dipl.-biochem. m. astrid walter - hu-berlin.de
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D i s s e r t a t i o n
zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Chemie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Dipl.-Biochem. M. Astrid Walter
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Stefan Hecht, Ph.D.
Gutachter: 1. Prof. Dr. Ulrich Panne
2. PD Dr. Michael G. Weller
Tag der mündlichen Prüfung: 30. Januar 2014
Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von November 2007 bis April 2011 im
Arbeitskreis von Prof. Dr. Ulrich Panne, Institut für Chemie, Humboldt-Universität
zu Berlin, durchgeführt.
“Meiner Beobachtung nach neigen die Leute dazu zurückzuschlagen, wenn man sie haut…”
Charlie Brown (Charles M. Schulz, Peanuts)
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Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung und Charakterisierung der ers-
ten Antikörper gegen Triacetontriperoxid (TATP), einem hoch empfindlichen und
unkonventionellen (nicht-kommerziellen) Initialsprengstoff. Entscheidend dafür
war die Synthese eines TATP-imitierenden Haptens, welches die typische nona-
gonale Struktur des TATP mit seinen drei Peroxid- und sechs Methylgruppen
nahezu perfekt nachbildet, aber den Vorzug einer zusätzlichen Carboxygruppe
zur kovalenten Kopplung an Proteine aufweist. Dadurch konnte das TATP-
Hapten an Rinderserumalbumin (BSA) gebunden werden, um ein immunogenes
Konjugat zu erzeugen, welches die erfolgreiche Immunisierung zweier Säuge-
tierarten, Maus und Kaninchen, ermöglichte.
Der Verlauf der In-vivo-Immunisierungen wurde durch die Analyse der Tier-
seren in regelmäßigen Abständen mittels enzymgekoppeltem Immunoassay
(ELISA) verfolgt. Die polyklonalen Antikörper beider Spezies waren ungewöhnlich
selektiv gegenüber TATP. Jedoch unterschied sich die Affinität der Antikörper der
zwei Spezies um das 5 000-fache, wobei die Kaninchenseren den Mausseren
überlegen waren. Entsprechend war auch die mit Kaninchenserum erreichbare
TATP-Nachweisgrenze von 0.01 µg L-1 deutlich besser im Vergleich zu 50 µg L-1,
die mit Mausserum erzielt wurden. Der Messbereich des TATP-ELISA mit Kanin-
chenserum deckte zudem mehr als vier Zehnerpotenzen ab, wie mittels Präzisi-
onsprofil bestimmt wurde.
Die erhaltenen TATP-Antikörper aus Kaninchen stehen damit Anwendungen in
Nachweissystemen für die sehr empfindliche Detektion von TATP zur Verfügung,
die u. a. in sicherheitsrelevanten Bereichen zum Einsatz kommen könnten. Als
erste Anwendung wurde ein TATP-ELISA realisiert, der im Rahmen dieser Arbeit
ausführlich optimiert wurde. Außerdem wurden erste Schritte zur Entwicklung
eines TATP-Schnelltests (LFA) unternommen. Weitere Biosensoren auf Grundla-
ge der neu entwickelten TATP-Antikörper sind denkbar.
VI
VII
The present work decribes the production and characterization of the first anti-
bodies against triacetone triperoxide (TATP), a highly sensitive and improvised
(non-commercial) primary explosive. Crucial to this work was the synthesis of a
TATP-related hapten that mimics almost perfectly the typical nonagonal structure
of TATP with its three peroxide and six methyl groups. Advantageously, it has an
additional carboxylic acid group, which provides a conjugation site for covalent
attachment to proteins. Thus, the TATP hapten could be linked to bovine serum
albumin (BSA) to produce an immunogenic conjugate, allowing the successful
immunization of two different mammalian species, mouse and rabbit.
The in vivo immunization progress was followed by periodically analyzing the
animals’ sera using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The polyclo-
nal antibodies of both species were remarkably selective to TATP. The affinity of
these TATP-antibodies was, however, different between the two species, with the
rabbit sera showing an affinity about 5 000-fold superior than the murine one.
Consequently, the TATP detection limit of 0.01 µg L-1 was considerably better
using the sera from rabbit in contrast to 50 µg L-1 when mouse serum was used.
The working range of the TATP-ELISA with rabbit sera covers more than four
decades, calculated from a precision profile.
The obtained TATP antibodies from rabbit are now available for applications in
highly sensitive detection systems for TATP, which could be employed, among
others, in security-relevant areas. The first application was the realization of a
TATP-ELISA, which was extensively optimized within the course of this work.
Furthermore, the first steps towards the development of a lateral flow assay
(LFA) targeting TATP were taken, making conceivable further biosensor plat-
forms based on the newly developed TATP antibodies.
VIII
IX
Diese Arbeit konnte nur durch die vielfältige Hilfe vieler Kolleginnen und Kollegen
und Freunde gelingen, wofür ich mich aufrichtig bei allen Beteiligten bedanke.
Neben viel Mühe und Zeit, die eine Promotion im Labor und am Schreibtisch er-
fordert, hatte ich viel Freude und Spaß und habe sehr gern in der Fachgruppe
Bioanalytik gearbeitet. Ein Dankeschön auch an alle nicht namentlich genannten
Kolleginnen und Kollegen für die gute Zusammenarbeit.
Mein Dank gilt an erster Stelle Dr. Michael G. Weller für das Vertrauen (beim
Überlassen des spannenden Themas) und die fachliche Unterstützung sowie die
Zeit und den immer währenden Zuspruch, die er stets für mich erübrigt hat. Ich
danke der BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung, insbesondere
Prof. Dr. Ulrich Panne, für die Möglichkeit, meine Doktorarbeit dort anzufertigen
und ihre Begutachtung zu übernehmen. Bei Dr. Rudolf J. Schneider bedanke ich
mich vor allem für die organisatorische Hilfe, insbesondere rund um die erste
Immunisierung der Mäuse, jedoch auch für jeglichen fachlichen Beistand seiner-
seits weit darüber hinaus.
Bei Karin Schultze bedanke ich mich herzlich für die sorgfältige Durchführung
und Auswertung der GC-MS-Versuche und bei Dr. Andreas Lehmann für die
Entwicklung der grundlegenden HPLC-Methode mittels HPLC-MS sowie für das
aufmerksame und kritische Hinterfragen meiner Vorhaben.
Ich danke Sabine Flemig für die MALDI-TOF-MS-Messungen, Kristin Petsch
für das Mitwirken und die Ausdauer bei den Untersuchungen der Hybridomzell-
kulturen und Nadine Scheel für die vielen Tage, die sie für mich an der HPLC
verbracht hat. Diesen dreien danke ich überdies besonders für die Erleichterung
und zuverlässige Hilfe im Laboralltag, die, neben dem Übernehmen von Bestel-
lungen von Chemikalien und Verbrauchsmaterialien, der Aufrechterhaltung der
Laborordnung und vielem mehr, auch gern mal spontan nötig und ermöglicht
wurde.
Für die Messung und Auswertung der NMR-Daten sowie für die äußerst gedul-
dige Erklärung dieser bin ich Dr. Dietmar Pfeifer sehr dankbar. Werner Kraus
danke ich für die Einkristallstrukturanalysen und der in diesem Zusammenhang
sehr angenehmen Zusammenarbeit mit Dr. Franziska Emmerling, deren Unter-
stützung bei meiner ersten Veröffentlichung unverzichtbar war. Für die Aufnahme
des hochaufgelösten Massenspektrums danke ich Dr. Michael von Löwis (Hum-
boldt-Universität zu Berlin).
Vielen Dank an meine Praktikanten und den Auszubildenden bzw. studenti-
schen Hilfskräften der Arbeitsgruppe Immunchemische Methoden, Steffen
Ramin, Susi Plötz, Anne Möller, Denise Thurmann, und André Grasnick für Ihr
Engagement und die endlosen ELISA, die ich allein nie geschafft hätte, sowie für
die wöchentliche Pufferherstellung und vielen weiteren Tätigkeiten, die sie mir
abgenommen haben.
X Danksagung
Nicht zu vergessen ist die Solidarität der Mit-Doktoranden, deren Kooperation
sich nicht nur auf den Schokoladen-Austausch begrenzte. Ich danke Dr. José
João Carvalho, Dr. Arnold Bahlmann, Dr. Charlotte Giesen, Dr. Julia Grandke,
Mandy Hecht, Steffen Ramin und Heike Pecher für eine schöne, gemeinsame
Zeit und illustre Mensa-Runden, denen auch Dr. Ana Descalzo López und
Dr. Knut Rurack angehörten. Das Mitteilen von Erfahrungen und Ratschlägen
sowie die Diskussion von Ideen und Ergebnissen sind ein entscheidender Vorteil
für die gegenseitige Motivation und das Vorankommen der Arbeit gewesen.
Ein Dankeschön geht ebenfalls an Anka Kohl für die immer schnelle IT-
Betreuung und technische Hilfe. Weiterhin danke ich den Sekretariatsdamen,
insbesondere Christin Heinrich und Juliane Schaefer, die stets gut gelaunt und
hilfsbereit für alle nicht wissenschaftlichen Probleme und Fragen ansprechbar
waren.
Meinen neuen Kollegen in der 2.3, vor allem Dr. Alexander von Oertzen danke
ich dafür, dass sie mir auf den letzten Metern zur Promotion verständnisvoll den
Rücken freigehalten haben.
Sehr dankbar bin ich außerdem allen, die diese Arbeit Korrektur gelesen ha-
ben, vor allem Dr. Michael G. Weller, meiner Mutter, Dr. Julia Grandke und ins-
besondere Dr. Malte Behrends.
Ich danke auch meinen Freunden außerhalb der BAM, darunter insbesondere
Heike, José, Julia, Nicole, Peter und Simone für ermutigende, verständnisvolle
Worte und erholsame Ablenkungsmanöver zum Teil schon seit der Studienzeit
und noch weit davor. Allen voran aber Tine, der besten Beste-Freundin, die man
sich vorstellen kann. Außerdem danke ich meinen Eltern und meiner Schwester
Annemarie, auf deren Rückhalt ich mich immer verlassen kann und die mich bei
allen Entscheidungen unterstützen, sowie meinem Großvater, der anhaltend Inte-
resse an meiner wissenschaftlichen Arbeit zeigt.
Vielen herzlichen Dank Ihnen/Euch allen!
Astrid
XI
Kurzzusammenfassung ....................................................................................... V
Abstract ............................................................................................................. VII
Danksagung ....................................................................................................... IX
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................... XI
Abkürzungsverzeichnis und Glossar ................................................................. XIII
Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen ..................................................... XVII
1 Einleitung ........................................................................................................ 1
2 Grundlagen ..................................................................................................... 7
2.1 Triacetontriperoxid ................................................................................ 7
2.1.1 TATP – Ein Überblick ..................................................................... 7
2.1.2 TATP-Analytik .............................................................................. 14
2.2 Gewinnung von Antikörpern ................................................................ 18
2.2.1 Haptene ....................................................................................... 18
2.2.2 Antikörper .................................................................................... 19
2.2.3 Immunisierung ............................................................................. 21
2.2.4 Alternativen .................................................................................. 24
2.3 Antikörper-basierte Nachweissysteme (Immunoassays) ..................... 26
2.3.1 Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA) ................................... 26
2.3.2 Immunchromatographischer Schnelltest (LFA) ............................ 30
2.3.3 Biosensoren ................................................................................. 31
2.3.4 Möglichkeit des Nachweises aus der Gasphase .......................... 32
3 Experimenteller Teil ...................................................................................... 35
3.1 Materialien .......................................................................................... 35
3.1.1 Chemikalien ................................................................................. 35
3.1.2 Proteine ....................................................................................... 38
3.1.3 Puffer und Lösungen .................................................................... 39
3.1.4 Verbrauchsmaterial ...................................................................... 41
3.1.5 Geräte .......................................................................................... 43
3.1.6 Computerprogramme ................................................................... 45
3.2 Sicherheitshinweis .............................................................................. 46
3.3 Methoden ............................................................................................ 46
3.3.1 TATP-Synthese und weiterführende Untersuchungen ................. 46
3.3.2 Synthese des TATP-Haptens ....................................................... 50
XII Inhaltsverzeichnis
3.3.3 Herstellung von Immunogenen und anderen TATP-
Proteinkonjugaten ........................................................................ 51
3.3.4 Immunisierungen ......................................................................... 58
3.3.5 Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA) ................................... 61
3.3.6 Immunchromatographischer Schnelltest (LFA)............................. 70
4 Ergebnisse und Diskussion ........................................................................... 73
4.1 Untersuchungen zu Triacetontriperoxid (TATP) ................................... 73
4.2 TATP-Hapten ...................................................................................... 80
4.3 Immunogene und andere Proteinkonjugate ......................................... 84
4.4 Immunisierungsverlauf ........................................................................ 88
4.5 Untersuchung von Faeces ................................................................... 98
4.6 Analytische Kenndaten des TATP-ELISA .......................................... 101
4.7 BSA-Zusatz und andere Optimierungen ............................................ 114
4.8 Konformeren-ELISA .......................................................................... 126
4.9 Lateral Flow Assay (LFA) .................................................................. 128
5 Zusammenfassung und Ausblick ................................................................. 135
6 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 139
Publikationen ........................................................................................................ i
Erklärungen ......................................................................................................... iii
XIII
ABTS 2,2′-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonat
ANFO Ammonium nitrate fuel oil (Gemisch aus porösem Ammoni-
umnitrat mit Diesel- oder Mineralöl)
APCI Atmospheric pressure chemical ionization (Chemische Ionisa-
tion bei Atmosphärendruck)
ax axial
BALB/c Bagg Albino (spezielle Mäuse-Inzuchtlinie)
Boost Nachimmunisierung
BSA Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)
CAS Chemical Abstracts Service (Datenbankdienst, vergibt die
CAS-Nummern)
CCDC Cambridge Crystallographic Data Centre (Datenbank für Kris-
tallstruktur kleiner Moleküle)
CMC Critical micelle concentration (Kritische Mizellbildungskonzent-
ration)
COSY Correlation spectroscopy (Korrelationsspektroskopie), NMR
cycl zyklisch
D Deuterierungsgrad, NMR
DAD Diodenarraydetektor
DADP Diacetondiperoxid
DCC N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid
DMF N,N-Dimethylformamid
DMNB 2,3-Dimethyl-2,3-dinitrobutan
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
DSC N,N′-Disuccinimidylcarbonat
EC Enzyme Commission numbers (EC-Nummern, numerisches
Klassifikationssystem für Enzyme nach der zu katalysierenden
Reaktion)
EGDN Ethylenglykoldinitrat (Nitroglykol, 1,2-Dinitroxyethan)
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (enzymgekoppelter Im-
munoassay)
EPA United States Environmental Protection Agency (Umwelt-
schutzbehörde der USA)
eq Equatorial (äquatorial)
XIV Abkürzungsverzeichnis und Glossar
ESEM Environmental scanning electron microscope (Variante des
Rasterelektronenmikroskops)
ESI Elektrospray-Ionisation
Fc oder F(c) Crystallizable (constant) fragment (kristallisierbarer Teil eines
Antikörpers, beinhaltet auch den Großteil der konstanten Do-
mänen der beiden schweren Polypeptidketten)
FT-ICR-MS Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry
(Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspek-
trometrie)
GC-MS Gaschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung
H&L Heavy & light chains (Bezeichnung der Polypeptidketten, von
denen je zwei schwere und zwei leichte die Antikörpergrund-
struktur bilden)
Hapten niedermolekulare Verbindung, < 1 500 – 5 000 Da, die ohne
Bindung an einen Trägermolekül selbst nicht immunogen wirkt
HAT Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin (im danach benannten
Selektionsmedium für Hybridomzellen enthalten)
hCG humanes Choriongonadotropin, ein Peptidhormon
HGPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Enzym im
DNA-Stoffwechsel)
HMBC Heteronuclear multiple bond coherence (heteronukleare Mehr-
fachbindungskohärenz), NMR
HME Homemade explosives (nicht-kommerzielle Explosivstoffe,
zumeist aus leicht zugänglichen Chemikalien ohne besondere
Ausrüstung oder Fachwissen herstellbar)
HMTD Hexamethylentriperoxiddiamin (1,6-Diaza-3,4,8,9,12,13-hexa-
oxabicyclo[4.4.4]tetradecan)
HMX High melting explosive/her Majesty's explosive/high-molecu-
lar-weight RDX (Oktogen, 1,3,5,7-Tetranitro-1,3,5,7-tetrazo-
can)
HPLC High performance liquid chromatography (Hochleistungsflüs-
sigkeitschromatographie)
HRP Horseradish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)
HSQC Heteronuclear single quantum coherence (heteronukleare
Einquantenkohärenz), NMR
IC50 Half maximal inhibitory concentration (mittlere inhibitorische
Konzentration)
IED Improvised explosive device (unkonventionelle Spreng- und
Brandvorrichtung)
Abkürzungsverzeichnis und Glossar XV
IgA Immunglobulin A, eine Klasse von Antikörpern, Hauptvertreter
auf Schleimhäuten, in Speichel sowie Tränen
IgG Immunglobulin G, eine Klasse von Antikörpern, die etwa 75%
aller Serumimmunglobuline ausmacht
IgM Immunglobulin M, eine Klasse von Antikörpern, die entschei-
dend bei der primären Immunantwort ist
IMS Ionen-Mobilitäts-Spektrometrie
K Kaninchen
KR Kreuzreaktivität
LFA Lateral flow assay (immunchromatographischer Schnelltest)
Lsg. Lösung
M Maus
MALDI-TOF-MS Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass
spectrometry (Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-
Flugzeitmassenspektrometrie)
MIP Molecularly imprinted polymer (molekular geprägtes Polymer)
NHS N-Hydroxysuccinimid
NIST National Institute of Standards and Technology (Bundesbe-
hörde der Vereinigten Staaten mit Sitz in Gaithersburg, MD,
USA, die u. a. eine Datenbank für Massenspektren unterhält)
NMR Nuclear magnetic resonance spectroscopy (Kernspinreso-
nanzspektroskopie)
OD Optical density (sinngemäß: Extinktion)
OVA Ovalbumin (aus Hühnereiweiß)
PBS Phosphate-buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)
PETN Pentaerythrityltetranitrat (auch Nitropenta oder Pentrit,
1,3-Bis(nitryloxy)-2,2-bis(nitryloxy-methyl)-propan)
Protein A Protein aus der Zellwand von Staphylococcus aureus, bindet
bevorzugt IgG
PTV Programmable temperature vaporizer (temperaturprogram-
mierbarer Verdampfer, Injektortyp bei der GC-MS)
q quartär
RDX Research department explosive/royal demolition explosive
(Hexogen, 1,3,5-Trinitro-1,3,5-triazin)
RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
rpm Revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
RPMI Roswell Park Memorial Institute (das danach benannte Zell-
kulturmedium wurde dort entwickelt)
XVI Abkürzungsverzeichnis und Glossar
RT Raumtemperatur
SAW Surface acoustic wave (akustische Oberflächenwelle)
scFv Single-chain variable fragment (monovalentes Antikörper-
fragment aus den kovalent verbundenen, variablen Domänen
einer schwere und einer leichten Polypeptidkette eines Anti-
körpers)
SELEX Systematic evolution of ligands by exponential enrichment
(Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle
Anreicherung)
SIM Selected ion monitoring (ausgewählte Massen, die bei der
GC-MS registriert werden, Einzelmassen-Registrierung)
SPME Solid phase microextraction (Festphasenmikroextraktion)
SPR Surface plasmon resonance (Oberflächenplasmonenreso-
nanz)
TATP Triacetontriperoxid (trimeres Acetonperoxid oder APEX, Ace-
tonperoxyd oder TCAP, Tricycloacetonperoxid, 3,3,6,6,9,9-
Hexamethyl-1,2,4,5,7,8-hexaoxonan)
TFA Trifluoroacetic acid (Trifluoressigsäure)
THF Tetrahydrofuran
Titer semiquantitatives Maß für die Konzentration einer Antikörper-
präparation (Maß für die spezifische Antikörperkonzentration)
TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin
TNT 2,4,6-Trinitrotoluol (2-Methyl-1,3,5-trinitrobenzol)
UV ultraviolette Strahlung
anti
-IgG sekundärer Antikörper: Antikörper gegen andere Antikörper
(Immunglobuline G)
XVII
Tabellen
Tabelle 2.1: Kenndaten und Eigenschaften von TNT und TATP. ......................... 8
Tabelle 2.2: Nachweisgrenzen von TATP. ......................................................... 14
Tabelle 3.1: Synthetisierte Proteinkonjugate. ..................................................... 52
Tabelle 3.2: Eingesetzte Mengen der Ausgangsstoffe zur Synthese der
Proteinkonjugate mit der NHS-Ester-Methode. ......................................... 54
Tabelle 3.3: Zeitplan der Mausimmunisierung. ................................................... 58
Tabelle 3.4: Zeitplan der Kaninchenimmunisierung. ........................................... 60
Tabelle 3.5: Herstellung der Stammlösungen zur Bestimmung der
Kreuzreaktivität. ........................................................................................ 67
Tabelle 4.1: Konzentration und Kopplungsdichte der TATP-Proteinkonjugate. .. 86
Tabelle 4.2: Affinitätsreifung von Maus 3. .......................................................... 90
Tabelle 4.3: Zahlen zur Fusion von Maus-2- und -3-Milzzellen (Schätzungen). . 92
Tabelle 4.4: Affinitätsreifung von Kaninchen 1. .................................................. 94
Tabelle 4.5: Affinitätsreifung von Kaninchen 2. .................................................. 96
Tabelle 4.6: Nachweisgrenzen des TATP-ELISA mit Kaninchen- und Maus-3-
Seren. ..................................................................................................... 101
Tabelle 4.7: Messbereich des TATP-ELISA mit Boost-11-Kaninchenseren. ..... 103
Tabelle 4.8: Kreuzreaktivität des TATP-ELISA gegenüber ausgewählten
Explosivstoffen. ...................................................................................... 106
Tabelle 4.9: Kreuzreaktivität des TATP-ELISA gegenüber Strukturanaloga,
bezogen auf TATP. ................................................................................. 107
Tabelle 4.10: Toleranz des TATP-ELISA gegenüber Lösungsmitteln und
Wasserstoffperoxid. ................................................................................ 111
Tabelle 4.11: Einfluss von Methanol in TATP-Kalibrierlösungen auf den TATP-
ELISA. .................................................................................................... 112
Tabelle 4.12: Einfluss von BSA und Guardian-Stabilisator in HRP-Konjugat-1-
Verdünnungen auf den TATP-ELISA. ..................................................... 115
Tabelle 4.13: Einfluss der BSA-Menge in HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf
den TATP-ELISA. ................................................................................... 116
Tabelle 4.14: Einfluss von BSA in Serum- und HRP-Konjugat-1-Verdünnungen
auf den TATP-ELISA. ............................................................................. 116
Tabelle 4.15: Vergleich der hergestellten HRP-Konjugate im TATP-ELISA...... 119
Tabelle 4.16: Vergleich von frischer und konservierter Plattenbeschichtung für
den TATP-ELISA. ................................................................................... 123
XVIII Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen
Tabelle 4.17: Einfluss von Tween 20 in TATP-Kalibrierlösungen auf den TATP-
ELISA. .................................................................................................... 125
Tabelle 4.18: Einfluss der Inkubationstemperatur des Kompetitionsschritts auf
den TATP-ELISA. ................................................................................... 126
Abbildungen
Abbildung 1.1: Kugel-Stab-Modell des TATP. ...................................................... 3
Abbildung 1.2: TATP (links) im Vergleich zu Haushaltszucker (Saccharose,
rechts). ....................................................................................................... 4
Abbildung 2.1: Reaktionsmechanismus der Darstellung von TATP und (in grau
gehalten) DADP (nach [85]). ..................................................................... 10
Abbildung 2.2: Die Konformere von TATP. ........................................................ 13
Abbildung 2.3: Schematische Darstellung eines Antikörpers (IgG). .................... 19
Abbildung 2.4: Schema des direkten und indirekten TATP-ELISA. .................... 29
Abbildung 3.1: Schematische Darstellung der TATP-Synthese. ......................... 47
Abbildung 3.2: Schematische Darstellung der TATP-Hapten-Synthese. ............ 51
Abbildung 3.3: Schematische Darstellung der TATP-Proteinkonjugat-Synthese
über die Gemischte-Anhydrid-Methode. .................................................... 53
Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der TATP-Proteinkonjugat-Synthese
über die NHS-Ester-Methode. ................................................................... 55
Abbildung 3.5: Schematische Darstellung der HMTD-Synthese. ........................ 68
Abbildung 3.6: Schema des Aufbaus eines LFA-Teststreifens für TATP. ........... 70
Abbildung 4.1: TATP-Kristall. ............................................................................. 74
Abbildung 4.2: Kinetische Untersuchung der Umwandlung von C2- zu D3-TATP
mittels HPLC. ............................................................................................ 77
Abbildung 4.3: Kugel-Stab-Modell des TATP-Haptens. ...................................... 80
Abbildung 4.4: Chromatogramm zur Reinigung des TATP-Haptens per HPLC
mittels binärem Gradienten aus Acetonitril/Methanol (10:1) und Wasser mit
0.1% (v/v) TFA aus dem bereits vorgereinigten Syntheseansatz. ............. 82
Abbildung 4.5: Überlagerung der röntgenkristallographisch bestimmten
Strukturen von TATP-Hapten (schwarz) und TATP (violett). ..................... 83
Abbildung 4.6: Reinigung der TATP-Proteinkonjugate über PD-10-Säulen mit
photometrischer Kontrolle der Fraktionen und anschließender
Proteinbestimmung (kleine Grafik) der vereinten Faktionen (violett) der am
Beispiel des Immunogens 3. ..................................................................... 85
Abbildung 4.7: MALDI-TOF-Massenspektren (Ausschnitte) ausgewählter TATP-
Proteinkonjugate. ...................................................................................... 87
Abbildung 4.8: Entwicklungsverlauf des Serums von Maus 3 im ELISA während
der Immunisierung. ................................................................................... 89
Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen XIX
Abbildung 4.9: Entwicklungsverlauf des Serums von Kaninchen 1 im ELISA
während der Immunisierung. .................................................................... 94
Abbildung 4.10: Entwicklungsverlauf des Serums von Kaninchen 2 im ELISA
während der Immunisierung. .................................................................... 95
Abbildung 4.11: Nachweis von TATP-Antikörpern in Extraktionen von Maus-3-
Faeces. Obere Kurve: Boost-8-Serum; untere, parallel verlaufende Kurven:
Extraktionen.............................................................................................. 99
Abbildung 4.12: Präzisionsprofil (violett) aus einer ELISA-Kurve (schwarz) mit
dem Serum von Kaninchen 1 (Boost 11). ............................................... 102
Abbildung 4.13: Präzisionsprofil (violett) aus einer ELISA-Kurve (schwarz) mit
dem Serum von Kaninchen 2 (Boost 11). ............................................... 103
Abbildung 4.14: Bestimmung der Kreuzreaktivität im ELISA mit Kaninchen-2-
Boost-7-Serum (Auswahl). ...................................................................... 110
Abbildung 4.15: Einfluss von HRP und OVA auf den ELISA. ........................... 117
Abbildung 4.16: TATP-ELISA mit Kaninchenserum ohne -Kaninchen-IgG-
Beschichtung und mit Serumvorverdünnungen in unterschiedlichen
Medien. ................................................................................................... 122
Abbildung 4.17: TATP-Konformeren-ELISA im direkten Vergleich zum HPLC-
Chromatogramm. .................................................................................... 127
Abbildung 4.18: ESEM-Aufnahmen vor und nach Anwendung der LFA-
Komponenten. ........................................................................................ 129
Abbildung 4.19: LFA für TATP mit Komponenten von Whatman (A) und Millipore
(B). ......................................................................................................... 131
Abbildung 5.1: Kugel-Stab-Modell des TATP-Haptens. .................................... 135
Abbildung 5.2: Vergleich der Kaninchen- und Mausserum-ELISA-Kurven. ...... 136
Einleitung 1
Viele große Entdeckungen und Erfindungen des Menschen haben zwei Seiten,
insbesondere die Explosivstoffe. Sie wurden zunächst zu rein militärischen Zwe-
cken entwickelt und verwendet [1] – ein Trend, der sich erst mit der Einführung
des Dynamits, einem hauptsächlich zivil genutzten Explosivstoff, änderte [2, 3].
Das 1866 von Alfred Nobel entwickelte Gemisch aus Nitroglycerin und ursprüng-
lich Kieselgur trieb den Berg- und Wegebau entscheidend voran. Durch diesen
indirekt konstruktiven Nutzen förderte es daneben die industrielle Revolution [2].
Inzwischen schützen und retten Explosivstoffe beispielsweise in Airbags und als
Medikamente, wie Nitroglycerin als Vasodilatator [4], viele Leben.
Das verbreitete Bedürfnis nach immer besseren Waffen führte ab
460-400 v. Chr. über antike Flammenwerfer und Brandmischungen, z. B. Grie-
chisches Feuer, etwa um 1300 zum ersten Explosivstoff, dem Schwarzpulver,
und letztlich auch zu den heute verwendeten Explosivstoffen [1]. Dieser Entwick-
lungsprozess ist nachvollziehbar, denn zum großen Teil basieren heutige Explo-
sivstoffe auf Verbrennungsvorgängen, die Sauerstoff, auch intramolekular, ver-
brauchen. Die Entstehung der gasförmigen Verbrennungsprodukte, hauptsäch-
lich Kohlenstoffdioxid, Wasserdampf, Kohlenstoffmonoxid, Stickstoff und Stick-
oxide, verläuft dabei jedoch schlagartig. Dadurch nehmen die entstandenen Ga-
se zunächst das Volumen des ursprünglichen Feststoffs ein, was in einem enor-
men Druckanstieg in diesem Bereich resultiert. Bei der dann folgenden Ausdeh-
nung leisten die Gase Volumenarbeit, welche den größten Teil des Zerstörungs-
potenzials dieser hochenergetischen Materialien ausmacht. Diese hohe Reakti-
onsgeschwindigkeit erhalten Explosivstoffe, weil der Sauerstoff nicht aus der um-
gebenden Luft benötigt wird, sondern größtenteils in ihrem Molekül gebunden
vorliegt. Chemisch sind konventionelle Explosivstoffe zumeist auf die Abkömm-
linge der Salpetersäure in Form von anorganischen Nitraten, die zugleich als
Dünger in großen Mengen eingesetzt werden, und von sogenannten Nitroverbin-
dungen (aliphatische und aromatische Verbindungen, Nitramine) und auf Ester
der Salpetersäure beschränkt [2, 3, 5]. Die meisten Explosivstoffe wurden zwi-
schen der Mitte des 19. bis zum Anfang des 20. Jahrhunderts entwickelt. Danach
wurden zumeist neue Formulierungen bekannter Explosivstoffe erprobt, die ver-
mehrt auch Sicherheitsaspekte berücksichtigten, in dem die Explosivstoffe Poly-
mer-gebunden und mit Plastifizierungsmitteln versetzt werden. So sind bis heute
Hexogen (RDX, 1920-1940), Oktogen (HMX, 1943), Nitropenta (PETN, 1894),
Ethylenglykoldinitrat (EGDN, 1870) und Trinitrotoluol (TNT, 1880) die meist ver-
wendeten, militärischen Explosivstoffe (in Klammer: Entwicklungsjahre) [3]. Fast
2 Einleitung
alle gewerblich genutzten Explosivstoffe sind Mischungen von Ammoniumnitrat
mit Brennstoffen (ANFO, ammonium nitrate fuel oil oder Emulsionen) [6].
Einhergehend mit dem Wettrüsten entstanden aber nicht nur neue Explosiv-
stoffe und Waffen, sondern zugleich erhielten viele Bereiche neue Impulse, viel-
leicht allen voran die Materialwissenschaften, die neue und bessere Materialien
z. B. für Panzerungen und den Schutz der Bevölkerung hervorbrachten [2]. In-
zwischen hat sich die Gefahrenlage verändert und aus Frontenkriegen sind heute
globale Bedrohungen geworden. Als Inbegriff hierfür wird oftmals der 11. Sep-
tember 2001 angesehen. Zusätzlich zu klassischer Abwehr oder Sanktionen für
einzelne Staaten oder Bündnisse steht daher heute viel mehr die Prävention zum
Schutz der Zivilbevölkerung im Vordergrund. Häufig geschieht dies durch die
Überwachung von öffentlichen Plätzen und Verkehrsmitteln, wie es sich beson-
ders an den Flughäfen weltweit bemerkbar macht. Dort wird gezielt nach explosi-
onsgefährlichem Material gesucht und das verstärkt schon seit dem Lockerbie-
Anschlag im Dezember 1988 [7, 8]. Infolgedessen wurde u. a. auch die Markie-
rung von plastifizierten Sprengstoffen mit z. B. 2,3-Dimethyl-2,3-dinitrobutan
(DMNB) [9] verpflichtend, was die Detektion der Explosivstoffe mit einem norma-
lerweise sehr geringem Dampfdruck erleichtern soll.
Selbstverständlich lassen sich derartige Vorschriften mit wenig krimineller
Energie umgehen. Zumal Terroristen bereit sind, Sprengstoffe zu benutzen, die
nicht ohne Grund nie für die zivile oder militärische Anwendung eingesetzt wur-
den, und immer neue unkonventionelle Sprengsätze (IED, improvised explosive
device) entwickeln und Verstecke finden [10-13]. Auf die Kreativität von Bomben-
bastlern zu reagieren und das Bauen von IED von vornherein zu verhindern, ist
schwierig, zumal sich entsprechende Gruppierungen global bewegen. Als Reak-
tion darauf werden vor allem Sicherheitskonzepte und –maßnahmen verbessert
und erweitert. Zwar nahmen auch die weltweiten Militärausgaben, die nach dem
Ende des Kalten Krieges Anfang der 1990er sanken, seit 2001 wieder zu [5],
aber die diffuse Angst vor Terrorismus führte daneben zu enormen Kosten bei
Transporten und Personenbeförderung durch die Umsetzung immer neuer
Sicherheitsanforderungen [14], was letztlich der eigentliche Schaden des Terrors
ist. Insbesondere kommen neue Technologien zur Detektion von Explosivstoffen,
von denen in den Medien vor allem die Körperscanner (basierend auf Terahertz-
strahlung) [15, 16] für Aufsehen sorgten, zum Einsatz. Ebenso wurden die För-
derprogramme für Forschung auf sicherheitsrelevanten Gebieten erweitert. So
stellt beispielsweise die Europäische Union allein in ihrem 7. Forschungsrah-
menprogramm insgesamt 1.4 Milliarden Euro verteilt über sieben Jahre für den
Themenbereich 10 „Sicherheitsforschung“ bereit [17].
Das Aufspüren und Identifizieren von konventionellen Explosivstoffen ist auch
in anderen Bereichen relevant, so zum Beispiel beim Umweltschutz, wo es zu-
meist um die Entsorgung von Altlasten geht [18]. Durch die freie Zugänglichkeit
von Informationen über das Internet probieren außerdem Laien Rezepturen zur
Herstellung von Explosivstoffen aus, was allein in Deutschland zu fünf bis zehn
Toten im Jahr führt [19]. Um diese häufig unkonventionellen Explosivstoffe, auch
homemade explosives (HME) genannt, ordnungsgemäß und vor allem sicher
Einleitung 3
vernichten zu können, ist hier eine vorherige Identifizierung notwendig. Einer der
populärsten HME ist Triacetontriperoxid (TATP, Abbildung 1.1), um dessen
Nachweis es in der vorliegenden Arbeit gehen soll. Es ist nicht nur aus leicht er-
hältlichen Haushaltschemikalien herstellbar, sondern seine Synthese ist zudem
sehr einfach. Bei Unachtsamkeit kann es sogar bei der Entsorgung von Abfällen
in einem Chemielabor entstehen, wie 2001 an der Universität Bonn geschehen,
wo dies zu einem Großaufgebot an Spezialeinheiten von Polizei und Feuerwehr
führte [20, 21]. Ferner wurde in Flaschen mit Diisopropylether, die über lange Zeit
lagerten und schließlich explodierten, die Bildung von TATP nachgewiesen [22].
Ein Schnelltest für TATP könnte einerseits durch regelmäßig durchgeführte Kon-
trollen der versehentlichen Entstehung größerer Mengen TATP vorbeugen und
andererseits die Arbeit der Einsatzkräfte und bei der Entsorgung erheblich er-
leichtern, wenn in Verdachtsfällen unverzüglich klar ist, ob es sich um TATP han-
delt.
Abbildung 1.1: Kugel-Stab-Modell des TATP.
TATP spielt, ebenso wie z. B. Hexamethylentriperoxiddiamin (HMTD) und andere
Peroxid-basierte Explosivstoffe, keine wirtschaftliche oder militärische Rolle (sie-
he auch Abschnitt 2.1.1). Es wurde fast ausschließlich als terroristischer Explo-
sivstoff, z. B. in IED und als Initialsprengstoff, bekannt [1, 23-25]. Offizielle Be-
richte über die Verwendung von TATP in Zusammenhang mit kriminellen Aktivitä-
ten gibt es erst seit den 1980er/Anfang der 1990er Jahre. Sie stammen aus dem
Westjordanland [26] und den USA [27, 28]. Besondere mediale Aufmerksamkeit
erlangte u. a. der als „Schuhbomber“ bezeichnete Richard Reid, der 2001 TATP
zum Zünden des PETN in seinem Schuh verwenden wollte [12, 23, 24, 29]. 2007
wurde die sogenannte „Sauerland-Gruppe“ verhaftet, deren große Mengen Was-
serstoffperoxid, mutmaßlich zur Herstellung von TATP, medienwirksam präsen-
tiert wurden [30, 31]. In Dänemark verletzte sich 2011 ein Attentäter beim Bau
einer Briefbombe mit TATP und Metallteilen selbst [32]. Vor allem sollen jedoch
die Anschläge vom 7. Juli 2005 in London, bei denen 56 Menschen starben, mit
TATP in großen Mengen begangen worden sein [23, 24, 33]. Ein Jahr später
konnten weitere Anschläge in London verhindert werden, bei welchen Flugzeuge
mittels Flüssigkeiten – über Flüssigsprengstoffe oder zur Vor-Ort-Synthese für
TATP wurde diskutiert [34, 35] – zum Absturz gebracht werden sollten. Daraufhin
wurde noch im selben Jahr das Mitführen von Flüssigkeiten im Handgepäck ein-
geschränkt [36], wie durch EU-Verordnung Nr. 185/2010 geregelt [37].
4 Einleitung
Die Beliebtheit von TATP bei seinen Verwendern ist nicht nur auf seine preis-
werte Produktion oder seine leichte Zündbarkeit zurückzuführen, sondern wohl
auch auf das Wissen um seine mit üblichen kommerziellen Verfahren schwierige
Detektion [24]. TATP ist, ähnlich Zucker, ein unauffälliger, farbloser Stoff, wie
Abbildung 1.2 veranschaulicht. Seine im Vergleich zu anderen Explosivstoffen
(siehe Tabelle 2.1) geringe Dichte machen es bei Untersuchungen durch
(Dichte-)Anomalie-Detektoren mittels Röntgenstrahlung oder Magnetresonanz
ähnlich unauffällig wie organische Materialien [29]. Durch seine Eigenschaften
als Initialsprengstoff sowie der Reib- und Schlagempfindlichkeit von TATP wird
außerdem kein Zünder benötigt [24], so dass auch Metalldetektoren versagen.
Vor allem aber das Fehlen von für Explosivstoffe typischen Nitrogruppen
(Abbildung 1.1) und seine Instabilität erweisen sich als schwierig für die gängigen
Nachweismethoden, selbst für Spürhunde [24, 38]. Am verbreitetsten sind gas-
chromatographische Methoden oder die Ionen-Mobilitäts-Spektrometrie (IMS).
Erstere werden jedoch aus Kostengründen zumeist ohne Massenspektrometrie-
Kopplung eingesetzt und sind damit für TATP ungeeignet. Letztere wird zur De-
tektion von Explosivstoffen sowie von Drogen gewöhnlich im negativen Modus
betrieben. TATP spricht jedoch nur im positiven Modus an [39].
Abbildung 1.2: TATP (links) im Vergleich zu Haushaltszucker (Saccharose, rechts).
Natürlich gibt es inzwischen zahlreiche weiterentwickelte und neue Methoden,
die einen Nachweis von TATP ermöglichen, wie Tabelle 2.2 in Abschnitt 2.1.2
zeigt. Viele sind bislang aber lediglich im Labor anwendbar oder zu aufwendig
und teuer. Gerade beim Nachweis von Explosivstoffen ist jedoch ein schneller
und zuverlässiger Vor-Ort-Nachweis angebracht, besonders im Falle von TATP,
welches aufgrund seiner Instabilität und Empfindlichkeit nicht transportiert wer-
den darf [40]. Die Anforderungen an ein derartiges Detektionssystem sind vielfäl-
tig: Neben Selektivität und Empfindlichkeit stehen eine leichte Handhabung und
wirtschaftliche Aspekte im Mittelpunkt [7]. Je nach Anwendungsgebiet muss
eventuell auch ein hoher Probendurchsatz möglich sein und dennoch gewährleis-
tet werden, dass es keine falsch-positiven oder falsch-negativen Resultate gibt.
Eine besondere Herausforderung dabei stellen Orte mit vielen Menschen dar,
insbesondere Flughäfen. Nicht nur die Berliner Flughäfen haben seit Jahren stets
steigende Passagierzahlen und zählten letztes Jahr über 25 Millionen Fluggäste
[41]. Der neue Flughafen Berlin Brandenburg BER soll einmal bis zu 45 Millionen
Passagiere abfertigen [42], d. h. es müssen derzeit mehr als ein Passagier pro
Sekunde samt Gepäck kontrolliert werden und später mehr als zwei in der glei-
chen Zeit. Hinzu kommen die unzähligen Substanzen, die in Lebensmitteln,
Einleitung 5
Kosmetika, Kleidung etc. mitgeführt werden und die keine Störfaktoren für die
Detektoren sein dürfen, wie es zuletzt bei den Körperscannern schon durch
Schweiß der Fall gewesen ist [16] oder auch bei harmlosen Produkten wie Honig
[43] beobachtet wurde.
Ziel der Arbeit
Ein neuer Ansatz zur Detektion von TATP wird in dieser Arbeit präsentiert, wobei
hier die einzigartige Struktur des TATP (Abbildung 1.1) ausgenutzt werden sollte.
Die Suche mit Hilfe von Superimposé 1.1 [44, 45] nach Verbindungen mit ähnli-
cher Struktur wie die des dreidimensionalen TATP-Moleküls (CCDC-Datenbank
HMHOCN01 [46]) ergab keine Treffer, so dass ein Nachweissystem, welches
direkt die Struktur des TATP erkennt, eine hohe Selektivität garantieren müsste.
Die Natur kennt solche Systeme, beispielsweise als Rezeptoren und Antikörper,
und erreicht dazu noch eine hohe Empfindlichkeit (durch Affinitätskonstanten von
> 1010 L mol-1 [47]). Eine bioanalytische Detektionsmethode, basierend auf Anti-
körpern, könnte also die Lösung für die Spurenanalytik von TATP sein. Zwar
wurden Immunoassays mit Antikörpern gegen die Explosivstoffe TNT [18, 48-57],
RDX [58, 59] und PETN [60, 61] mehrfach beschrieben, jedoch kam es trotz der
schon 1996 durch die Umweltschutzbehörde der USA (EPA) für TNT [62] und
RDX [63] herausgebenden Methoden bislang nicht zu einem breiten, kommerziel-
len Einsatz. Über die Herstellung und Anwendung von Antikörpern zur Detektion
von HME ist bisher nichts bekannt [64]. Zumal vor allem die Peroxid-basierten
Explosivstoffe instabil sind und daher der Ausgang einer Immunisierung unge-
wiss schien. Entscheidend für die Gewinnung von Antikörpern ist zunächst das
Hapten-Design, von dessen Güte der Nachbildung der TATP-Struktur und Stabili-
tät im immunisierten Organismus schließlich die Qualität der Antikörper bezüglich
der Erkennung des Analyten TATP abhängt. Ehe die TATP-Antikörper dann zur
Gestaltung einer geeigneten Biosensor-Plattform dienen können, müssen sie
hinsichtlich ihrer analytischen Eigenschaften, wie Nachweisgrenze und Kreuzre-
aktivität, charakterisiert werden. Das geschieht gemeinhin mittels enzymgekop-
peltem Immunoassay (ELISA), dessen Entwicklung die Grundlage für weitere
immunchemische Methoden bietet, selbst aber auch schon als Labormethode
zum Nachweis von TATP einsetzbar ist.
7
2.1 Triacetontriperoxid
2.1.1 TATP – Ein Überblick
Historisches
Der Berliner Chemiker Richard Wolffenstein entdeckte 1895 das von ihm Tri-
cycloacetonsuperoxyd genannte TATP eher zufällig und erkannte schnell sein
explosives Potenzial [65]. Dieses versuchte er sprengtechnisch zu nutzen und
meldete im selben Jahr unter der Patenschrift Nr. 84953 die Darstellung von
TATP beim Kaiserlichen Patentamt an [66], ließ das Patent aber schon zwei Jah-
re später wieder fallen [1]. 1925, also dreißig Jahre später, reichten G. Pyl und
die Sprengstoffwerke Dr. R. Nahnsen & Co. AG ein Reichspatent zur Nutzung
von TATP in Initialzündmitteln ein [67]. Im Jahr darauf wurde im Jahresbericht V
der Chemisch-Technischen Reichsanstalt erklärt, dass TATP wegen seiner
Flüchtigkeit, die bereits Wolffenstein auffiel [65], ungeeignet als Initialsprengstoff
ist [68]. Dennoch wurden die Initialsprengstoffeigenschaften des TATP weiter
untersucht [69, 70] und über seinen Einsatz als Zündbeschleuniger in Diesel-
kraftstoffen nachgedacht [71]. TATP kam jedoch aufgrund seiner Sublimationsei-
genschaften und Instabilität nie zur praktischen Verwendung im zivilen oder mili-
tärischen Bereich [1, 6, 72]. Daher unterliegen Acetonperoxide erst – seit 2002 –
durch den Feststellungsbescheid Nr. 413 dem Sprengstoffgesetz [73].
Eigenschaften
Die Gefahr, die von TATP ausgeht, ist nicht zu unterschätzen. Zum einen reagiert
es ähnlich wie Nitroglycerin (Schlagempfindlichkeit: 0.2 Nm [74], vgl. Tabelle 2.1)
äußerst empfindlich auf Schlag und bezüglich der Reibung sogar deutlich emp-
findlicher als Nitroglycerin, das bis zu einer Stiftbelastung von 360 N keine Reak-
tion zeigt [74]. Des Weiteren kann TATP jedoch auch durch statische Elektrizität,
Temperaturerhöhung oder gar spontan explodieren und selbst bei einem Feuch-
tigkeitsgehalt von bis zu 25% noch detonieren [75]. Zum anderen genügen 0.05 g
TATP, um PETN zu initiieren [72]. Seine Sprengkraft wird mit bis zu 88% der
Sprengkraft von TNT angegeben ([24, 25], das TNT-Äquivalent schwankt je nach
Autor und Methode) und liegt in Mischungen mit Ammoniumnitrat sogar leicht
darüber (107%, [76]). Das TNT-Äquivalent wird klassischerweise herangezogen,
8 Grundlagen
um Explosivstoffe bewerten zu können, indem ihre Eigenschaften im Vergleich
mit denen des TNT betrachtet werden (siehe Tabelle 2.1 für TATP).
Tabelle 2.1: Kenndaten und Eigenschaften von TNT und TATP.
TNT TATP
Sekundärsprengstoff Initialsprengstoff
Summenformel C7H5N3O6 C9H18O6
CAS-Nummer 118-96-7 17088-37-8
M 227.13 222.24
Schmelzpunkt 80.8 °C von 91 °C [72] bis 97 °C [65]
Verpuffung ab 300 °C 165°C [77]
Dichte
Kristall: 1.65 g cm-3 [78] geschmolzen: 1.47 g cm-3
1.2 g cm-3 [75, 78]
Dampfdruck
5 × 10-4 Pa (25 °C) [79]
7 Pa (25 °C) [79], Sublima-tion: 68,6 % in 14 Tagen [75], mit Wasserdampf oder Ether flüchtig [77]
Löslichkeit in Wasser
100.5 mg L-1 (25 °C, pH 6.8)
[80] 177 mg L-1 (22 °C) [diese Arbeit]
Gut löslich in
Benzol, Toluol, Aceton, Chloroform [78]
Aceton, Ether, Benzol [65], Tetrachlormethan, Pyridin, Chloroform [75], Ethylacetat, Hexan [77], Toluol [81]
Schwer löslich in
Ethanol, Tetrachlormethan [78]
Methanol, Isopropanol, Gly-cerol [75], Ethanol, Eisessig [77]
Sauerstoffbilanz -73.9% -151.2% [75]
Stickstoffgehalt 18.50% 0.00%
Bleiblockausbauchung 300 cm3/10 g 250 cm3/10 g [72]
Schlagempfindlichkeit 15 Nm 0.3 Nm [72]
Reibempfindlichkeit
keine Reaktion bis 353 N Stiftbelastung
Explosion bei 0.1 N Stiftbe-lastung
Detonationsgeschwin-digkeit
6900 m s-1 ( = 1.6 g cm-3)
5290 m s-1 ( = 1.2 g cm-3) [82]
Kristalle
farblos bis gelb, orthorhom-bisch oder monoklin [78]
farblos, monoklin [77]
Sonstiges
toxisch; krebserzeugendes Potenzial [83]
würziger Geruch [65]
Quelle, soweit nicht anders vermerkt: [84]
Grundlagen 9
Darstellung
Die Synthese von TATP, das auch als trimeres Acetonperoxid, APEX, Aceton-
peroxyd, TCAP, Tricycloacetonperoxid, 3,3,6,6,9,9-Hexamethyl-1,2,4,5,7,8-
hexaoxonan oder 3,3,6,6,9,9-Hexamethyl-1,2,4,5,7,8-hexaoxacyclononan be-
zeichnet wird, ist sehr einfach aus Aceton, Wasserstoffperoxid und etwas Säure
mit ca. 65% Ausbeute [46] durchzuführen, wie der Reaktionsmechanismus in
Abbildung 2.1 veranschaulicht (schematische Darstellung: Abbildung 3.1). Wolf-
fenstein [65] beobachtete, dass die Verwendung von reinem Aceton und destil-
liertem Wasserstoffperoxid nicht zur Bildung von TATP-Kristallen führte, jedoch
nach mehrtägigem bis vierwöchigem Stehen einer Mischung aus Aceton und 10-
bis 50%iger Wasserstoffperoxidlösung bei Raumtemperatur TATP auch ohne
Säurezugabe in sehr geringer Menge kristallisierte. Offensichtlich sind die durch
die Autoprotolyse des Wassers entstehenden Protonen als Katalysator für die
Reaktion ausreichend. Bei Zugabe von Phosphorsäure zu den reinen Ausgangs-
stoffen konnte Wolffenstein [65] die Reaktion zu TATP sofort sehen.
10 Grundlagen
Abbildung 2.1: Reaktionsmechanismus der Darstellung von TATP und (in grau gehalten) DADP
(nach [85]).
Baeyer und Villiger [86, 87] fanden bei ihren Untersuchungen zur Einwirkung des
Caro’schen Reagenz auf Aceton ein dimeres Acetonperoxid (DADP). Sie stellten
weiterhin fest, dass bei der Zugabe von konzentrierten Säuren zu 50%iger Was-
serstoffperoxidlösung und Aceton ein breiiger Niederschlag entstand, der sich bei
der Verwendung von Salzsäure als TATP erwies und bei der Verwendung von
Schwefelsäure als eine Mischung aus dimeren und trimeren Acetonperoxiden.
Einen etwas anderen Weg TATP darzustellen, zeigten Criegee und Metz [88] auf.
Sie ließen ihr neu entdecktes, nicht-zyklisches Triperoxid (1,1‘-Bishydroperoxy-
diisopropylperoxyd) in Aceton mit wasserfreiem Kupfersulfat 14 Tage inkubieren
und fällten TATP anschließend durch die Zugabe von Wasser aus, wobei sie eine
Ausbeute von 80% erzielten. Die Studien über organische Peroxide von Milas
und Golubovic [89] ergaben, dass sich ohne die Anwesenheit einer Säure aus
Aceton und 50%iger Wasserstoffperoxidlösung innerhalb von vier Stunden bei
0 °C oder nach 24 Stunden bei Raumtemperatur (also deutlich kürzere Inkubati-
Grundlagen 11
onszeiten als bei Wolffenstein [65]) keine zyklischen Peroxide bilden, sondern
überwiegend ein bis dahin unbekanntes Diperoxid (2,2-Dihydroperoxypropan)
und in geringer Menge auch das Triperoxid, das ebenfalls von Criegee und Metz
beobachteten [88]. Wird einem Reaktionsansatz aus Aceton und 50%iger Was-
serstoffperoxidlösung jedoch konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, so entste-
hen vier verschiedene Peroxide, darunter auch die beiden bereits genannten (ein
weiteres bleibt unidentifiziert), aber vor allem – zu 90% – TATP.
Neuere Untersuchungen beschäftigten sich mit dem Einfluss der als Katalysa-
tor eingesetzten Säure auf die TATP-Synthese. So analysierten Matyas und
Pachman [90] die Abhängigkeit von Art und Konzentration der verwendeten Säu-
re auf die thermische Stabilität des ungereinigten TATP. Mit Salz- oder Salpeter-
säure beginnt die Zersetzung des Rohprodukts oberhalb von 145 °C, unabhängig
von der eingesetzten Menge. Wird hingegen Schwefel- oder Perchlorsäure bei
der Synthese benutzt, so bewirken dabei höhere Säurekonzentrationen, dass
TATP bereits während des Schmelzens oder schon davor zerfällt. Ab einem mo-
laren Verhältnis von Säure zu Aceton von 1 × 10-2 oder darunter entsteht ein
Produkt, welches die gleiche Stabilität wie mit den beiden ersten Säuren herge-
stelltes oder umkristallisiertes TATP aufweist. Einige Autoren (z. B. [81] und [91])
erwähnen, dass beim Einsatz von Schwefelsäure als Katalysator DADP als Ne-
benprodukt gebildet wird, dessen Entstehung bei der Verwendung von Salzsäure
ausbleibt, wie auch schon von Baeyer und Villiger [87] beschrieben. In vielen
Fällen, selbst bei strukturanalytischen Untersuchungen ohne Umkristallisation
[46], wurde dennoch Schwefelsäure als Katalysator bei der TATP-Synthese ein-
gesetzt, ohne dass die Autoren von der Entstehung des DADP berichteten. Sel-
tener wurde tetrameres Acetonperoxid beobachtet [91], welches nach Jiang et al.
[92] bei der Verwendung von Zinnchloriden (SnCl4·5H2O oder SnCl2·2H2O) ent-
steht. Peña et al. [93] hingegen erkannten einen Einfluss der Temperatur auf die
Bildung von Dimer und Tetramer, welche erst oberhalb von 10 °C neben dem
trimeren Acetonperoxid entstehen. Auch die Verwendung zu hoch konzertierter
Säuren hat ihrer Beobachtung nach diesen Effekt, wobei hier ebenfalls die Wär-
meentwicklung beim Mischen eine Rolle spielen könnte. Wird die Temperatur des
Syntheseansatzes unter 5 °C gehalten, so ist TATP das einzige Produkt.
Zersetzung/Zerfall
Beim Erwärmen oder längerer Einwirkung mit verdünnter Schwefelsäure zerfällt
TATP quantitativ wieder in seine Ausgangsstoffe Aceton und Wasserstoffperoxid
[65, 77], was daher auch eine gute Methode zur Entsorgung von kleineren Men-
gen TATP ist. Die Behandlung mit anderen Säuren wie Essig- (1 M) [94] oder
Salzsäure (37%) [95, 96] führt ebenfalls zum Zerfall von TATP. Armitt [96] schlug
für die Schwefelsäure- (35%) sowie die Salzsäure-katalysierte Zersetzung von
TATP außerdem zwei mögliche Mechanismen vor. Im Falle der Schwefelsäure
kann dabei in einem Zwischenschritt auch vorübergehende DADP gebildet wer-
den, ehe Aceton und Wasserstoffperoxid entstehen. Bei der Verwendung von
Salzsäure könnten zusätzlich chlorierte Aceton-Derivate resultieren. Allerdings ist
der Einsatz von Säuren, insbesondere konzentrierten, nur für Mengen von bis zu
12 Grundlagen
etwa einem Gramm TATP ratsam, da die Reaktion von Oxley et al. [97] als
exotherm eingeschätzt wurde und in größerem Maßstab zur Detonation des
TATP führen kann. Stattdessen zeigten sie, dass der Einsatz von ZnSO4 und
CuCl2 in Kombination mit Zink oder Kupfer und weiteren Salzen eine Vernichtung
von TATP-Lösungen bei Raumtemperatur innerhalb von 24 Stunden ermöglicht,
wobei ein Ansäuern der Lösung diesen Prozess beschleunigt. Ähnliches wurde
bereits zuvor von Bellamy [81] mit SnCl2·2H2O versucht, jedoch musste hier zu-
sätzlich die TATP-haltige Lösung (u. a. mit Toluol) auf 65 °C erwärmt werden.
Eine weitere, wenn auch weniger effiziente Möglichkeit, TATP zu zersetzen, ist
die UV-Bestrahlung [98-101]. Auch hierbei entsteht Wasserstoffperoxid, wenn-
gleich keine Angaben gemacht wurden, wie schnell oder vollständig die Reaktion
abläuft.
Andere Methoden wie das Abbrennen von TATP (gemeinsam mit brennbaren
Lösungsmitteln) sind zwar effizienter und schneller bei seiner Vernichtung, ber-
gen aber große Gefahren, da es zu unkalkulierbaren Detonationen kommt [81].
Auch eine vorsichtige thermische Zersetzung hat sich nicht durchgesetzt, da hier
selbst nach 12 Tagen unter Rückfluss in Toluol (111 °C) noch TATP-Reste vor-
handen waren [81]. Auch Oxley et al. [102] untersuchten die thermische Zerset-
zung von TATP bei 150-230 °C unter verschiedenen Bedingungen, wobei das
Hauptzersetzungsprodukt immer Aceton war. Während in protischen Lösungsmit-
teln und in der kondensierten Phase fast ausschließlich Aceton freigesetzt wurde,
entstanden in der Gasphase daneben Essigsäuremethylester bzw. bei höheren
Temperaturen Kohlenstoffdioxid. In geringem Umfang wurde auch Essigsäure
sowie Verbindungen aus der Reaktion mit Methylradikalen beobachtet. Explizit
wurde darauf hingewiesen, dass während des Zerfalls von TATP kein DADP ge-
funden wurde. Bei dieser Betrachtung nahmen die Autoren stets an, dass der
Zerfall von TATP durch die homolytische Spaltung einer der Peroxidgruppen be-
ginnt.
Dubnikova et al. [46] untersuchten den wohl interessantesten Aspekt der Zer-
setzung von TATP – seine Explosion. Sie postulierten, dass die Explosion von
TATP eher eine Zerfallsreaktion als ein Oxidationsvorgang ist und nicht wie bei
anderen Explosivstoffen ein Großteil der Energie durch exotherme Reaktionen
freigesetzt wird. Dabei bilden sich aus einem TATP-Molekül vier gasförmige Mo-
leküle, ein Ozon- und drei Aceton-Moleküle, was mit einer enormen Volumen-
ausdehnung einhergeht und die Zunahme der Entropie des gasförmigen gegen-
über dem festen Zustand bewirkt.
Struktur
TATP besteht aus drei ringförmig angeordneten Peroxidgruppen, welche jeweils
durch ein Kohlenstoffatom voneinander getrennt sind. Zusammen bilden sie ein
Nonagon. An den drei ringständigen Kohlenstoffatomen sind jeweils zwei Methyl-
gruppen lokalisiert (Abbildung 1.1 und Abbildung 2.2). Diese Struktur wurde be-
reits von Wolffenstein 1895 gezeichnet [65]. Die erste Kristallstrukturanalyse er-
folgte 1969 durch Groth [103] (CCDC-Datenbank: HMHOCN) und wurde 2005
Grundlagen 13
durch Dubnikova et al. [46] (CCDC-Datenbank: HMHOCN01 oder CCDC-
241973) bestätigt. Den monoklinen Kristallen wurde die Raumgruppe P21/c zu-
geordnet und sie enthalten vier Moleküle je Elementarzelle ohne Einschluss von
Lösungsmittel. Die Konformation des TATP-Moleküls, welches die Symmetrie
eines regelmäßigen Dreiecks (D3) aufweist, wurde als Twist-Wannen-Sessel be-
schrieben (Abbildung 2.2).
Das Vorhandensein eines weiteren, bei Raumtemperatur stabilen TATP-
Konformers wurde erst 2002 bei Widmer et al. [104] deutlich. Dort wurden zu-
nächst noch unbekannterweise mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC) zwei TATP-Konformere voneinander getrennt. Die im Anschluss an die
Fraktionierung erfolgte Untersuchung per Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)
erbrachte nur wenig Aufschluss über die Identität des zweiten Signals im HPLC-
Chromatogramm einer reinen TATP-Lösungen, da die Trennung scheinbar nicht
vollständig war. Weitere HPLC-Untersuchungen zeigten den Grund: Zwischen
dem ersten, größeren Signal und dem nachfolgenden, kleineren stellte sich trotz
der Trennung immer wieder ein Verhältnis von 15:1 ein. Die Autoren schlossen
daraus, dass es sich um ein weiteres Konformer des TATP handeln muss, zumal
ein Jahr zuvor halbempirische Betrachtungen von Yavari et al. [105] auf die Exis-
tenz eines Twist-Sessel-Sessel-Konformers von TATP (Abbildung 2.2) hinwie-
sen. Dieses besitzt eine C2-Symmetrie, die einer Punktspiegelung entspricht, und
eine nach den Berechnungen in [105] um 3.4 kJ mol-1 höhere Bildungsenthalpie
als das D3-Konformer.
Abbildung 2.2: Die Konformere von TATP.
14 Grundlagen
Mit den energetischen Unterschieden zwischen D3- und C2-TATP beschäftigten
sich auch Denekamp et al. [106]. Ihre theoretisch ermittelte Energiedifferenz von
1.85 kcal mol-1 (7.7 kJ mol-1) ist gut doppelt so hoch wie die von Yavari et al.
[105] und zeigt ebenfalls, dass das D3-TATP mit dem geringeren Energiegehalt
das stabilere Konformer von beiden ist. Außerdem postulierten Denekamp et al.
[106] einen eventuellen Flip-Flop-Mechanismus für die Umwandlung der TATP-
Konformere ineinander und berechneten die Aktivierungsenergie zum Überwin-
den der Umwandlungsbarriere in der Gasphase auf E = 26.3 kcal mol-1
(110 kJ mol-1).
2.1.2 TATP-Analytik
Die Identifizierung und Quantifizierung von Explosivstoffen kann über jede nur
denkbare Methode erfolgen, von klassischen chromatographischen und massen-
spektrometrischen über optische, elektrochemische sowie nanotechnologische
zu bioanalytischen und weiteren Anwendungen. Übersichtsartikel und Bücher
[107-114] darüber sind in großer Zahl erschienen und dennoch gibt es weiterhin
Bedarf für Messsysteme, die insbesondere den Ansprüchen der Sicherheits-
überwachung bezüglich Schnelligkeit, Zuverlässigkeit sowie der möglichst berüh-
rungslosen Detektion von Explosivstoffen genügen [115] und die auch unkonven-
tionelle Explosivstoffe mit einschließen [116]. Viele Entwicklungen beziehen sich
zunächst auf TNT, das häufig auch als Vergleichsgröße für andere Explosivstoffe
(Abschnitt 2.1.1) herangezogen und dementsprechend in späteren Kapiteln stets
als Beispiel dienen wird.
Einleitend wurden bereits die Schwierigkeiten erwähnt, die die üblichen, z. B.
auf Nitrogruppen ausgerichteten, Detektionsverfahren für Explosivstoffe mit
TATP haben [114]. In den letzten zehn Jahren hat jedoch die Anzahl der Metho-
den zum Nachweis von TATP in erheblichem Maße zugenommen, wie die Über-
sichtsartikel von Schulte-Ladbeck et al. [117] und Burks und Hage [118, 119]
zeigen. Auch das National Institute of Standards and Technology (NIST) brachte
erst vor Kurzem ein Referenzmaterial SRM 2907 Trace Terrorist Explosives Si-
mulants zur Prüfung von Methoden zur Spurenanalyse von TATP heraus [120].
Nachstehende Tabelle 2.2 ist in Anlehnung an die von Burks und Hage [118,
119] erstellte Auflistung von Nachweisverfahren für die Peroxid-basierten Explo-
sivstoffe HMTD und TATP entstanden und soll als Erweiterung (ohne Anspruch
auf Vollständigkeit) für TATP angesehen werden.
Tabelle 2.2: Nachweisgrenzen von TATP.
Nachweisgrenze Methode Quelle
10 µg L-1
GC-MS, Elektronenstoßionisation/Ionenfalle, nur m/z 43
[121]
670 pg
GC-MS, Multiphotonenionisation (Femtosekunden-laser)/Flugzeit, m/z 15, 43 und 222
[122]
Grundlagen 15
Nachweisgrenze Methode Quelle
< 1 ng
Headspace-GC-MS Elektronenstoßionisati-on/Ionenfalle, m/z 43, 59, 75 und 221
[123]
0.05 ng
GC-MS, Elektronenstoßionisation/Quadrupol, m/z 43, 59, 75
[124]
6.4 ng
GC-MS mit SPME, Elektronenstoßionisati-on/Ionenfalle, m/z 20-250
[125]
62.5 ng (12.5 mg L-1)
MS, ESI, positiver Modus mit Na+/Quadrupol, m/z 50-800,
[126]
1-50 ng von Ober-flächen
MS, Desorptions-Elektrospray-Ionisation, positiver Modus mit Na+/Quadrupol, m/z 45
[127]
~ 70 pg (30 ppb)
MS, APCI, positiver Modus mit NH4+/Flugzeit,
m/z 240 [128]
222 mg L-1 HPLC mit Fourier-Transform-Infrarot-Detektor [129]
0.8 ng
LC-MS/MS, APCI, positiver Modus mit NH4
+/Quadrupol, m/z 240, 240/223, 240/74 [130]
100 µg L-1
LC-MS, APCI, positiver Modus mit NH4+/Quadrupol,
m/z 89 [104]
wenige mg
Headspace-IMS, positiver Modus, mit planarer SPME
[131]
wenige µg L-1 Luftg
Tragbares Aspirations-IMS, positiver und negativer Modus, Anreicherung: 3.5 min mit 4 L min-1
[132]
187 mg L-1 IMS, positiver Modus [133]
< 100 µgs
Infrarot-Laser-photoakustische Spektroskopie, CO2-Laser, 9-11 µm
[134, 135]
0.5 mg L-1
Differentielle Absorption-Lidar-System, CO2-Laser,
online = 10.632 µm, offline = 10.220 µm
[136]
10 mgs
Stand-off-Raman-Spektroskopie, Distanz: 7 m, Ar-Laser
[137]
~ 0.02 mg L-1g
Oberflächenverstärkte Raman-Streuung, Diodenla-ser, (Signal bei 553 cm-1)
[138]
31 ppbg
Quarzkristall-Mikrowaage, Beschichtung: Dendri-mere aus Polyphenylenen
[139]
ppb-Bereichg Chemiresistor, ZnO-beschichtete Silica-Nanofedern [140, 141]
(~105 ppbv, <5 mg)g
Elektrochemischer Gassensor, Zn+ auf TiO2-Nanoröhren
[142]
2.9 ppb (0.5 mg)g
Elektrochemischer Gassensor, In2O3-Nanopartikel (bei 270 °C)
[143]
ppm-Bereichg
Thermodynamischer Gassensor, Mikroheizung mit Nickeloberfläche beschichtet mit Metalloxiden
[144]
100 ppbg
Elektrochemischer Gassensor, Halbleiter mit Mo-nolayer aus organischen Verbindungen
[145]
1.9 mg L-1 Chronoamperometrie mit Br - (bei 55 °C) [146]
Angaben, wenn möglich in g L-1
umgerechnet g
aus Gasphase s Feststoff
16 Grundlagen
Die Tabelle 2.2 zeigt viele interessante, klassische und neuere, Möglichkeiten zur
TATP-Detektion, deren Nachweisgrenzen zum Teil erheblich variieren. Massen-
spektrometrische Methoden sind mit Abstand am verbreitetsten. Mit ihnen wer-
den auch die besten Nachweisgrenzen erreicht. Bei vielen anderen Verfahren,
insbesondere jenen, die TATP über Metalloxidoberflächen erkennen, fehlen An-
gaben über die Selektivität dieser Beschichtungen. Die Methoden mit den
schlechtesten Nachweisgrenzen haben aber einen Vorteil gegenüber den Mas-
senspektrometern: Sie sind mobil und teilweise sind sie außerdem schneller.
Erwähnenswert sind in diesem Zusammenhang auch Entwicklungen im Bereich
der Sicherheitsüberwachung, die z. B. die hohe Empfindlichkeit der APCI-MS in
einer Durchlaufschleuse mit Ansaugsystem zur Probenanreicherung und den
hohen Dampfdruck von TATP ausnutzen [147, 148]. Ein Feldversuch zeigte,
dass in 2 bis 3 s TATP auf Personen oder Gepäckstücken (1200 je Stunde)
nachgewiesen werden kann. Allerdings gab es zum einen mit Aceton falsch-
positive Signale und zum anderen eignet sich dieses Verfahren kaum für andere
Explosivstoffe, also nicht für Substanzen mit (sehr) geringem Dampfdruck. Dane-
ben gelang es Chen et al. [149] mittels neutraler Desorption unter Verwendung
von Stickstoff als Trägergas zur Probenahme und angeschlossener extraktiver
ESI-MS/MS die Analyten TNT, RDX, HMX, Nitroglycerin sowie TATP direkt von
der Haut ohne weitere Probenaufbereitung im Bereich ab 0.5 bis 10 pg nachzu-
weisen.
Nicht wenige beschriebene Verfahren weisen TATP indirekt über Wasserstoff-
peroxid nach, wie die Beispiele im folgenden Absatz ausführlich zeigen. Diese
Verfahren nutzten dabei aus, dass TATP durch Einwirkung von Säure und UV-
Strahlung in seine Ausgangsstoffe zerfällt (Abschnitt 2.1.1). Obwohl diese Me-
thoden zum Teil gute Empfindlichkeiten erzielen, so bleibt doch zu bedenken,
dass sie letztendlich nicht zwischen TATP und Wasserstoffperoxid unterscheiden
können und damit ein hohes Risiko für falsch-positive Signale gegeben ist, vor
allem da Wasserstoffperoxid in viele Alltagsprodukten (Waschmitteln, Kosmetika,
Desinfektionsmitteln) vorkommen kann.
Mit dem Einmal-Schnelltest ACRO-P.E.T. [24, 150] ließen sich geringe Mengen
TATP (1 bis 2 mg, keine Nachweisgrenzen angegeben) in wenigen Minuten
nachweisen, wobei nach dem Kontakt mit starken Säuren H2O2 entstand, wel-
ches nach der Neutralisierung der Probenlösung eine enzymkatalysierte Farbre-
aktion unter Verwendung des chromogenen Substrats 2,2′-Azino-di(3-ethylbenz-
thiazolin)-6-sulfonat (ABTS) auslöste. Verwendet wurde dazu die aus immun-
chemischen Methoden (wie ELISA, Abschnitt 2.3.1) bekannte und weitverbreitete
Meerrettich-Peroxidase (HRP, horseradish peroxidase). Sehr ähnliche Prinzipien
wurden von Schulte-Ladbeck et al. [98] und Girotti et al. [95] vorgestellt. Erstere
benutzten ebenfalls ABTS und HRP um die Entstehung von H2O2 zu detektieren,
jedoch nach UV-Bestrahlung des TATP, und konnten 8 µmol L-1 (2 mg L-1) TATP
noch nachweisen. Mit dem Subtrat 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure konnte
durch fluorimetrische Messung die Nachweisgrenze auf 0.8 µmol L-1 (0.2 mg L-1)
verbessert werden. Girotti et al. [95] verwendeten als Substrat Luminol und konn-
ten durch die Detektion der eintretenden Chemilumineszenz 40 µg L-1 TATP im
Grundlagen 17
Mikrotiterplattenformat bzw. 50 µg L-1 TATP mit einem tragbaren Detektor nach-
weisen. Ebenfalls nach der Behandlung einer TATP-Probe mit Säure wurde aus
einem fluorogenen Substrat durch oxidative Wirkung des freigesetzten H2O2 ein
Fluoreszenzsignal gemessen und eine Nachweisgrenze von unter 10 nmol L-1
(2 µg L-1) sowohl für H2O2 als auch für TATP angegeben [94]. Mit einer Zerset-
zung des TATP durch UV-Licht gelang die Detektion der Fluoreszenz bis in den
Bereich von 100 nmol L-1 (22 µg L-1) [100]. Die Oxidation eines Farbstoffs durch
H2O2 nach dem Zerfall von TATP wurde auch von Lin und Suslick [151] ausge-
nutzt. Ihr colorimetrischer Sensor detektierte TATP semiquantitativ im Bereich
von 50 bis 10 000 ppb aus der Gasphase, wobei die untere Grenze etwa 0.02%
des Sättigungsdampfdrucks entspricht. Mit elektrochemischen Methoden, z. B.
über ein Redoxsystem aus Fe(II/III)-Ethylendiamintetraacetat und H2O2, konnte
eine Nachweisgrenze von 0.89 µmol L-1 (0.2 mg L-1) TATP [152] oder mit Ei-
sen(III)-hexacyanoferrat(II/III) (Preußisch oder Berliner Blau) eine Nachweisgren-
ze von 55 nmol L-1 (12 µg L-1) TATP [153] erreicht werden. Fast identisch ist eine
Methode, bei der TATP photochemisch zersetzt wurde [154], wobei unter Ver-
wendung einer UV-Lampe für 5 min ein TATP-Nachweis bis 0.25 µmol L-1
(0.1 mg L-1) und mit der Bestrahlung durch einen Laser für 15 s bis 50 nmol L-1
(11 µg L-1) möglich war. Auch gekoppelt an eine HPLC kann die Behandlung von
TATP mit UV-Strahlung zur anschließenden elektrochemischen Detektion ge-
nutzt werden [101]. Mit diesem Verfahren, das später zum Nachweis von TATP
aus der Luft diente, wurde eine Nachweisgrenze von 3 µmol L-1 (1 mg L-1) TATP
erreicht. Damit konnten nach 20-minütiger Anreicherung von TATP aus der Gas-
phase mittels Waschflaschen 550 ng TATP pro Liter Luft ermittelt werden, wobei
jedoch durch den enzymatischen Nachweis des Degradationsprodukts H2O2 (mit
HRP mit ABTS als Substrat) bis 190 ng TATP pro Liter Luft nachgewiesen wer-
den konnten [99]. Eine ausgefallene, wenngleich nicht sehr empfindliche Detekti-
onsmethode für TATP wurde von Chen et al. [155] beschrieben. Sie gaben TATP
in ein Gemisch aus Cysteinmethylester und p-Toluolsulfonsäure, in dem das
durch die Säure freiwerdende H2O2 als Oxidationsmittel die Ausbildung von
Disulfidbrücken bewirkte. Das Signal für die Anwesenheit von 1.5 bis 20 mg
TATP ist die Beobachtung des Gelierens des Gemischs (0.4 bis 4 mL) innerhalb
von 2 bis 30 min.
Zur viel in den Medien diskutierten Terahertzspektroskopie als zerstörungsfreie
und berührungslose Methode zur Detektion von Explosivstoffen [15, 16] ist keine
Aussage zur Anwendbarkeit der nicht-spurenanalytischen Methode für TATP
unter realen Bedingungen zu treffen. Es wurde nur ein einziges Spektrum von
0.3 bis 18 THz mit ersten Absorptionssignalen ab ca. 4 THz veröffentlicht [156],
ohne jegliche Vergleichsspektren anderer Substanzen, die die TATP-Signale
überdecken könnten. Der Vergleich mit Spektren anderer Explosivstoffe (TNT,
RDX, HMX und PETN) ist kaum möglich, da deren Terahertzspektren nur von 0.2
bis maximal 6 THz gemessen wurden [157, 158]. Sie zeigten jedoch in diesem
unteren Bereich jeweils typische Muster, was bei dem TATP-Spektrum in diesem
Bereich durch die ungünstige Skalierung nicht erkennbar war.
18 Grundlagen
Immunchemische Methoden zum Nachweis von TATP wurden bisher nicht be-
schrieben, da keine entsprechenden Antikörper existierten [64]. Es gibt jedoch
ein „biologisches System“, das TATP aus der Gasphase anzeigen kann: Honig-
bienen, die mittels Anreiz durch Zuckerwasser auf mit TATP angereicherte Luft
trainiert wurden [159]. Sicherlich (und hoffentlich) wird sich dieses Verfahren
nicht durchsetzen, da die immobilisierten Tiere nach ca. 48 h sterben. Dennoch
ist dies ein Beispiel für die enormen Fähigkeiten, die die Natur zu bieten hat. Ne-
ben Antiköpern werden auch Enzyme (siehe vorheriger Absatz: HRP) und sogar
ganze Organismen, die gentechnisch verändert wurden, wie Bakterien, Algen,
Hefen sowie Pflanzen (Arabidopsis thaliana) zur Detektion von Explosivstoffen
genutzt [160, 161]. Ratten und Schweine werden zum Aufspüren von Landminen
eingesetzt, deren olfaktorisches System noch empfindlicher als das von Hunden
ist [161]. Doch vor allem Spürhunde spielen bei Sicherheitskontrollen nach wie
vor eine große Rolle. Wenngleich ihre Ausbildung zeit- und kostenintensiv und
mit ihnen keine quantitative Aussage möglich ist, so fehlt es noch immer an bes-
seren Gasphasen-Sensoren, die sie ablösen könnten [24, 108, 109, 161].
2.2 Gewinnung von Antikörpern
2.2.1 Haptene
Niedermolekulare Verbindungen mit einer Molekülmasse von unter 1 500 Da
[162] - 5 000 Da [163], wie TATP mit 222 Da, sind zu klein, um selbst immunogen
zu wirken. Sie müssen als Haptene an Trägermoleküle gekoppelt werden, um
eine Immunreaktion auszulösen. Diese Carrier sind meist Proteine (Albumine wie
z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin (OVA) oder Schlitzschnecken-
Hämocyanin). Es können aber auch Polyaminosäuren, Polysaccharide (wie z. B.
Agarose oder Sepharose), Mikropartikel oder Membranen sein [164].
Da TATP keine geeigneten funktionellen Gruppen zur Kopplung besitzt, muss
ein kopplungsfähiges, strukturelles Analogon gefunden oder synthetisiert werden.
Üblicherweise werden Carboxygruppen bevorzugt, da sie schonende Methoden
unter milden Bedingungen – ohne extreme Temperaturen, pH-Werte oder hohe
Lösungsmittelkonzentrationen – für die kovalente Kopplung des Haptens an Pro-
teine gestatten [47]. Verbreitet sind dazu Methoden über NHS (N-Hydroxy-
succinimid)-Ester [165, 166] sowie über gemischte Anhydride [167, 168].
Entscheidend für die spätere Antikörperspezifität ist, dass die Struktur des
Haptens mit der des Analyten die größtmögliche Übereinstimmung in Größe,
Geometrie und Ladung aufweist [169, 170]. Daneben gibt es weitere Empfehlun-
gen, die beim Hapten-Design nicht unbeachtet bleiben sollten. Vor allem ein Ab-
standhalter (sogenannter Spacer oder Linker) zwischen Trägerprotein und der
Erkennungsstruktur des Analyten sollte in das Hapten integriert sein. Dieser soll
sterische Hinderungen verringern und so die Struktur des eigentlichen Analyten
Grundlagen 19
dem Immunsystem besser zugänglich machen [47]. Newsome et al. [171] erhiel-
ten bei der Immunisierung mit einem Konjugat aus Tetrahydrophthalimid und
menschlichem Serumprotein die empfindlichsten Antikörper, als sie eine Alkylket-
te mit fünf Kohlenstoffatomen als Abstandhalter verwendeten. Bei Untersuchun-
gen anhand von Steroid-Immunogenen, u. a. bezüglich der Kettenlänge und -art
des Abstandshalters zwischen einem Steroid und einem BSA-Molekül, ergaben
vier bis sechs linear angeordnete Kohlenstoffatome die höchste Antikörperspezi-
fität [172, 173]. Längere Ketten führten zu keiner weiteren Verbesserung bei der
Herstellung von Steroid-Antikörpern. Außerdem sollten die Abstandhalter weder
sperrig noch geladen sein, also z. B. nicht aromatisch oder polar, um selbst keine
Immunreaktion auszulösen [169, 170]. Daneben kann auch die Position ihrer
Anbindung an die Erkennungsstruktur des Analyten einen Einfluss auf die Affini-
tät des resultierenden Antikörpers haben [174].
2.2.2 Antikörper
Struktur
Antikörper sind globuläre Glykoproteine, die als Teil des Immunsystems, genauer
der humoralen Immunantwort, Antigene erkennen und binden. Etwa 75% der
Antikörper im Serum (ca. 10 mg mL-1) sind Immunglobuline der Klasse G (IgG)
[175, 176], so dass meist IgG gemeint sind, wenn von Antikörpern gesprochen
wird. Der prinzipielle Aufbau eines IgG ist in Abbildung 2.3 dargestellt. Es handelt
sich um ein formal achsensymmetrisches Heterotetramer aus jeweils zwei mole-
kular identischen schweren (~ 50 kDa) und leichten (~ 22 kDa) Polypeptidketten.
Diese sind durch Disulfidbrücken kovalent sowie durch weitere nicht-kovalente
Bindungen verbunden und bilden die typische Y-förmige Quartärstruktur [175,
177].
Abbildung 2.3: Schematische Darstellung eines Antikörpers (IgG).
20 Grundlagen
Antikörper werden in konstante und variable Regionen eingeteilt. Die konstanten
Domänen der schweren und leichten Ketten (in Abbildung 2.3 dunkel dargestellt)
werden bei immunchemischen Methoden ausgenutzt, um Spezies-spezifische
Antikörper durch sekundäre Antikörper (-IgG) zu binden. Dazu wird nicht selten
auch nur der untere Abschnitt (hin zum Carboxy-Terminus) der konstanten Regi-
on verwendet, der aus dem kristallisierbaren Teil (Fc oder F(c)) der konstanten
Domänen der beiden schweren Polypeptidketten besteht. Anhand der konstanten
Abschnitte der fünf Typen schwerer Ketten – , , , und – werden außerdem
die fünf Klassen von Immunglobulinen charakterisiert, die die meisten Vertebra-
ten besitzen und die sich in Struktur und Auftreten voneinander unterscheiden.
Während die Immunglobuline E und D strukturell dem IgG ähneln, kann Immun-
globulin A (IgA) auch als Dimer und Immunglobulin M (IgM) als Penta- oder
Hexamer auftreten [175, 177]. Das ubiquitär auftretende IgG ist als einzige Im-
munglobulinklasse plazentagängig und außer im Blutserum auch in der Extrazel-
lulärflüssigkeit und den Epithelien [175], vor allem des Gastrointestinaltrakts [178-
180], zu finden. IgA tritt vor allem in Körperflüssigkeiten wie Speichel, Tränen
oder Muttermilch sowie auf den Schleimhäuten der Atemwege, des Verdauungs-
trakts und des Genitaltrakts auf, wohingegen IgM im frühen Stadium der primären
Immunantwort eine Rolle spielt und fast ausschließlich im Blut gelöst oder mem-
brangebunden auf der Oberfläche von B-Lymphozyten vorkommt. Die leichten
Polypeptidketten der Antikörper treten in zwei Typen – und – in allen Immun-
globulinklassen auf [175, 177].
Der für Immunoassays und natürlich auch für die Immunabwehr entscheidende
Teil, die Antigenbindungsstelle, wird im Bereich der Amino-Termini der variablen
Domänen (in Abbildung 2.3 heller dargestellt) einer schweren und einer leichten
Kette gebildet. Aus dem funktionell symmetrischen Aufbau der Antikörper resul-
tiert daher eine Bivalenz, über die die Antikörper verfügen, d. h. sie besitzen zwei
identische Antigenbindungsstellen mit derselben Bindungsspezifität. Für Säuge-
tiere wird angenommen, dass sie durch Rekombination der Gene der
(hyper-)variablen Region und alternatives Spleißen der Gentranskripte mindes-
tens 106 bis 107 verschiedene Antikörperspezifitäten hervorbringen könnten [175,
181].
Monoklonale und polyklonale Antikörper
Die Antigen-Antikörper-Bindung beruht ausschließlich auf nicht-kovalenten Bin-
dungen, also ionischen, hydrophoben, Wasserstoffbrücken- sowie van-der-
Waals-Wechselwirkungen und erreicht eine außerordentliche Bindungsaffinität
von bis zu K = 1010 L mol-1 oder sogar darüber, was einer Bindungsenergie von
ca. 65 kJ mol-1 entspricht [182]. Zusammen mit ihrer hohen Spezifität, die sie
selbst zwischen Konformeren und Stereoisomeren unterscheiden lässt, sind sie
zu einem wertvollen analytischen Werkzeug geworden. Außer ihrer natürlichen
Funktion bei der Immunabwehr in Organismen werden Antikörper verbreitet in
Medizin, Forschung und (Umwelt-)Analytik eingesetzt, wobei der Schwerpunkt
deutlich auf der klinischen Diagnostik und bei therapeutischen Anwendungen
Grundlagen 21
liegt [47, 183]. Für viele Zwecke können monoklonale und polyklonale Antikörper
in gleicher Weise verwendet werden. Beide haben aber Vorzüge und Nachteile.
Monoklonale Antikörper stammen aus einer Zelllinie, also aus Zellen, die auf
nur einen einzigen B-Lymphozyten zurückgeführt werden können. Polyklonale
Antikörper werden hingegen aus einer Mischpopulation von Zellen gebildet, so
wie sie natürlicherweise im Blut vorliegen, weswegen sie oft auch als (polyklona-
les) Antiserum bezeichnet werden. Tatsächlich ist die schnelle Gewinnung der
Antikörper durch das direkte Arbeiten mit dem Serum immunisierter Tiere der
Hauptvorteil, zeitlich und finanziell, gegenüber monoklonalen Antikörpern, wie im
nachfolgenden Abschnitt 2.2.3 genauer beschrieben wird. Gleichzeitig resultiert
daraus auch ein entscheidender Nachteil, denn ihre Verfügbarkeit ist endlich und
abhängig von der Verfassung des Versuchstieres. Genau diese Sterblichkeit wird
bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern umgangen und eine quasi
unbegrenzte Menge sowie gleichbleibende Qualität garantiert, die beispielsweise
auch der Reproduzierbarkeit von Tests dient [164].
Ein entscheidender Unterschied zwischen monoklonalen und polyklonalen An-
tikörpern kann auch ihre Epitopspezifität sein. Monoklonale Antikörper erkennen
nur ein einziges Epitop eines Antigens (oder Analyten), so dass auch die Zahl
etwaiger Kreuzreaktivitäten und unspezifischer Bindungen begrenzt sein sollte.
Polyklonale Antikörper sind zwar, ebenso wie monoklonale Antikörper, Antigen-
spezifisch, können aber durchaus gegen unterschiedliche Epitope dieses Anti-
gens gerichtet sein. Daraus kann ein vermehrtes Auftreten von Kreuzreaktionen
resultieren oder es können ebensolche unspezifischen Bindungen kompensiert
werden. Außerdem wird insbesondere bei veränderten Analyten die Wahrschein-
lichkeit einer Antigen-Antikörper-Bindung erhöht und damit auch das zu erwar-
tende Signal in einem Assay, ein Umstand, den monoklonale Antikörper kaum
ausgleichen können [164]. Für TATP ist zu vermuten, dass es aufgrund seiner
geringen Größe und dazu seiner Symmetrie nur ein Epitop aufweist, so dass
diesbezüglich weder polyklonale noch monoklonale Antikörper einen Vorteil ha-
ben.
2.2.3 Immunisierung
Allgemeiner Ablauf
Die Immunisierung von Vertebraten, zumeist Säugetieren, darf nur im Rahmen
des Tierschutzgesetzes erfolgen [184]. Die Gabe des möglichst reinen Antigens
bzw. Immunogens (z. B. einem Hapten-Protein-Konjugat) dazu erfolgt in aller
Regel durch Injektion. Vor allem bei der Erstimmunisierung erfolgt dies gemein-
sam mit einem Adjuvans, das die Immunogenität erhöhen und dadurch die Im-
munantwort verstärken soll, indem das beispielsweise enthaltene Mineralöl eine
Entzündungsreaktion forciert [164]. Im Rahmen der primären Immunantwort nach
dem ersten Kontakt mit dem Immunogen wird zunächst überwiegend IgM gebil-
det [47, 175, 177]. Erst später und vor allem nach wiederholter Applikation des
22 Grundlagen
Immunogens steigt nach einem Klassenwechsel der Titer der gewünschten IgG
an, welche bis zu 10% der Antikörperpopulation im Serum ausmachen können
[164]. Bei den Nachimmunisierungen, auch Boosts genannt, kommt es durch die
bei der Erstimmunisierung gebildeten Gedächtniszellen auch schneller zur Bil-
dung der IgG (sekundäre Immunantwort). Dabei steigt neben der Menge auch die
Qualität der Antikörper, da hauptsächlich somatische Hypermutationen
(Punktmutationen) der Gene des hypervaribalen Bereichs der Antikörper eine
Affinitätsreifung ermöglichen [175, 185].
Sowohl für die Herstellung polyklonaler als auch monoklonaler Antikörper sind
diese Vorgänge entscheidend. Die polyklonalen Antikörper können direkt als Se-
rum oder nach Isolierung der IgG daraus verwendet werden [164]. Die Boosts
dienen nach Abschluss der Affinitätsreifung dem Erhalt des Antikkörpertiters im
Blut, wo IgG eine Halbwertszeit von drei Wochen aufweisen [175]. Bei der Ge-
winnung monoklonaler Antikörper spielen die Antikörper im Blut nur eine unter-
geordnete Rolle und werden lediglich zur Verfolgung des Immunisierungsverlaufs
verwendet. Wichtig ist hier die Stimulation der Zellen, welche die gewünschten
Antikörper produzieren. Da die Proliferation der B-Lymphozyten in den Organen
des lymphatischen Systems erfolgt, wird zur Isolierung der Zellen zumeist die
Milz entnommen, seltener die Lymphknoten [47, 186]. Die gewonnenen
B-Lymphozyten werden mit Myelomzellen zu Hybridomzellen fusioniert und an-
schließend vereinzelt – ein Verfahren, dass sich seit der Entwicklung durch Köh-
ler und Milstein [187] 1975 nur wenig verändert hat.
Bei der klassischen, chemischen Fusionsmethode wird Polyethylenglykol zur
Destabilisierung der Zellmembranen verwendet. Neuere Verfahren setzen auch
elektrische Pulse oder eine Kombination aus chemischer und Elektrofusion ein,
selten wird auch eine durch Viren vermittelte Fusion angewandt [164]. Die Fusion
erfolgt ungerichtet. Die Fusionswahrscheinlichkeit ist mit 0.001-0.4% (je nach
Methode) [188-190] sehr gering und Hybridomzellen sind aufgrund der erhöhten
Chromosomenzahl zudem oftmals nicht stabil, so dass die wenigen Antikörper-
sezernierenden und zugleich immortalisierten Hybridomzellen durch z. B. eine
HAT-Selektion identifiziert werden müssen. Üblicherweise werden Myelomzell-
linien verwendet, die einen Mangel an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-
transferase (HGPRT) aufweisen. In einem HAT-Medium mit Hypoxanthin, Ami-
nopterin und Thymidin können Myelomzellen oder reine Myelomzell-Hybride auf-
grund von Einschränkungen im DNA-Stoffwechsel nicht überleben, da Aminopte-
rin die De-novo-Biosynthese von Guanosintriphosphat und Thymidintriphosphat
inhibiert. Der alternative Syntheseweg (salvage pathway), um Guanosintriphos-
phat aus Hypoxanthin zu synthetisieren, entfällt durch das Fehlen der HGPRT-
Aktivität. Thymidintriphosphat wird durch das zugesetzte Thymidin weiterhin ge-
bildet. Die B-Lymphozyten besitzen zwar HGPRT, sind aber nicht kultivierbar, so
dass nicht-fusionierte B-Lymphozyten oder Hybride aus diesen in vitro innerhalb
von 14 Tagen sterben. Nur Hybridomzellen, die die Eigenschaften sowohl der
Myelomzellen als auch der B-Lymphozyten tragen, wachsen schließlich in der
Kultur und werden durch limitierende Verdünnung streng vereinzelt. Die Zell-
kulturüberstände der reklonierten Hybridomzellen werden im Allgemeinen mittels
Grundlagen 23
ELISA, inzwischen auch durch Durchflusszytometrie, untersucht, um diejenigen
Klone zu identifizieren und zu kultivieren, die die gewünschten monoklonalen
Antikörper produziert [47, 164, 175].
Besonderheiten von Mäusen und Kaninchen
Bei der Herstellung von Antikörpern ist auch die Wahl der zu immunisierenden
Spezies zu beachten, wobei ein Einfluss auf das komplexe biologische System
Tier sehr begrenzt ist. So kann es Spezies-spezifisch (wie z. B. bei Ziege und
Kaninchen [191] oder bei Maus und Kaninchen [192]) oder bei einem einzelnen
Individuum zu einer unzureichenden Antikörperbildung bis hin zum Ausbleiben
der Immunantwort kommen. Die Ursachen dafür können zum einen Immuntole-
ranzen sein [164], die vor allem bei zu jungen Tieren auftreten, und zum anderen
der Schutzmechanismus vor Autoantikörpern, wenn das Immunogen körpereige-
nen Strukturen zu ähnlich ist [175, 193]. Aus (u. a.) Schaf, Ziegen, Pferd, Kameli-
den und Hühnerei lassen sich größere Vorräte polyklonaler Antikörper gewinnen.
Steht hingegen nur eine geringe Menge Immunogen zur Verfügung, sind Maus,
Ratte, Meerschweinchen und Kaninchen geeignetere Kandidaten. Bei der Her-
stellung monoklonaler Antikörper sind die Möglichkeiten deutlich eingeschränkter,
da nur wenige fusionsfähige Myelomzelllinien zur Verfügung stehen, wobei häu-
fig nicht nur auf die gemeine Herkunft mit den B-Lymphozyten aus einer Spezies,
sondern oft auch desselben Stammes geachtet werden muss [47, 164]. Die
Hybridomtechnik wird daher seit langem fast ausschließlich mit etablierten Nage-
tier-Myelomzelllinien von Mäusen [187, 194-196] und Ratten [197-199] ange-
wandt. Wegen der therapeutischen Relevanz [200] wurden auch schon recht früh
humane, monoklonale Antikörper auf diese Weise hergestellt [201]. Neuer hinge-
gen sind monoklonale Antikörper aus Kaninchen, da die einzig stabile Kanin-
chen-Myelomzelllinie von Knight und ihren Kollegen unter Patentschutz steht
[202] und erst seit Mitte/Ende der 2000er von Epitomics [203] kommerziell einge-
setzt wird.
Am häufigsten werden Mäuse zur Herstellung monoklonaler Antikörper heran-
gezogen und Kaninchen, um polyklonale Seren zu gewinnen. Direkte Vergleiche
beider, vor allem bezüglich ihrer Affinität, sind in der Literatur kaum zu finden, da
dazu die Immunisierungen mit identischen oder zumindest sehr ähnlichen Immu-
nogenen erfolgt sein sollten. Jedoch wird mit der nun zunehmenden Zahl mono-
klonaler Antikörper aus Kaninchen deutlich, dass die Antikörper aus Kaninchen
denen aus Mäusen oft überlegen sind. Zumindest zeigten in der Immunhisto-
chemie monoklonale Antikörper aus Kaninchen höhere Empfindlichkeit bei
gleichbleibender Selektivität, erwiesen sich als robuster und ermöglichen höhere
Verdünnungen (positiv für den Kostenfaktor) als die gegen die gleichen Antigene
erzeugten, monoklonalen Antikörper aus Mäusen [204-206]. Saito et al. [205]
bezogen in ihre Untersuchungen an einem Tumormarker auch entsprechende
polyklonale Antikörper aus Kaninchen ein. Sie konnten trotz ihrer anfänglichen
und allgemeinen Vermutung, dass polyklonale Seren zwar empfindlicher, aber
dafür weniger spezifisch als monoklonale Antikörper aus Mäusen sind, keinen
Nachteil gegenüber den monoklonalen Antikörpern aus Kaninchen finden. Erklärt
24 Grundlagen
wird der Unterschied zwischen den Antikörpern aus Kaninchen und Mäusen
durch die Besonderheiten des Immunsystems der Kaninchen [185]. Im Gegen-
satz zu z. B. Maus und Mensch besitzen Kaninchen kein IgD und ihr IgG hat im
Bereich der Amino-Termini der variablen Domänen weniger Aminosäuren und
mehr Disulfidbrücken und weist außerdem keine Subklassen auf. Auch der zu
90-95% in Kaninchen auftretende -Typ der leichten Polypeptidketten bildet eine
weitere Disulfidbrücke aus. Es wird vermutet, dass diese zusätzlichen Disulfid-
brücken mit verantwortlich für die besserer Stabilität und Haltbarkeit der Antikör-
per aus Kaninchen sind. Entscheidend für die erhöhte Affinität ist jedoch die Ent-
stehung der größeren Antikörpervielfalt. Sie setzen dabei weniger auf die Re-
kombination der Antikörpergene, sondern mehr auf Genkonversion durch Inserti-
on und Deletion von Codons sowie Clusterverschiebung von Nukleotiden. Diese
Vorgänge laufen in den ersten Lebenswochen vorwiegend im Darm-assoziierten
lymphatischen Gewebe ab und bauen das primäre Antikörper-Repertoire auf,
weswegen sehr junge Tiere noch immuninkompetent sind. In adulten Kaninchen
erfolgen Genkonversion und somatische Hypermutation auch in den sekundären
lymphatischen Organen wie Milz und Lymphknoten, wo die abschließende Anti-
körperreifung während der sekundären Immunantwort erfolgt [185, 207]. Antikör-
per aus Kaninchen sollen so Affinitäten bis KD = 10-12 M erreichen können, wäh-
rend monoklonale Antikörper aus Mäusen meist Affinitäten im nano- bis subna-
nomolaren Bereich (KD = 10-9 bis 10-10 M) aufweisen. Nicht zuletzt erhöht die hö-
here Zahl an verschiedenen Antikörpern auch die Wahrscheinlichkeit einer (bes-
seren) Erkennung von Epitopen, die dem Immunsystem der Mäuse verborgen
bleiben oder eine nur schwache Immunantwort auslösen. Daneben enthält die
Kaninchenmilz auch 50-mal mehr Lymphozyten als die einer Maus, was die Er-
folgsquote bei der Herstellung von Hybridomzellen merklich steigert [185].
2.2.4 Alternativen
Antikörper erkennen außerordentlich empfindlich und selektiv die dreidimensio-
nale Struktur von Molekülen und sind hervorragend zur qualitativen und quantita-
tiven Analyse in einer Vielzahl von Methoden einsetzbar. Daher ist es nahelie-
gend, dieses biologische Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion zu imitieren.
Dadurch können vor allem auch Tierversuche umgangen werden. Gleichzeitig
werden Kosten- und Zeitersparnis sowie eine bessere Einflussnahme in den Pro-
duktionsprozess (z. B. durch Konzepte wie rationales Design [208]) erhofft.
In-vitro-Methoden können synthetische oder teilsynthetische Alternativen wie
rekombinante Antikörper, Peptide, Aptamere (einzelsträngige DNA- oder RNA-
Oligonukleotide) oder MIP (molekular geprägte Polymere) bieten [209, 210].
Zur Erzeugung hochaffiner rekombinanter Antikörper oder Antikörperfragmen-
te, Peptide und Aptamere werden Bibliotheken mit entsprechenden Genen, DNA-
oder RNA-Sequenzen benötigt, von deren Vielfalt, wie schon bei den Antikörpern
(Abschnitt 2.2.3), maßgeblich die erfolgreiche Selektion gegen die gewünschte
Zielstruktur abhängt. Als bewährtes Selektionsverfahren für Proteine und Peptide
Grundlagen 25
hat sich dabei das Phage display [211] erwiesen, wobei die in den Bakteriopha-
gen exprimierten Proteine oder Peptide auf der Oberfläche der Phagen dem zu
erkennenden Molekül präsentiert werden [47, 212]. Mit der sehr ähnlichen Me-
thode des Yeast display, bei der die Oberflächenexpression auf Hefen erfolgt,
welche auch die Glykosylierung der Proteine durchführen, konnten Boder et al.
[213] eine Affinität von KD = 4.8 × 10-14 M für Fluorescein erreichen. Das ist die
wahrscheinlich höchste Antikörperaffinität, die bislang bekannt ist [208]. Sie
nahmen die variable Domäne je einer schweren und leichten Polypeptidkette
eines bereits vorhandenen Antikörpers und fügten der entsprechenden DNA,
u. a. durch die Verwendung einer fehleranfälligen DNA-Polymerase, randomisier-
te Mutationen ein, so dass eine Bibliothek mit 105 bis 107 Varianten entstand, und
erhielten einen monovalenten scFv-Antikörper [213]. Diese und ähnliche Techni-
ken ermöglichen also auch eine nachträgliche Affinitätsreifung von Antikörpern
in vitro, wobei meist nur der Abschnitt rund um die Antigenbindungsstelle modifi-
ziert wird und in der Regel eine Immunisierung vorausgeht [47, 208]. Für den
Analyten TNT wurden rekombinante Antikörper aus einem scFv-Fragment, ge-
bunden an den konstanten Teil eines humanen Antikörpers, entwickelt, mit de-
nen eine Nachweisgrenze von 1 µg L-1 erreicht wurde [214]. Sie binden ähnlich
gut wie einige monoklonale TNT-Antikörper, die Nachweisgrenzen zwischen 1.5
und 6.1 µg L-1 [51, 54, 55] in verschiedenen Assayformaten zeigten, schon mit
den besseren monoklonalen Antikörpern, mit Nachweisgrenzen von 0.008 bis
0.11 µg L-1 [50-52, 56] jedoch nicht mehr. Die besten polyklonalen Antikörper aus
Kaninchen, mit denen Nachweisgrenzen von 0.002 µg L-1 [52] bzw. 0.0006 µg L-1
[57] erlangt wurden, sind deutlich besser als die rekombinanten TNT-Antikörper,
zumal letztere starke Kreuzreaktivitäten aufweisen [214]. Goldman et al. [215]
hatten im Jahr zuvor bereits mit der Phage-display-Technik Peptide gewonnen,
die selektiv TNT binden. Mit dieser (noch an den Phagen gebundenen) Kette aus
nur zwölf Aminosäuren konnten sie mittels ELISA immerhin 10 mg L-1 TNT detek-
tieren. Auch Cerruti et al. [216] generierten so ein Peptid aus zwölf Aminosäuren,
das selektiv TNT aus einer 100 mg L-1-Lösung erkannte, aber nicht auf Dinitroto-
luol in gleicher Konzentration reagierte.
Oligonukleotide, die aufgrund ihrer räumlichen Sekundärstruktur in der Lage
sind, spezifisch andere Moleküle zu binden, werden Aptamere genannt [217].
Aus einer Bibliothek mit zufälligen RNA- oder DNA-Sequenzen wird in einem
SELEX genannten Verfahren [218, 219], ähnlich dem Phage display, über eine
immobilisierte Zielstruktur das am stärksten bindende Aptamer selektiert. Eh-
rentreich-Förster et al. [220] entwickelten ein TNT-Aptamer. Diese RNA-Sequenz
aus 86 Nukleotiden wurde mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und in einem
dem indirekten, kompetitiven Immunoassay ähnlichen Format eingesetzt. Die
Arbeitsgruppe konnte damit Messungen bis in den pM-Bereich vornehmen und
sie stellten keine Kreuzreaktivitäten fest, was vergleichbar mit den Ergebnissen
der polyklonalen TNT-Antikörper von Ramin et al. [57] ist. Ebenso erreichten Ho
et al. [221] mit ihrem DNA-Aptamer aus 100 Nukleotiden einen erstaunlichen
Detektionsbereich, den sie mit 10-14 bis 10-3 M für das Sandwich-Assay angeben.
26 Grundlagen
Auch MIP wurden schon zur Detektion von Explosivstoffen eingesetzt. Sie wer-
den durch Vernetzung eines Polymers um eine dem Analyten möglichst ähnliche
Schablone (template) herum hergestellt. Nach dem Auswaschen der Schablone
steht eine für den Analyten selektive Bindungsstelle zur Verfügung [210]. Murray
und Arnold [222] nutzten beispielsweise ein polymerisierbares Porphyrin-Derivat
und den Analyten selbst als Schablone [223], um ein für TNT selektives MIP zu
erhalten und ließen sich das Verfahren patentieren. Sowohl mit Acrylamid als
auch mit Methacrylsäure als Monomere und TNT jeweils als Schablone gelang
Bunte et al. [224] die Herstellung TNT selektiver MIP, die Dinitrotoluol nicht ban-
den. Das Polyacrylamid-MIP erreichte die höchste Empfindlichkeit und ermöglich-
te auf einer Quarzkristall-Mikrowaage die Anreicherung von 150 pg je
Mikrogramm MIP pro Stunde aus der Gasphase. Für den elektrochemischen
TNT-Sensor von Alizadeh et al. [225] wurde ein Polymer aus Methacrylsäure
synthetisiert. Das erhaltene MIP diente der selektiven Anreichung von TNT und
befähigte das Sensorsystem so zu einer Nachweisgrenze von 1.5 × 10−9 mol L−1
(= 0.3 µg L-1).
Mit den beschriebenen Alternativen können in Assays teilweise ähnliche Emp-
findlichkeiten wie mit Antikörpern erreicht werden. Neben der Reproduzierbarkeit
in der Herstellung ist insbesondere die Toleranz der Aptamere gegenüber orga-
nischen Lösungsmitteln [220] und vor allem der MIP gegenüber chemischen,
thermischen und enzymatischen Einflüssen von Vorteil [209, 210]. Dennoch ha-
ben sie die Antikörper als selektives und empfindliches Mittel in der Analytik bis-
her nicht abgelöst. Obwohl die Methoden zu Generierung hochaffiner rekombi-
nanter Antikörper(-fragmente), Peptide, Aptamere und MIP zum Teil schon seit
langem bekannt sind (z. B. Phage display seit den 1980er Jahren [211]), sind
diese Verbindungen nicht kommerziell erhältlich [210]. Anhand des Beispiels TNT
konnte zudem gezeigt werden, dass diese Alternativen – mit Ausnahme der Ap-
tamere – dem Vergleich mit Antikörpern aus immunisierten Tieren nicht standhal-
ten können.
2.3 Antikörper-basierte Nachweissysteme (Immunoassays)
2.3.1 Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA)
Allgemeines
Es gibt zahllose Methoden, die auf der Antigen-Antikörper-Bindung beruhen. Als
erster Immunoassay gilt der von Yalow und Berson [226] beschriebene Radio-
immunoassay. Daraus wurden viele verschiedene Arten von quantitativen Immu-
noassays abgeleitet, die meisten zunächst mit einem medizinischen Hintergrund
[227]. Der wahrscheinlich prominenteste Vertreter unter den Immunoassays ist
der enzymgekoppelte Immnoassay (ELISA, enzyme-linked immunosorbent as-
Grundlagen 27
say). Er spielt nicht nur bei klinischen und biochemischen Untersuchungen eine
Rolle, wie bei der oben bereits geschilderten Gewinnung von Antikörpern (Ab-
schnitt 2.2.3) [228], sondern hat als schnelle und kostengünstige Methode auch
Einzug in die Umweltanalytik gefunden (z. B. [170, 229-231]).
ELISA haben gegenüber den Radioimmunoassays den Vorteil, dass hier an-
stelle von radioaktiven Isotopen (meist 125I oder 3H [232]) Enzyme zur Markierung
des Analyten oder des (sekundären) Antikörpers verwendet werden. Daneben
führt der Einsatz von Enzymen durch Ausnutzen der von ihnen katalysierten Re-
aktion zu einer Amplifikation des Signals, was die Grundlage für die hohe Emp-
findlichkeit des ELISA ist. Immunoassays können theoretisch eine Empfindlich-
keit von bis zu 10-15 bis 10-16 mol L-1 bzw. in der kompetitiven Variante bis zu
10-14 mol L-1 erreichen [233]. Die ersten ELISA sind parallel etwa 1971 entstan-
den. Engvall und Perlmann [234] setzten Alkalische Phosphatase und als chro-
mogenes Substrat p-Nitrophenylphosphat für ihren Assay ein. Avrameas und
Guilbert [235] verwendeten Meerrettich-Peroxidase (HRP) mit H2O2/o-Dianisidin
(3,3′-Dimethoxybenzidin) als chromogenes Substrat. Diese beiden Enzyme sind
bis heute üblich als Marker, seltener werden -Galactosidase, Glucoseoxidase
und andere eingesetzt. Daneben stehen diverse Chromogene, wie z. B. das be-
reits in Abschnitt 2.1.2 erwähnte ABTS, zur Verfügung, wobei die höchste Emp-
findlichkeit mit H2O2/3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) für HRP erreicht wird
[232, 233], das auch in dieser Arbeit verwendet wird [236]. Mit fluorimetrisch
nachweisbaren Substraten wie H2O2/3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure für HRP
oder 4-Methylumbelliferylphosphat lässt sich die Testempfindlichkeit um das
Zwei- bis Zehnfache erhöhen [232, 233].
In dieser Arbeit verwendete ELISA-Formate
In der vorliegenden Arbeit werden zwei Formate des heterogenen, kompetitiven
ELISA angewandt: der direkte und der indirekte. Der Ablauf beider ist in Abbil-
dung 2.4 dargestellt, wobei die Größenverhältnisse nicht der Realität entspre-
chen. Nach allen Schritten (außer dem Entwicklungsschritt) folgen Waschschritte.
Die hier gewählte Bezeichnung des direkten und indirekten Immunoassays ist
keineswegs allgemeingültig. Nicht selten werden Immunoassays über die Art und
Weise der Detektion mittels der Antikörper definiert [176, 232].
ELISA sind Festphasenassays und werden in Mikrotiterplatten aus Polystyrol
durchgeführt, welches eine hohe Bindekapazität für Proteine hat. Die Adsorption
der Proteine beruht hauptsächlich auf hydrophoben Wechselwirkungen [232]. Im
direkten Fall werden die Analyt-spezifischen Antikörper, vermittelt durch sekun-
däre Antikörper (-IgG), auf dem Träger immobilisiert (Beschichtung und Serum-
inkubation). Es wird außerdem ein Enzym-markierter Analyt, auch Tracer ge-
nannt, benötigt. Dieses HRP-Konjugat wird, ebenso wie das für den indirekten
ELISA notwendige Analyt-Protein-Konjugat (hier: OVA), durch kovalente Kopp-
lung des entsprechenden Haptens an die Proteine analog zur Synthese des Im-
munogens (Abschnitt 2.2.1) hergestellt. Das Analyt-OVA-Konjugat wird beim indi-
rekten Assay als erstes in der Mikrotiterplatte immobilisiert. Nach dieser Be-
28 Grundlagen
schichtung folgt ein Blockierungsschritt mit preisgünstigen und gut verfügbaren
Proteinen wie Casein, durch welche unspezifische Bindungen der Antikörper an
noch freie Stellen der Plattenoberfläche in den nachfolgenden Schritten verhin-
dert werden.
Wegen dieses zusätzlichen Schritts dauert die Durchführung des indirekten
ELISA auch länger als die des direkten. Ein Vorteil des indirekten Assays kann
aber sein, dass die Probe nicht in Kontakt mit dem empfindlichen Enzym kommt.
Während beim direkten ELISA der Analyt markiert ist, wird im indirekten der se-
kundäre Antikörper (-IgG-HRP) markiert. Das bedeutet, dass im entscheiden-
den Kompetitionsschritt im direkten Testformat der freie Analyt aus der Probe mit
dem HRP-Konjugat um die begrenzte Zahl der selektiven Bindungsstellen der
immobilisierten Antikörper konkurriert. Das gebundene HRP-Konjugat dient
schließlich der Detektion. Im indirekten ELISA erfolgt die Konkurrenzreaktion
zwischen dem freien Analyten und dem immobilisierten OVA-Konjugat um die
Antigenbindungsstellen der ebenfalls frei in Lösung befindlichen Antikörper aus
der Serumverdünnung. Detektiert wird dann der an das OVA-Konjugat gebunde-
ne Antikörper mit Hilfe des -IgG-HRP.
Der letzte Schritt, die Entwicklung des Assays, sowie seine Auswertung sind
für beide ELISA-Formate identisch. Die photometrische Endpunktbestimmung
des gebildeten gelben Farbstoffs erfolgt nach Absenkung des pH-Wertes,
wodurch einerseits die Enzymreaktion gestoppt wird und andererseits der in An-
wesenheit von HRP und Wasserstoffperoxid aus TMB entstandene, zunächst
blaue Farbkomplex zerfällt [237]. Hohe Extinktionen entsprechen in den kompeti-
tiven Assays niedrigen Analytkonzentrationen und geringere Extinktionswerte
höheren Konzentrationen des Analyten. Die Auswertung über eine
4-Parametergleichung (Gleichung 4, Abschnitt 3.3.5) [238], die einen sigmoidalen
Kurvenverlauf beschreibt, gilt schon lange als allgemein anerkannt [239]. Sie ist
vergleichbar mit Dosis-Wirkungs-Kurven aus der Pharmakologie [47], weswegen
die Konzentration im Wendepunkt der Kurve (Parameter C oder C-Wert in Glei-
chung 4), auch als mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) angegeben werden
kann. Dieser Testmittelpunkt kann direkt zur Abschätzung der Affinität der Anti-
körper (Gleichung 5) [240, 241] sowie zur Bestimmung der Kreuzreaktivität (Glei-
chung 7) [242] herangezogen werden. Die Werte der 4-Parametergleichung hel-
fen außerdem bei der Beurteilung des Messbereichs durch die Erstellung eines
Präzisionsprofils nach Ekins (Gleichung 6) [243], da durch den sigmoidalen Kur-
venverlauf die Werte mit den höchsten Steigungen (um den Testmittelpunkt her-
um) die höchste Genauigkeit aufweisen und die Messunsicherheit zu höheren
und niedrigeren Konzentration hin teils drastisch zunimmt. Zur Bestimmung der
Nachweisgrenze der ELISA wird verbreitet das Signal des Nullwerts (blank), das
auch dem A-Wert der 4-Parametergleichung gleichgesetzt werden kann, abzüg-
lich seiner dreifachen Standardabweichung betrachtet [244, 245].
Grundlagen 29
direkt indirekt
Beschichtung 18-25 h
Blockierung 1 h —
Seruminkubation 1 h
—
Kompetition 30 min
-IgG-HRP 30 min
—
Entwicklung bis zur Blaufär-bung, dann Stop-pen
Mikrotiterplattenoberfläche
-IgG
TATP-OVA-Konjugat Blockpuffer
polyklonale TATP-Antikörper
TATP-HRP-Konjugat
-IgG-HRP
TATP Entwicklung
Abbildung 2.4: Schema des direkten und indirekten TATP-ELISA.
30 Grundlagen
2.3.2 Immunchromatographischer Schnelltest (LFA)
Ein immunchromatographischer Schnelltest (LFA, lateral flow assay, auch
Dipstick-Test) wäre ein anwenderfreundlicher Ansatz zum Nachweis von TATP,
der nicht nur einfach und schnell, sondern auch kostengünstig und mobil ist.
Während zur Durchführung eines ELISA (und vieler anderer Methoden) geschul-
tes Fachpersonal benötigt wird, kann ein LFA jedermann handhaben. Dafür er-
möglichen sie häufig aber nur semiquantitative Aussagen [246]. Der wohl mit
Abstand bekannteste LFA ist der seit Mitte der 1980er Jahren eingesetzte Nach-
weis des humanen Choriongonadotropin (hCG) – ein Teststreifen zur Schwan-
gerschaftsfrüherkennung, der inzwischen sogar digital erhältlich ist [246, 247].
Die Funktionsweise eines LFA-Teststreifens beruht auf den Kapillarkräften,
durch die die flüssige Probe durch eine poröse Membran aus Nitrozellulose, Po-
lyester oder Viskose transportiert wird. Auf der Membran sind entweder Analyt-
spezifische Antikörper oder Analyt- bzw. Antigen-Protein-Konjugate, ähnlich den
zuvor beschriebenen direkten oder indirekten ELISA, immobilisiert. Verbreiteter
ist allerdings ein Sandwich-Format, für das zwei Antikörper benötigt werden, die
zwei unterschiedliche Epitope des gleichen Analyten erkennen. Nach Zugabe der
Probe bindet der im Probenauftragsbereich befindliche markierte Antikörper den
Analyten. Beide wandern als Komplex durch die Membran bis der Analyt von
dem zweiten, an der Membran immobilisierten Antikörper festgehalten wird. So
konzentrieren sich an dieser Stelle nur die Analyt-gebundenen markierten Anti-
körper auf und die zunehmende Färbung zeigt einen positiven Nachweis an. Zur
Detektion werden meist sichtbare Markierungen mit kolloidalem Gold oder ge-
färbten Kunststoffpartikeln eingesetzt, die einen Nachweis von bis zu 10-9 M bis
10-12 M gestatten [246]. Da TATP nur ein Epitop hat, muss in dieser Arbeit ein auf
dem indirekten, kompetitiven ELISA beruhender Aufbau (Abschnitt 3.3.6, Abbil-
dung 3.6) gewählt werden, wie er auch für Schnelltests zum Nachweis von
Saxitoxin [248] oder Aflatoxin [249] gezeigt wurde.
Die Tatsache, dass in der medizinischen Diagnostik, wofür die LFA ursprüng-
lich konzipiert waren, der Nachweis von Krankheitserregern oder anderen Fakto-
ren direkt aus einer geringen Menge (1 mL und deutlich darunter) Blut, Speichel
oder Urin erfolgt, zeigt, wie robust die LFA gegenüber komplexen Matrizes sind.
Das macht sie vermehrt auch für die Umwelt- und Lebensmittelanalytik interes-
sant [246, 249]. Inzwischen auch recht gebräuchlich sind immunchromatographi-
sche Nachweisverfahren für Drogen, die u. a. von Polizei und Zoll als Speichel-
oder Wischtests eingesetzt werden [250]. Für die Detektion von Explosivstoffen
sind kommerzielle LFA nicht bekannt, wurden aber z. B. von Girotti et al. [251] für
TNT durchaus entwickelt. Ihr Testsystem mit einem monoklonalen TNT-
Antikörper basiert ebenfalls auf dem indirekten ELISA-Format und kolloidalem
Gold als sichtbarem Marker und erreicht eine Nachweisgrenze von 1 mg L-1. Mit
dem aus denselben Immunreagenzien aufgebauten indirekten ELISA (mit
-IgG-HRP und Luminophoren) betrug die Nachweisgrenze < 1 mg L-1. Die Um-
stellung des TNT-LFA auf enzymkatalysierte Chemilumineszenz-Detektion ergab
Grundlagen 31
eine verbesserte Nachweisgrenze von 0.2 mg L-1, machte aber ein entsprechen-
des Messgerät erforderlich [252].
Obwohl die immunchromatographischen Schnelltests im Spurenbereich nicht
an die Empfindlichkeit klassischer Immunoassays heranreichen, so lassen sie
dennoch sehr schnell, innerhalb von Minuten, eine Aussage darüber treffen, ob
eine potenziell gefährliche Substanz vorliegt. Jedoch können die kommerziellen
Teststreifen zum Teil noch recht ungenau sein [247, 250], insbesondere durch
verschiedene Interpretationen von positiven und negativen Resultaten durch das
menschliche Auge [247]. Doch die Entwicklung der LFA geht schnell voran, vor
allem bezüglich der Reduzierung der Messunsicherheit. Mit elektronischen Ele-
menten, die sie langsam zu Biosensoren machen werden, lassen sich die Tests
digitalisieren sowie quantifizieren. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit bis in den
fM-Bereich kann z. B. die Detektion von Lumineszenzfarbstoffen ermöglicht wer-
den. Außerdem macht die relativ leichte Umsetzung des Nachweises mehrerer
Analyten (multiplexing) auf einem Teststreifen die LFA für viele Anwendungen
attraktiv [246].
2.3.3 Biosensoren
An dieser Stelle sollen nur einige Beispiele Antikörper-basierter Biosensoren,
sogenannter Immunosensoren, zur Detektion von Explosivstoffen vorgestellt
werden. Aufgrund nur weniger verfügbarer bzw. fehlender Antikörper für andere
Explosivstoffe sind bisherige Immunosensoren fast ausschließlich für den Nach-
weis von TNT entwickelt worden. Smith et al. [160] geben dazu einen guten Ein-
blick, der jedoch auch Methoden wie ELISA und LFA mit einbezieht, die ohne
Signalwandler und angegliederte Datenausgabe keine Biosensoren im eigentli-
chen Sinn darstellen. Eine Vielzahl an Systemen für Immunosensoren stellen
Conroy et al. [253] vor. Die selektive und hochaffine Bindung eines Analyten an
den entsprechenden Antikörper, wobei entweder ein Antigen-Konjugat oder der
Antikörper immobilisiert an der Sensoroberfläche vorliegen, wird durch elektro-
chemische, piezoelektrische und optische Systeme in ein quantifizierbares Signal
übersetzt.
Die meisten TNT-Immunosensoren nutzen die Oberflächenplasmonenreso-
nanzspektroskopie (SPR, surface plasmon resonance) [254], um die Analyt-
Antikörper-Wechselwirkung ohne die Notwenigkeit einer Enzym- oder Farbstoff-
markierung optisch zu detektieren. Ein (Protein-)Konjugat des Analyten oder ei-
nes Analogons wird dennoch benötigt, welches bei der häufig angewendeten
indirekten, kompetitiven Variante des Sensoraufbaus auf dessen Oberfläche im-
mobilisiert wird. Mit diesen SPR-Immunosensoren konnten Nachweisgrenzen für
TNT zwischen 2 und 8 ng L-1 erzielt werden, bei einer Zyklusdauer von 2 bis
13 min und mindestens 20 bis über 100 möglichen Zyklen durch die Regenerati-
on des Sensors mit einer Pepsinlösung [52, 255, 256]. Mit einem ähnlichen Sen-
sor, jedoch auf der Basis eines Displacement-(Verdrängungs)-Immunoassays,
32 Grundlagen
konnten Onodera et al. [257] zwar nur etwas unter 1 µg L-1 TNT detektieren, das
aber in 12 s und einer Regeneration mit Natriumhydroxidlösung in 3 s.
Andere Sensoren beruhen auf der Detektion von Fluoreszenz-markierten Ana-
lyten. Diese werden z. B. infolge der Verdrängung durch den Analyten von den,
auf einer Membran oder einem Säulenmaterial immobilisierten, Antikörpern frei-
gesetzt und von einem Detektor registriert. Mit dieser Anordnung in einem Con-
tinuous-flow-Immunosensor konnten TNT und RDX im ppb-Bereich [258] bzw. in
einem mikrofluidischen System TNT im ppb (µg L-1)-Bereich [259] bis 0.01 µg L-1
[260] und RDX bis in den unteren µg L-1-Bereich [261] nachgewiesen werden. Mit
kommerziellen Biosensor-Plattformen, die nach ähnlichen Prinzipien funktionie-
ren, und jeweils monoklonalen Antikörpern konnten 0.05 µg L-1 TNT in < 10 min
mit dem KinExA Inline-Biosensor [53, 262] und 10 µg L-1 TNT und RDX in etwa
5 min mit dem FAST 2000-Biosensor [263] bestimmt werden.
Ein Bespiel für ein nicht-optisches Detektionsverfahren ist der auf Kohlenstoff-
nanoröhren aufgebaute Displacement-Immunosensor von Park et al. [264]. Hier
erfolgte durch die Freisetzung des an ein immobilisiertes TNT-Analogon gebun-
denen Antikörpers bei der Zugabe von TNT eine Veränderung der Leitfähigkeit,
die gemessen wurde und so einen Messbereich von 0.5 bis 5000 µg L-1 TNT er-
möglichte. Larsson et al. [265] beschrieben eine indirekt, kompetitiv arbeitende
Sensorplattform, die sie sowohl mit optischen (SPR) als piezoelektrischen
(Quarzkristallmikrowaage) Signalwandlern testeten. Für beide Verfahrensweisen
konnten sie eine Nachweisgrenze von < 10 µg L-1 bestimmen. Allerdings dauerte
das Wiedererreichen der Basislinie mit der Mikrowaage fast eine halbe Stunde
und damit etwa achtmal so lang wie mit der SPR-Methode.
Da viele der vorgestellten TNT-Immunosensoren nicht die Empfindlichkeit des
ELISA erreichen und die Antikörper zunächst per ELISA (siehe auch Abschnitt
2.2.4, zwischen 1 und 0.002 µg L-1) charakterisiert werden, soll abschließend
noch die Entwicklung eines tragbaren TNT-Chemilumineszenz-ELISA erwähnt
werden. Ciumasu et al. [266] verwendeten einen für TNT spezifizierten Einmal-
chip, auf dessen Goldoberfläche der TNT-Antikörper immobilisiert wurde und der
außerdem auch das HRP-Konjugat und ein Probenreservoir enthält. Der Rest der
Apparatur blieb universell und könnte auch für andere Analyten mit dem entspre-
chenden Chip benutzt werden. Für TNT wurde damit eine Nachweisgrenze von
0.1 µg L−1 erreicht. Inzwischen lassen sich derartige Systeme noch weiter zu
einem ELISA-on-a-chip miniaturisieren – eine Möglichkeit, die sich, aufgrund der
relativ einfachen Umsetzung aus einem klassischen ELISA, der kurzen Entwick-
lungszeit von 30 s und der mit 0.027 µg L-1 hohen Empfindlichkeit (für kardiales
Troponin gezeigt) [267], vielleicht längerfristig durchsetzen kann [268].
2.3.4 Möglichkeit des Nachweises aus der Gasphase
Alle bis hierhin betrachteten Antikörper-basierten Methoden operieren in wässri-
ger Phase. Eine besondere Herausforderung, und vor allem für die Detektion von
Grundlagen 33
Explosivstoffen interessant, ist der möglichst direkte Nachweise aus der Umge-
bungsluft. Insbesondere für TATP mit seinem hohen Dampfdruck von 7 Pa bei
25 °C (vgl. TNT: 5 × 10-4 Pa (25 °C)) [79] bietet sich ein derartiges Verfahren an.
Jedoch sind Antikörper bzw. generell Proteine auf physiologische Bedingungen
angewiesen und ein Austrocknen führt aufgrund fehlender Wechselwirkungen
hauptsächlich mit Wassermolekülen zur Veränderung ihrer dreidimensionalen
Struktur (Denaturierung) und dadurch zu Einbußen in ihrer Funktion [269]. Daher
sind Gasphasen-Immunoassays selten.
Dennoch unternahmen Bowen et al. [48] einen Versuch, den sie fast identisch
zuvor zum Patent anmeldeten [270], und bauten zur Detektion von TNT aus der
Gasphase einen Antikörper-basierten SPR-Biosensor. Auf dessen Oberfläche
wurden monoklonale TNT-Antikörper kovalent an einen Monolayer gebunden,
der seinerseits an einem dünnen Goldfilm auf einem Trägerglas immobilisiert
war, was bedeutet, dass die Antikörper dann trocken lagen. Es konnte immerhin
gezeigt werden, dass TNT in gesättigter Gasphase, die sie bei 40 °C mit einer
Konzentration von 73 ppb angaben, nachgewiesen werden kann. Es kam jedoch
auch zu Kreuzreaktionen, u. a. mit Dinitrotoluol und Toluol, die jedoch nicht wie
TNT irreversibel an die Sensoroberfläche banden.
Eine Möglichkeit der Stabilisierung von Biomolekülen für die Anwendung in der
Gasphase demonstrierten Jaworski et al. [271]. Aus einer Phagen-Bibliothek
(Abschnitt 2.2.4) wurde zunächst ein Dinitrotoluol-bindendes Peptid aus zwölf
Aminosäuren selektiert, welches dann über ein Oligoethylenglykol auf einer
Goldoberfläche immobilisiert wurde. Das hygroskopische Oligoethylenglykol soll
als Hydrogel bewirken, dass das Peptid auch an der Luft nicht austrocknet. Lei-
der wurden auch hier nur wieder Tests in einem mit DNT gesättigtem Gasraum
(angegeben mit 18 ppm bei 60 °C) durchgeführt. Die Arbeitsgruppe konnte so
zwar zeigen, dass die Bindung von DNT an die selektive Oberfläche erfolgte. Es
trat zugleich aber eine Kreuzreaktion mit TNT ein, das trotz des deutlich niedrige-
ren Dampfdrucks [6] ein Viertel der Signalintensität von DNT erreichte. Dennoch
könnten Hydrogele helfen, Antikörper für den Einsatz in der Gasphase zu stabili-
sieren. Für den Nachweis von Kokain (bzw. Benzoylecgonin) aus der Luft mit
einem SAW (akustische Oberflächenwelle)-Immunosensor wurden Hydrogele
zuvor schon erfolgreich verwendet und dabei die auf der Sensoroberfläche über
Protein A immobilisierten Antikörper mit einem Hydrogelfilm überzogen [272].
Eine Nachweisgrenze wurde nicht angegeben (wieder in gesättigter Gasphase
getestet), aber es ist davon auszugehen, dass die Analyt-Antikörper-Bindung
durch den Einsatz des Hydrogels geschwächt wird [273], was sich negativ auf
Affinität und Selektivität auswirkt.
Generell kann ein Analyt auch aus der Gasphase angereicht und anschließend
aus flüssigem Medium untersucht werden. Durch die Kombination eines Con-
tinuous-flow-Immunosensors und einem Gerät zur Probenanreicherungen aus
der Luft (Zyklonabscheider) entwickelten Whelan et al. [54] ein schnelles
(< 10 min) Verfahren zum Nachweis von TNT aus der Gasphase. So wiesen sie
zwar TNT nicht direkt aus der Luft nach, konnten aber weiterhin in wässriger Lö-
34 Grundlagen
sung mit den monoklonalen TNT-Antikörpern arbeiten und noch 2.5 µg L-1 (11 nM
oder 2.5 ppb) TNT detektieren.
35
3.1 Materialien
3.1.1 Chemikalien
Sämtliche Chemikalien wurden in der angegebenen, zumeist höchsten erhältli-
chen Qualität verwendet und von AccuStandard (AccuStandard, Inc., New Ha-
ven, CT, USA), AppliChem (AppliChem GmbH, Darmstadt), Artimmun Analytik
(Artimmun Analytk GmbH, Kelkheim), J.T.Baker (Mallinckrodt Baker, inzwischen
Avantor, Griesheim), LGC Standards (LGC Standards GmbH, Wesel), Merck
(Merck KGaA, Darmstadt), SERVA (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg),
Protea Biosciences (Proteabio Europe S.A.S., Nîmes, Frankreich) und Sigma-
Aldrich (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) bezogen. Sigma-Aldrich um-
fasst die Marken Aldrich, Fluka, Riedel-de Haën und Sigma.
Substanz Reinheit
Hersteller, Bestellnummer Lotnummer
Aceton picograde
LGC Standards, SO-1142-B #603905 und #810903
Acetonitril Baker HPLC analyzed
J.T.Baker, 9012 #0726217021
Ammoniumnitrat ≥ 99.0%
Sigma-Aldrich, 09890 #1376281
Aprotinin from bovine lung, solid, 3-7 TIU mg-1
Sigma-Aldrich, A4529 #058K7018
2-Butanon ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 04380 #BCBB1352
Chloroform LiChrosolv
Merck, 102444 #K37538744
Chloroform-D1 99.8 atom % D
Sigma-Aldrich, 151823 #MKAA4173
Dichlormethan Baker, min. 99%
J.T.Baker, 7153 #0716302005
N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) ≥ 99%
Sigma-Aldrich, D80002 #S08931-183
Dikaliumhydrogenphosphat ≥ 99.0%
Sigma-Aldrich, 60354 #1408936 und #1438965
36 Experimenteller Teil
N,N-Dimethylacetamid ≥ 99.5%, over molecular sieve
Sigma-Aldrich, 38839 #1355816, #1390787 und #1437715
N,N-Dimethylformamid (DMF) ≥ 99.5%, over molecular sieve
Sigma-Aldrich, 40228 #1345724 und #BCBB4151
Dimethylsulfoxid (DMSO) ≥ 99.5%, over molecular sieve
Sigma-Aldrich, 41648 #BCBB4817
Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 71644 und 71643 #1278485 bzw. #BCBC4956
Dinatriumtetraborat wasserfrei zur Analyse
Merck, 106306 #A886806749
N,N′-Disuccinimidylcarbonat (DSC) ≥ 95.0%
Sigma-Aldrich, 43720 #1360733
Ethylenglykol ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 03750 #1447265
Glycerol wasserfrei reinst
Merck, 104093 #306K19201793
Haushaltszucker (Saccharose) Diamant (Pfeifer & Langen, Köln)
Hexamethylentetramin ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 33233 #SZE90680
n-Hexan picograde
LGC Standards, SO-1244-B #702401 und #812122
Isobutylchloroformiat 98%
Sigma-Aldrich, 177989 #1322957
Kaliumdihydrogencitrat ≥ 99.0%
Sigma-Aldrich, 60214 #1382178
Kaliumdihydrogenphosphat ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 60219 #1182467 und #1158643
Kaliumsorbat ≥ 99.0%
Sigma-Aldrich, 85520 #1209745 und #1254877
[12]Krone-4 98%
Sigma-Aldrich, 194905 #MKBB0225G9
[18]Krone-6 ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 274984 #1311427
Leupeptin-Hydrochlorid > 90%, microbial
Sigma-Aldrich, L9783 #089K8629
Methanol ≥ 99.8%, Baker HPLC analyzed
J.T.Baker, 8402 #0735216002, #0816316003 und #0908300015
Methanol-D4 min. 99.8% D
Merck, 106028
4-Methylmorpholin ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 67869 #1242607
Methylsulfonsäure ≥ 99.0%
Sigma-Aldrich, 64280 #1381742
Molekularsieb mit Farbindikator, 3 Å
Sigma-Aldrich, 69839 #1353770
Experimenteller Teil 37
N-Hydroxysuccinimid (NHS) zur Synthese, ≥ 99%
Merck, 804518 #S35137248
Natriumazid ≥ 99%
Sigma-Aldrich, 13412 #50170
Natriumchlorid ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 71378 und 71376 #1266100 und #1317413 bzw. #1429188
Natriumcarbonat ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 71345 #1202847
Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat ≥ 99.0%
Sigma-Aldrich, 71502 #1138615
Natriumhydrogencarbonat ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 71627 #1136674
Natriumhydroxid zur Analyse, max. 0.02% K
Merck, 106469 #B601169609
Natriumsulfat wasserfrei
Merck, 106639 #A637539537
Nitroguanidin contains 25% water
Sigma-Aldrich, N17351 #S31452
7-Oxooktansäure 98%
Sigma-Aldrich, 343625 #09017CE
Pefabloc SC AEBSF Function tested, homogeneous in TLC
Roche, 11429868001
Pepstatin A min. 98%
AppliChem, A2205 #9M005031
2-Pentanon ≥ 99.0%
Sigma-Aldrich, 68950 #1399841
3-Pentanon ≥ 99%
Sigma-Aldrich, 345121 #S78959-489
Phosphorsäure ≥ 85%
Sigma-Aldrich, 215104 #S01276-022
Polyvinylalkohol Mw 9 000-10 000, 80% hydrolyzed
Sigma-Aldrich, 360627 #03630EH
Salzsäure 32%, Baker analyzed
J.T.Baker, 6070 #0627901007
Schwefelsäure 95-97%, Baker analyzed
J.T.Baker, 6057 #0511210002
Sinapinsäure ultrapure, MALDI Matrix
Protea Biosciences, CMS-101 #0313092
Tetrabutylammoniumborhydrid ≥ 97.0%
Sigma-Aldrich, 86855 #422555/1 und #07420KA
Tetrahydrofuran (THF) ≥ 99.5%, over molecular sieve
Sigma-Aldrich, 87371 #1358908
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) research grade
SERVA, 35926 #080550 und #090248
38 Experimenteller Teil
Titan(IV)oxidsulfat schwefelsaure Lösung, 27-31% H2SO4
Sigma-Aldrich, 89532 #433555/1
p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat 98.5%
Sigma-Aldrich, T35920 #1356227
Trehalose-Dihydrat 97%
Artimmun Analytik #2007-1130
Triacetontriperoxid-Standard 0.1 mg mL-1 in Acetonitril
AccuStandard, M-8330-ADD-24 #B7090089
Trifluoressigsäure (TFA) 99%
Sigma-Aldrich, T6508 #096K152 (für HPLC)
Trifluoressigsäure (TFA) zur Proteinsequenzierung
Merck, 108178 #S4841878 825 (für MALDI-TOF-MS)
Tributylamin ≥ 99.0%
Sigma-Aldrich, 90780 #1281528
Tween 20 pure
SERVA, 37470 #090135 und #100541
Wasserstoffperoxid 30% (w/w)
Sigma-Aldrich, H1009 #S45604-507 (für Synthesen)
Wasserstoffperoxid ≥ 30%
Sigma-Aldrich, 95321 #1344721 (für ELISA)
Zitronensäure ≥ 99.5%
Sigma-Aldrich, 27488 #1436796
Diacetondiperoxid (DADP), Hexamethylentriperoxiddiamin (HMTD), Triacetontri-
peroxid (TATP) sowie die anderen Triperoxide (Tributanontriperoxid, Tri-2-
pentanontriperoxid und Tri-3-pentanontriperoxid) wurden aus den angegeben
Chemikalien selbst hergestellt.
Hexogen (RDX), Nitropenta (PETN, Pentrit), Oktogen (HMX) und 2,4,6-
Trinitrotoluol (TNT) wurden von der BAM, Fachgruppe 2.3, zur Verfügung ge-
stellt.
3.1.2 Proteine
Zur Synthese des Immunogens wurde Rinderserumalbumin (BSA, bovine serum
albumin), Fraction V receptor grade, lyophilized von SERVA Electrophoresis
GmbH, Heidelberg, Bestellnummer 11924, eingesetzt. Für die Immunogene 1
und 2 (Mausimmunisierung) wurde BSA mit der Lotnummer #14084 und für das
Immunogen 3 (Kaninchenimmunisierung) der Lotnummer #080026 verwendet.
Meerrettich-Peroxidase (HRP, horseradish peroxidase, EC 1.11.1.7), EIA gra-
de, Bestellnummer 10814393001 wurde von Roche Applied Science (Roche Di-
agnostics Deutschland GmbH, Mannheim) bezogen. Vier der HRP-Konjugate
(1-4) wurden mit HRP der Lotnummer #14265740 und das fünfte mit der Lot-
nummer #13074735 hergestellt. Diese Konjugate wurden in Guardian Peroxidase
Conjugate Stabilizier/Diluent von Pierce/Thermo Scientific (Thermo Fisher Scien-
Experimenteller Teil 39
tific BV & Co KG, Bonn) verdünnt und gelagert (Bestellnummer 37548, Lotnum-
mern #JC121597 und #JK128522).
Ovalbumin (OVA), MS grade zur Herstellung von OVA-Konjugaten wurde von
Protea Biosciences (Proteabio Europe S.A.S., Nîmes, Frankreich, Bestellnummer
PS-125, Lotnummer #0904081) erworben.
Die verwendeten sekundären Antikörper (-IgG) stammen von Acris Antibodies
GmbH, Herford. Für die Immunoassays mit Kaninchenserum wurde
-Kaninchen-IgG (Polyclonal Antibody to Rabbit IgG [H&L] - Purified, Bestell-
nummer R1364P, Lotnummer #19406) benutzt. Die Konzentration des aus Ziege
gewonnenen polyklonalen Antikörpers wurde mit 2.23 mg mL-1 angegeben.
ELISA mit Mausserum wurden zumeist mit -Maus-IgG (Polyclonal Antibody to
Mouse IgG [H&L] – Purified, Bestellnummer R1256P, Lotnummer #20243) aus
Schaf durchgeführt, wofür eine Konzentration von 2.17 mg mL-1 benannt wird.
Seltener wurde ein zweiter -Maus-IgG (Polyclonal Antibody to Mouse IgG F(c) –
Purified, Bestellnummer R1612P, Lotnummer #20185) verwendet, welcher in
Ziege erzeugt wurde, nur den Fc-Teil eines Maus-Antikörpers erkennt und eine
Konzentration von 2.05 mg mL-1 hat.
Des Weiteren wurden von Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, -IgG-
Peroxidase-Konjugate (-IgG-HRP) gekauft: -Maus-IgG-HRP (Anti-Mouse IgG
(whole molecule)–Peroxidase antibody produced in goat, 0.8 mg mL-1, Bestell-
nummer A4416, Lotnummer #067K6010) für Immunoassays mit Mausserum und
-Kaninchen-IgG-HRP (Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Peroxidase antibody
produced in goat, 0.9 mg mL-1, Bestellnummer A6154, Lotnummer #028K6035)
für Immunoassays mit Kaninchenserum. Gold-konjugierte -Kaninchen-IgG
(Dressed Gold, 40 nm, 50 OD, goat anti-rabbit IgG [H&L]) für immunchromato-
graphische Schnelltests wurden von BioAssay Works, L.L.C., Ijamsville, MD,
USA (Bestellnummer DGRGL-B001, Lotnummer #I07J-05) bezogen.
Als Pufferzusätze wurden BSA, ≥ 98%, lyophilized powder (Bestellnummer
A7906, Lotnummer #078K0729) und Casein, sodium salt from bovine milk (Be-
stellnummer C8654, Lotnummer #045K0159) verwendet. Außerdem wurde Pfer-
deserum, donor herd, USA origin, sterile-filtered, suitable for cell culture, suitable
for hybridoma (Bestellnummer H1270, Lotnummer #078K0375) bei einigen Tests
eingesetzt. Diese drei Komponenten wurden von Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München erhalten.
3.1.3 Puffer und Lösungen
Die nachstehenden Puffer und Lösungen wurden, sofern nicht anders angege-
ben, mit Reinstwasser angesetzt, welches zur Demineralisierung mittels Ionen-
austauscher und weiterer Reinigung durch ein Milli-Q-Wasserreinigungssystem
geleitet wurde.
40 Experimenteller Teil
Laufmittel A (HPLC) Wasser mit 0.1% (v/v) TFA
Laufmittel B (HPLC) Acetonitril/Methanol (10:1) mit 0.1% (v/v) TFA
PBS 10 mM Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat
70 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat
145 mM Natriumchlorid
pH 7.6
Natriumhydrogencarbonatpuffer 130 mM Natriumhydrogencarbonat
pH ~ 8
Waschpuffer, 60 × 45 mM Kaliumdihydrogenphosphat
375 mM Dikaliumhydrogenphosphat
1.5 mM Kaliumsorbat
3% (v/v) Tween 20
pH 7.6
(vor Verwendung 1:60 mit Wasser verdünnen)
0.1% BSA/PBS 0.1% (w/v) BSA
in PBS
(2-3 Tage bei 4 °C haltbar)
0.005% BSA/PBS 1:20 in PBS verdünntes 0.1% BSA/PBS
(2-3 Tage bei 4 °C haltbar)
Blockpuffer 1% (w/v) Casein
in PBS
(täglich frisch ansetzen)
Citratpuffer 220 mM Kaliumhydrogencitrat
0.5 mM Kaliumsorbat
pH 4.0
TMB-Lösung (nach [236]) 8.0 mM Tetrabutylammoniumborhydrid
40 mM 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB)
in N,N-Dimethylacetamid
(unter N2- oder Ar-Schutzatmosphäre herstellen)
Substratlösung 21.6 mL Citratpuffer
8,34 µL Wasserstoffperoxid
540 µL TMB-Lösung
(für eine Mikrotiterplatte, stets frisch ansetzen)
Protease-Inhibitor-Mix, 100 × 0.1% (w/v) Pepstatin A in Methanol
0.1% (w/v) Aprotinin in Wasser
0.1% (w/v) Leupeptin-Hydrochlorid in Wasser
12.5% (w/v) Pefabloc SC AEBSF in Wasser
zu gleichen Teilen mit weiterem Teil Wasser
mischen, Lagerung bei -20 °C
Experimenteller Teil 41
Faecesextraktionspuffer 1% (w/v) BSA oder 0.1% (v/v) Tween 20
1% (w/v) Natriumazid
1% (v/v) Protease-Inhibitoren-Mix, 100 ×
in PBS
(täglich frisch ansetzen)
Konservierungslösung 0.5% (w/v) BSA
0.5% (w/v) Polyvinylalkohol
0.5% (w/v) Trehalose-Dihydrat
in PBS
(täglich frisch ansetzen)
LFA-Vorbehandlungslösung 4-5% (w/v) Saccharose (Haushaltszucker)
0.5-0.6% (w/v) BSA
0.3-0.4% (v/v) Tween 20
in PBS
Die pH-Werte der in braunen Flaschen verwahrten Puffer wurden mit verdünnter
Salzsäure bzw. Natriumhydroxidlösung eingestellt. Citratpuffer und TMB-Lösung
wurden bei 4 °C und dunkel gelagert. Der 100 × Protease-Inhibitor-Mix lagerte
bei -20 °C. Die Lagerung der anderen Lösungen erfolgte bei Raumtemperatur.
Die Lösungen wurden maximal drei Wochen verwendet, ausgenommen die Sub-
stratlösung sowie alle proteinhaltigen Lösungen.
Die Herstellung von Stamm- und Kalibrierlösungen ist in späteren Abschnitten
beschrieben, etwa bei den Synthesen entsprechender Substanzen oder ihrer
Verwendung.
3.1.4 Verbrauchsmaterial
Beschreibung Hersteller
Dispensierspitzen, 1 und 2.5 mL Combitips plus
Eppendorf, Hamburg
Entsalzungssäule PD-10 Desalting Columns with Sephadex G-25 Medium
GE Healthcare Europe GmbH, München
GC-Säule DB-XLB, fused silica capillary column, 20 m × 0.25 mm ID × 0.25 µm
Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG, Wald-bronn
GC-Vorsäule deactivated fused silica capillary precol-umn, 2 m × 0.25 mm ID
Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG, Wald-bronn
Filtermembran Nucleopore Polycarbonate Track-Etch Membranes, 25 mm Ø, 0.6 µm
Whatman GmbH, Dassel (GE Healthcare)
42 Experimenteller Teil
HPLC-Säule UltraSep ES, Phen1, C18, Reversed pha-se, 260 mm × 3 mm, 5 μm
SEPSERV (Separation Service Berlin), Berlin
HPLC-Säule, monolithisch Onyx, Monolithic C18, 50 mm × 2.0 mm
Phenomenex Ltd., Aschaffenburg
Mikro-Entsalzungssäule Zeba Micro Desalt Spin Columns
Pierce/Thermo Fisher Scientific BV & Co KG, Bonn
Mikrotiterplatten, transparent, stark bindend Immuno 96 MicroWell Solid Plates, Ma-xiSorp, C96
Nunc GmbH & Co. KG, Langen-selbold (Thermo Scientific)
Mikrotiterplatten, transparent, unbehandelt 96 MicroWell Plates, Non-treated, Flat
Nunc GmbH & Co. KG, Langen-selbold (Thermo Scientific)
Mikrotiterplatten, UV-transparent UV-Star 96 Microplate, 96 Well
Greiner Bio-One, Frickenhausen
Mikrotiterplatte mit Glaseinsätzen 96er Ausführung, Volumen 1200 µL
Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt
Verschlussfolie Parafilm
Pechiney Plastic Packaging Com-pany, Chicago, IL, USA
Pipettenspitzen, diverse Größen epT.I.P.S.
Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen, für Liquidator96 LTS Tips, LQR-200
RAININ Deutschland/Mettler-Toledo GmbH, Giessen
pH-Indikatorpapier Universalindikator pH 1-14
Merck KGaA, Darmstadt
Schraubdeckelglasfläschchen, 2 mL Screw cap vials
Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG, Wald-bronn
Waschbehälter für Zapfenplatten TSP Washing Tray
Nunc GmbH & Co. KG, Langen-selbold (Thermo Scientific)
Zapfenplatten, stark bindend Immuno TSP, MaxiSorp
Nunc GmbH & Co. KG, Langen-selbold (Thermo Scientific)
Mikroreaktionsgefäße in diversen Größen und Ausführungen wurden meist von
Eppendorf, Hamburg bezogen oder die Eigenmarke von neoLab Migge Laborbe-
darf-Vertriebs GmbH, Heidelberg benutzt. Außerdem standen verschiedenste
klare und braune Flaschen mit einem Volumen von 15 mL bis einem Liter und
andere Glasgeräte zur Verfügung, u. a. von SCHOTT AG, Mainz und BRAND
GmbH + CO KG, Wertheim. Einmalspritzen und -kanülen in unterschiedlichen
Größen wurden von Becton Dickinson GmbH, Heidelberg (BD Plastipak und BD
Mircolance) bzw. Henke-Sass, Wolf GmbH, Tuttlingen (Norm-Ject) erworben.
Für den Aufbau eines immunchromatographischen Schnelltests (LFA) wurden
Produkte von Millipore (Millipore GmbH, Schwalbach/Ts.) und Whatman (What-
man GmbH, Dassel, zugehörig zu GE Healthcare) als Muster dankend erhalten.
Zusätzlich wurde von BioAssay Works, L.L.C., Ijamsville, MD, USA ein mit Gold-
konjugiertem Protein A getränktes Band Proben- und Konjugatauftragsvlies (Pro-
tein A Tell-Tale Gold ribbon, 0.25 OD cm-2, Bestellnummer TTGA-S001, Lot-
nummer I07J-06) beschafft.
Experimenteller Teil 43
Bezeichnung Beschreibung
Hersteller, Bestellnum-mer, Lotnummer
diagnostische Membran
Hi-Flow Plus HF120 Nitrocellulose, 120 s 4-1 cm-1
Millipore, HF12002XSS, #R9PN61120
Hi-Flow Plus HF135 Nitrocellulose, 1350 s 4-1 cm-1
Millipore, HF13502XSS, #R0BA96904
Immunopore RP Nitrocellulose, 85-115 s 4-1 cm-1
Whatman, 78356403, #D107720
Proben- und Konjugatauftragsvlies*
Hi-Flow G041 Glasfaser
Millipore, GFCP203000, #0585475
Rapid 24 Glasfaser, Absorptionsvermögen: 55 mg cm-2
Whatman, 8131-6621
Rapid 27 Glasfaser, Absorptionsvermögen: 40 mg cm-2
Whatman, 8132-6621, #880935
Standard 14 Glasfaser, Absorptionsvermögen: 55 mg cm-2
Whatman, S8133-6621, #680620
Absorptionsvlies*
Hi-Flow C083 Cellulosefaser
Millipore, CFSP223000, #88000702
CF3 Cellulosefaser, Wasseraufnahme: 31 mg cm-2
Whatman, 8113-6621, #900072
CF4 Cellulosefaser, Wasseraufnahme: 46 mg cm-2
Whatman, 8114-6621
CF6 Cellulose-Glasfaser, Wasseraufnahme: 128 mg cm-2
Whatman, 8116-6621, #755403
(*Verwendung in dieser Arbeit, Hersteller gibt mitunter mehrere Möglichkeiten an)
3.1.5 Geräte
Gerät Hersteller
Analysenwaage R 180 D-*D1
Sartorius AG, Göttingen
Einkanal-Pipetten, diverse Größen Research und Reference (variabel)
Eppendorf, Hamburg
ESEM Tabletop Microscope Hitachi TM-1000
Hitachi High-Technologie Corpora-tion, Tokyo, Japan
Evaporationsgerät SLS 02 Evaporator "Sweet Little Sixteen"
SLS Färber-Skutlarek GbR, Bad Münstereifel
44 Experimenteller Teil
GC-MS Trace DSQ mit CTC CombiPal (Probengeber)
Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen CTC Analytics, Zwingen, Schweiz
Handdispenser, manuell Multipette plus
Eppendorf, Hamburg
HPLC mit DAD Model 480 mit UVD 160S/320S
Gynkotek, inzwischen Dionex GmbH, Idstein
HPLC mit DAD Serie 1200
Agilent Technologies Sales & Ser-vices GmbH & Co.KG, Waldbronn
HPLC-MS Serie 1100 (HPLC) mit API 4000 (MS)
Agilent Technologies Sales & Ser-vices GmbH & Co.KG, Waldbronn (LC) und Applied Biosystems, Deutschland GmbH, Darmstadt
Hochauflösendes FT-ICR-MS LTQ FT
Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen
Magnetrührer, mehrfach Multipoint 15
H+P Labortechnik AG, Ober-schleißheim (Thermo Scientific)
MALDI-TOF-MS Reflex III
Bruker Daltonik GmbH, Bremen
Mehrkanal-Pipetten (8/12), elektronisch Research pro
Eppendorf, Hamburg
Mikrotiterplatten-96-Kanal-Pipette Liquidator96
Steinbrenner Laborsysteme GmbH, Wiesenbach (Mettler-Toledo, Gies-sen)
Mikrotiterplatten-Schüttler Titramax 101
Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach
Mikrotiterplatten-Spektrophotometer SpectraMax Plus384
Molecular Devices GmbH, Isma-ning
Mikrotiterplatten-Waschautomat ELx405 Select
BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall
Mikrozentrifuge (mit Kühlung) 5417 R mit Festwinkelrotor: FA-45-24-11 (rmax = 8.3 cm)
Eppendorf, Hamburg
NMR-Spektrometer, 400 MHz DMX 400
Bruker BioSpin GmbH, Rheinstet-ten
NMR-Spektrometer, 600 MHz Avance 600
Bruker BioSpin GmbH, Rheinstet-ten
Oberschalenwaage LP 1200 S(-OCE)
Sartorius AG, Göttingen
pH-Meter (pH/mV/°C) pH 211 Microprocessor
HANNA Instruments Deutschland GmbH, Kehl am Rhein
Röntgendiffraktometer SMART APEX II
Bruker AXS GmbH, Karlsruhe
Schüttler „Vortex“ MS 3 basic
IKA Werke GmbH & Co. KG, Stau-fen
Experimenteller Teil 45
Thermomixer, 1.5- und 2 mL-Adapter comfort
Eppendorf, Hamburg
Ultraschallbad Transsonic T 460
Elma GmbH & Co KG, Singen
Wasserreinigungssystem Milli-Q Synthesis A 10
Millipore GmbH, Schwalbach/Ts.
Das pH-Meter wurde mindestens einmal wöchentlich mit pH-Pufferlösungen von
Mettler-Toledo AG, Analytical, Schwerzenbach, Schweiz (Bestellnummern
51302069, pH 4.01; 51302047, pH 7.00 und 51302070, pH 9.21) kalibriert.
3.1.6 Computerprogramme
Für die Darstellung und Aufarbeitung der Ergebnisse wurden vorwiegend Micro-
soft Office 2003- und 2010-Produkte (Microsoft Corporation, Redmond, WA,
USA) sowie Origin 8G und 8.5G (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)
verwendet. Die chemischen Strukturen und die Vorhersage der NMR-Spektren
wurden mit ChemDraw Ultra 8.0 (CambridgeSoft Corporation, Cambridge, MA,
USA) erstellt. ArgusLab 4.0.1 (Mark A. Thompson Planaria Software LLC, Seatt-
le, WA, USA) wurde zum Zeichnen der Kugel-Stab-Modelle benutzt. Digitalkame-
ra- und ESEM-Aufnahmen wurden mit Corel PHOTO-PAINT X4 (Corel Corpora-
tion, Ottawa, CDN) nachbearbeitet.
Die Steuerung der einzelnen Geräte und zum Teil auch die Auswertung der
Ergebnisse erfolgte im Falle des Mikrotiterplatten-Spektrophotometers mit Soft-
max Pro 5.3 (Molecular Devices GmbH, Ismaning), für die HPLC von Gynkotek
über GynkoSoft 4.22 (Softron, inzwischen Dionex Softron GmbH, Germering) und
für die HPLC Serie 1200 von Agilent über ChemStation B.04.01 (Agilent Techno-
logies Sales & Services GmbH & Co.KG, Waldbronn), am GC-MS mit
Xcalibur 1.4 (Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen) sowie für die HPLC-MS
mittels Analyst 1.4.1 (Applied Biosystems/MDS SCIEX, Foster City, CA, USA).
Die Aufnahme und Prozessierung der NMR-Spektren erfolgte über Topspin 2.1
(Bruker BioSpin GmbH, Reinstetten). Die Daten zur Einkristallstrukturanalyse
wurden mit AXS SAINT 1.22 und SADABS 2.01 (Bruker AXS GmbH, Karlsruhe)
verarbeitet und die Strukturverfeinerung mit SHELXS 2008/1 und SHELXL
2008/4 [274] sowie die grafische Darstellung mit Mercury 2.4 (Cambridge
Crystallographic Data Centre, Cambridge, UK) vorgenommen.
46 Experimenteller Teil
3.2 Sicherheitshinweis
Das Arbeiten mit TATP erfordert äußerste Vorsicht: TATP neigt insbesondere im
trockenen Zustand dazu, unter Schlag, Reibung, statischer Elektrizität und Tem-
peraturerhöhung – aber auch spontan – zu explodieren. Außerdem sollte seine
Fähigkeit zur Sublimation berücksichtigt werden. Folglich sollte nur entsprechend
geschulten Personen der Umgang mit TATP unter Einhaltung angemessener
Schutzmaßnahmen gestattet sein. Zur Sicherheit wurden stets geringe Mengen
von maximal 100 mg synthetisiert und verarbeitet. Auch mit anderen Peroxid-
basierten Explosivstoffen ist so zu verfahren. Unter Einwirkung von schwefelsau-
rer Titan(IV)oxidsulfatlösung wurde TATP entsorgt.
3.3 Methoden
3.3.1 TATP-Synthese und weiterführende Untersuchungen
Synthese und Verarbeitung von TATP
Die Synthese und Reinigung durch Umkristallisation von TATP (3,3,6,6,9,9-
Hexamethyl-1,2,4,5,7,8-hexaoxonan) erfolgte auf Grundlage der Originalschrift
von Richard Wolffenstein [65] sowie den Arbeiten von Milas und Golubovic [89],
Matyas und Pachman [90] und Dubnikova et al. [46]. Dazu wurden 221 µL Ace-
ton (3 mmol) und 153 µL Wasserstoffperoxid (1.5 mmol, 30%) gemischt und auf
0 °C gekühlt, bevor 7.5 µL Schwefelsäure (0.015 mmol, 2 M) als Katalysator hin-
zugefügt wurden (Abbildung 3.1, Mechanismus siehe Abbildung 2.1). Der Ansatz
wurde anschließend bei Raumtemperatur ca. 24-48 h stehen gelassen. Die ent-
standenen TATP-Kristalle wurden abfiltriert und dreimal aus heißem Methanol
umkristallisiert.
Das gereinigte TATP wurde über Nacht im Exsikkator getrocknet, um dann per
NMR untersucht zu werden und vor allem der gravimetrischen Herstellung von
methanolischen Stammlösungen (1-15 g L-1) zu dienen. Aus diesen wurden Ka-
librierlösungen mit Reinstwasser volumetrisch angesetzt (Verdünnungsreihen im
Bereich von 0.8 ng L-1 bis 150 mg L-1), die hauptsächlich im ELISA verwendet,
die höheren Konzentrationen aber auch bei Untersuchungen mittels HPLC ein-
gesetzt wurden. Bei der HPLC wurden zusätzlich auch direkt die Stammlösungen
verwendet oder weitere methanolhaltige, nur wenig verdünnte Lösungen ange-
setzt sowie die Mutterlauge vom Umkristallisieren (gesättigte Lösung) benutzt.
Außerdem wurde eine gesättigte, wässrige Lösung mit ungelösten Kristallen da-
rin hergestellt, die zunächst mehrere Tage bei Raumtemperatur vor Sonnenlicht
geschützt geschüttelt und dann im Kühlschrank verwahrt wurde. Jeweils vor Ab-
nahme des Überstandes zu Messungen wurde diese Lösung am Tag zuvor unter
Schütteln wieder auf Raumtemperatur gebracht. Für GC-MS-Analysen wurden
Experimenteller Teil 47
Kalibrierlösungen in n-Hexan gravimetrisch hergestellt. Zusätzlich wurden kleins-
te TATP-Kristalle und unterschiedlich konzentrierte, wässrige TATP-Lösungen (je
50 µL) in gasdichte Schraubdeckelglasfläschchen mit Septen gegeben und meh-
rere Tage bei Raumtemperatur gründlich (horizontal und vertikal im Wechsel)
geschüttelt, um den Gasraum darüber zu sättigen und zu untersuchen. Die Kris-
talle zur Röntgenstrukturanalyse verblieben bis zur Untersuchung in ihrer Mutter-
lauge, da sie an der Luft zur Trübung neigten. TATP wurde stets dunkel gelagert,
wobei sich Feststoff, Mutterlauge und Kristalle in Mutterlauge bei Raumtempera-
tur und alle anderen Lösungen bei 4 °C befanden.
Abbildung 3.1: Schematische Darstellung der TATP-Synthese.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC und HPLC-MS)
Für verschiedenste Untersuchungen per HPLC mit Diodenarraydetektor (225 nm)
wurde ein binärer Gradient aus Laufmittel A (Wasser mit 0.1% (v/v) TFA) und
Laufmittel B (Acetonitril/Methanol (10:1) mit 0.1% (v/v) TFA) bei konstanter Fluss-
rate von 0.45 mL min-1 benutzt. Bei der Verwendung der UltraSep ES, Phen1-
Säule wurde zunächst mit einem dreiminütigen isokratischen Verlauf von 40%
Laufmittel B gestartet, welches dann innerhalb von 17 min auf 95% erhöht wurde.
Dieses Niveau wurde 10 min gehalten, ehe binnen 1 min die Ausgangsbedin-
gungen wieder eingestellt und damit die Säule für den nächsten Lauf 8 min äqui-
libriert wurde. Die Temperatur des Säulenofens betrug 30 °C.
Das HPLC-Programm wurde mittels HPLC (Serie 1100) mit Triple-Quadrupol-
Massenspektrometer-Kopplung (API 4000) und der UltraSep ES, Phen1-Säule
entwickelt und war ursprünglich zur Aufreinigung des TATP-Haptens (Abschnitt
3.3.2) vorgesehen. Da TATP und auch das Hapten nur sehr niedrige UV-Signale
liefern, mussten die Retentionszeiten mithilfe des Massenspektrums ermittelt
werden. Aufgrund des schwachen UV-Signals wurde auch die Verwendung von
Acetonitril als Laufmittel (niedrigere Basislinie) notwendig, wobei ohne einen Rest
Methanol (10% in Laufmittel B) TATP wiederum nicht im Massenspektrum zu
sehen war. TATP war nur mittels chemischer Ionisation bei Atmosphärendruck im
positiven Ionen-Modus (APCI+) ionisierbar und das Hapten durch Elektrospray-
Ionisation im Negativmodus (ESI-). Der Einsatz von TFA ist für Untersuchungen
von TATP nicht erforderlich, bei der Hapten-Aufreinigung verbessert es jedoch
die Auflösung.
Untersuchungen zur Synthese von TATP sowie Konzentrationsbestimmungen
wie die Bestimmung der Wasserlöslichkeit von TATP erfolgten an der HPLC Mo-
del 480 mit UVD 160S/320S mit der UltraSep ES, Phen1-Säule. Die Trennung
der beiden Konformere, D3- und C2-TATP, sowie die Untersuchung der Kinetik
48 Experimenteller Teil
deren gegenseitiger Umwandlung wurden mit dem Gerät der Serie 1200 durch-
geführt, welches auch eine Kühlung des Probensammlers ermöglichte. Es wurde
hierbei vor allem die monolithische Onyx-Säule verwendet (ebenfalls Umkehr-
phasen-Säule). Für diese kleinere, monolithische Säule musste auch das HPLC-
Programm verkürzt werden (Ofentemperatur und Flussrate blieben): Der isokrati-
sche Verlauf mit 40% Laufmittel B zu Beginn dauerte 0.5 min, ging anschließend
in 8.5 min auf 95% Laufmittel B über und wurde so dann 3 min gehalten. Nach
weiteren 0.5 min wurden die Ausgangsbedingungen wieder erreicht und verblie-
ben für 3.5 min vor dem nächsten Lauf.
Bestimmung der Wasserlöslichkeit von TATP
Die gesättigte, wässrige Lösung wurde fünf Tage bei Raumtemperatur geschüt-
telt, anschließend der Überstand (60-80 µL, n = 3) in die HPLC injiziert und mit
dem oben beschriebenen HPLC-Programm (mit TFA) analysiert. Durch Einsprit-
zen (n = 2) verschiedener Volumina (20 µL, 30 µL, 40 µL 50 µL und 60 µL einer
0.5 g L-1 TATP-Lösung, entsprechend 10–30 µg) einer 1:2 volumetrisch in Was-
ser verdünnten 1 g L-1 methanolischen TATP-Stammlösungen wurde auf die glei-
che Weise eine lineare Kalibriergerade über die Absorption erhalten. Die Retenti-
onszeit von TATP betrug 16.9 min. Die Wasserlöslichkeit von TATP wurde bei
22 °C bestimmt, da alle Abläufe bei dieser Raumtemperatur erfolgten.
Die so ermittelte Konzentration für die gesättigte TATP-Lösung wurde später
auch im ELISA mit Mausserum (Abschnitt 3.3.5) verifiziert. Dazu wurde eine
1:10-Verdünnungsreihe des Überstandes angefertigt, welche zur Erstellung einer
ELISA-Kalibrierkurve diente, die mit der Kalibrierkurve einer Verdünnungsreihe
mit bekannter Konzentration verglichen wurde (jeweils 8-Punkt-Kurven, n = 4, auf
gleicher Platte).
Kinetische Untersuchungen der Umwandlung zwischen D3- und C2-TATP
Wie schon Widmer et al. [104] zeigten, lassen sich die beiden TATP-Konformere
per HPLC voneinander trennen und anschließend die Geschwindigkeit ihrer Um-
wandlung beobachten. Dazu wurde die monolithische Säule wegen der deutlich
kürzeren Analysezeiten (Programm oben beschrieben) benutzt und ohne TFA-
Zugabe gearbeitet. Es wurden 7 µL der am höchsten erhältlichen TATP-Lösung
(methanolische Mutterlauge, extrapoliert: ~ 40 g L-1, Literaturwert [81]: 38 g L-1) in
das System eingebracht. Nach 2.5 min kam das Haupt-TATP-Signal des
D3-TATP-Konformers und nach 3.0 min das kleinere Signal des C2-TATP-
Konformers. Letzteres wurde in ein gekühltes Fläschchen aufgefangen und die
erhaltenen 150 µL mit 350 µL Wasser verdünnt. Dadurch stellte sich die Tempe-
ratur der Lösung schnell wieder auf Raumtemperatur (23 °C) ein und 50 µL der
verdünnten C2-TATP-Fraktion konnten alle 16 min reinjiziert werden. Gleiches
wurde wiederholt, nur dass die verdünnte C2-TATP-Fraktion bei 37 °C (mittels
Thermomixer) gehalten wurde und 90 µL reinjiziert werden konnten. Die Abnah-
me des Signals des C2-Konformers bei gleichzeitiger Entstehung des
D3-Konformers wurde bis zur Einstellung des Gleichgewichts im Chromatogramm
Experimenteller Teil 49
beobachtet. Aus den Messpunkten ließen sich die Halbwertszeiten der Umwand-
lung zwischen den TATP-Konformeren bei 23 °C und 37 °C über eine Exponenti-
alfunktion (ohne Berücksichtigung der Rückreaktion) bestimmen. Daraus konnte
die Umwandlungskonstante (Zerfallskonstante) k und mit ihr wiederum die Akti-
vierungsenergie EA mit
zumindest näherungsweise ermittelt werden, wobei R die allgemeine Gaskon-
stante und T die Temperatur in Kelvin ist. Außerdem konnte aus dem Verhält-
nis K der beiden Konformere im Gleichgewichtszustand die Energiedifferenz E
zwischen den beiden Konformeren in der Gasphase mit
berechnet werden (R und T wie zuvor).
Gaschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (GC-MS)
TATP, insbesondere sein Verhalten in der Gasphase, wurde auch gaschromato-
graphisch mit gekoppeltem MS (Trace DSQ) untersucht. Dazu wurde die Analy-
senmethode unter Aufnahme des kompletten Massenspektrums von m/z 30-400
mit Helium als Trägergas optimiert (mit Einflüssen aus [123-125]), die auch als
Referenzmethode dienen kann. Der Heliumfluss durch die DB-XLB-Säule mit
Vorsäule betrug stets 1.0 mL min-1. Die Starttemperatur des Säulenofens lag bei
60 °C für 2 min und es wurde dann mit 10 °C je Minute auf 150 °C hochgeheizt,
die wiederum 2 min gehalten wurden. Die Ausgangstemperatur des PTV-
Injektors wurde für 0.2 min bei 50 °C gehalten, ehe dieser mit 12 °C je Sekunde
auf 150 °C erhitzt wurde und 1 min bei dieser Temperatur verblieb. Die optimier-
ten Temperaturen der Transferleitung sowie der Ionenquelle betrugen 150 °C.
Die Quadrupol-Massenspektren wurden mit Elektronenstoßionisation bei 70 eV
im SIM-Modus mit m/z 59, 75 und 222 aufgenommen. Die Injektionen erfolgten
splitlos (1 min) und mit einer gasdichten 10 µL-Spritze des Probengebers, wobei
von den TATP-Lösungen in n-Hexan jeweils 1 µL injiziert wurde. Für die Gaspro-
ben erwies sich eine Dosierung von 6 µL am geeignetsten. Die Retentionszeit für
TATP betrug 8.4 min. Die Auswertung der Daten erfolgte manuell über die Sig-
nalflächen der Chromatogramme und es wurden lineare Kalibriergeraden (10
Messpunkte, n = 3) mit einem Korrelationskoeffizienten von jeweils > 0.99 erhal-
ten.
Bestimmung von TATP in der Gasphase
Zunächst wurde mittels GC-MS (siehe oben) die Konzentration von TATP in ge-
sättigter Gasphase bei 25 °C (Raumtemperatur) bestimmt. Dazu wurden jeweils
6 µL (n = 3-6) des Gasraums ausgiebig geschüttelter, gasdichter Schraubdeckel-
dT
kdRTEA
ln 2
(Gleichung 1)
K ln RTE2
3
C
D K mit (Gleichung 2)
50 Experimenteller Teil
glasfläschchen (n = 4), die kleine TATP-Kristalle enthielten, über Septen ent-
nommen und injiziert. Der TATP-Gehalt wurde anhand einer Kalibriergeraden mit
einem Korrelationskoeffizienten von 0.9993 bestimmt.
Des Weiteren wurde der Gasraum von auf gleiche Weise behandelten
Schraubdeckelglasfläschchen (n = 2), in denen sich jeweils 50 µL einer wässri-
gen TATP-Lösung der Konzentrationen 0.5, 50 bzw. 150 mg L-1 befanden, analy-
siert (n = 2). Dadurch sollte die Menge an TATP ermittelt werden, welches aus
der flüssigen Phase in die Gasphase übergeht. Das Volumen der verwendeten
Glasfläschchen wurde durch Auswiegen mit Wasser bestimmt und betrug durch-
schnittlich 2 080 µL. Die Probenvorbereitung und Messungen erfolgten bei 22 °C.
Einkristallstrukturanalysen
Die Einkristallstrukturanalysen wurden an einem Röntgendiffraktometer SMART
APEX II durchgeführt. Die dabei verwendete Strahlung war mit einem Graphit-
kristall monochromatisierte MoK-Strahlung ( = 0.71073 Å). Aufgrund des hohen
Dampfdrucks von TATP wurden diese Messungen bei -80 °C durchgeführt, die
restlichen Messungen jeweils bei Raumtemperatur (spätere Abschnitte). Die Da-
tenreduktion erfolgte mit den Programmen AXS SAINT und SADABS (Absorpti-
onskorrektur). Die anschließende Strukturlösung wurde mit Hilfe direkter Metho-
den und die Strukturverfeinerung (full-matrix least-squares on F2) mittels
SHELXS und SHELXL [274] durchgeführt. Dabei wurden die anisotropen Tempe-
raturfaktoren aller Nicht-Wasserstoffatome bestimmt. Die Wasserstoffatome wur-
den als isotrop angenommen mit einem Wert von Uiso = 1.2-mal dem Äquivalent
des Mutteratoms. Im Falle von Methylengruppen betrug dieser Wert 1.5.
Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)
1H- und 13C-NMR-Spektren wurden bei 25 °C unter Standardbedingungen zur
Kontrolle von Synthesen, insbesondere wenn aus diesen keine Kristalle resultier-
ten, aufgenommen. Die Strukturverifikation erfolgte über H,H-COSY- sowie H,C-
HMBC- und H,C-HSQC-Korrelationsspektren. Die Messungen entstanden am
600 MHz-Spektrometer (Avance 600) mit 600.20 MHz für 1H- und 150.94 MHz für 13C-Spektren oder am 400 MHz-Spektrometer (DMX 400) mit 400.14 MHz für 1H-
und 100.62 MHz für 13C-Spektren. TATP und andere zu untersuchende Substan-
zen wurden, wenn nicht anders erwähnt, in deuteriertem Methanol gelöst und auf
dessen Verschiebung gegen Tetramethylsilan = 3.31 ppm (CHD2OD) bzw.
= 49.15 ppm (CHD2OD) bezogen.
3.3.2 Synthese des TATP-Haptens
In abgewandelter Form der Synthese von TATP (Abbildung 3.1) konnte durch die
Zugabe von 7-Oxooktansäure ein carboxyliertes TATP, 6-(3,6,6,9,9-Pentamethyl-
1,2,3,5,7,8-hexaoxonan-3-yl)hexansäure (C14H26O8, M = 322.35 g mol-1), erzeugt
Experimenteller Teil 51
werden. Dieses TATP-Hapten wurde aus einer äquimolaren Mischung von je
0.5 mmol Aceton (37 µL), Wasserstoffperoxid (51 µL, 30%) und 7-Oxooktansäure
(79 mg, 98%) synthetisiert, der nach Kühlung auf 0 °C noch 2.5 µL Schwefelsäu-
re (0.005 mmol, 2 M) zugefügt wurde (Abbildung 3.2). Der Ansatz wurde für min-
destens 24 h bis hin zu mehreren Tagen bei Raumtemperatur inkubiert.
Abbildung 3.2: Schematische Darstellung der TATP-Hapten-Synthese.
Vor der Aufreinigung des TATP-Haptens mittels HPLC wurde 1 mL Wasser zu
dem Reaktionsansatz gegeben und dieser dann 10 min bei maximaler Ge-
schwindigkeit (16 400 rpm) zentrifugiert. Es entstanden zwei Phasen, von denen
die obere, wässrige verworfen und die untere, etwas zähflüssig-trübe in 500 µL
40% Laufmittel B (Ausgangsbedingung bei der HPLC) aufgenommen wurde.
Durch diesen Schritt konnte bereits ein Großteil der wasserlöslichen Verunreini-
gungen, wie auch Wasserstoffperoxid und die 7-Oxooktansäure, entfernt werden.
Das auf diese Weise vorgereinigte Produkt wurde anschließend per HPLC mit
der unter Abschnitt 3.3.1 aufgeführten Methode (mit TFA) von Ausgangsstoffe
und Nebenprodukten isoliert. Eine Trennung mit der monolithischen Säule gelang
nicht, während das Hapten von der UltraSep ES, Phen1-Säule 15.8 min (Model
480 mit UVD 160S/320S) bzw. 16.4 min (Serie 1200) eluierte. Das bei dieser
Reaktion ebenfalls entstandene TATP folgte bei Minute 17.3 bzw. 17.4. Die ge-
sammelte TATP-Hapten-Fraktion wurde unter einem Stickstoffstrom (SLS 02
Evaporator "Sweet Little Sixteen") eingedampft und über Nacht im Exsikkator
getrocknet. Die erhaltenen Kristalle wurden mittels Röntgenstrukturanalyse und
NMR (siehe Abschnitt 3.3.1) untersucht und mit der Struktur des TATP vergli-
chen. An einem Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-MS (ESI--FT-
ICR-MS) wurde außerdem ein hochaufgelöstes Massenspektrum aufgenommen.
3.3.3 Herstellung von Immunogenen und anderen TATP-Proteinkonjugaten
Kopplung des TATP-Haptens an Proteine
Der eigentliche Zweck der Synthese des TATP-Haptens war, ein kopplungsfähi-
ges TATP-Derivat zur Herstellung von TATP-Immunogenen und anderen TATP-
Proteinkonjugaten zu bekommen. Wie in Tabelle 3.1 aufgelistet, erfolgten zahl-
reiche Kopplungen nach verschiedenen Methoden und für unterschiedliche Ver-
wendungen. Die Konjugation erfolgt vorwiegend über die -Aminogruppen der
Lysinreste der Proteine. Theoretisch ist jedoch ebenso die Kopplung an selten
frei vorliegende Thiolgruppen der Cysteine sowie an Kohlenhydrate im Falle von
Glykoproteinen, zu denen auch OVA [275] zählt, möglich [276]. Für die stöchio-
52 Experimenteller Teil
metrischen Berechnungen der Reaktionsansätze wurde von Massen von 66 kDa
für BSA, 44 kDa für HRP und 43 kDa für OVA ausgegangen. Die Immunogene
(TATP-BSA-Konjugate) wurden den Versuchstieren zur Antikörperbildung injiziert
(Abschnitt 3.3.4), HRP-Konjugate dienten im direkten ELISA und OVA-Konjugate
im indirekten ELISA als Reagenzien (Abschnitt 3.3.5).
Tabelle 3.1: Synthetisierte Proteinkonjugate.
TATP-Proteinkonjugat
Methode Hapten:Protein
(Syntheseansatz) Bemerkung
Immunogen 1
gemischtes Anhydrid
22:1
insolubilisiert, zur Mausimmunisierung
Immunogen 2 NHS-Ester, THF 50:1 zur Mausimmunisierung
Immunogen 3
NHS-Ester, THF
38:1
zur Kaninchenimmuni-sierung
Immunogen 4 NHS-Ester, THF 13:1 nicht verwendet
HRP-Konjugat 1 NHS-Ester, DMF 21:1 hauptsächlich verwendet
HRP-Konjugat 2 NHS-Ester, DMF 36:1
HRP-Konjugat 3 NHS-Ester, THF 41:1
HRP-Konjugat 4 NHS-Ester, THF 49:1 kein MALDI-TOF-MS
HRP-Konjugat 5 gemischtes Anhydrid 41:1
OVA-Konjugat 1
NHS-Ester, DMF
07:1
häufig für Tests mit Mausserum verwendet
OVA-Konjugat 2 NHS-Ester, THF 24:1 nicht verwendet
OVA-Konjugat 3 NHS-Ester, THF 20:1 hauptsächlich verwendet
Das Immunogen 1 wurde nach der Gemischten-Anhydrid-Methode der Vorschrift
von Aslam und Dent [167] folgend, wie Abbildung 3.3 schematisch zeigt, herge-
stellt. Um bis zur Kopplung wasserfreie Bedingungen zu schaffen bzw. zu erhal-
ten, wurde Tetrahydrofuran (THF) 24 h über frisch regeneriertem Molekularsieb
nachgetrocknet und die Syntheseschritte unter Schutzgas (Argon oder Stickstoff)
durchgeführt. Es wurden 0.55 mg gereinigtes, trockenes TATP-Hapten (1.7 µmol)
in 74 µL THF gelöst und 13.5 µL einer 1:30 vorverdünnten Tributylamin-THF-
Lösung (1.9 µmol Tributylamin entsprechend) hinzugegeben. Nach kurzem Mi-
schen wurde der Ansatz auf 0 °C gekühlt und mit 12.4 µL einer 1:50 vorverdünn-
ten, gekühlten Isobutylchloroformiat-THF-Lösung (1.9 µmol Isobutylchloroformiat
entsprechend) versetzt. Das Reaktionsgemisch, welches schließlich TATP-
Hapten, Tributylamin und Isobutylchloroformiat im Verhältnis 10:11:11 enthielt,
wurde weitere 20 min bei ca. 0 °C leicht geschüttelt. Währenddessen wurden
6.17 mg BSA in 1.2 mL PBS (phosphate buffered saline, phosphatgepufferte
Salzlösung) gelöst (pH ~ 7-8) und ebenfalls gekühlt. Der Syntheseansatz mit
dem nun durch die Bildung eines reaktiven Anhydrids aktivierten TATP-Hapten
wurde vollständig in 1 mL der Proteinlösung (0.08 µmol BSA entsprechend) ge-
geben. Es ist bei diesem Schritt zu beachten, dass nicht mehr als 10% Lösungs-
mittel (100 µL THF) in die Proteinlösung (1 mL) gelangen, da Proteine sonst zu
denaturieren drohen. Zudem wurde nach dem Vermischen der pH-Wert erneut
geprüft und blieb unverändert. TATP-Hapten und Protein wurden letztlich im mo-
Experimenteller Teil 53
laren Verhältnis 22:1 zusammengebracht und der Immunogen-Ansatz wurde
nach 1 h schütteln bei ca. 2 °C aufgearbeitet und charakterisiert (siehe unten).
Abbildung 3.3: Schematische Darstellung der TATP-Proteinkonjugat-Synthese über die Gemisch-
te-Anhydrid-Methode.
Ähnlich dem Prinzip der Synthese des Immunogens 1 wurde auch ein HRP-
Konjugat (5) über die Aktivierung des TATP-Haptens als gemischtes Anhydrid
erzeugt. Jedoch wurde sich dabei nach Munro und Stabenfeldt [168] gerichtet,
die 4-Methylmorpholin als Base in der Reaktion anstelle von Tributylamin benutz-
ten. Außerdem wurde mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und bei -20 °C gearbei-
tet, aber weiterhin unter wasserfreien Bedingungen mit Schutzgas. Es wurden
60 µL DMF mit 0.48 µL 4-Methylmorpholin (4.3 µmol) vermengt und zum Lösen
von 0.97 mg trockenem TATP-Hapten (3.0 µmol) verwendet. Anschließend wur-
den 0.48 µL Isobutylchloroformiat (3.6 µmol) hinzugegeben, so dass Hapten,
4-Methylmorpholin und Isobutylchloroformiat in einem molaren Verhältnis von
5:7:6 vorlagen. Die Mischung wurde weiter bei -20 °C für 30 min auf einem Mag-
netrührer leicht gerührt. Währenddessen wurden 200 µL Wasser mit 120 µL DMF
vermischt und in 48 µL dieser Lösung 3.19 mg HRP aufgelöst und auf -20 °C
abgekühlt. Anschließend wurde unter Rühren langsam die Lösung mit dem
TATP-Hapten-Anhydrid zu der Proteinlösung pipettiert, so dass Hapten und Pro-
tein im Verhältnis 41:1 vorlagen. Der Ansatz wurde zunächst 1 h bei -20 °C und
dann weitere 2 h bei etwa 0 °C gerührt, ehe er aufgearbeitet und charakterisiert
(siehe unten) wurde.
Für die Herstellung der meisten Proteinkonjugate (Tabelle 3.1) wurde das
TATP-Hapten jedoch über die Bildung eines NHS-Esters zur Kopplung aktiviert,
wie in Abbildung 3.4 schematisch dargestellt. Dabei wurde sich an Tatake et al.
[166] und Franek et al. [165] orientiert. Auch bei dieser Methode ist es wichtig, bis
zur Kopplung an das Protein auf wasserfreie Bedingungen zu achten, so dass
wieder Lösungsmittel nachgetrocknet und unter Schutzgas gearbeitet wurde. Die
gesamte Durchführung erfolgte bei Raumtemperatur. Die eingesetzten Mengen
der Ausgangsstoffe zur Synthese des jeweiligen TATP-Proteinkonjugats sind in
54 Experimenteller Teil
Tabelle 3.2 aufgeführt. Wegen der geringen benötigten Mengen an N-Hydroxy-
succinimid (NHS, 97%) und N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 99%) wurden
zunächst Lösungen von beiden in wasserfreiem THF bzw. DMF hergestellt, de-
ren Konzentration so gewählt wurde, dass den Reaktionsansätzen jeweils zwi-
schen 10 und 20 µL davon hinzugesetzt werden musste. Nach dem Lösen des
trockenen TATP-Haptens in THF bzw. DMF wurde zuerst die entsprechende
Menge NHS-Lösung hinzupipettiert und der Ansatz mittels Thermomixer oder
Magnetrührer gemischt. Wurde mit THF gearbeitet, wurde an dieser Stelle au-
ßerdem etwas N,N′-Disuccinimidylcarbonat (DSC) [277] hinzugefügt, um die
wasserfreien Bedingungen zu garantieren. Anschließend wurde die benötigte
Menge DCC-Lösung dazugeben und der Reaktionsansatz über Nacht vor Licht
geschützt gerührt oder geschüttelt. Es bildete sich ein weißer Niederschlag (vor
allem aus Dicyclohexylharnstoff bestehend), der durch Zentrifugation (16
400 rpm, 10 min, 15 °C) entfernt wurde. BSA, HRP bzw. OVA wurden in 130 mM
Natriumhydrogencarbonatpuffer gelöst und unverzüglich der Überstand mit dem
aktivierten TATP-Hapten-NHS-Ester tropfenweise und unter stetigem Rühren
dazupipettiert. Zum Teil wurde ein Überstand auf zwei Proteinlösungen aufgeteilt
(in Tabelle 3.2 gekennzeichnet). Währenddessen sollte der pH-Wert der Lösung
bei ~ 8 bleiben und es wurde darauf geachtet, dass der Lösungsmittelanteil ma-
ximal 10% betrug. Der Konjugat-Ansatz wurde weitere 3-5 h gerührt, danach auf-
gearbeitet und charakterisiert (siehe unten). Falls die Aufarbeitung nicht sofort
geschieht, kann die Lösung auch über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
Tabelle 3.2: Eingesetzte Mengen der Ausgangsstoffe zur Synthese der Proteinkonjugate mit der
NHS-Ester-Methode.
TATP-Proteinkonjugat
Lösungs-mittel
TATP-Hapten [µmol]
[mg]
NHS [µmol]
[mg]
DCC [µmol]
[mg]
Hapten: NHS:DCC
(molar)
Protein [µmol]
[mg]
Immunogen 2▲ THF 1.7 0.54
2.5 0.30
2.5 0.52
2:3:3 0.033 2.2
Immunogen 3◊ THF 6.8
2.2
8.2 0.97
8.2 1.7
5:6:6 0.18 12
Immunogen 4◊ THF 1.6
0.50 1.9 0.22
1.9 0.39
5:6:6 0.12 8.0
HRP-Konjugat 1● DMF 1.9
0.61 3.8 0.45
3.8 0.79
1:2:2 0.089 3.9
HRP-Konjugat 2● DMF 1.6
0.53 3.3 0.39
3.3 0.68
1:2:2 0.045 2.0
HRP-Konjugat 3□ THF 2.9
0.95 4.4 0.52
4.4 0.92
2:3:3 0.072 3.2
HRP-Konjugat 4▲ THF 1.3 0.43
2.0 0.24
2.0 0.42
2:3:3 0.027 1.2
OVA-Konjugat 1● DMF 0.4
0.14 0.9 0.10
0.9 0.18
1:2:2 0.058 2.5
OVA-Konjugat 2□ THF 1.2
0.37 1.7 0.21
1.7 0.36
2:3:3 0.048 2.1
OVA-Konjugat 3 THF 6.5 2.1
7.8 0.93
7.8 1.6
5:6:6 0.33 14
gleiche Zeichen (▲◊●□) = aus einem Überstand mit aktivierten TATP-Hapten-NHS-Ester; HRP-Konjugat 4 wurde erst neun Tage später gekoppelt. Der TATP-Hapten-NHS-Ester-Ansatz stand bis dahin luftdicht verschlossen bei 4 °C.
Experimenteller Teil 55
Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der TATP-Proteinkonjugat-Synthese über die NHS-
Ester-Methode.
Reinigung der Konjugate und Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Reinigung der Proteinkonjugat-Ansätze erfolgte in der Regel am Tag der
Kopplung. Falls dies nicht möglich war, wurden die Ansätze bei 4 °C gelagert und
tags darauf aufgearbeitet. Durchgeführt wurde diese Reinigung mittels PD-10-
Säulen (bestehend aus Sephadex G-25, 5 mL Säulenvolumen), die zum Entsal-
zen von Proteinlösungen dienen und auf dem Prinzip der Gelfiltration (Größen-
ausschlusschromatographie) beruhen. Mit ihrer Ausschlussgröße von Molekülen
> 5 000 Da (= g mol-1) trennen sie die Konjugate von Ausgangs- und Nebenpro-
dukten der oben beschriebenen Synthesen ab. Die Trennleistung ist nicht ausrei-
chend, um ungekoppelte Proteine von gekoppelten zu separieren.
Neue PD-10-Säulen wurden mit 25 mL, bereits benutzte (nur mit gleichem
Konjugat wiederverwendet) mit 50 mL kaltem, 1:10-verdünntem PBS konditio-
niert. Vor dem Auftragen auf die Säulen wurden die Proteinkonjugat-Ansätze
10 min bei 4 °C und 16 400 rpm zentrifugiert, da häufig auch leichte Trübungen
erkennbar waren. Die gesamte Proteinlösung wurde dann mittig, möglichst ohne
den Säulenrand zu berühren, auf die Säulenoberfläche getropft und einlaufen
gelassen. Anschließend wurden 5 mL kaltes (~ 4 °C), 1:10-verdünntes PBS auf-
gegeben und das Eluat in UV-transparenten Mikrotiterplatten mit drei Tropfen pro
Kavität manuell aufgefangen. Die PD-10-Säule wurde mit 50 mL kaltem, 1:10-
verdünntem PBS vor dem nächsten Probenauftrag nachgespült oder mit 100 mL
kaltem, 1:10-verdünntem PBS oder Wasser gespült und bis zur nächsten Ver-
wendung maximal drei Monate bei 4 °C aufbewahrt. Die Platte mit den gesam-
melten Eluaten wurde im Mikrotiterplatten-Spektrophotometer (Spectra-
Max Plus384) bei 280 nm ausgelesen und die Fraktionen mit dem Proteinkonjugat
vereint, bei BSA- und OVA-Konjugaten komplett, bei HRP-Konjugaten als Haupt-
fraktion (Fraktionen mit den höchsten Signalen) und Nebenfraktion (Flanken der
Elutionskurve), um die Konzentration der Hauptfraktion möglichst hoch zu halten.
56 Experimenteller Teil
Die Konzentration der TATP-Proteinkonjugate in 1:10-verdünntem PBS wurden
photometrisch (280 nm) über eine Kalibriergerade des jeweiligen Proteins be-
stimmt. Dies erfolgte per Mikrotiterplatten-Spektrophotometer in UV-
transparenten Platten, in deren Kavitäten auf das gleiche Volumen der Lösungen
einer Kalibrierreihe und der zu bestimmenden Probe geachtet wurde. Der Aus-
gleich der Füllhöhen durch das Photometer „PathCheck“ funktioniert nicht adä-
quat. Zumeist wurden die restlichen Protein-Pufferlösungen von der Kopplungs-
reaktion (etwas mehr als nötig dabei angesetzt) verwendet oder frische Protein-
lösungen in 1:10-verdünntem PBS hergestellt, die dann 1:2 in 1:10-verdünntem
PBS verdünnt wurden. Aufgenommen wurden vier bis sieben Messpunkte im
Bereich von ca. 0.03 bis 1 mg mL-1 (n = 1). Die zu messenden Proben (n = 1-4)
mussten in der Regel 1:10 verdünnt werden, um Extinktionen < 1 und Werte im
Bereich der Kalibrierung zu erhalten. Die Konzentration der HRP-Konjugate wur-
de außerdem über den molaren Extinktionskoeffizienten der HRP,
= 102 L mmol-1 cm-1 ( = 402 nm) [278, 279], ermittelt und in die Mittelwertbil-
dung mit einbezogen, wenn die Kalibriergerade nicht mit HRP erstellt wurde.
Bestimmung der Kopplungsdichten
Nach der Reinigung der TATP-Proteinkonjugate wurden mittels Matrix-
unterstützter Laser-Desorption/Ionisation-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI-
TOF-MS) die Kopplungsdichten bestimmt. Das Gerät (Reflex III) arbeitet bei einer
Beschleunigungsspannung von 20 kV und mit einem Stickstofflaser, der mit einer
Pulsdauer von 3 ns die Proben im Hochvakuum desorbiert und ionisiert. Als
Matrix diente Sinapinsäure, die in einer Konzentration von 10 g L-1 in wässriger
Lösung mit 50% (v/v) Acetonitril und 0.05% (v/v) TFA immer frisch angesetzt
wurde. Auf den Probenteller wurden als erstes 0.5 µL dieser Matrixlösung aufge-
tragen und 10-20 min an der Luft trocknen gelassen. Die Proben, Lösungen ge-
koppelter und ungekoppelter Proteine, wurden entsalzt, indem 10 µL auf eine
zuvor äquilibrierte Mikro-Entsalzungssäule (Zeba Micro Desalt Spin Columns)
aufgegeben und 90 s bei 10 000 rpm zentrifugiert wurden. Mit 10 µL Wasser
wurden die Proteine anschließend wieder von der Säule durch zweiminütige
Zentrifugation bei 10 000 rpm eluiert und 50 µL Matrixlösung dazugegeben. Von
diesem Protein-Matrix-Gemisch wurden ebenfalls 0.5 µL auf den Probenteller mit
der getrockneten Matrix gegeben und vor der Messung für 1-2 h bei Raumtempe-
ratur an der Luft getrocknet.
Zur Auswertung und Darstellung der Spektren (mit Origin) wurden sie zunächst
auf eine gemeinsame Basislinie gebracht, in dem der Mittelwert eines Bereiches
(m/z 10 000) mit Hintergrundrauschen von allen Werten abgezogen wurde. Au-
ßerdem wurden sie mit einem gleitenden Durchschnitt von 300 Punkten geglättet.
Die daraus resultierenden Maxima des TATP-Proteinkonjugats und des unge-
koppelten Proteins wurden als Molekülmassen zur Berechnung der mittleren
Kopplungsdichten benutzt, wobei die Massenzunahme des Proteins nach der
Konjugation gegenüber dem (ungekoppelten) Protein beobachtet wurde:
Experimenteller Teil 57
Aufgrund der fehlenden Massenkalibrierung des MALDI-TOF-MS mussten
grundsätzlich die ungekoppelten Proteine immer wieder mitbestimmt werden In
den Grafiken (Abschnitt 4.3, Abbildung 4.7) wird daher nur die Differenz der bei-
den Maxima (TATP-Proteinkonjugat – Protein, m/z) angegeben. Die Signale der
mehrfach geladenen Proteine und Konjugate wurden nicht zur Auswertung her-
angezogen.
Lagerung
Die Langzeitlagerung sämtlicher TATP-Proteinkonjugate erfolgte bei 4 °C. Auch
während aller Arbeiten wurde darauf geachtet, dass die Proteinlösungen mög-
lichst auf ~ 4 °C gehalten wurden (ausgenommen Synthese). Ebenfalls zum
Schutz der Proteine (vor Verunreinigungen wie Bakterien-/Pilzbefall oder generell
Proteasen) wurden größere Mengen in kleine Aliquote aufgeteilt.
Die HRP-Konjugate wurden mit gleichem Volumen Guardian versetzt und ali-
quotiert. Guardian wurde speziell zum Stabilisieren der HRP entwickelt, welche
als Enzym empfindlicher ist, als nicht-katalytisch wirkende Proteine wie die glo-
bulären Albumine. Ein Verlust ihrer enzymatischen Aktivität hätte negative Aus-
wirkungen auf den ELISA, weswegen auch kein Natriumazid eingesetzt werden
darf, welches üblicherweise zur Konservierung von Proteinlösungen verwendet
wird. Natriumazid ist ein (nahezu irreversibler) Inhibitor der HRP [280, 281]. Da
jedoch die genaue Zusammensetzung von Guardian unbekannt ist und mit gro-
ßer Wahrscheinlichkeit Proteine wie BSA enthalten sind, müssen alle Charakteri-
sierungen vor der Guardian-Zugabe erfolgen. Daher wurden auch 100 µL jedes
synthetisierten HRP-Konjugats ohne Guardian zurückgestellt. Auch die OVA-
Konjugate wurden aliquotiert, wobei die Hälfte der Lösungen unbehandelt blieb
und die anderen Aliquote mit 0.5% Natriumazid aus einer 10%igen (w/v) Lösung
versetzt wurden.
Die TATP-BSA-Konjugate verblieben in 1:10-verdünntem PBS und konnten
ebenfalls nicht mit Natriumazid versetzt werden, da sie als Immunogene in die
Tiere injiziert wurden (Abschnitt 3.3.4). Es wurden Aliquote, die von 50 µg Immu-
nogen je Tier und Impfung ausgingen, an die jeweiligen Firmen gekühlt (in Styro-
porboxen mit Kühlakkus) versendet. Von Immunogen 1 und 2 wurden für die Im-
munisierung dreier Mäuse 150 µg, entsprechend der Proteinkonzentration also
100 bzw. 90 µL (aufgerundet) pro Aliquot abgefüllt und für die Immunisierung der
beiden Kaninchen 100 µg von Immunogen 3, was 13 µL (aufgerundet) entspricht.
Immunogen 1 wurde als einziges zudem noch insolubilisiert, indem den Aliquoten
1 mL Acetonitril zugeben wurde und die Proteine so ausgefällt wurden. Nach
24 h bei Raumtemperatur wurden die Ansätze bei 4 °C und 16 400 rpm für
10 min zentrifugiert. Nach dem Abnehmen des Überstandes und Eintrocknen des
Rests wurde erneut jeweils 1 mL Acetonitril auf die Niederschläge gegeben, die
sich auch nach 30 s im Ultraschallbad bereits nicht mehr lösten. Nach 3 h bei
WasserHapten-TATP
ProteinjugatProteinkon-TATP
M M
M M ichteKopplungsd
(Gleichung 3)
58 Experimenteller Teil
4 °C wurde erneut zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die Präzipitate
über Nacht im Exsikkator getrocknet. Die Reste der Immunogenlösungen sowie
die komplette Immunogen-4-Lösung wurde unaliquotiert bei 4 °C aufbewahrt.
3.3.4 Immunisierungen
Immunisierung dreier Mäuse
Tabelle 3.3: Zeitplan der Mausimmunisierung.
Injektion Tag Serumentnahme (Tag)
● Erstimmunisierung 50 µg 000 0 (präimmun)
● Boost 1 50 µg 042 048
● Boost 2 50 µg 084 091
● Boost 3 50 µg 126 133
● Boost 4 50 µg 154 166
● Boost 5 10 µg 182 189
● Boost 6 10 µg 210 217
● Boost 7 10 µg 252 259
● Boost 8 10 µg 294 301
● Boost 9 (final) 50 µg 320 (322, Milzentnahme)
Bis Boost 2 wurde insolubilisiertes Immunogen 1 verwendet, danach Immuno-gen 2.
Die unter Abschnitt 3.3.3 synthetisierten TATP-BSA-Konjugate wurden zur Er-
zeugung von TATP-Antikörpern in Versuchstieren benötigt. Dazu wurden drei
weibliche, ca. acht Wochen alte BALB/c-Mäuse zunächst mit dem insolubilisier-
ten Immunogen 1 erstimmunisiert. Dieses Immunogen mit einer niedrig gewähl-
ten Kopplungsdichte wurde auch für zwei Nachimmunisierungen (Boost) verwen-
det, ehe ab Boost 3 das höher-gekoppelte und lösliche Immunogen 2 injiziert
wurde. Die genaue zeitliche Abfolge und die injizierte Menge an Immunogen sind
in Tabelle 3.3 abzulesen. Alle Immunogengaben erfolgten intraperitoneal und mit
inkomplettem Freund-Adjuvans versetzt. Lediglich für die Erstimmunisierung
wurde das komplette Freund-Adjuvans verwendet und der finale Boost 9 wurde
ohne Adjuvans gesetzt. Diese letzte Nachimmunisierung wurde nur bei Maus 2
und 3 vorgenommen und diente als Vorbereitung auf die Milzentnahme und da-
mit die Herstellung der Hybridomzellen. Die Auswahl der Mäuse erfolgte durch
die Überwachung des Immunisierungsverlaufs per ELISA (Abschnitt 3.3.5) mit
(TATP-)Antikörper enthaltenden Serum-Proben, die allen Tieren in der Regel
sieben Tage nach erfolgter Injektion abgenommen wurden. Maximal 100 µL Se-
rum konnten dabei pro Maus gewonnen werden, welche nach Erhalt mit 0.5%
Natriumazid aus einer 10%igen (w/v) Lösung versetzt und bei 4 °C gelagert wur-
den. Sie standen für zahlreiche, weitere Untersuchungen mittels ELISA zur Ver-
fügung. An Tag 313 der Immunisierung wurden außerdem Kotproben der einzel-
Experimenteller Teil 59
nen Mäuse beim Einstreuwechsel (nach mehreren Tagen) zu Testzwecken ge-
sammelt.
Mit der Immunisierung, inklusive Tierhaltung, Serum- und Kotentnahme wurde
die Charles River Laboratories Research Models and Services Germany GmbH,
Kisslegg, beauftragt, die zu entsprechenden Tierversuchen berechtigt ist. Die
Immunogene wurden der Firma zugesandt und die einzusetzenden Mengen so-
wie der zeitliche Verlauf vorgegeben. Auf andere, dort übliche Verfahrensweisen
wurde kein Einfluss genommen und das dort verwendete Equipment daher unter
3.1 auch nicht aufgeführt. Nach Boost 9 wurden die Mäuse 2 und 3 lebend von
Kisslegg nach Marl zur Squarix biotechnology GmbH überführt, wo die Herstel-
lung der Hybridomzellen erfolgte.
Herstellung der Hybridomzellen
Die folgende Beschreibung der Herstellung der Hybridomzellen für die Produktion
monoklonaler Antikörper nach Köhler und Milstein [187] beruht auf dem Bericht
der Squarix biotechnology GmbH, Marl, die mit der Durchführung betraut wurde.
Auch die hierzu benötigte Ausstattung ist in dieser Arbeit nicht aufgeführt. In die
Vorgehensweise wurde nicht eingegriffen, jedoch wurden die Zellkulturüberstän-
de der Hybridomzellkulturen dort nicht untersucht. Diese wurden nach dem Ex-
pressversand (gekühlt, in Styroporboxen mit Kühlakkus) selbst mittels ELISA auf
das Vorhandensein von TATP-Antikörper getestet.
Die Mäuse 2 und 3 wurden zwei Tage nach dem letzten Boost getötet und ihre
Milzen unter sterilen Bedingungen entnommen. Die Milzzellen wurden desinte-
griert, indem die Milz durch ein spezielles Sieb gepresst wurde. Die Zellzahlen
wurden dann mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Milz und andere
Organe von Maus 2 wiesen makroskopisch keine pathologischen Veränderungen
auf. Die Zahl der Milzzellen betrug 8.2 × 107, von denen nur etwa 10% stimuliert
waren. Auch Maus 3 zeigte keine organischen Auffälligkeiten und es wurden
1.9 × 108 Milzzellen gezählt, von denen immerhin 20% stimuliert waren. Mit einer
Trypanblau-Färbung wurde die Vitalität der Zellen getestet, um die geeignete
Menge (lebender) Milzzellen für die Fusion mit HGPRT-defizienten Maus-
Myelomzellen (Linie P3-X63-Ag8.653) zu bestimmen. Bei der chemischen Fusion
mit Polyethylenglykol (M ~ 1 500 g mol-1) wurden Milzzellen und Myelomzellen im
gleichen Verhältnis zueinander eingesetzt. Anschließend wurden die Zellen in
HAT-Medium, welches zusätzlich 20% fetales Rinderserum enthielt, auf
96-Kavitäten-Zellkulturplatten verteilt, woraus fünf Platten für die Zellen von
Maus 2 und 12 Platten für die von Maus 3 resultierten. Zur Selektion wurden die
Hybridomzellen 14 Tage in dem Selektionsmedium gezüchtet, ehe zunächst
Aminopterin und sieben Tage später auch Hypoxanthin und Thymidin abgesetzt
wurden. Die noch verbliebenen Zellen wurden anschließend in RPMI 1640-L-
Glutamin-Medium mit 10% fetalem Rinderserum kultiviert.
Vierzehn Tage nach der Fusion wurden mikroskopisch etwa 500 Zellklone re-
gistriert. Hatten diese eine ausreichende Zelldichte erreicht, wurden alle Zell-
kulturüberstände einer Platte zum Testen erhalten, was wegen des unterschied-
60 Experimenteller Teil
lich schnellen Wachstums und der Wiederholungsmessungen mehrmals erfolgte.
Die ersten 68 Zellkulturüberstände wurden an Tag 18 nach der Fusion abge-
nommen und versandt. Weitere Abnahmen sämtlicher Überstände der 17 Platten
erfolgte an den Tagen 24, 32 und 53. Jeweils an den darauffolgenden zwei Ta-
gen wurden sie per ELISA untersucht. Die Klone zunächst positiv getesteter Zell-
kulturüberstände wurden in 24-Kavitäten-Zellkulturplatten überführt und zu weite-
ren Tests hochgezüchtet.
Immunisierung zweier Kaninchen
Tabelle 3.4: Zeitplan der Kaninchenimmunisierung.
Injektion Tag Serumentnahme (Tag)
● Erstimmunisierung 100 µg 000 0 (präimmun)
● Boost 1 100 µg 007 0—
● Boost 2 100 µg 010 014
● Boost 3 100 µg 018 021
● Boost 4 050 µg 042 049
● Boost 5 050 µg 056 063
● Boost 6 050 µg 084 091
● Boost 7 050 µg 112 119
● Boost 8 050 µg 140 147
● Boost 9 050 µg 168 175
● Boost 10 050 µg 196 203
● Boost 11 (final) 050 µg 224 231
Immunogen 3 wurde zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt, welche durch
Eurogentec S.A., Seraing, Belgien, durchgeführt wurde. Ähnlich wie schon für die
Mäuse wurde der Firma das TATP-BSA-Konjugat übergeben und die zu injizie-
renden Mengen sowie der zeitliche Verlauf bestimmt, wobei Details der dortigen
Abläufe und verwendeten Materialien (zum Teil auch Firmeninterna) unbekannt
blieben. Es wurden zwei, 9-12 Wochen alte, 2-2.5 kg schwere Kaninchen sub-
kutan immunisiert. Für den Beginn der Immunisierung wurde das Speedy 28-day
protocol [282] gewählt, welches vier Injektionen à 100 µg Immunogen in kurzer
zeitlicher Abfolge vorsieht (Tabelle 3.4, bis Boost 3). Laut Eurogentec S.A. hat
dieses Vorgehen keine Nachteile gegenüber einem üblichen, längeren Immuni-
sierungsverlauf, da ein firmeneigenes Nicht-Freund-Adjuvans eingesetzt wird. Ab
Boost 4 wurde die Immunisierung mit einem individuellen Zeitplan fortgesetzt und
den Tieren nur noch 50 µg Immunogen mit inkomplettem Freund-Adjuvans inji-
ziert (Tabelle 3.4). Die Blutabnahme erfolgte dann immer sieben Tage nach dem
letzten Boost. Nach der Untersuchung der Seren im ELISA (Abschnitt 3.3.5) wur-
de über den nächsten Boost entschieden, bis keine Verbesserung der TATP-
Antikörper, sowohl qualitativ als auch quantitativ, mehr festgestellt wurde. Ab
Boost 4 wurden jeweils 15-20 mL Serum pro Kaninchen erhalten, nach dem letz-
ten Boost sogar ~ 60 mL (ausgeblutet). Die Seren wurden zur Hälfte mit 0.1%
Experimenteller Teil 61
Natriumazid (aus 10%iger (w/v) Lösung) und der Rest mit 1% (aus 40%iger (w/v)
Lösung) konserviert, zu 1 mL-Aliquoten abgefüllt und bei 4 °C gelagert.
3.3.5 Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA)
Allgemeiner Ablauf und Auswertung der ELISA
Enzymgekoppelte Immunoassays (ELISA) wurden in transparenten, hochbinden-
den Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten bei Raumtemperatur durchgeführt. Wäh-
rend der Inkubationszeiten wurden die Platten mit Parafilm abgedeckt und auf
einen Schüttler (Titramax 101) bei 750 rpm gestellt. Die Waschschritte, drei im
direkten, vier im indirekten ELISA, erfolgten mit Waschpuffer (1 ×) in einem
Waschautomaten (ELx405 Select) zwischen den Inkubationen. Bei jedem
Waschschritt wurden gleichzeitig alle 96 Kavitäten dreimal hintereinander ge-
spült. Die stets auf 4 °C gehaltenen Seren wurden täglich frisch verdünnt und
zuvor 10 min bei 4 °C und 16 400 rpm zentrifugiert. Von den in Guardian gelager-
ten HRP-Konjugaten wurden 1:100-Vorverdünnungen in Guardian hergestellt, die
wenige Wochen verwendet wurden. Sämtliche im Folgenden angegeben HRP-
Konjugatverdünnungen beziehen diese Vorverdünnungen mit ein. Die vermerk-
ten Endkonzentrationen berücksichtigen zudem die Guardian-Zugabe bei der
Lagerung.
Zur Veranschaulichung der nachfolgend beschriebenen Schritte hilft Abbildung
2.4: Prinzipiell begann jeder ELISA mit einem Beschichtungsschritt, bei dem über
Nacht (ca. 18-25 h, selten auch mehrere Tage bei 4 °C) jede Kavität mit 200 µL
einer Verdünnung in PBS, je nach Format, entweder eines sekundären Antikör-
pers, -IgG (direkt) oder eines OVA-Konjugats (indirekt) inkubiert wurde. Im indi-
rekten ELISA wurde die Beschichtung durch einen anschließenden Blockie-
rungsschritt (~ 1 h) mit 200 µL Blockpuffer ergänzt. Bei direkten ELISA folgte die
Inkubation von 200 µL einer Serumverdünnung in BSA/PBS für 1 h. Dann
schloss sich bei beiden Assay-Varianten der Kompetitionsschritt an, wobei zu-
nächst eine Kalibrierreihe aus acht (bedingt durch die 8 × 12-Aufteilung der Plat-
te) TATP-Lösungen ausgewählter Konzentrationen, einschließlich Wasser als
Nullwert, à 200 µL in jeweils drei Kavitäten (n = 3) eingefüllt wurden. An dieser
Stelle wurden auch Proben oder Vergleichssubstanzen im gleichen Volumen
aufgetragen. Unmittelbar darauf wurden 50 µL Serumverdünnung in BSA/PBS
(indirekt) oder HRP-Konjugat-1-Verdünnung in 0.1% BSA/PBS (direkt) in jede
Kavität hinzugegeben und gemeinsam mit den Kalibrierlösungen eine halbe
Stunde inkubiert. Für den indirekten ELISA wurde noch ein 30-minütiger Enzym-
Inkubationsschritt mit 200 µL in 0.1% BSA/PBS verdünnter -IgG-HRP-Lösung
angehängt.
Die Detektion lief bei sämtlichen ELISA gleich ab. Zunächst wurden 200 µL der
frisch angesetzten Substratlösung in alle Kavitäten pipettiert. Das farblose
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) wurde durch Einwirken des Enzyms HRP in
Gegenwart von Wasserstoffperoxid zu einem blauen Farbkomplex umgesetzt.
62 Experimenteller Teil
Abhängig von der Farbentwicklung, idealerweise nach 30 min bei maximalen
Extinktionen um 1, wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 µL 1 M Schwefel-
säure und der damit einhergehenden Inaktivierung der HRP gestoppt. Dabei zer-
fiel durch das Abfallen des pH-Wertes auch der Farbkomplex und u. a. wurde ein
stabiler, gelber Farbstoff gebildet [237]. Die gesamte Mikrotiterplatte wurde dann
in einem Mikrotiterplatten-Spektrophotometer (SpectraMax Plus384) bei 450 nm
ausgelesen, mit 620 nm als abzuziehende Extinktion bei der Referenzwellenlän-
ge. Über die Steuerungssoftware Softmax Pro 5.3 oder mit Origin wurden die
gemessenen Extinktionen über die TATP (Analyt)-Konzentrationen halblogarith-
misch aufgetragen, so dass eine sigmoidale Kalibrierkurve (n = 3, wenn nicht
anders angegeben) entstand, die über eine 4-Parametergleichung [238] ange-
passt wurde:
Parameter A (oder A-Wert) beschreibt die obere Asymptote, die als höchstes
Signal etwa dem Nullwert (blank) entspricht und auch zum Vergleich der Antikör-
pertiter herangezogen wurde. Die untere Asymptote wird durch Parameter D be-
schrieben und zeigt den Untergrund der Messwerte und höchste Analytkonzent-
rationen (vollständige Verdrängung der HRP-Konjuagte durch Sättigung aller
Antigenbindungsstellen der Antikörper mit den Analyten) an. Parameter B ist die
Steigung in Parameter C, der die Konzentration im Wendepunkt der Kurve an-
zeigt und auch als Testmittelpunkt, C-Wert oder IC50 bezeichnet wird. Je kleiner
der Testmittelpunkt ist, desto empfindlicher ist der Antikörper, respektive der
ELISA. Die Konzentrationen der acht Kalibrierlösungen wurden so gewählt, dass
sie um den Testmittelpunkt herum angeordnet waren, wobei je eine im (begin-
nenden) Bereich des Parameter A (Nullwert) und des Parameter D (hohe Kon-
zentration) als „Anker“-Konzentrationen lag.
Bis auf die Detektion und Auswertung der ELISA wurden bei Optimierungsver-
suchen sowie zur Klärung verschiedener Fragestellungen zahlreiche Abweichun-
gen vom allgemeinen Ablauf des Immunoassays vorgenommen. Diese können
hier nicht einzeln und im Detail beschrieben werden, sind aber dann bei den ent-
sprechenden Ergebnissen vermerkt. Diese Veränderungen betreffen z. B. den
BSA- und Tween-20-Anteil in Verdünnungen, die Temperatur, die Verwendung
der sekundären Antikörper, Seren sowie HRP-Konjugate, die eingesetzten Volu-
mina und vieles mehr. Einige sehr spezielle Vorgehensweisen werden nachfol-
gend in diesem Abschnitt dargestellt.
ELISA mit Mausserum
Mit dem Serum der drei Mäuse wurden neben der Überwachung des Immunisie-
rungsverlaufs und der Vorbereitung auf die Untersuchung der Zellkulturüberstän-
de der Hybridomzellkulturen nur ausgewählte Versuche durchgeführt. Aufgrund
des Mangels an Mausserum war auch nur eine begrenzte Optimierung des Tests
D
C
c 1
D -A Extinktion
TATP
B
(Gleichung 4)
Experimenteller Teil 63
möglich. Die meisten weiterführenden Untersuchungen wurden mit Serum von
Maus 3 nach Boost 8 vorgenommen, wie die Bestimmung der Kreuzreaktivität.
Die Seren der anderen beiden Mäuse waren weitaus weniger affin und lieferten
nur im indirekten ELISA brauchbare Ergebnisse.
Für den direkten ELISA wurden die Mikrotiterplatten mit 1:2 000 in PBS ver-
dünnten -Maus-IgG beschichtet (1.1 mg L-1). In Verdünnung von 1:10 000 in
0.1% BSA/PBS wurden die Seren und das HRP-Konjugat 1 (0.2 mg L-1) einge-
setzt. Platten für den indirekten ELISA wurden mit 1:2 500 verdünnten OVA-
Konjugat 1 (1.2 mg L-1) beschichtet. Die Seren wurden 1:10 000 in 0.1%
BSA/PBS verdünnt verwendet und -Maus-IgG-HRP in PBS 1:5 000 (0.2 mg L-1)
verdünnt. TATP-Kalibrierlösungen wurden zunächst in einer 1:10-Verdünnungs-
reihe von 0.0001 bis 100 mg L-1 zuzüglich des Nullwerts hergestellt. Später wur-
de der Kalibrierbereich genauer eingegrenzt und TATP-Lösungen in den Kon-
zentrationen 0, 0.05, 0.3, 1, 3, 10, 30 und 100 mg L-1 verwendet.
Anders als oben im allgemeinen ELISA-Ablauf beschrieben, wurden der Kom-
petitionsschritt der meisten Mausserum-Assays mit 100 µL Kalibrierlösung und
entsprechend 100 µL HRP-Konjugat-1- bzw. Serumverdünnung durchgeführt.
Eine Ausnahme davon bildeten (hauptsächlich) die Untersuchungen zur Kreuz-
reaktivität, die parallel zu den Kaninchenserum-Tests durchgeführt wurden. Da-
bei wurden im Kompetitonsschritt 200 µL Kalibrierlösung je Kavität eingesetzt
und somit von der HRP-Konjugat-1- (direkt) bzw. Serumverdünnung (indirekt) nur
noch 50 µL verwendet. Aufgrund des halbierten Volumens wurden beide demzu-
folge nur 1:5 000 verdünnt. Im indirekten ELISA wurde zusätzlich auch das OVA-
Konjugat 3 mit einer Verdünnung von 1:20 000 (0.3 mg L-1) verwendet.
Eine weitere Besonderheit trat durch die Verwendung von Zapfenplatten bei
einigen Untersuchungen der Zellkulturüberstände der Hybridomzellkulturen auf.
Der Ablauf war weitestgehend identisch, jedoch wurden unbehandelte Mikrotiter-
platten als Reservoirs für die Lösungen der einzelnen Schritte (vom Beschichten
bis zur Substratinkubation) zum Eintauchen der 96 Zapfen benötigt. Der Vorteil
dabei lag darin, dass die Zellkulturüberstände nicht beim Waschschritt verloren
gingen und mehrmals untersucht werden konnten. So konnten die Überstände,
von denen nur je 200 µL zur Verfügung standen, entweder direkt und indirekt
oder auch auf Inhibitionsvermögen getestet werden. Nach der Beschichtung der
Zapfenplatten mit -Maus-IgG bzw. mit OVA-Konjugat 3 (1:15 000, 0.4 mg L-1,
mit anschließendem Blockierungsschritt) wurden die Zapfen 2 h in die gelieferten
Zellkulturüberstände gehängt. Anschließend wurden sie für 60 min in HRP-
Konjugat-1- bzw. -Maus-IgG-HRP-Verdünnungen inkubiert. Zuletzt wurden die
Zapfenplatten 45 min in Substratlösung gehalten. Die Bildung des löslichen
Farbstoffes und der Farbumschlag durch Zugabe der Schwefelsäure erfolgten in
den dabei zunächst als Reservoir dienenden Mikrotiterplatten, welche im Spek-
trophotometer ausgelesen wurden. Als Positivkontrolle wurde Maus-3-Serum,
Boost 8 in 1:7 700- und 1:77 000-Verdünnungen in Kavitäten mitgeführt, die vor-
her als frei von Zellen gemeldet wurden oder auf eine 18. Platte überführt wur-
den. Die Zapfenplatten wurden manuell in speziellen Behältnissen gewaschen
64 Experimenteller Teil
und wegen der schlechteren Durchmischung und geringeren Oberfläche bei
900 rpm geschüttelt. Bei positiven Ergebnissen wurden Inhibitionstests, als direk-
te und/oder indirekte ELISA in Mikrotiterplatten, mit unterschiedlich in PBS ver-
dünnten Zellkulturüberständen durchgeführt. Je nach Menge der Überstände
wurde entweder der Extinktionsabfall bei der Kompetition mit einer 0 mg L-1 zu
einer 100 mg L-1 TATP-Lösung beobachtet oder eine verkürzte Kalibrierreihe
inklusive Nullwert mit TATP-Konzentrationen zwischen ca. 0.1 und 177 mg L-1
(gesättigte Lösung, ohne jegliches Methanol) aufgenommen.
Faeces
Nicht nur die Seren sondern auch der Kot der Mäuse wurde mittels ELISA unter-
sucht, wobei auch hier vorwiegend Maus 3 im Fokus lag. Die Faeces wurden an
Tag 313 gesammelt, was zeitlich etwa der Serumentnahme nach Boost 8 ent-
spricht. Um TATP-Antikörper darin nachweisen zu können, mussten diese zu-
nächst durch Extraktion aufgeschlossen werden. Dazu wurden 0.5 g luftgetrock-
neter Kot in 7.5 mL Faecesextraktionspuffer (der entweder BSA oder Tween 20
enthielt) 23 h gründlich geschüttelt. Anschließend wurden die Extrakte zweimal
bei Raumtemperatur und 16 400 rpm für 10 min zentrifugiert, um Schwebteilchen
komplett zu entfernen. Die unverdünnten Extrakte der Faeces wurden neben
einer 1:30 000-Verdünnung in 0.1% BSA/PBS von Maus-3-Serum, Boost 8 im
direkten ELISA getestet. Das HRP-Konjugat (100 µL) wurde 1:10 000 in 0.1%
BSA/PBS verdünnt den Kalibrierlösungen (100 µL) zugesetzt. Die auf diese Wei-
se erzeugten TATP-ELISA-Kurven (n = 3) wurden dann bezüglich ihrer Testmit-
telpunkte miteinander verglichen.
ELISA mit Kaninchenserum
Seren zweier Kaninchen wurden ausgiebigen Untersuchungen unterzogen.
Hauptsächlich wurde dazu der direkte ELISA benutzt und die Mikrotiterplatten mit
einer 1:2 500-Verdünnung in PBS des -Kaninchen-IgG (0.9 mg L-1) beschichtet.
Die Seren wurden in 0.005% BSA/PBS 1:5 000 bis 1:600 000 je nach Boost und
Testzweck verdünnt. Zumeist wurden die Seren nach Boost 7 1:80 000 verdünnt
und nach Boost 11 in einer 1:100 000-Verdünnung eingesetzt. Ähnlich variabel
verhielt es sich mit den Verdünnungen des HRP-Konjugats 1 in 0.1% BSA/PBS,
die zwischen 1:20 000 (0.1 mg L-1) und 1:600 000 (0.004 mg L-1) lagen, meist für
ELISA mit Boost-7-Seren bei 1:100 000 (0.02 mg L-1) und mit Boost-11-Seren bei
1:300 000 (0.007 mg L-1). Die TATP-Kalibrierlösungen hatten Konzentrationen
von 0, 0.001, 0.05, 0.3, 1, 5, 50 und 500 µg L-1.
Der indirekte ELISA wurde mit Kaninchenserum selten und fast ausschließlich
mit Boost-7-Serum durchgeführt. Das OVA-Konjugat 3 zur Beschichtung der Plat-
te wurde 1:20 000 in PBS (0.3 mg L-1) verdünnt. Nach der Inkubation des Block-
puffers wurden zu den 200 µL Kalibrierlösung 50 µL der 1:40 000 Serumverdün-
nung in 0.005% BSA/PBS gegeben. Danach folgte die Einwirkung des 1:60 000
in 0.1% BSA/PBS verdünnten -Kaninchen-IgG-HRP (0.02 mg L-1).
Experimenteller Teil 65
Im Gegensatz zu der Untersuchung des Immunisierungsverlaufs der Mäuse
(Maus 3) konnten für die Kaninchenseren aufgrund der größeren Antikörpertiter-
unterschiede keine einheitlichen Verdünnungen verwendet werden. Die Darstel-
lung der Immunisierungsverläufe (Abbildung 4.9 und Abbildung 4.10) wurde nur
durch die Kombination von Kurven möglich, wozu die Durchführung von direkten
ELISA auf insgesamt vier Platten notwendig war. Auf der ersten Platte wurden
das Präimmunserum und die Seren nach Boost 2-4 mit einer Verdünnung von
1:10 000 aufgetragen und das HRP-Konjugat 1 1:20 000 verdünnt verwendet.
Platte 2 enthielt die 1:80 000 verdünnten Seren nach Boost 4-7 und die Verdün-
nung des HRP-Konjugats 1 betrug 1:100 000. Die Seren nach Boost 7-10 wurden
auf eine dritte Platte und die nach Boost 8-11 auf die vierte pipettiert. Beide Male
wurden die Seren 1:100 000 und das HRP-Konjugat 1 1:200 000 verdünnt. Die
Platte 1 wurde über die Kurven des Boost-4-Serums an die zweite Platte ange-
passt und sämtliche Kurven der ersten Platte aufgrund der A-Wert-Differenz von
Boost 4 entsprechend verschoben. Gleiches erfolgte mit den Kurven des
Boost-7-Serums (Platte 3 zu Platte 2) und des Boost-8-Serums (Platte 4 zu Platte
3).
Außerdem wurde der ELISA bezüglich des Testmittelpunkts mit jedem einzel-
nen Kaninchenserum optimiert, um die Entwicklung der Affinitätsreifung genau
verfolgen zu können. Dies geschah durch die zweidimensionale Verdünnung
jedes Serums zu dem HRP-Konjugat 1, bis bei einem bestimmten Verhältnis der
kleinstmögliche IC50 erhalten wurde. Häufig waren bei weiterer Verdünnung kaum
Veränderungen zu beobachten. Teilweise konnte aber nicht festgestellt werden,
ob die Optimierung abgeschlossen war, da trotz der Verlängerung der Inkubati-
onszeit der Substratlösung (1 h) die Extinktionen zu schwach wurden. Diese IC50
einer ELISA-Kurve (Parameter C der Gleichung 4) wurden dennoch zur Abschät-
zung der Affinität der Antikörper in den Seren herangezogen, wobei angenom-
men werden muss, dass die Konzentrationen von Antikörper und HRP-Konjugat
gegen null gehen [240, 241]:
Der IC50, also der C-Wert der ELISA-Kurve muss hier zunächst auf die tatsächli-
che Konzentration (Kalibrierlösungen sind mit HRP-Konjugat-1-Lösungen ver-
dünnt) gebracht und in mol L-1 angegeben werden.
Messbereich
Der Messbereich des TATP-Immunoassays wurde mit Seren beider Kaninchen
(Boost 11, 1:100 000, HRP-Konjugat 1 1:300 000) durch die Aufnahme eines
Präzisionsprofils nach Ekins [243] bestimmt. Dazu wurden 32 statt der üblicher-
weise acht Kalibrierlösungen zur Erstellung einer ELISA-Kurve (n = 3) benutzt,
deren Konzentrationen sich über den Bereich von 0.0008 - 2700 µg L-1 (zuzüglich
Nullwert) gleichmäßig etwa mit dem Faktor 1.7 verteilten. Anschließend wurden
50IC
1 Affinität (Gleichung 5)
66 Experimenteller Teil
die relativen Fehler der Konzentration jedes Messwertes unter Zuhilfenahme der
Parameter aus Gleichung 4 berechnet und gegen die Konzentration aufgetragen.
Die Nachweisgrenze der ELISA wurde aus den regulären 8-Punkt-Kurven (n = 3)
ermittelt, wobei auch mehrere Kurven verschiedener Platten berücksichtigt wer-
den konnten, so dass vor allem die Seren von Maus 3, Boost 8, sowie die
Boosts 7 und 11 der Kaninchen betrachtet wurden. Angewandt wurde die soge-
nannte 3s-Methode [244, 245], bei welcher die dreifache Standardabweichung
des aus der ELISA-Kurve erhaltenen A-Werts von eben diesem abgezogen wur-
de. Die entsprechende Konzentration wurde als Nachweisgrenze festgelegt.
Kreuzreaktivität
Zur Bestimmung der Kreuzreaktivität (KR) wurden die Wendepunktkonzentratio-
nen einer Kalibrierkurve (C-Wert, Gleichung 4, auch IC50) von TATP und einer zu
testenden Substanz (Kreuzreaktand) zueinander in Relation gesetzt [242]:
Für die molare Kreuzreaktivität wurden die Massenkonzentrationen zuvor in
Stoffmengenkonzentration umgerechnet. Die Kreuzreaktivität zeigt in Prozent die
Empfindlichkeit des TATP-Immunoassays (und damit des Antikörpers) gegen-
über anderen Substanzen an. Dazu wurden, wie oben beschrieben, ELISA-
Kurven der als interessant erachteten Stoffe mit acht Kalibrierlösungen inklusive
einem Nullwert (Wasser) auf einer einzelnen Mikrotiterplatte direkt mit einer
TATP-Kurve verglichen. Nur die Kreuzreaktivität des TATP-Haptens wurde auf
drei verschiedenen Platten zur Feststellung der Unsicherheit bestimmt (n = 3), da
alle anderen Substanzen keine oder nur schwache Kreuzreaktivitäten aufwiesen.
In letzteren Fällen wurde der Parameter D der 4-Parameteranpassung auf das
Niveau der TATP-Kurve gesetzt, um einen sigmoidalen Kurvenverlauf zu erzwin-
gen und eine Schätzung der Kreuzreaktivität zu ermöglichen. Sämtliche Kreuzre-
aktivitäten wurden mit den Seren beider Kaninchen nach Boost 7 (1:80 000,
HRP-Konjugat 1 1:100 000, selten indirekt: 1:40 000, -Kaninchen-IgG-HRP 1:60
000) und vereinzelt auch mit Maus-3-Serum nach Boost 8 (1:10 000, HRP-
Konjugat 1 1:5 000, indirekt: 1:5 000, -Maus-IgG-HRP 1:10 000) ermittelt.
Es wurden andere Explosivstoffe, strukturelle Analoga sowie die Ausgangsstof-
fe der TATP-Synthese ausgewählt, um die Seren auf Kreuzreaktivität gegenüber
diesen zu testen. Einige der Kreuzreaktanden mussten zunächst synthetisiert
werden, weil sie kommerziell nicht erhältlich sind. Von allen zu untersuchenden
Stoffen wurden Stammlösungen hergestellt, die dann in Wasser verdünnt wurden
[%] ionKonzentrat der Fehler relativer
B
TATP
B
TATPC
c 2
c
C
A)- (D B
Extinktion der weichungStandardab 100-
(Gleichung 6)
001 C
C KR
andKreuzreakt
TATP (Gleichung 7)
Experimenteller Teil 67
(Tabelle 3.5). Während die ersten Verdünnungen unterschiedlich waren (teils
bedingt durch die Löslichkeit in Wasser), folgten daraus jeweils sechs weitere
Kalibrierlösungen durch (meist) 1:10-Verdünnungsreihen. Als erste der insge-
samt acht Kalibrierlösungen für die Bestimmung der Kreuzreaktivität im ELISA
wurde stets reines Wasser verwendet (wie oben).
Tabelle 3.5: Herstellung der Stammlösungen zur Bestimmung der Kreuzreaktivität.
Substanz cStammlsg. [g L-1]
Lösungsmittel 1. Ver-
dünnung cKalibrierlsg. [mg L-1]
Lösungs-mittelrest
TNT1 5 CH3OH/DMSO 1:50 100 2%
RDX1 5 CH3OH/DMSO 1:50 100 2%
PETN1 5 CH3OH/DMSO 1:100 50 1%
HMX1 5 CH3OH/DMSO 1:500 10 0.2%
HMTD2 1 DMSO 1:10 100 10%
Nitroguanidin3 10 DMSO 1:100 100 1%
Ammoniumnitrat 10 Wasser 1:100 100 —
TATP-Hapten2,
4 ~ 1 CH3OH 1:100 8.88 1%
Tributanontriperoxid2,
4 — CH3OH 1:200 — 0.5%
Tri-3-pentanontriperoxid2,
4 — CH3OH 1:200 — 0.5%
Tri-2-pentanontriperoxid2,
4 — CH3OH 1:200 — 0.5%
DADP2 10 CH3OH 1:100 100 1%
[18]Krone-6 1 Wasser 1:10 100 —
[12]Krone-4 10 Wasser 1:100 100 —
7-Oxooktansäure 10 Wasser — 10 000 —
Aceton 10 Wasser — 10 000 —
Wasserstoffperoxid 10 Wasser — 10 000 —
1wegen der schlechten Löslichkeit in reinem Methanol in einem Gemisch aus gleichen Teilen
Methanol und Dimethylsulfoxid (DMSO) angesetzt; 2Details im Text unter dieser Tabelle;
3Wasseranteil von ~ 25% berücksichtigt, somit nur ungefähre Konzentrationsangabe möglich;
4nicht gravimetrisch hergestellt
Die TATP-Hapten-Stammlösung in Methanol wurde grob auf 1 g L-1 eingestellt
und dann 1:100 in Wasser verdünnt (und als höchst konzentrierte der acht Kalib-
rierlösungen eingesetzt). Die Konzentration der ca. 10 mg L-1 Lösung wurde mit-
tels HPLC (Abschnitt 3.3.1) mit einer 10 mg L-1 TATP-Stammlösung über die
Signalflächen verglichen und auf 8.88 mg L-1 berichtigt.
Tributanontriperoxid, Tri-3-pentanontriperoxid und Tri-2-pentanontriperoxid
wurden analog zur Synthese von TATP dargestellt. Wie oben beschrieben wur-
den 3 mmol des jeweiligen Ketons (267 µL Butanon, 319 µL 3- oder 2-Pentanon
anstelle von Aceton) mit 153 µL Wasserstoffperoxid (1.5 mmol, 30%) unter Ein-
wirkung von 7.5 µL Schwefelsäure (0.015 mmol, 2 M) zur Reaktion gebracht.
Nach 48-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Reaktionsansätze
vollständig in 10 mL Methanol aufgenommen und dienten so als Stammlösun-
68 Experimenteller Teil
gen. Ein in gleicher Weise behandelter TATP-Syntheseansatz wurde zur Ab-
schätzung der Syntheseausbeute und damit der Konzentrationen der Lösungen
anhand einer TATP-ELISA-Kalibrierkurve verwendet. Dabei wurde angenommen,
dass die Ausbeute der drei anderen Triperoxide der des TATP entspricht. Auf-
grund der Schwierigkeiten mit der Reinigung der Triperoxide, insbesondere in
Ermangelung der Kristallbildung, konnten mittels per NMR Indizien für erfolgrei-
che Synthesen gewonnen werden (Abschnitt 3.3.1).
Diacetondiperoxid (DADP) wurde entsprechend der Vorschrift in Dubnikova et
al. [46] aus TATP hergestellt. In 500 µL einer über Molekularsieb getrockneten
Lösung von p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat in Chloroform (~ 0.002 mmol,
< 5 g L-1) wurde 105 mg gewaschenes und gründlich getrocknetes TATP
(0.47 mmol) gelöst. Nach zweiwöchiger Inkubation unter Lichtausschluss bei
Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom verdampft
und das Produkt zweimal aus heißem Methanol umkristallisiert. Um eine mögli-
che Zersetzung des DADP zu verhindern, wurde es in Mutterlauge aufbewahrt.
Die gravimetrische Herstellung der 10 g L-1 DADP-Stammlösung in Methanol war
daher ungenau, weil Methanolreste mitgewogen wurden. Die Kontrolle der Syn-
these erfolgte mittels GC-MS, NMR und Einkristallstrukturanalyse (Abschnitt
3.3.1). Eine ebenfalls beschriebene Methode zur direkten Synthese von DADP
aus Aceton und Wasserstoffperoxid in Dichlormethan mit Methylsulfonsäure als
Katalysator war weniger effizient und verlief deutlich langsamer.
Abbildung 3.5: Schematische Darstellung der HMTD-Synthese.
Hexamethylentriperoxiddiamin (HMTD) wurde in Anlehnung an Wierzbicki und
Cioffi [283] synthetisiert. Dazu wurden 105 mg Hexamethylentetramin
(0.75 mmol) in 944 µL Wasserstoffperoxidlösung (9.24 mmol, 30%) gelöst und
nach dem Abkühlen auf 0 °C vorsichtig mit 177 mg kristalliner Zitronensäure
(0.72 mmol) versetzt (Abbildung 3.5). Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf
Raumtemperatur gebracht und nach spätestens fünf Tagen hatten sich HMTD-
Kristalle gebildet. Diese wurden erst ausgiebig mit Wasser, dann mit eiskaltem
Methanol gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Wegen der schlechten Lös-
lichkeit von HMTD in diversen Lösungsmitteln wurde die 1 g L-1 Stammlösung in
DMSO gravimetrisch hergestellt. Der Erfolg der Synthese wurde durch NMR und
Einkristallstrukturanalyse (Abschnitt 3.3.1) überprüft.
Ähnlich der Bestimmung der Kreuzreaktivitäten wurde auch die Toleranz der
ELISA (direkt und auch indirekt) gegenüber Lösungsmitteln untersucht. Dabei
wurde die Auswirkung von Aceton, Methanol, DMSO, Glycerol und Ethylenglykol
im Bereich von 0.5-50% (v/v) in Wasser, die anstelle der Kalibrierlösungen ein-
gesetzt wurden, beobachtet. Ebenso wurde beim Einsatz Wasserstoffperoxid
(0.1-15%, (v/v)) in hohen Konzentrationen geprüft, wann das Signal gegenüber
Experimenteller Teil 69
reinem Wasser abfiel. Vergleichbar war auch die Untersuchung der Effekte, die
HRP- (0.01-100 000 µg L-1) und OVA-Verdünnungsreihen (0.1-1 000 000 µg L-1)
im ELISA auslösten. Außerdem wurde der Einfluss von 2, 5 und 10% (v/v) Me-
thanol und 0.1, 0.2 und 0.5% (v/v) Tween 20 direkt in den Kalibrierlösungen ana-
lysiert.
Konformeren-ELISA
Da sich, wie in Abschnitt 3.3.1 beschrieben, die beiden TATP-Konformere D3 und
C2 per HPLC trennen lassen, sollten diese auch im ELISA unabhängig voneinan-
der untersucht werden. Dafür wurde 1 µL einer 10 g L-1 methanolischen TATP-
Lösung (= 10 µg TATP) chromatographisch (ohne TFA) getrennt. Im
0.05-Minutentakt wurden Fraktionen von jeweils ca. 18.5 µL (genaue Volumina
bekannt) in einer Mikrotiterplatte mit Glaseinsätzen bei 4 °C aufgefangen. Da ein
Eindampfen der Fraktionen nicht möglich war, weil TATP selbst dabei sublimie-
ren würde, wurde zu jeder Fraktion 1 mL Wasser geben, u. a. um den Anteil des
Lösungsmittels (~ 95% Acetonitril/Methanol) für den ELISA zu reduzieren. Die
verdünnten Fraktionen wurden ein weiteres Mal 1:10 verdünnt und anschließend
je 200 µL beider Verdünnungsstufen auf eine bereits mit Kaninchen-1-Serum
(Boost 11, 1:100 000) behandelte Platte geben. Aufgrund der kurzen Halbwerts-
zeit der Umwandlung der beiden TATP-Konformere ineinander, musste die ge-
samte Durchführung sehr schnell erfolgen. Daher wurde zum einen die monoli-
thische Säule mit dem nur 16-minütigen HPLC-Programm verwendet und zum
anderen die HRP-Konjugat-1-Konzentrantion sechsfach erhöht (1:50 000,
0.04 mg L-1). Dadurch konnte der Kompetitionsschritt nach 5 min beendet werden
und es vergingen nur 33 min vom Fraktionieren bis zum Ende des Kompetitions-
schritts. Die Auswertung erfolgte über die parallel auf der ELISA-Platte angefer-
tigten TATP-Kalibrierreihe, in dem die Konzentration der einzelnen verdünnten
Fraktionen bestimmt wurde und so auch das HPLC-Chromatogramm nachgebil-
det werden konnte. Die weniger stark verdünnten Fraktionen lagen dabei außer-
halb des Kalibrierbereichs und konnten nicht zur Auswertung herangezogen wer-
den.
Plattenkonservierung
Die Konservierung von ELISA-Platten dient nicht nur der Zeitersparnis sondern
vereinfacht auch die Kommerzialisierung von Tests. Es wurde ein durch Bahl-
mann et al. [284] für den Carbamazepin-ELISA mit monoklonalen Antikörpern
optimiertes Protokoll auf der Grundlage von Kolosova et al. [285] benutzt. Dabei
verliefen die ersten beiden Schritte des Immunoassays (Beschichtung mit
-Kaninchen-IgG und Inkubation mit Kaninchen 1, Boost-11-Serum) sowohl von
den Zeiten als auch den Konzentrationen wie oben beschrieben. Nach dem Wa-
schen und damit dem Entfernen der Serumverdünnung wurden jedoch in jede
Kavität 200 µL der Konservierungslösung pipettiert und diese 1 h einwirken ge-
lassen. Danach wurde die Lösung aus der Platte geschüttelt und diese einmal
vorsichtig auf einem Tuch ausgeklopft, so dass Tropfen entfernt wurden und nur
ein dünner Flüssigkeitsfilm auf der Kunststoffoberfläche verblieb. Die Platte wur-
70 Experimenteller Teil
de nun für 90 min bei 40 °C getrocknet, anschließend mit Parafilm gut verschlos-
sen und luftdicht (mit Trockenmittel) bei 4 °C gelagert. Die konservierten Platten
wurden direkt durch das Beginnen mit dem Kompetitionsschritt reaktiviert, was an
den Tagen 8 und 24 nach der Konservierung geschah. Zum Einschätzen der
Qualitätsverluste der konservierten Platten wurden jeweils frisch angefertigte
Platten parallel bearbeitet und die Signalhöhen sowie Testmittelpunkte (A- und C-
Werte, Gleichung 4) verglichen.
3.3.6 Immunchromatographischer Schnelltest (LFA)
Die nachstehenden Beschreibungen zu Aufbau und Durchführung eines immun-
chromatographischen Schnelltests (LFA, lateral flow assay) für TATP sind bis-
lang nur erste Schritte hin zu einem funktionsfähigen Test. Anhand der Produktin-
formationen der Hersteller der verwendeten Materialien Millipore GmbH und
Whatman GmbH (GE Healthcare) [286] sowie einer Dissertation zum Thema der
quantitativen LFA-Entwicklung [287] wurde eine erste Machbarkeitsstudie durch-
geführt.
Probenauftrag diagnostische Membran Absorption
Millipore
Hi-FlowG041
HF120 HF135
Hi-Flow C083
Whatman
Rapid 24 Rapid 27
Standard 14
Immunopore RP
CF3 CF4 CF6
1.5-2.0 cm 4.0-5.5 cm 1.5-2.0 cm
0.5 cm
TATP-OVA-Konjugat -Kaninchen-IgG
Abbildung 3.6: Schema des Aufbaus eines LFA-Teststreifens für TATP.
Ein LFA-Teststreifen wurde aus einem Proben- und Konjugatauftragsvlies, einer
diagnostischen Membran und einem Absorptionsvlies, in diversen Kombinationen
aller erhaltenen Mustermaterialien, zusammengesetzt (Abbildung 3.6). Diese
Bestandteile wurden im A4-Format geliefert und zunächst in 0.5 cm breite Strei-
fen geschnitten, wobei stets Handschuhe getragen wurden, um die Oberflächen,
insbesondere der Membranen, nicht zu berühren. Die drei einzelnen Komponen-
ten wurden dann auf einen umgedrehten Streifen transparenten Klebebands
fixiert, wobei mit der mittig liegenden Membran begonnen wurde. Ein 4-5.5 cm
langes Stück davon wurde anschließend auf der einen Seite von 1.5-2 cm des
Proben- und Konjugatauftragsvlies und auf der anderen von einem Stück Ab-
sorptionsvlies gleicher Länge mit jeweils ca. 2 mm Überlappung flankiert. Wäh-
rend bei der Membran auf die korrekte Ausrichtung von Ober- und Unterseite
geachtet werden musste (rückseitig ist ein dünner Plastikträger), spielte dies bei
den Vliesen keine Rolle. Sämtliche Materialien können ohne Vorbehandlung
verwendet werden. Dennoch wurde getestet, ob das Laufverhalten der Proben
durch das Einlegen der Proben- und Konjugatauftragsvliese in LFA-Vorbehand-
Experimenteller Teil 71
lungslösung (mit leicht variierender Zusammensetzung, in Anlehnung an die
Arbeiten von Klewitz [287, 288]) verbessert. Nach mindestens 3 h Schütteln in
dieser Lösung wurden die Vliese luftgetrocknet und konnten bei Raumtemperatur
länger aufbewahrt werden.
Noch vor dem Zusammensetzen der Teststreifen wurde auf die diagnostischen
Membranen in ca. 2 cm Abstand von der Probenauftragsseite eine senkrechte
Linie mit TATP-OVA-Konjugat 3 (6.3 mg mL-1) aufgebracht, um ein Testsystem
ähnlich dem indirekten ELISA zu erzeugen. Etwa 1 cm daneben wurde eine zwei-
te Linie mit -Kaninchen-IgG (2.23 mg mL-1) als Kontrolle aufgetragen (Abbildung
3.6). Beide Proteinlösungen wurden unverdünnt durch Beträufeln von 3 × 0.2 µL
mit der Einkanal-Pipette (Volumenbereich: 0.1-2.5 µL) aufgetragen. Die Membra-
nen wurden nun mindestens 4 h bei Raumtemperatur an Luft getrocknet und an-
schließend vor Staub geschützt gelagert, auch über mehrere Tage. Einige der
Membranen wurden noch mit Blockpuffer nachbehandelt. Dazu wurden sie zu-
nächst 10 min in dem Blockpuffer und nach einem Lösungswechsel nochmals für
mindestens 40 min vorsichtig geschüttelt. Anschließend wurden sie mehrere
Stunden in PBS mit 0.1% (v/v) Tween 20 gewaschen, wobei die Lösung viermal
erneuert wurde. Abschließend wurde die Membran mit PBS gespült, um sie vom
Tween 20 zu befreien, und konnte nach dem Trocknen verwendet werden.
Zur Probenvorbereitung wurden in PBS (häufig auch mit bis zu 2% (v/v) Casein
oder 0.1% (v/v) BSA versetzt) 1% (v/v) (1:100) Gold-konjugierte -Kaninchen-
IgG-Lösung und Kaninchenserum (Kaninchen 1, Boost 11) vorsichtig durch
Schwenken und Schütteln des Mikroreaktionsgefäßes vermischt. Das Kanin-
chenserum wurde dabei in Verdünnungen von 1:500-1:100 000 eingesetzt, meist
mit 0.1% (v/v) (1:1 000). Es folgte eine gemeinsame Inkubation für mindestens
4 h bei 4 °C, damit sich ein Komplex aus den enthaltenen Antikörpern bilden
konnte. Kurz vor dem Auftragen auf den Teststreifen wurde fast immer 0.1% (v/v)
Tween 20 (über eine 1:10-Vorverdünnung) zugegeben, um das Laufverhalten zu
verbessern. Bei Kompetitionsversuchen wurden davor noch 100 mg L-1 TATP
oder Wasser in gleichen Teilen zu dem Antikörper-Konjugationsmix hinzugefügt.
Es wurden Volumina von 20-100 µL aufgetragen, die zugleich den Lauf des LFA
starteten und seltener zuvor auf dem Proben- und Konjugatauftragsvlies einge-
trocknet wurden. Etwas PBS (meist mit 0.1% (v/v) Tween 20) wurde zusätzlich
zur Aufrechterhaltung (oder zum Auslösen) des Flusses hinterher pipettiert. Die
Laufzeit eines Tests betrug 5-10 min. Die Begutachtung der Testergebnisse er-
folgte visuell.
Alternativ wurde als Proben- und Konjugatauftragsvlies ein vorgefertigtes, mit
Gold-konjugiertem Protein A getränktes Vlies (Protein A Tell-Tale Gold ribbon)
verwendet. Hierbei erfolgte die Probenvorbereitung ohne Gold-konjugiertes
-Kaninchen-IgG. Außerdem wurden verschiedene Negativkontrollen durchge-
führt, wie Proben ohne Gold-konjugiertes -Kaninchen-IgG, ohne Serum oder mit
Kaninchenserum einer anderen Immunisierung (für TNT-Antikörper [289]).
Die unbehandelten sowie die LFA-Materialien nach einem durchlaufenen As-
say wurden rasterelektronenmikroskopisch (ESEM, environmental scanning
72 Experimenteller Teil
electron microscope, Tabletop Microscope Hitachi TM-1000) betrachtet, um Ver-
änderungen der Oberfläche feststellen zu können.
73
4.1 Untersuchungen zu Triacetontriperoxid (TATP)
Beobachtungen zur TATP-Synthese
Zu Beginn dieser Arbeit stand zunächst noch nicht der Nachweis von TATP im
Mittelpunkt, sondern der Analyt selbst. Durch seine Synthese sowie weiterfüh-
rende Untersuchungen konnte mehr über seine Eigenschaften erfahren werden,
wobei der vorsichtige Umgang mit TATP stets vorrangig war. Dass die Synthese
dieses brisanten Stoffes auch ohne jegliche Kenntnis der einschlägigen Fachlite-
ratur nur durch simple Internetsuchanfragen hätte erfolgen können, ist erschre-
ckend. Diese Tatsache macht nochmals sehr eindrücklich deutlich, welche po-
tenzielle Gefahr von diesem Explosivstoff, der sich aus einfachen Haushaltsche-
mikalien – Aceton, Wasserstoffperoxid und Säure – herstellen lässt, ausgeht und
dass effektive und schnelle Nachweisverfahren notwendig sind.
Unter Berücksichtigung der in Abschnitt 3.3.1 genannten Literatur konnte ohne
weitere Optimierung TATP mit einer Ausbeute von ~ 60-70% [46] synthetisiert
werden. Obwohl bei den meisten Vorschriften mit Schwefelsäure gearbeitet wur-
de (z. B. [46, 89, 102]), gibt es Hinweise darauf, dass bei der Verwendung von
Salzsäure als Katalysator reineres TATP und weniger DADP als Nebenprodukt
entsteht [81, 87, 91]. Dies konnte im Vergleich zweier nahezu identischer HPLC-
DAD-Chromatogramme (225 nm) entsprechender Syntheseansätze mit gleichen
Molaritäten nicht bestätigt werden und würde nach Reinigung durch Umkristalli-
sation auch keine Rolle mehr spielen. Selbst in ungereinigten Syntheseansätzen
mit Schwefelsäure, die vor dem Einspritzen in die GC-MS einfach in n-Hexan
stark verdünnt wurden, konnte kein DADP nachgewiesen werden. Des Weiteren
wird zur Darstellung von stabilem TATP eine niedrige Säurekonzentration emp-
fohlen, wozu von Matyas und Pachman [90] ausführliche Untersuchungen veröf-
fentlicht wurden. Insbesondere für Schwefel- und Perchlorsäure wurde dort ein
molares Verhältnis von Säure zu Aceton von < 1 × 10-2 als günstig ermittelt und
in dieser Arbeit mit 5 × 10-3 angewendet (da molar doppelt so viel Aceton wie
Wasserstoffperoxid eingesetzt wurde). Eine sehr hohe Schwefelsäurekonzentra-
tion (Säure/Aceton ~ 3), wie von Cerna et al. [290] zur Synthese von 3,3,6,6,9,9-
Hexaethyl-1,2,4,5,7,8-hexaoxonan mit 3-Pentanon anstelle des Acetons ange-
wendet, führte zur sofortigen Bildung eines weißen, breiigen Niederschlags. Per
ELISA wurde festgestellt, dass die Ausbeute an TATP unter 1% lag. Eine Analy-
se des Niederschlags wurde nicht vorgenommen, aber Beayer und Villinger [86,
87] beschrieben für eine fast identisch verlaufende Synthese ähnliches und wie-
74 Ergebnisse und Diskussion
sen darauf hin, dass ihr (wahrscheinlich polymeres) „Acetonsuperoxyd“ sich von
Wolffensteins unterscheidet.
Die erste Bestätigung des Syntheseerfolgs wurde mittels HPLC-MS gewonnen,
wobei das einzig kommerziell erhältliche TATP in Form eines 0.1 mg mL-1 Stan-
dards in Acetonitril (AccuStandard) als Vergleich diente. Der käuflich erworbene
Standard wies jedoch in der HPLC-Analyse mehr Verunreinigungen als der ledig-
lich in Wasser verdünnte Reaktionsansatz auf. Daher wurde die Herstellung ei-
gener TATP-Lösungen aus gereinigtem TATP nötig, welches durch dreimaliges
Umkristallisieren des Rohprodukts aus Methanol gewonnen wurde. Das umkris-
tallisierte TATP wurde durch Einkristallstrukturanalysen und NMR (siehe unten)
untersucht und bestätigt.
Einkristallstrukturanalysen
Für das synthetisierte und umkristallisierte TATP (wie
Abbildung 4.1) wurden mittels Röntgendiffraktometrie
die Gitterkonstanten a = 13.8407 Å, b = 10.7018 Å,
c = 7.9113 Å, = 90°, = 91.701°, = 90° ermittelt.
Damit war eine eindeutige Zuordnung von TATP
durch die Übereinstimmung mit zwei Einträgen in der
CCDC-Datenbank, HMHOCN und HMHOCN01,
möglich. Die erste Messung von Groth [103] mit
a = 13.925(5) Å, b = 10.790(4) Å, c = 7.970(4) Å,
= 90°, = 91.64(5)°, = 90° stammt bereits aus
dem Jahr 1969. Der zweite Eintrag (HMHOCN01
oder CCDC-241973) von Dubnikova et al. [46] hat
mit a = 13.788(6) Å, b = 10.664(5) Å, c = 7.894(4) Å,
= 90°, = 91.77(5)°, = 90° noch ähnlichere, fast
identische Werte. In beiden Arbeiten wurde außerdem erwähnt, dass es sich bei
den Kristallstrukturen um das D3-Konformer des TATP handelt, worauf später in
diesem Abschnitt noch eingegangen wird.
Während TATP-Kristalle bislang nur ohne eingeschlossene Lösungsmittelmo-
leküle und mit der Raumgruppe P21/c (monoklin) bekannt waren, wurden in eini-
gen Proben erstmals TATP-Kristalle gefunden, welche Methanol im molaren Ver-
hältnis 1:1 im Kristallgitter (C9H18O6 • CH3OH) enthielten. Bemerkenswert dabei
ist, dass alle TATP-Kristalle bis zur Messung in Methanol gelagert wurden und
dennoch die meisten kein Methanol aufwiesen. Außerdem war der Methanolein-
schluss weder dauerhaft noch äußerlich erkennbar. Er führte jedoch zu einer
leicht veränderten, hexagonalen TATP-Kristallstruktur der Raumgruppe R3 c mit
den Gitterkonstanten a = 11.8111(7) Å, c = 16.8071(13) Å. Ausführliche Daten
zur durchgeführten Strukturverfeinerung (R1 = 0.0549) wurden bereits von Walter
et al. [291] veröffentlicht oder können in der Datenbank unter der Nummer
CCDC-769685 eingesehen werden.
Abbildung 4.1: TATP-Kristall.
Ergebnisse und Diskussion 75
Wasserlöslichkeit von TATP
Mittels HPLC wurde durch die Untersuchung einer gesättigten, wässrigen TATP-
Lösung die Wasserlöslichkeit bestimmt. Diese wurde bislang in der Fachliteratur
mit „unlöslich“ angegeben. Anhand variierter Injektionsvolumina einer wässrigen
TATP-Lösung (mit 50% (v/v) Methanol) wurde eine lineare Kalibriergerade (n = 2)
erhalten, aus der die
Wasserlöslichkeit von TATP (22 °C) =
177 ± 2 mg L-1
mit n = 3 ermittelt wurde. Dieser Wert wurde im direkten ELISA mit Serum von
Maus 3, Boost 8 (1:10 000, HRP-Konjugat 1 1:10 000) mittels graphische Aus-
wertung bestätigt. Hierbei ergaben eine 1:10-Verdünnungsreihe des Überstandes
der gesättigten Lösung und eine TATP-Kalibrierreihe der in dieser Arbeit verwen-
deten TATP-Kalibrierlösungen zwei deckungsgleiche, sigmoidale Kurvenverläufe
(jeweils n = 4).
TATP in der Gasphase
Die GC-MS sollte ursprünglich als Referenzmethode zu den immunchemischen
Nachweismethoden für TATP dienen, kam aber in Ermangelung von Realproben
nicht zum Einsatz. Es wurde aber eine Analysenmethode optimiert, welche eine
Bestimmungsgrenze von ca. 70 µg L-1 (oder 70 pg) TATP in n-Hexan im SIM-
Modus besitzt. Dabei wurden in Übereinstimmung mit der Literatur die Fragmente
m/z 43 [C2H3O]+, 59 [C3H7O]+ und 75 [C3H7O2]+ detektiert. Das Molekülion
(m/z 222) war jedoch erst ab einer Konzentration von 1 000 µg L-1 (1 ng) detek-
tierbar. Die Empfindlichkeit der Methode entspricht damit den Nachweisgrenzen
in den auch zur Methodenentwicklung herangezogenen Artikeln (ohne vorge-
schaltete SPME): Sigman et al. [124] geben ihre Nachweisgrenze für TATP mit
0.05 ng (m/z 43, 59, 75, Quadrupol) und Stambouli et al. [123] mit < 1 ng (m/z 43,
59, 75 und 221 [M-1], Ionenfalle) an. Die Empfindlichkeit konnte durch das Aus-
schließen von m/z 43 auch noch etwas verbessert werden, wohingegen sie bei
der Aufnahme des kompletten Massenspektrums um eine Zehnerpotenz schlech-
ter war als im SIM-Modus.
Die optimierte GC-MS-Methode wurde für zwei Versuche zur Bestimmung von
TATP aus der Gasphase benutzt. Da TATP flüchtig ist, bietet sich ein Nachweis
aus der Luft an, so dass zunächst der TATP-gesättigte Gasraum eines Glas-
fläschchens, mit einem kleinen TATP-Kristall darin, betrachtet wurde. Anfängliche
Bedenken bezüglich der Genauigkeit und Machbarkeit eines Vergleichs von Ka-
libriergeraden, die aus TATP-Lösungen in n-Hexan erstellt wurden, mit gasförmi-
gen Proben scheinen unbegründet. Während von den flüssigen Proben jeweils
1 µL-Injektionen ausreichten (Korrelationskoeffizienten der Geraden > 0.99), war
dieses Volumen nicht optimal für gasförmige Injektionen und führte zu extremen
Schwankungen der Werte (Signalflächen der Chromatogramme). Bei 6 µL-
Injektionsvolumen mit einer 10 µL Dosierspritze wurden reproduzierbare Resulta-
te erzielt. So wurde die
76 Ergebnisse und Diskussion
Sättigungskonzentration von TATP in der Gasphase (Luft, 25 °C) =
1.08 ± 0.05 mg L-1
mit n = 18 und einer Kalibriergeraden (n = 3) mit einem Korrelationskoeffizienten
von 0.9993 bestimmt. Dieses Ergebnis ist in derselben Größenordnung wie die
von Oxley et al. [79] ebenfalls bei 25 °C ermittelten 0.62 (± 0.04) mg L-1. Auch
dort wurden flüssige TATP-Kalibrierlösungen (in Acetonitril) verwendet und mit
Gasproben verglichen. Zusätzlich untersuchten sie TNT und fanden eine Kon-
zentration in der Gasphase von nur 0.05 µg L-1. In molaren Dimensionen bedeu-
tet das, dass TATP-Moleküle in 13 000-fach größerer Anzahl als TNT-Moleküle in
der jeweils gesättigten Gasphase auftreten. Natürlich sind diese Unterschiede
bedingt durch die Dampfdrücke, der bei TNT mit 5 × 10-4 Pa und bei TATP mit
7 Pa bei 25 °C angegeben wurde. Schon 3 °C weniger und der TATP-
Dampfdruck beträgt nur noch rund 1.5 Pa. Bei 22 °C fanden Oxley et al. [79] nur
noch 0.13 mg L-1 und 0.17 mg L-1 TATP in der Luft und hier wurden 0.85 mg L-1
und 0.89 mg L-1 gemessen. Diese (nicht systematischen) Wiederholungsmes-
sungen zur Bestimmung der Sättigungskonzentration von TATP in der Gasphase
sind nicht sehr aussagekräftig (n = 2) und wurden zunächst nicht beachtet. Den-
noch zeigten sie gemeinsam im Vergleich mit den Daten aus [79], dass die Kon-
zentrationen deutlich mit fallender Temperatur abnehmen und die Werte durch-
aus vertrauenswürdig sind. Oxley et al. [79] entwickelten aus weiteren Werten
zusätzlich eine Gesetzmäßigkeit zur Abhängigkeit des Dampfdrucks von TATP
von der Temperatur und zeigten, dass im Bereich von 12-58 °C der TATP-Gehalt
in der Luft von ca. 0.09-50 mg L-1 variiert.
Ein ähnlich gearteter Versuch wurde mit 50 µL wässriger TATP-Lösungen an-
stelle eines TATP-Kristalls in den Glasfläschchen (2 080 µL Gesamtvolumen)
durchgeführt, in dem auch hier die Konzentration des Analyten in dem Gasraum
darüber bestimmt wurde. Dabei konnte TATP nicht in der Gasphase über einer
0.5 mg L-1 TATP-Lösung nachgewiesen werden. In den Glasfläschchen mit den
höher konzentrierten Lösungen, 50 und 150 mg L-1, wurden hingegen
0.055 ± 0.041 mg L-1 bzw. 0.302 ± 0.022 mg L-1 TATP in der Gasphase mit der
GC-MS (n = 4) analysiert. Das entspricht einer absoluten Menge von 0.1 bzw.
0.6 µg TATP im Gasraum bei einem Volumen der Fläschchen von 2 080 µL.
Dementsprechend sind unter allgemeinen Laborbedingungen bei 22 °C ca. 4%
des TATP in 50 µL TATP-Lösung (50 mg L-1) und 8% der 50 µL Lösung
(150 mg L-1) aus der wässrigen Phase in die Gasphase übergegangen. Für das
analytische Arbeiten mit TATP-Lösungen ist das ein bedenkliches Ergebnis, weil
unkontrolliert Verluste von TATP in die Gasphase auftreten können.
Kinetik der Umwandlung zwischen D3- und C2-TATP
Beim Umgang mit TATP ergaben sich am Rande des Themas dieser Arbeit auch
einige interessante Einsichten in die kinetischen Aspekte bei der gegenseitigen
Umwandlung der TATP-Konformere. Im 1H-NMR-Spektrum (CD3OD,
600.20 MHz) wurde mit = 1.39 (s, 18H, 6 × CH3) sowohl das D3-Konformer mit
einer Twist-Wannen-Sessel-Konformation als auch mit = 1.23 (s, 9H,
Ergebnisse und Diskussion 77
3 × CH3(ax)), 1.71 (s, 9H, 3 × CH3(eq)) das C2-Konformer mit einer Twist-Sessel-
Sessel-Konformation gesehen. Ähnliche chemische Verschiebungen sind auch
bei Widmer et al. [104] (andere Versuchsbedingungen) angegeben. Hieraus wur-
de außerdem die Trennung der beiden Konformere mittels HPLC übernommen.
Ein vergleichbares Chromatogramm ist im Abschnitt 4.8 beim Konformeren-
ELISA dargestellt (Abbildung 4.17), wo D3- und C2-TATP noch einmal betrachtet
werden. Nach der Isolation des C2-TATP-Konformers über die monolithische
Säule mit dem kürzeren 16-minütigen HPLC-Programm wurde die verdünnte
C2-TATP-Fraktion mehrfach reinjiziert. Dabei wurde die Abnahme des C2-TATP-
Signals (bei gleichzeitiger Zunahme des D3-TATP-Signals) beobachtet und das
Verhältnis C2-TATP zum Gesamt (C2- + D3-)-TATP über die Zeit aufgetragen, wie
Abbildung 4.2 zeigt. Es konnten sieben Messpunkte bei 23 °C und fünf bei 37 °C
aufgenommen werden. Während sich bei der auf 37 °C gehaltenen, verdünnten
C2-TATP-Fraktion das Gleichgewicht einstellte, war dies bei der bei 23 °C gehal-
tenen Fraktion noch nicht ganz der Fall.
Abbildung 4.2: Kinetische Untersuchung der Umwandlung von C2- zu D3-TATP mittels HPLC.
In Origin wurden die Daten über eine Exponentialfunktion angepasst, woraus
sich (unter Vernachlässigung der Rückreaktion) die Halbwertszeiten T1/2 zur ge-
genseitigen Umwandlung der beiden TATP-Konformere ableiten ließen:
T1/2 (296 K) = 33 ± 2.8 min
T1/2 (310 K) = 8.0 ± 0.31 min
Es wurden weitere Experimente durchgeführt, die zu ähnlichen Ergebnissen führ-
ten. Beispielsweise wurde mit der UltraSep ES, Phen1-Säule bei gleichem Vor-
gehen T1/2 (296 K) = 33 ± 0.25 min erhalten. Der Nachteil dieser Säule war, be-
dingt durch das 40 min dauernde HPLC-Programm, dass die Messung nicht bei
37 °C für die sehr kurze Halbwertszeit erfolgen konnte. Außerdem wurde auch
versucht, die D3-TATP-Fraktion zu sammeln und dann die Zunahme des
0 20 40 60 80 1000
10
20
30
40
50
60
Raumtemperatur (23 °C)
37 °C
C2-T
AT
P/G
esa
mt-
TA
TP
[%
]
[min]
78 Ergebnisse und Diskussion
C2-TATP-Signals zu verfolgen. Dabei konnte mit der UltraSep ES, Phen1-Säule
T1/2 (296 K) = 30 ± 1.5 min und mit der monolithischen Säule T1/2 (296 K) =
20 ± 2.1 min sowie T1/2 (310 K) = 8.0 ± 0.021 min ermittelt werden. Die Halb-
wertszeit bei 23 °C, welche über die monolithische Säule bestimmt wurde,
scheint ein Ausreißer zu sein, da alle anderen sehr gut übereinstimmen.
Aus den Messresultaten (bzw. den Halbwertszeiten) konnte zum einen nach
Gleichung 1 mit
EA = 77.5 kJ mol-1
die Aktivierungsenergie für die Umwandlung der TATP-Konformere abgeschätzt
werden, wobei beide Temperaturen zum gleichen Wert führen. Denekamp et al.
[106] berechneten für die Umwandlungsbarriere in der Gasphase E =
110 kJ mol-1 (umgerechnet). Zu berücksichtigen ist, dass der in dieser Arbeit er-
mittelte Wert in wässriger Lösung mit ca. 30% Acetonitrilanteil (und etwas Me-
thanol) und nicht in der Gasphase bestimmt wurde. Des Weiteren konnte die
Energiedifferenz zwischen dem D3- und dem C2-Konformer in der Gasphase
E = 6.4 kJ mol-1
aus dem Verhältnis der beiden Konformere im Gleichgewichtszustand anhand
von Gleichung 2 ermittelt werden. Dieser Wert ist ebenfalls mit einem bei Dene-
kamp et al. [106] theoretisch berechneten (7.7 kJ mol-1, umgerechnet) vergleich-
bar und liegt ebenfalls leicht unter den dortigen Angaben. Ältere, halbempirische
Berechnungen von Yavari et al. [105] ergaben eine Energiedifferenz von
3.4 kJ mol-1. Das stabile D3-TATP mit dem geringeren Energiegehalt kommt im
Gleichgewicht entsprechend weitaus häufiger vor als das C2-TATP, wobei das
Verhältnis der beiden Konformere zueinander vom Lösungsmittel abhängig ist:
D3/C2 = 15:1 in Methanol (± 0.80, 5%, n = 7 × 3)
D3/C2 = 32:1 in Wasser (± 2.0, 6%, n = 4 × 3)
Ein Verhältnis von 15:1 wurde auch von Widmer et al. [104] bei HPLC-
Experimenten mit Lösungen in Methanol oder Acetonitril beobachtet. Ein Litera-
turwert zum Vergleich des Verhältnisses in wässrigen Lösungen existiert nicht.
Alternativ zur Bestimmung der Halbwertszeit per HPLC wurde auch eine NMR-
Messung vorgenommen. Es traten dabei einige Schwierigkeiten auf, dennoch soll
das Prinzip hier kurz vorgestellt werden. Mittels HPLC und durch die notwendi-
gen Messvorbereitungen am NMR-Spektrometer konnte C2-TATP nicht schnell
genug und in ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden, was auch in
einer zwischenzeitlich veröffentlichten, parallel entstandenen Arbeit von Haroune
et al. [292] zu Problemen bei einer direkten LC-NMR-Kopplung führte. Daher
wurde ausgenutzt, dass die TATP-Kristalle nur aus dem D3-Konformer bestehen.
Ein einzelner Kristall wurde unmittelbar vor Messbeginn in deuteriertem Methanol
aufgenommen. Allerdings gab es auch hier einen undefinierbaren Zeitraum zwi-
schen dem Lösen, dem Temperieren, den Messvorbereitungen (ca. 2 min) und
Ergebnisse und Diskussion 79
der eigentlichen Messung. Auch Lösungseffekte können nicht ausgeschlossen
werden. Es gelang trotzdem, die Entstehung des C2-Konformers und die Abnah-
me des D3-Konformers zu beobachten, auch wenn die Änderungen hier, wie
oben beschrieben, nur sehr gering ausfallen. Die Halbwertszeit wurde so bei
37 °C auf T1/2 (310 K) = 41 ± 1.1 min ermittelt und ist damit fünfmal länger als die
mittels HPLC bestimmte. Das D3/C2-Verhältnis im NMR-Spektrum betrug im
Gleichgewicht ca. 20:1. Bei einer Optimierung der Methode sind sicherlich noch
einige Verbesserungen möglich oder die Unsicherheit dieses Werts kann abge-
schätzt werden. Jedoch blieben die unkalkulierbaren Effekte beim Lösen des
TATP-Kristalls: Es ist nicht zu erkennen, wann der Lösungsvorgang abgeschlos-
sen ist. Falls er andauert und immer neues D3-TATP hinzukommt, würde das
eine scheinbare Verlängerung der Halbwertszeit erklären. Auch das Arbeiten in
100% (deuteriertem) Methanol unterscheidet die NMR-Methode von der HPLC-
Variante, bei der hauptsächlich Wasser (und ~ 30% Acetonitril) in Kontakt mit
dem TATP kommt. Insbesondere das Wasser könnte, wie bei den D3/C2-
Verhältnissen oben gezeigt, eine entscheidende Rolle bei der Umwandlung von
einem TATP-Konformer zum anderen einnehmen. In der bereits erwähnten Ver-
öffentlichung [292] wurde per LC-NMR unter Beobachtung der Fraktion des
C2-TATP in einem Gemisch aus 65% Methanol in Wasser eine Halbwertszeit der
Umwandlung der beiden Konformere von T1/2 (295 K) ≈ 2.5 h bestimmt. Die
Halbwertszeit bei 22 °C ist damit etwa fünfmal länger als die in dieser Arbeit per
HPLC bei fast gleicher Temperatur von 23 °C ermittelten 33 min. Das ist erstaun-
lich, da wieder ein Unterschied um den Faktor fünf zwischen HPLC- und NMR-
Messungen für die Halbwertszeiten erhalten wurde. Das untermauert den Ver-
dacht, dass der Einfluss des Lösungsmittels auf die Umwandlungsgeschwindig-
keit und das Gleichgewicht der Konformere nicht vernachlässigt werden darf. Die
gewählte analytische Methode an sich sollte dabei keine Rolle spielen. Bei 12 °C
wurde außerdem in [292] eine Halbwertszeit von T1/2 (285 K) > 17 h abgeschätzt,
was auch in Einklang mit der hier festgestellten starken Zunahme der Umwand-
lung der Konformere ineinander bei steigender Temperatur steht.
Viele der in diesem Abschnitt dargestellten Ergebnisse wurden bereits 2010 in
Langmuir von Walter et al. veröffentlicht [291]. Im Vordergrund dieser Experimen-
te stand die Untersuchung der Flexibilität der TATP-Struktur. Insbesondere war
dabei das Verhalten bei 37 °C interessant, da bei dieser Temperatur Immunisie-
rungen in den Tieren erfolgen, wohingegen die Arbeiten mit den gewonnenen
Antikörpern im Labor bei Raumtemperatur (22-23 °C) durchgeführt werden. Es
wurde angenommen, dass das TATP-Hapten, das im nächsten Abschnitt behan-
delt wird, sich als strukturelles Analogon ähnlich verhält wie TATP. Eine ebenso
ausführliche Untersuchung des Haptens wäre daher auch angebracht gewesen,
war aber aufgrund der geringen Probenmenge unmöglich. Es bestand der Ver-
dacht, dass sich eine flexible Struktur ungünstig auf die Immunisierung, vor allem
auf die Affinität der resultierenden Antikörper, auswirkt. Andererseits wäre auch
ein zu abweichendes Verhalten des Haptens von TATP ebenso nicht förderlich,
da Antikörper durchaus in der Lage sein können, Konformere zu unterscheiden.
80 Ergebnisse und Diskussion
4.2 TATP-Hapten
Abbildung 4.3: Kugel-Stab-Modell des TATP-Haptens.
Ein entscheidender Teil dieser Arbeit konnte mit der erfolgreichen Synthese ei-
nes kopplungsfähigen TATP-Analogons, dem TATP-Hapten (Abbildung 4.3), er-
reicht werden. Die Synthese (Abbildung 3.2) wurde direkt von der Herstellung
des TATP abgeleitet und der Mischung aus Aceton, Wasserstoffperoxid und
Schwefelsäure lediglich 7-Oxooktansäure zugefügt. Diese erfüllt gleich mehrere
Ansprüche: Durch die Carbonylgruppe am Kohlenstoffatom (C-7) der Oktansäure
kann wie bei Aceton eine Methylgruppe am Triperoxidring entstehen, so dass
tatsächlich nur eine der sechs Methylgruppen des TATP ausgetauscht wird. Der
aliphatische Teil dient als Abstandhalter (auch Spacer oder Linker) zwischen dem
Zielanalyten und dem Protein, an das das Hapten gekoppelt ist. Die Kette aus
fünf Kohlenstoffatomen entspricht der dazu empfohlenen Länge [169, 171-173].
Schließlich ermöglicht die endständige Carboxygruppe nach Aktivierung (Ab-
schnitte 3.3.3 und 4.3) die kovalente Kopplung des Moleküls an Proteine.
Die Synthese des Haptens verlief jedoch nicht so unproblematisch wie die
TATP-Synthese, insbesondere hinsichtlich der Ausbeute und der Reinigung des
Produkts. Nach ersten Hinweisen für eine erfolgreiche Synthese und Bestim-
mung der Retentionszeiten mittels HPLC-MS wurden Optimierungsversuche mit
dem HPLC-DAD-Signal verfolgt und ausgewertet (via Signalflächen). Dabei wur-
de davon ausgegangen, dass TATP und sein Hapten in ähnlicher Weise bei
225 nm absorbieren und so die Konzentration des Haptens über TATP-
Kalibrierlösungen abgeschätzt werden kann. Bei ersten Versuchen lag die Syn-
theseausbeute des TATP-Haptens noch unter 1% und konnte durch Variation der
eingesetzten Ausgangsstoffkonzentrationen verbessert werden. Schließlich ge-
lang es mit einer äquimolaren Mischung der drei Ausgangsstoffe die Ausbeute
auf etwa 5% zu steigern. Entscheidend dafür war, dass die Menge an
7-Oxooktansäure gegenüber der Menge an Aceton erhöht wurde. Eine weitere
Erhöhung war jedoch kaum möglich, da ~ 80 mg der 7-Oxooktansäure in nur ca.
90 µL Aceton/Wasserstoffperoxid gelöst wurden und die Durchmischung er-
schwert war. Zudem bedeutete zusätzliches Aceton auch mehr TATP als Neben-
produkt. Im äquimolaren Verhältnis von Aceton zu 7-Oxooktansäure wurde mehr
als doppelt so viel TATP-Hapten wie TATP erhalten, doch schon bei einem zwei-
fachen Überschuss Aceton gegenüber der 7-Oxooktansäure war das Verhältnis
Ergebnisse und Diskussion 81
genau umgekehrt. Mit einer Veränderung der eingesetzten Menge Wasserstoff-
peroxid konnte die Ausbeute des TATP-Haptens nicht weiter gesteigert werden,
anders als bei der Wahl der katalytischen Säure und deren Konzentration. Die
von der TATP-Synthese übernommene Menge an Schwefelsäure brachte dabei
die besten Resultate. Sowohl eine Erhöhung als auch eine Verringerung der
Säurekonzentration verschlechterte die Bilanz. Bei der 100-fachen Säuremenge
entstand nicht einmal TATP und bei dem Einsatz eines Zehntels der Säurekon-
zentration wurde nicht nur weniger TATP erhalten, sondern auch das Verhältnis
TATP-Hapten zu TATP ungünstig beeinflusst. Offensichtlich reicht die Säurestär-
ke der 7-Oxooktansäure (pKa von Oktansäure: 4.89 [293]) nicht aus, um selbst
für die Reaktion als Katalysator zu wirken, was zunächst in Betracht gezogen
wurde. Auch die Verwendung von Salzsäure brachte keine Verbesserung. Zwar
blieb die TATP-Hapten-Ausbeute nahezu unverändert, jedoch verschob sich das
Verhältnis von TATP-Hapten und TATP zu Gunsten des TATP. Generell war das
bei der Hapten-Synthese in erheblichen Mengen entstandene TATP auch der
aus Sicherheitsaspekten limitierende Faktor bei der Wahl der Ansatzgröße.
Die Isolierung des reinen TATP-Haptens aus den Synthese-Ansätzen erwies
sich als schwierig: Es wurden etliche Versuche mit diversen Lösungsmitteln
durchgeführt, um das Hapten durch Ausschütteln vom TATP, der restlichen
7-Oxooktansäure sowie allen anderen Nebenprodukten abzutrennen. Auch das
Neutralisieren des Reaktionsansatzes oder das Abdampfen des Lösungsmittels
führten nicht zum Erfolg, so dass eine chromatographische Trennung (Abschnitte
3.3.1 und 3.3.2) erfolgte. Ein Teil des TATP konnte vorher entfernt werden, da es
ausgefallen war. Die restliche Reaktionslösung wurde mit 1 mL Wasser versetzt
und zentrifugiert. Auf diese Weise konnte ein Großteil der wasserlöslichen Kom-
ponenten wie 7-Oxooktansäure und Wasserstoffperoxid entfernt werden. Dabei
gingen ca. 20% des TATP-Haptens verloren, aber aufgrund der niedrigen Kosten
der Ausgangsstoffe und vor allem der Möglichkeit, dadurch letztlich größere
Mengen TATP-Hapten zu injizieren (ohne die eigentlich analytische Säule zu
überladen), war dies vertretbar.
Das Chromatogramm bzw. der vergrößerte Ausschnitt daraus in Abbildung 4.4
zeigt die klare Basislinientrennung von TATP (17.3 min) und dem Hapten
(16.4 min), aber bei beiden jeweils auch ein kleines Folgesignal (18.0 bzw.
16.8 min). Diese entsprechen den jeweiligen C2-Konformeren, welche auch im
NMR-Spektrum identifiziert wurden (siehe unten). Die vier Signale vor dem
TATP-Hapten (15-16 min) wurden nur grob mittels HPLC-MS untersucht und
nicht genauer identifiziert. Wahrscheinlich handelt es sich dabei um verschiedene
7-Oxooktansäure-Acetonperoxid-Verbindungen, denn es wurden u. a. m/z 421
und 521 (ESI-) registriert, die von Aceton-di-7-oxooktansäuretriperoxid und Tri-7-
oxooktansäuretriperoxid stammen könnten. Da die Trennung zwischen dem letz-
ten dieser Signale und dem TATP-Hapten-Signal nicht Basislinien-getrennt ist
und sehr sauberes Hapten für die weiteren Synthesen benötigt wurde, begann
das Sammeln der TATP-Hapten-Fraktion erst spät. Nach dem Abdampfen des
Laufmittels und Trocknen im Exsikkator wurde durch Auswiegen eine Ausbeute
von ca. 1% an hochreinem TATP-Hapten bestimmt. Meist wurden dabei kleine
82 Ergebnisse und Diskussion
TATP-Hapten-Kristalle oder Pulver erhalten, seltener bleib eine ölige Flüssigkeit
zurück, die aber sowohl bei Analyse mittels HPLC oder im NMR-Spektrum als
auch in ihrer Funktionsweise bei den nachfolgenden Synthesen in keiner Weise
Unterschiede zu dem festen Hapten aufwies.
Abbildung 4.4: Chromatogramm zur Reinigung des TATP-Haptens per HPLC mittels binärem
Gradienten aus Acetonitril/Methanol (10:1) und Wasser mit 0.1% (v/v) TFA aus dem bereits vorge-reinigten Syntheseansatz.
Mit dem TATP-Hapten, 6-(3,6,6,9,9-Pentamethyl-1,2,3,5,7,8-hexaoxonan-3-yl)-
hexansäure, wurde eine neue Verbindung hergestellt, deren Struktur genauer
untersucht und die zum Patent angemeldet [294-296] wurde. Das hochaufgelöste
Massenspektrum (ESI--FT-ICR-MS) des gereinigten TATP-Haptens wies eine
Masse von m/z 321.1552 [C14H26O8 - H]+ auf, die nur 0.0001% (-0.25 mmu) von
der berechneten exakten Masse m/z 321.1555 (Berechnung: ChemDraw) ab-
weicht. Auch ein Cl--TATP-Derivat-Komplex mit der Masse m/z 357.1320 konnte
mit nur 0.0001% (-0,18 mmu) Unterschied zur theoretischen Masse von
m/z 357.1322 detektiert werden. Des Weiteren konnte die Existenz des beschrie-
benen carboxylierten TATP auch durch NMR-Untersuchungen bestätigt werden,
wobei die Zuordnung der Signale über Korrelationsspektren erfolgte. Im Folgen-
den sind die chemischen Verschiebungen des D3-Konformers angegeben:
1H-NMR [ppm] (CD3OD, 600.2 MHz): = 1.37 (m, 2H, Ccycl-(CH2)2-CH2), 1.39 (s,
15H, 5 × CH3), 1.48 (m, 2H, Ccycl-CH2-CH2), 1.62 (m, 2H, Ccycl-(CH2)3-CH2), 1.81
(m, 2H, Ccycl-CH2), 2.29 (t, 2H, J = 7.6 Hz, CH2-CO2H).
13C-NMR [ppm] (CD3OD, 150.94 MHz): = 21.7 (5 × CH3), 24.8 (Ccycl-CH2-CH2),
26.1 (Ccycl-(CH2)3-CH2), 30.4 (Ccycl-(CH2)2-CH2), 34.7 (Ccycl-CH2), 35.0 (CH2-
CO2H), 108.5 (Cq), 177.8 (CO2H).
Die chemischen Verschiebungen für die Methylgruppen von 1.39 ppm (CH3) und
21.7 ppm (CH3) sowie des quartären Kohlenstoffatoms von 108.5 ppm (Cq) sind
14 15 16 17 18
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
TATP
Re
lative
Ab
sorp
tio
n ( =
225
nm
)
[min]
TATP-Hapten
0 5 10 15 20 25 30 35
0
250
500
Ergebnisse und Diskussion 83
identisch mit denen des D3-TATP-Konformers. Ebenso konnten Überein-
stimmungen der chemischen Verschiebungen mit dem C2-Konformer sowohl im 1H-NMR- als auch im 13C-NMR-Spektrum sowie zu den Daten für D3- und
C2-TATP von Haroune et al. [292] beobachtet werden. Das C2-TATP-Hapten lag
nur in Spuren vor und trat auch in den HPLC-Chromatogrammen (Abbildung 4.4)
in Erscheinung. Durch die Möglichkeit der axialen oder äquatorialen Anordnung
des Kettenrests der 7-Oxooktansäure wurden für die Methylgruppe am quartären
Kohlenstoffatom, für dieses selbst sowie für die beiden folgenden
Methylengruppen der Kette jeweils zwei chemische Verschiebungen beobachtet.
Die hier angegebenen Signale stammen von der äquatorialen Anordnung. Die
Daten für die axiale Ausrichtung sowie für das C2-TATP-Hapten sind in Walter et
al. [291] angegeben.
Abbildung 4.5: Überlagerung der röntgenkristallographisch bestimmten Strukturen von TATP-
Hapten (schwarz) und TATP (violett).
Die NMR-Messungen belegten schon die hohe strukturelle Übereinstimmung von
TATP und dem TATP-Hapten. Diese ließ sich ebenfalls durch die Kristallstruktur-
analyse zeigen. Für das TATP-Hapten wurden die Gitterkonstanten
a = 5.951(5) Å, b = 11.882(7) Å, c = 12.470(9) Å, = 97.56(3)°, = 93.92(2)°,
= 98.934(16)° eines triklinen Kristalls der Raumgruppe mit 1 bestimmt. Die
gelungene TATP-Hapten-Synthese konnte damit auch durch die Strukturlösung
und -verfeinerung (R1 = 0.0549) verifiziert werden. Ausführliche Daten und kris-
tallographische Informationen sind in Walter et al. [291] sowie unter dem Daten-
bankeintrag CCDC-769686 im Cambridge Crystallographic Data Centre [297]
abrufbar. Interessanter für diese Arbeit ist die Möglichkeit, die röntgenkristallo-
graphisch bestimmte Struktur des TATP-Haptens mit einer bereits in der CCDC-
Datenbank vorhandenen TATP-Struktur (CCDC-241973, HMHOCN01, [46]) zu
überlagern (nur D3-Konformere). In Abbildung 4.5 wird so deutlich, dass die Tri-
peroxidringe mit vier der unveränderten Methylgruppen von TATP und dem Hap-
ten weitgehend identisch sind. Ferner weisen die fünfte Methylgruppe in Nähe zu
der aliphatischen Kette und selbst die erste Methylengruppe der Kette in der
TATP-Haptenstruktur nur minimale Abweichungen gegenüber der Anordnung der
Methylgruppen des TATP auf. Damit ist das Ziel der TATP-Hapten-Synthese er-
reicht: Das Hapten stimmt nahezu hundertprozentig mit der Struktur des Analyten
84 Ergebnisse und Diskussion
überein, so dass die Produktion eines selektiven TATP-Antikörpers ermöglicht
werden kann. Als Zwischenschritt dahin musste das Hapten jedoch an Proteine
gekoppelt werden, was mit Hilfe seiner Carboxygruppe erfolgte.
Abschließend soll noch erwähnt werden, dass sich das TATP-Hapten aufgrund
der veränderten Seitenkette im Vergleich zu TATP als sehr stabil erwiesen hat.
Vor allem konnte festgestellt werden, dass das TATP-Hapten nicht flüchtig ist,
denn es ließ sich hervorragend durch Abdampfen von Lösungsmitteln gewinnen
und konnte so auch von TATP getrennt werden. Des Weiteren konnte kein Ab-
bau des gereinigten Produkts, getrocknet oder in Lösung, über einen Zeitraum
von 12-18 Monaten bei 4 °C beobachtet werden. Eine Aussage über die Fähig-
keit zur Explosion oder Sprengkraft des TATP-Haptens lässt sich nicht treffen. Da
aber der Triperoxidring wie beim TATP vorhanden ist, sollte auch hier Vorsicht
geboten sein. Leider war es nicht möglich, weiterführende Charakterisierungen
(z. B. zu den D3-/C2-Konformere) mit dem TATP-Hapten vorzunehmen. Es wur-
den nur ca. 15 mg TATP-Hapten gewonnen und fast vollständig zur Synthese
von Proteinkonjugaten oder der Strukturanalyse verbraucht.
4.3 Immunogene und andere Proteinkonjugate
Das synthetisierte TATP-Hapten erfüllt seine Aufgaben nur, wenn es kovalent an
ein Protein gebunden ist. Wie in Abschnitt 3.3.3 ausführlich geschildert, wurde
das carboxylierte TATP zu BSA-, HRP- und OVA-Konjugaten verarbeitet und
fungierte so als Immunogen oder markierter Analyt. Sowohl die Kopplung über
die Aktivierung des Haptens zum NHS-Ester als auch über die Gemischte-
Anhydrid-Methode führten zu brauchbaren TATP-Proteinkonjugaten, wenngleich
die NHS-Ester-Methode verbreiteter ist. Ein Grund dafür wird die einfachere
Handhabbarkeit (vor allem durch das Arbeiten bei Raumtemperatur) sein, wes-
wegen sie auch in dieser Arbeit bevorzugt wurde. Es hätte auch die Möglichkeit
bestanden, die TATP-Hapten-NHS-Ester chromatographisch zu reinigen, denn
sie sind zumindest über einen kurzen Zeitraum in mäßig saurem Milieu stabil
[298]. Da jedoch schon die Reinigung des Haptens mit großem Aufwand erfolgte
und weitere Verluste wegen der nur begrenzt vorhandenen Menge unbedingt
vermieden werden sollten, wurde darauf verzichtet. Damit wurde riskiert, auch
Antikörper gegen Nebenprodukte zu produzieren, was auch bei den gemischten
Anhydriden nicht verhindert werden konnte. Da letztere noch hydrolyseempfind-
licher sind, bot sich die chromatographische Trennung hier nicht an.
Die Aufarbeitung der TATP-Proteinkonjugate nach der Kopplung lief bei allen
Experimenten gleich ab. Am Beispiel des Immunogens 3 ist in Abbildung 4.6 die
Reinigung und Bestimmung der Proteinkonzentration der TATP-Proteinkonjugate
dargestellt. Die Elution der Proteinkonjugate von der PD-10-Säule in die UV-
durchlässigen Mikrotiterplatten wurde bei 280 nm verfolgt. Die in Abbildung 4.6
farblich hervorgehobenen Immunogen-3-Fraktionen 16-30 (15 Kavitäten) wurden
vereinigt. Auch die anderen Konjugate eluierten in diesem Bereich, bei den HRP-
Ergebnisse und Diskussion 85
Konjugaten wurden jedoch die Fraktionen mit den höchsten Signalen (etwa die
Hälfte der Kavitäten mit dem Protein) getrennt von denen, die die Flanken der
Elutionskurve bilden, gesammelt. Der beginnende Anstieg der Extinktion der letz-
ten Fraktionen war ebenfalls stets zu beobachten. Er rührt von den Ausgangs-
und Nebenprodukten der Synthesen her, die bei dieser Größenausschlusschro-
matographie (> 5 000 Da) zuletzt von der Entsalzungssäule kommen. Anhand
des erhaltenen Volumens und der bestimmten Proteinkonzentration der Protein-
konjugate wurde eine Wiederfindung von ca. 80-90% der eingesetzten Protein-
menge festgestellt. Unter Berücksichtigung der Verluste beim Pipettieren, Zentri-
fugieren und vor allem beim Vereinen nur der Fraktionen, die deutlich aus dem
Untergrund hervortreten, entspricht das ungefähr der Angabe des Herstellers, der
eine Wiederfindung von 95% für Proteine verspricht [299].
Abbildung 4.6: Reinigung der TATP-Proteinkonjugate über PD-10-Säulen mit photometrischer
Kontrolle der Fraktionen und anschließender Proteinbestimmung (kleine Grafik) der vereinten Fak-tionen (violett) der am Beispiel des Immunogens 3.
Daneben wurden auch die Konzentrationen der TATP-Proteinkonjugat-Lösungen
photometrisch bei 280 nm bestimmt. In Abbildung 4.6 (kleines Bild) ist exempla-
risch eine BSA-Kalibriergerade dazu gezeigt, die ähnlich auch für OVA und HRP
aufgenommen wurde. Die damit ermittelten Konjugatkonzentrationen sind in Ta-
belle 4.1 zusammengestellt (für HRP-Konjugate: nur Hauptfraktionen und ohne
Guardian-Zusatz). Die Bestimmung der Proteinkonzentration ist keine sehr exak-
te Methode, weswegen die erhaltenen Werte eher als Richt- und Vergleichswerte
angesehen werden sollten. Auch die Verwendung des molaren Extinktionskoeffi-
zienten der HRP bei 402 nm erwies sich dabei als nicht ideal. Auch hier traten
zum Teil erhebliche Schwankungen und Abweichungen gegenüber den mittels
Kalibriergeraden bestimmten Konzentrationen auf. Egal ob die Kalibriergerade
mit HRP oder OVA erstellt wurde, die Vergleichsmessung per molaren Extinkti-
onskoeffizienten ergab kleinere Werte für die HRP-Konjugatkonzentration. Ent-
scheidend ist außerdem, dass TATP bei diesen Wellenlängen nicht absorbiert
und so keinen Einfluss auf die Messwerte der Konjugate hatte. Allerdings lässt
sich daher auch nicht zwischen gekoppelten und ungekoppelten Proteinen unter-
scheiden, die durch die Reinigung mit den PD-10-Säulen nicht voneinander
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0
1
2
3
4
5
6
7
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.2
0.4
0.6
Extin
ktio
n ( =
28
0 n
m)
Fraktion
Extin
ktio
n ( =
28
0 n
m)
BSA [mg mL-1]
R2 = 0.9995
86 Ergebnisse und Diskussion
trennbar waren. Aufschluss über die erfolgreiche Kopplung konnten dann erst die
MALDI-TOF-MS-Messungen geben.
Tabelle 4.1: Konzentration und Kopplungsdichte der TATP-Proteinkonjugate.
TATP-Proteinkonjugat
TATP-Hapten:Protein (Syntheseansatz)
Proteinkonzentration [mg mL-1]
Kopplungsdichte (MALDI-TOF-MS)
Immunogen 1 (BSA) 22:1 1.5 1< 5:1
Immunogen 2 (BSA) 50:1 1.7 < 11:1
Immunogen 3 (BSA) 38:1 7.8 < 14:1
Immunogen 4 (BSA) 13:1 6.6 1< 4:1
HRP-Konjugat 1 21:1 4.2 1< 1:1
HRP-Konjugat 2 36:1 2.1 1< 1:1
HRP-Konjugat 3 41:1 2.0 1< 2:1
HRP-Konjugat 4 49:1 1.3 1< —
HRP-Konjugat 5 41:1 2.8 1< 1:1
OVA-Konjugat 1 07:1 2.9 1< 2:1
OVA-Konjugat 2 24:1 2.1 1< 3:1
OVA-Konjugat 3 20:1 6.3 1< 4:1
Die Kopplungsdichten geben Auskunft über die Anzahl der TATP-Hapten-
Moleküle, die an ein Molekül des jeweiligen Proteins gebunden werden konnten.
Sie liegen deutlich unter den Verhältnissen im Syntheseansatz, wie Tabelle 4.1
zeigt. Besonders auffällig ist, dass vor allem die HRP-Konjugate nur maximal 1-2
gekoppelte Hapten-Moleküle aufweisen. Gleiches wurde auch in verschiedenen
Veröffentlichungen berichtet [276, 300], wo ebenfalls nur zwei der sechs zugäng-
lichen-Aminogruppen von Lysinresten unter den milden Bedingungen der NHS-
Ester-Methode eine Verknüpfung eingingen. Der Angriff an die vier anderen Ly-
sinreste sollten über aggressivere Methoden, z. B. durch den Einsatz von Anhyd-
riden [276], erreicht werden. Die erfolgreiche Bindung an die weiteren Lysinreste
kann anhand der Kopplungsdichte von HRP-Konjugat 5 jedoch nicht bestätigt
werden. Auch für die Herstellung des Immunogens 1 wurde das Hapten in einem
gemischten Anhydrid verwendet und auch hier zeigte dieses keine stärkere Re-
aktion als die NHS-Ester. Stattdessen ist tendenziell eher eine Abhängigkeit der
Kopplungsdichte von der eingesetzten Menge TATP-Hapten zu erkennen. Von
den 59 Lysinen in BSA stehen etwa 30-35 zur Kopplung zur Verfügung [301],
auch wenn im Mittel nur eine Kopplungsdichte von 11-14 Haptenmolekülen pro
Molekül BSA erlangt wurde. Die sehr breiten Verteilungen der Massen im MALDI-
TOF-Massenspektrum (Abbildung 4.7) von Immunogen 2 und 3 machen aber
auch deutlich, dass durchaus einige BSA-Moleküle die maximale Kopplungsdich-
te erreichten und andere unverändert aus dem Syntheseansatz hervorgingen.
Der Versuch, die mittlere Kopplungsdichte durch den 100-fachen Überschuss an
aktiviertem TATP-Hapten während der Kopplungsreaktion zu erhöhen, scheiterte.
Für die Acetylierung und Succinylierung der 20 verfügbaren -Aminogruppen von
Lysinresten des OVA mittels Anhydriden gibt es Untersuchungen von Batra et al.
[302], die erst durch den Einsatz von > 1 000 aktivierten Reaktanden pro OVA
Ergebnisse und Diskussion 87
eine vollständige Kopplung erzielten. Bei einem Verhältnis von unter 30 Anhydri-
den auf ein Molekül OVA wurden Aminogruppen im einstelligen Bereich modifi-
ziert (Acetylierung: 3-7, Succinylierung: 5). Mit der milderen NHS-Ester-Methode
wurden in dieser Arbeit TATP-OVA-Konjugate ähnlicher Kopplungsdichte erhal-
ten (Tabelle 4.1).
Abbildung 4.7: MALDI-TOF-Massenspektren (Ausschnitte) ausgewählter TATP-Proteinkonjugate.
Die Bestimmung der Kopplungsdichte erfolgte anhand von MALDI-TOF-Massen-
spektren, wie sie in Abbildung 4.7 für ausgewählte TATP-Proteinkonjugate zu
sehen sind (die meist verwendeten HRP- und OVA-Konjugate sowie alle Immu-
nogene, inklusive des nicht eingesetzten Immunogens 4). Die Spektren und das
Vergleichsspektrum eines ungekoppelten Proteins wurden auf eine gemeinsame
Basislinie gezogen, geglättet und die Differenz aus den Maxima der Kurven ge-
bildet. Diese wird nach Gleichung 3 durch die molare Masse des TATP-Haptens
65000 70000 75000
0
5000
10000
15000
20000
65000 70000 75000
0
10000
20000
30000
40000
50000
65000 70000 75000
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
65000 70000 75000
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
40000 45000 50000
0
5000
10000
15000
40000 45000 50000
0
5000
10000
15000
Inte
nsität
m/z
BSA
Immunogen 1
1475
Inte
nsität
m/z
BSA
Immunogen 2
3240
Inte
nsität
m/z
BSA
Immunogen 3
4178 1198
Inte
nsität
m/z
BSA
Immunogen 4
Inte
nsität
m/z
HRP
HRP-Konjugat 1
344
Inte
nsität
m/z
OVA
OVA-Konjugat 3
1120
88 Ergebnisse und Diskussion
abzüglich des im Verlauf der Reaktion (netto) abgespaltenen Wassers
(304.33 g mol-1) geteilt und ergibt die mittlere Kopplungsdichte.
Es ist zu beachten, dass die berechneten Kopplungsdichten zwar starke Indi-
zien für die erfolgreiche Kopplung des TATP-Haptens an ein Protein liefern, aber
letztlich nur eine Massenverschiebung anzeigen. Erst nach dem Gelingen der
ersten Immunisierung und der ELISA-Experimente stand der Erfolg endgültig
fest. Tatsächlich ist nicht die Kopplungsdichte für die Güte eines Konjugats ent-
scheidend, sondern seine Funktionalität im ELISA bzw. bei der Immunisierung.
Daher wurde von HRP-Konjugat 4 auch kein MALDI-TOF-Massenspektrum auf-
genommen, schließlich führte sein Einsatz im ELISA mit Mausserum zu keinem
Signal. Offensichtlich blieb der TATP-Hapten-NHS-Ester nicht über mehrere Ta-
ge (bei 4 °C, luftdicht verschlossen) stabil, denn frisch verwendet für die Immu-
nogen-2-Synthese lieferte er ein hervorragendes Konjugat. Für Enzymkonjugate
ist zudem entscheidend, dass ihre Aktivität nicht durch die Synthesevorgänge
beeinträchtigt wird. Für die markierten Analyten wird oftmals ein Hapten/HRP-
Verhältnis (oder Hapten/OVA) von 1:1 in kompetitiven Assays als ideal angege-
ben. In den nachfolgenden Abschnitten wird noch auf den Verwendungszweck
und die Leistungsfähigkeit der einzelnen TATP-Proteinkonjugate genauer einge-
gangen.
4.4 Immunisierungsverlauf
Mausimmunisierung
Zur Immunisierung dreier Mäuse (Abschnitt 3.3.4, Tabelle 3.3) wurde zunächst
das insolubilisierte und niedrig gekoppelte Immunogen 1 verwendet. Die Idee
war, zum einen durch die schlechte Löslichkeit das Immunsystem der Mäuse
stärker zu stimulieren und zum anderen der unausweichlichen Bildung von Anti-
körpern gegen Synthese-Nebenprodukte zumindest bei der ELISA-Durchführung
entgegen zu wirken. Immunogen 1 wurde über die Methode der gemischten An-
hydride hergestellt (Abschnitt 3.3.3), so dass beispielsweise auch Isobutylreste
gekoppelt sein und entsprechende Antikörper ebenfalls auftreten könnten. Da bei
der Herstellung des HRP-Konjugats 1 oder der OVA-Konjugate 1 und 3 mittels
der NHS-Ester-Aktivierung des TATP-Haptens nicht die gleichen Nebenprodukte
entstehen (vor allem durch das hochreaktive N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid und
seine Abkömmlinge), können Kreuzreaktionen diesbezüglich im ELISA ausge-
schlossen werden. Außerdem zeigte bereits die Untersuchung des Maus-3-
Serums nach Boost 2 Kompetition gegenüber TATP (Abbildung 4.8, Tabelle 4.2),
wenn auch die Antikörperkonzentration im Blut des Tieres noch recht gering war.
Zu diesem Zeitpunkt war bei Maus 1 und 2 noch keine Antikörperbildung zu be-
obachten. Um den Prozess zu beschleunigen, wurde den Tieren ab Boost 3 das
höher gekoppelte Immunogen 2 in löslicher Form injiziert. Zwar war dieses Im-
munogen ebenso wie die markierten Analyten über die NHS-Ester-Methode an-
gefertigt worden, aber die Kompetitionsfähigkeit des Tests lässt sich eindeutig
Ergebnisse und Diskussion 89
TATP-Antikörpern zuordnen und ermöglicht ihre Charakterisierung sowie Ver-
wendung. Ein Einfluss von möglicherweise gebildeten Antikörpern gegen Syn-
thesenebenprodukte lässt sich nicht erkennen, da der Testhintergrund (D-Wert,
Gleichung 4) während der gesamten Immunisierung auf dem Niveau des
Präimmunserums blieb und keine störenden Signale auftraten, wie aus Abbildung
4.8 hervorgeht. Die Durchführung verschiedener Synthesemethoden für die un-
terschiedlich eingesetzten TATP-Proteinkonjugate ist damit vermutlich unnötig.
Der Immunisierungsverlauf von Maus 3 ist in Abbildung 4.8 (die maximale Ex-
tinktion der Kurve des Boost-8-Serums wurde auf A = 1, Gleichung 4 normiert)
und Tabelle 4.2 ausführlich dargestellt. Zwischen dem Präimmunserum und dem
Serum nach dem ersten Boost lässt sich kein Unterschied erkennen. Erst ab Se-
rum des 2. Boosts zeigt sich die Entwicklung von TATP-Antikörpern. Obwohl be-
reits Boost 3 mit dem höher gekoppelten Immunogen 2 erfolgte, steigt der TATP-
Antikörpertiter erst nach Boost 4 sprunghaft an. Danach scheint die Antikör-
perentwicklung nahezu zu stagnieren. Obwohl die Immunogengabe um ein Fünf-
tel reduziert wurde, hätte weiterhin eine Affinitätsreifung erfolgen können. Statt-
dessen schwankten die Resultate von Boost zu Boost, insbesondere der Testmit-
telpunkt (IC50) pendelte sich um 2.5 mg L-1 bzw. die Antikörperaffinität von
0.17 × 106 L mol-1 (Gleichung 8) ein. Diese Schwankungen entsprechen denen,
die auch bei Boost-8-Serum im Laufe der Untersuchungen auf verschiedenen
Platten und an verschiedenen Tagen auftraten.
Abbildung 4.8: Entwicklungsverlauf des Serums von Maus 3 im ELISA während der Immunisie-
rung.
Für die Seren von Maus 1 und 2 konnten keine Kurven im direkten ELISA erhal-
ten werden, weswegen auf ihre Untersuchung hier nicht genauer eingegangen
wird und sich die Darstellungen auf Maus 3 beschränken. Es sei jedoch erwähnt,
dass beide im indirekten ELISA Signale ab dem dritten Boost lieferten. Mit dem
Serum von Maus 1 konnte zum Ende der Immunisierung hin ein ähnlicher Anti-
0.0009 0.1 1 10 100
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
Extinktion ( =
450 n
m)
(norm
iert
)
TATP [mg L-1]
präimmun
Boost 1
Boost 2
Boost 3
Boost 4
Boost 5
Boost 6
Boost 7
Boost 8
90 Ergebnisse und Diskussion
körpertiter wie der von Maus 3 festgestellt werden, wohingegen das Maus-2-
Serum deutlich schwächere Signale bei gleicher Verdünnung (1:10 000) hervor-
rief. Insgesamt funktionierte der indirekte ELISA für die Mausseren besser. So
konnte bei Maus-3-Serum ein etwas besserer Testmittelpunkt von 1-1.5 mg L-1
gemessen werden. An den Beobachtungen zur Antikörperreifung, die nahezu
ausblieb (vergleichbar mit Tabelle 4.2), änderte sich jedoch nichts. Während der
IC50 von Maus-1-Serum zwei- bis dreimal schlechter im Vergleich zu Maus-3-
Seren war, wurde für Maus-2-Serum ein Testmittelpunkt von 0.2-0.3 mg L-1 erhal-
ten. Da das Maus-2-Serum somit eine etwa fünfmal bessere Antikörperaffinität
als das Maus-3-Serum aufwies, wurde auch diese Maus zur Herstellung von
Hybridomzellen eingesetzt.
Tabelle 4.2: Affinitätsreifung von Maus 3.
Verdünnung IC50 Affinität
Boost Serum HRP-Konjugat [mg L-1] [L mol-1]
● 2 1:10 000 1:10 000 4.25 ± 1.48 0.105 ± 0.037 × 106
● 3 1:10 000 1:10 000 2.89 ± 0.57 0.154 ± 0.030 × 106
● 4 1:10 000 1:10 000 2.96 ± 0.12 0.150 ± 0.006 × 106
● 5 1:10 000 1:10 000 2.26 ± 0.22 0.197 ± 0.019 × 106
● 6 1:10 000 1:10 000 2.29 ± 0.11 0.194 ± 0.010 × 106
● 7 1:10 000 1:10 000 2.83 ± 0.30 0.157 ± 0.017 × 106
● 8 1:10 000 1:10 000 2.75 ± 0.16 0.162 ± 0.009 × 106
Untersuchung der Hybridomzellkulturen
Nach Boost 8 wurden Maus 2 und 3 für die Fusion ihrer Milzzellen mit Myelom-
zellen ausgewählt. Zur Vorbereitung darauf mussten die Tiere zwei Tage vor der
Milzentnahme ein letztes Mal immunisiert werden. Nach diesem neunten Boost
war für ausführliche Tests nicht genügend Serum vorhanden. Der einzig mögli-
che ELISA offenbarte aber fast identische Werte wie mit Boost-8-Serum. Rück-
blickend lässt sich aus den Ergebnissen in Abbildung 4.8 und Tabelle 4.2 sagen,
dass der finale Boost nicht erst an Tag 320 nach der Erstimmunisierung der
Mäuse hätte erfolgen können sondern deutlich eher. Während der Tests zwi-
schen den einzelnen Nachimmunisierungen war jedoch jegliche Schwankung mit
der Hoffnung auf weitere Verbesserung verknüpft. Die Fusion von Milz- und
Myelomzellen sollte zu TATP-Antikörper-sekretierenden und zugleich immortali-
sierten Hybridomzellen führen. Mittels ELISA wurden die Zellkulturüberstände auf
das Vorhandensein von TATP-Antikörpern geprüft. Das Ergebnis dieser Untersu-
chungen war trotz des enormen Aufwands und funktionierenden Positiv- und Ne-
gativkontrollen ernüchternd: Es konnte kein positiver Zellklon identifiziert werden,
so dass auch keine monoklonalen TATP-Antikörper produziert werden können.
Im direkten ELISA mit den ersten 68 Zellkulturüberständen von Tag 18 nach
der Fusion sowie mit sämtlichen Überständen von 17 Mikrotiterplatten nach 24
und 32 Tagen wurde kein positives Ergebnis erhalten. Für Hybridomzellen, die
Ergebnisse und Diskussion 91
aus Zellen von Maus 2 erzeugt wurden (fünf Platten), war das nicht auszuschlie-
ßen, da schon das Serum keine Kurven im direkten ELISA hervorbrachte. Für
Maus-3-Fusionszellen (zwölf Platten) wurde aber ein anderes Ergebnis erwartet.
Mit denselben Überständen, jedoch ohne die von Tag 24, dafür zusätzliche vom
53. Tag nach der Fusion, wurden auch indirekte Tests vorgenommen. Diese
ergaben zunächst sogar einige positive Signale, welche sich dann aber als nicht
relevant herausstellten. Einige waren falsch-positiv und manche davon kamen
von Überständen aus Kavitäten, die gar keine Zellen enthielten. Solche Resultate
waren nicht reproduzierbar und ihre Ursache konnte nicht geklärt werden. Ein
Einfluss des Kulturmediums auf den ELISA konnte durch Tests ausgeschlossen
werden. Andere positive Signale traten zwar wiederholt auf und die Zellen der
entsprechenden Kavitäten konnten auch vermehrt werden, so dass genügend
Zellkulturüberstand für weitere Untersuchungen vorhanden war. Jedoch wies
keine dieser Hybridomzellkulturen die Fähigkeit zur Bildung von TATP-
Antikörpern auf, da keine Inhibition im kompetitiven ELISA (indirekt oder direkt)
durch Zugabe von TATP-Lösungen beobachtet werden konnte. Diese positiven
Signale könnten durch andere entstandene Antikörper ausgelöst worden sein,
die entweder ganz unspezifisch an die Mikrotiterplatte oder ihre Beschichtung
binden oder sich vor allem gegen BSA, eventuell aber auch gegen Nebenproduk-
te der NHS-Ester-Synthese (wie oben beschrieben), richten. Die OVA-
Konjugate 1 und 3 wurden auf die gleiche Weise wie das Immunogen 2 herge-
stellt und könnten somit die gleichen Strukturen tragen. Entsprechend entstan-
dene Antikörper könnten so an die OVA-Konjugat-Beschichtung einer Mikrotiter-
platte binden, wobei BSA-Antikörper aufgrund struktureller Ähnlichkeiten von
OVA zu BSA direkt an das OVA binden würden. Mit derartigen Antikörpern kann
TATP nicht kompetitiv wechselwirken und durch den Einsatz von -Maus-IgG-
HRP werden sie nicht selektiv detektiert. Das tatsächliche Vorhandensein von
Antikörpern gegen Synthesenebenprodukte (z. B. gegen N′-Dicyclohexyl-
harnstoffderivate u. ä.) wurde nicht geprüft. Lediglich BSA-Antikörper wurden mit
Mausserum im indirekten ELISA untersucht. In Kavitäten mit BSA-Beschichtung
wurden dabei extrem hohe Extinktionen erzielt, was für die Bildung größerer
Mengen BSA-Antikörper spricht, und auch Kavitäten mit einer Beschichtung aus
ungekoppeltem OVA riefen Signale hervor.
Die Ursachen für den Misserfolg bei der Herstellung TATP-Antikörper-
produzierender Hybridomzellen können vielfältig sein. Die Squarix biotechnology
GmbH ist eine Firma mit langjähriger Erfahrung und der in dieser Arbeit entwi-
ckelte TATP-ELISA funktionierte zuverlässig, auch unter den angepassten Be-
dingungen für die Verwendung von Zapfenplatten, wie die mitgeführten Kontrol-
len bestätigen. Fehler bei der Durchführung können daher nahezu ausgeschlos-
sen werden. Seit der Einführung der Hybridomtechnik von Köhler und Milstein
1975 [187] wurden zahlreiche Versuche, vor allem in den 1980er und 1990er
Jahren, unternommen, die Methode zur Gewinnung monoklonaler Antikörper zu
verbessern, doch vom Prinzip her blieb sie stets gleich. Die bekannte Schwach-
stelle ist die eigentliche Fusion von Milz- mit Myelomzellen, wie Tabelle 4.3 für
die praktische Durchführung in dieser Arbeit andeuten soll.
92 Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4.3: Zahlen zur Fusion von Maus-2- und -3-Milzzellen (Schätzungen).
Maus 2 Maus 3
Milzzellen (unabhängig von ihrer Vitalität) 82 000 000 190 000 000
davon stimuliert 10% 20%
fusionierte Zellen bei einer maximalen Fusionswahrscheinlichkeit von 0.01%
8 200 19 000
Anzahl der Kavitäten, auf die Zellen verteilt wurden
480 1 152
mikroskopisch sichtbare Zellklone 14 Tage nach der Fusion
500
Es gibt (auch aus Tierschutzgründen [184]) kaum statistisch abgesicherte Stu-
dien zur Einflussnahme auf die Fusionseffizienz zur Bildung von Hybridomzellen.
Meist handelt es sich um wenige oder gar einzelne durchgeführte Immunisierun-
gen, die veröffentlicht werden. Auch die gewählten Bedingungen, wie Tiermodell,
Zelllinie, Fusionsrezept, Zeitspannen etc. weichen häufig voneinander ab. Letzt-
lich ist selbst der Einfluss des gewählten Immunogens, das stets variiert, weitge-
hend unbekannt und eventuelle Effekte sind nicht auszuschließen, so dass Ver-
gleiche verschiedener Immunisierungen schwierig sind. So ist es nicht verwun-
derlich, dass zum einen wenige Boosts [303, 304] empfohlen werden und zum
anderen vor allem bei schwachen Immunogenen Immunisierungsverläufe bis zu
einem Jahr [47] kein Problem darstellen, um eine erfolgreiche Fusion zu erzielen.
Die in dieser Arbeit recht lange Immunisierungszeit von 320 Tagen muss also
nicht als entscheidendes Kriterium angesehen werden. Ein Grund könnte der
relativ geringe TATP-Antikörpertiter sein. Die Mausseren ließen sich kaum weiter
verdünnen als 1:10 000 (nur in Ausnahmefällen 1:77 000, wie als Positivkontrolle
ohne die Aufnahme einer ELISA-Kompetitionskurve). Im Vergleich zu ähnlich
verlaufenden Immunisierungen im gleichen Labor ist der Titer 10 bis 100-fach
schlechter [305, 306]. Zwar gibt es in der Literatur Hinweise, dass eine 1:10 000-
Verdünnung als Titer ausreichend ist [47, 188], aber nach Angaben von Squarix
biotechnology GmbH war dieser Wert schon an der unteren Grenze für eine er-
folgreiche Fusion. Ihrer Erfahrung nach waren außerdem die beiden Milzen der
immunisierten Mäuse kaum vergrößert (normal sind ~ 108 Zellen [47]) und insbe-
sondere bei Maus 2 fiel die Anzahl der stimulierten Zellen relativ gering aus. Ho-
he Zellzahlen sind wünschenswert, da die Wahrscheinlichkeit der Verschmelzung
von Milzzellen mit Myelomzellen bei der chemischen Fusion mit Polyethylengly-
kol nur 0.001-0.1% beträgt [188-190]. Dabei ist noch nicht sicher, ob auch die
richtige Hybridomzelle, mit der Fähigkeit den gewünschten Antikörper zu produ-
zieren, entstanden ist und sie stabil bleibt. Tabelle 4.3 macht deutlich, dass von
knapp 300 Millionen Milzzellen zweier Mäuse schließlich nur 500 Zellklone resul-
tierten (< 0.0002%). Darunter befinden sich auch die Hybridomzellen nicht stimu-
lierter Milzzellen (80-90%) und solche, die nicht TATP-Antikörper sondern bei-
spielsweise BSA-Antikörper oder Antikörper natürlichen Ursprungs sekretieren.
Des Weiteren kommt es vor, dass Hybridomzellen unter Stress ihre erworbenen
Eigenschaften auch wieder verlieren [47]. Insgesamt ist die Chance, die ge-
Ergebnisse und Diskussion 93
wünschten Antikörper-sekretierenden Zellen zu erzeugen und damit monoklonale
Antikörper produzieren zu können, recht gering.
Sowohl die Immunisierung (bis auf die Wahl der exakten Haptenstruktur) als
auch die Herstellung der Hybridomzellen für die Produktion monoklonaler Anti-
körper sind weitgehend empirische Methoden, die weder vorhersehbar noch ge-
nau steuerbar sind. Selbst neuere Forschungsarbeiten zur Verbesserung der
Zellfusion, bei denen sich oftmals die Elektrofusion durchgesetzt hat, erreichen
mit 0.4% eine kaum höhere Fusionseffizienz [190]. Es sind leider keine Daten
von etablierten Firmen bekannt, die einen Hinweis auf die Erfolgsquote für die
Herstellung stabiler Zelllinen zur Produktion monoklonaler Antikörper geben. Ein-
zig folgender Kommentar aus einer Patentschrift [307] gibt Auskunft: „Bei einer
typischen, von PEG vermittelten Verschmelzung von 100 Millionen Milzzellen und
10 Millionen Myelomzellen betrug die Ausbeute an verschmolzenen Zellen weni-
ger als 1 000, wovon vier oder fünf geklonte Zellen, jedoch häufig keine, einen
Antikörper mit der gewünschten Spezifizität bilden. Das führt in der Praxis dazu,
daß 5 bis 10 Fusionsverfahren gleichzeitig durchgeführt werden, was zu einer
aufwendigen nachfolgenden Behandlung führt, um das geeignete Hybridom her-
auszufinden.“ Ein wenig hoffnungsvoller Satz, der aber die hier bei der Durchfüh-
rung gemachten Erfahrungen bestätigt.
Kaninchenimmunisierung
Das Scheitern der Herstellung von monoklonalen TATP-Antikörpern machte eine
neue Strategie zur Produktion von TATP-Antikörpern notwendig. Da die Immuni-
sierung der Mäuse prinzipiell funktionierte, aber nur geringe Mengen polyklonaler
TATP-Antikörper in Form ihrer Seren (≤ 100 µL) verfügbar waren, wurden zur
Gewinnung größere Mengen polyklonaler TATP-Antikörper zwei Kaninchen im-
munisiert. Pro Blutung konnten dabei jedem Kaninchen bis zu 20 mL Serum ent-
nommen werden, zum Abschluss der Immunisierung sogar knapp 60 mL. Mit den
Erfahrungen von der ersten Immunisierung wurde von Anfang an lösliches Im-
munogen 3 mit einer hohen Kopplungsdichte injiziert, das nahezu identisch dem
bei der Mausimmunisierung eingesetzten Immunogen 2 war (Abschnitt 3.3.3 so-
wie Tabelle 4.1 und Abbildung 4.7). Zunächst wurden bis einschließlich zum drit-
ten Boost jedem Tier 100 µg Immunogen dem Speedy 28-day protocol von Euro-
gentec S.A. [282] folgend verabreicht (Tabelle 3.4). Bereits in dem Serum nach
Boost 2 ließen sich TATP-Antikörper nachweisen, doch Boost 3 brachte noch-
mals beachtliche qualitative und quantitative Verbesserungen des Serums beider
Kaninchen, so dass eine Fortsetzung der Immunisierung über das ursprünglich
gebuchte Programm hinaus sinnvoll erschien.
Ab Boost 4 wurden beiden Kaninchen dann 50 µg Immunogen 3 gespritzt und
ab Boost 5 erfolgte die Immunogengabe in regelmäßigem Abstand von vier Wo-
chen (Tabelle 3.4). Die positive Entwicklung der Antikörper setzte sich auch nach
Boost 3 weiter fort und verlief für beide Kaninchen fast parallel. Die Affinitätsrei-
fung der Seren macht besonders zwischen Boost 2 und Boost 6 stetige Entwick-
lungen erkennbar, wie Tabelle 4.4 für Kaninchen 1 und Tabelle 4.5 für Kanin-
94 Ergebnisse und Diskussion
chen 2 zeigt. Schließlich werden die Veränderungen immer kleiner, so dass ab
Boost 8 keine signifikante Besserung auftritt. Interessanterweise ist die Zunahme
des Titers der TATP-Antikörper, wie aus Abbildung 4.9 (Kaninchen 1) und Abbil-
dung 4.10 (Kaninchen 2) abzulesen ist, durch regelrechte Schübe nach Boost 2
sowie nach Boost 6 und Boost 7 geprägt. Danach treten Schwankungen des Ti-
ters auf und um nicht zu riskieren, dass der Titer eventuell einbricht (Hyposensi-
bilisierung), wurde die Immunisierung mit Boost 11 beendet.
Abbildung 4.9: Entwicklungsverlauf des Serums von Kaninchen 1 im ELISA während der Immuni-
sierung.
Tabelle 4.4: Affinitätsreifung von Kaninchen 1.
Verdünnung IC50 Affinität
Boost Serum HRP-Konjugat [µg L-1] [L mol-1]
Immunisierung nach Speedy 28-day protocol von Eurogentec S.A.
● 2 1:5 000 1:20 000 140 ± 450 0.002 ± 0.001 × 109
● 3 1:20 000 1:40 000 37.8 ± 13.7 0.007 ± 0.003 × 109
verlängerte Immunisierung nach individuellem Protokoll
● 4 1:120 000 1:30 000 3.59 ± 1.36 0.077 ± 0.029 × 109
● 5 1:120 000 1:30 000 1.50 ± 0.21 0.185 ± 0.026 × 109
● 6 1:40 000 1:180 000 0.859 ± 0.170 0.323 ± 0.064 × 109
● 7 1:200 000 1:100 000 0.608 ± 0.364 0.457 ± 0.273 × 109
● 8 1:500 000 1:600 000 0.225 ± 0.026 1.234 ± 0.143 × 109
● 9 1:300 000 1:600 000 0.297 ± 0.064 0.934 ± 0.200 × 109
● 10 1:300 000 1:600 000 0.274 ± 0.108 1.015 ± 0.402 × 109
● 11 1:300 000 1:600 000 0.268 ± 0.074 1.037 ± 0.286 × 109
3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 präimmun
Boost 2
Boost 3
Boost 4
Boost 5
Boost 6
Boost 7
Boost 8
Boost 9
Boost 10
Boost 11
Extinktion ( =
450 n
m)
(norm
iert
)
TATP [µg L-1]
0
Ergebnisse und Diskussion 95
Die in Abbildung 4.9 und Abbildung 4.10 angegebenen Extinktionen stellen keine
gemessenen Werte dar, sondern sind das Resultat von über die A-Werte (Glei-
chung 4) aneinander gereihten Kurven. Daher rührt auch der Eindruck, dass der
TATP-Antikörpertiter von Kaninchen 1 geringer ist als von Kaninchen 2. Tatsäch-
lich sind bei den Seren der letzten Boosts beide Titer aber sehr ähnlich und der
Titer von Kaninchen 1 liegt nur geringfügig über dem von Kaninchen 2. Ebenso
verhält es sich mit den Affinitäten, die aus den gründlich, durch die zweidimensi-
onale Verdünnung jedes Serums zu dem HRP-Konjugat 1, optimierten Testmit-
telpunkten in Tabelle 4.4 und Tabelle 4.5 nach Gleichung 8 ([240, 241]) ermittelt
wurden. Der für Kaninchen 1 durch die Affinitätsreifung erreichte Endwert unter-
scheidet sich mit rund 1 × 109 L mol-1 nicht signifikant von den knapp
0.7 × 109 L mol-1 von Kaninchen 2. Spätestens nach Boost 8 liegen demnach
Seren zweier Kaninchen vor (Boost-7-Seren sind nicht viel schlechter), die nahe-
zu identisch sind. Daher hätte die Immunisierung bei beiden Kaninchen nach
Boost 8 beendet werden können, aber durch drei weitere Boosts pro Kaninchen
konnten insgesamt mehr als 2 × 100 mL fast gleichwertiger polyklonaler TATP-
Antikörperlösung erhalten werden.
Abbildung 4.10: Entwicklungsverlauf des Serums von Kaninchen 2 im ELISA während der Immu-
nisierung.
Der Immunisierungsverlauf der zwei Kaninchen widerspricht den Zusicherungen
von Eurogentec S.A. [282], dass die Affinitätsreifung und die Titerentwicklung mit
dem Speedy 28-day protocol ausreicht, um vergleichbare polyklonale Seren wie
durch längere Immunisierungen mit weiteren Injektionen zu erlangen. Wäre die
Immunisierung nach Boost 3 mit einer Serumentnahme an Tag 28 beendet wor-
den, so wären nicht nur hohe quantitative Einbußen durch den deutlich geringe-
ren Titer und weniger Serumentnahme die Folge gewesen. Vor allem hätte auch
nicht die Qualität der Seren erreicht werden können, wie sie nach acht Boosts
vorlag. Die Affinitäten wären etwa 50- (Kaninchen 2) bis 150-mal (Kaninchen 1)
3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 präimmun
Boost 2
Boost 3
Boost 4
Boost 5
Boost 6
Boost 7
Boost 8
Boost 9
Boost 10
Boost 11
Extinktion ( =
450 n
m)
(norm
iert
)
TATP [µg L-1]
0
96 Ergebnisse und Diskussion
schlechter gewesen, was sich negativ auf die Empfindlichkeit des ELISA und
anderer Testformate ausgewirkt hätte.
Tabelle 4.5: Affinitätsreifung von Kaninchen 2.
Verdünnung IC50 Affinität
Boost Serum HRP-Konjugat [µg L-1] [L mol-1]
Immunisierung nach Speedy 28-day protocol von Eurogentec S.A.
● 2 1:15 000 1:40 000 78.6 ± 21.2 0.004 ± 0.001 × 109
● 3 1:40 000 1:30 000 16.8 ± 2.70 0.017 ± 0.003 × 109
verlängerte Immunisierung nach individuellem Protokoll
● 4 1:120 000 1:30 000 1.91 ± 0.63 0.146 ± 0.048 × 109
● 5 1:120 000 1:30 000 1.25 ± 0.09 0.222 ± 0.015 × 109
● 6 1:120 000 1:30 000 0.850 ± 0.130 0.327 ± 0.050 × 109
● 7 1:100 000 1:300 000 0.535 ± 0.167 0.519 ± 0.162 × 109
● 8 1:200 000 1:600 000 0.400 ± 0.061 0.694 ± 0.105 × 109
● 9 1:600 000 1:600 000 0.426 ± 0.050 0.653 ± 0.076 × 109
● 10 1:600 000 1:600 000 0.447 ± 0.084 0.621 ± 0.116 × 109
● 11 1:300 000 1:600 000 0.407 ± 0.072 0.683 ± 0.121 × 109
Vergleich von Maus- und Kaninchenimmunisierung
Zunächst sei erwähnt, dass die Immunisierungen der drei Mäuse (mit Einschrän-
kungen bei Maus 1 und 2) und der zwei Kaninchen erfolgreich waren und somit
auch nochmals die passende Struktur des TATP-Haptens und die gelungenen
Proteinkonjugatsynthesen bestätigt wurden. Obwohl die beiden Immunisierungen
nicht identisch durchgeführt wurden, konnten außerdem doch einige interessante
Beobachtungen und Schlüsse aus einem Vergleich ihrer Verläufe gezogen wer-
den. Vor allem der Anfang der beiden Immunisierungsschemen (Abschnitt 3.3.4
und Tabelle 3.4) wich voneinander ab: Ausführende Firma, Kopplungsdichte,
Löslichkeit sowie Menge des Immunogens und die zeitlichen Abstände der Injek-
tionen. Erst ab Boost 3 bzw. 4 wurden ähnliche Immunogene und regelmäßige
4-6-wöchige Intervalle für die Boosts gewählt, die bei beiden zu einer recht lan-
gen Immunisierungszeit führten (Maus: 320 Tage, Kaninchen: 224 Tage).
Die erste Auffälligkeit ist, dass beide Immunisierungsverläufe trotz erwähnter
unterschiedlichster Ausgangsbedingungen ähnlich beginnen. Zwar gibt es von
den Kaninchen kein Serum nach Boost 1, das bei Maus 3 noch keine erkennbare
Immunreaktion zeigte, aber Boost-2-Serum zeigte bei beiden Tierarten lediglich
eine recht schwache Reaktion. Erst mit dem Serum nach Boost 3 sind deutliche
Verbesserungen und insbesondere ein Anstieg des TATP-Antikörpertiters zu
verfolgen. Hier lassen sich die zuerst einsetzende primäre Immunantwort, bei der
zunächst überwiegend die in geringen Mengen vorliegenden, pentameren IgM
agieren, und der Übergang zur sekundären Immunantwort erkennen. Erst durch
den wiederholten Kontakt mit demselben Antigen setzt letztere ein und führt zur
Produktion vieler IgG und ihrer Affinitätsreifung [175, 185]. Auch wenn die Kanin-
Ergebnisse und Diskussion 97
chenseren eine viel deutlichere Entwicklung aufweisen, so setzt doch bei beiden
Immunisierungen nach rund 150 Tagen eine Stagnation ein, wobei die Kanin-
chen in diesem Zeitraum doppelt so oft nachimmunisiert wurden wie die Mäuse
(Maus: Boost 4, Tag 154, Kaninchen: Boost 8, Tag 140). Bemerkenswert ist in
diesem Zusammengang auch, dass bei beiden Spezies die Antigenmenge nach
dem dritten (Maus: von 50 auf 10 µg) bzw. vierten Boost (Kaninchen: von 100 auf
50 µg) reduziert wurde und der Titer davon unbeirrt weiter anstieg. Es ist davon
auszugehen, dass die von den Firmen geforderte Immunogenmenge zur Sicher-
heit ein Überschuss dessen darstellt, was eigentlich zur Auslösung der Immun-
antwort ausreichen würde.
Relevanter für diese Arbeit aber ist, dass sich die polyklonalen Seren sehr er-
heblich in TATP-Antikörperaffinität und -konzentration unterschieden. Nach Ab-
schluss der Antikörperreifung, die bei den Mäusen nur sehr schwach ausfiel,
konnten für Maus-3-Serum eine TATP-Antikörperaffinität von knapp
0.2 × 106 L mol-1 und für die Kaninchen zwischen ca. 0.7 und 1 × 109 L mol-1 er-
mittelt werden. Die polyklonalen Antikörper beider Spezies liegen damit in dem
erwarteten Affinitätsbereich, der auch oft über die reziproken Dissoziations-
konstanten der Antigen-Antikörper-Bindung mit etwa 10-6 bis 10-11 M angegeben
wird [175]. Dennoch unterscheiden sich die Affinitäten um den Faktor 5 000 zu
Gunsten der Kaninchen. Ebenso ist die Antikörperkonzentration in den Kanin-
chenseren ungleich höher als in denen der Mäuse. Zwar liefern die beschriebe-
nen Titer nur relative Werte, die allenfalls Anhaltspunkte für die TATP-Antikörper-
konzentration sein können, aber da hier ähnliche Versuchsbedingungen für
ELISA mit Maus- und Kaninchenserum vorlagen, ist ein Vergleich möglich. Wäh-
rend die Mausseren gerade einmal 1:10 000 verdünnt werden konnten, war bei
den Kaninchenseren eine Verdünnung bis 1:300 000 möglich. Anders ausge-
drückt lassen sich mit den 100 µL Serum, die Maus 3 nach Boost 8 entnommen
werden konnten, ELISA auf 45 Mikrotiterplatten durchführen, wohingegen mit
dem Boost-11-Serum eines Kaninchens (60 mL) mindestens 600 000 Platten
bearbeitet werden können, was ca. 58 Mio. Tests entspricht.
Lehrbücher und (ältere) Publikationen (z. B. [164] und [191, 192]) erklären als
allgemein bekannt, dass verschiedene Spezies oder sogar verschiedene Vertre-
ter der gleichen Art sehr unterschiedlich auf ein und dasselbe Antigen reagieren.
Lediglich auf die Vermeidung von speziesübergreifenden Ähnlichkeiten von Pro-
teinstrukturen, auch bei der Auswahl von Trägerproteinen für Haptene, wird we-
gen der Verminderung bis hin zum Ausbleiben einer Immunantwort auf körperei-
gene Strukturen hingewiesen. Das Erkennen eines Antigens durch das Immun-
system einer Spezies sowie der gesamte Immunisierungsverlauf in den Tieren
und damit auch der positive Ausgang einer Immunisierung werden häufig auch
als abhängig von Zufall und Glück bezeichnet. Das kann (und sollte) sicherlich
auch nicht ausgeschlossen werden, zumal das Arbeiten in biologischen Syste-
men nicht selten von Schwankungen geprägt und nur bedingt steuerbar ist.
Durch die jüngsten Entwicklungen bei der Herstellung monoklonaler Antikörper
aus Kaninchen mehren sich jedoch neuerlich konkrete Hinweise, dass Kaninchen
besser zur Immunisierung geeignet sind als Mäuse, was schon länger vermutet
98 Ergebnisse und Diskussion
wurde. Bei Vergleichen von monoklonalen Antikörpern von Mäusen und von Ka-
ninchen konnte anhand immunhistochemischer Methoden gezeigt werden, dass
die Kaninchen-Antikörper höhere Affinitäten aufweisen [204-206]. Das geht kon-
form mit den Beobachtungen der in dieser Arbeit produzierten polyklonalen Se-
ren aus Maus und Kaninchen. Sowohl während des gesamten Verlaufs der Im-
munisierung als auch wegen des TATP-Antikörpertiters und vor allem ihrer Affini-
tät sind die Kaninchenseren denen der Mäuse weit überlegen. Die Begründung
dafür scheint in den Unterschieden der Immunsysteme der beiden Spezies (siehe
Abschnitt 2.2.3) gefunden, das sich bei den Kaninchen durch eine höhere Anti-
körpervielfalt auszeichnet. Deswegen dauert auch die Antikörperreifung über
mehr Nachimmunisierungen an als bei den Mäusen [185].
Aus Mäusen konnten mit dem TATP-Hapten und Immunogen nur mäßig erfolg-
reich TATP-Antikörper produziert werden. Mit dem gleichen Hapten und Immu-
nogen wurden jedoch aus Kaninchen polyklonale TATP-Antikörper erhalten, die
mehr als 1 000-mal besser bezüglich ihrer Affinität sowie Quantität sind. Werden
die wirtschaftlichen Aspekte betrachtet, so ist auch hier der polyklonale Antikör-
per mit deutlich günstigeren knapp 2 000 € im Vorteil gegenüber dem 12 000 €
teuren Versuch, monoklonale TATP-Antikörper aus Mäusen zu gewinnen. Den-
noch werden monoklonale Antikörper wegen ihrer besser reproduzierbaren Her-
stellung sicherlich das analytische Werkzeug der Wahl bleiben.
4.5 Untersuchung von Faeces
Antikörper sind für viele Anwendungen heutzutage unerlässlich und es ist nicht
absehbar, wie lange zu ihrer Herstellung die Immunisierung von Tieren noch als
wichtigstes Mittel notwendig sein wird. Aus tierschutzrechtlichen [184] sowie ethi-
schen Gründen sollten Hersteller und Forscher nach Alternativen suchen, um
Tierversuche zu umgehen oder, wenn diese unvermeidbar sind, Schmerzen und
Leiden der Tiere so gering wie möglich zu halten. Vor allem für kleine Tiere wie
Mäuse können bereits Injektionen und besonders Blutabnahmen unangenehme
Folgen haben. Daher ist es erfreulich, dass parallel zu zwei weiteren Immunisie-
rungen [305, 306] hier der Nachweis von Hapten-spezifischen Antikörpern aus
den Faeces der Mäuse gelang.
Nach Boost 8 wurde den Mäusen nicht nur Serum entnommen, sondern auch
der Kot der kurzfristig getrennt gehaltenen Tiere eingesammelt. Mit den wässri-
gen Faecesextrakten (Abschnitt 3.3.5) konnten TATP-Kompetitionskurven erhal-
ten werden, wie für Maus 3 in Abbildung 4.11 im Vergleich zu der Kurve mit
Boost-8-Serum im direkten ELISA gezeigt. Die unterschiedlich hohen A-Werte
der Kurvenverläufe, trotz einer dreifach stärkeren Verdünnung des Serums als
üblich (und daher längerer Entwicklungszeit), weisen auf den niedrigen TATP-
Antikörpergehalt in den unverdünnt eingesetzten Extrakten hin. Entweder verlief
die Extraktion nicht ideal, der Kot enthält von vornherein weniger Antikörper oder
diese wurden teils durch Proteasen (z. B. von Bakterien) zersetzt. Wie bereits im
Ergebnisse und Diskussion 99
vorangegangen Abschnitt erwähnt, scheint der Titer der TATP-Antikörper im
Mausserum im Vergleich zu den anderen Immunisierungen schwächer zu sein,
aber dennoch reichte selbst dieser aus, um den Nachweis auch aus den Faeces
zu ermöglichen. Interessanter für die Verfolgung der Affinitätsreifung während
einer Immunisierung ist der Vergleich der Testmittelpunkte und dabei stehen die
Kotextrakte den Seren nicht nach. Der IC50 des Extrakts mit 0.1% Tween-20-
Anteil betrug 2.5 ± 0.3 mg L-1 und der dessen mit 1% BSA-Anteil 2.8 ± 0.5 mg L-1,
was dem Testmittelpunkt von 2.8 ± 0.1 mg L-1 des Boost-8-Serums entspricht.
Ähnliche Beobachtungen konnten auch mit Serum und Faeces von Maus 1 und 2
gemacht werden (nicht gezeigt). Auch hier waren die Titer der Kotextrakte deut-
lich niedriger als die der Seren, aber ausreichend, die Testmittelpunkte jeweils
vergleichbar und der TATP-ELISA funktionierte nur im indirekten Format.
Abbildung 4.11: Nachweis von TATP-Antikörpern in Extraktionen von Maus-3-Faeces. Obere
Kurve: Boost-8-Serum; untere, parallel verlaufende Kurven: Extraktionen.
Die durchgeführten Tests erfolgten, direkt wie indirekt, mit -Maus-IgG als se-
kundäre Antikörper oder als HRP-Konjugate (Abschnitt 3.1.2), die durch Immuni-
sierung von Tieren mit vollständigen Maus-IgG als Immunogen hergestellt wur-
den. Diese polyklonalen Antikörper erkennen daher Bereiche der konstanten
Domänen sowohl der schweren als auch der leichten Polypeptidketten der Anti-
körperstruktur ([H&L]) oder nur Teile davon und sind wenig spezifisch. Da vor
allem die leichten Ketten ( und ) der Immunglobulinklassen einer Spezies na-
hezu identisch sind, treten Kreuzreaktionen zu all diesen auf, worauf viele Her-
steller hinweisen [308-310]. Die überwiegende Klasse von Antikörpern im Darm
und somit im Kot sind IgA [175], aber auch IgG sind dort vertreten [178-180].
Folglich bleibt unklar, welche Klasse von Immunglobulinen in den Faecesextrak-
tionen nachgewiesen wurden. Carvalho [305] präsentiert ausführlichere Untersu-
chungen dazu. Durch den Einsatz von -Maus-IgA als Sekundärantikörper konn-
te er per ELISA zeigen, dass IgA in der Überzahl zu IgG vorliegen, wobei aber
Boost 8-Serum
Extraktion mit 1% BSA
Extraktion mit 0.1% Tween 20
0.0009 0.1 1 10 100
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Extinktion ( =
450 n
m)
TATP [mg L-1]
0
100 Ergebnisse und Diskussion
eine erkennbare Kompetition der IgA ausblieb. Mit -Maus-IgG F(c) als sekundä-
rem Antikörper, der gegen einen Großteil der konstanten Domänen der beiden
schweren Polypeptidketten der Maus-IgG gerichtet ist und daher Klassen-
spezifischer Immunglobuline bindet, hatte er konträr zu Serumtests deutlich nied-
rigere Signale gemessen als mit dem -Maus-IgG [H&L]. Da diese beiden Er-
gebnisse gegenläufig scheinen, ist es am wahrscheinlichsten, dass eine Mi-
schung aus IgG und IgA in den Faecesextraktionen mit dem wenig Immunglobu-
linklassen-spezifischen -Maus-IgG [H&L] detektiert wurde.
Obwohl sämtliche Extraktionen zu positiven Ergebnissen führten, wurden ver-
schiedene Methoden ausprobiert. Wie in Abschnitt 3.3.5 (bzw. 3.1.3) beschrie-
ben, wurden in dieser Arbeit Faeces-Extraktionspuffer mit Tween 20 oder BSA (in
PBS mit Proteaseinhibitoren) variiert. Wie aus Abbildung 4.11 deutlich wird, las-
sen sich die beiden so erhaltenen Extrakte kaum unterscheiden. Ebenso zeigten
Extraktionen der Antikörper aus den Faeces ohne Proteaseinhibitoren oder in
reinem Wasser im ELISA keine Veränderung [305]. Eine Erhöhung der Einwaa-
gen von Mäusekot in Extraktionspuffer ist kaum mehr möglich, da die bereits
verwendeten Mengen zu dickflüssigen Rohextrakten führten, von deren Volumen
nach der Zentrifugation nur die Hälfte für den ELISA-Auftrag übrig blieb. Diese
unverdünnt eingesetzten Extrakte waren tief braun und kaum noch durchsichtig,
dennoch zeigten sich die durchgeführten TATP-ELISA unbeeindruckt von dieser
schwierigen Matrix und der Signaluntergrund blieb auf dem Niveau der TATP-
Kalibrierreihe mit Reinstwasser (Abbildung 4.11). Es konnte also bislang keine
Optimierung des Extraktionsverfahrens der Antikörper aus den Faeces erreicht
werden, die vielleicht die Antikörperkonzentration in den Extrakten erhöht hätte.
Dies könnte hilfreich bei der noch offenen Frage sein, ob auch die Titerentwick-
lung während der Immunisierung über die Kotproben zu verfolgen ist. Ein Zu-
sammenhang mit der IgG-Konzentration im Serum und dem sekretorischen IgA
im Darm ist zumindest bekannt [311] und es scheint keinen logischen Grund zu
geben, warum IgG im Darm sich abweichend davon verhalten sollte. Daneben
besteht insbesondere Optimierungsbedarf bezüglich der Extraktionsdauer, die
bisher stets über Nacht geschah.
Drei unabhängige Mausimmunisierungen mit den chemisch so unterschiedli-
chen Haptenen Isolithocholsäure [305], Ochratoxin A [306] und TATP (diese Ar-
beit) und voneinander abweichenden Extraktionsmethoden ergaben eine ge-
meinsame Erkenntnis, die veröffentlicht wurde [312]: Der Nachweis von Hapten-
spezifischen Antikörpern in Faeces gelang. Da die Affinität dieser Antikörper aus
den wässrigen Kotextrakten mit der Affinität der Antikörper aus den jeweiligen
Seren übereinstimmte, ermöglicht dies die Überwachung des Immunisierungsver-
laufs über die Faeces. Ein Nachweis über den Urin [180] ist ebenso denkbar und
wäre für den Experimentator eleganter, aber die Probensammlung stellt sich
weitaus schwieriger dar. Kotproben können täglich genommen werden, ohne die
Mäuse oder andere Versuchstiere unnötig zu stressen, so dass der Immunisie-
rungshergang zeitlich sogar noch enger kontrolliert werden könnte. Die wichtigste
Errungenschaft ist jedoch, dass mit dieser nicht-invasiven Methode den Tieren
Ergebnisse und Diskussion 101
weniger Schmerz und Leid zugefügt wird. Dafür wäre auch der erhöhte (sicher
noch optimierbare) Arbeitsaufwand durch die Faecesextraktion vertretbar.
4.6 Analytische Kenndaten des TATP-ELISA
Nachweisgrenze und Messbereich
Zur Verfolgung von Immunisierungsverläufen sowie der Untersuchung der
Hybridomzellkulturüberstände werden standardmäßig ELISA (wie in Abschnitt 4.4
beschrieben) angewandt [47]. Auch die Charakterisierung der Antikörper erfolgt
meist per ELISA, bevor dieses Format für analytische Zwecke weiterverwendet
wird oder die Antikörper in anderen Systemen zum Einsatz kommen. Der entwi-
ckelte TATP-ELISA ist also nur eine Variante, die hergestellten TATP-Antikörper
zu nutzen. Er eignet sich aber hervorragend, um deren Potenzial zu zeigen. Ana-
lytisch relevant sind besonders Nachweisgrenzen von Analyseverfahren, wie sie
in Tabelle 4.6 für den TATP-ELISA für verschiedene Seren angegeben werden.
Für den TATP-ELISA mit den Kaninchenseren (ab Boost 7) konnte eine Nach-
weisgrenze von etwa 10 ng L-1 ermittelt werden. Das entspricht bei einem Pro-
benvolumen von 200 µL je Kavität 2 pg TATP. Damit ist der TATP-ELISA eine
der empfindlichsten, vielleicht sogar die empfindlichste, Nachweismethoden für
TATP, wie ein Blick auf die Werte in Tabelle 2.2 (Abschnitt 2.1.2) verdeutlicht.
Selbst per GC-MS konnte mit 70 µg L-1 (oder 70 pg) TATP diese Grenze nicht
erreicht werden (Abschnitt 4.1).
Tabelle 4.6: Nachweisgrenzen des TATP-ELISA mit Kaninchen- und Maus-3-Seren.
Boost 7 Boost 11
Kaninchen 1 06 ± 8 ng L-1 09 ± 7 ng L-1
Kaninchen 2 11 ± 8 ng L-1 11 ± 5 ng L-1
Boost 8
direkt indirekt
Maus 3 45 000 ± 20 000 ng L-1 52 000 ± 25 000 ng L-1
Die Nachweisgrenzen wurden aus je fünf ELISA-Kompetitionskurven von jeweils
unterschiedlichen Mikrotiterplatten (und Versuchstagen) und mit jeweils drei
Messwerten (Kavitäten) pro TATP-Kalibrierlösung über die 3s-Methode bestimmt.
Bis auf die für Boost-11-Seren der Kaninchen miteinbezogenen Werte aus den
Kurven zum Erstellen der Präzisionsprofile in Abbildung 4.12 und Abbildung 4.13
mit 32 TATP-Kalibrierlösungen, wurden die üblichen 8-Punkt-Kurven betrachtet.
Diese machen nicht nur den Vergleich mit den ELISA mit Maus-3-Serum möglich
und lassen die Einbeziehung vieler Kurven zu, sondern entsprechen vor allem
den tatsächlichen Messbedingungen. Es konnte kein signifikanter Unterschied
zwischen den 32- und 8-Punkt-Kurven mit den Kaninchenseren (Boost 11) fest-
gestellt werden, sowohl bezüglich des IC50 als auch der Nachweisgrenze.
102 Ergebnisse und Diskussion
Um die Gegenüberstellung der Nachweisgrenzen der ELISA mit Kaninchen- und
Mausseren unter möglichst ähnlichen Voraussetzungen durchzuführen, wurden
der direkte und indirekte ELISA mit Boost-8-Serum von Maus 3 zunächst ver-
sucht zu optimieren und 200 µL TATP-Kalibrierlösung verwendet. Der Testmittel-
punkt des indirekten Assays änderte sich nicht und der des direkten passte sich
ihm mit ~ 1.5 mg L-1 an. Durch die neuen Volumina von Kalibrierlösung und HRP-
Konjugat 1 verbesserte sich die Antikörperaffinität (Abschnitt 4.4) jedoch nicht, so
dass der ELISA auch vor der versuchten Optimierung gut eingestellt war und die
Konzentrationen nur den veränderten Volumina angepasst wurden (Abschnitt
3.3.5). Bei einem vorangegangenen Versuch, Maus-3-Serum nach Boost 4 zu
optimieren, wurde das Gleiche beobachtet und es konnte ebenfalls keine Ver-
besserung erzielt werden. Die unter diesen nun angepassten Bedingungen erhal-
tenen Werte für die Nachweisgrenzen der TATP-ELISA mit den verschiedenen
polyklonalen Antikörpern untermauern zwei Aussagen aus Abschnitt 4.4: Zum
einen unterscheiden sich die Seren der Kaninchen 1 und 2 nicht (oder nur mini-
mal) und bereits Boost 7 kann mit den höheren Boosts mithalten (bis auf den
Titer). Zum anderen sind, wie schon die Antikörperaffinitäten, die Nachweisgren-
zen der ELISA mit Kaninchenseren 5 000-mal besser als mit Mausserum im di-
rekten oder indirekten ELISA. Daran ist auch gut zu erkennen, dass der Testmit-
telpunkt (IC50) der ELISA-Kurven einen sehr guten Anhaltspunkt für die Empfind-
lichkeit eines ELISA liefert und sich vor allem für direkte Vergleiche eignet.
Abbildung 4.12: Präzisionsprofil (violett) aus einer ELISA-Kurve (schwarz) mit dem Serum von
Kaninchen 1 (Boost 11).
Entscheidend für den zuverlässigen Nachweis eines Analyten ist nicht nur die
Nachweisgrenze sondern auch der Messbereich. Für ELISA bietet sich dabei ein
Präzisionsprofil nach Ekins [243] an, wie für Boost 11 beider Kaninchen gesche-
hen (Abschnitt 3.3.5). Abbildung 4.12 und Abbildung 4.13 zeigen kompetitive
ELISA-Kurven aus 32 TATP-Kalibrierlösungen in jeweils dreifacher Ausführung
(schwarz; grau/offen = ausgenommen Wert bei 2 µg L-1 von Kaninchen 2, bei
3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Extin
ktio
n ( =
450
nm
)
TATP [µg L-1]
Re
lative
r F
eh
ler
der
Ko
nze
ntr
atio
n [
%]
Kaninchen 1
0
Ergebnisse und Diskussion 103
dem ein Ausreißer nicht berücksichtigt wurde). Daraus wurden nach Gleichung 6
die jeweiligen Präzisionsprofile erstellt, welche ebenfalls in die beiden Abbildun-
gen (violett) integriert wurden. Tabelle 4.7 bietet dazu einen Überblick über aus-
gewählte relative Fehler der Konzentration der Messwerte, unterhalb derer als
Toleranzgrenze sich entsprechende Messbereiche der TATP-ELISA mit
Boost-11-Seren beider Kaninchen ausmachen lassen.
Abbildung 4.13: Präzisionsprofil (violett) aus einer ELISA-Kurve (schwarz) mit dem Serum von
Kaninchen 2 (Boost 11).
Tabelle 4.7: Messbereich des TATP-ELISA mit Boost-11-Kaninchenseren.
tolerierter Fehler
Kaninchen 1 [µg L-1]
Kaninchen 2 [µg L-1]
30% 0.200 bis < 0300 0.05 bis < 1100
40% 0.030 bis < 0350 0.04 bis < 1400
50% 0.025 bis < 2700 0.03 bis < 2700
60% 0.025 bis < 2700 0.03 bis < 2700
Der Messbereich gibt Auskunft über die Präzision der Messwerte und ermöglicht
dem Anwender zu entscheiden, in welchem Bereich für ihn noch tolerierbare Ab-
weichungen liegen. Sind beispielsweise 40% akzeptabel, so erstreckt sich der
auswertbare Bereich des TATP-ELISA für Kaninchen-1-Serum über vier Zehner-
potenzen und für Kaninchen-2-Serum sogar noch darüber hinaus (Tabelle 4.7).
Doch schon mit bloßem Auge ist sichtbar, dass beide ELISA-Kurven (Abbildung
4.12 und Abbildung 4.13) große Unsicherheiten hauptsächlich im Bereich der
niedrig konzentrierten TATP-Kalibrierlösungen aufweisen, wohingegen beson-
ders die Werte oberhalb der Testmittelpunkte (Kaninchen 1: 0.50 µg L-1, Kanin-
chen 2: 0.35 µg L-1) sich trotz kleiner werdender Extinktionen durch ihre hohe
Reproduzierbarkeit auszeichnen. Es wurden einige Anstrengungen unternom-
3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
0
50
100
150
200
250
300
350Kaninchen 2
Extinktion ( =
450 n
m)
TATP [µg L-1]
0
Rela
tiver
Fehle
r der
Konzentr
ation [
%]
104 Ergebnisse und Diskussion
men, um das Vertrauen in den ELISA auch für kleinere Konzentrationen zu erhö-
hen. Der Einsatz einer 96-Kanal-Pipette (Liquidator96), schnelles Arbeiten, ver-
schiedene Durchführende oder der Versuch, die Kalibrierlösungen durch Metha-
nolzugabe zu stabilisieren, führten zu keiner Verbesserung. Da besonders der
Bereich der kleineren Konzentrationen betroffen ist, wirkt sich das deutlich auf die
Nachweisgrenze aus. Auch wenn diese theoretisch bei rund 10 ng L-1 liegt, so ist
praktisch ein belastbarer und vertrauenswürdiger TATP-Nachweis erst oberhalb
von 40 ng L-1 oder sogar darüber empfehlenswert.
Ein Großteil der Daten zu den Kaninchenseren im ELISA (inklusive Immunisie-
rungsverlauf) wurde zusammen mit den folgenden Untersuchungen zur Kreuzre-
aktivität veröffentlicht [313].
Kreuzreaktivität
Synthese zu untersuchender Kreuzreaktanden
Einige der potenziellen Kreuzreaktanden mussten, wie in Abschnitt 3.3.5 ausge-
führt, selbst hergestellt werden, da sie kommerziell nicht verfügbar sind. Der Er-
folg dieser Synthesen wurde mittels NMR und/oder Einkristallstrukturanalyse
(Abschnitt 3.3.1) kontrolliert.
Für DADP (C6H12O4) wurden die Gitterkonstanten a = 5.9109 Å, b = 5.9213 Å,
c = 10.5816 Å, = 90°, = 94.222°, = 90° durch Messung am Röntgendiffrak-
tometer erhalten. In der CCDC-Datenbank fanden sich drei übereinstimmende
Einträge (AROZEM [314], AROZEM01 [46], AROZEM02 [315]), die eine eindeu-
tige Identifizierung von DADP zuließen. Auch die NMR-Untersuchungen bestätig-
ten die Struktur von DADP. Im 1H-NMR-Spektrum (CD3OD, 400.14 Mhz) wurden
Signale bei = 1.30 (s, 6H, 2×CH3) und 1.74 ppm (s, 6H, 2×CH3) sowie im 13C-
NMR-Spektrum (CD3OD, 100.62 Mhz) bei = 20.9 (2×CH3(ax)), 22.6 (2×CH3(eq))
und 108.7 ppm (Cq) registriert. Zusätzlich konnte das dimere Acetonperoxid auch
per GC-MS über die NIST-Massenspektrenbibliothek nachgewiesen werden (vgl.
Abschnitt 3.3.1). Im Rahmen der Kreuzreaktivitätsuntersuchungen wurde des
Weiteren zunächst per ELISA festgestellt, dass das aus TATP (unter Verwen-
dung von p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat als Katalysator [46]) entstandene
DADP im getrockneten Zustand in wenigen Monaten bei 4 °C wieder vollständig
zu TATP zurückreagiert (Mechanismus unklar). Auch bei der anschließenden
Untersuchung des entsprechenden Ansatzes mittels HPLC-MS konnte nur TATP
nachgewiesen werden. Bei der Lagerung des umkristallisierten DADP in metha-
nolischer Mutterlauge, also ohne Kontakt der Kristalle zu Luft, konnte dies nicht
beobachtet werden.
HMTD (C6H12N2O6) konnte nach der Bestimmung der Gitterkonstanten mittels
Einkristallstrukturanalyse auf a = 10.4697 Å, b = 10.4697 Å, c = 6.9808 Å,
= 90°, = 90°, = 120° durch den Abgleich mit der CCDC-Datenbank klar über
den Eintrag CUXWIB02 [316] zugeordnet werden. Die Synthese von HMTD
konnte daneben ebenso über die chemischen Verschiebungen im NMR
abgesichert werden. Nur ein Signal wurde dazu im13C-NMR-Spektrum (CDCl3,
Ergebnisse und Diskussion 105
100.62 Mhz) mit = 90.4 ppm (CH2) erhalten. Im 1H-NMR-Spektrum (CDCl3,
400.14 Mhz) trat ein Hauptsignal bei = 4.77 ppm (s, 12H, 6×CH2) auf und
weitere Signale im Protonenbereich rührten von diversen, nicht weiter
untersuchten Rotameren her.
Der Syntheseerfolg von Tributanontriperoxid, Tri-3-pentanontriperoxid und Tri-
2-pentanontriperoxid ließ sich kaum belegen, da eine Kristallbildung ausblieb und
die Syntheseansätze ohne Reinigung untersucht wurden. Lediglich dem symmet-
rischen Tri-3-pentanontriperoxid (C15H30O6), das auch schon in Veröffentlichun-
gen beschrieben wurde [290], konnten NMR-spektroskopisch chemische Ver-
schiebungen zugewiesen werden. Dabei wurden zwei Konformere erfasst, die
etwa im Verhältnis 4:1 vorlagen. Daher sind sowohl im 1H-NMR-Spektrum
(CD3OD, 400.14 Mhz) mit = 0.94 bzw. 0.92 ppm (t, 18H, 6×CH3) und 1.71 bzw.
1.65 ppm (q, 12H, 6×CH2) als auch im 13C-NMR-Spektrum (CD3OD, 100.62 Mhz)
mit = 8.3 (CH3), 23.3 bzw. 22.9 ppm (CH2) und 114.6 bzw. 114.7 ppm (Cq)
jeweils zwei dicht beieinander liegende Signale verzeichnet worden, von denen
das ersterwähnte dem häufigeren Konformer entspricht. Bei Tributanontriperoxid
und Tri-2-pentanontriperoxid sind mehr Konformere (oder andere Isomere) zu
erwarten, so dass eine Vielzahl von chemischen Verschiebungen in den NMR-
Spektren erschienen. Die beiden gewünschten Substanzen ließen sich nicht ein-
deutig aus den Produktgemischen identifizieren und lediglich einige Indizien deu-
ten auf ihre Entstehung hin.
Untersuchung der Kreuzreaktivität
Den nachfolgenden Tabellen ist zu entnehmen, dass weder andere Explosivstof-
fe (Tabelle 4.8) noch strukturell zu TATP ähnliche Moleküle und Ausgangsstoffe
seiner Synthese (Tabelle 4.9) relevante Kreuzreaktivität in den Immunoassays
mit den polyklonalen TATP-Antikörpern aus den beiden Kaninchen (K1 und K2,
Boost 7) oder Maus 3 (M3, Boost 8) hervorrufen. Aufgrund der sehr kleinen Wer-
te, die für die Kreuzreaktivität von DADP und Nitroguanidin erhalten wurden, sind
die Unzulänglichkeiten bei der Herstellung ihrer Stammlösungen vernachlässig-
bar. Methanolreste mussten bei der Einwaage von DADP akzeptiert werden, um
die Rückreaktion zu TATP zu verhindern (siehe oben). Nitroguanidin enthielt
nach Herstellerangaben ungefähr 25% Wasser, so dass eine exakte Berücksich-
tigung des Wassergehalts bei Ansetzen der Stammlösung unmöglich war.
Beide immunisierten Spezies, Maus und Kaninchen, brachten sehr selektive
polyklonale TATP-Antikörper hervor. Lediglich gegenüber dem TATP-Hapten ist
der ELISA mit den Seren der beiden Kaninchen fünfmal empfindlicher als gegen-
über TATP. Da nicht TATP sondern das Hapten („derivatisiertes TATP“) gekop-
pelt an BSA als Immunogen zur Tierimmunisierung eingesetzt wurde, ist das Er-
gebnis eine logische Konsequenz und trat entsprechend auch mit Maus-3-Serum
auf. Somit reagierte der direkte ELISA dreimal empfindlicher auf das TATP-
Hapten als auf TATP selbst, im indirekten Format sogar zehnmal empfindlicher.
Der indirekte Assay mit Mausserum schien erneut empfindlicher und wies höhere
Intensitäten auf als der direkte. Insgesamt ist der Unterschied im Vergleich zu
den Tests mit Kaninchenserum aber nicht groß. Da das TATP-Hapten im Rah-
106 Ergebnisse und Diskussion
men der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal synthetisiert, beschrieben und zum
Patent angemeldet wurde und es nicht kommerziell hergestellt wird oder in der
Natur vorkommt, geht von ihm keine Gefahr falsch-positiver Signale unter realen
Messbedingungen aus.
Tabelle 4.8: Kreuzreaktivität des TATP-ELISA gegenüber ausgewählten Explosivstoffen.
Verbindung M
[g mol-1] molare KR
[%]
TATP
222.24
100.0M K1
100.0M K2
100.0M M3
TNT
227.13
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.01 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
RDX
222.12
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.07 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
PETN
316.14
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.01 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
HMX
296.16
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.01 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
HMTD
208.17
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.01 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
Nitroguanidin
104.07
< 0.01 K1
< 0.01 K2
— M3
Ammoniumnitrat NH4NO3 80.04
< 0.01 K1
< 0.01 K2
— M3
— nicht getestet
NO2O2N
NO2
N
N N
NO2
O2N NO2
O
O
O
ONO2
O2N
O2N
NO2
NN
N N
NO2O2N
NO2O2N
O
O
O
O
N
N
OO
NNO2
NH2H2N
Ergebnisse und Diskussion 107
Tabelle 4.9: Kreuzreaktivität des TATP-ELISA gegenüber Strukturanaloga, bezogen auf TATP.
Verbindung M
[g mol-1] molare KR
[%]
TATP-Hapten
322.35
000490 ± 100 K1
00470 ± 10 K2
309.000 1085.0000
M3, direkt M3, indirekt
Tributanontriperoxid
264.32
< 4.00 K1
< 3.00 K2
< 9.00 < 4.00
M3, direkt M3, indirekt
Tri-3-pentanontriperoxid
306.40
< 0.02 K1
< 0.01 K2
< 0.30 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
Tri-2-pentanontriperoxid
306.40
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.01 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
Diacetondiperoxid (DADP)
148.16
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.01 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
[18]Krone-6
264.32
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.01 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
[12]Krone-4
176.21
< 0.01 K1
< 0.01 K2
— M3
7-Oxooktansäure
158.19
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.01 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
Aceton
58.08
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.01 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
Wasserstoffperoxid H2O2 34.01
< 0.01 K1
< 0.01 K2
< 0.01 < 0.01
M3, direkt M3, indirekt
— nicht getestet
O
OO
O
O
O
O
OO
O
O O
OO
OH
O O
O
108 Ergebnisse und Diskussion
Interessanter für spätere Anwender im Sicherheitsbereich ist die Frage, ob
TATP-Antikörper-basierte Nachweismethoden auch andere Explosivstoffe, mit
und ohne Peroxidgruppen, detektieren. Wie Tabelle 4.8 demonstrieren soll, wür-
de in solchen Tests spezifisch TATP angezeigt, was insbesondere bei der Ent-
sorgung (z. B. für Kampfmittelräumdienste) überaus hilfreich ist. Immunchemi-
kern stellt sich diese Frage nicht. Da die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung auf
der reinen, sehr spezifischen Strukturerkennung beruht, sind Moleküle mit struk-
turellen Ähnlichkeiten, wie Ausgangs-, Neben- und Abbauprodukte der Synthese
des Analyten und strukturelle Analoga am ehesten Kreuzreaktanden (Tabelle
4.9) in Immunoassays [284]. Da TATP aus so alltäglichen Chemikalien herge-
stellt wird, wäre ein Antikörper, der auf Aceton oder Wasserstoffperoxid reagiert,
weitgehend unbrauchbar. Falsch-positive Signale mit daraus eventuell resultie-
renden Fehlalarmen wären unausweichlich. Dies ist auch ein schwerwiegender
Nachteil von zahlreichen Verfahren (siehe Abschnitt 2.1.2), die TATP nach Zerfall
durch Einwirkung von Säure [94, 95, 150, 151] oder UV-Strahlung [98-101] über
Wasserstoffperoxid nachweisen sollen. Die in dieser Arbeit erzeugten TATP-
Antikörper beider Spezies sprechen nicht auf die Ausgangsstoffe, die zugleich
auch die Zerfallsprodukte sind, oder DADP als mögliches Nebenprodukt der
TATP-Synthese an. Selbst die 7-Oxooktansäure aus der Hapten-Synthese, die
nicht nur die Kopplungen ermöglicht, sondern auch als Abstandhalter fungiert,
löst keine messbare Kreuzreaktion aus. Aus anderen Arbeiten ist bekannt, dass
durchaus Antikörper diese Abstandhalter miterkennen, vor allem wenn diese, wie
Triglycin [306], komplexer als eine simple aliphatische Kette sind.
Als einzig kommerziell erhältliche und wenigstens ansatzweise ähnliche Struk-
turen aufweisende, potenzielle Kreuzreaktanden wurden zwei Kronenether ge-
testet. Weil die Ähnlichkeit bei [18]Krone-6 nur durch sechs Sauerstoffatomen in
einem sonst aus Kohlenstoffatomen aufgebauten Ring besteht, der von vornhe-
rein schon aufgrund seiner Größe nicht der geeignetste Kandidat schien, wurde
zusätzlich auch [12]Krone-4 mit dem kleinen Moleküldurchmesser, aber nur vier
Sauerstoffatomen, ausgewählt. Interessant wurden beide jedoch vor allem durch
ihre strukturbedingte Eigenschaft, Kationen komplexieren zu können – ebenso
wie TATP. [18]Krone-6 bindet selektiv K+ und [12]Krone-4 bindet bevorzugt Li+.
Für TATP sind Komplexe mit diversen ein- bis dreiwertigen Metallionen beschrie-
ben, darunter Na+, NH4+, Li+, K+, [117, 127, 317], Zn2+ [142] sowie Cu+,Cd2+, In3+,
Sb3+, Sc3+ und Ti4+ (zum Teil nur theoretisch berechnet und destabilisierend auf
die TATP-Struktur wirkend) [318]. Trotz dieser Analogien ließ sich keine erkenn-
bare Kreuzreaktivität mit den Kronenethern im TATP-ELISA feststellen. Der
Grund dafür liegt wahrscheinlich in den Moleküldurchmessern, welche unter Zu-
hilfenahme von Mercury 2.4 mit Strukturdaten aus der CCDC-Datenbank (jeweils
3-5 Einträge) über das Zentrum der Strukturen abgeschätzt wurden. Dabei fiel
auf, dass TATP mit einem Durchmesser von ~ 3.5 Å (zum Vergleich: DADP hat
~ 2.7 Å) bedeutend kleiner als [18]Krone-6 mit ~ 6.7 Å und auch [12]Krone-4 mit
~ 4.6 Å ist. Mit diesem Größenunterschied können die Kronenether, selbst bei
günstigster Anordnung der Sauerstoffatome, nicht an die auf TATP optimierten
Antigenbindungsstellen der Antikörper passen.
Ergebnisse und Diskussion 109
Die Untersuchung der Kreuzreaktivität (Tabelle 4.9) der polyklonalen TATP-
Antikörper gegenüber Tributanontriperoxid, Tri-3-pentanontriperoxid und Tri-2-
pentanontriperoxid kann aufgrund unzureichender Reinheit und Identifizierung
sowie Konzentrationsbestimmung über die Ausbeute der TATP-Synthese glei-
cher Molaritäten nur eine grobe Abschätzung sein. Daher wurde auch auf eine
Unsicherheitsbetrachtung verzichtet. Dennoch lässt sich eine Tendenz dieser
schwachen Kreuzreaktivitäten erkennen, die auch den Erwartungen entspricht:
Unter Beibehaltung des Triperoxidrings nimmt die Kreuzreaktivität mit zuneh-
mender Kettenlänge der ursprünglichen Methylgruppen in TATP ab. Bei Tribu-
tanontriperoxid entstanden durch die Verwendung von Butanon zur Synthese
anstelle dreier Methylreste drei Ethylreste und für alle untersuchten Seren konn-
ten dafür Kreuzreaktivitäten im einstelligen Prozentbereich festgestellt werden.
Schon durch den Austausch aller Methylreste zu Ethylresten, wie in Tri-3-
pentanontriperoxid, war die Kreuzreaktivität noch stärker vermindert und beim
Tri-2-pentanontriperoxid mit drei Propylresten war sie fast nicht mehr bestimm-
bar. Diese Messergebnisse beweisen durch die Abhängigkeit der hervorgerufe-
nen Kreuzreaktivität von der Ähnlichkeit des Kreuzreaktanden zur Molekülstruktur
des Analyten, dass bereits kleine Strukturänderungen die Antikörpererkennung
erheblich stören und sehr selektive TATP-Antikörper vorliegen. Außerdem wird
klar, dass nicht allein die Peroxidgruppen und ihre Anordnung im Ring, sondern
auch die Methylgruppen mit den Antikörpern bei der Bindung entscheidend
wechselwirken. Daher gibt es auch keine Kreuzreaktion zu Wasserstoffperoxid
oder HMTD. Doch auch wenn die drei Triperoxide die „idealen“ Kreuzreaktanden
darstellen, wobei nur Tributanontriperoxid maßgeblich zu Kreuzreaktionen führte,
so sind diese Substanzen doch im Normalfall kaum zu erwarten. Falls doch, so
ist des Weiteren davon auszugehen, dass auch sie wahrscheinlich explosiv sind
und eine Detektion somit aus sicherheitsrelevanter Sicht kein Fehlalarm wäre.
Für die hergestellten polyklonalen TATP-Antikörper, selbst die aus der Maus,
konnten keinen beachtenswerten Kreuzreaktanden identifiziert werden. Sie sind
also extrem selektiv. Dies zeigt, dass polyklonale Antikörper durchaus eine sehr
hohe Spezifität gegenüber einem Analyten erreichen können. Insbesondere
durch kombiniert wirkende Antikörper in sogenannten Sandwich-Assays kann
diese Spezifität manchmal sogar besser sein als die von vergleichbaren mono-
klonalen Antikörpern [47]. Im Fall des sehr kleinen Analyten TATP ist jedoch an-
zunehmen, dass dieser Vorteil hier nicht zum Tragen kommt, weil es den Anti-
körpern nur ein Epitop - sich selbst als Ganzes oder als Teil seiner trimeren
Struktur - als Bindungsregion anbietet. Die spezifische Erkennung nur eines
Epitops ist eigentlich ein Vorteil monoklonaler Antikörper, die aus diesem Grund
im Allgemeinen als selektiver gelten, weil so auch Kreuzreaktionen minimiert
werden. Die besondere Struktur des TATP und ihre Einzigartigkeit begünstigt
also die Selektivität der Antikörper. So ergab ein dreidimensionaler Strukturver-
gleich mit den Strukturdaten für TATP aus der CCDC-Datenbank (HMHOCN01
[46]) mittels Superimposé 1.1 [44, 45] keine Übereinstimmungen mit bekannten
Verbindungen (vor allem Pharmaka).
110 Ergebnisse und Diskussion
Lösungsmitteltoleranz
Schon während der Bestimmung der Kreuzreaktivität wurde der Einfluss von Lö-
sungsmitteln auf den TATP-ELISA wahrgenommen. So zeigt Abbildung 4.14 bei-
spielhaft die Kurven dreier auf ihre Kreuzreaktion im ELISA hin untersuchter Stof-
fe im Vergleich zu einer TATP-Kurve.
Abbildung 4.14: Bestimmung der Kreuzreaktivität im ELISA mit Kaninchen-2-Boost-7-Serum
(Auswahl).
Zur besseren Veranschaulichung wurden Kurven von unterschiedlichen Mikroti-
terplatten ausgewählt und auf eine maximale Extinktion (Parameter A) von eins
normiert. Zu den Berechnungen der Kreuzreaktivitäten (Tabelle 4.8 und Tabelle
4.9) wurde jedoch immer eine TATP-Kurve auf derselben Mikrotiterplatte als Be-
zug verwendet (Abschnitt 3.3.5). HMTD, RDX und [18]Krone-6 wiesen keine oder
nur sehr schwache Kreuzreaktivitäten auf. Um diese Kreuzreaktivität durch das
Verhältnis der Wendepunktekonzentrationen einer TATP-Kalibrierkurve zu der
Kurve einer jeweiligen Testsubstanz ermitteln zu können ([242], Gleichung 7),
musste bei letzterer der Parameter D der 4-Parameteranpassung (Gleichung 4)
auf das Niveau der TATP-Kurve gesetzt werden, damit ein sigmoidaler Kurven-
verlauf erhalten wurde. Die resultierenden Graphen sahen alle ähnlich aus: Nach
einem geradlinigen Verlauf fielen die Extinktionen bei einer Konzentration von
1 × 105 µg L-1 (100 mg L-1) ab, wie für [18]Krone-6 (grüne Kurve) zu sehen. An-
scheinend führt eine hohe Konzentration, unabhängig von der Art des Stoffes zu
einer unspezifischen, schwachen Hemmung im ELISA. Ebenso wie [18]Krone-6
verhielten sich die meisten untersuchten Substanzen, deren erste Kalibrierlö-
sungsverdünnung nur reines Wasser oder einen niedrigen Lösungsmittelgehalt,
z. B. 1% Methanol (Tabelle 3.5) aufwies. Bei HMTD (orange Kurve), RDX (violet-
te Kurve) und TNT, bei denen sich wegen ihrer schlechten Löslichkeit nicht nur
mehr Lösungsmittel sondern vor allem DMSO in der ersten Verdünnung befand,
ist ein Abfallen der Extinktion bereits bei Konzentrationen von ca. 1 × 104 µg L-1
3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 1E4 1E5
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
[18]Krone-6
RDX
HMTD
TATPExktinktion ( =
450 n
m)
(norm
iert
)
[µg L-1]
0
Ergebnisse und Diskussion 111
festzustellen. Während dies auf die Kreuzreaktivitätsuntersuchungen im ELISA
mit Kaninchenseren keine Auswirkungen hatte, wurde das Ergebnis des direkten
ELISA mit Maus-3-Serum davon beeinflusst und zeigte eine schwache Kreuzre-
aktivität an. Der indirekte Mausserum-ELISA zeichnete sich dabei hingegen er-
neut als robuster aus und wies keine Kreuzreaktivität auf.
Beobachtungen wie in Abbildung 4.14 gaben Anlass zu genaueren Untersu-
chungen der Toleranz der ELISA gegenüber ausgewählten Lösungsmitteln. Ähn-
lich der Kreuzreaktivitätstests wurden ELISA mit Serum der Kaninchen (Boost 7)
und Maus 3 (Boost 8) angefertigt und die Ergebnisse in Tabelle 4.10 aus den
erhaltenen Kurven ermittelt (Abschätzung). Auffällig ist, dass die Lösungsmittelto-
leranz der ELISA mit Kaninchenseren nicht besonders groß ist und dass die
ELISA mit Mausserum sowie der indirekte ELISA im Allgemeinen widerstandsfä-
higer erscheinen. Vor allem Aceton und DMSO störten bereits ab Konzentratio-
nen von > 0.1% bzw. > 0.3% und führten schon im unteren einstelligen, prozen-
tualen Konzentrationsbereich zu einem Signalverlust (Parameter A, Gleichung 4)
von 50% („IC50“) gegenüber reinem Wasser. Dass gerade das stets als biokom-
patibel angepriesene DMSO so unverträglich ist, verwundert. Es bestätigt aber
die Erkenntnisse aus (u. a.) Abbildung 4.14. Die höchste Verträglichkeit wiesen
ELISA mit Kaninchenserum gegenüber Methanol und Glycerol auf. Hier verur-
sachten Lösungsmittelkonzentrationen von 3-4% keine Verringerung auf die ma-
ximale Extinktion. Ethylenglykol scheint auf den ersten Blick zwar eine ähnliche
Wirkung auf den ELISA zu haben, führte aber zu unerklärlichen, starken
Schwankungen der Messwerte.
Tabelle 4.10: Toleranz des TATP-ELISA gegenüber Lösungsmitteln und Wasserstoffperoxid.
Lösungsmittel ELISA-Format
% Lösungsmittelkonzentra-tion ohne Signalverlust
% Lösungsmittelkonzentra-tion 50% Signalverlust
K1 K2 M3 K1 K2 M3
Aceton direkt 0.07 0.1 4 0.7 1 17
indirekt 0.4 0.1 1 8 13 8
Methanol direkt 3 3 2 13 13 19
indirekt 15 5 100* 100* 100* 100*
Wasserstoff-peroxid
direkt 0.001 0.001 1 0.06 0.05 4
indirekt 0.03 0.01 100* 7 2 100*
DMSO direkt 0.3 0.2 — 3 2 —
Glycerol direkt 4 3 — 17 13 —
Ethylenglykol▲ direkt 4 0.5 — 14 7 —
Die (zum Teil extrapolierten) Werte wurden den erhaltenen Kurven (4-Parametergleichungen) entnommen, bei denen der Parameter D auf das Niveau der TATP-Kurve gesetzt wurde. * bei 100% Lösungsmittel ist der Wert noch nicht erreicht; ▲
verursacht starkes Schwanken der Messwerte
In Tabelle 4.10 sind auch die Lösungsmittelkonzentrationen angegeben, bei de-
nen ein Signalverlust von 50% gegenüber reinem Wasser erreicht wurde. Es liegt
letztlich am Experimentator, wie viel Signaleinbuße oder mehr Reagenzienein-
112 Ergebnisse und Diskussion
satz akzeptabel sind. Für Methanol zeigte sich dabei, dass im indirekten ELISA
mit Kaninchenserum bei 100% Methanol die maximale Extinktion noch nicht ein-
mal um die Hälfte abfiel und schon 5-15% Methanol ohne erkennbaren Signalver-
lust gegenüber reinem Wasser tolerabel sind. Da Methanol als verträglichstes
Lösungsmittel im ELISA mit allen Seren deutlich hervortrat und auch eines der
gebräuchlichsten ist, wurden mit Kaninchenserum weiterführende Untersuchun-
gen dazu angestellt. Wie schon zum Präzisionsprofil angemerkt, wurden TATP-
Kalibrierlösungen mit 2, 5 und 10% (v/v) Methanol in Wasser angesetzt. Damit
wurden ELISA-Kurven im direkten ELISA mit den Seren beider Kaninchen aufge-
nommen, weil dies das bevorzugte Format ist. Im Vergleich zu methanolfreien
TATP-Kalibrierkurven sind in Tabelle 4.11 die Werte für die maximale Extinktion
und den Testmittelpunkt (Parameter A und C aus Gleichung 4) angegeben. Mit
steigender Methanolkonzentration in den TATP-Kalibrierlösungen nahmen zwar
die Signalintensität und die Testempfindlichkeit (IC50-Zunahme) ab, aber je nach
Messanwendung wären die Kurven durchaus brauchbar. Mit 10% Methanol in
den Lösungen war der ELISA gut fünfmal unempfindlicher, was für die Spuren-
analytik problematisch werden könnte. Zwar konnte durch die Methanolzugabe
nicht erreicht werden, dass die Werte der niedrig konzentrierteren TATP-
Lösungen (siehe Abbildung 4.12 und Abbildung 4.13 zum Präzisionsprofil) stabi-
lisiert und weniger anfällig für Schwankungen werden, aber sie würde u. a. die
Anreicherung oder Probenahme (z. B. Abwischen von eventuell kontaminierten
Oberflächen) von TATP in Methanol ermöglichen, wenn der Empfindlichkeitsver-
lust vertretbar ist.
Tabelle 4.11: Einfluss von Methanol in TATP-Kalibrierlösungen auf den TATP-ELISA.
% (v/v) Methanol in TATP-Kalibrier-lösungen
Kaninchen 1 Kaninchen 2
Parameter A IC50
[µg L-1] Parameter A
IC50
[µg L-1]
0 0.001 ± 0.041 0.55 ± 0.24 0.001 ± 0.040 0.61 ± 0.20
2 0.947 ± 0.027 1.3 ± 0.3 0.980 ± 0.028 1.1 ± 0.2
5 0.892 ± 0.034 1.6 ± 0.6 0.901 ± 0.017 1.5 ± 0.2
10 0.629 ± 0.024 3.2 ± 1.2 0.634 ± 0.018 3.2 ± 0.8
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve ohne Methanol auf eins ge-setzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.
Parallel zu den Untersuchungen der Toleranz der ELISA gegenüber Lösungsmit-
teln wurde auch der Einfluss von Wasserstoffperoxid auf den Assay betrachtet
(Tabelle 4.10). Wasserstoffperoxid ist für den TATP-ELISA in zweifacher Hinsicht
von Bedeutung. Es ist nicht nur als Substrat für die Enzymreaktion der HRP uner-
lässlich, sondern auch als Ausgangsstoff der TATP-Synthese sowie als dessen
Zerfallsprodukt stets als potenzielle Verunreinigung gegenwärtig. Durch letzteres
können daher auch höhere Konzentrationen in Proben vorkommen, deren Aus-
wirkung auf die TATP-ELISA geprüft wurde. Im direkten ELISA mit Kaninchense-
rum wurde eine Abnahme der maximalen Extinktion im Vergleich zu reinem
Wasser ab Konzentrationen von 0.001% Wasserstoffperoxid (~ 0.1 × 105 µg L-1,
~ 0.3 mmol L-1) beobachtet. Bei 0.05% Wasserstoffperoxid (~ 5 × 105 µg L-1,
Ergebnisse und Diskussion 113
~ 15 mmol L-1) betrug der Signalverlust bereits 50%. Dieser Wert stimmt mit den
Angaben in Tabelle 4.9 überein, denn auch wenn die Kreuzreaktivität des Was-
serstoffperoxids im ELISA unter 0.01% blieb, so wurde doch auch hierbei ein
Wert von IC50 ~ 5 × 105 µg L-1 (ca. 0.05% H2O2) ermittelt und entsprechend bei
kleineren Konzentrationen ab ~ 0.1 × 105 µg L-1 schon die Abnahme der Extinkti-
on beobachtet. Die Inaktivierung der HRP durch ihr eigenes Substrat ist schon
länger [319] bekannt, wobei die angegebenen Wasserstoffperoxid-
Konzentrationen, ab denen ein Aktivitätsverlust eintrat, von 0.001 mmol L-1 (ab
1 mmol L-1 irreversibel) [320] bis 0.4 mmol L-1 [321] variieren. Die mehrfach im
direkten ELISA beobachtete Extinktionsabnahme ab einer Wasserstoffperoxid-
Konzentration von ~ 0.3 mmol L-1 (0.001%) liegt im oberen Bereich der Werte
aus der Literatur und könnte demnach auf inhibitorische Effekte des Wasserstoff-
peroxids auf die HRP zurückzuführen sein. Der indirekte TATP-ELISA reagierte
zwar deutlich unempfindlicher auf Wasserstoffperoxid und vertrug 10- bis 30-fach
höhere Konzentrationen als der direkte Assay, aber auch er war im Vergleich zu
den untersuchten Lösungsmitteln am wenigsten tolerant gegenüber Wasserstoff-
peroxid. Da im indirekten Format das Wasserstoffperoxid (als Analyt) nicht in
direkten Kontakt mit der HRP kommt, könnte seine Wirkung als starkes Oxidati-
onsmittel eine Rolle spielen. Proteine können durch Oxidation ihre Struktur (z. B.
durch Methioninoxidation) und damit einhergehend auch ihre Funktion verlieren,
was auch das Erkennungs- und Bindungsvermögen der Antikörper negativ beein-
flussen kann. Bemerkenswert ist daher die dennoch höhere Resistenz des ELISA
mit Mausserum gegenüber Wasserstoffperoxid im Vergleich zum Kaninchense-
rum, aber auch hier ist diese schlechter als gegenüber den getesteten Lösungs-
mitteln.
Wasserstoffperoxid übt also einen ernstzunehmenden Einfluss auf den TATP-
ELISA aus, wobei die ausgeprägten Unterschiede zwischen direktem und indirek-
tem Format primär durch die negative Einwirkung auf das Enzym und nicht auf
die TATP-Antikörper zurückzuführen sind. Im direkten ELISA werden Analyt oder
Proben, wie Wasserstoffperoxid, gemeinsam mit dem HRP-Konjugat inkubiert,
während bei der indirekten Assay-Variante ein Waschschritt dazwischen liegt.
Dazu wurden auch Versuche mit Lösungsmitteln durchgeführt. Diese wurden
nach dem Inkubationsschritt mit Kaninchenserum im direkten ELISA eine Stunde
in der Mikrotiterplatte belassen. Anschließend folgten ein Waschschritt und erst
danach die Zugabe des HRP-Konjugats. Obwohl das direkte Waschen vor dem
Auftragen des HRP-Konjugats bei realen Analysen wegen der ausbleibenden,
notwendigen Konkurrenzreaktion zwischen Analyt (im Lösungsmittel) und HRP-
Konjugat nicht praktikabel ist, wurde dabei erst bei einer Methanol- oder Aceton-
konzentration von 50% ein deutlicher Signalverlust gegenüber reinem Wasser
festgestellt. Das zeigt erneut, dass weniger die Antikörper von den Lösungsmit-
teln beeinträchtigt werden als vielmehr die Aktivität des empfindlicheren Enzyms
geschwächt wird. Auch mit DMSO und Wasserstoffperoxid konnte dieser Effekt
beobachtet werden. Zwar war der Signalverlust stärker bzw. trat bei geringeren
Konzentrationen auf, aber dennoch liegt die Toleranzschwelle (zweistelliger pro-
zentualer Bereich) weit über der des indirekten ELISA ohne zwischengeschalte-
tem Waschschritt (Tabelle 4.10). Tatsächlich sind also die TATP-Antikörper we-
114 Ergebnisse und Diskussion
niger anfällig als vermutet, so dass in HRP- oder allgemein enzymunabhängigen,
auf Antikörpern basierenden Nachweissystemen mit höherem Lösungsmittelge-
halt gearbeitet werden könnte. Da ein Verdampfen von Lösungsmitteln aus
TATP-Lösungen auf Grund dessen Flüchtigkeit quasi unmöglich ist, könnte das
für TATP-Analysen durchaus ein entscheidender Faktor sein.
Alle durchgeführten Messungen wurden mit Reinstwasser angefertigt. Der Ein-
fluss der Lösungsmittel sowie die unspezifischen, wenn auch schwachen Hem-
mungen im ELISA bei hohen Konzentrationen (unabhängig von der Art des Stof-
fes), werfen Fragen bezüglich der Leistungsstärke des TATP-ELISA unter Real-
bedingungen auf. Tests dazu, ob die Kreuzreaktionen in Probenmischungen oder
Realproben auch so gering ausfallen, stehen noch aus. Die Seren beider Kanin-
chen reagierten sowohl bei der Untersuchung der Kreuzreaktivität als auch der
Toleranz gegenüber Lösungsmitteln und Wasserstoffperoxid, wie schon beim
Immunisierungsverlauf und der Nachweisgrenze, erneut gleich. Obwohl die
Nachweisgrenzen dieser polyklonalen TATP-Antikörper 5 000-mal besser als die
Nachweisgrenzen mit Mausserum sind, erscheinen die Antikörper aus der Maus
widerstandsfähiger gegenüber Lösungsmitteln und Wasserstoffperoxid. Diese
Eigenschaften würden sie bei ausreichend zur Verfügung stehender Menge ideal
für affinitätschromatographische Anwendungen machen, da die geringere Affini-
tät reversible Bindungen und die Resistenz gegenüber Lösungsmitteln ausrei-
chend stringente Elutionsbedingungen begünstigen. Die TATP-Antikörper aus
den Kaninchen eignen sich hingegen ausgezeichnet für spurenanalytische Me-
thoden, z. B. für die Applikation in Biosensoren.
4.7 BSA-Zusatz und andere Optimierungen
Verwendung von BSA
Die Optimierung der TATP-ELISA beschränkte sich vor allem auf die verwende-
ten Proteine wie BSA als Pufferzusatz oder die Auswahl der in Abschnitt 3.3.3
synthetisierten TATP-Proteinkonjugate. Als Puffer für die Proteinlösungen diente
stets PBS, der verbreitetste und wahrscheinlich meist verwandte Puffer bei bio-
chemischen Methoden. Schon in vorangegangenen Abschnitten, wie in Abschnitt
4.4 bei der Verfolgung der Immunisierungsverläufe durch Optimierung der Se-
rum- und HRP-Konjugat-1-Verdünnungen oder bei der Betrachtung des Einflus-
ses von Lösungsmitteln in Abschnitt 4.6, standen die Parameter A und C der
4-Parameteranpassung (Gleichung 4) im Mittelpunkt. Auch nachfolgend wurden
diese zur Bewertung der Signalintensität (maximale Extinktion) und der Test-
empfindlichkeit anhand des Testmittelpunkts herangezogen. Dazu wurden fast
ausschließlich direkte ELISA mit Kaninchenserum durchgeführt.
Zunächst wurde der Einfluss von BSA in Verdünnungen des HRP-Konjugat 1
auf den ELISA untersucht. Da die HRP-Konjugate üblicherweise in Guardian ge-
lagert (und 1:100 vorverdünnt) wurden und dieser HRP-Stabilisator sehr wahr-
Ergebnisse und Diskussion 115
scheinlich auch BSA oder andere Proteine enthält, wurde die Guardian-freie
Rückstellprobe verwendet (Abschnitt 3.3.3), um auch die Auswirkung komplett
ohne zusätzliche Proteine zu sehen. Tabelle 4.12 zeigt für die Seren beider Ka-
ninchen (Boost 7) ähnliche Resultate und macht deutlich, dass schon ein gerin-
ger Proteinanteil aus dem Guardian in PBS (ein Tausendstel aus der 1:100-
Vorverdünnung; HRP-Konjugat-1-Endkonzentration: 1:100 000) zu einer signifi-
kanten Signalerhöhung (Parameter A) führt. Mit 0.1% (w/v) BSA in den HRP-
Konjugat-1-Verdünnungen wurden die höchsten Signalintensitäten erreicht, wo-
bei sie ohne die Lagerung und Vorverdünnung des Konjugats in Guardian noch
etwas höher lagen. Ein Grund dafür kann nicht angegeben werden. Da aber der
größte Teil der hergestellten HRP-Konjugate in Guardian gelagert wurde und der
Unterschied nicht sehr groß ist, wurde dennoch weiterhin damit gearbeitet. Es ist
jedoch fraglich, wie sinnvoll der Einsatz von Guardian ist, dessen Zusammenset-
zung nicht bekannt ist. Offensichtlich scheint die Stabilität der sowohl mit als
auch ohne Guardian aufbewahrten HRP-Konjugate seit über zwei Jahren ge-
währleistet. Ein Effekt auf den Testmittelpunkt (IC50) konnte hier nicht festgestellt
werden.
Tabelle 4.12: Einfluss von BSA und Guardian-Stabilisator in HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf
den TATP-ELISA.
Lagerung des HRP-Konjugat 1
HRP-Konjugat-1-Verdünnung in
Parameter A IC50
[µg L-1]
Kaninchen 1
ohne Guardian PBS 0.563 ± 0.009 0.47 ± 0.07
Guardian PBS 0.758 ± 0.003 0.53 ± 0.02
ohne Guardian 0.1% BSA/PBS 1.178 ± 0.029 0.58 ± 0.13
Guardian 0.1% BSA/PBS 0.001 ± 0.012 0.55 ± 0.06
Kaninchen 2
ohne Guardian PBS 0.629 ± 0.019 0.43 ± 0.11
Guardian PBS 0.707 ± 0.015 0.48 ± 0.08
ohne Guardian 0.1% BSA/PBS 1.057 ± 0.021 0.36 ± 0.06
Guardian 0.1% BSA/PBS 0.001 ± 0.034 0.41 ± 0.11
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit in 0.1% BSA/PBS verdünntem und ohne Guardian gelagertem HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.
Da eine BSA-Zugabe den TATP-ELISA bezüglich der Signalhöhe erheblich ver-
besserte, sollte nun auch geprüft werden, welchen Einfluss die Menge des zu der
HRP-Konjugat-1-Verdünnung (mit Guardian aus Lagerung und 1:100-
Vorverdünnung) zugegebenen BSA hat. Anhand von Tests mit Kaninchen 2,
Boost-7-Serum konnte mit zunehmender BSA-Konzentration in den HRP-
Konjugat-1-Verdünnungen ein Anstieg der Signalintensität gemessen werden.
Außerdem zeigt Tabelle 4.13 eine leichte Verbesserung des IC50, was in den
obigen Ergebnissen aus Tabelle 4.12 nicht beobachtet werden konnte.
116 Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4.13: Einfluss der BSA-Menge in HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf den TATP-ELISA.
% BSA/PBS zur HRP-Konjugat-1-Verdünnung
Parameter A IC50
[µg L-1]
0 0.634 ± 0.012 0.81 ± 0.12
0.001 0.793 ± 0.016 0.78 ± 0.12
0.01 0.881 ± 0.021 0.70 ± 0.13
0.1 0.001 ± 0.026 0.56 ± 0.10
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit in 0.1% BSA/PBS verdünntem HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die ande-ren Werte entsprechend angepasst wurden.
Kaum anders verhält es sich mit BSA in den Serumverdünnungen, präsentiert für
Boost-7-Serum von Kaninchen 1 in Tabelle 4.14. Während der IC50 wenig darauf
reagierte, konnte die Signalintensität durch nur 0.005% (w/v) BSA in der Serum-
verdünnung nahezu verdoppelt werden. Der Einfluss des BSA in der Serumver-
dünnung ist so beträchtlich, dass der Effekt des BSA in der HRP-Konjugat-1-
Verdünnung nicht hervortritt. In den vorangegangenen Versuchen enthielten die
Serumverdünnungen bereits 0.005% (w/v) BSA.
Aus unbekannten Gründen führte BSA in den Verdünnungen, sowohl in denen
für die Seren als auch für das HRP-Konjugat 1, zu einer beachtlichen Zunahme
der Signalintensität und damit Verbesserung des TATP-ELISA. Auch wenn der
Einfluss auf die Testempfindlichkeit, wenn überhaupt vorhanden, eher marginal
ist, so lohnt sich der Einsatz von BSA dennoch. Es ermöglicht, dass die wertvol-
len Seren stärker verdünnt werden können, u. a. auch, weil es die Antikörper vor
dem Aggregieren schützt [322], was auch aus wirtschaftlichen Gründen günstig
ist.
Tabelle 4.14: Einfluss von BSA in Serum- und HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf den TATP-
ELISA.
Serum-Verdünnung in
HRP-Konjugat-1-Verdünnung in
Parameter A IC50
[µg L-1]
PBS PBS 0.579 ± 0.008 0.56 ± 0.07
PBS 0.1% BSA/PBS 0.551 ± 0.011 0.57 ± 0.11
0.005% BSA/PBS PBS 1.049 ± 0.017 0.48 ± 0.07
0.005% BSA/PBS 0.1% BSA/PBS 0.001 ± 0.020 0.44 ± 0.08
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit in 0.005% BSA/PBS verdünntem Serum und in 0.1% BSA/PBS verdünntem HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.
Es zeigte sich, dass BSA sich stabilisierend auf den TATP-ELISA insgesamt
auswirkte. Für den Assay mit Mausserum sowie im indirekten Format mit Seren
beider Spezies wurden ebenfalls dieselben Verbesserungen beim Einsatz von
BSA in den Verdünnungen von Serum und HRP-Konjugat 1 bzw. -IgG-HRP
festgestellt. Generell ist es nicht selbstverständlich, dass BSA sich positiv auf
einen Assay auswirkt, wie u. a. bei Baermann [306] zum Ochratoxin-A-ELISA zu
lesen. Dort wurde festgestellt, dass BSA in den HRP-Verdünnungen den Kompe-
Ergebnisse und Diskussion 117
titionsschritt empfindlich stört, da BSA zwei hochaffine Bindungsstellen für
Ochratoxin A besitzt. Aufgrund der Untersuchungsergebnisse kann hier davon
ausgegangen werden, dass TATP nicht signifikant von BSA gebunden wird.
Dennoch wurde auf eine weitere Erhöhung des BSA-Gehalts über die ausgewie-
senen BSA-Anteile in Lösungen hinaus verzichtet, denn wegen der starken
Schaumbildung schon bei geringen BSA-Gehalten wird das Pipettieren der Lö-
sungen schwer kontrollierbar. Bei einem Füllvolumen von 200 µL für die Serum-
verdünnungen waren nicht über 0.005% (w/v) BSA handhabbar. Aufgrund des
kleineren Pipettiervolumens von 50 µL für die HRP-Konjugat-1-Verdünnungen
konnten trotz der Schaumbildung 0.1% (w/v) BSA eingesetzt werden, ohne nega-
tive Folgen für den TATP-ELISA durch Pipettierfehler zu provozieren.
HRP-Konjugate
Ähnlich den Versuchen zur Kreuzreaktivität und Lösungsmitteltoleranz wurden
auch die ungekoppelten Proteine HRP und OVA auf etwaige Beeinflussung des
ELISA untersucht (Abschnitt 3.3.5). Die Ergebnisse (n = 4) der Tests mit Kanin-
chen-1-Serum (Boost 11) sind in Abbildung 4.15 grafisch dargestellt, wobei die
Kurven von TATP und OVA schon vor der Normierung auf eins auf demselben
Niveau verliefen und nur die von HRP diesbezüglich angepasst wurde, weil hier
bereits nach 3 min (statt nach 20 min) die Entwicklungsreaktion gestoppt werden
musste.
Abbildung 4.15: Einfluss von HRP und OVA auf den ELISA.
Für die Verdünnungsreihe mit OVA anstelle mit TATP konnte dabei kaum ein
Effekt beobachtet werden. Erst bei 1 000 000 µg L-1 fiel die ansonsten horizontal
verlaufende Extinktion im Vergleich zu reinem Wasser bzw. dem Wert des Para-
meter A einer TATP-Kurve (in der Abbildung 4.15 stark gestaucht) leicht ab. HRP
verursachte hingegen ab 1 000 µg L-1 eine starke Signalerhöhung mit einer dem
3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 1E4
0
2
4
6
8
10
HRP
OVA
TATP
Extinktion ( =
450 n
m)
(norm
iert
)
[µg L-1]
0
118 Ergebnisse und Diskussion
TATP gegenläufigen, sigmoidalen Kurve, begünstigt durch seine eigentliche
Funktion als Signal-verstärkendes Element des Assays. Da dieser Anstieg erst
bei höheren HRP-Konzentrationen auftrat, kann davon ausgegangen werden,
dass HRP nicht direkt an die Mikrotiterplattenoberfläche bindet, die ohnehin
durch die Beschichtung mit -Kaninchen-IgG und der Inkubation der Serumver-
dünnung mit BSA-Anteil blockiert sein sollte. Vielmehr wird HRP mit den bereits
an der Platte gebundenen Proteinen unspezifisch interagiert haben. Negative
Auswirkungen auf den TATP-ELISA sind dennoch nicht zu erwarten, wenn die
maximale HRP-Konzentration von 1 000 µg L-1 bei der Verwendung der HRP-
Konjugate unterschritten bleibt. Selbst bei den Tests mit Mausserum, bei denen
das HRP-Konjugat 1 lediglich 1:10 000 verdünnt werden konnte, wurde mit
210 µg L-1 nur ein Fünftel dieser Konzentration benötigt. Bei TATP-ELISA mit
Kaninchenseren (Boost 11: 1:300 000, Boost 7: 1:100 000) wurden nur
7-21 µg L-1 HRP-Konjugat 1 benötigt, was bis zu 150-mal unterhalb der maxima-
len HRP-Konzentration liegt. Zwar wurde nur der direkte ELISA untersucht, aber
es ist zu vermuten, dass es sich im indirekten ähnlich verhält, da auch hier HRP
als Markierung von -IgG zur Detektion eingesetzt wurde und eine Überlagerung
des Signals von unspezifisch gebundenen HRP kritisch wäre.
Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit fünf HRP-Konjugate für den
TATP-ELISA hergestellt (Abschnitt 3.3.3). Bis auf HRP-Konjugat 5, welches mit-
tels der Methode der gemischten Anhydride [168] entstand, wurden alle Konjuga-
te über die Aktivierung des Haptens als NHS-Ester [165, 166] synthetisiert
(Tabelle 3.1). Schon in den per MALDI-TOF-MS bestimmten Kopplungsdichten
des TATP-Haptens an HRP (Tabelle 4.1) spiegelten sich nicht die in den Reakti-
onen eingesetzten Verhältnisse (Tabelle 3.2) wieder und sie ließen vor allem
auch keine Aussage über die tatsächliche Qualität eines Konjugats für den
ELISA zu (Abschnitt 4.3). Daher wurden alle HRP-Konjugate, auch HRP-
Konjugat 4, welches im ELISA mit Mausserum versagte, entsprechend ihrer er-
mittelten Konzentration (Tabelle 4.1) auf das Niveau von 1:200 000 verdünntem
HRP-Konjugat 1 (10.5 µg L-1) gebracht und im ELISA mit Kaninchen-1-Serum
(Boost 11) verglichen. Tabelle 4.15 zeigt die Ergebnisse des HRP-Konjugat-
Vergleichs anhand des Parameter A und des IC50 (Gleichung 4). Wie auch erste
einfache Tests mit Mausserum ergaben, wurden mit dem deshalb später aus-
schließlich verwendeten HRP-Konjugat 1 die besten Ergebnisse erzielt, sowohl
was die Signalhöhe als auch die Empfindlichkeit des Immunoassays betraf. HRP-
Konjugat 2 war nur wenig schlechter bezüglich der Signalintensität und wurde
außerdem aus demselben NHS-Ester-Reaktionsansatz angefertigt. Obwohl diese
beiden Konjugate nur jeweils ein Hapten pro HRP aufwiesen, war ihre Leistungs-
fähigkeit im ELISA besser als die des HRP-Konjugat 3 mit zwei TATP-Haptenen
je HRP. Die geringste Extinktion erreichte HRP-Konjugat 4, was auch erklärt,
warum es im schlechter funktionierenden ELISA mit Mausserum gar kein Signal
hervorbrachte. Daher wurde es auch nicht mittels MALDI-TOF-MS vermessen.
Trotz einer zu HRP-Konjugat 2 identischen Signalhöhe schnitt HRP-Konjugat 5
hinsichtlich der Testempfindlichkeit am schlechtesten ab. Aufgrund der für Prote-
ine drastischen Reaktionsbedingungen mit einem etwa 2.5-fachen Überschuss
an DMF gegenüber Wasser während der Synthese wäre auch ein Einbruch der
Ergebnisse und Diskussion 119
Signalintensität durch einen (Teil-)Verlust der Enzymaktivität oder wegen der
geringen Kopplungsdichte (< 1) nicht auszuschließen gewesen.
Tabelle 4.15: Vergleich der hergestellten HRP-Konjugate im TATP-ELISA.
TATP-Proteinkonjugat Protein:TATP-Hapten
(Kopplungsdichte) Parameter A
IC50
[µg L-1]
HRP-Konjugat 1 < 1:1 0.001 ± 0.017 0.47 ± 0.06
HRP-Konjugat 2 < 1:1 0.886 ± 0.019 0.36 ± 0.06
HRP-Konjugat 3 < 2:1 0.557 ± 0.008 0.81 ± 0.10
HRP-Konjugat 4 < — 0.287 ± 0.004 0.96 ± 0.10
HRP-Konjugat 5 < 1:1 0.882 ± 0.012 01.1 ± 0.10
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.
Prinzipiell ließen sich mit allen fünf HRP-Konjugaten ELISA mit Kaninchenserum
durchführen, wenn auch die Konjugate 3-5 nur etwa halb so empfindliche ELISA
ermöglichten wie die Konjugate 1 und 2. Insbesondere HRP-Konjugat 4 schnitt
bei dieser Untersuchung schlecht ab und es soll noch einmal betont werden,
dass das Verarbeiten der aktivierten NHS-Ester möglichst kurzfristig nach ihrer
Herstellung erfolgen sollte und nicht erst Tage später. Obwohl die HRP-
Konjugate 1 und 2 mit einem Hapten/HRP-Kopplungsverhältnis von 1:1 am effizi-
entesten im TATP-ELISA arbeiteten, lässt sich aus den wenigen Daten hier keine
generelle Schlussfolgerung ziehen, zumal die Kopplungsdichten allesamt mit
< 1-2 recht niedrig waren. Des Weiteren wäre zusätzlich auch eine vergleichende
Betrachtung der Enzymaktivitäten der HRP-Konjugate zur umfassenden Beurtei-
lung dienlich, auf die hier verzichtet wurde.
Auch die drei OVA-Konjugate (Abschnitte 3.3.3. und 4.3) können kurz anhand
der Erfahrungen, die während des praktischen Arbeitens gewonnen wurden, ver-
glichen werden. Genauer untersucht wurden sie jedoch nicht, da der indirekte
ELISA in dieser Arbeit nur eine untergeordnete Rolle spielte. Zwischen OVA-
Konjugat 1 und 2 konnte dabei kein Unterschied in der Signalintensität oder Test-
empfindlichkeit festgestellt werden, wobei OVA-Konjugat 2 sehr selten benutzt
wurde. OVA-Konjugat 3 unterscheidet sich durch die mehr als doppelt so hohe
Proteinkonzentration sowie der Kopplungsdichte erheblich von OVA-Konjugat 1.
Durch verschieden starke Verdünnungen wurden im ELISA Konzentrationen von
ca. 1.2 mg L-1 des zweifach mit Hapten gekoppelten OVA-Konjugat 1 und etwa
0.3 mg L-1 des vierfach gekoppelten OVA-Konjugat 3 eingesetzt, so dass unter
Berücksichtigung der unterschiedlichen Kopplungsdichten scheinbar fast ein
Ausgleich zu Stande kam und auch keine Veränderungen des IC50 bei der Ver-
wendung der OVA-Konjugate bemerkt werden konnten.
Haltbarkeit der Arbeitslösungen
Bereits oben im Abschnitt zur Verwendung von BSA wurde erwähnt, dass die
synthetisierten HRP-Konjugate bei 4 °C mindestens zwei Jahre stabil bleiben,
unabhängig davon, ob sie in Guardian–Stabilisator oder ohne aufbewahrt wur-
120 Ergebnisse und Diskussion
den. Wegen der hohen Endverdünnungen wurden zusätzlich 1:100-
Vorverdünnungen in Guardian notwendig (Abschnitt 3.3.5), die anfangs wöchent-
lich erneuert wurden. Diese HRP-Konjugat-1-Vorverdünnungen erwiesen sich
ebenfalls als haltbar und zeigten über einen Untersuchungszeitraum von
4.5 Monaten nicht die geringsten Veränderungen beim Einsatz im ELISA mit Ka-
ninchen-2-Serum (Boost 11), weder in Bezug auf die Signalintensität noch den
Testmittelpunkt (Daten nicht gezeigt).
Auch mit Kaninchenseren, die an sich wie die meisten konzentrierten Antikör-
perlösungen lange (mit Natriumazid) stabil sind, wurden Versuche mit Vorver-
dünnungen von Boost-5-Serum von Kaninchen 1 und 1:30 000 verdünntem HRP-
Konjugat 1 unternommen. Die 1:1 000-Serumvorverdünnungen wurden in 0.1%
BSA/PBS, PBS, Reinstwasser und Pferdeserum angefertigt und an den jeweili-
gen Versuchstagen weiter auf eine 1:40 000-Endverdünnung in PBS gebracht.
ELISA mit in 0.1% BSA/PBS vorverdünntem Serum ergaben die höchsten Werte
für Parameter A und die (tendenziell) niedrigsten IC50. Wie oben beschrieben
wirkt sich BSA sehr günstig auf den ELISA-Verlauf aus, so dass die Immunoas-
says mit Serumvorverdünnungen in PBS und Reinstwasser, die sich nahezu
identisch verhielten, geringfügig schlechtere Ergebnisse als die mit BSA ergaben.
Der Einsatz von Pferdeserum, einer trüben, undefinierten Lösung, führte zu einer
Verringerung des Wertes von Parameter A um ca. 40%, dafür blieb der IC50 fast
unverändert im Vergleich zu in 0.1% BSA/PBS vorverdünntem Serum. Trotz die-
ser Auswirkungen der zu Serumvorverdünnungen verwendeten Medien auf den
ELISA traten über einen Zeitraum von drei Monaten weder Empfindlichkeits-
noch Signalverluste bei der Gegenüberstellung mit dem Ergebnis des ersten Ta-
ges des jeweils benutzten Vorverdünnungsmediums auf. Obwohl diese Ergeb-
nisse vielversprechend waren, wurde jedoch nie eine Vorverdünnung für die Se-
ren angewendet. Zum einen wechselten die Seren zunächst von Boost zu Boost,
zum anderen waren die benötigten Mengen für eine komplette ELISA-Platte groß
genug, um nicht zwangsläufig vorverdünnen zu müssen. Für andere Anwendun-
gen, routinemäßige oder solche mit kleineren Mengen, kann die Möglichkeit einer
Vorverdünnung oder Lagerung der Seren in diversen Medien jedoch durchaus
interessant werden. Im nächsten Abschnitt über die Plattenbeschichtung
und -konservierung wird auf diesen Versuch unter einem anderen Aspekt
(Abbildung 4.16) nochmals eingegangen.
Eine dritte Gruppe von Lösungen, deren Langzeitstabilität für den TATP-ELISA
von Bedeutung ist, stellen die Stamm- und Kalibrierlösungen von TATP dar. Bei
methanolischen Stammlösungen konnten selbst nach mehr als 1.5 Jahren und
bei wässrigen Kalibrierlösungen nach über sieben Monaten kein Unterschied zu
frisch hergestellten TATP-Lösungen im ELISA, egal ob mit Maus- oder Kanin-
chenserum, entdeckt werden. Die aufgenommenen Kurven verliefen so parallel,
dass sie vollständig übereinander lagen und fast nicht unterscheidbar waren (oh-
ne Abbildung). Die Stabilität von TATP-Lösungen wird auch von Pachman und
Matyas [323] per HPLC bestätigt, wenn die Lösungen mit umkristallisiertem
TATP angefertigt und dunkel gelagert wurden. Entscheidend ist, dass die Be-
fürchtungen aus Abschnitt 4.1 nicht eingetroffen sind. Obwohl dort eindeutig be-
Ergebnisse und Diskussion 121
wiesen werden konnte, dass TATP aus dem Gasraum über wässrigen TATP-
Lösungen per GC-MS nachweisbar ist und somit aus den Lösungen entweicht,
scheint das keine merklichen Folgen für die Konzentrationen der TATP-Lösung
und den ELISA zu haben. Plausible Gründe dafür gibt es einige: Zunächst wur-
den die TATP-Lösungen weitestgehend bei 4 °C gehalten, was den Dampfdruck
erheblich senkt (schon bei 12 °C auf etwa ein Siebentel des Wertes von 25 °C
[79]). Außerdem war der Gasraum über den Stamm- und Kalibrierlösungen er-
heblich kleiner (im ungünstigsten Fall ~ 75%, eher ~ 50%) als in den Gaspha-
senexperimenten (98%), so dass auch weniger TATP entweichen konnte. Insbe-
sondere wurden meist sehr viel kleinere Konzentrationen für die wässrigen Kalib-
rierlösungen verwendet als für die GC-MS-Untersuchungen nötig waren. Schon
über der 0.5 mg L-1 TATP-Lösung konnte in der Gasphase kein TATP mehr
nachgewiesen werden.
Alle Reagenzien, die speziell für den TATP-ELISA (und eventuelle andere Im-
munoassayformate) notwendig sind, also die TATP-HRP-Konjugate, die polyklo-
nalen TATP-Antikörper sowie die TATP-Lösungen, sind auch in Verdünnungen
über viele Monate bis Jahre halt- und verwendbar. Insbesondere für eine etwaige
kommerzielle Nutzung ist dies ein maßgebliches Kriterium bei der Vermarktung
eines Assays, wobei Untersuchungen zur Stabilität der Komponenten bei Raum-
temperatur dabei auch interessant wären. Tests dazu stehen noch aus, sind aber
bei Immunoassays auch nicht gebräuchlich, da Proteine, vor allem in Lösung,
generell kalt gelagert werden.
Plattenbeschichtung und -konservierung
Viele Festphasenimmunoassays bedienen sich einer Beschichtung mit polyklona-
len, Spezies-spezifischen -IgG (sekundären Antikörpern). Diese ermöglichen
wiederum aus einer Vielzahl von Proteinen in einem Serum oder anderen Pro-
teingemischen nur den Antikörpern (IgG) die Bindung an den mit -IgG beschich-
teten Oberflächen. Dadurch können mehr der gewünschten, durch die Immuni-
sierung gebildeten Antikörper binden. Abbildung 4.16 präsentiert ELISA-Kurven,
die ohne die erste Beschichtung der Platte mit -Kaninchen-IgG und stattdessen
nur mit Kaninchen-1-Serum (Boost 5) aus den (14 Tage alten) Vorverdünnungen
des vorangegangen Abschnitts erzeugt wurden. Ausgehend von diesen 1:1 000-
Vorverdünnungen wurden durch eine 1:40-Verdünnung in PBS die 1:40 000-
Endverdünnungen der Seren erreicht, so dass beim Aufgeben in die Platte zwei
der Serumverdünnungen noch 0.0025% BSA (25 mg L-1) bzw. 2.5% Pferdeserum
enthielten. Mit diesen brachen die Kurven des normalerweise gut funktionieren-
den TATP-ELISA ein, da die sonst durch die -Kaninchen-IgG vorgenommene
Antikörper-Selektion ausblieb und so alle Proteine an die Platte binden konnten.
Die Proteine (BSA oder andere Serumproteine) lagen außerdem im Verhältnis zu
den Antikörpern in hohem Überschuss vor, dass letztere fast vollständig von die-
sen bei der Bindung an der Mikrotiterplattenoberfläche „verdrängt“ wurden und
somit die Extinktionen sehr klein blieben. Die IC50 waren aber noch bestimmbar
und kaum verändert gegenüber den Kurven mit Sekundärantikörper-
122 Ergebnisse und Diskussion
Beschichtung und tendenziell auch immer noch etwas besser als die Kurven, die
aus Serumvorverdünnungen in PBS oder Reinstwasser entstanden.
Abbildung 4.16: TATP-ELISA mit Kaninchenserum ohne -Kaninchen-IgG-Beschichtung und mit
Serumvorverdünnungen in unterschiedlichen Medien.
Auch die Kurven mit Serumvorverdünnungen in Reinstwasser und PBS wiesen
ohne vorherige Beschichtung der Platten mit -Kaninchen-IgG kaum einen Un-
terschied der Testempfindlichkeit im Vergleich zu Messungen mit beschichteten
Platten auf. Jedoch nahm auch hier die Signalintensität merklich, allerdings bei
weitem nicht so drastisch, ab. Die durchgeführten Versuche reichen nicht aus,
um die Beobachtungen zu quantifizieren, aber mit einer Verdopplung der Zeit für
die Substratentwicklung konnten fast die Signalhöhen der Versuche mit Sekun-
därantikörper-Beschichtung erreicht werden. Damit konnte gezeigt werden, dass
die Beschichtung der Mikrotiterplatten mit -Kaninchen-IgG für den ELISA mit
polyklonalen TATP-Antikörpern aus Kaninchen nicht erforderlich ist, wenn auf
eine Zugabe von Proteinen zu den Serumverdünnungen verzichtet wird. Für den
optimalen Verlauf des TATP-ELISA ist jedoch eine -IgG-Beschichtung zur se-
lektiven Bindung von Kaninchen-Antikörpern zu empfehlen, da die Zugabe von
BSA zu besseren Resultaten führt, wie oben bereits ausführlich erläutert wurde.
Bereits in Abschnitt 4.5 wurde auf die Unterschiede der sekundären Antikörper
eingegangen. Üblicherweise wurden -IgG [H&L] verwendet, doch mit Maus-3-
Serum (Boost 5) wurde zum Vergleich auch -Maus-IgG F(c) getestet. Trotz der
etwas geringeren Konzentration des -Maus-IgG F(c) (2.05 mg mL-1) war Para-
meter A bei Beschichtung der Platte mit diesem Antikörper um 22% (n = 3 × 2
Kurven) höher als mit dem -Maus-IgG [H&L] (2.2 mg mL-1) bei gleichbleibender
Verdünnung von 1:2 000. Die Testmittelpunkte wichen dagegen nicht signifikant
voneinander ab. Die Tatsache, dass die [H&L]-Antikörper weniger spezifisch
sind, könnte dazu geführt haben, dass beispielsweise auch mehr Antikörperfrag-
mente an sie binden konnten und so weniger Bindungsstellen für intakte
0.0003 0.01 0.1 1 10 100 1000 1E4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
PBS
Wasser
0.1% BSA/PBS
Pferdeserum
Extinktion ( =
450 n
m)
TATP [µg L-1]
0
Ergebnisse und Diskussion 123
(TATP-)Antikörper zur Verfügung standen. Diese intakten Antikörper werden
durch den -Maus-IgG F(c), der häufig beim Arbeiten mit monoklonalen Antikör-
pern verwendet wird und spezifisch einen Teil der konstanten Domänen der bei-
den schweren Polypeptidketten der Maus-IgG erkennt, bevorzugt gebunden.
Dennoch wurde weiterhin mit [H&L]-Antikörpern gearbeitet, auch um die Ver-
gleichbarkeit mit vorangegangenen Versuchen aufrecht zu erhalten, zumal ein
Signalverlust vertretbar ist, solange die Testempfindlichkeit nicht betroffen ist.
Außerdem stellte sich der -Maus-IgG [H&L] bei den Faeces-Untersuchungen
(Abschnitt 4.5) als vorteilhaft heraus, weil er verschiedene Immunglobulinklassen
erfasst; eine Eigenschaft, die auch zu Beginn einer Immunisierung nützlich ist,
wenn zunächst Hapten-spezifische IgM gebildet werden.
Eine andere Vorgehensweise bei der Beschichtung einer ELISA-Platte, vor al-
lem im Hinblick auf einen kommerziellen Einsatz, ist die Plattenkonservierung,
die in Abschnitt 3.3.5 beschrieben wurde. Nach der üblichen Inkubation des Se-
rums von Kaninchen 1 (Boost 11) in bereits mit -Kaninchen-IgG beschichteten
Mikrotiterplatten wurde durch das Einwirken einer Konservierungslösung und
dem anschließenden Trocknen die Lagerung der Platten über einen längeren
Zeitraum bei 4 °C möglich. Nach 8 bzw. 24 Tagen wurden die konservierten Plat-
ten mit einer wie üblich frisch angesetzten Platte verglichen (n = 6-12). Aus Ta-
belle 4.16 geht hervor, dass die konservierten Platten nur knapp 30% des Wertes
von Parameter A einer frischen Platte erreichten und über viermal weniger emp-
findlich waren. Die Dauer der Lagerung hatte dabei, zumindest in dem recht kur-
zen Untersuchungszeitraum, keinen Einfluss auf die Ergebnisse.
Tabelle 4.16: Vergleich von frischer und konservierter Plattenbeschichtung für den TATP-ELISA.
frisch konserviert % (konserviert/frisch)
Parameter A
Tag 8 1 ± 0.038 0.282 ± 0.003 28
Tag 24 1 ± 0.017 0.290 ± 0.002 29
IC50
[µg L-1]
Tag 8 0.47 ± 0.14 2.0 ± 0.2 430
Tag 24 0.40 ± 0.05 1.9 ± 0.1 470
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve einer frisch angefer-tigten Platte auf eins gesetzt und der andere Wert entsprechend angepasst wurde.
Die Abnahme der Signalintensität ließe sich wahrscheinlich leicht durch eine Er-
höhung der Serum- oder HRP-Konjugat-1-Konzentration ausgleichen. Durch Op-
timierung des ursprünglich für monoklonale Antikörper entwickelten Konservie-
rungsprotokolls könnte ebenfalls versucht werden, die Einbuße an Empfindlich-
keit zu verringern. Doch selbst wenn die Qualitätsverluste durch die Konservie-
rung der Platten, wie in dieser kleinen Machbarkeitsstudie, unvermeidbar blieben,
könnte sich die Methode durchsetzen. Beim TATP-ELISA werden alle Platten
eines Kaninchenserums desselben Boosts bis zu dessen Inkubation gleich be-
handelt, so dass viele Platten gleichzeitig vorbereitet werden können, was
124 Ergebnisse und Diskussion
schließlich nicht nur am Versuchstag durch den direkten Beginn mit dem Kompe-
titionsschritt Zeit spart, sondern auch die Reproduzierbarkeit der Tests erhöhen
könnte und die Möglichkeit des einfachen Versands eröffnet. Selbstverständlich
sollten dazu die konservierten Platten mindestens über sechs Monate, besser
noch ein Jahr, stabil bleiben. Dann könnte dieses Prinzip der Immobilisierung und
Konservierung der TATP-Antikörper auf andere (Kunststoff-)Oberflächen, z. B.
Sensoroberflächen oder Membranen, übertragen werden.
Sonstige Optimierungsansätze
Tween 20
Neben den verschiedenen Proteinen (in Puffern) und den Kalibrierlösungen spielt
abgesehen von den Puffersalzen noch das Detergens Tween 20 bei der Durch-
führung des TATP-ELISA eine Rolle. Es war mit 0.05% (v/v) ein Bestandteil des
Waschpuffers, wird aber auch als Benetzungsmittel oder Bestandteil bei Proben-
aufarbeitungen auch in späteren Anwendungen und Formaten verwendet. Ana-
log zu den Versuchen mit Methanol (Abschnitt 4.6, Tabelle 4.11) wurden den
TATP-Kalibrierlösungen verschiedene Mengen Tween 20 zugegeben und im
ELISA mit den Kaninchenseren (Boost 7) eingesetzt. In Tabelle 4.17 ist der Ein-
fluss des Tween 20 auf den TATP-ELISA wieder anhand der Parameter A und
der IC50 aus der 4-Parameter-Anpassung (Gleichung 4) dargestellt. Die Auswir-
kungen waren deutlich: Schon 0.005% (v/v) führten zu einem Einbruch der Sig-
nalhöhe um bis zu 50% und die Testempfindlichkeit nahm um mehr als die Hälfte
ab. Dies entsprach nur einem Zehntel der Tween-20-Konzentration im Waschpuf-
fer, der zwar aus den Kavitäten entfernt wurde, aber dennoch blieben stets Reste
davon an der Oberfläche zurück. Ein Verzicht auf Tween 20 beim Waschen war
nicht möglich, da nicht nur die Signalintensität dabei einbrach, sondern vor allem
die Messwerte kaum auswertbar waren, weil sie um bis zu 40% streuten (normal
maximal um ~ 5%). Tween 20 ist offensichtlich notwendig, um die Ober-/Grenz-
flächenspannung für den Waschprozess in den Kavitäten herabzusetzten und
anschließend auch die Antikörper und HRP-Konjugate an der Oberflächen der
Mikrotiterplatte vor Austrocknung zu schützen.
Insbesondere die bereits erwähnten Schwankungen der Messwerte im Bereich
der sehr gering konzentrierten Kalibrierlösungen veranlassten diese Untersu-
chungen. Da TATP unpolar ist, wurden auch Interaktionen mit Kunststoffoberflä-
chen wie dem Polystyrol der Mikrotiterplatten vermutet, welche aber nicht nach-
gewiesen werden konnten. Mit der Mizellenbildung des Tween 20 (CMC =
8.04 × 10-5 M ≈ 0.01% (w/v) bei 21 °C [324]) unter Einschluss von TATP scheint
mit diesen Untersuchungsergebnissen hingegen ein plausibler Grund gefunden.
Eine Beeinträchtigung der Antikörper kann nahezu ausgeschlossen werden, da
alle ELISA im gleichen Labor mit demselben Waschprogramm behandelt werden
und viele andere immunchemische Methoden ebenfalls mit Tween 20 arbeiten.
Das manuelle Nachspülen der Kavitäten mit PBS nach dem Waschschritt direkt
vor dem Kompetitionsschritt, um den Kontakt von TATP mit Tween 20 zu verhin-
dern oder zumindest zu minimieren, rief jedoch keine Verbesserung gegenüber
Ergebnisse und Diskussion 125
dem normalen Waschvorgang mit 0.05% (v/v) Tween 20 am Waschautomaten
hervor.
Tabelle 4.17: Einfluss von Tween 20 in TATP-Kalibrierlösungen auf den TATP-ELISA.
% (v/v) Tween 20 in TATP-Kalibrier-lösungen
Kaninchen 1 Kaninchen 2
Parameter A IC50
[µg L-1] Parameter A
IC50
[µg L-1]
0 0.001 ± 0.036 0.63 ± 0.21 0.001 ± 0.033 0.54 ± 0.14
0.005 0.360 ± 0.005 02.1 ± 0.29 0.545 ± 0.003 ml1.2 ± 0.043
0.01 0.280 ± 0.007 02.7 ± 0.74 0.443 ± 0.010 01.5 ± 0.27
0.05 0.130 ± 0.003 5.6 ± 2.0 0.204 ± 0.004 02.5 ± 0.44
0.1 0.127 ± 0.003 .6.7 ± 2.3 0.199 ± 0.001 05.2 ± 0.22
0.2 0.100 ± 0.002 .7.7 ± 2.1 0.159 ± 0.003 06.6 ± 1.60
0.5 0.072 ± 0.002 135 ± 4.3 0.135 ± 0.003 07.8 ± 1.90
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve ohne Tween 20 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.
Temperaturabhängigkeit des Kompetitionsschritts
Da die Kompetition zwischen TATP und dem HRP-Konjugat 1 den sensibelsten
Teil des TATP-ELISA darstellt und TATP zudem auch noch in Abhängigkeit von
der Temperatur flüchtig ist (siehe auch oben: Haltbarkeit der Arbeitslösungen
sowie Abschnitt 4.1), lag eine Überprüfung des Einflusses der Temperatur auf
diesen Schritt nahe. Alle vier Parameter der sigmoidalen TATP-Kalibrierkurve
(Gleichung 4) eines wie üblich bei Raumtemperatur durchgeführten ELISA mit
Kaninchen-1-Serum (Boost 11) wurden in Tabelle 4.18 mit den Parametern eines
ELISA verglichen, der sich lediglich durch die Inkubationstemperatur von 4 °C
während des 30-minütigen Kompetitionsschritts unterschied. Aus den Daten von
zwei Versuchstagen (jeweils n = 12) geht hervor, dass Parameter D (Untergrund)
und Parameter B (Steigung der Kurve im Wendepunkt) sich nicht signifikant ver-
änderten. Der IC50 erreichte bei 4 °C zwar nur ~ 75% des Wertes bei Raumtem-
peratur, aber diese Empfindlichkeitsverbesserung war nur an einem der Ver-
suchstage signifikant, so dass der Einfluss der Temperatur, wenn überhaupt, nur
sehr gering ausfiel. Anders hingegen verhält sich die Signalintensität (Parame-
ter A), die bei niedrigerer Temperatur um ca. 50% verringert war. Dabei ist jedoch
davon auszugehen, dass hier kein direkter Einfluss auf den TATP-ELISA vorlag,
sondern ganz allgemein die Geschwindigkeit der Bindung des Analyten sowie
des HRP-Konjugats an die Antikörper durch die Temperaturdifferenz von über
15 K herabgesetzt war. Ebenso könnte der Temperaturunterschied auf die Um-
setzung des Substrats TMB durch das Enzym HRP nachgewirkt haben. Dieser
Entwicklungsschritt wurde zwar bei Raumtemperatur durchgeführt, jedoch wird
es eine Weile gedauert haben, ehe sich die Mikrotiterplatte von 4 °C auf Raum-
temperatur anpasste, weswegen die Reaktionsgeschwindigkeit zunächst ver-
langsamt war. Hier greift näherungsweise die einfache Reaktionsgeschwindig-
keit-Temperatur-Regel [325].
126 Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4.18: Einfluss der Inkubationstemperatur des Kompetitionsschritts auf den TATP-ELISA.
Messung RT 4 °C % (4 °C/RT) RT 4 °C
Parameter A Parameter D
1 1 ± 0.007 0.547 ± 0.015 55 0.012 ± 0.007 0.019 ± 0.012
2 1 ± 0.034 0.385 ± 0.015 39 0.038 ± 0.047 0.038 ± 0.019
IC50
[µg L-1] Parameter B
1 0.39 ± 0.02 0.29 ± 0.06 74 0.612 ± 0.021 0.707 ± 0.094
2 0.41 ± 0.11 0.32 ± 0.10 76 0.633 ± 0.108 0.636 ± 0.125
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve einer frisch angefertigten Platte auf eins gesetzt und der andere Wert entsprechend angepasst wurde.
Die Durchführung eines ELISA, auch nur teilweise, bei 4 °C ist umständlich zu
bewerkstelligen. So ist es auch aus praktikabler Sicht sehr positiv zu werten,
dass keine große Anhängigkeit des Kompetitionsschritts im TATP-ELISA von der
Temperatur festgestellt werden konnte. Entscheidend dabei ist vor allem die Er-
kenntnis, dass TATP offensichtlich nicht in ausschlaggebendem Umfang bei
Raumtemperatur aus den wässrigen Kalibrierlösungen in den Kavitäten ent-
weicht, wie nach den GC-MS-Untersuchungen (Abschnitt 4.1) zu vermuten war,
sonst hätte aufgrund des Dampfdruckunterschieds zu 4 °C ein erheblicher Emp-
findlichkeitsverlust des ELISA beobachtet werden können. Gleiches war bereits
oben bei den Untersuchungen zur Haltbarkeit der Arbeitslösungen diskutiert wor-
den.
4.8 Konformeren-ELISA
In Abschnitt 4.1 wurde ausführlich von den beiden Konformeren des TATP und
den vorgenommenen Untersuchungen durch die Trennung von D3- und C2-TATP
per HPLC (Abschnitt 3.3.1) berichtet. Das Chromatogramm dieser Trennung ließ
sich per ELISA mit Kaninchen 1 Serum (Boost 11) nachbilden, indem die in re-
gelmäßigen Abständen (0.05 min) gesammelten Fraktionen anhand einer TATP-
Kalibriergeraden ausgewertet wurden, wie in Abbildung 4.17 für den Bereich der
Retentionszeiten etwa zwischen Minute 2 und 3.6 präsentiert. Diese direkte Ge-
genüberstellung zeigt, dass mit dem Konformeren-ELISA das große Signal des
D3-TATP-Konformers in den Fraktionen, die etwa bei 2.5 min gesammelt wurden,
sowie das kleinere Signal des C2-TATP-Konformers in den Fraktionen, die etwa
bei 3.0 min aufgefangen wurden, hervorragend mit dem Elutionsprofil des HPLC-
Chromatogramms übereinstimmen.
Es gibt jedoch auch Diskrepanzen zwischen den beiden Methoden. So wurden
von den 10 µg TATP, die aus einer methanolischen Lösung in die HPLC injiziert
wurden, in den neun dem D3-TATP zugeordneten Fraktionen (2.31-2.71 min)
11.7 µg und in den sechs C2-TATP-Fraktionen (2.86-3.11 min) 0.3 µg TATP im
ELISA ermittelt. Die Abweichungen der Werte können vielfältige Gründe haben.
Ergebnisse und Diskussion 127
Ein Faktor könnte die Größe der Fraktionen sein, die durchschnittlich 18.5 µL
betrug. Die genauen Volumina jeder einzelnen Fraktion, mit denen auch gerech-
net wurde, betrugen zwischen 17.16 und 19.50 µL und wurden vom HPLC-
Programm ausgegeben. Die Richtigkeit dieser Angaben wurde jedoch nicht
überprüft. Nicht auszuschließen ist außerdem der Einfluss des Restlösungsmit-
tels (überwiegend Acetonitril) in den verdünnten Fraktionen. Ein Entfernen der
Lösungsmittel durch Eindampfen der Fraktionen ist aufgrund der Flüchtigkeit von
TATP nicht möglich, so dass durch eine 1:55-Verdünnung (18.5 µL + 1 000 µL
Wasser), gefolgt von einer zweiten 1:10-Verdünnung, der Lösungsmittelgehalt
auf knapp 0.2% reduziert werden musste. Der erste Verdünnungsschritt reichte
außerdem nicht aus, um Werte innerhalb des Kalibrierbereichs zu erhalten und
auszuwerten. Zwar wurde in Abschnitt 4.6 nicht explizit die Lösungsmitteltoleranz
des TATP-ELISA gegenüber Acetonitril untersucht, jedoch zeigt die Tabelle 4.10,
dass einige Lösungsmittel sich auch schon bei geringen Konzentrationen von
unter 1% negativ auf den TATP-ELISA auswirken können.
Abbildung 4.17: TATP-Konformeren-ELISA im direkten Vergleich zum HPLC-Chromatogramm.
Ein weitaus interessanterer Unterschied zwischen den Ergebnissen von HPLC
und ELISA ist das abweichende Verhältnis der beiden Konformere zueinander.
Im HPLC-Chromatogramm betrug das D3/C2-Verhältnis 22:1, wobei wieder ange-
nommen wurde, dass beide Konformere ein gleiches oder zumindest ähnliches
UV-Absorptionsverhalten bei 225 nm aufweisen. Damit liegt dieses etwas höher
als das üblicherweise in Methanol beobachtete 15:1-Verhältnis (Abschnitt 4.1).
Aus den Ergebnissen des Konformeren-ELISA wurde ein Verhältnis zwischen
D3- und C2-TATP von 39:1 ermittelt. Es zeigt sich also, dass das C2-Konformer
von den polyklonalen TATP-Antikörpern deutlich schlechter erkannt wird als das
D3-TATP. Die unterschiedlichen Konformeren-Verhältnisse deuten auf eine
Kreuzreaktivität der Antikörper gegenüber C2-TATP von etwa 50% hin. Dabei ist
davon auszugehen, dass die tatsächliche Kreuzreaktivität nochmals mindestens
2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50
0
20
40
60
80
0
100
200
300
400 HPLC-Chromatogramm
Rela
tive A
bsorp
tion
( =
225 n
m)
C2-TATP
[min]
D3-TATP
TA
TP
[µ
g L
-1]
cTATP
via ELISA
128 Ergebnisse und Diskussion
um die Hälfte darunter liegt, vielleicht sogar gegen Null geht, da trotz des ver-
kürzten ELISA-Ablaufs bereits eine volle Halbwertszeit für die gegenseitige Um-
wandlung der beiden Konformere (33 min) von der Fraktionierung bis zum Ende
des Kompetitionsschritts verstrichen und somit schon mindestens die Hälfte des
C2-TATP in D3-TATP übergegangen war.
Obwohl aufgrund der Erkenntnisse in Abschnitt 4.2 in Spuren auch C2-TATP-
Hapten und damit auch ein entsprechendes Immunogen vorlag, scheinen sich
die daher theoretisch in dem polyklonalen Serum vorhandenen C2-TATP-
Antikörper nicht durchgesetzt zu haben bzw. liegen in einer zu geringen
Konzentration gegenüber den D3-TATP-Antikörpern vor, um einen
ausgleichenden Einfluss auf diese Messung auszuüben. Nach mehreren
Halbwertszeiten hätte hingegen bald zu identischen Verhältnissen zwischen den
beiden Signalen im Chromatogramm und den per ELISA ermittelten Mengen an
TATP in den entsprechenden Fraktionen geführt, da dann den polyklonalen
Antikörpern das D3-TATP in allen Fraktionen gleichermaßen zur Verfügung steht.
Durch die kaum reversible Antigen-Antikörper-Bindung wird sich außerdem das
Gleichgewicht zwischen den Konformeren verschieben und sich zu Gunsten des
D3-TATP in Lösung immer wieder neu einstellen müssen.
Das Ziel des Konformeren-ELISA war es, die beiden TATP-Konformere nach
der chromatographischen Trennung unabhängig voneinander untersuchen zu
können. Dabei konnte ein Unterschied in der Antikörpererkennung zwischen dem
D3- und C2-TATP registriert werden. Auch wenn bereits etwa die Hälfte des
C2-TATP in den Fraktionen des kleineren Signals zu D3-TATP umgewandelt war,
konnte dennoch das Prinzip der unabhängigen Untersuchung von Konformeren
eines Analyten im ELISA unter Zuhilfenahme einer HPLC-Trennung präsentiert
werden, wenngleich sich dafür Substanzen mit längeren Halbwertszeiten für ge-
genseitige Umwandlung der Konformere besser eignen würden als TATP.
4.9 Lateral Flow Assay (LFA)
Zum Abschluss dieser Arbeit sollen erste Experimente für eine weitere Anwen-
dung der hergestellten TATP-Antikörper vorgestellt werden. In Abschnitt 3.3.6
wurden der allgemeine Aufbau und verschiedene Maßnahmen zur Entwicklung
eines LFA (lateral flow assay, immunchromatographischer Schnelltest) für TATP
ausführlich geschildert. Schon in kurzer Zeit konnten erste Resultate erzielt wer-
den, wenn auch kein zuverlässiger TATP-LFA entstand. Nachstehende Informa-
tionen sind daher eher als prinzipieller Ansatz der Realisierbarkeit eines LFA für
TATP zu verstehen.
Das Zusammensetzen von Proben- und Konjugatauftragsvlies, diagnostischer
Membran und Absorptionsvlies (Abbildung 3.6) ließ sich mit einfachsten Mitteln
bewerkstelligen. Dabei sollten die Materialien verschiedener Hersteller nicht
kombiniert und nur gemäß ihrer vorgegebenen Bestimmung eingesetzt werden
Ergebnisse und Diskussion 129
(z. B. nicht das Absorptionsvlies zum Probenauftrag verwenden), da sonst
schlecht oder nicht funktionierende LFA die Folge waren. Obwohl Whatman und
Millipore angaben, dass die unter Abschnitt 3.1.4 aufgeführten LFA-Materialien
direkt einsetzbar sind, wurde versucht, Proben- und Konjugatauftragsvliese mit
verschiedenen Zusammensetzungen einer Saccharose-, BSA- und Tween-20-
haltiger Pufferlösung (Abschnitt 3.1.3, aus [287, 288]) vorzubehandeln. Dies er-
wies sich nicht als vorteilhaft. Statt das Laufverhalten zu verbessern und zu stabi-
lisieren, kam es dadurch auf der Membran zu unregelmäßigen Lauffronten und
Trocknungseffekten, die die zum Teil sehr schwach vom kolloidalen Gold gefärb-
ten Linien überlagerten und schwer erkennbar machten. Das Blocken nach dem
Auftragen der TATP-OVA-Konjugat-3- und -Kaninchen-IgG-Linie (Test- und
Kontrolllinie) der noch freien Bindungsstellen auf der Membran mit Blockpuffer,
wie bei anderen Verfahren häufig notwendig, wirkte sich hingegen nicht nachtei-
lig auf das Endergebnis des LFA aus, jedoch verlangsamte sich die Geschwin-
digkeit der Lauffront merklich.
Probenauftragsvlies
Rapid27 (Whatman) (400 × vergrößert)
diagnostische Membran Immunopore RP (Whatman)
(3 000 × vergrößert)
Absorptionsvlies CF6 (Whatman)
(600 × vergrößert)
unb
en
utz
t
ben
utz
t
Abbildung 4.18: ESEM-Aufnahmen vor und nach Anwendung der LFA-Komponenten.
Während das Proben- und Konjugatauftragsvlies nach einer Befeuchtung mit
anschließender Lufttrocknung zusammengefallen war, konnte eine Veränderung
der Struktur einer bereits benutzen (oder vorbehandelten) Membran makrosko-
pisch nicht festgestellt werden. Deshalb wurden ESEM-Aufnahmen (Abbildung
4.18, Tonkurve zur Kontrastverbesserung automatisch angepasst) der drei LFA-
Komponenten vor (unbenutzt) und nach (benutzt) einem Testdurchlauf angefer-
tigt, wobei das Absorptionsvlies eine untergeordnete Rolle spielte und nur der
Vollständigkeit halber mit betrachtet wurde. Abgebildet ist nur eine Auswahl des
Materials von Whatman, aber Materialien gleichen Verwendungszweckes, auch
130 Ergebnisse und Diskussion
denen von Millipore, waren strukturell jeweils sehr ähnlich aufgebaut und verhiel-
ten sich ebenso, auch in der praktischen Anwendung. Die Porengrößen werden
für die Immunopore-RP-Nitrozellulosemembran mit 8 µm und für das Rapid27-
Proben- und Konjugatauftragsvlies mit 22 µm von Whatman [286] angegeben.
Zum Vergleich: Eine klassische Immunblot-Nitrozellulosemembran (zum Wes-
tern Blot) hat nur 0.45 µm große Poren und zeigte selbst bei 10 000 × Vergröße-
rung keine erkennbare Struktur. Mikroskopisch ist zwischen unbenutztem und
benutztem Proben- und Konjugatauftragsvlies sowie Absorptionsvlies kaum eine
Veränderung zu sehen, wohingegen die Poren der diagnostischen Membran
nach Benutzung geweitet erscheinen. Da die Benutzung bzw. Befeuchtung der
LFA-Materialien sichtbare oder im Laufverhalten wahrnehmbare Veränderungen
hervorriefen und die Vorbehandlung eher zur Verschlechterung des Assays als
zu seiner Verbesserung beitrug, wurde bei nachfolgenden Versuchen darauf ver-
zichtet. Dadurch wird außerdem bei der Durchführung, insbesondere der Vorbe-
reitung der Teststreifen, nicht nur Zeit, sondern auch Verbrauchsmaterial für Puf-
fer gespart.
Problematischer war das Auftragen der TATP-OVA-Konjugat-3- und -Kanin-
chen-IgG-Linien. Beide Proteinlösungen mussten mindestens eine Konzentration
von 0.5 mg mL-1 aufweisen, um im Verlauf des Tests zumindest ein schwach
sichtbares Signal durch die Bindung der Gold-konjugierten Antikörper hervorzu-
bringen. Daher wurden sie unverdünnt mit 6.3 mg mL-1 (OVA-Konjugat 3) bzw.
2.23 mg mL-1 (-Kaninchen-IgG) auf die Membran aufgebracht. Es wurden ver-
schiedene Methoden getestet, doch weder mit einer Glaskapillare (zerstört Ober-
fläche der Membran), noch mit einem Pinsel (dem bei Berührung mit der Memb-
ran sofort sämtliche Flüssigkeit ausgesogen wird) oder durch Aufträufeln mit ei-
ner Pipette konnten gleichmäßige Linien mit den Proteinlösungen gezogen wer-
den. Am geeignetsten erwies sich das Auftragen mit der Pipette, insbesondere
weil es ohne direkten Kontakt und damit einhergehender Verletzung der Mem-
branoberfläche auskam. Außerdem was es am besten zu dosieren und deshalb
(mit Einschränkungen) am reproduzierbarsten. Die unregelmäßigen Linien, die
nach dem Durchlauf des Assays sichtbar wurden, geben zum Teil sogar das
Tropfenmuster wieder. Als Beispiele solcher abgeschlossener TATP-LFA ist in
Abbildung 4.19 je ein Streifen aus Whatman- und einer aus Millipore-
Komponenten dargestellt. Die weinrote Färbung durch das kolloidale Gold muss-
te für den Druck durch eine automatische Bildanpassung, einen Weißabgleich
sowie eine Veränderung des Kontrasts um -50% hervorgehoben werden.
Nach dem Trocknen hafteten TATP-OVA-Konjugat 3 und -Kaninchen-IgG ir-
reversibel an der diagnostischen Membran, woraufhin der eigentliche Test begin-
nen konnte. Gold-konjugierte -Kaninchen-IgG wurden mit Kaninchen-1-Serum
(Boost 11) vorinkubiert, um indirekt über den sich bildenden Komplex den sicht-
baren Nachweis für die Bindung der Antikörper aus Kaninchen an den beiden
Testlinien zu ermöglichen. Vor dem Probenauftrag wurde der Lösung bei Kompe-
titionsversuchen noch TATP und für ein besseres Laufverhalten Tween 20 zuge-
setzt. Aufgrund des Aufbaus auf Klebeband war es nicht möglich, die Teststreifen
direkt in die Probenlösung zu tauchen, bis sich das Proben- und Konjugatauf-
Ergebnisse und Diskussion 131
tragsvlies vollgesogen hatte. Stattdessen wurden die Proben und anschließend
etwas PBS vorsichtig im Waagerechten auf das Proben- und Konjugatauf-
tragsvlies pipettiert, wobei darauf geachtet werden musste, dass der Flüssigkeits-
film nicht über die Membran läuft, sondern durch die Kapillarkräfte von selbst
wandert. Nach 5-10 min erreichte die Lauffront das Absorptionsvlies und auf der
Membran waren die beiden Proteinlinien angefärbt.
A
Probenauftrag diagnostische Membran Absorption
Whatman Rapid 27 Immunopore RP CF6
0.5 cm
TATP-OVA-Konjugat -Kaninchen-IgG
B
Millipore Hi-FlowG041 HF120 Hi-Flow C083
0.5 cm
TATP-OVA-Konjugat -Kaninchen-IgG
Abbildung 4.19: LFA für TATP mit Komponenten von Whatman (A) und Millipore (B).
Das Eintrocknen der Probenlösung (ohne den Analyten) auf dem Proben- und
Konjugatauftragsvlies, wie es bei solchen Test üblich ist, ging mit einem Verlust
der Farbintensität der Testlinien einher, ließ aber die Lagerung der Membranen
bei Raumtemperatur zu. Zum Ausgleich könnten die Probelösungen jedoch kon-
zentrierter eingesetzt werden, da beispielsweise – deutlich sichtbar durch die zart
rote Färbung des Proben- und Konjugatauftragsvlies – viele Antikörper dort zu-
rück blieben. Ähnliches wurde auch mit dem vorgefertigten, Gold-konjugierten
Protein-A-getränkten Vlies (Protein A Tell-Tale Gold ribbon) beobachtet, das ei-
nen Teil seiner Färbung nach dem Testdurchlauf behielt. Das Protein A trat an
die Stelle des Gold-markierten -Kaninchen-IgG und sollte ganz ähnlich wie die-
ses die Antikörper aus Kaninchen binden, jedoch blieb hier die Färbung der
TATP-OVA-Konjugat-3-Linie auf der Membran aus. Es ist nicht auszuschließen,
dass die Komplexbildung zwischen dem Gold-konjugierten Protein A und den
Antikörpern aus dem Serum mehr Zeit gebraucht hätte, wie von Klewitz [287] für
den Komplex aus einem monoklonalen Botulinum-Neurotoxin-Antikörper, Gold-
konjugiertem -IgG und Botulinum-Neurotoxin beschrieben. Die Färbung der
-Kaninchen-IgG-Linie kann unspezifisch durch die direkte Bindung des Gold-
konjugierten Protein A an den sekundären Antikörper erfolgt sein.
Das Testsystem des LFA ist ähnlich dem indirekten TATP-ELISA aufgebaut,
wobei das -Kaninchen-IgG zusätzlich als Kontrolle diente, an der nicht nur
TATP-Antikörper sondern sämtliche Antikörper aus dem Kaninchenserum bin-
den. Als Negativkontrolle wurde zum einen nur Gold-konjugiertes -Kaninchen-
IgG ohne Kaninchenserum aufgetragen, welches keine Färbung der Proteinlinien
auf der Membran auslöste und bis in das Absorptionsvlies gelangte. Dieses er-
hielt dadurch eine schwache Rotfärbung. Als zweite Negativkontrolle wurden
polyklonale TNT-Antikörper aus Kaninchen [289] statt der TATP-Antikörper ver-
wendet, mit denen die Färbung der TATP-OVA-Konjugat-3-Linie ausblieb, aber
132 Ergebnisse und Diskussion
die Linie mit -Kaninchen-IgG sichtbar wurde. Obwohl weder die Gold-markierten
IgG noch andere Antikörper als solche gegen TATP oder weitere Bestandteile
der Kaninchenseren unspezifische Bindungen auf der Membran verursachten,
konnte bislang selbst mit 50 mg L-1 TATP in dem Antikörper-Konjugationsmix der
Probenlösung keine Kompetition beobachtet werden. Dazu trugen zwei Faktoren
ausschlaggebend bei: Die unregelmäßigen Proteinlinien und das indirekte Test-
format. Gleichmäßige Linien, insbesondere des TATP-OVA-Konjugat 3 sind un-
entbehrlich, selbst wenn der Teststeifen elektronisch über ein LFA-Kolorimeter
ausgewertet wird. Das manuelle Auftragen der Linien führte allein schon zu In-
tensitätsschwankungen, die die Identifizierung einer eventuellen Kompetition
nicht erlaubten. Hinzu kommt, dass das indirekte Testformat, wenn überhaupt,
nur bei sehr hohen TATP-Konzentrationen die Färbung der TATP-OVA-
Konjugat-3-Linie vollständig unterdrückt und dass geringe Konzentrationen nur
eine sehr geringe Erniedrigung des Signals bewirken. Des Weiteren könnte auch
die Tatsache, dass mit unaufgereinigtem Serum gearbeitet wurde, einen negati-
ven Einfluss auf den Testverlauf, vor allem auf die insgesamt relativ schwache
Färbung der Linien ausgeübt haben. Die TATP-Antikörperkonzentration könnte
zu gering sein und müsste durch eine selektive Aufreinigung verbessert werden.
Die gleichen Gründe lassen auch keine Aussage über den Einfluss von
Tween 20 und BSA bzw. Casein auf den Assay zu, denn Unterschiede mit diesen
Zusätzen oder ohne sie konnten nicht eindeutig festgestellt werden.
Auch wenn abschließend noch kein funktionsfähiger TATP-LFA präsentiert
werden kann, so konnten doch innerhalb von nur wenigen Wochen einige Er-
kenntnisse erlangt und erste vielversprechende Tests durchgeführt werden. Das
vorgestellte Konzept des LFA für TATP scheint realisierbar, doch ehe weitere
Optimierungen folgen können, muss die reproduzierbare Auftragung der TATP-
OVA-Konjugat-3- und -Kaninchen-IgG-Linie gewährleistet werden. Dazu wird
ein automatisches Dosiersystem notwendig sein, das ähnlich einem Tintenstrahl-
drucker die Proteinlösungen aufsprüht, so dass berührungslos gleichmäßige Li-
nien entstehen. Die Membranen und Vliese der verschiedenen Hersteller sind
derart ausgereift, dass kein Blocken oder sonstige Vorbehandlung notwendig ist.
Es werden stets größere Proteinmengen als z. B. für einen ELISA erforderlich
sein, da die Auswertung der Tests typischerweise ohne signalverstärkende Effek-
te (durch beispielsweise Enzyme) und rein visuell erfolgt. Dafür ist ein LFA sehr
schnell (5-10 min) in der Durchführung, einfach zu handhaben und das Ergebnis
in der Regel auch ohne ein spezielles Auslesegerät (zumindest qualitativ) ables-
bar. Für den hier entworfenen TATP-LFA würde sich jedoch ein Messinstrument
zur Auswertung anbieten, um mit Hilfe einer (abgespeicherten) TATP-
Kalibriergeraden auch eine quantitative Aussage des kompetitiven Assays zu
erhalten. Insbesondere unerfahrene Anwender verwirrt zudem das umgekehrt zur
TATP-Konzentration proportionale Signal, welches dann benutzerfreundlich in
eine elektronische Anzeige umgewandelt werden kann. Ein klassischer, soge-
nannter Sandwich-Assay, der nicht kompetitiv arbeitet und nur zwischen positiv
und negativ entscheiden muss, wie bei einem handelsüblichen Schwanger-
schaftstest, ist für TATP nicht möglich. Denn im Gegensatz zu der in Abschnitt
4.6 bei den Untersuchungen zur Kreuzreaktivität als vorteilhaft beschriebenen
Ergebnisse und Diskussion 133
Eigenschaft von TATP, dass es Antikörpern nur ein Epitop zur Verfügung stellt,
verhindert genau diese Eigenschaft nun den Aufbau eine Sandwich-Formats.
Dafür wäre ein zweiter Antikörper notwendig, der ein anderes Epitop als der erste
bindet.
135
Das primäre Ziel dieser Arbeit konnte mit der erfolgreichen Herstellung der ersten
Antikörper gegen Triacetontriperoxid (TATP) erreicht werden. Dieses Ergebnis
lässt sich auch grafisch in Abbildung 5.2 für die Immunisierung der beiden Spe-
zies, Maus und Kaninchen, zusammenfassen. Ausgehend von der gelungenen
Synthese eines carboxylierten Derivats des TATP – dem TATP-Hapten
(Abbildung 5.1) – das eine durch NMR- und Einkristallstrukturanalysen verifizier-
te, nahezu identische Ringstruktur zu TATP aufweist, konnten TATP-
Immunogene erzeugt werden. Mit diesen TATP-BSA-Konjugaten wurden Mäuse
und Kaninchen immunisiert. Die auf diese Weise erhaltenen polyklonalen TATP-
Antikörper wurden insbesondere auf ihre analytischen Kenndaten hin charakteri-
siert, wobei sich herausstellte, dass das Potenzial der Antikörper aus Kaninchen
weit über denen aus Mäusen lag.
Abbildung 5.1: Kugel-Stab-Modell des TATP-Haptens.
Mittels ELISA wurden die Immunisierungsverläufe verfolgt. Beispielkurven für die
Seren von Kaninchen 1 (Boost 11) und Maus 3 (Boost 8) sind in Abbildung 5.2
gegeben und machen auch die enormen Unterscheide zwischen den zwei Säu-
getierarten erkenntlich. Am Ende der Immunisierungen wurden für die Seren der
beiden Kaninchen Affinitäten von etwa 1 × 109 L mol-1 ermittelt, wohingegen
Maus-3-Serum nur eine Affinität von knapp 0.2 × 106 L mol-1 erlangte. Dieser
Unterschied um den Faktor 5 000 wirkte sich auch direkt auf die Nachweisgrenze
aus, die mit Kaninchenserum ca. 0.01 µg L-1 betrug, während mit Serum von
Maus 3 lediglich 50 µg L-1 erreicht werden konnten. Trotz ihrer großen Differen-
zen bezüglich der Empfindlichkeit erwiesen sich die polyklonalen Antikörper bei-
136 Zusammenfassung und Ausblick
der Spezies als hoch selektiv gegenüber TATP, da keine relevante Kreuzreaktion
festgestellt wurde.
Abbildung 5.2: Vergleich der Kaninchen- und Mausserum-ELISA-Kurven.
Die Antikörper aus der Maus stünden – wenn sie in ausreichender Menge vorlä-
gen - zur Anwendungen im Bereich der Affinitätsreinigung zur Verfügung, da ihre
geringere Affinität eine schnellere Reversibilität der Antikörperbindung zulässt.
Die TATP-Antikörper, die aus den Kaninchen gewonnen wurden, sind hingegen
hervorragend zur Spurenanalytik einsetzbar, wie mittels ELISA gezeigt wurde.
Analysen von Realproben stehen jedoch noch aus. Zwar wurde z. B. der Einfluss
von etwaigen Kreuzreaktanden sowie von BSA und Tween 20 untersucht, aber
Effekte komplexer Matrizes können nicht gänzlich ausgeschlossen werden, zu-
mal die Toleranz der TATP-ELISA gegenüber Lösungsmitteln eher gering war.
Wenngleich mit den polyklonalen Antikörpern aus Kaninchen überzeugende Re-
sultate erzielt wurden und sich die Affinität und Kreuzreaktivität zwischen po-
lyklonalen und monoklonalen Antikörpern nicht wesentlich unterscheiden sollten,
so werden auf lange Sicht sicherlich monoklonale Antikörper wegen ihrer besse-
ren Reproduzierbarkeit und Vermarktungsmöglichkeiten das analytische Werk-
zeug der Wahl bleiben. Es wird jedoch erst seit wenigen Jahren auch vermehrt
(kommerziell) die Herstellung monoklonaler Antikörper von Kaninchen über die
Hybridomtechnik angeboten, was momentan ein noch kostspieligeres Verfahren
als mit dem verbreiteten Weg über die Immunisierung von Mäusen ist.
Obwohl der TATP-ELISA ausgezeichnet funktioniert, ist seine Anwendung auf
entsprechend ausgerüstete Labore mit Fachpersonal beschränkt. Außerdem sind
ELISA eine schnelle Methode bei Hochdurchsatzuntersuchungen, jedoch bei
Einzelproben verhältnismäßig zeitaufwendig. Der hier noch in den Anfängen ste-
ckende TATP-LFA mit kolloidalem Gold als visuelle Anzeige ist schon ein erster
Ansatz zu einem praxistauglichen Schnelltest, der ohne bioanalytische Kenntnis-
se etwa von der Polizei oder Kontrolleuren am Flughafen als Wischtest ange-
0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 1E4 1E5
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Kaninchen
Maus
Extinktion ( =
450 n
m)
TATP [µg L-1]
0
Zusammenfassung und Ausblick 137
wandt werden könnte. Wird der LFA weiterentwickelt, so ließe sich TATP damit
sogar quantitativ nachweisen und das Ergebnis könnte von einem Digitaldisplay
abgelesen werden. Mittlerweile konnten Climent et al. [326] mit den in dieser Ar-
beit hergestellten polyklonalen TATP-Antikörpern sehr erfolgreich ein LFA basie-
rend auf der Antikörper-kontrollierten Farbstofffreisetzung aus mesoporösen
Komposit-Nanopartikeln aufbauen. Die Durchführung dieses Tests nimmt nur
zwei bis zehn Minuten in Anspruch, jedoch ist seine Empfindlichkeit etwa
1 000-fach schlechter als die des ELISA mit den gleichen Antikörpern. Daneben
stehen die TATP-Antikörper aber auch zum Einsatz in anderen schnellen und
tragbaren Nachweissystemen bereit. Es gibt inzwischen ein weites Feld an Bio-
sensoren, deren Selektivität und Empfindlichkeit auf Antikörpern beruhen, die
beispielsweise an den Sensoroberflächen gebunden wurden. Außerdem sind
Multi-Analyt-Systeme denkbar, bei denen z. B. durch die Markierung von Antikör-
pern gegen verschiedene Explosivstoffe mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstof-
fen gleich mehrere Explosivstoffe parallel identifiziert oder ausgeschlossen wer-
den können (Multiplexing), was für die Beurteilung von Gefahrenlagen sowie Ent-
sorgungsstrategien entscheidend ist.
Die beiden in dieser Arbeit beschriebenen TATP-Assays erfordern zwingend
ein Arbeiten in wässrigen Lösungen. Interessanter wäre jedoch ein Nachweis
direkt aus der Luft. Da TATP einen so hohen Dampfdruck hat, wodurch auch ein
Eindampfen zur Aufkonzentrierung von Lösungen nicht möglich ist, sollte das
enorme Potenzial der Gasphasenanalytik bei TATP auch ausgenutzt werden.
Dies mit Antikörpern, die ein wässriges Milieu unter physiologischen Bedingun-
gen benötigen, ohne oder nur mit geringen Qualitätsverlusten zu bewerkstelligen,
wird eine Aufgabe für die Zukunft sein.
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i
Aus der vorliegenden Arbeit ging eine Patentanmeldung beim Deutschen Patent-
und Markenamt hervor:
DE 10 2009 002 652 A1. Triacetontriperoxid und Diacetondiperoxid-Derivat
Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung. Walter A, Schneider R,
Weller MG. Patentanmeldung: 27. April 2009, Offenlegung: 28. Oktober 2010.
Daraus folgten Nachmeldungen beim europäischen Patentamt sowie beim US-
amerikanischen Patent- und Markenamt:
EP 2 246 342 A2. Triacetontriperoxid und Diacetondiperoxid-Derivat, Verfahren
zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung/Triacetone triperoxide and diace-
tone diperoxide derivative, method for their manufacture and their applicati-
on/Dérivés de tri-péroxyde de tri-acétone et de di-péroxyde de di-acétone, pro-
cédé destiné à leur fabrication et leur utilisation. Walter A, Schneider R, Weller
MG. Patentanmeldung: 16. April 2010, Offenlegung: 3. November 2010.
US 2010/0273193 A1. Triacetone triperoxide and diacetone diperoxide deriva-
tives, Method for the preparation and use thereof. Walter A, Schneider RJ,
Weller MG. Patentanmeldung: 26. April 2010, Offenlegung: 28. Oktober 2010.
Des Weiteren wurden im Rahmen der Promotion nachstehende Zeitschriftenarti-
kel veröffentlicht:
Walter MA, Pfeifer D, Kraus W, Emmerling F, Schneider RJ, Panne U, Weller
MG. Triacetone triperoxide (TATP): Hapten design and development of anti-
bodies. Langmuir. 2010;26(19):15418-23.
Walter MA, Panne U, Weller MG. A novel immunoreagent for the specific and
sensitive detection of the explosive triacetone triperoxide (TATP). Biosensors.
2011;1(3):93-106.
Carvalho JJ, Walter MA, Baermann-Stapel Y, Weller MG, Panne U, Schenk JA,
Schneider RJ. Non-invasive monitoring of immunization progress in mice via
IgG from feces. In Vivo. 2012;26(1):63-9.
Climent E, Gröninger D, Hecht M, Walter MA, Martínez-Máñez R, Weller MG,
Sancenón F, Amorós P, Rurack K. Selective, sensitive, and rapid analysis with
lateral-flow assays based on antibody-gated dye-delivery systems: The
example of triacetone triperoxide. Chemistry - A European Journal.
2013;19(13):4117-22.
ii Publikationen
Daneben folgten Beiträge zu Vorträgen:
Rurack K, Biyikal M, Walter MA, Ramin S, Weller MG. Biological and biomimet-
ic approaches toward the Ddetection of nitro- and peroxide-based explosives.
International Workshop on Explosives Detection 2010. Valencia, Spanien, 2010
Nov 25.
Weller MG, Walter MA, Ramin S. Detection of explosives by bioanalytical tech-
niques. Potsdam Days on Bioanalysis. Potsdam, 2011 Nov 9-10.
sowie Poster:
Kraus W, Walter MA, Emmerling F, Schneider RJ, Weller MG, Panne U. Tri-
acetone triperoxide hapten structure for the development of antibodies.
Crystals, Minerals, and Materials. Salzburg, Österreich, 2011 Sep 20-24.
Berlin, 21. November 2013
iii
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter
Verwendung der angegebenen Quellen, Hilfen und Hilfsmittel angefertigt habe.
Ich erkläre, dass ich mich nicht bereits anderwärts um einen Doktorgrad bewor-
ben habe bzw. einen entsprechenden Doktorgrad besitze und diese Arbeit in
dieser oder anderer Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt wur-
de. Der Inhalt der dem angestrebten Verfahren zugrunde liegenden Promotions-
ordnung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-
Universität zu Berlin vom 01. September 2005 ist mir bekannt.
Astrid Walter
Berlin, 21. November 2013