DIFFUSIONE

Una banda di soluto si muove attraverso una colonna cromatografica. Idealmente, una banda infinitamente stretta iniettata all’inizio della colonna, emerge all’uscita con una forma gaussiana (in condizioni meno ideali la banda diviene asimmetrica).

Una delle principali cause dell’allargamento della banda è la DIFFUSIONE dovuto al flusso (J) della sostanza da una zona a maggiore concentrazione ad una a minore concentrazione.

dxdc

DJsm

molFlusso

2D = coefficiente di diffusione

Segno negativo perché il flusso netto va da una zona a maggiore ad una a minore concentrazione

Profilo gaussiano della banda per effetto della diffusione )4(2

e4

Dtx

Dtm

c

Equazione del picco gaussiano

22 2)(e2

1

xy Dt2

dev. std del picco

È importante sottolineare che i piatti non esistono realmente all’interno della colonna, sono solo un modello per facilitare la comprensione del processo che avviene in colonna. Inoltre sono utili per poter valutare l’efficienza della colonna.

IL MODELLO DEI PIATTI TEORICIQuesto modello suppone che la colonna cromatografica contenga un elevato numero di “strati” detti piatti teorici sui quali si instaura l’equilibrio di ripartizione dell’analita tra fase stazionaria e fase mobile.L’analita si sposta verso la fine della colonna attraverso il movimento della fase mobile, all’equilibrio su un piatto, al piatto successivo.

EFFICIENZA DELLA COLONNA

Se il soluto nella colonna ha percorso una distanza x alla velocità di flusso lineare ux, il tempo che ha trascorso nella colonna sarà t = x/ux.

Se per effetto della diffusione la 2 della banda è 2Dt, di conseguenza:

xHxuD

ux

DDtxx

2222

Altezza del Piatto Teorico

xH 2

L’Altezza del Piatto Teorico è la costante di proporzionalità tra la varianza della banda (2) e la distanza che essa ha percorso (x)

Per un soluto che emerge da una colonna di lunghezza L, il numero di piatti teorici (N) dell’intera colonna, è la lunghezza L divisa per l’H :

Altezza del piatto piccola

Picchi stretti Migliori separazioni

Quindi il numero di piatti teorici per una colonna può essere calcolato esaminando un picco cromatografico dopo l’eluizione.Come si può osservare dall’equazione, il numero di piatti della colonna è diverso per ciascun analita nel campione.

22/1

2

2

2

2

2

2

2

2

55.516

spazio di anzichè tempo di unità in e invece Esprimendo

/4. e poichè

16

w

t

w

tN

wL

wxL

w

LLxLHL

N

RR

La teoria cinetica Una descrizione più realistica del processo che avviene all’interno della colonna tiene conto anche del tempo necessario all’analita per il raggiungimento dell’equilibrio tra fase stazionaria e fase mobile (nel modello dei piatti teorici si considera che il raggiungimento dell’equilibrio è istantaneo) La forma del picco cromatografico è pertanto influenzata dalla velocità di eluizione, ma anche dai cammini preferenziali dell’analita all’interno della fase stazionaria. Considerando i vari meccanismi che contribuiscono all’allargamento del picco si arriva alla Equazione di Van Deemter per l’altezza del piatto teorico:

H = A + B / u + C u dove u è la velocità media della fase mobile mentre A, B, e C sono fattori che contribuiscono all’allargamento del picco e sono costanti per una determinata colonna e fase stazionariaA – Diffusione di Eddy. La fase mobile contenente l’analita fluisce attraverso la colonna impaccata con la fase stazionaria, pertanto le molecole di analita seguiranno cammini casuali e differenti all’interno della fase stazionaria. Ciò comporta un allargamento della banda perché i diversi cammini hanno diversa lunghezza e quindi le molecole usciranno in tempi diversi. B/u– Diffusione Longitudinale. Poiché la concentrazione dell’analita è maggiore al centro della banda, l’analita diffonderà dal centro alla periferia determinando un allargamento della banda stessa. Questo effetto è tanto meno pronunciato quanto più elevata è la velocità della fase mobile (l’analita passa meno tempo all’interno della colonna). C u – Resistenza al trasferimento di massa. Se la velocità della fase mobile è elevata e se l’analita ha una forte affinità per la fase stazionaria, l’analita nella fase mobile esce prima dell’analita nella fase stazionaria originando un grande allargamento della banda. Questo effetto è tanto maggiore quanto più è veloce la fase mobile.

Risoluzione = 0.5 Risoluzione

= 0.75

Risoluzione = 1.00

Risoluzione = 1.50

In cromatografia la RISOLUZIONE fra 2 picchi è definita come:

wm = larghezza media dei 2 picchi w1/2m = larghezza media a metà altezza dei 2 picchi

m

r

m

r

wt

wt

2/1

589.0eRisoluzion

Per l’analisi quantitativa è preferibile una risoluzione uguale o superiore a 1.5

È utile mettere in relazione R con il numero di piatti teorici della

colonna, i fattori di selettività e i fattori di ritenzione dei due analiti.

L’equazione che correla tutti questi parametri è la seguente:

'

'114 B

B

kkN

R

Per ottenere un’alta risoluzione, è necessario massimizzare i 3

termini.

Un aumento del numero di piatti teorici, aumentando la lunghezza della

colonna, porta ad un aumento nel tempo di ritenzione, ma può

provocare anche un aumento della larghezza della banda.

In alternativa per aumentare il numero di piatti si può ridurre l’altezza

del piatto teorico riducendo la dimensione delle particelle della fase

stazionaria.

La separazione può essere migliorata controllando il fattore di capacità

variando la composizione della fase stazionaria.

Un tocco di realismo: bande di forma asimmetrica

Il coefficiente di ripartizione K = Cs/Cm dovrebbe essere costante ed

indipendente dalla concentrazione del soluto. Se così fosse avremmo bande simmetriche di forma gaussiana. Nelle colonne reali tuttavia K cambia all’aumentare della concentrazione del soluto e le bande si presentano codate.

Cm

Cs

Seg

nal

e

Tempo

Sovraccarico (fronting)

K aumenta

Seg

nal

e

Tempo

Codatura (tailing)

Seg

nal

e

Tempo

IDEALE

K diminuisce

K = Cs/Cm = costante

Sovraccarico per iniezione di troppo soluto: la banda emerge gradualmente dalla colonna, ma termina bruscamente

Alcuni siti della fase stazionaria trattengono il soluto più fortemente di altri: si origina così una codatura prolungata