dioxin as pcb
DESCRIPTION
DIOXINASTRANSCRIPT
Avances en el screening de Dioxinas y PCBs en productos de la pesca
Dr. Gerardo Fernández MartínezU id d d Té i C áfi SAIUnidad de Técnicas Cromatográficas - SAI
ESQUEMA
¿Qué queremos medir? Dioxinas, furanos y PCBs¿A que nivel tenemos que medir? Aspectos legislativosMetodologías generales. ¿Son todas iguales?Requisitos de un laboratorio de analisis de PCDD/F y
PCBPCBsEsquema de una metodología de confirmaciónNuevas metodologías: ¿ Dónde podemos actuar?Nuevas metodologías: ¿ Dónde podemos actuar?Nuevos métodos de preparación de muestrasNuevos métodos de determinaciónNuevos métodos de determinaciónConclusiones
¿Qué queremos medir? Dioxinas, furanos y PCBs
OCl Cl1 28
910
Cl Cl1 28
9
Cl 7 3 Cl 7 3OCl Cl45
67 3 OCl Cl4
56
7 3
2,3,7,8 Tetraclorodibenzo-p-diossina 2,3,7,8 Tetraclorodibenzofurano
¿Qué queremos medir? Dioxinas furanos y PCBs¿Qué queremos medir? Dioxinas, furanos y PCBs
2,3,7,82,3,7,8--TCDFTCDF CBCB--77771,2,3,7,81,2,3,7,8--PeCDFPeCDF
2,3,4,7,82,3,4,7,8--PeCDFPeCDF
1,2,3,4,7,81,2,3,4,7,8--HxCDFHxCDF
1 2 3 6 7 81 2 3 6 7 8 H CDFH CDF
CBCB--8181
CBCB--126126
CBCB--1691691,2,3,6,7,81,2,3,6,7,8--HxCDFHxCDF
2,3,4,6,7,82,3,4,6,7,8--HxCDFHxCDF
1,2,3,7,8,91,2,3,7,8,9--HxCDFHxCDF
1,2,3,4,6,7,81,2,3,4,6,7,8--HpCDFHpCDF
CBCB--123123
CBCB--118118
CBCB--114114, ,3, ,6, ,8, ,3, ,6, ,8 pCpC
1,2,3,4,7,8,91,2,3,4,7,8,9--HpCDFHpCDF
OCDFOCDF
2,3,7,82,3,7,8--TCDDTCDD
CBCB--105105
CBCB--167167
CBCB--156156
1,2,3,7,81,2,3,7,8--PeCDDPeCDD
1,2,3,4,7,81,2,3,4,7,8--HxCDDHxCDD
1,2,3,6,7,81,2,3,6,7,8--HxCDDHxCDD
CBCB--157157
CBCB--189189
1,2,3,7,8,91,2,3,7,8,9--HxCDDHxCDD
1,2,3,4,6,7,81,2,3,4,6,7,8--HpCDDHpCDD
OCDDOCDD
TEFTEFTEFTEF
2,3,7,82,3,7,8--TCDFTCDF 0,10,1
1,2,3,7,81,2,3,7,8--PeCDFPeCDF 0,050,05
2 3 4 7 82 3 4 7 8--PeCDFPeCDF 0 50 5
TEFTEF
CBCB--7777 0,00010,0001
CBCB--8181 0,00010,00012,3,4,7,82,3,4,7,8--PeCDFPeCDF 0,50,5
1,2,3,4,7,81,2,3,4,7,8--HxCDFHxCDF 0,10,1
1,2,3,6,7,81,2,3,6,7,8--HxCDFHxCDF 0,10,1
2,3,4,6,7,82,3,4,6,7,8--HxCDFHxCDF 0,10,1
CBCB--126126 0,10,1
CBCB--169169 0,010,01
CBCB--123123 0,00010,0001
N1,2,3,7,8,91,2,3,7,8,9--HxCDFHxCDF 0,10,1
1,2,3,4,6,7,81,2,3,4,6,7,8--HpCDFHpCDF 0,010,01
1,2,3,4,7,8,91,2,3,4,7,8,9--HpCDFHpCDF 0,010,01
CBCB--118118 0,00010,0001
CBCB--114114 0,00050,0005
CBCB--105105 0,00010,0001
CBCB 167167 0 000010 00001Σ Ci x TEFiTEQ =N
OCDFOCDF 0,00010,0001
2,3,7,82,3,7,8--TCDDTCDD 11
1,2,3,7,81,2,3,7,8--PeCDDPeCDD 11
1 2 3 4 7 81 2 3 4 7 8 H CDDH CDD 0 10 1
CBCB--167167 0,000010,00001
CBCB--156156 0,00050,0005
CBCB--157157 0,00050,0005
CBCB--189189 0 00010 0001
Σ i iQ1,2,3,4,7,81,2,3,4,7,8--HxCDDHxCDD 0,10,1
1,2,3,6,7,81,2,3,6,7,8--HxCDDHxCDD 0,10,1
1,2,3,7,8,91,2,3,7,8,9--HxCDDHxCDD 0,10,1
1,2,3,4,6,7,81,2,3,4,6,7,8--HpCDDHpCDD 0,010,01
CBCB 189189 0,00010,0001
1,2,3,4,6,7,81,2,3,4,6,7,8 HpCDDHpCDD 0,010,01
OCDDOCDD 0,00010,0001
¿A que nivel tenemos que medir? Aspectos legislativos
Sustancias tóxicas a niveles muy bajos (pg/g)Necesidad de métodos altamente selectivos y sensiblesNecesidad de métodos altamente selectivos y sensiblesEn alimentación el nivel a medir viene dado por la
normativa.normativa.Alimentación animal: Orden PRE/1809/2006Alimentación humana: Reglamento (CE) Nº 1881/2006g ( ) /
MetodologíasMetodologías
Método de referencia GCMétodo de referencia GC--HRMSHRMS Métodos US EPA 1613 y Métodos US EPA 1613 y 16681668EIEI--SIM modoSIM modo
Resolución 10.000 (10%valle)Resolución 10.000 (10%valle)
16681668European Standard Method European Standard Method EN 1948EN 1948--1/2/3 1/2/3
TécnicasTécnicas alternativasalternativas y y complementariascomplementarias
MétodosMétodos químicosquímicos:: GCGC--Ion trap MS/MSIon trap MS/MSGCGC--TQ MS/MSTQ MS/MSGCxGCGCxGC--µECDµECDGCxGCGCxGC µECDµECDGCxGCGCxGC--TOFTOF
MétodosMétodos de de bioensayobioensayo:: DRDR--CaluxCalux assayassayyy yy
Reglamento (CE) Nº 1883/2006
Requisitos que deben cumplir los laboratoriosRequisitos que deben cumplir los laboratorios
Requisitos de aceptación de los procedimientosRequisitos de aceptación de los procedimientosanáliticos
Reglamento (CE) Nº 1883/2006
Requisitos que deben cumplir los laboratorios
- Los laboratorios deben demostrar la eficacia del método
- Límite de cuantificación 1/5 del nivel considerado/
- Medidas internas de control de calidad
- Participación den ejercicios interlaboratoriosp j
- Sistemas de gestión de calidad. Acreditación
Reglamento (CE) Nº 1883/2006
Requisitos de aceptación de los procedimientosálitianáliticos
- Sensibilidad adecuada y límites de detección bajos. Orden dejpg
- Selectividad elevada (especificidad). Distinción de losi ó tó i d l tó iisómeros tóxicos de los no tóxicos
- Elevada exactitud y precisión
Cl ifi ió d l ét d fi ió ib d- Clasificación de los métodos en confirmación y cribado
MetodologíasMetodologías
Método de referencia GCMétodo de referencia GC--HRMSHRMS Métodos US EPA 1613 y Métodos US EPA 1613 y 16681668é odo de e e e c a GCé odo de e e e c a GC SS
EIEI--SIM modoSIM modoResolución 10.000 (10%valle)Resolución 10.000 (10%valle)
16681668European Standard Method European Standard Method EN 1948EN 1948--1/2/3 1/2/3
Técnicas alternativas y complementariasTécnicas alternativas y complementarias
Métodos químicos:Métodos químicos: GCGC--Ion trap MS/MSIon trap MS/MSGCGC--TQ MS/MSTQ MS/MSGCxGCGCxGC--µECDµECDGCxGCGCxGC µECDµECDGCxGCGCxGC--TOFTOF
Métodos de bioensayo:Métodos de bioensayo: DRDR--Calux assayCalux assayyy yy
Métodos de confirmaciónMétodos de confirmación
Ventajas- Elevada sensibilidad compatible con la normativa
Elevada selectividad y especificidad- Elevada selectividad y especificidad- Minimización de falsos positivos y negativos- Una vez implantada la metodología. Elevada robusted
InconvenientesElevada inversión- Elevada inversión
- Alta cualificación del personal- Alto mantenimiento- mayor tiempo de análisis?mayor tiempo de análisis?
Métodos de cribadoMétodos de cribado
Ventajas- Menor coste
Menor cualificación del personal- Menor cualificación del personal- Herramienta útil para el cribado de negativos
InconvenientesLimitada sensibilidad no siempre compatible con la normativabaja selectividad y especificidad- baja selectividad y especificidad
- Elevado número de falsos positivos- Buenos resultados dependientes del estado de instrumental- No necesariamente mayor rapidezNo necesariamente mayor rapidez
Reglamento (CE) Nº 1883/2006
Requisitos de los métodos de confirmación
- Utilización de patrones marcados isotópicamente
- Realización de controles de recuperación
- Verificación de la correcta separación cromatográfica decongéneres e interferencias
- Realización de la determinación conforme a método EPA 1613o similar
PCDDs/Fs y PCBs/ yProductos de la pesca
Muestra
PCDDF y PCB LCS
Extracción soxhlet
Clean-up automático
Ataque ácido
Clean up automático
Concentración
PCDDF y PCB ISS
HRGC-HRMS
PCDDs/Fs y PCBs/ yPreparación de muestras y Extracción
soxhletsoxhlet
HOMOGEINIZACIÓN Y EXTRACCIÓN TOLUENOPatrones 13C12
PREPARACIÓN DE MUESTRA
8 HORAS BÜCHI 811 Reposo 3 horas
PCDDs/Fs y PCBs/ yMuestras grasas: Ataque ácido
Disolución en hexanoCambio de disolventetolueno-hexano
Ataque con ácido sulfúrico2 X 100 mL
tolueno hexano
2 X 100 mL
Concentración
Clean-up
PCDDs/Fs y PCBs/ y“CLEAN UP”
Eluato en hexanoFMS
Sílice multicapa
12 mLFMS
POWER-PREP
pAlúmina básicaCarbón px-21
HexanoDCM/Hexano 2%DCM/Hexano 50%
A OEt/T l 50%AcOEt/Tolueno 50%Tolueno
l Frac. DCM/HexanoMono-ortho PCBs
Frac. ToluenoNon-ortho PCBs
PCDD/Fs
PCDDs/Fs y PCBsPCDDs/Fs y PCBsANÁLISIS INSTRUMENTAL
THERMO FINNIGANTHERMO FINNIGANMAT 95 XP
Extracto a sequedad F l
Extracto a sequedad F l Frac. tolueno
EPA1613-ISS
Frac. tolueno y DCM/Hex
EPA1668-ISSEPA1613 ISS+
nonano
HRGC:DB5-MS
EPA1668 ISS+
nonano
HRGC:RTX 2330HRGC:DB5 MS60 m x 0,25 mm
x 0,1 um
HRGC:RTX 233060 m x 0,25 mm x
0,1 um
HRGC: MID R= 10000
HRGC: MID R= 10000
SCREENING:?Donde podemos actuar?
TIEMPO
COSTE
METODOS DE SCREENINGMETODOS DE SCREENING
Métodos químicos:Métodos químicos: GCGC--Ion Ion traptrap MS/MSMS/MSGCGC--TQ MS/MSTQ MS/MSGC GCGC GC ECDECDGCxGCGCxGC--µECDµECDGCxGCGCxGC--TOFTOF
Preparación de muestra
Métodos de bioensayo:Métodos de bioensayo: DRDR--CaluxCalux assayassayMétodos ELISAMétodos ELISA
METODOS DE SCREENINGMETODOS DE SCREENINGRequisitos de los métodos de screening
- Debe ser lo suficientemente selectivos y sensibles en los niveles ymatrices legislados.
- Es necesario disponer y proporcionar información de los falsospositivos y negativos en una amplia serie de datos.
- El porcentaje de falsos negativos debe ser inferior al 1%El porcentaje de falsos negativos debe ser inferior al 1%
- El porcentaje de falsos positivos debe ser lo suficientemente bajopara resultar útil
- Deberán confirmarse mediante HRGC/HRMS todos los positivos y almenos entre un 2-10% de las muestras negativas
- Según la estrategia de análisis del Reglamento (CE) 1883/2006Según la estrategia de análisis del Reglamento (CE) 1883/2006deberían confirmarse muestras cuyo EQT > 25% del limite
METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: Bioensayo
Método Calux: Chemical Activated LUciferase gene eXpression.g
PCDD, PCDF y PCB se unen a un receptor intracelular, conocido como receptos aril hidrocarburos (Ah). La unión al receptor Ah es seguido por el transporte del complejo PHAH-Ah complejo al núcleo de la célula y la posterior unión a secuencias específicas en el ADN.
E t i ífi d ADN d i l t d tEstas secuencias específicas de ADN se denominan elementos de respuesta (ER). La unión del complejo químico a los receptores de la RE activa la expresión de genes asociados a RE. El impacto toxicológico de las sustancias químicas se inicia con el cambio observado en la expresiónsustancias químicas se inicia con el cambio observado en la expresión génica.
En términos finales se mide la actividad luminiscente de la enzima luciferasaEn términos finales se mide la actividad luminiscente de la enzima luciferasa formando complejo con la luciferina por descarboxilacion oxidativa.
METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: BioensayoMétodo DR-Calux: 1. Toma de muestra
2. Extracción de la muestra
3. Clean-up: Silica, Alúmina, Florisil
4. Cultivo celular
5. Crecimiento celular
6. Exposición de las células a extractos
de muestra.
7. Adición de luciferina y cuantificación de la
actividad luminiscente de la luciferasa
8. Comparacion de curva de calibrado y
expresión de resultados : CALUX-EQT
METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: BioensayoMétodo DR-Calux: ejemplo
Aceite vegetal fabricación de piensos.30 muestras. pBuena correlacion con HRGC-HRMS
METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: BioensayoMétodo DR-Calux: ejemplo Aceite de pescado
2011/23856 07/27/2011 04:04:52 PM 2011/23856J037
RT: 22.00 - 24.00 SM : 9G
60
80
100
Abun
danc
e
23.2322.11
22.2422.2222.35
NL: 3 .13E3m/z= 321.7936-321.9936 F: + c EI SIM ms [ 303.40-364.48] M S 20110727C07
EQT CALUX 3 25 /22.0 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7 22.8 22.9 23.0 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9
Time (min)
0
20
40
Rel
ativ
e
22 .9722.74
22.47 23.30 23.6523.4023.06
RT: 22.00 - 24.00 SM : 9B
60
80
100
bund
ance
22 .10 23.22
22.23
22 36
NL: 2 .29E3m/z= 319.7965-319.9965 F: + c EI SIM ms [ 303.40-364.48] M S 20110727C07
EQT CALUX= 3.25 pg/gEQT HRGC-HRMS= 0.64 pg/g
22.0 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7 22.8 22.9 23.0 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9Time (min)
0
20
40
Rel
ativ
e Ab 22.36
22.9622.47 22.7323.6522.8422.63 23.4223.05 23.49 23.7023.51 23.75 23.84 23.94
RT: 22.00 - 24.00 SM : 9B
60
80
100
ndan
ce
22 .96 NL: 5.71E5m/z= 331.8300-332.0300 F: + c EI SIM ms [ 303.40-364.48] M S 20110727C07
22.0 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7 22.8 22.9 23.0 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9Time (min)
0
20
40
60
Rel
ativ
e Ab
un
23.40
23.56 23.6523.25 23.73 23.80 23.88 23.9122.3222.2822.21 22.44 22.59 22.72 22.7622.07
RT: 22.00 - 24.00 SM : 9B
80
100
ance
22 .96 NL:7.06E5m/z= 333.8339-334.0339 M S
22.0 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7 22.8 22.9 23.0 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9Time (min)
0
20
40
60
Rel
ativ
e Ab
unda
23 .40
23.6123.5823.13 23.22 23.9623.82 23.8822.3722.34 22.8222.1322.11 22.6322.28 22.5422.42 22.73
20110727C07
METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: BioensayoMétodo ELISA: Enzime-Linked Inmunosorbent Assay
- Las dioxinas presentes en la muestra compitenpor el antígeno de recubrimiento (hapteno 2 3por el antígeno de recubrimiento (hapteno 2, 3,7 – Tricloro 8 – carboxi – dibenzo dioxina) porlos sitios activos en anticuerpos inmovilizados
- Después de un lavado los compuestos nounidos son eliminados
L ió d di i i-La concentración de dioxinas es inversamenteproporcional al color producido
- La obtención del EQT se realiza porLa obtención del EQT se realiza porcomparación con una curva de calibración enEQT
METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: Bioensayo
)E t ió )ExtracciónClean-up
ELISAObtención de EQT
METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: BioensayoCaracterísticas
- Elevada rapidez Placas de 96 platos simultaneos- Elevada rapidez. Placas de 96 platos simultaneos
- Menor necesidad de purificación. Aunque los resultados pueden ser
fuertemente dependientes del mismofuertemente dependientes del mismo
- Elevada sensibilidad. Uso de reducido tamaño de muestra
- Estudio directo de la toxicidad de la muestra
- Coste reducido. Sobre un 50-60% del método de confirmación
- Selectividad comprometida. Depende del perfil de contaminación.
Posibilidad de falsos positivos
- No siempre se utilizan con rigor
- No proporcionan perfil de congéneres. Difícil saber el origen de al
contaminación
METODOS DE SCREENINGMETODOS DE SCREENING
Métodos químicos:Métodos químicos: GCGC--Ion Ion traptrap MS/MSMS/MSGCGC--TQ MS/MSTQ MS/MSGCxGCGCxGC--µECDµECDGCxGCGCxGC TOFTOF
Preparación de muestra GCxGCGCxGC--TOFTOFmuestra
ExtracciónPurificación
AutomatizaciónAutomatización
METODOS DE SCREENING: QuímicosMETODOS DE SCREENING: QuímicosExtracción: PLE (pressurized liquid extraction)
1. Extracción con
disolventes a elevadas
temperaturas y presiones
2. Uso de disolventes de
muy diferente polaridad y
en poco volumen
Extracción soxhlet4 muestras 8-12 h
Extracción PLE12 muestras 2 h
3. Permite incluir una etapa
de purificación dentro de
la extracción
METODOS DE SCREENING: QuímicosMETODOS DE SCREENING: QuímicosExtracción: PLE (pressurized liquid extraction)
Solución total: extracción – purificación - concentración5 muestras: 4 h a falta del análisis5 muestras: 2 dias. Resultados finalesProblema: Coste elevado
METODOS DE SCREENING: QuímicosQExtracción: MSPD (Matrix Solid Phase Disperssion)
1. Matriz disgregada con unagente dispersante
2. Extracción estática ydinámica con eldisolvente adecuado
3. Permite incluir una etapade purificación y eluciónd i t f ide interferencias.
4. Uso combinado dediferentes adsorbentes:biobeads silica alúmina
SIN INSTRUMENTAL
biobeads, silica, alúmina,carbon .
5. Dificultad para un clean-up fino de las sustanciasS S U
FACIL PARA CUALUIERLABORATORIO
up fino de las sustanciasplanas: necesidad de otraetapa
METODOS DE SCREENING: QuímicosQExtracción: MSPD (Matrix Solid Phase Disperssion)
Una posible aplicación: Diseño de un kit basado en QuEChErs
Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe
Extracción y purificacióngruesa: grasas
Aislamiento de PCBs y DIOX
SIN INSTRUMENTAL
Clean-up final
MIPsS S UFACIL PARA CUALUIERLABORATORIO
MEPS
METODOS DE SCREENING: QuímicosQPURIFICACION: Polímeros de Impresión Molecular
- Preparación de un polímero altamente entrecruzadop pen presencia del analito (plantilla) para el cual se deseael reconocimiento selectivo.- Se pone inicialmente en contacto el analito con unmonómero adecuado con el fin de formar un complejop jde pre-polimerización.- Posteriormente se le añade el entrecruzante, eliniciador y el disolvente en el que se lleva a cabo lapolimerización (porogen).p (p g )- Una vez obtenido el polímero, se extrae el analitoplantilla, liberando los sitios de reconocimientoespecífico.- La plantilla puede ser el propio analito (posiblesp p p p (pproblemas de fondo) o moléculas de estructura similar.- Se pueden preparar estructuras solo para TCDD(como representante de EQT) o todos los congéneres.- Necesario calibrar para cada matriz.p
METODOS DE SCREENING: QuímicosQPURIFICACION: MicroExtraction by Packed Sorbent
METODOS DE SCREENING: QuímicosQANALISIS
C t d dC t d dGCGC--Ion Ion traptrap MS/MS:MS/MS:
-- Coste moderadoCoste moderado-- Sensibilidad aceptableSensibilidad aceptable-- Selectividad moderadaSelectividad moderada-- Selectividad moderadaSelectividad moderada-- Resolución bajaResolución baja-- Robustez bajaRobustez bajajj
-- Coste medioCoste medioSensibilidad buenaSensibilidad buena
GCGC--Triple Triple cuadrupolocuadrupoloMS/MS:MS/MS:
-- Sensibilidad buenaSensibilidad buena-- Selectividad moderadaSelectividad moderada-- Resolución 0.7 Resolución 0.7 amuamu-- Robustez altaRobustez alta-- rapidez elevadarapidez elevada
CONCLUSIONES
11 Los métodos deLos métodos de screeningscreening resultan un herramienta útil para laresultan un herramienta útil para la1.1. Los métodos de Los métodos de screeningscreening resultan un herramienta útil para la resultan un herramienta útil para la obtención de manera rápida y asequible de un gran numero de obtención de manera rápida y asequible de un gran numero de datos sobre los niveles de dioxinas y datos sobre los niveles de dioxinas y PCBs.PCBs. Son muy útiles en las Son muy útiles en las crisiscrisiscrisis.crisis.
2.2. De manera rutinaria deben de ser usados con responsabilidad. Lo De manera rutinaria deben de ser usados con responsabilidad. Lo mejor son programas combinados con HRGCmejor son programas combinados con HRGC--HRMS.HRMS.
3.3. Deben investigarse a fondo y validarse par cada matriz. Conocer el Deben investigarse a fondo y validarse par cada matriz. Conocer el perfil de congéneres y evitar falsos negativos y positivos.perfil de congéneres y evitar falsos negativos y positivos.
44 M h d l l t d l ét d dM h d l l t d l ét d d ii ii4.4. Muchos de los elementos de los métodos de Muchos de los elementos de los métodos de screeningscreening sirven para sirven para hacer también mas rápidos los métodos de confirmación.hacer también mas rápidos los métodos de confirmación.
5.5. Además de las metodologías, es necesaria la inversión en personal Además de las metodologías, es necesaria la inversión en personal g , pg , pcualificado cualificado
AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS
PERSONAL DE LA UTCMUCHASPERSONAL DE LA UTC
CONSUELO LÓPEZ BOLAÑOPAULA MARTÍNEZ TOJEIRO
MUCHAS GRACIAS PORPAULA MARTÍNEZ TOJEIRO
CRISTINA MONTOIORO PEREIROVERONICA FERNANDEZ-VILLARRENAGA
GRACIAS POR SU ATENCIÓNSU ATENCIÓN