A - Các phương pháp định lượng Samonela:

Phương pháp đếm trực tiếp:

Mật độ đơn bào có kích thước lớn như nấm men, tảo… có thể được xác định

bằng cách đếm trực tiếp bẳng buồng đếm trên kính hiển vi. Quy trỉnh đếm trực

tiếp cho phép xác định nanh chóng vi sinh vật trong mẫu nhưng phương pháp

này có một số nhược điểm là không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào

chết, dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các hạt vật thể khác trong mẫu, khó đạt

được độ ch1inh xác cao, không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ

thấp.

Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

Buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2-3mm có một vùng đĩa

đếm nằm giữa phiến kính và được bao quanh bởi một rãnh. Đĩa đếm thấp hơn

bề mặt của phiến kính khoảng 1/10mm, có hình tròn vì thế khi được phủ lên

bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ không đồng đều nhau. Vùng đĩa

đếm có diện tích 1mm2 vá được chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô

là 1/25 mm2 và 400 ô vuông nhỏ, mỗi ô có diện tích 1/400 mm2.

Khi thực hiện quan sát và đếm vi sinh vật, cho thêm vài giọt formalin váo trong

mẫu, trộn đề. Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm

có khoảng 5-10 tế bào vi sinh vật. Để đạt được độ pha loãng như vậy cần ước

lượng được số vi sinh vật trong mẫu, đồng thời phải thử vái lần trong quá trình

pha loãng. Mẫu phải được pha loãng bằng dung dịch pha loãng chứa 0.1%

pepton và 0.1% laurylsulphate và 0.01% methyl blue. Tất cả các dung dịch pha

loãng đều phải được lọc trước khi sử dụng. Đặt một giọt mẫu được pha loãng

vào vùng đếm trên buồng đếm, đậy bằng lá kính. Chỉnh kính hiển vi, với vật

kính ×40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một

thị trường chứa trọn một ô lớn (4 × 4 = 16 ô nhỏ). Đếm số tế bào hiện diện

trong môt ô lớn. Sau đó, chỉnh thị trường tìm một ô lớn khác . Đếm số tế bào

của ít nhất 5 ô lớn. Lấy trị số trung bình.

Cách tính mật độ sơ đồ như sau: thề tích của một lô lớn là 1/25mm2 × 1/10mm

= 1/250mm3 hay 1/250 × 103cm3 = 4 × 10-6ml. Như vậy mật độ tế bào của

huyền phù mẫu là : N/ml = 0.25a × 106 tế bào/ ml ( trong đó a là số tế bào bình

quân trong một ô lớn ).

Đếm trực tiếp bằng buồng đếm Breed

Buồng đếm này rất hữu ích trong việc đếm tổng số vi sinh vật bằng phương

pháp đếm trực tiếp.buồng đếm Breed có một vùng diện tích 1cm2 được đánh

dấu. dùng bơm tiêm hay que cấy vòng cho khoảng 0.01 ml mẫu cần đếm vào

trong vùng này, sấy khô bằng ngọn lửa sau đó nhuộm với methyl blue. Khi

đếm, cho dầu nhúng lên diện tích vùng cần đếm. Mật độ vi sinh vật đượ tính từ

số đếm trong các vùng đếm khác nhau là: N/ml = 4a × 104/лd2 (trong đó a là số

tế bào trong một vùng đếm và d là đường kính của vùng đếm).

Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang

Khi nhuộm mẫu chứa vi khuẩn bằng một trong các chất nhuộm phát huỳnh

quang khác nhau như acridin cam (AODC),4’,6-dianidino-2-phenyl-indol

(DAPI), flourescein isothiocyanate (FITC), mật độ vi khuẩn cũng có thể được

xác đinh trực tiếp dưới kính hiển vi huỳnh quang. Số đếm nhận từ phương pháp

này luôn cho kết quả cao khoảng gấp đôi so với kết quả nhận được bằng

phương pháp đếm khẩn lạc. sự khác biệt giữa phương pháp đếm trực tiếp và

phương pháp đếm khuẩn lạc phản sự chọn lọc của môi trường, điều kiện nuôi

cấy, môt phần tế bào bị chết hay bị tổn thương, không thể nuôi cấy được. Giá

trị của số đếm trực tiếp bằng phương pháp phát huỳnh quang tên kính hiển vi

tương đương với số lượng vi sinh vật thật sự có trong mẫu. Giá trị này cho

phép ước đoán được số lượng thật sự của tổng các loài vi sinh vật khác nhau

hiện diện trong mẫu tự nhiên, trong nước biển, nước tự nhiên, mặc dù các loài

này có sự khác biệt lớn về số lượng đặc điểm sinh lý. Số đếm này thường phản

ánh đúng sinh khối, vì thế thường được dùng để ước lượng sinh khối vi sinh vật

có trong mẫu.

Phương pháp màng lọc

Phương pháp này thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong

mẫu nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vi sinh vật

tương đối thấp. phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật trong

một mẫu nước trên màng lọc và xác định số tế bào vi sinh vật dựa vào số khuẩn

lạc đếm được sau khi đặt môi trường lọc lên trên thạch có thành phần dinh

dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm.Dựa trên khối lượng mẫu nhước

ban đầu và quy ước là mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào vi sinh vật,

người ta quy ra số lương vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích nước. Như

vậy, phương pháp này là sự kết hợp của phương pháp lọc và phương pháp đếm

khuẩn lạc trên đĩa petri. Màng lọc có kích thước lỗ là 0.45µm hoặc 0.2 µm

được chế tạo từ các nguyên liệu là sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi polypropilene,

thường được cung cấp trong trạng thái vô trùng.

Ngoài màng lọc bình thường hiện nay người ta còn sử dụng màng lọc lưới kỵ

nước trên đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước. Caqc vật chia ô bằng vật

liệu này ngăn cản sự mọc lan của các khuẩn lạc. Khác với trường hợp màng lọc

bi2ng thường, từ các số ô vuông có khẩn lạc mọc, mật độ vi sinh vật trong mẫu

được tính và trình bày dưới dạng số có xác suất lớn nhất (MPN) của lượng vi

sinh vật có trong một đơn vị thể tích mẫu theo công thức: MPN = Nln(N/N – x)

trong đó N là tổng số các ô vuông, x là ô có số khuẩn lạc mọc.

Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Phu7o7g pháp MPN ( phương pháp số có xác suất cao nhất (số tối khả) cò

được gọi là phương pháp tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương

pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác

suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định

lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm đượ lặp lại ở một số

độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc d9i5ng lượng này được thực hiện

lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 × 3 = 9 ống nghiệm.

Quy trình thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau: Cho vào các

ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật

cần định lượng một thể tích chính xác ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp

(ví dụ 1/10,1/100,1/1000). Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả

biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng

ống nghiệm (thường là các hiện tượng sing hơi, đổi màu, đục…), ghi nhận số

ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sủ dụng các số liệu này dựa vào

bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số

MPN/100ml hay số MPN/ 1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào

số ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại

càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn. Phương pháp MPN có thể

dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi

trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiến thích hợp. Ví dụ, sử dụng môi

trường BGBL ở 370C có thể đinh lượng nhóm cliform, cùng môi trường này ở

450C cho phép đinh lượng coliform phân hoặc môi trường Mannitol Salt Proth

có thể dùng để định lượng Staphylococus...

Cần lưu ý rằng đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong

100ml dung dịch được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml,

0.1ml. Trên thực tế phân tích, chúng ta không sử dụng các liều lượng khác

nhau của mẫu như trên do nồng độ các thành phần môi trường sẽ khác nhau

nhiều ở các ống nghiệm, ảnh hường đến các kết quả phân tích. Thông thường

người ta sử dụng đồng loạt một dung tích mẫu nhất định cho các mẫu đã pha

loãng 10-1, 10-2 và 10-3 được dùng để phân tích .Trường hợp mật độ vi sinh vật

quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng tiếp theo cần phải nhân trị số

tra theo bảng MPN nêu trên với hệ số loãng. Ví dụ sử dụng 1ml cho mỗi độ pha

loãng 10-2, 10-3 và 10-4 tức là chỉ sử du5bg 1/10 lượng mẫu ở nồng độ so với

trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3. Do vậy, trị số

tra theo bảng MPN nêu trên cần được nhân thêm hệ số pha loãng là 10.

Đếm khuẩn lạc

1. Giới thiệu chung:

Bản chất của phương pháp này là cấy một thể tích xác định mẫu huyền

phù vi sinh vật lên môi trường thạch trong hộp peptri. Môi trường được chọn

có thành phần co chất đặc trưng và thích hợp cho loài vi sinh vật cần định

lượng phát triển. Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất

hiện các khuẩn lạc và ta có thể quan sát được bằng mắt thường. Nếu loài vi

sinh vật là đơn bào, dạng riêng lẽ thì ta có thể xem mỗi khuẩn lạc là kết quả của

sự phát triển từ một tế bào. Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã

cấy và hệ số pha loãng, ta có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu khảo sát

ban đầu.

Lưu ý:

Khi các tế bào vi sinh vật tồn tại dạng đôi, dạng tứ, dạng chuỗi hoặc dạng

khối thì mỗi khuẩn lạc sẽ có nguồn gốc từ nhiều tế bào. Ngoài ra, nếu nồng độ

vi sinh vật trong mẫu cấy quá đậm đặc và kỹ thuật gieo cấy không tốt cũng có

thể làm xuất hiện các khuẩn lạc có nguồn gốc từ những tế bào khác nhau. Do

đó, kết quả định lượng bằng phương pháp này luông được biểu diễn dưới dạng

số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu hoặc số khuẩn lạc có trong 1g mẫu.

Ưu điểm của phương pháp này:

Định lượng được những tế bào sống có trong mẫu khảo sát. Phương pháp

này phổ biến và được ứng dụng rộng rãi hơn các phương pháp khác. Phương

pháp này thường được sử dụng để theo dõi sự sinh trưởng của vi sinh vật trong

các quá trình lên men cũng như để kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực

phẩm.

Nhược điểm:

Thời gian dài, tốn kém chi phí hóa chất, nhân công nhiều hơn so với các

phương pháp khác.

Để định lượng vi khuẩn, ví dụ như tổng số vi khuẩn hiếu khí, người ta

thường sử dụng môi trường thạch tryptone glucose. Để định lượng tổng số nấm

men, môi trường phổ biến nhất là môi trường thạch nấm men nấm sợi. Để định

lượng nấm sợi, người ta thường sử dụng mội trường thạch dextrose Sabouraud.

B - Quy trình phân tích định tính Salmonella trong thực phẩm

a) Tăng sinh

Thực hiện trong môi trường không chọn lọc như Buffer Pepton Water.

Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô

trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong

15 hoạc 30 giây. Ủ ở 37 10C trong 18 – 24 giờ.Đối với một số loại thực

phẩm có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của

Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt sau:

- Đối với mẫu gia cầm tươi sống: đặt gia cầm vào trong một bao nhựa lớn,

thêm vào một lit dung môi tăng sinh BPW. Lắc bằng máy khoảng 30

giây để môi trường thấm được vào trong toàn bộ mẫu.

- Đối với sữa khô: cho 25g mẫu vào trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml

môi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng.Sau đó lắc cho đến

khi sữa tan hoàn toàn.

- Đối với các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đồng nhất

mẫu ở độ pha loãng 1/100 trong BPW (thay vì 1/10 như bình thường)

trước khi nuôi tăng sinh. Biện pháp này làm giảm nồng độ các hợp chất

ức chế tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh.

- Đối với các mẫu như casein, phomat, bơ và các sản phẩm tương tự khác:

thực hiện đồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã dược làm ấm

đến 400C.

- Đối với sản phẩm như cocoa: đồng nhất mẫu trong môi trường Skim

Milk Broth được làm ấm ở 400C.

- Đối với dừa, các sản phẩm của dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo

cao: đồng nhất mẫu với BPW, sau đó thêm 2-3 giọt Triton X- 100 trước

khi ủ tăng sinh.

b) Tăng sinh chọn lọc

Thực hiện trong môi trường chọn lọc cho Salmonella: RV , TTB, Selenite

Cystine Broth, …

- Không có môi trường nào chọn lọc cho tất cả các kiểu huyết thanh của

Salmonella

- Nên chọn lọc ít nhất 2 môi trường chọn lọc trên cùng 1 mẫu

- Môi trường RV và TTB không chọn lọc cho S. typhi

Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng

sinh Rappapport-Vassliadis Soya Pepton đã được ủ ấm đến độ 420C.Ủ ở 42

0,20C trong 12- 24 giờ. Khi cần thiết có thể kaéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ.

Một số môi trường tăng sinh chọn lọc như Selenite Cysteine Broth,

Tetrathionate Muller- Kauffman cũng được dùng. Mỗi loại môi trường chỉ có

tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm phát triển của Salmonella, một số dòng

Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng

trưởng được trong môi trường khác. Ví dụ Salmonella typhi không tăng trưởng

được trong môi trường Rappaport Vassiliadis và Tetrathionate Muller-

Kaufmann, Salmonella dublin không tăng trưởng được trong môi trường

Rappaport Vassilidis. Do vậy,để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng

Salmonella hiện diện trong mẫu thực phẩm cần phải dùng ít nhất hai loại môi

trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu. Ngoài ra, mỗi môi

trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ nuôi cấy khác nhau như môi trường RV

được ủ ở 420C, môi trường TT và SC ủ ở 370C trong 22-24 giờ.

c) Phân lập và nhận diện

được thực hiện trên môi trường chọn lọc phân biệt cho Salmonella. XLD, HE,

BS, BPLS, SS.

- Nên sử dụng ít nhất 2 môi trường phân lập cho cùng một mẫu để tăng cường

khả năng phát hiện Salmonella

- Môi trường XLD được khuyến khích sử dụng

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ

dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc đặc trưng cho Salmonella

như XLD, HE, BS,… Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở trạng

thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. Để nhận

dạng được tất cả các dòng Salmonella phải dùng tối thiểu 2 môi trường chọn

lọc phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên

từng môi trường khác nhau như sau:

- Môi trường XLD: Khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có

tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể

chiếm gần hết khuẩn lạc

- Môi trường BS: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ nàu xanh

dương sang xanh đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím. Môi

trương chung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển

thành đen nếu kéo dài thời gian ủ.

- Môi trường BPLS: có khuẩn lạc Salmonella màu hồng nhạt, trong suốt,

xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển màu đỏ.

- Môi trường SS: tất cả các đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở 370C

trong 22-26 giờ. Sau khi ủ, chọn các khuẩn lạc có đặc điểm của

Salmonella như trên để thực hiện bước khẳng định bằng các thử nghiệm

sinh hóa và thử nghiệm kháng nguyên.

d) Khẳng định

Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy ít nhất 5 khuẩn lạc nghi

ngờ sang môi trường không chọn lọc ví dụ như TSA. Ủ ở 370C trong 18-24

giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng cho các thử

nghiệm sinh hóa và huyết thanh.

Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là lên men

glucose, lactose, saccharose, H2S, urea, indol, VP, ODC, LDC, sử dụng

mannitol, sorbitol. Các chủng Salmonella cho các kết quả thử nghiệm sinh

hóa như sau:

- Thử nghiệm sinh H2S(TSI hay KIA): Salmonella chỉ lên men được

đường glucose trong các môi trường trên vì thế phần nghiêng của môi

trường có màu đỏ , phần sâu có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella

đềy có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi

trường này. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ

thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoàng bên

dưới đáy ống nghiệm.

- Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy môi trường chuyển thành kiềm,

màu môi trường được chuyển thành màu như ban đầu( màu tím hay

xanh).

- Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm

thay đổi pH môi trường; Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên

màu vàng cam.

- Lên men mannitol, sorbitol (+): môi trường sau khi cấy bị acid hóa và

chuyển thành màu vàng.

- Thử nghiệm Indol và VP(-).

Các thử nghiệm kháng nguyên cần được thực hiện song song với mẫu

chứng không bằng dịch nước muối sinh lý để loại trừ khả năng nhu6ng

kết giả. Hailaọi kháng huyết thanh đa giá cần dùng là Salmonella

Polyvalent O và Salmonella Polyvalent H. Phản ứng (+) khi chủng thử

nghiệm tạo ngưng kết với nước muối sinh lý.

e) Báo cáo kết quả

Quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính

Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong

25g mẫu, không cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện

trong mẫu. Để khẳng định được tên chủng Salmonella phân lập được

phải tiến hành thử nghiệm ngưng kết với các loại kháng huyết thanh đơn

giả khác nhau hay cần gửi chủng Salmonella phân lập được đến các

phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật.

Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm. Do

vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các

chủng Salmonella dùng làm đối chúng (+) cũng như khi thao tác trên các

chủng phân lập được. Các mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng

cẩn thận trước khi rửa.

4. Quy trình phân tích định tính Salmonella trong nước

Salmonella có thể hiện diện trong tất cả các loại nước( nước sinh hoạt,

nước uống, nước dùng cho nông nghiệp, nước sông hồ, nước thải, nước

biển) với mật độ thấp. Do vậy để phát hiện Salmonella trong nước cần

phải qua bước lọc thu gộp tế bào qua màng lọc, làm giàu trong môi

trường tăng sinh, để phục hồi các tế bào bị tổn thương. Quy trình phát

triển cũng gồm 4 bước tu7ong tự như trường hợp thực phẩm với một số

lưu ý ở bước tăng sinh như sau: Nếu thể tích mẫu nhỏ hơn 10ml, cho

mẫu vào trong 50ml môi trường BPW có nồng độ đơn. Nếu mẫu có thể

tích lớn hơn 10ml, cho vào mẫu vào môi trường BPW có nồng độ kép

theo tỉ lệ 1:1. Trường hợp dùng màng lọc để thu gộp tế bào, sau khi lọc

mẫu, cho màng lọc vào 50ml môi trường BPW. TIến hành ủ ở 36 0,20C

trong 16- 20 giờ, sau đó tiếp tục bước tăng sinh chọn lọc, phân lập và

khẳng định như trên.

C- Định lượng theo TC AOAC:

Đánh dấu Salmonella bằng ADN

1) Nguyên lý chung:

Nguyên lý sử dụng sợi đơn ADN đánh đáu rất đơn giản. một sợi đơn ngắn

ADN có trình tự bổ sung với một gen có mặt trong vi sinh vật cần phát hiện

được tổng hợp và đánh dấu (có thể đánh dấu bằng chất phóng xạ 32P hay đánh

dấu bằng enzym). Mẫu thực phẩm cần phân tích được sử lý sao cho tất cả các

tế bào phải được phân hủy và giải phóng ADN của chúng. ADN của chúng sau

đó được sử lý để bị biến tính, hai mạch đơn rời nhau ra. ADN đánh dấu được

đưa vào môi trường. sự lai được xẩy ra giữa ADN đánh dấu và ADN của vi

khuẩn gây bệnh có mặt trong thực phẩm được tách ra. Các sợi đơn ADN của vi

sinh vật không tham gia lai được tách ra thưởng bằng cách rửa mẫu. sự lai được

phát hiện nhờ ADN đánh dấu.

Ví dụ: Gene TrakTM system sử dụng để phát hiện Salmonella trong thực

phẩm. Hệ thống này sử dụng hai ADN dò: một mẫu dò bắt (capture probe) và

một mẫu dò phát hiện (detection probe). Hai mẫu dò này bắt cặp bổ sung với

hai vùng khác nhau của gen mã hóa ARN ribosom của Salmonella. Sở dĩ ARN

ribosom của Salmonella được chọn để phát hiện là do gen này có số lượng bản

copy rất lớn (khoảng 5.000 bản copy của gen này có mặt trong tế bào

Salmonelle). ADN đầu dò họat động tốt khi có nhiều ADN đích của nó trong

môi trường. Một điều rất quan trọng là các đầu dò ADN phải đặc hiệu đối với

vi khuẩn Salmonelle có nghĩa là nó chỉ bắt cặp bổ sung với ADN của

Salmonella mà không bắt cặp bổ dung với ADN của các vi khuẩn khác có mặt

trong mẫu thực phẩm. Điều này thực hiện trên cơ sở so sánh trình tự ARN

ribosom của một số lượng lớn các loài vi khuẩn và chọn một trình tự đặc trưng

của Salmonella.

2) Các bước tiến hành:

• Làm giàu canh trưng, nghiền mẫu

• Phân ly tế bào, biến tính ADN (chuyển ADN sợi kép thành ADN sợi đơn)

• Cho capture probe và detection capture vào dung dịch. Capture probe có đuôi

polyA và detector probe có đánh dấu (enzym)

• Thực hiện phép lai giữa ADN của Salmonella và hai đầu dò.

• Dùng que thử dipstick (có poly T) tách các mẫu dò có lai (ADN của vi khuẩn

và hai mẫu dò) và capture probe không lai.

• Đưa vào môi trường chứa cơ chất của enzym dùng để đánh dấu (peroxydase).

Enzym xúc tác chuyển cơ chất chromogen thành sản phẩm cuối có màu.

Các ưu điểm chính của phương pháp:

Giảm thời gian phân tích (48 giờ, đôi khi là 24 giờ), giảm ít nhất 1 ngày so với

dùng pp truyền thống

Đặc hiệu: rất nhiều vi khuẩn gần với Salmonella (Citrobacter, Enterobacter,

Escherrichia, Klebssielle, Proteus) có khả năng phát triển trên môi trường nuôi

cấy đặc trưng cho Salmonella. Điều này gâp kết quả sai dương tính nếu dùng

pp truyền thống.

Một vài chủng Salmonella không đặc trưng và không tạo khuẩn lạc trên môi

trường của Salmonella. Điều này gây kết quá sai âm tính.

Nhược điểm:

Vẫn yêu cầu có làm giàu canh trường vi khuẩn trước khi phân tích. Do đó việc

phân tích Salmonella tức thời bằng pp này là không thể. Tuy nhiên việc làm

giàu canh trường trước phân tích cũng có tác dụng, các vi khuẩn chết sẽ không

được phát hiện trừ khi chúng có mặt với số lượng lớn. Điều này cho phép tránh

kết quả sai dương tính.

Định tính bằng phương pháp PCR

1) Nguyên tắc

Kỹ thuật PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại số lượng bản sao của một

trình tự AND đích qua các chu kỳ gồm 3 bước: biến tính ADN, bắt cặp bổ sung

với mồi và tổng hợp mạch mới nhờ enzym ADN polymerase. Phương pháp

định tính này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay

không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch

đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn

UV có bước sóng là 302 mm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di

sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn

ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không

xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không

phù hợp với đoạn ADN đích.

2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật và các loại hoá chất khác

Khuyến khích sử dụng môi trường nuôi cấy dạng bột khô và các vật liệu dùng

cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành kit đang được lưu hành

trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới đây.

Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản

xuất. Trong trường hợp sử dụng các vật liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh khiết của

các thành phần và nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh và

sinh học phân tử.

Dung dịch đệm pepton

Pepton (C5H10O5): 10,0g

Natri clorua (NaCl): 5,0g

Ðinatri hyđro phôt phat (Na2HPO4): 3,6 g

Kali đihyđro phôt phat (KH2PO4): 1,5g

Nước cất: 1000 ml

Hoà tan các thành phần trong nước cất, đun tan, phân phối vào trong các bình

chứa phù hợp. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phú. pH sau khi khử

trùng là 7,0 0,2 ở 25oC.

Hỗn hợp dùng trong khuếch đại PCR 1,1x

Taq polymerase: 0,025 U/ml (1,25 U/50 ml)

Tris - HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25oC): 75 mM

Sunphat amon (NH4)2ư SO4: 20 nM

Tween 20: 0,01% (v/v)

dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 200 mM (mỗi loại)

Magiê clorua (MgCl2) 1,5 mM

Tất cả các thành phần trên được pha chế trong nước cất 2 lần và bảo quản ở

nhiệt độ 4oC trong 1 tháng. Có thể bảo quản ở nhiệt độ - 20oC trong 1 năm.

Không nên rã đông và tái đông dung dịch đã pha chế nhiều lần.

Thang ADN

Nên sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 520 bp.

Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp đã biết trước làm

thang đo trong phương pháp này.

Agarose

Sử dụng trong kỹ thuật này là loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ hơn

1000 bp.

Ðệm điện di TAE 1x

Tris: 4,84 g

Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0: 2 ml

Axit axetic băng: 1,14 ml

Nước cất cho đủ: 1000 ml

Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), khi sử dụng mới pha loãng

với nước thành dung dịch 1x.

Ðệm tải mẫu 6x

Glyxerol: 30 %

Xanh bromphenon: 0,25 %

Tris: 200 mM

Na2EDTA: 20 mM

Các thành phần trên được pha trong nước cất, bảo quản ở nhiệt độ 4oC.

Thuốc nhuộm AND: dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml

3. Cách tiến hành

3.1 Lấy mẫu

Cân chính xác 25 g mẫu (hoặc một khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) rồi

cho vào bình tam giác hoặc bao PE vô trùng.

3.2 Tăng sinh

Nhằm làm tăng số lượng Salmonella trong mẫu, các tế bào bị suy yếu hay tổn

thương cũng được phục hồi và phát triển. Giai đoạn này được tiến hành trong

môi trường không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽ

bổ sung 9 phần khối lượng môi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ

sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm.

ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0oC 1,0oC trong khoảng 18 giờ 2

giờ.

Xử lý mẫu giải phóng ADN

Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh, rửa sạch môi trường

sau khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN. Cách xử lý như sau:

- Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trong ống eppendorf có thể

tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ phần

môi trường lỏng bên trên. Rửa sinh khối bên dưới với nước cất vô trùng rồi tiếp

tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước.

- Huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước cất vô trùng. Ðun sôi cách

thuỷ trong 10 phút. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 vòng/phút

trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên

được coi là khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại.

3.3 Khuếch đại

Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân

nhiệt (thermocycler) bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến

hành trong khoảng 30 chu kỳ.

- Chuẩn bị ống khuếch đại

Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR có

thể tích 0,2 hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6

pM và 3 ml mẫu khuôn ADN. Tổng thể tích trong một ống khuếch đại là 50 ml.

Ðối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng dịch ADN của Salmonella

chuẩn đã biết.

Ðối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng nước cất vô trùng.

- Chương trình khuếch đại

Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch

đại như sau:

Duy trì nhiệt độ 95oC trong 5 phút để làm biến tính hoàn toàn các sợi ADN

trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 95oC/60

giây; 54oC/45 giây và 72oC/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ

ở nhiệt độ 72oC trong 10 phút, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20oC cho đến khi

điện di.

3.4 Ðiện di sản phẩm khuếch đại

- Chuẩn bị gel điện di agarose 1%

Gel agarose 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào

khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng

3 - 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE.

- Chuẩn bị dịch điện di

Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật

đều.

- Ðiện di

Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối

chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agarose. Tiến

hành điện di trong 60 phút ở hiệu điện thế 100 vôn.

3.5 Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại

- Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu

Pha dung dịch nhuộm ADN như sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5

lít nước, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản gel điện di.

- Nhuộm gel

Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 phút. Rửa gel bằng

nước trong khoảng 3 - 5 phút để loại bỏ phần etyl bromua dư.

- Quan sát, chụp hình

Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan

sát các vạch sáng đỏ của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đó, chụp hình để lưu

trữ kết quả.

4. Ðọc và giải thích kết quả

Kết quả phân tích chỉ được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương tính có

sản phẩm khuếch đại ADN với kích tước 520 bp và mẫu đối chứng âm không

có sản phẩm này.

Mẫu được kết luạn là dương tính Salmonella khi có sản phẩm khuếch đại 520

bp trên bản gel. Mẫu được kết luận là âm tính khi không có sản phẩm khuếch

đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác hơn 520 bp.

5. Qui định về đảm bảo an toàn

Trong quá trình tiến hành thao tác phải thực hiện đúng các qui định sau đây:

- Thuốc nhuộm etyl bromua là một chất độc có thể gây ung thư cho người và

động vật. Do đó, khi sử dụng hoá chất này phải có găng tay và kính bảo hộ.

Dung dịch sau khi sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ.

- Chỉ được bật đèn UV để quan sát ADN sau khi đã đóng kính bảo vệ.

- Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại

cho việc tăng sinh hay chuẩn bị mẫu.

- Phòng thí nghiệm phải được bố trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khi

khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng

nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả.