--freien Bedingungen,

d.h. in HCO3--freien Lösungen, durchgeführt und sind daher unabhängig vom extrazellulären

Vorhandensein von HCO3-. Jeglicher Einfluß von HCO3

- könnte demzufolge nur durch

endogen produzierte HCO3--Ionen auftreten. Dieser Einfluß läßt sich allerdings nur

schwerlich quantifizieren. Um diese Vorgänge näher zu untersuchen, würden sich in Zukunft

Versuche mit HCO3--angereicherten Lösungen anbieten. Daß sich dadurch durchaus

37 Diskussion

Änderungen der Transporteigenschaften einiger Proteine ergeben können, wurde in einer

Studie nachgewiesen (51).

Die Fluoreszenzmessungen zeichnen sich durch hohe Vibrations- und Lichtempfindlichkeit

aus. Deswegen wurde zum einen ein schwingungsarmer Tisch benutzt. Außerdem fanden die

Messungen in abgedunkelten Räumen und unter Verwendung eines Lichtkäfiges statt.

4.1.2 Die pHi-Messung mit BCECF

Der Gebrauch des pH-empfindlichen Farbstoffes BCECF ist für Messungen des

intrazellulären pH-Wertes weitreichend etabliert. Gleiches gilt für die Nigericin-

Kalibrierungsmethode, mit der die gemessenen Fluoreszenzintensitäten in absolute pH-Werte

umgerechnet wurden (7). In vielen Studien werden die pH-Wert-Veränderungen, die mit

BCECF gemessen werden, als Maß zur Bestimmung der Säuresekretion der Belegzelle

verwendet. Der Vorteil zur C14-Aminopyrin-Aufnahme-Technik, einem anderen Verfahren

zur Messung der Magensäuresekretion (18), liegt in der Darstellung in Echtzeit. Dadurch

kann direkt in die laufenden Vorgänge eingegriffen, und es können Manipulationen zum

Beispiel an der Ionenzusammensetzung der Lösungen durchgeführt und sofort beobachtet

werden. Da die beiden gemessenen Fluoreszenzintensitäten (490 nm und 440 nm) nicht nur

von der Farbstoffkonzentration, sondern auch vom Zellvolumen und -durchmesser abhängen,

wird über die Bildung des Quotienten (ratio 490/440) die Unabhängigkeit von diesen

Faktoren erreicht.

Die Veränderung des intrazellulären pH-Wertes kann dabei Ausdruck verschiedener

Vorgänge sein. Zum einen führt der Protonenausstoß über die Protonenpumpe zu einer

Alkalisierung des intrazellulären Milieus. Ebenso spielt allerdings auch die Aktivität der

NHE-Proteine, die ebenfalls Protonen aus der Zelle hinaustransportieren, eine Rolle. Hinzu

kommt die Arbeit der Cl-/HCO3--Austauscher, die über die Verfügbarkeit von Cl--Ionen

manipuliert werden kann. Auch extrazellulär fehlende Cl--Ionen können über die

intrazelluläre Akkumulation von HCO3--Ionen zu einer meßbaren Alkalisierung führen (40).

Die unter Na+-freien Bedingungen betrachtete Realkalisierung der Belegzelle wurde hierbei

als direkter Spiegel des Protonenausstoßes über die Protonenpumpe gewertet, der durch den

Protonenpumpenhemmstoff AZD0865 geblockt werden konnte. Zur gleichen Zeit konnte

gezeigt werden, daß dieser Protonenexport vom basolateralen Austausch von Cl-- und HCO3--

Ionen abhängig ist. Unter der Annahme, daß der luminale Protonenverlust zu einem

38 Diskussion

alkalischeren Zellinneren führt, würde man aus gleichem Grund auch erwarten, daß der

basolaterale Export von HCO3- genau gegensätzlich dazu zu einer Verschiebung des pH-

Wertes hin zu saureren Werten führt. Wenn diese Prozesse sich quantitativ entsprechen

würden, würde man also folglich keinerlei Veränderung in der pHi-Messung beobachten

können. Die beobachteten pHi-Anstiege legen nahe, daß unter diesen Bedingungen entweder

weniger Cl-/HCO3--Transport basolateral als HCl-Sekretion luminal stattfindet, oder die

Stöchiometrie des SLC26A7 auf der Seite von Cl- liegt.

4.1.3 Die [Cli]-Messung mit MQAE

Die Entwicklung Cl--empfindlicher Fluoreszenzfarbstoffe ermöglichte die direkte Darstellung

und Untersuchung von Cl--Ionen in lebenden Zellen. Der in den dargestellten Versuchen

benutzte Fluoreszenzfarbstoff MQAE besitzt dabei unter den erhältlichen Farbstoffen die

wenigsten Einschränkungen und erweist sich als zuverlässige Indikatorsubstanz für

intrazelluläre Cl--Konzentrationen (58). Nachteilig ist in diesem Zusammenhang, daß gewisse

Hemmstoffe während der Cli-Messung aufgrund autofluoreszierender Eigenschaften bei den

für MQAE verwendeten Wellenlängen nicht eingesetzt werden können. Dazu zählen der Cl-

/HCO3--Austauscher-Hemmstoff DIDS und der NKCC-Hemmstoff Bumetanid.

Der Einstrom von Cl--Ionen erzeugt einen Abfall der mit MQAE gemessenen

Fluoreszenzemission, welcher mit der intrazellulären Cl--Ionenkonzentration korreliert,

allerdings geschieht dies nicht in einer einfachen und linearen Beziehung. Aus diesem Grund

können hier keine quantitativen Aussagen über den Cl--Einstrom bzw. -Ausstrom gemacht,

sondern lediglich qualitative Bewertungen durchgeführt werden. Wie zuvor schon in anderen

Arbeiten, bei denen auch Fluoreszenzfarbstoffe mit nur einer einzelnen Exzitations-

/Emissionswellenlänge verwendet wurden, sind die Ergebnisse in relativen Einheiten

dargestellt (17). Infolge unterschiedlicher anfänglicher Farbstoffaufnahme der Zellen, die

trotz immer gleich bleibender Bedingungen wie Inkubationszeit und Temperatur auftrat, kam

es zu geringen Schwankungen der Intensitäten, die nicht korrigiert werden konnten. Das im

Verlauf der Messung auftretende Ausbleichen (Photobleaching), welches sich durch

verringernde Fluoreszenzintensität aufgrund der Zerstörung von Farbstoffmolekülen durch

intensive Bestrahlung ergibt, wurde durch Minimierung der Belichtungszeit so gering wie

möglich gehalten.

39 Diskussion

4.1.4 Zwei funktionelle Zustände: azidotisch und alkalotisch

Die Untersuchungen der Belegzelle fanden unter zwei unterschiedlich gewählten pHi-

Zuständen statt. Durch das Ammoniumpulsverfahren, die Na+-freien Lösungen und auch

durch den Einsatz von Amilorid wurde der pHi-Wert der Zellen abgesenkt, die Messungen

also in einen azidotischen pHi-Bereich (6.5-6.6) verlegt. Im Unterschied dazu wurde der

zweite Funktionszustand im leicht alkalotischen pH-Bereich von 7.2-7.3 betrachtet. Durch

diese Vorgehensweise konnten die einzelnen Transporter differenzierter untersucht werden.

Die Messung der Realkalisierung nach Ansäuerung der Belegzelle stellt hierbei eine etablierte

Methode zur Aktivitätsbestimmung der H+/K+-ATPase dar (26). Anders verhält es sich mit

dem Cl-/HCO3--Austauscher AE2. Dieses Protein wird bei azidotischen Bedingungen

zunehmend inaktiviert (2; 43). Wie bisherige Studien zeigten, verändert sich der zytosolische

pH-Wert von Parietalzellen beim Übergang vom ruhenden zum stimulierten Zustand nur

minimal, und die Zellen werden aufgrund der H+/K+-ATPase-Aktivität etwas alkalischer. Im

Insgesamt hält die balancierte Funktion von H+/K+-ATPase, Cl-/HCO3--Austauschern und

Na+/H+-Austauschern den pHi-Wert der Zelle konstant (40; 41). Möglicherweise trägt auch

eine intrazelluläre Pufferung dazu bei (21).

4.2 Die einzelnen Funktionsproteine

4.2.1 Die H+-Exporter H+/K+-ATPase und Na+/H+-Austauscher

Die Untersuchung des Protonenexportes zeigte unter Histaminstimulation einen überraschend

großen Anteil des Na+/H+-Austauschers neben einem deutlich geringeren Anteil der

Protonenpumpe. Es ist zu hinterfragen, wodurch diese Verteilung zustande kommt. Möglich

wäre eine partielle Inaktivierung der Protonenpumpe aufgrund der experimentellen

Bedingungen z.B. durch das verwendete Ammoniumchlorid. Es fällt zudem auch nach

Inhibition mit Amilorid und AZD0865 ein relativ großer Restbetrag bei der Alkalisierung auf.

Dieser könnte durch die unvollständige Hemmung der verschiedenen Isoformen der NHE-

Familie durch das Amilorid bedingt sein. In der Belegzelle wurden die Isoformen NHE1-4

nachgewiesen, und diese Isoformen weisen jeweils unterschiedliche pharmakologische

Charakteristiken auf (6; 28; 48). Zudem variieren die Angaben in der Literatur über die

nötigen Amiloridkonzentrationen (IC50) teilweise erheblich (10; 28; 60).

40 Diskussion

4.2.2 Der Cl-/HCO3--Austauscher AE2

Unsere Messungen des pHi und der [Cli] zeigten AE2 als einen durch geringe DIDS-

Konzentration (10 µM) hemmbaren Cl-/HCO3--Austauscher, der lediglich unter alkalotischen

Bedingungen seine Funktion erfüllen konnte. Bei der Beobachtung des HCO3--Exportes unter

alkalotischem pHi nahm AE2 im Vergleich zu SLC26A7 prozentual einen etwas größeren

Anteil ein. Bei alkalotischem pHi konnte unter gleichzeitiger Hemmung von SLC26A7 eine

Cl--Aufnahme in die Belegzelle anteilig über AE2 und NKCC1 gezeigt werden, während

unter azidotischen Bedingungen der Zelle, die durch die fehlenden Na+-Ionen erreicht

wurden, keine Cl--Aufnahme mehr über AE2 erfolgen konnte.

Die [Cli]-Messungen und die pHi-Messungen zeigen, daß die AE2-Aktivität stark vom

vorliegenden intrazellulären pH-Wert abhängig ist. Diese Abhängigkeit von einem

ausreichend hohen zytosolischen pH-Wert wurde auch in anderen Studien gefunden (2; 43).

In vorangegangenen Studien wurde das AE2-Protein als der vorherrschende Cl--

Aufnahmemechanismus bei der Magensäuresekretion vermutet (5; 23; 42; 47; 51). Hierbei

fallen aber die hohen Konzentrationen von DIDS auf, die dabei zur Inhibition von AE2

benutzt wurden (38). Diese Konzentrationen führen eben auch zu einer gleichzeitigen

Hemmung des SLC26A7-Proteins. Studien an AE2-knock-out Mäusen berichten von sehr

stark eingeschränkter Säuresekretion bei Verlust dieses Transportproteins (15). Allerdings

war die Morphologie des Magengewebes äußerst stark verändert, und die Tiere zeigten bereits

in der Säugezeit eine sehr hohe Sterblichkeit, was eine Interpretation der Daten schwierig

macht.

Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnisse deuten darauf hin, daß es einen

alternativen Weg für Cl--Ionen über einen Austauschmechanismus mit HCO3- in die Zelle

hinein gibt, der Na+-unabhängig ist, bei intrazellulär angesäuertem Milieu funktioniert und

durch höhere Dosierungen von DIDS in seiner Funktion gehemmt wird.

4.2.3 Der Cl-/HCO3--Austauscher SLC26A7

Das SLC26A7-Protein wurde erst vor kurzem identifiziert. Mit dem Einsatz monoklonaler

Antikörper wurde es bisher ausschließlich in Magenbelegzellen sowie in den Epithelien der

Sammelrohre des Nierenmarks lokalisiert (43; 61). Die hohe Expression dieses Proteins an

der basolateralen Zellseite läßt darauf schließen, daß es eine ganz spezielle Funktion in diesen

41 Diskussion

säuresezernierenden Zellen haben muß. SLC26A7 kann dabei sowohl bei azidotischen als

auch alkalotischen pHi-Werten arbeiten, wie bereits andere Studien zeigten (43). Die

eingeschränkte Funktion von AE2 bei funktionell azidotischem pHi würde SLC26A7 damit

die Hauptrolle für die Cl--Aufnahme bei einer solchen Stoffwechsellage zuspielen.

Für die Untersuchung standen uns zwei experimentelle Werkzeuge zur Verfügung, zum einen

DIDS und zum anderen NPPB. In einer Arbeit an SLC26A7-überexprimierenden Oozyten

führten DIDS-Konzentrationen von über 100 µM zu einer Verkleinerung des Cl--Leitwertes

von mindestens 50% (25). Als ein weiterer Schritt wurde durch Einsatz von NPPB der Cl--

Leitwert über die Membran in den Oozyten verringert (in freundlicher Zusammenarbeit mit

Prof. Muallem, Texas), wobei 100 µM NPPB zu einer ungefähr 60%igen Hemmung führten.

Unsere Ergebnisse zeigen, daß die mit Histamin stimulierte Säuresekretion durch die

Protonenpumpe erst bei einer Erhöhung der DIDS-Konzentration auf 250 µM, und damit

einer gleichzeitigen Hemmung von SLC26A7, verhindert wurde. Eine Alkalisierung der Zelle

war dann nicht beobachtbar. Die in der Literatur angegebenen und verwendeten DIDS-

Konzentrationen zur Hemmung von SLC26A7 variieren zwischen 100 und 500 µM (5; 25;

43; 44). Ebenso verhinderte erst eine hohe DIDS-Konzentration den HCO3--Export

vollständig. Dieser Transporter benötigt somit bedeutend höhere Konzentration an DIDS als

AE2, was im Einklang mit früheren Beobachtungen steht, die mit Gebrauch von 200 µM

DIDS einen sehr ähnlichen Hemmeffekt auf die Zellalkalisierung in stimulierten

Kaninchenbelegzellen erreichten, wie er auch in der vorliegenden Arbeit gezeigt wird (41).

In den intrazellulären pH-Messungen führte eine NPPB-Konzentration von 100 µM zu einer

fast kompletten Hemmung der Alkalisierung, ein Protonenausstoß über die H+/K+-ATPase

fand nach Hemmung von SLC26A7 so gut wie nicht mehr statt.

Dieser Unterschied zwischen den Oozytenmessungen und der Wirkung an den isolierten

Magendrüsen könnte damit zusammenhängen, daß ein Teil des Wirkstoffes vom Dotter

„abgepuffert“ wird. Hinzu kommt der Umstand, daß die Oozytenmessungen bei

Raumtemperatur und nicht bei 37°C durchgeführt werden. Denkbar wäre außerdem ein

veränderter Aufbau der exprimierten Proteine in den Oozyten, z.B. durch das Fehlen

funktionell wichtiger Untereinheiten.

Als prinzipiell problematisch stellen sich beim Einsatz von pharmakologischen Hemmstoffen

immer die Aspekte der Spezifität und der unerwünschten Nebenwirkungen dar, insbesondere

wenn hohe Konzentrationen zur Anwendung kommen. Bei den in dieser Arbeit verwendeten

Inhibitoren (NPPB und DIDS) für das SLC26A7-Protein handelt es sich nicht um

hochspezifische Hemmstoffe. Unter diesen Gesichtspunkten ist von besonderer Bedeutung,

42 Diskussion

inwieweit der luminale Cl--Kanal (ClC-2) in den Belegzellen gerade von NPPB beeinflußt

wird. In der Literatur wird dies nicht übereinstimmend beurteilt (24; 34). Zudem ist im

Zusammenhang mit der Anwendung von NPPB die mitochondriale Entkopplung beschrieben

(30). Eine spezifische Einflußnahme auf SLC26A7 wäre deswegen wünschenswert.

Die genaue Arbeitsweise dieses Transporters bleibt bis heute in der Literatur umstritten. Nach

einer Studie handelt es sich bei SLC26A7 um einen Cl-/HCO3--Austauscher (43). Im

Gegensatz dazu stehen Versuche einer anderen Forschungsgruppe, bei denen nur eine sehr

geringe Permeabilität des Proteins für HCO3- gefunden wurde. SLC26A7 wird daher von

ihnen als ein vom intrazellulären pH-Wert gesteuerter Cl--Kanal diskutiert (25). In diesem

Zusammenhang könnte dies eine Erklärung für die Beobachtung der deutlichen

Realkalisierung der Belegzelle bei H+/K+-ATPase-Aktivität sein, da dann das anfallende

HCO3- die Zelle nicht verlassen würde. In der intakten Belegzelle stehen dem Cl--Einstrom

über einen Cl--Kanal allerdings die elektrischen Triebkräfte aufgrund des negativen

Membranpotentiales entgegen. Unter den von uns gewählten Bedingungen präsentiert sich

SLC26A7 als Cl-/HCO3--Austauscher, wie die Untersuchungen zum HCO3

--Export zeigen.

4.2.4 Der Na+-2Cl--K+-Cotransporter NKCC1

Wir konnten keine Beteiligung des NKCC1-Proteins an der Histamin-stimulierten

Säuresekretion unter azidotischen Bedingungen nachweisen. Auf die Alkalisierungsrate

wurde kein Einfluß des NKCC1-Transporters gefunden. Diese Ergebnisse bestätigen

Beobachtungen in NKCC1-knock-out Mäusen. In diesen Mutanten konnte in sogenannten

„whole stomach measurements“ keine signifikante Einschränkung bei der Fähigkeit,

Magensäure zu produzieren, festgestellt werden (13).

Unter alkalotischen Bedingungen konnte gezeigt werden, daß es in den Belegzellen einen

Na+-abhängigen Mechanismus für die Cl--Aufnahme gibt, der nicht von HCO3- beeinflußt

wird. Dieser entspricht dem NKCC1-Protein. Diese Aufnahme reagiert ebenfalls sensibel auf

eine Stimulation durch Histamin. Erschwert wird die genaue Interpretation der Cl--Aufnahme

dadurch, daß alle drei Aufnahmewege auf die Bereitstellung von Na+ angewiesen sind,

allerdings aus verschiedenen Gründen. NKCC1 braucht als Cotransporter offensichtlich Na+,

für AE2 ist die Verschiebung des pHi-Wertes zu saureren Werten, und für SLC26A7 die

Verringerung des HCO3- aufgrund der Umwandlung in CO2 entscheidend.

43 Diskussion

Eine Studie an Magengewebe von Mäusen machte das NKCC1-Protein hauptsächlich für den

elektroneutralen Einwärtstransport von Na+, K+ und Cl- an Belegzellen verantwortlich, der

allerdings nicht mit der Säuresekretion assoziiert ist, sondern lediglich für die

Flüssigkeitsabgabe in das Drüsenlumen zuständig ist (38). Dies steht im Widerspruch zu

älteren Studien an Hamstern bzw. Amphibien, die unter Behandlung mit Furosemid bzw.

Bumetanid von einem hemmenden Einfluß auf die Magensäuresekretion in

Mukosapräparationen berichteten (5; 53). Unsere Ergebnisse in den [Cli]-Messungen

bestätigen demnach die Auffassung, wonach ein beträchtlicher Einstrom von Cl--Ionen über

das NKCC1-Protein stattfindet. Dieser Einstrom ist jedoch nicht mit der Säuresekretion über

die luminale Membran der Belegzelle verknüpft. Einige Autoren sprechen deswegen von zwei

unterschiedlichen Sekretionsarten für Cl--Ionen, die luminal an der Belegzelle stattfinden:

eine ist an die Säuresekretion gekoppelt und die andere nichtsäuregebunden (38). Denkbar

wäre durchaus, daß NKCC1 die Cl-- und K+-Ionen für die Zelle bereitstellt, die dann luminal

über die entsprechenden Kanäle ins Lumen abgegeben werden, und daß die Na+-Ionen

basolateral über die Na+/K+-ATPase wieder die Zelle verlassen können. Allerdings bliebe in

diesem Modell die Frage nach der Entsorgung des entstehenden HCO3- offen. Die Zelle

würde so sehr schnell intrazellulär alkalisieren und so die Protonenpumpe zum Stillstand

bringen.

4.3 Mögliche medikamentöse Therapieansätze und weitere Forschung als Ausblick

Aus den Ergebnissen dieser Arbeit lassen sich in der Zukunft möglicherweise alternative

medikamentöse Behandlungsformen der Magensäureüberproduktion entwickeln. Dies könnte

im besonderen für den kleinen Anteil an Patienten, bei denen sich die Therapie mit

Protonenpumpeninhibitoren als nicht effektiv erweist, eine große Erleichterung bedeuten (4;

39). Gerade das SLC26A7-Protein würde sich möglicherweise als ein attraktives Ziel für neue

Therapieansätze darstellen, da es aufgrund der bisher bekannten Lokalisation nur in zwei

Organen (Magen und Niere) vorkommt. Somit wäre davon auszugehen, daß ähnlich wie es

bei der Protonenpumpe der Fall ist, die Nebenwirkungen bei einem medikamentösen Eingriff

beschränkt sind.

Von großem Interesse dürften sicherlich auch Experimente mit humanem Magengewebe aus

Resektionspräparaten sein. Gerade zwischen verschiedenen Spezies könnten die Unterschiede

44 Diskussion

in ein und demselben Protein nur in der Verschiedenheit einer Untereinheit bestehen, was

allerdings funktionell und pharmakologisch zu bedeutenderen Änderungen führen kann (2;

16). Dies ist besonders unter dem Gesichtspunkt zu sehen, daß mittlerweile von vielen

Transportproteinen der Aufbau in zahlreichen Untereinheiten entdeckt und beschrieben

wurde.

Letztlich konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend geklärt werden, welche

Stöchiometrie zwischen dem HCl-Ausstoß an der luminalen Seite der Parietalzelle und dem

Cl-/HCO3--Austausch basolateral besteht. Außerdem bleibt die Frage für künftige

Untersuchungen spannend, welche Bedeutung diese spezielle Ausstattung der Parietalzelle

mit zwei unterschiedlichen Cl-/HCO3--Austauschern, die verschiedene pHi-Bedingungen

abdecken, in Verbindung mit der Magensäuresekretion hat.

45 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Pathologische Hypersekretion von Magensäure ist ursächlich an zahlreichen Erkrankungen

des oberen Magen-Darm-Traktes beteiligt. Die medikamentöse Hemmung der Säuresekretion

ist heute die wirksamste Therapiemaßnahme. Aus diesem Grund kommt den zellulären

Mechanismen bei der Säuresekretion und ihrer Kenntnis große Bedeutung zu.

Der Protonenausstoß über die luminale Membran der Belegzelle läuft hierbei über die

Protonenpumpe (H+/K+-ATPase) ab. Funktionell ist die Aktivität dieses Proteins an

benachbarte K+- und Cl--Kanäle gekoppelt und von einer leichten Azidose der Zelle abhängig.

An der basolateralen Membran verfügen die Belegzellen über drei mögliche Cl--

Einstromwege: die beiden Cl-/HCO3--Austauscher AE2 und SLC26A7 sowie den Na+-2Cl--

K+-Cotransporter NKCC1. Zielsetzung dieser Arbeit war die Untersuchung der funktionellen

Beteiligung dieser verschiedenen Cl--Transporter an der Cl--Aufnahme während der

stimulierten Säuresekretion. Zu diesem Zweck wurden mikrofluorimetrische Messungen des

intrazellulären pH-Wertes (pHi) mit dem Farbstoff BCECF und der intrazellulären Cl--

Ionenkonzentration (Cl-i) mit dem Farbstoff MQAE an handisolierten Rattenmagendrüsen

durchgeführt.

Mit den Messungen des pHi im azidotischen Bereich konnte gezeigt werden, daß die

Belegzelle Protonen zum einen über Na+/H+-Austauscher und zum anderen über die

Protonenpumpe exportiert. Dieser Protonenexport war unabhängig von der Funktion des

NKCC1-Proteins. Der Protonenausstoß über die H+/K+-ATPase konnte durch Histamin

stimuliert und über die Hemmstoffe DIDS und NPPB blockiert werden. Beide Wirkstoffe

greifen mit einem spezifischen Profil an den Cl--Transportwegen der Belegzelle an. DIDS

zeigte hierbei allerdings erst in hoher Konzentration, wie sie für SCL26A7 notwendig ist, eine

Wirkung, und nicht bei einer niedrigen, für AE2 charakteristischen Konzentration. Bei pHi-

Messungen im alkalotischen pHi-Bereich unter Histaminstimulation verschoben sich die

Anteile der beiden Cl-/HCO3--Austauscher. Die HCO3

--gekoppelte Cl--Aufnahme erfolgte zu

rund 60% durch AE2-Aktivität und zu 40% über das SLC26A7-Protein. Die Cl-i-Messungen

zeigten eine deutlich durch Histamin stimulierbare Erhöhung der intrazellulären Cl--

Konzentration nur in Gegenwart von Na+-Ionen. Zu rund 50% kam dieser Cl--Einstrom über

AE2 zustande. Die Na+-Abhängigkeit hierbei ergab sich durch die für den Cl-/HCO3--

Austausch notwendige parallele Aktivität des Na+/H+-Austauschers. Der weitere Anteil kam

HCO3--unabhängig über NKCC1 zustande. Unter Na+-freien Bedingungen und somit bei

46 Zusammenfassung

erniedrigten pHi-Werten und gleichzeitiger Hemmung von SLC26A7 fand so gut wie keine

Cl--Aufnahme mehr statt.

Die durchgeführten Messungen sprechen dafür, daß den zur Verfügung stehenden Cl--

Einstrommechanismen verschiedene Aufgaben zukommen. NKCC1 scheint in diesem Ansatz

unter azidotischem pHi keine Rolle für die Cl--Aufnahme bei der Säuresekretion zu spielen.

Unter alkalotischem pHi sind sowohl AE2 als auch NKCC1 wesentlich an der Cl--Aufnahme

beteiligt, während das SLC26A7-Protein bei einer Erniedrigung des pHi-Wertes zunehmend

den Cl--Transport übernimmt. Die Beobachtungen legen nahe, daß die Protonenpumpe die

benötigten Protonen nur in das Lumen sezernieren kann, wenn zur gleichen Zeit Cl--Ionen zur

Verfügung stehen, die luminal ausströmen können. Diese Cl--Ionen müssen basolateral über

die charakterisierten Transporter wieder aufgenommen werden, um intrazellulär zur

Verfügung zu stehen.

47 Literatur

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53 Danksagung

7 Danksagung

Meinen ersten herzlichen Dank möchte ich an dieser Stelle an meine Familie aussprechen.

Nicht nur bei dieser Arbeit, sondern zu jedem Zeitpunkt wurde mir jegliche mögliche

Unterstützung zu teil. Eine bedingungslose Unterstützung, die man leider zu oft als

selbstverständlich annimmt, und für die man nicht oft genug danken kann.

Sodann gilt mein größter Dank Herrn Prof. Dr. Markus Bleich für seine überaus zeitintensive

Betreuung während der Fertigstellung der Arbeit. Die zahlreichen Diskussionen und

Anregungen stellten eine große Bereicherung für mich dar.

Für die großzügige Bereitstellung jeglicher Materialien sowie der Arbeitsplätze möchte ich

Herrn Prof. Dr. John Geibel besonders danken. Seine fachliche Begleitung sowie ansteckende

Motivation haben die Zeit an der Universität in New Haven zu einer unvergeßlichen

Erfahrung gemacht. Daneben möchte ich allen weiteren Mitarbeitern im dortigen Labor

danken, die mir mit Rat und Tat zur Seite standen, herauszuheben sind Frau Stephanie M.

Busque und Herr Dr. Philipp Kirchhoff.

Zuletzt bin ich Herrn Felix Renhof dankbar. Er sorgte mit seinem Einsatz dafür, daß der

Computer immer das machte, was er sollte.

54 Lebenslauf

8 Lebenslauf

Ortrud Kosiek 23.12.1978 geboren in Nürtingen als drittes Kind des

Diplomphysikers Dr. Rolf Kosiek und seiner Ehefrau Christa, geb. Klages

1985-1989 Grundschule in Nürtingen-Reudern 1989-1996 Max-Planck-Gymnasium in Nürtingen 1996-1997 Gastschulaufenthalt an der Lewiston-High-School in

Lewiston, Idaho, USA 1997-1999 Max-Planck-Gymnasium in Nürtingen; Abitur Juni 1999 1999-2003 Studium der Humanmedizin an der

Christian-Albrechts-Universität zu Kiel; Physikum August 2001; Erstes Staatsexamen August 2002

2003-2004 Forschungsaufenthalt an der Yale University School of Medicine, New

Haven, CT, USA bei Prof. Dr. John Geibel, Department of Cellular and Molecular Physiology; Experimenteller Teil der Dr.Arbeit

2004-2005 Wiederaufnahme des Studiums an der Christian-Albrechts- Universität zu Kiel Zweites Staatsexamen September 2005 2005-2006 Praktisches Jahr:

1. Tertial: Anästhesie - Universitätsklinik Kiel 2. Tertial: Chirurgie - Yale New Haven Hospital, New Haven, CT,

USA 3. Tertial: Innere Medizin - Regionalspital Bozen, Italien Drittes Staatsexamen Dezember 2006

Jan. 2007 Assistenzärztin in der Abteilung für Diagnostische Radiologie der Universitätsklinik Magdeburg

55 Lebenslauf

Veröffentlichungen: Kirchhoff P., Andersson K., Socrates T., Sidani S.M., Kosiek O., Geibel J.P., Characteristics of the K+-competitive H,K-ATPase Inhibitor AZD0865 in isolated rat gastric glands, Am J Physiol 291: G838-G843, 2006. Kirchhoff P., Dave M. H., Remy C., Kosiek O., Busque S., Dufner M., Geibel J. P., Verrey F., Wagner C.A., An amino acid transporter involved in gastric acid secretion, Pflugers Arch 451: 738-748, 2005. Kosiek O., Vucic E., Grahammer F., Geibel J.P., Chloride influx in rat gastric parietal cells is Na+/K+/2Cl--cotransporter (NKCC) dependent, AGA-meeting 2004, New Orleans, USA (Poster)

die mechanismen des chlorideinstroms der … · kaliumpermeabilität der luminalen membran und das...

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