Katarina Grdiša

Vrijednost galektina-3 i CA 125 kod procjene

stadija kardiomiopatija

DIPLOMSKI RAD

predan Sveučilištu u Zagrebu Farmaceutsko-biokemijskom fakultetu

Zagreb, 2016.

Ovaj diplomski rad prijavljen je na kolegiju Klinička biokemija organa i organskih sustava 2

Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta i izrađen na Kliničkom zavodu

za kemiju KBC Sestre milosrdnice u Zagrebu pod stručnim vodstvom izv. prof dr.sc. Nade

Vrkić.

Zahvaljujem mentorici izv.prof.dr.sc. Nadi Vrkić na vodstvu, stručnoj pomoći te pruženom

znanju i iskustvu pri izradi ovog diplomskog rada.

Najljepše zahvaljujem prim. Danijelu Planincu, dr. med., specijalstu kardiologije, Klinke za

bolesti srca i krvnih žila, KBC Sestre milosrdnice što je velikodušno omogućio realizaciju

ovog diplomskog rada.

Posebno hvala mojoj obitelji i prijateljima na velikoj podršci tijekom studiranja.

SADRŽAJ

1. UVOD ................................................................................................................................. 1

1.1. GALEKTIN-3 ..................................................................................................................... 1

1.1.1.Struktura i funkcija ............................................................................................................ 1

1.1.1. Galektin-3 u srčanom zatajenju ................................................................................... 3

1.2. UGLJIKOHIDRATNI ANTIGEN 125 ........................................................................... 3

1.2.1. Tumorski biljezi ........................................................................................................... 3

1.2.2. Struktura i funkcija CA 125 ......................................................................................... 4

1.2.3. CA 125 u tumorskim bolestima ................................................................................... 5

1.2.4.CA 125 u srčanom zatajenju ............................................................................................. 5

1.3. MOŽDANI NATRIJURETSKI PEPTID ........................................................................ 6

1.3.2. Struktura i funkcija BNP ............................................................................................. 6

1.3.3. BNP u srčanom zatajenju ............................................................................................ 7

1.4. KARDIOMIOPATIJE ..................................................................................................... 9

1.4.1. Dilatativna ili kongestivna kardiomiopatija ............................................................. 11

1.4.2. Restriktivna kardiomiopatija ..................................................................................... 12

1.4.3. Hipertrofična kardiomiopatija ................................................................................... 13

1.5. POVEZANOST KARDIOMIOPATIJA S BILJEZIMA SRČANOG OŠTEĆENJA -

GALEKTINOM-3, CA 125 I NT-proBNP .............................................................................. 14

2.OBRAZLOŽENJE TEME …………………………………………………………………19

3.MATERIJALI I METODE ………………………………………………………………...20

3.1. ISPITANICI ...................................................................................................................... 20

3.2.UZORKOVANJE ............................................................................................................... 20

3.3 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE CA 125 ................................................................. 20

3.3.1. Priprema uzorka ............................................................................................................. 20

3.3.2. Reagensi ......................................................................................................................... 20

3.3.3. Postupak određivanja koncentracije CA 125 ................................................................. 21

3.3.3.1. Kalibracija i kontrola kvalitete .................................................................................... 21

3.3.3.2. Načelo metode i postupak ........................................................................................... 21

3.4. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE NT-proBNP ......................................................... 22

3.4.1 Priprema uzorka .............................................................................................................. 22

3.4.2. Reagensi ......................................................................................................................... 22

3.4.3. Postupak određivanja NT-proBNP ................................................................................. 23

3.4.3.1. Kalibracija i kontrola kvalitete ................................................................................... 23

3.4.3.2. Načelo metode i postupak ........................................................................................... 23

3.5. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE GALEKTINA-3 .................................................. 24

3.5.1. Priprema uzorka ............................................................................................................. 24

3.5.2. Reagensi ......................................................................................................................... 24

3.5.3. Postupak određivanja koncentracije galektina-3 ............................................................ 24

3.5.3.1. Načelo metode ............................................................................................................. 24

3.5.3.2. Postupak određivanja galektina-3 ............................................................................... 25

3.5.3.3. Izračunavanje koncentracije galektina-3 ..................................................................... 26

3.6. STATISTIČKE METODE ................................................................................................ 27

4.REZULTATI I RASPRAVA ................................................................................................ 29

4.1.REZULTATI ...................................................................................................................... 29

4.1.1 Prikaz rezultata kroz deskriptivnu statistiku ................................................................... 29

4.1.2. Međuovisnost CA 125 i NT-proBNP ............................................................................. 32

4.1.2.1. Korelacija CA 125 i NT-proBNP ................................................................................ 32

4.1.2.2. Regresijski model za povezanost CA 125 i NT-proBNP .......................................... 33

4.1.3. Međuovisnost CA 125 i galektina-3 .......................................................................... 35

4.1.3.1.Korelacija CA 125 i galektina-3 ................................................................................... 35

4.1.3.2. Regresijski model za povezanost CA 125 i galektina-3 ............................................ 36

4.1.4. Međuovisnost NT-proBNP i galektina-3 ................................................................... 38

4.1.4.1. Korelacija NT-proBNP i galektina-3 .......................................................................... 38

4.1.4.2. Regresijski model za povezanost NT-proBNP i galektina-3 ..................................... 39

4.1.5. Međuovisnost NYHA stadija i galektina-3, NT-proBNP i CA 125 .......................... 41

4.1.6. Multipla regresija ....................................................................................................... 42

4.1.6.1. Wilcoxonov test ........................................................................................................... 43

4.2. RASPRAVA .................................................................................................................. 44

5. ZAKLJUČCI ..................................................................................................................... 50

6. LITERATURA ................................................................................................................. 51

7. SAŽETAK ........................................................................................................................ 54

7.1 SUMMARY ....................................................................................................................... 55

8. TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA/BASIC DOCUMENTATION

CARD.………………………………………………………………………………………..56

POPIS KRATICA KORIŠTENIH U TEKSTU

ACE engl.angiotensin-converting-enzym, angiotenzin konvertirajući enzim

AIDS engl. acquired immune deficiency syndrome, stečeni sindrom humane

imunodeficijencije

ANP engl.atrial natriuretic peptide, atrijski natriuretski peptid

BNP engl. B-type or Brain natriuretic peptide, moždani natrijuretski peptid

Bcl-2 engl.B-cell lymphoma 2, onkogen

CA 125 engl. Carbohydrate antigen 125, ugljikohidratni antigen 125

cGMP engl. Cyclic guanosine monophosphate, ciklički gvanozin monofosfat

CNP engl. C-type natriuretic peptide, C tip natrijuretskog peptida

CRD eng. carbohidrate-recognition-binding domain, domena koja veže šećere

CREB engl. cAMP response element-binding protein, transkripcijski faktor

CRP engl.C-reactive protein C-reaktivni protein

ECLIA engl. electrochemiluminescnce immunoassay, imunoanaliza

elektrokemiluminescencije

eGFR engl. estimated glomerular filtration rate, glomerularna filtracija

EKG elektrokardiogram

ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay, enzimska imunosorbent metoda

hs CRP engl. high-sensitivity C-reactive protein, visoko osjetljivi CRP

ICON engl. International Collaborative of NT-proBNP Study, Internacionalan kolaboracija

NT-proBNP

IL-1 interleukin-1

IL-5 interleukin-5

IL-6 interleukin-6

K-Ras engl. V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma, onkogen

LPS engl. Lipopolysaccharide, lipopolisaharid

MMP-2 engl. Matrix Metallopeptidase 2, matriksna metalopeptidaza-2

MUC 16 engl. Mucin 16, gen

NYHA engl. New York Heart Association, Stručno društvo kardiologa u New Yorku čiji su

kriteriji za stadije srčanog zatajenja usvojeni

PIIINP engl. the amino terminal peptide of type III procollagen, biljeg kolagena tipa-3

PRIDE engl. Pro-BNP Investigation of Dyspnea in the Emergency Department, Akronim

prospektivne kliničke studije za utvrđivanje kliničke valjanosti NT-proBNP

RAAS renin-angiotenzin-aldosteron sustav

RIA engl. Radioimmunoassay, radioimunološka metoda

RTG, rendgen

TGF-β engl. Transforming growth factor beta, transformirajući faktor rasta beta

TIMP-1 engl. tissue inhibitor of metalloproteinases, inhibitor metaloproteinaza

TNF-α engl. TNF, tumor necrosis factor alpha, faktor nekroze tumora alfa

1

1. UVOD

1.1. GALEKTIN-3

1.1.1.Struktura i funkcija

Galektini su karakteristična skupina jedinstvenih proteina, lektina. Članovi porodice

galektina su posebni po specifičnom vezanju β-galaktozidnih struktura. Najbolje istražen

galektin je galektin-3, koji igra veliku ulogu u upali, imunosti te pojavi tumora. Do sada je

identificirano 14 galektina u sisavaca, te je njihova poveznica evolucijski konzervirana

sekvenca od otprilike 130 aminokiselina, poznatija kao domena koja veže šećere (eng.

carbohidrate-recognition-binding domain, CRD). Galektini se svrstavaju u tri podskupine:

prototipna skupina, kimerna skupina i skupina „uzastopno ponavljajućeg slijeda“. Podskupine

su formirane na osnovi broja i organizacije CRD domena, pa tako prototipna skupina

(galektin-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13 i -14) sadrži jednu CRD domenu, kimerna skupina u kojoj

je samo galektin-3 također ima jednu CRD domenu, ali i dugačku N-terminalnu domenu,

bogatu prolinom i glicinom. Treća skupina, „skupina uzastopno ponavljajućeg slijeda“

(galektin-4, -6, -8, -9 i -12) sastoji se od jednog polipeptidnog lanca koji tvori dvije različite,

ali homogene CDR domene, koje su odvojene nekonzerviranim povezujućim slijedom dugim

70-ak aminokiselina. Vezujuća sposobnost galektina ovisi o prisutnosti galaktoze, međutim

vezujući afinitet raste ukoliko je galaktoza povezana na neki drugi saharid, kao npr. N-

acetilglukozamin, te tako tvoreći N-acetillaktozamin (Dumić i sur., 2006).

Slika 1. Struktura galektina-3 (preuzeto s https://en.wikipedia.org/wiki/Galectin-3)

2

Galektin-3 kao glavni predstavnik ove široke skupine smješten je unutar stanične jezgre i

citoplazme, na površini stanice i u izvanstaničnom prostoru. U humanom genomu kodira ga

jedinstveni gen LGALS3 koji je smješten na kromosomu 14, lokus q21-q22. Humani

LGALS3 sastoji se od 6 egzona i 5 introna, veličine oko 17 kb. Slijed koji kodira N-

terminalnu domenu smješten je potpuno unutar egzona III, a slijed koji kodira CDR domenu

unutar egzona V (Raimond J i sur., 1997). Tijekom prvog trimestra ljudske embriogeneze

najviše je izražen u epitelu kože, epitelu koji oblaže gastrointestinalni i respiratorni trakt, te

stanicama miokarda i jetre. Iako se galektin-3 može naći u gotovo cijelom tijelu, velika većina

je koncentrirana u epitelnim i mijeloidnim stanicama. Galektin-3 eksprimiran je i kod

različitih tumora, dok sam intenzitet ovisi o progresiji, invanzivnosti i metastatskom

potencijalu tumora. Biološke uloge galektina-3 definirane su njegovom lokalizacijom u

stanici. Prvi otkriveni ligand galektina-3 unutar citoplazme je Bcl-2, molekula uključena u

regulaciju apoptoze. Daljnjim istraživanjima otkriveno je da ulazi u interakcije s mnogim

drugim molekulama uključenim u regulaciju apoptoze. Svojim interakcijama s K-Ras

proteinom te Akt proteinom utječe na regulaciju stanične proliferacije, diferencijacije,

preživljavanja i smrti. U jezgri je galektin-3 povezan s ribonuklearnim proteinskim

kompleksima. Djeluje kao pre-mRNA faktor za izrezivanje. Također svojim mnogobrojnim

interakcijama aktivira transkripcijske faktore CREB i SP1 te inducira promotorsku aktivnost

ciklina D1 (Liu i sur., 2005). Izvanstanični galektin-3 nema prepoznatljiv sekrecijski signalni

slijed niti prolazi klasičan put preko endoplazmatskog retikula i Golgijeva aparata. Međutim

potvrđena je i njegova lokalizacija na staničnoj površini i u izvanstaničnom prostoru, vezanog

na druge elemenete izvanstaničnog prostora, te u biološkim tekućinama i serumu.

Izvanstanični galektin-3 ima brojne autokrine i parakrine efekte. Posreduje u staničnoj

adheziji i staničnoj aktivaciji te djeluje kao kemoatraktant za određene stanične oblike. Kao

takav ima biološku ulogu u postizanju stanične homeostaze, imunološkim reakcijama,

organogenezi, angiogenezi te invazivnosti i metastaziranju tumora. Multivalentna svojstva i

sposobnost vezanja glikoproteina staničnih površina te glikoliziranih komponenti

izvanstaničnog matiksa, kao što su laminin, integrin, selektin, fibronektin, kolagen IV i dr.

definiraju njegovu ulogu u staničnoj adheziji. Osim toga pojačava produkciju proupalnog

interleukina-1 (IL-1) induciranu lipopolisaharidom (LPS) te potiče proizvodnju

superoksidnog aniona u humanim monocitima periferne krvi i neutrofilima, što posljedično

vodi do oksidativnog praska. Potiče otpuštanje medijatora u mast stanicama, a kao najčešći

negativan učinak navodi se selektivna inhibicija ekspresije IL-5, na razini proteina i mRNA.

Kao što je već spomenuto djeluje kemoatraktivno na monocite, makrofage i alveolarne

3

makrofage. Dokazano je da su za tu njegovu ulogu neophodne obje podjedinice, N-terminalna

domena i CDR domena. Pri višim koncentracijama djeluje kemoatraktivno, dok pri nižim

uzrokuje kemokinezu, povećava neusmjerena gibanja stanica (Dumić i sur.,2006).

1.1.1. Galektin-3 u srčanom zatajenju

Galektin-3 također ima važnu ulogu u razvoju fibroze i remodeliranju srčanog tkiva,

što su dva najvažnija mehanizma razvijanja i progresije zatajenja srca (Cohn i sur., 2000).

Istraživanja pokazuju da je neovisan pokazatelj smrtnosti u populaciji pacijenata s umjerenim

i naprednim stupnjem srčanog zatajenja. Galektin potiče migraciju makrofaga, proliferaciju

fibroblasta i sintezu kolagena. Lok i suradnici u svom istraživanju navode značajnu

povezanost koncentracije galektina-3 i renalne disfunkcije (Lok i sur., 2010). Provedenim

istraživanjem na štakorima kojima se 4 tjedna intraperikardijalno injicirao galektin-3

dokazana je povećana infiltracija makrofagima i mast stanicama, povećana intersticijska i

perivaskularna fibroza srčanog tkiva, hipertrofija srčanog tkiva, povećana ekspresija TGF-β te

smanjena sistolička i dijastolička funkcija srca (Liu YH i sur., 2009).

1.2. UGLJIKOHIDRATNI ANTIGEN 125

1.2.1. Tumorski biljezi

Tumorski biljezi su široka skupina proteina, gena, enzima, hormona i antigena. Koriste

se u procjeni rizika za nastanak karcinoma, probiranju tijekom rane pojave bolesti, kod

postavljanja dijagnoze, procjene prognoze, predviđanja uspješnosti terapije te kod praćenja

recidiva ili progresije bolesti. Ugljikohidratni antigeni su također skupina tumorskih biljega,

CA 15-3 poznati je predstavnik ove skupine i koristi se za praćenje terapije kod pacijenata

oboljelih od karcinoma dojke. Uz CA 15-3, u podskupini visokomolekularnih mucina su i CA

125, CA 549, CA 27.29. Druga podskupina su antigeni krvnih grupa, a najpoznatiji

predstavnici su CA 19-9, CA 19-5, CA 50, CA 72-4, CA 242. Ugljikohidratni tumorski biljezi

su klinički specifičniji od biljega koji se prirodno luče, poput enzima i hormona (Štraus,

2009).

4

1.2.2. Struktura i funkcija CA 125

CA 125 (engl. cancer antigen 125, carcinoma antigen 125, carbohydrate antigen 125)

je visokomolekularni glikoprotein s molekularnom masom > 200 kDa i 24 % ugljikohidrata.

Eksprimiran je na epitelnim stanicama jajnika kod tumora jajnika, te u drugim patološkim i

normalnim stanjima Műllerovog kanala. Naziva se i mucin 16, a kodira ga gen MUC 16, te

ima jednu transmembransku domenu. Karakterističan je po svojoj dužini od 22 000

aminokiselina te je tako najduži mucin vezan na membranu. Sastoji se od tri domene, N-

terminalne, tandem ponavljajuće i C-terminalne domene. N-terminalna i tandem ponavljajuća

domena su ekstracelularne domene i pretežito O-glikozilirane. Aminokiseline koje se

ponavljaju u tandem ponavljajućoj domeni su serin, treonin i prolin. C-terminalna domena

sastoji se od ekstracelularne, transmembranske domene te citoplazmatskog repa.

Proteolitičkim cijepanjem se odvaja ekstracelularna regija. Mucin 16 nalazi se u okularnom

sustavu, respiratornom traktu te epitelu ženskog reproduktivnog trakta. Njegov visok stupanj

glikozilacije stvara hidrofilni okoliš koji djeluje kao barijera prema stranim česticama i

infektivnim agensima na apikalnoj strani epitelnih stanica, dok se citoplazmatski rep

povezuje sa citoskeletom (Thomas, 1998).

Slika 2. Struktura CA125 (preuzeto s

https://en.wikipedia.org/wiki/File:The_Structure_of_MUC16_2.jpeg)

5

1.2.3. CA 125 u tumorskim bolestima

Glavna dijagnostička važnost CA 125 je pomoć u prognozi i praćenju terapije tumora

ovarija. Također je drugi izbor kod tumora pankreasa, nakon određivanja CA 19-9. Ne

preporuča se određivanje kod drugih malignih bolesti zbog premale kliničke osjetljivosti i

specifičnosti. Koncentracija CA 125 dobro korelira s veličinom tumora ovarija. (Thomas,

1998) Koncentracija CA 125 povišena je kod 50% pacijenata s fazom I bolesti, 90%

pacijenata s fazom II te više od 90% pacijenata s fazom III i IV. Kada se koristi kao

prognostički biljeg, preoperativne koncentracije manje od 65 kU/L povezane su s znatno

većim petogodišnjim preživljenjem. Također se koristi za detekciju ostatne bolesti kod

pacijenata na terapiji. Nakon kemoterapije praćenje koncentracije omogućava određivanje

prognoze. Pad koncentracije CA 125 nakon prvog kruga kemoterapije pokazatelj je

poboljšanja, dok perzistirajući porast koncentracije CA 125 nakon trećeg kruga kemoterapije

indicira lošu prognozu. Kod detekcije ostatnih metastaza točnost CA 125 kao indikatora je

75% (Burtis, 2008).

Povišene koncentracije CA 125 prisutne su kod brojnih drugih benignih stanja: endometrioze,

peritonitisa, intestinalne opstrukcije, benignih gastrointestinalnih bolesti, akutnog

pankreatitisa, kolecistitisa, akutnog i kroničnog aktivnog hepatitisa, kronične bolesti jetre,

ciroze jetre, autoimunih bolesti, srčane i bubrežne insuficijencije. Referentni interval koji se

navodi u literaturi je ≤ 35 U/ml, sa 99 %-tnom pouzdanošću za zdrave pacijente, a ≤ 65 U/ml

s 99,8 %-tnom pouzdanošću za zdrave pacijente i pacijente s benignim bolestima. Princip

određivanja CA 125 leži na postojanju monoklonalnog antitijela OC 125 koje reagira sa

humanim epitelnim stanicama tumora ovarija te tumorskim stanicama u ascitesu, OC 125

također reagira sa normalnim i tumorski promijenjenim stanicama endometrija i endocerviksa,

epitelom Műlerovog kanala, parijetalnim stanicama i mezotelijalnim stanicama (Thomas,

1998).

1.2.4.CA 125 u srčanom zatajenju

CA 125 dobro poznat kako tumorski biljeg je također sve više istraživan kao

potencijalni biomarker kod pacijenata sa zatajenjem srca. Etiologija povećane koncentracije

kod zatajenja srca objašnjava se hipotezom nastanka u mezotelijalnim stanicama uz pojavu

ascitesa te pleuralnog ili perikardijanog izljeva, ili sintezom potaknutom upalom i

citokinskom stimulacijom. Citokini poput TNF-a (engl. Tumor necrosis factor, TNF) i IL-6

(engl. Interleukin-6) pokazuju povezanost sa ishodom bolesnika s kongestivnim srčanim

6

zatajenjem. IL-6 može inducirati proliferaciju stanica koje stvaraju CA 125. (Karaca i

sur.,2012) Također je dokazano da perikardijalno tkivo stvara CA 125, nakon autopsije tkivo

je obilježeno CA 125 protutijelima, te su serumske i perikardijalne vrijednosti CA 125 bile

značajno više kod pozitivnih tj. obilježenih tkiva perikardija. Dosadašnje studije pokazuju

dobre korelacije koncentracije CA 125 u serumu sa lošijom prognozom, funkcionalnim

statusom te različitim prognostičkim ehokardiografskim parametrima (Duman i sur., 2008.).

1.3. MOŽDANI NATRIJURETSKI PEPTID

1.3.1. Natrijuretski peptidi

BNP, moždani natrijuretski peptid (engl. Brain, ili B-type peptide) je hormon prvi put

izoliran iz tkiva mozga svinje. Naziv moždani se zadržao do danas iako su istraživanja otkrila

da su najveće koncentracije u ventrikulu miokarda te se preporuča naziv B tip natrijuretskog

hormona. BNP je član porodice koju čine 4 natrijuretska peptida: atrijski natrijuretski peptid

(ANP), natrijuretski peptid C-tipa (CNP), urodilatin te već spomenuti moždani natrijuretski

peptid (BNP). BNP, ANP i CNP imaju vrlo sličnu strukturu sa 12 zajedničkih aminokiselina,

od ukupno 28 aminokiselina kod ANP-a, 32 aminokiseline kod BNP-a te 22 aminokiseline

kod CNP-a. Disulfidni mostovi između cisteina tvore prstenastu strukturu, koja je odgovorna

za vezanje na specifične receptore ciljnih tkiva: bubrega, vaskularnog endotela, nadbubrežne

žlijezde i stanica središnjeg živčanog sustava. Otkrivena su tri receptora natrijuretskog peptida

(NPR-A, NPR-B i NPR-C). Vezanjem natrijuretskih hormona na receptore A i B stvara se

drugi glasnik cGMP (engl. cyclic guanosine monophosphate; ciklički gvanozin monofosfat)

koji posreduje u većini njegovih bioloških učinaka. NPR-C je receptor putem kojeg se BNP

uklanja iz plazme.

1.3.2. Struktura i funkcija BNP

Sinteza BNP-a ovisi o genskoj ekspresiji te pojačanoj regulaciji s mRNA. Gen BNP-a

aktivira se kad je zid miokarda izložen pojačanom stresu, uzrokovanom povećanim tlakom ili

volumenom opterećenja miokarda. Mogući uzroci su ishemija, sepsa, kardiotoksične tvari te

hemodinamski stres. Pre-proBNP sastoji se od 134 aminokiseline i početni je peptid u miocitu

kojeg cijepaju proteaze na proBNP (108 aminokiselina) te signalni peptid (26 aminokiselina).

proBNP, cirkulirajuće proteaze cijepaju na aktivni hormon BNP te amino-terminalni fragment

(NT-proBNP). BNP se sastoji od 32 aminokiseline i karboksi-terminalni je kraj proBNP-a,

7

dok amino-terminalni kraj ima 76 aminokiselina. Karboksi i amino fragmenti luče se u krv u

ekvimolarnim količinima, međutim karboksi fragment, odnosno BNP ima kraći poluvijek

života, pa su i njegove koncentracije u plazmi manje od koncentracija amino fragmenta, NT-

proBNP-a. Na koncentracije u plazmi utječe dnevni ritam, životna dob, tjelesni napor, položaj

tijela, prehrambene navike, lijekovi te razna klinička stanja. Određeni lijekovi mogu utjecati

na koncentraciju BNP-a, npr. diuretici, inhibitori angiotenzin-konvertaze te blokatori

receptora angiotenzina II smanjuju koncentraciju BNP-a, a što može rezultirati

koncentracijama BNP-a unutar referentnog intervala kod pacijenata sa kroničnim stabilnim

zatajenjem srca. Na interpretaciju koncentracije NT-proBNP-a najviše utječe dob te prisutnost

drugih komorbiditeta, posebno kronične bubrežne insuficijencije koja se očituje smanjenjem

glomerularne filtracije (Raymond i sur., 2003). Dokazan je porast koncentracije NT-proBNP-

a otprilike 7% svakim desetljećem nakon 50-te godine života, te da sam porast s dobi ovisi o

eGFR (engl. estimated glomerular filtration rate) (Bernstein i sur., 2011). BNP se izlučuje

degradacijom, razgradnjom endopeptidazama i vezanjem na specifične receptore te se dio

izlučuje bubrezima, dok se NT-pro BNP u potpunosti izlučuje bubrezima, te je tako osjetljiviji

na promjene u renalnoj funkciji. Iako je NT-proBNP neaktivan fragment može se koristiti u

dijagnostici zatajenja srca jer je povišen prilikom istezanja srčanog mišića, slično kao BNP.

Također njegove koncentracije koreliraju sa stupnjem oštećenja dijastoličke funkcije.

Najvažniji fiziološki učinak srčanih natrijuretskih peptida je vazodilatacija i hipotenzivni

učinak, iako imaju i brojne druge učinke kao odgovor na stanični stres: inhibicija simpatičkog

živčanog sustava, inhibicija aktivnosti hormonskog sustava renin-angiotenzin-aldosteron,

omogućavanje izlučivanja natrija mokraćom i mokrenja preko aferentnih i eferentnih

hemodinamičkih mehanizama bubrega i distalnih tubula, smanjenje periferne krvožilne

rezistencije, povećanje opuštanja glatkih mišića, usmjeravanje opuštajućih svojstava u srčani

mišić, antiproliferativno i antifibrotičko djelovanje na krvožilno tkivo, sprječavanje rasta i

hipertrofije srčanog mišića te djelovanje protivno mitogenezi koja uzrokuje histološke

promjene u stjenci klijetke (Eroglu i sur., 2008).

1.3.3. BNP u srčanom zatajenju

B tip natrijuretskog hormona je koristan pokazatelj srčane funkcije. Istraživanja

pokazuju da je dobar u razlikovanju grudne boli odnosno srčane od ne-srčane dispneje te da je

dobar pokazatelj dugoročne prognoze (Dvornik, 2009).

8

Slika 3. Sinteza od preproBNP-a do NT.proBNP-a i BNP-a (preuzeto s

www.openi.nlm.nih.gov )

9

1.4. KARDIOMIOPATIJE

Kardiomiopatija se najlakše definira kao bolest srčanog mišića. To je bolest koja kao i

svaka druga ima mnogo uzroka, znakova i simptoma te različitih načina dijagnostike i

terapije. Glavno obilježje kardiomiopatija je da se srčani mišić mijenja, na način da postaje

veći, deblji ili tvrđi, te u rijetkim slučajevima tkivo mišića biva zamijenjeno fibrotičnim

tkivom i ožiljkom. Kako se miokard mijenja, srce postaje slabije i lošije pumpa krv i lošije

održava normalni električni ritam. Kao rezultat javljaju se poremećaji srčanog ritma, aritmije,

komplikacije s valvulama i najgori ishod, zatajenje srca. Postoji nekoliko glavnih tipova:

ishemična, hipertenzivna, dilatativna kongestivna, hipertrofična, infiltrativna i restriktivna

kardiomiopatija. Tri najčešća tipa su restriktivna, dilatativna i hipertrofična kardiomiopatija

(www.msd-prirucnici.placebo.hr). Često se spominje i „stresom inducirana kardiomiopatija“

popularno nazvana „sindrom slomljenog srca“. Stresom inducirana kardiomiopatija ima

jednake simptome kao i srčani udar, kratkoća daha, bol u prsima, znojenje i bol u ruci.

Nastanak tog sindroma tumači se velikim količinama hormona koji se luče kao odgovor na

stres, pogotovo adrenalina i drugi okidača simpatičkog živčanog sustava koji može

onesposobiti srčani mišić i njegovu funkciju pumpanja krvi. Ono što razlikuje ova dva stanja

jest izgled koronarnih arterija, koje su kod „sindroma slomljenog srca“ normalne, dok su kod

srčanog udara začepljene (www.heart.org).

Dijelimo ih na primarne, nasljedne kardiomiopatije gdje se nasljeđuje promijenjeni gen i na

sekundarne, stečene, kao posljedica neke druge bolesti. Uzroci su često nepoznati, a bolest

može zahvatiti sve dobne skupine. Ukoliko je kardiomiopatija posljedica mutacije u nekom

genu, a do danas su istražene i otkrivene brojene mutacije u točno određenim gena koje

vežemo za određeni tip kardiomiopatije, najčešće se taj gen odnosi na neki srčani protein koji

omogućava kontrakciju. Nasljeđuje se autosomno dominantno. Kardiomiopatije se mogu

razviti i uz nasljedne poremećaje metabolizma koji se nasljeduju autosomno recesivno. U

rijetkim slučajevima kardiomiopatije zahvaćaju samo muške osobe, a to su Duchennova i

Beckerova mišićna distrofija koje se nasljeđuju X vezano. Mitohondrijski naslijeđene

kardiomiopatije često prate neurološki problemi, napadaji i gluhoća. Liječenje

kardiomiopatija podrazumijeva promjenu životnog stila, medicinsko liječenje, operacije, te

ugrađene uređaje i medikamentoznu terapiju kako bi se korigirala funkcija oštećenog

miokarda, reducirale komplikacije i preveniralo daljnje pogoršanje.

10

Kardiomiopatije pogađaju sve dobne skupine i rase, ali određeni tipovi bolesti su češći u

određenim grupama. Dilatativna kardiomiopatija je češća kod Afroamerikanaca nego kod

bijelaca. Veća prevalencija je kod muškaraca nego kod žena. Glavni faktori koji povećavaju

rizik pojave kardiomiopatija su: pozitivna obiteljska anamneza kardiomiopatija, zatajenja srca

ili srčanog aresta, bolesti koje oštećuju srce kao što su koronarna srčana bolest, infarkt

miokarda, virusna infekcija miokarda, dijabetes i druge metaboličke bolesti, bolesti koje u

svojoj progresiji oštećuju srce, hemokromatoza, sarkoidoza, amiloidoza, alkoholizam i

dugotrajno prisutan visok krvni tlak. Nekoliko rijetkih oblika kardiomiopatija ima glavne

značajke koje se preklapaju s glavnim značajkama osnovnih tipova. Jedna od njih je

aritmogena displazija desnog ventikula, karakterizirana je dilatiranim, loše funkcionalnim

desnim ventrikulom koji ima i depozite masti u zidovima i životno ugrožavajućom

ventrikluarnom tahikardijom. Mitohondrijska kardiomiopatija je posljedica kao što samo ime

kaže abnormalnosti mitohondrija. Očituje se rano u djetinjstvu i često je povezana s

abnormalnostima mišića, jetre ili neurološkog sustava. Najčešće se prenosi genski, a glavna

klinička manifestacije je zadebljanje tj. hipertrofija zida miokarda (www.heart.org).

Slika 4. Prikaz izgleda srčanog mišića, gore lijevo prikaz normalnog srca, gore desno prikaz

dilatativne kardiomiopatije, dolje lijevo prikaz hipertrofične kardiomiopatije, dolje desno

prikaz restriktivne kardiomiopatije. (preuzeto s http://cardiologydatabase.blogspot.hr)

11

1.4.1. Dilatativna ili kongestivna kardiomiopatija

Dilatativna ili kongestivna kardiomiopatija je bolest srčanog mišića koja dovodi do

zatajenja srca, a prevladava dilatacija ventrikula i sistolička disfunkcija. Najčešći je oblik

kardiomiopatija. Simptomi su zaduha, opća slabost i periferni edemi. U razvoju bolesti mogu

se razlikovati asimptomatski stadij, umjereno teška i teška klinička slika. Bolesnici se

najčešće otkriju kod pojave zaduhe pri naporu ili kada se pojave znakovi kongestivnog

zatajivanja srca kao noćni kašalj, ortopneja ili paroksizmalne noćne dispneje. Uzrok može biti

genetski ili povezan s infekcijom ili uvjetima u okolišu. Česti uzrok su i virusi, (npr. coxackie

B virus), te je bolest češća kod oboljelih od AIDS-a. Kao potencijalni uzročnici razvijanja ove

bolesti, navode se i različite toksične tvari, poput alkohola, organskih otapala te

kemoterapeutika (www.msd-prirucnici.placebo.hr). Također se može razviti posljedično zbog

koronarne tromboze, srčanog udara ili upalne imunološke bolesti. Nasljedni oblik obuhvaća

30-50 % svih slučajeva bolesti, te se nasljeđuje autosomno dominantno ( Bielecka-Dabrowa i

sur., 2008). Miokard se dilatira, stanjuje i kompenzatorno hipertofira, što posljedično dovodi

do funkcionalne mitralne ili trikuspidne regurgitacije i proširenja atrija. Dakle glavne

patološke karakteristike dilatativne kardiomiopatije jesu: dilatacija svih četiriju srčanih

šupljina, a osobito lijevog ventrikula, povećana masa lijevog ventrikula, hipetrofični,

izduženi miociti sa smanjenim brojem miofibrila te intersticijska fibroza. U većine bolesnika

poremećaj zahvaća oba ventrikula. Simptomi ovise koji je ventrikul zahvaćen, disfunkcija

lijevog ventikula uzrokuje zaduhu pri naporu i umaranje zbog povišenog dijastoličkog tlaka

LV i niskog minutnog volumena. Ako simptomi zahvaćaju desni ventrikul doći će do pojave

perifernih edema i proširenja vena vrata, te atrijskih aritmija. Česti su simptomi poremećaja

srčanog ritma, koji uključuju palpitacije, sinkope, konvulzije i iznenadne srčane zastoje.

Dijagnoza se postavlja na temelju anamneze, fizikalnog pregleda, RTG prsnog koša, EKG-a

te ultrazvuka srca.. Prognoza je loša, otprilike 70 % bolesnika umire unutar 5 godina.

Polovica smrti je iznenadna, zbog maligne aritmije ili embolije (www.heart.org). Ukoliko

postoje primarni uzroci prva terapija je usmjerena na njih, u drugim slučajevima liječenje je

isto kao kod zatajivanja srca, predvođeno ACE inhibitorima, beta blokatorima, diureticima i

digoksinom. Bolesnici s dilatativnom kardiomiopatijom su često kandidati za transplantaciju

srca. Prednost se daje bolesnicima mlađim od 60 godina, te je potrebno isključiti pridružene

sistemske bolesti, psihijatrijske bolesti te visok otpor u žilama pluća. Iako transplantacija srca

rješava problem simptoma zatajenja srca, također pokreće probleme kao što su: infekcije,

12

odbacivanje transplantata, bolest koronarnih arterija te nuspojave popratne terapije

(www.msd-prirucnici.placebo.hr).

1.4.2. Restriktivna kardiomiopatija

Restriktivna kardiomiopatija je najrjeđi oblik kardiomiopatija, a glavno patološko

obilježje je restrikcija punjenja ventrikula te postojanje nerastezljivih zidova ventrikula koji

se opiru dijastoličkom punjenju te tako uzrokuju opću slabost i zaduhu pri naporu. Sama

kontraktilna funkcija i debljina zida ventikula je normalna, ali je abnormalna faza relaksacije

ili punjenja. Zbog nemogućnosti pravilnog punjenja ventikula, krv se vraća u atrije, a

posljedično i u pluća i ostatak tijela. Najčešće je zahvaćen desni ventrikul što vodi do

perifernih edema, nakupljanja ascitesa te hepatomegalije, ali uz nepromijenjenu veličinu srca

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2209/). Uzrok je u većini slučajeva nepoznat.

Prema istraživanjima primarna restriktivna kardiomiopatija je autosomno dominantan

poremećaj sa zahvaćanjem miokarda, provodnog sustava srca i skeletnih mišića. Uzroci

sekundarne restriktivne kardiomiopatije mogu biti različiti patološki procesi koji infiltriraju

miokard ili stvaraju ožiljke u endomiokardu. Neki poremećaji koji uzrokuju restriktivnu

kardiomiopatiju također zahvaćaju i druga tkiva: amiloidoza, difuzna sistemska skleroza,

fibroza endokarda, Fabryeva bolest, fibroelastoza, Gaucherova bolest, hemokromatoza,

Löfflerov sindrom, sarkoidoza, hipereozinofilni sindrom. Zadebljanje endokarda ili

prožimanje miokarda, ponekad je povezano i sa s odumiranjem miocita, hipertrofijom

miokarda i fibrozom. Patološki proces kod endomiokardne fibroze zahvaća ulazne dijelove

jednog ili obaju ventrikula, dok izlazni dijelovi ostaju nezahvaćeni. Postupno se razvije teška

fibroza endokarda i subendokardijalnih slojeva miokarda s mutiplim muralnim trombima, koji

se organiziraju u fibrozne ožiljke obliterirajući šupljinu ventrikula. Kao rezultat može nastati

funkcionalna insuficijencija mitralnog ili trikuspidalnog zaliska, ili oštećenje sinoatrijskog

čvora i različitih stupnjeva atrij-ventrikularnog bloka. Zbog oštećenog dijastoličkog punjenja i

povišenog tlaka punjenja dolazi do hipertenzije vena pluća. Kompenzatorna hipertrofija

dodatno pogoršava stanje, a nastali ugrušci u šupljini ventrikula mogu dovesti do sistemske

embolizacije. Česte su atrijske i ventrikulske aritmije i atrij-ventrikularni blok, dok su angina

i sinkope rijetke. Za postavljanje dijagnoze potrebno je učiniti EKG, RTG prsnog koša i

ultrazvuk srca te pretrage za otkrivanje poznatih uzroka, npr. biopsija sluznice rektuma za

amiloidozu ili određivanje željeza ili biopsiju jetre za hemokromatozu. Ehokardiogram

13

pokazuje povećanje atrija, normalnu veličinu ventrikula, normalnu funkciju srca, a

progresijom bolesti i porast tlaka u plućnim arterijama. Liječenje je simptomatsko, a

prognoza loša jer se često bolest otkrije u poodmaklom stadiju (www.msd-

prirucnici.placebo.hr).

1.4.3. Hipertrofična kardiomiopatija

Hipertrofična kardiomiopatija jest prirođeni ili stečeni poremećaj srčanog mišića, koji

se klinički očituje simetričnom ili asimetričnom hipertrofijom lijevog i/ili desnog ventrikula u

odsutnosti bilo kojeg drugog uzroka hipertrofije. Simptomi su, kao i kod većine bolesti srca;

bol u prsima, zaduha, sinkopa i iznenadna smrt. Kod nekih pacijenata razvija se i aritmija koja

je faktor rizika pojave iznenadne srčane smrti. Zaduha je posljedica povećanog tlaka punjenja

lijeve klijetke i povećanog tlaka u plućnim venama, a palpitacije su posljedica aritmija. U

nastanku sinkope može sudjelovati više patofizioloških mehanizama, uključujući malo

dijastoličko punjenje, ishemiju miokarda, srčane aritmije i opstrukciju izlaznog dijela

ventrikula kod opstruktivnog tipa bolesti Dijagnoza se postavlja ultrazvukom srca. Liječi se

β-blokatorima te se ponekad opstrukcija liječi kemijskim tvarima ili kirurški.za prevenciju

iznenadne smrti. Zbog teških aritmija ugrađuje se implantibilni kardioverter defibrilator. On

prati srčani ritam, kada se pojavi ventrikularna tahikardija ili fibrilacija otpušta šok kako bi se

srčani ritam normalizirao. Također se izvodi septalna miomektomija, kojom se uklanja mišić

koji dovodi do opstrukcije i sprječava protok krvi. Ovakva operacija kontrolira simptome, ali

ne zaustavlja progresiju hipertrofije, niti tretira opasne aritmije (Docekal, 2016.). Upravo je

hipertrofična kardiomiopatija čest uzrok neobjašnjivih sinkopa te iznenadnih smrti mladih

sportaša, čiji se uzrok otkrije tek prilikom obdukcije. Većina poremećaja je nasljedno, gotovo

50 % svih slučajeva. Nasljeđuje se autosomno dominantno, ali su česte i spontane mutacije te

ja fenotipski izričaj raznolik. Dio pacijenata ostaje asimptomatski tijekom života, dok drugi

dio umire iznenadnom progresijom zatajenja srca. Hipertrofija se ne može objasniti

povećanim tlakom niti volumenom (Uszenski i sur.,1993). Mutacije kod hipertrofične

kardiomiopatije zahvaćaju DNA koji kodira za teški lanac β-miozina, α-tropomiozina i

troponin T (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2209/). Bolesnici obično razvijaju

hipertrofiju za vrijeme brzog tjelesnog rasta u mladenaštvu, ali su poznati i slučajevi

hipertrofične kardiomiopatije, koji su nastali u dobi starijoj od 60 godina. Zajedničko svim

kardiomiopatijama je poremećena organizacija stanica i mišićnih vlakana. U najčešćem obliku

14

hipertrofične kardiomiopatije, gornji dio interventrikulskog septuma ispod aortnog zaliska je

značajno hipertrofičan i zadebljao, uz istodobno blago ili nikakvo zadebljanje stražnjeg zida

lijevog ventrikula. Za vrijeme sistole septum zadeblja i ponekad prednji listić mitralnog

zaliska bude privučen prema septumu, što dodatno suzuje izlazni trakt i smanjuje minutni

volumen. Kontraktilnost srca se najčešće ne promijeni, ali hipetrofija dovodi do ukočenosti i

nerastezljivosti srčanih šupljina. Stvara se otpor dijastoličkom punjenju, raste tlak na kraju

dijastole i posljedično tlak u plućnim venama. Mijenja se i protok krvi kroz koronarne arterije,

što dovodi do pojave angine pektoris, sinkopa i aritmija bez prisutnosti same koronarne

bolesti. Zbog nedovoljnog protoka krvi te suženog lumena intramiokardnih arterija zbog

hipertrofije i hiperplazije intime i medije, dio miocita potpuno odumire. Oni bivaju

zamijenjeni fibroznim tkivom i dovode do širenja hipertrofičnog miokarda te razvijanja

sistoličke disfunkcije. Krvni tlak i srčana frekvencija su obično normalni, a često se čuje 4.

srčani ton zbog snažne atrijske kontrakcije nasuprot slabe rastezljivog lijevog ventrikula u

dijastoli. Kod postavljanja dijagnoze treba učiniti EKG i dvodimenzionalni ultrazvuk srca, a

test opterećenja i 24-satni Holter EKG mogu biti od pomoći u bolesnika za koje se smatra da

se pod povećanim rizikom. Stopa smrtnosti obrnuto je proporcionalna dobi u kojoj su se

javili simptomi i najveća je u bolesnika koji imaju učestale, nepostojane ventrikulske

tahikardije ili sinkope. Prognoza je lošija kod mladih bolesnika s pozitivnom obiteljskom

anamnezom iznenadne smrti. Smrt obično nastupa iznenadno, rijetko dolazi do kroničnog

zatajivanja srca (www.msd-prirucnici.placebo.hr).

1.5. POVEZANOST KARDIOMIOPATIJA S BILJEZIMA SRČANOG

OŠTEĆENJA - GALEKTINOM-3, CA 125 I NT-proBNP

PubMed kao najznačajnija elektronička baza znanstvene periodičke literature iz

područja biomedicinskih znanosti ima više od 2700 publikacija o galektinu-3 što svakako

pokazuje njegovu važnost i sudjelovanje u mnogim biološkim procesima. Poveznica je

između upale i fibroze, povišene koncentracije nađene su kod ciroze, idiopatske plućne

fibroze, pankreatitisa i renalnog zatajenja (Ahmad i Felker, 2012). Velik utjecaj ima i na srce,

smatra se da povećava fibrozu i modulira imunološki odgovor, dva ključna procesa u

srčanom remodeliranju. Njegova raznolika uloga i sudjelovanje u brojim procesima proširuje

njegovu titulu i značenje biljega određenih stanja i bolesti na titulu modulatora istih stanja i

bolesti. Gopal i suradnici pokazali su povezanost galektina-3 sa zatajenjem srca i jetrenom

15

funkcijom. Tijekom fibroze ekspresija galektina-3 je maksimalna dok je njegova ekspresija

gotovo odsutna tijekom oporavka. Upravo taj podatak objašnjava njegovu važnost rutinskog

određivanja kod pacijenata sa zatajenjem srca jer on kao takav ima kliničko prognostičko

značenje, može identificirati pacijenta s visokim rizikom ponovne pojave zatajenja srca ili

smrti te tako usmjeriti i individualizirati terapiju (de Boer i sur., 2009.). U samom srčanom

mišiću galektin-3 je predominantno lokaliziran u miokardijalnom matriksu, u fibroblastima i

makrofazima. Sharma i suradnici su u svom istraživanju pokazali da egzogeni rekombinantni

galektin-3 značajno povećava migraciju makrofaga i time su potvrdili hipotezu da je galektin-

3 stimulator makrofagne migracije (Sharma i sur., 2008). U terapiji zatajenja srca a time i

kardiomiopatija želi se primijeniti takav lijek koji će modificirati bolest i inhibirati sam proces

razvoja zatajenja srca. Prognostička vrijednost galektina-3 ispitivana je u brojnim

istraživanjima i dokazana je njegova povećana koncentracija kod hipertrofičnog miokarda, te

da je povišena koncentracija neovisan prediktor smrtnosti kroz 60 dana (de Boer i sur., 2009).

Određena cut-off vrijednost galektina-3 je 17,7 ng/mL, i predstavlja preporučenu gornju

granicu normalnih vrijednosti (Lok i sur.,2010). Vrijednosti galektina-3 ovise o dobi, manje

su kod mlađih osoba, renalnoj disfunkciji, porast koncentracije galektina-3 s porastom renalne

disfunkcije, više koncentracije kod pacijenata s višim koncentracijama NT-proBNP te

značajna povezanost s BMI (engl. body mass indeks, tj. indeks tjelesne mase). Noviji radovi

pokazuju korelaciju galektina-3 sa serumskim kolagenskim markerom PIIINP (engl. N-

terminal type III colagen peptide), matriksnom metalopreptidaza-2 (MMP-2) i tkivnim

inhibitorom metaloproteinaza-1 (TIMP-1). Ove korelacije dodatno objašnjavaju ulogu

galektina-3 u sintezi kolagena i reorganizaciji matriksa, migraciji i razvoju fibroze (Lok i sur.,

2010.).

Danas se kao biomarkeri srčanog zatajenja najčešće koriste BNP i NT-proBNP, koji su

povišeni proporcionalno rastezanju ili povećanom volumenu miokarda. Ipak njihova

primjenjivost je ograničena jer su njihove koncentracije varijabilne iz dana u dan i nisu

povezane sa samim procesom srčane bolesti. Također na njihove koncentracije utječe puno

faktora; dob, funkcija jetre, te anemija (Lok i sur., 2010). Većina biomarkera su zapravo

„svjedoci“ oštećenja srca kao što su CRP, troponin i BNP, a galektin-3 de Boer naziva

„krivcem“ jer ekstracelularni galektin sudjeluje u remodeliranju srčanog tkiva. Uz galektin

kao ostali „krivci“ navode se LDL i glukoza (de Boer i sur., 2009).

16

Kardiolozima je koncentracija natrijuretskih hormona korisna jer korelira s klinički

definiranim stadijima zatajenja srca prema New York Heart Association (NYHA).

Progresijom zatajenja srca opada njegova funkcija pumpe te veliku ulogu igra

neurohormonalni sustav. U prvom stadiju NYHA I minimalno je oštećena funkcija srca te se

ANP luči iz oba atrija zbog istezanja zidova atrija, a BNP zbog povećanja volumena i

ventrikularnog tlaka oslobađa se iz kardiomiocita. ANP i BNP imaju kompenzatorni efekt,

perifernu vazodilataciju i povećanje renalne eliminacije vode i natrija. Ako je minutni

volumen srca smanjen u prvom stadiju, baroreceptori inhibiraju simpatički živčani sustav i

renin-angiotenzin-aldosteron sustav (RAAS). U stadiju NYHA II poremećen je odgovor

barorefleksa, nema inhibicije simpatičkog i RAAS sustava, te također natrijuretski peptidi ne

mogu postići kompenzaciju, prevladava periferna vazokonstikcija i zadržavanje vode. U

stadiju NYHA III oštećena je i renalna funkcija, natrijutski peptidi su prisutni u visokim

koncentracijama ali bez svog fiziološkog utjecaja na bubrege. Posljedično dolazi do porasta

intravaskularnog volumena i daljnje dilatacije srca koja dodatno pogoršava srčanu funkciju.

NYHA IV stadij karakteriziran je dekompenziranim srčanim zatajenjem, kada natrijuretski

peptidi više nemaju utjecaja, a prostanglandini stvoreni u bubrezima dodatno stimuliraju

simpatički i RAAS sustav.

ANP i BNP imaju gotovo iste fiziološke uloge, ANP se predominantno nalazi u atrijima, a

BNP u ventrikulima, međutim kod zatajenja srca BNP se uz ventrikularni dio miokarda može

naći i u atrijskom dijelu miokarda, u koncentracijama višim od koncentracije ANP-a. BNP je

specifičan indikator porasta volumena u ventrikulima, porasta tlaka lijevog ventrikula i

dijastoličkog tlaka što ga čini jako dobrim pokazateljem zatajenja srca. Ostale indikacije kod

kojih se određuje su: procjena ventrikularne disfunkcije poslije infarkta miokarda,

hipertrofična opstruktivna kardiomiopatija, hipertrofija lijevog ventikula te dilatirajuća

kardiomiopatija (Thomas, 1998).

Kod zdravih ljudi koncentracije BNP-a i NT-proBNP-a su slične, dok su kod pacijenata sa

zatajenjem srca koncentracije NT-proBNP-a 2-10 puta veće od BNP-a. Iako se izlučuju u

jednakim koncentracijama, BNP ima kraće poluvrijeme života u serumu pa je posljedično i

njegova koncentracija manja. Poluvrijeme života BNP-a je 20 minuta, a NT-proBNP-a 60-120

minuta. Međutim mnogi faktori utječu na koncentraciju natrijuretskih peptida u serumu te su

nezavisni o stupnju oštećenja srca. Neki od faktora su dob, koncentracija proporcionalno

raste s dobi, spol, više koncentracije kod žena, glomerularna filtracija, koncentracije rastu s

17

bubrežnim oštećenjem, pretilost, koncentracija opada proporcionalno indeksu tjelesne mase

(engl. body mass indeks BMI) (Bielecka-Dabrowa i sur., 2008).

2005. godine Januzzi i suradnici u svojoj velikoj studiji popularno nazvanoj PRIDE (engl.

Pro-BNP Investigation of Dyspnea in the Emergency Department) istražili su važnost

testiranja NT-proBNP-a kao biljega kroničnog srčanog zatajenja. Dodatnu značajnost ovoj

studiji daje njezin velik broj ispitanika, 600 pacijenata koji su primljeni u hitni prijem s

dispnejom. Kao rezultat ove studije izašlo je nekoliko kliničkih važnih vrijednosti NT-

proBNP-a. Ako govorimo o NT-proBNP-u kao neovisnom o dobi i s visokom negativnom

prediktivnom vrijednošću (99%), 300 pg/mL je odlučujuća vrijednost za isključivanje

kroničnog srčanog zatajenja. Obzirom da koncentracija NT-proBNP značajno ovisi o dobi te

se povišena vrijednost kod starijih tumači pojavom komorbiditeta poput kroničnih strukturnih

promjena srca, akutnog koronarnog sindroma i pogoršanja bubrežne funkcije, preporučene

vrijednosti na temelju kojih se donosi klinička odluka zatajenja srca za pacijente mlađe od 50

godina iznosi >450 pg/mL s osjetljivošću 93% i specifičnošću 95%, dok za pacijente starije

od 50 godina ta vrijednost jest > 900 pg/mL s osjetljivošću 91% i specifičnošću 80% (Januzzi

i sur., 2005). Mnoge studije navode NT-proBNP kao korisniji biljeg od BNP-a. Također se

želi naglasiti utjecaj različitih faktora i komorbiditeta na samu koncentraciju te se predlaže

korekcija s obzirom na dob i vrijednosti eGFR-a. Velikim istraživanjem 2011. godine uočilo

se da koncentracija NT-proBNP –a iznenada raste nakon dobi od 50 godina, porast

koncentracije za 7 % svako desetljeće života nakon 50-te godine, pad eGFR-a za 4 % svako

desetljeće života iznad 50-te godine starosti, porast NT-proBNP-a može biti odgođen ili

ubrzan zbog prisutnosti različitih komorbiditeta (Bernstein i sur., 2011).

Određivanje BNP-a i NT-proBNP-a omogućuje bržu dijagnozu, smanjuje vrijeme provedeno

u hitnoj ambulanti te tako smanjuje troškove i potrebu za rehospitalizacijom. Internacionalna

kolaboracija NT-proBNP-a (engl. International Collaborative of NT-proBNP Study, ICON)

potvrdila je cut-off vrijednost 300 pg/ml kao neovisnu o dobi, uz negativnu prediktivnu

vrijednost od 98%, što ovu pretragu čini značajnijom u isključivanju nego u potvrdi zatajenja

srca (Ekelund, 2014.).

Filipiak i suradnici u svom istraživanju navode da simultano određivanje NT-proBNP-a i CA

125 daje najvišu prediktivnu točnost u izračunu rizika zatajenja srca. Zato se tumorski biljeg

CA 125 sve češće spominje kao neovisni prediktivni biljeg ponovne hospitalizacije srčanih

bolesnika (Filipiak i surad., 2007.).

18

NT-proBNP i CA 125 imaju različite patofiziološke mehanizme te tako daju i različite

klinički važne informacije. NT-proBNP se luči kao odgovor na ventrikularnu dilataciju

uzrokovanu povećanjem tlaka ili volumena, te je njegovo poluvrijeme života 60-120 minuta,

dok je poluvrijeme života CA 125 tjedan dana i sintetizira se u seroznim stanicama kao

odgovor na nakupljanje tekućine ili pojačano stvaranje citokina. Maksimalnu koncentraciju

CA 125 postiže trećeg dana hospitalizacije pacijenta (Santoro i sur., 2016).

Prvi rad koji je svojim rezultatima istraživanja pokazao sistemsku povezanost između

kliničkog stanja zatajenja srca, hemodinamskog stanja, prognoze pacijenta i koncentracije CA

125 objavljen je 1999. U njemu je postavljena cut-off vrijednost od 35 U/mL. Zajedno s CA

125 dokazane su i istodobno povišene koncentracije neurohormona noradrenalina i atrijalnog

natriuretskog peptida. U svim zabilježenim slučajevima progresivan porast vrijednosti CA

125 zabilježen je kod terminalnog stadija pacijenata, što uvelike pridonosi ranijoj intervenciji

koja može prevenirat progresiju bolesti i potencijalno smanjiti mortalitet (Nägele i sur., 1999).

Nägele i suradnici također navode da je IL-6 povezan sa CA 125 na način da potiče

proliferaciju stanica koje proizvode CA 125 te se kao najvjerojatnija hipoteza postavlja

činjenica da razvojem kongestije dolazi do aktivacije stanica peritonealnog mezotelijuma.

Nägele i suradnici su u svojem istraživanju dobili rezultate koji upućuju na to da je

koncentracija CA 125 povišena kod svih stupnjeva NYHA, dok su D'Aloia i sur. u svom

istraživanju na 286 pacijanata, od kojih 23 ima dilatativnu kardiomiopatiju dobili rezultate iz

kojih se zaključuje da je koncentracija CA 125 značajno povišena u NYHA stupnjevima III i

IV. Rezultati su: niti jedan pacijent sa NYHA stupnjem I nije imao koncentraciju CA 125

veću od 35 U/mL, 12% pacijenata sa stupnjem II je imalo povišen koncentracije, 84 %

pacijenata sa stupanjem III te 100 % pacijenata sa stupnjem IV je imalo značajno povišene

koncentracije CA 125. Zaključak tog istraživanja jest da koncentracija CA 125 pada s

primjenom agresivne terapije te da je povišena kod pleuralnog, perikardijalnog ili

peritonelanog nakupljanja tekućine.

Porast koncentracije CA 125 bez prisutnosti akumulacije tekućine objašnjava se hipotezom da

sintezu potiče upala i citokinska stimulacija prilikom zatajenja srca. Karaca i suradnici su u

istraživanju na pacijenatima s neishemičnom dilatirajućom kardiomiopatijom došli do

zaključka da je koncentracija CA 125 povezana sa NYHA stupnjem, reduciranom sistoličkom

i dijastoličkom funkcijom, pogresijom mitralne regrutacije i povećanom koncentracijom

BNP-a (Karaca i sur., 2012).

19

2.OBRAZLOŽENJE TEME

Današnja medicina i laboratorijska dijagnostika žele zajedničkim pristupom ubrzati

dijagnostiku bolesti u najranijoj fazi, kako bi se terapija počela pravovremeno primjenjivati.

Kod bolesti srčanog mišića, kardiomiopatija, izuzetno je važno otkriti bolest na vrijeme kako

bi se terapijom pokušala zaustaviti progresija bolesti i krajnji ishod zatajenje srca. Dispneja,

slabost te retencija tekućine glavni su simptomi srčanog zatajenja. Glavni simptomi kao

tipični ipak nisu dovoljno specifični i nužno ih je razlikovati od ostalih hitnih stanja poput

akutnog respiratornog zatajenja kod starijih osoba. Veliki napori ulažu se u otkrivanje novih

biljega za dijagnozu, prognozu, praćenje i procjenu rizika. Osim rutinskih laboratorijskih

pretraga: krvne slike, elektrolita i kreatinina brojne druge pretrage mogu pokazati stanje

funkcije srca. Kardiomiopatije su bolesti srčanog mišića u kojima se mijenja sam oblik

mišića, on postaje deblji, veći ili tvrđi te tako uvjetuje i promjene same srčane funkcije i

opskrbe tijela krvlju.

Cilj rada:

Odrediti povezanost koncentracija galektina-3, CA-125 i NT-proBNP-a u serumu

pacijenata s dijagnozom kardiomiopatija, različitog NYHA stadija.

Specifični ciljevi:

1. Odrediti koncentraciju galektina-3 u uzorcima pacijenata

2. Odrediti koncentraciju CA-125 u uzorcima pacijenata

3. Odrediti koncentraciju NT-proBNP u uzorcima pacijenata

4. Odrediti međuovisnost koncentracija galektina-3, CA 125 i NT-proBNP kod

kardiomiopatija

5. Odrediti međuovisnost NYHA stadija s koncentracijama galektina-3, CA 125 i

NT-proBNP te metodom multiple regresije postaviti matematički model za

procjenu stadija bolesti na temelju biokemijskih pokazatelja

20

3.MATERIJALI I METODE

3.1. ISPITANICI

Ispitanici su pacijenti s dijagnosticiranim jednim od oblika kardiomiopatije, u dobi od

28 do 83 godina. Ukupan broj ispitanika bio je 65, a svrstani su u grupe prema NYHA stadiju:

stadij I- 2 pacijenta, stadij II- 21 pacijent, stadij I/II- 3 pacijenta, stadij III- 10 pacijenta, stadij

II/III- 5 pacijenata, stadij IV- 15 pacijenata i stadij III/IV- 7 pacijenata.

3.2.UZORKOVANJE

Uzorkovanje se provodilo u prijemnoj ambulanti Kliničkog zavoda za kemiju KBC

Sestre milosrdnice u Zagrebu, od 8 do 10 sati, prema smjernicama o rutinskom uzorkovanju

venske krvi. Krv je uzeta u serumski spremnik, bez antikoagulansa sa crvenim čepom, tj. u

standardizirani spremnik sa podtlakom (Greiner Bione, Austrija). Uzorci su ostavljeni 30

minuta prije centrifugiranja u standardnoj laboratorijskoj centrifugi brzinom od 3500 ok/min

kroz 10 minuta. Takvi uzorci pohranjeni su na temperaturi -20 °C do postupka obrade. Uzorci

su prikupljeni u periodu od siječnja do prosinca 2015. godine.

3.3 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE CA 125

3.3.1. Priprema uzorka

Prikupljeni uzorci dostavljeni su u obliku zamrznutog alikvota odvojenog od stanica

centrifugiranog seruma, na lokaciju Klinike za tumore. Prije početka same analize dostavljeni

uzorci su odmrznuti stajanjem na sobnoj temperaturi, nakon čega su homogenizirani na

tresalici ili ručno. Analiza se provodila na analizatoru Cobas e411, tvrtke Roche, Njemačka.

3.3.2. Reagensi

Korišten je komercijalno dostupa paket reagensa naziva CA125 II (II. generacija testa) koji

sadrži:

M mikročestice obložene streptavidinom (0,72 mg/ml), konzervans

R1 anti-CA 125-At-biotin, monoklonsko protutijelo (anti-CA 125-At) obilježeno

biotinom, (mišje protutijelo M 11), 1 mg/ml, fosfatni pufer (100 mmol/L), pH 7,4,

konzervans

R2 anti-CA 125-At-Ru(byp)32+ (OC 125, mišja), monoklonsko protutijelo (anti-

CA 125-At) obilježeno rutenijevim kompleksom, (mišje protutijelo OC 125), 1

mg/L, fosfatni pufer (100mmol/L), pH 7,4, konzervans

21

OC 125 detekcijsko protutijelo, a M 11 vezajuće protutijelo, Ru(byp)32+, tris(2,2'-

bipiridil)rutenijum(II) kompleks

3.3.3. Postupak određivanja koncentracije CA 125

3.3.3.1. Kalibracija i kontrola kvalitete

Ova metoda je sljediva i standardizirana do CA 125 II RIA, Fujirebio Diagnostics.

Svaki set reagensa označen je barkodom koji sadrži specifične podatke o kalibraciji. Tako se

preuzima i definirana kalibracijska krivulja. Kalibracija se mora provesti kod svakog novog

lota, te se preporuča ponoviti nakon 8 tjedan korištenja istog lota reagensa, svakih 7 dana

korištenja istog kita reagensa te ukoliko dođe do odstupanja kontrola od preporučenih

vrijednosti.

Za kontrolu kvalitete koriste se kontrole PreciControl Tumor Marker. Preporuča se puštanje

kontrola različitih koncentracija barem jednom dnevno, jednom za svaki novi kit reagensa te

nakon kalibracije. Svaki laboratorij treba definirati svoje raspone koncentracija kontrola koji

zadovoljavaju definirane kriterije.

3.3.3.2. Načelo metode i postupak

Za određivanje koncentracije CA 125 u serumu koristila se metoda imunoanalize

elektrokemiluminescencije (engl. electrochemiluminescnce immunoassay, ECLIA).

Luminometrija jest fotometrijska tehnika u kojoj mjerimo intenzitet emitirane svjetlosti.

Podvrste luminometrije su fotoluminescencija, kemiluminescencija, elektrokoluminescencija,

fosforescencija, termoluminescencija itd. ECLIA je kombinacija kemiluminescencije i

elektroluminescencije. Kod kemiluminiscentnih metoda kao obilježivači imunokemijske

reakcije upotrebljavaju se kemiluminescentne tvari. Njihovo osnovno svojstvo jest da se

nakon pobuđivanja kemijskom reakcijom vraćaju u osnovno energijsko stanje i pritom

emitiraju fotone, a reakcija se naziva kemiluminescencijom. Kod ove metode reakcija je

izazvana električnom strujom i zato se naziva elektroluminescencija (Dodig, 2015).

Test se bazira na principu sendvič, ukupno trajanje testa je 18 minuta. U prvoj inkubaciji

pomiješa se 20 µL uzorka, monoklonalna CA 125 specifična protutijela obilježena biotinom

te monoklonalna CA 125 protutijela obilježena rutenijevim komplekom. Komponente smjese

formiraju takozvani sendvič, specifična protutijela obilježena biotinom vežu CA 125 iz

uzorka, koji je antigen, te se s njegove druge strane veže monoklonalno protutijelo obilježeno

22

rutenijevim kompleksom. Nakon dodavanja mikročestica obloženih streptavidinom, kompleks

se veže na čvrstu fazu zbog interakcija između biotina i streptavidina. Taj korak se događa

tijekom druge inkubacije. Reakcijska smjesa se aspririra, a mikročestice s vezanim

kompleksom antigena i protutijela se magnetski zadržavaju na površini elektrode. Nevezane

čestice se uklanjanu s ProCell/ProCell M smjesom pufera. Primjenom napona na elektrodu

inducira se kemiluminescentna emisija svjetla koja se mjeri uz pomoć fotomulitiplikatora.

Količina nastalog svjetla je direktno proporcionalna količini analita tj. CA 125 u uzorku.

Rezultati se dobivaju usporedbom s kalibracijskom krivuljom.

3.4. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE NT-proBNP

3.4.1 Priprema uzorka

Prikupljeni uzorci dostavljeni su u obliku zamrznutog alikvota odvojenog od stanica

centrifugiranog seruma, na lokaciju Kliničkog zavoda za kemiju, KBC Sestre milosrdnice.

Prije početka same analize dostavljeni uzorci su odmrznuti stajanjem na sobnoj temperaturi,

nakon čega su homogenizirani na tresalici ili ručno. Analiza se provodila na analizatoru

Cobas e411, tvrtke Roche, Njemačka.

3.4.2. Reagensi

Korišten je komercijalno dostupan paket reagensa Elecsys proBNP II, N-terminalni

proBNP natrijuretski peptid koji sadrži:

M mikročestice obložene streptavidinom (0,72 mg/ml), konzervans

R1 anti-NT-proBNP-biotin, monoklonska protutijela (anti-NT-proBNP protutijela)

obilježena biotinom (mišja protutijela), 1,1 µg/mL, fosfatni pufer 40 mmol/L, pH

5,8, konzervans

R2 anti-NT-proBNP-At- Ru(byp)32+ monoklonska (anti-NT-proBNP) protutijela

obilježena s rutenijevim kompleksom (ovčja protutijela), 1,1 µg/mL, fosfatni pufer

40 mmol/L, pH 5,8 i konzervans

Ru(byp)32+-tris(2,2'-bipiridil)rutenijum(II) kompleks, oba monoklonska protutijela su

usmjerena na epitope N-terminalnog dijela proBNP-a (1-76 aminokiselina).

23

3.4.3. Postupak određivanja NT-proBNP

3.4.3.1. Kalibracija i kontrola kvalitete

Ova metoda je sljediva i standardizirana do proBNP II assay (REF 03121640). Svaki

set reagensa označen je barkodom koji sadrži specifične podatke o kalibraciji. Tako se

preuzima i definirana kalibracijska krivulja. Kalibracija se mora provesti kod svakog novog

lota, te se preporuča ponoviti nakon 12 tjedan korištenja istog lota reagensa, svakih 7 dana

korištenja istog kita reagensa te ukoliko dođe do odstupanja kontrola od preporučenih

vrijednosti.

Za kontrolu kvalitete koriste se kontrole PreciControl Cardiac II. Preporuča se puštanje

kontrola različitih koncentracija barem jednom dnevno, jednom za svaki novi kit reagensa te

nakon kalibracije. Svaki laboratorij treba definirati svoje raspone koncentracija kontrola koji

zadovoljavaju definirane kriterije.

3.4.3.2. Načelo metode i postupak

Za određivanje koncentracije NT-proBNP u serumu koristila se metoda imunoanalize

elektrokemiluminescencije (engl. electrochemiluminescnce immunoassay, ECLIA). Ista

metoda je korištena i za određivanje CA 125 te je opisana u prethodnom poglavlju.

Test se bazira na principu sendvič, ukupno trajanje testa je 18 minuta. U prvoj inkubaciji

pomiješa se 20 µL uzorka u kojem je prisutan antigen, NT-proBNP, monoklonala NT-

proBNP specifična protutijela obilježena biotinom te monoklonalna NT-proBNP protutijela

obilježena rutenijevim komplekom. Komponente smjese formiraju takozvani „sendvič“,

specifična protutijela obilježena biotinom vežu NT-proBNP iz uzorka, te se s njegove druge

strane veže monoklonalno protutijelo obilježeno rutenijevim kompleksom. Nakon dodavanja

mikročestica obloženih streptavidinom, kompleks se veže na čvrstu fazu zbog interakcija

između biotina i streptavidina. Taj korak se događa tijekom druge inkubacije. Reakcijska

smjesa se aspririra, a mikročestice se magnetski zadržavaju na površini elektrode. Nevezane

čestice se uklanjanu s ProCell/ProCell M smjesom pufera. Primjenom napona na elektrodu

inducira se kemiluminescentna emisija koja se mjeri uz pomoć fotomulitiplikatora. Količina

nastalog svjetla je direktno proporcionalna količini analita tj. NT-proBNP-u u uzorku.

Rezultati se dobivaju usporedbom s kalibracijskom krivuljom.

24

3.5. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE GALEKTINA-3

3.5.1. Priprema uzorka

Prikupljeni uzorci dostavljeni su u obliku zamrznutog alikvota odvojenog od stanica

centrifugiranog seruma, na lokaciju Kliničkog zavoda za kemiju, KBC Sestre milosrdnice.

Prije početka same analize dostavljeni uzorci su odmrznuti stajanjem na sobnoj temperaturi,

nakon čega su homogenizirani na tresalici ili ručno. Analiza se provela na komercijalnom

dostupnom ELISA (engl. Enzyme-linked Immunosorbent Assay) kitu za kvantitativnu

detekciju ljudskog galektina-3.

3.5.2. Reagensi

Korišten je komercijalno dostupan paket reagensa za kvantitativno određivanje humanog

galektina-3, ELISA BMS279/4, eBioscience, SAD.

Mikrotitarska pločica obložena s monoklonalnim protutijelima na humani

galektin-3 (96 jažica)

HRP konjugat

Liofilizirani standard humanog galektina-3 (60 ng/l)

Otapalo za uzorke, Sample Diluent

Koncentrat pufera za test, Assay Buffer ( PBS sa 1% Tween 20 i 10 % BSA)

Koncentrat pufera za ispiranje, Wash Buffer ( PBS sa 1% Tween 20)

Otopina supstrata ( tetrametil.benzidin)

Prekidačka (stop) otopina (1 M fosforna kiselina)

Adhezivni film

3.5.3. Postupak određivanja koncentracije galektina-3

3.5.3.1. Načelo metode

Enzimoimunokemijska metoda, ELISA je metoda kojom se ispituje nazočnost

određenih antigena u uzorku. Reakcija se odvija na mikrotitarskoj pločici koja može biti

obložena antigenima ili protutijelima. Reakcija se zasniva na formiranju kompleksa antigen-

protutijelo i stvaranju obojenja. Vezno protutijelo je ono koje veže antigen za čvrstu podlogu,

dok je detekcijsko protutijelo ono koje je obilježeno enzimom. Dodatkom supstrata dolazi do

25

reakcije i stvaranja obojenog produkta. Najčešće korišten enzim je peroksidaza iz hrena

(engl. horseradish peroxidase, HRP) koja katalizira redukciju vodikovog peroksida. Nakon

stvaranja produkta, potrebno je zaustaviti enzimsku reakciju te očitati apsorbanciju na

definiranoj valnoj duljini. Usporedbom signala uzorka s poznatim vrijednostima iz baždarne

krivulje izračunavaju se kvantitativni rezultati (Dodig, 2015).

Na mikrotitarsku pločicu adsorbirana su protutijela, anti-humana galektin-3 protutijela.

Galektin-3 iz uzorka ili standarda veže se na protutijela adsorbirana na miktotitarske pločicu.

Nakon prve inkubacije slijedi pranje puferom kako bi se isprale nevezane biološke

komponente. Zatim se dodaje HRP konjugat, anti-galektin-3 antitijelo koje se veže na

galektin-3 koji je vezan na prvo protutijelo. Slijedi ponovno ispiranje puferom te dodavanje

otopine supstrata koja reagira s HRP-om. Taj korak je treća inkubacija. Reakcijom enzima i

supstrata nastaje obojani produkt (Slika 5.). Intenzitet obojenja jažice proporcionalan je

koncentraciji galektina-3 u jažici. Reakcija se zaustavlja dodavanjem kiseline i mjeri se

apsorbancija na 450 nm. Kalibracijska (baždarna) krivulja radi se iz 7 točaka otopina

standarda galektina-3. Na temelju kalibracijske krivulje očitavaju se rezultati, tj. koncentracije

galektina-3.

3.5.3.2. Postupak određivanja galektina-3

Koncentrat otopine za ispiranje (Wash Buffer) volumena 50 ml razrijediti s

destiliranom vodom do volumena 1000 ml

Koncentrat otopine Assay Buffer volumena 5 ml razrijediti s destiliranom vodom

do volumena 100 ml

Pripremiti standardne otopine (S1-S7) tako da u svih 7 epruveta dodamo 225 µL

Sample Diluent otopine, te u prvu epruvetu pipetiramo 225 µL rekonstruiranog

standarda, aspiriramo i prenosimo 225 µL u sljedeću epruvetu. Taj postupak

ponovimo za svih 7 epruveta, tako dobijemo serijsko razrjeđenje, 7 koncentracija

za konstruiranje standardne krivulje. Koncentracija rekonstruiranog standarda je

60 ng/ml, a raspon standarda 30 – 0,47 ng/ml

Uzorke seruma termostatirati na sobnu temperaturu

Odrediti broj mikrotitarskih jažica potrebnih za uzorke, slijepe probe i standarde

Isprati mikrotitarsku pločicu dva puta po 400 ml Wash Buffer-a

Pipetirati 100 µl Sample Diluenta u duplikatu u jažice koje predstavljaju slijepe

probe

26

Pipetrirati 100 µl svakog standarda (S1-S7) u duplikatu

Dodati 50 µl Sample Diluent otopine u sve ostale jažice

Dodati 50 µl uzorka u svaku jažicu

Pokriti mikrotitarsku pločicu adhezivnom folijom te inkubirati 1 h na tresalici za

mikrotitarske pločice

Koncentrat HRP-konjugata razrijediti s Assay Buffer-om, u omjeru 1:100

Ukloniti adhezivnu foliju i isprazniti pločicu te oprati jažice 4 puta s 400 µl

otopine Wash Buffer

Dodati 100 µl razrijeđenog HRP-konjugata u sve jažice

Pokriti mikrotitarsku pločicu adhezivnom folijom te inkubirati 1 h na tresalici za

mikrotitarske pločice

Ukloniti adhezivnu foliju i isprazniti pločicu te oprati jažice 4 puta s 400 µl

otopine Wash Buffer

Pipetirati 100 µl TMB supstrata u sve jažice

Inkubirati mikrotitarsku pločicu na sobnoj temperaturi u tamnom otprilike 30

minuta

Preporučljivo je dodati 100 µl stop otopine u sve jažice kada standard s najvećom

koncentracijom razvije tamnoplavu boju

Očitati apsorbanciju reakcijske otopine u jažicama unutar 1 h koristeći čitač

mikrotitarskih pločica na valnoj duljini 450 nm

3.5.3.3. Izračunavanje koncentracije galektina-3

Nakon očitavanja apsorbancije standarda konstruira se baždarna krivulja sa poznatim

apsorbancijama na ordinati i koncentracijama humanog galektina-3 na apscisi. Za određivanje

koncentracije humanog galektina-3 iz uzorka, potrebno je na ordinati pronaći dobivenu

apsorbanciju za uzorak i povući horizontalnu crtu te na presjecištu sa standardnom krivuljom

povući okomicu na apscisu i očitati koncentraciju za određeni uzorak. Tijekom samog ELISA

postupka, uzorci su bili razrijeđeni 1:2, stoga se koncentracije očitane iz standardne krivulje

moraju pomnožiti sa faktorom razrjeđenja (x 2).

27

Slika 5. Koraci ELISA metode određivanja galektina-3 (preuzeto iz uputa unutar kutije

reagensa, Package insert, dostupan na www.ebioscience.com )

3.6. STATISTIČKE METODE

Za prikaz rezultata i statističku obradu podataka korišteni su računalni programi Excel

2010, Microsoft Office (Microsoft USA) i MedCalc v.10.1.2. (MedCalc Software,

Mariakerke, Belgija). Korištenjem deskriptivne statistike prikazani su dobiveni podaci, a

skupovi podataka ispitani su D'Agostino-Pearsonovim statističkim testom na normalnost

raspodjele. Ukoliko distribucija podataka ne slijedi Gaussovu raspodjelu koristit ćemo

neparametrijske testove koji su analogni parnom t-testu. Za ispitivanje varijabli i njihove

sukladnosti i povezanosti korišten je statistički parametar izračunavanja korelacije, kojim se

dobiva Pearsonov (r) ili Spearmanov (ρ) koeficijent korelacije ovisno o raspodjeli podataka

koje koreliramo te njihova statistička značajnost P koja ukazuje koliko je korelacija statistički

utemeljena. Vrijednosti P <0,05 smatraju se statistički značajne. Koeficijenti korelacije

tumače se prema Coltonu (Tablica 1.). Za utvrđivanje postotka podudarnosti izmjerenih

veličina s regresijskim modelom izračunat je i koeficijent determinacije (R2).

Rezultati su prikazani grafičkim prikazom histograma kojim se zaključuje o raspodjeli

podataka, zatim pravcem regresije s jednadžbom y= a + bx, gdje „a“ predstavlja odsječak na

28

osi y u kojem pravac siječe ordinatu, a „b“ nagib pravca, tj. porast na osi y za jedinični porast

na osi x, uz naznačene granice pouzdanosti od 95 % i granice predviđenih vrijednosti od 95

%. Grafički su prikazane i raščlambe ostataka tj. reziduali koji predstavljaju mjeru rasipanja

rezultata oko pravca regresije. Prikaz reziduala omogućava i vizualnu evaluaciju dobivenih

podataka te lakše uočavanje potencijalnih vrijednosti koje jako odudaraju od ostalih, tzv.

outliers.

Metodom multiple regresije postavljen je matematički model za procjenu stadija srčanog

zatajenja u skladu s NYHA kriterijem, na temelju 3 nezavisne varijable (NT-proBNP, CA125

i galektin-3) na razini značajnosti P<0,05.

Za usporedu klinički određenih i imatematičkim modelom izračunatih NYHA stadija prema

regresijskom modelu korišten je Wilcoxonov test također na razini značajnosti P<0,05.

Tablica 1. Tumačenje koeficijenta korelacije r prema Coltonu

KOEFICIJENT KORELACIJE (r) POVEZANOST

0 do ± 0,25 nema povezanosti

± 0,26 do ± 0,50 slaba povezanost

± 0,51 do ± 0,75 umjereno do dobra povezanost

± 0,76 do ± 1 dobra do izvrsna povezanost

Tablica 2. Prikaz referentnih intervala, odnosno graničnih vrijednosti za zdravu populaciju

VARIJABLA GRANIČNA VRIJEDNOST

(CUT-OFF)

Galektin-3 < 17,7 ng/ml

NT-proBNP < 125 ng/L

CA 125 < 35 U/ml

U Tablici 2. navedene su vrijednosti varijabli koje predstavljaju referentne intervale ili cut-off

vrijednosti dobivene iz literature ili prakse. Za NT-proBNP mnogi autori predlažu više

vrijednosti, < 300 ng/L (Januzzi i sur., 2005).

29

4.REZULTATI I RASPRAVA

4.1.REZULTATI

4.1.1 Prikaz rezultata kroz deskriptivnu statistiku

U istraživanju je sudjelovalo 65 bolesnika koji boluju od kardiomiopatije. Na njihovim

uzorcima provedena su mjerenja CA 125, NT-proBNP i galektina-3.

Slika 6. Grafički prikaza histograma koji prikazuju raspodjelu podataka mjerenja

Iz prikaza histograma učestalosti na Slici 4. vidi se da podaci za CA 125 i NT-proBNP ne

slijede normalnu raspodjelu. Krivulje su nagnute u desnu stranu. Podaci za galektin-3 slijede

normalnu razdiobu.

30

Tablica 3. Statistički opis ispitivane skupine te izmjerenih koncentracija CA 125, NT-proBNP

i galektin-3

Varijable CA 125 (

U/mL )

NT-proBNP

(ng/L)

Galektin-3 (

ng/mL)

Starosna dob

ispitivane

skupine

N 65 60 60 65

Srednja

vrijednost

120,5 4621,1 9,8 54,6

95 % CI 73,6 – 167,5 3107,3 – 6135,0 8,104 – 11,5 51,7 – 57,5

SD 189,6 5860,1 6,6 11,7

Medijan 34,4 2853,5 8,7 56,0

95 % CI 22,2 – 58,3 1495,0 – 3856,9 6,2 – 12,2 50,1 – 59,9

Minimum 7,0 124 0,4 28,0

Maksimum 949,8 35000,0 29,8 83,0

5-95 percentil 9,1 – 512,2 505,0 – 15366,5 1,2 – 21,0 34,5 – 73,3

P < 0,0001 < 0,0001 0,0890 0,8591 N- broj uzoraka; P – vjerojatnost normalne distribucije testirane po D'Agostino-Pearsononu; statistička značajnost na razini

P<0,05; SD – standardna devijacija; 95% CI – 95% interval pouzdanosti

U Tablici 3. prikazan je skup podataka ispitivane skupine za izmjerene vrijednosti CA 125,

NT-proBNP i galektin-3. Statističkom obradom podataka prikazali smo broj uzorka (N),

srednju vrijednost, 95 %-tni interval pouzdanosti aritmetičke sredine (95% CI), standardnu

devijaciju (SD), medijan, 95 %-tni interval pouzdanosti za medijan (95% CI), minimum i

maksimum kao mjeru rasapa podataka, 5-95 percentil koji predstavljaju 5-95 % distribucije i

parametar P koji predstavlja statistički značajnu povezanost. Distribucija podataka testirana je

D'Agostino-Pearsonovim statističkim testom kojim dobivamo parametar P. Ovaj test zapravo

testira statističku značajnost razlike između teorijske i empirijske raspodjele. Nul-hipoteza

takvog testa je da razlika ne postoji, odnosno da ispitivana raspodjela slijedi normalnu tj.

teorijsku raspodjelu. Pokaže li se da postoji statistički značajna razlika, tada zaključujemo da

naša empirijska raspodjela nije normalna. Testiranje je pokazalo da se distribucije podataka za

CA 125 i NT-proBNP značajno razlikuju od normalne raspodjele (P <0,05), dok se raspodjela

podataka za galektin-3 (P= 0,089) podudara sa normalnom raspodjelom. Te podatke smo

vizualno provjerili histogramima učestalosti (Slika 5.). Podatak o normalnosti uvjetuje izbor

statističkog testa. Normalno raspodijeljene podatke testiramo tzv. parametrijskim testovima,

dok raspodjele koje nisu normalne testiramo neparametrijskim testovima. Dakle, u daljnjoj

statističkoj obradi podataka korist ćemo parametrijske i neparametrijske testove.

31

Tablica 4. Statistički opis NYHA stadija ispitivane skupine i izračunatog NYHA stadija

ispitivane skupine

Varijabla NYHA NYHA-C

N 64 54

Srednja

vrijednost

2,77 2,73

95 % CI 2,54-2,99 2,57-2,89

SD 0,91 0,36

Medijan 2,75 2,6

95 % CI 2,0- 3.0 2,38-2,77

Minimum 1 2,04

Maksimum 4 5,18

P 0,1879 <0,0001 N- broj uzoraka; P – vjerojatnost normalne distribucije testirane po D'Agostino-Pearsononu; statistička značajnost na razini

P<0,05; SD – standardna devijacija; 95% CI – 95% interval pouzdanosti, NYHA – C – kalkulirani NYHA stadij mutiplom

regresijom

U Tablici 4. prikazani su podaci opisne statistike za NYHA stadije, srednja vrijednost naše

ispitivane skupine jest 2,77 te ona slijedi normalnu distribuciju (P=0,1979).

32

4.1.2. Međuovisnost CA 125 i NT-proBNP

4.1.2.1. Korelacija CA 125 i NT-proBNP

Statističkom obradom podataka 60 uzoraka izračunat je Spearmanov koeficijent korelacije ρ=

0,64 (P<0,0001, 95% CI: 0,46-0,77) što prema Coltonu označava umjerenu do dobru

povezanost. Računali smo Spearmanov koeficijent jer je on neparametrijska inačica

koeficijenta korelacije i koristi se kada niti jedna od promatranih varijabli nema normalnu

raspodjelu.

Tablica 5. Korelacija CA 125 i NT-proBNP

N 60

ρ (rho) 0,64

Kategorija povezanosti prema Coltonu umjereno do dobra

povezanost

95 % CI 0,46 do 0,77

P <0,0001

N-broj uzoraka, ρ - Spermanov koeficijent korelacije, CI – interval pouzdanosti, P-statistička značajnost na razini P<0,05

U Tablici 5. prikazani su podaci dobiveni korelacijskim postupkom. N je broj uzoraka, ρ

predstavlja Spearmanov koeficijent korelacije, 95% interval pouzdanosti (CI) i P prikazuje

statističku značajnost.

33

4.1.2.2. Regresijski model za povezanost CA 125 i NT-proBNP

Rezultati koje smo dobili za CA 125 i NT-proBNP ne slijede Gaussovu krivulju, no

logaritamskom preobrazbom rezultata za NT-proBNP dobili smo normalnu raspodjelu

podataka (P=0,81), pa možemo pristupiti regresijskom modelu, koji zahtjeva da ovisna (y)

varijabla slijedi normalnu raspodjelu. Regresijom kao statističkom metodom predviđamo

vrijednost jedne varijable iz vrijednosti druge.

Koeficijent determinacije (R2) iznosi 0,19 što označava da 19 % mjerenja u potpunosti slijedi

navedeni regresijski model. Pravac regresije je log(y)= 3,2723 + 0,001121s odsječkom na osi

y, „a“, koji iznosi 3,2723, a nagib pravca, „b“ iznosi 0,001121.

U grafičkom prikazu dijagrama regresije, neovisna varijabla (x) je na horizontalnoj osi, dok

vertikalnu os predstavlja ovisna varijabla (y). Svaka točka u grafičkom prikazu predstavlja

jedan rezultat, x vrijednost i f(x) vrijednost izračunatu iz jednadžbe regresijskog pravca.

Slika 6. Pravac regresije s prikazanim granicama pouzdanosti i granicama predviđenih

vrijednosti za povezanost CA 125 i NT-proBNP

0 200 400 600 800 1000

1000000

100000

10000

1000

100

CA 125 (U/ml)

NT

-pro

BN

P (

ng

/L)

34

Na Slici 6. može se primjetiti da se veoma mali broj podataka nalazi unutar granica

pouzdanosti.

Slika 7. Točkasti dijagram reziduala NT-proBNP u regresijskom modelu povezanosti NT-

proBNP i CA 125

Slika 7. prikazuje raščlambu ostataka (reziduala) kojima se ocjenjuje uspješnost regresijske

jednadžbe. Reziduali su mjera rasipanja rezultata oko pravca regresije, dakle NT-proBNP

(ng/L) – F (x) predstavlja razliku izmjerene vrijednosti NT-proBNP-a i izračunate vrijednosti

prema regresijskom modelu. Vidimo da dosta dobivenih rezultata u većoj mjeri varira oko

pravca regresije.

0 200 400 600 800 1000

100

10

1

0,1

0,01

CA 125 (U/ml)

NT

-pro

BN

P (

ng

/L)

- F

(x)

35

4.1.3. Međuovisnost CA 125 i galektina-3

4.1.3.1.Korelacija CA 125 i galektina-3

Statističkom obradom podataka 60 uzoraka izračunat je Pearsonov koeficijent korelacije

r=0,23, (P= 0,0722, 95 % CI: -0,02 -0,46 ) što prema Coltonu nema povezanosti, a ujedno

nema ni statističke značajnosti. Računali smo Pearsonov koeficijent korelacije jer galektin-3

slijedi normalnu raspodjelu, a CA 125 smo prilagodbom logaritmiranjem sveli na normalnu

raspodjelu te smo mogli koristiti inačicu koeficijenta korelacije za parametrijske tetstove.

Tablica 6. Korelacija CA 125 i galektin-3

N 60

Koeficijent korelacije r 0,23

Kategorija povezanosti prema Coltonu nema povezanosti

95 % CI -0,02 do 0,46

P 0,0722

N-broj uzoraka, r - koeficijent korelacije, CI – interval pouzdanosti, P-statistička značajnost na razini P<0,05

U Tablici 6. prikazani su podaci dobiveni korelacijskim postupkom. N je broj uzorak, r

predstavlja Pearsonov koeficijent korelacije, 95 %-tni interval pouzdanosti (CI) i P statističku

značajnost.

36

4.1.3.2. Regresijski model za povezanost CA 125 i galektina-3

Rezultati za galektin-3 slijede Gaussovu krivulju te možemo pristupiti regresijskom modelu.

Jedini uvjet jest da galektin-3 zbog normalne raspodjele bude neovisna varijabla (y).

Koeficijent determinacije (R2) iznosi 0,02 što označava da tek 2 % mjerenja potpunosti slijedi

navedeni regresijski model povezanosti galektina-3 i CA 125. Pravac regresije je y= 9,2304 +

0,004984x , odsječak na osi y, „a“ iznosi 0,2304, a nagib pravca, „b“ iznosi 0,004984.

Slika 8. Pravac regresije s prikazanim granicama pouzdanosti i granicama predviđenih

vrijednosti za povezanost galektin-3 i CA 125

Na Slici 8. može se primjetiti da se veoma mali broj rezultata nalazi unutar granica

pouzdanosti.

0 200 400 600 800 1000

30

25

20

15

10

5

0

-5

CA 125 (U/ml)

GA

LE

KT

IN-3

(n

g/m

l)

37

Slika 9. Točkasti dijagram reziduala galektina-3 u regresijskom modelu povezanosti

galektina-3 i CA 125

Slika 9. prikazuje raščlambu ostataka (reziduala) kojima se ocjenjuje uspješnost regresijske

jednadžbe. Reziduali su mjera rasipanja rezultata oko pravca regresije, dakle galektin-3

(ng/ml) – F (x) predstavlja razliku izmjerene vrijednosti galektina-3 i izračunate vrijednosti

prema regresijskom modelu. Vidimo da većina dobivenih rezultata u većoj mjeri varira oko

pravca regresije.

0 200 400 600 800 1000

20

15

10

5

0

-5

-10

CA 125 (U/ml)

GA

LE

KT

IN-3

( n

g/m

l) -

F(x

)

38

4.1.4. Međuovisnost NT-proBNP i galektina-3

4.1.4.1. Korelacija NT-proBNP i galektina-3

Statističkom obradom podataka 55 uzoraka izračunat je Pearsonov koeficijent korelacije

r=0,30, (P= 0,0280, 95 % CI: 0,03 – 0,52) što prema Coltonu označava slabu povezanost, ali

statistički značajnu. Računali smo Pearsonov koeficijent korelacije jer galektin-3 slijedi

normalnu raspodjelu, a NT-proBNP smo prilagodbom logaritmiranjem sveli na normalnu

raspodjelu te smo mogli koristiti inačicu koeficijenta korelacije za parametrijske tetstove.

Tablica 7. Korelacija NT-proBNP i galektin-3

N 55

Koeficijent korelacije r 0,30

Kategorija povezanosti prema Coltonu slaba povezanost

95 % CI 0,03 do 0,52

P 0,0280

N-broj uzoraka, r - koeficijent korelacije, CI – interval pouzdanosti, P-statistička značajnost na razini P<0,05

U Tablici 7. prikazani su podaci dobiveni korelacijskim postupkom. N je broj uzoraka, r

predstavlja Pearsonov koeficijent korelacije, 95 %-tni interval pouzdanosti (CI) i P statističku

značajnost.

39

4.1.4.2. Regresijski model za povezanost NT-proBNP i galektina-3

Rezultati za galektin-3 slijede Gaussovu krivulju te možemo pristupiti regresijskom modelu.

Jedini uvjet jest da galektin-3 zbog normalne raspodjele bude neovisna varijabla (y).

Koeficijent determinacije (R2) iznosi 0,04 što označava da 4 % mjerenja u potpunosti slijedi

navedeni regresijski model povezanosti galektina-3 i NT-proBNP. Pravac regresije je y=

8,8232 + 0,0002203 x , odsječak na osi y, „a“ iznosi 8,8232, a nagib pravca, „b“ iznosi

0,0002203.

Slika 10. Pravac regresije s prikazanim granicama pouzdanosti i granicama predviđenih

vrijednosti za povezanost galektin-3 i NT-proBNP

Na Slici 10. može se primjetiti da veoma mali broj rezultata nalazi unutar granica

pouzdanosti.

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

35

30

25

20

15

10

5

0

-5

NT-proBNP (ng/L)

GA

LE

KT

IN-3

(n

g/m

l)

40

Slika 11. Točkasti dijagram reziduala galektina-3 u regresijskom modelu povezanosti

galektina-3 i NT-proBNP

Slika 11. prikazuje raščlambu ostataka (reziduala) kojima se ocjenjuje uspješnost regresijske

jednadžbe. Reziduali su mjera rasipanja rezultata oko pravca regresije, dakle galektin-3

(ng/ml) – F (x) predstavlja razliku izmjerene vrijednosti galektina-3 i izračunate vrijednosti

prema regresijskom modelu. Vidimo da većina dobivenih rezultata u većoj mjeri varira oko

pravca regresije.

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

20

15

10

5

0

-5

-10

NT-proBNP (ng/L)

GA

LE

KT

IN-3

(n

g/m

l) -

F(x

)

41

4.1.5. Međuovisnost NYHA stadija i galektina-3, NT-proBNP i CA 125

Statističkom obradom podataka izračunati su Pearsonovi koeficijenti korelacije. Određena je

kategorija povezanosti tumačena prema Coltonu. Podatke za CA 125 i NT-proBNP

logaritmiranjem smo prilagodili na normalu razdiobu.

Tablica 8. Korelacija NYHA stadija i galektina-3, NT-proBNP i CA 125

Galektin-3 NT-proBNP CA-125

N 59 59 64

Korelacijski

koeficijent (r)

0,28

0,77

0,59

P 0,03 <0,0001 <0,0001

95 % CI 0,03019-0,5035 0,6462-0,8598 0,4076-0,7327

Kategorija

povezanosti prema

Coltonu

slaba

dobra do izvrsna

umjerena do dobra

N – broj uzoraka, r – koeficijent korelacije, P-statistička značajnost na razini P<0,05, CI – interval pouzdanosti

U Tablici 8. prikazani su podaci dobiveni korelacijskim postupkom. N je broj uzoraka,

r predstavlja Pearsonov koeficijent korelacije, 95% interval pouzdanosti (CI) i P prikazuje

statističku značajnost.

42

4.1.6. Multipla regresija

Multipla regresija je statistička metoda koja nam omogućuje predviđanje jednog kriterija,

zavisne varijable iz više prediktora, tj. nezavisnih varijabli. U multiploj regresiji svi prediktori

ne moraju imati jednaku težinu u predviđanju vrijednosti kriterija. To znači da promjena u

jednom prediktoru može dovesti do puno veće promjene u vrijednosti kriterija nego promjena

u nekom drugom prediktoru.

Tablica 9. Opis multiple regresije NYHA kao zavisne varijable i NT-proBNP, CA 125 i

galektinom-3 kao nezavisnih varijabli

MULTIPLA REGRESIJA Zavisna varijabla NYHA

N 54

R2 0,46

R2 prilagođen 0,42

Multipli korelacijski

koeficijent

0,68

Rezidualna standardna

devijacija

0,67

REGRESIJSKA

JEDNADŽBA

Nezavisne varijable

NT-proBNP CA 125 Galektin-3

Koeficijent 0,00007 0,0015 0,0280

P 0,0001 0,0041 0,0731

ANALIZA VARIJANCE

F-vrijednost 14,28

P <0,001

Koeficijent korelacije svake

pojedinačne nezavisne

varijable (zero order)

NT-proBNP CA 125 Galektin-3

0,56 0,44 0,32

N-broj uzoraka; R2koeficijent determinacije, P-statistička značajnost na razini P<0,05, F-test

Koeficijent determinacije prikazuje podudarnost izmjerene veličine s regresijskim modelom.

Prilagođeni koeficijent determinacije jest koeficijent determinacije koji je prilagođen broju

nezavisnih varijabli u regresijskom modelu. Multipli korelacijski koeficijent pokazuje koliko

se rezultati grupiraju oko regresijskog pravca. Ako je P vrijednost jednog ili više

koeficijenata, kod regresijske jednadžbe, manji od 0,05, zaključujemo da su ti koeficijenti

statistički značajni i da te nezavisne varijable pokazuju nezavisni utjecaj na zavisnu varijablu.

Analizom varijance odnosno F-testom i P vrijednošću <0,05 odbijamo hipotezu da ne postoji

linearna ovisnost. Prema Tablici 9. vidimo da je koeficijent determinacije 0,46 što znači da 46

% mjerenja u potpunosti slijedi navedeni regresijski model. Koeficijenti regresijske jednadžbe

za CA 125 i NT-proBNP su statistički značajni, a analiza varijance također pokazuje

43

statističku značajnost. Galektin-3 ima najmanji doprinos u predviđanju NYHA stadija

(P=0,073) dok najznačajniji doprinos ima NT-proBNP i CA 125 (P=0,0001 i P=0,0041).

Regresijska jednadžba za izračun NYHA stadija na temelju koncentracija NT-proBNP, CA

125 i galektina-3:

NYHA= 1,9880+0,00007*[NT-proBNP]+0,0015*[CA125]+0,0280*[Galektin-3]

Konstanta – 1,9880, koeficijenti korelacije – 0,00007, 0,0015, 0,0280, [x] – koncentracije za NT-proBNP u ng/L, za CA 125

u U/ml, za galektin-3 u ng/mL

4.1.6.1. Wilcoxonov test

Nakon što smo multiplom regresijom postavili matematički model izračunavanja NYHA

stadija, pristupili smo Wilcoxonovu testu, kako bi usporedili klinički ustanovljene i izračunate

NYHA stadije. Ovaj test je neparametrijska inačica t-testa i koristili smo ga jer izračunati

NYHA stadiji ne slijede normalu razdiobu, niti se logaritmiranjem mogu svesti na normalu

razdiobu (Tablica 4.). P vrijednost dobivena Wilcoxonovim testom iznosi 0,78 i označava da

ne postoji značajna razika između medijana klinički utvrđenih i izračunatih NYHA stadija, što

također možemo zaključiti prema Slici 12.

Slika 12. Usporedba određenih NYHA stadija i NYHA stadija izračunatih prema

regresijskom modela (NYHA-C)

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

NYHA NYHA-C

44

4.2. RASPRAVA

Kardiomiopatije su široka skupina srčanih bolesti koje svojom kompleksnošću

uvjetuju prije svega kvalitetu življenja oboljelih pacijenata, ali i postavljaju velike izazove

kardiolozima u samoj dijagnostici, praćenju i prilagodbi terapije. Napredovanjem znanja,

dostupnosti tehnologije i samim povezivanjem uzročno-posljedičnih veza povećao se broj

dostupnih biljega bolesti. U ovom istraživanju nisu uzeti parametri bolesti poput različiti

ehokardiografskih mjerenja funkcije srca kao pumpe, također su izostavljeni podaci o

komorbiditetima i terpiji. Cilj ovog rada bio je pokazati povezanost kombinacije triju biljega,

dobro utvrđenog pokazatelja volumne opterećenosti srca, NT-proBNP-a, novo istraživanog

biljega CA 125, koji svojim tezama povećanja kod srčanih bolesti postaje velika karika

dijagnoze cijelog procesa te galektina-3, također novijeg biljega prozvanog modulatorom

srčanog remodeliranja (de Boer i sur., 2009).

Naše istraživanje obuhvatilo je 65 pacijenata koji boluju od kardiomiopatija, nakon

određivanja CA 125, NT-proBNP i galektina-3 pristupili smo statističkoj obradi dobivenih

podataka. Prvo što smo mogli uočiti jest da samo galektin-3 slijedi normalnu raspodjelu, dok

smo NT-proBNP i CA 125 logaritmiranjem prilagodili normalnoj razdiobi (Slika 6. i Tablica

3.). Daljnje testiranje prilagodili smo pravilima korelacije i regresije, što je objašnjeno u

prethodnom poglavlju uz prikazane rezultate. Međuovisnost CA 125 i NT-proBNP-a prikazali

smo računanjem Spermanovog koeficijenata korelacije (neparamterijski koeficijent

korelacije) koji iznosi 0,64, što se prema Coltonu tumači kao umjerena do dobra povezanost.

(Tablica 5.) Zatim smo regresijskim modelom željeli vidjeti koliko jednu varijablu možemo

opisati drugom, te smo dobili koeficijent determinacije (R2) 0,19 što označava da 19 %

mjerenja ukazuje na povezanost CA 125 i NT-proBNP. Svi pravci regresije prikazani su s

95% granicama pouzdanosti i 95% granicama predvidljivosti koje predstavljaju raspon

vrijednosti rezultata unutar kojeg s određenom sigurnošću nalazimo predviđene rezultate. Na

Slici 6. uočava se da veoma mali broj rezultata ulazi u interval pouzdanosti. Prije pristupanja

regresijskom modelu podatke za NT-proBNP smo logaritmiranjem prilagodili normalnoj

raspodjeli jer je nužno da barem jedna varijabla kod regresijske usporedbe bude pod

normalnom distribucijom. Zadnji parametar koji smo računali kod prikazivanja međuovisnosti

jesu reziduali, kao mjera rasipanja oko pravca regresije. Na Slici 7. vidimo da dosta dobivenih

rezultata u većoj mjeri varira oko pravca regresije. Sljedeća međuovisnost koju smo prikazali

jest međuovisnost CA 125 i galektina-3. U prvom koraku smo prikazali njihovu korelaciju

preko Pearsonovog koeficijenta korelacije (parameterijski koeficijent korelacije) koji iznosi

45

0,23 i tumači se kao da nema povezanosti među varijablama (Tablica 6.). Regresijskim

modelom dobili smo koeficijent determinacije (R2) 0,02 što označava da 2 % mjerenja

ukazuje na povezanost galektina-3 i CA 125. Na Slici 8. vidimo da se vrlo mali broj

dobivenih rezultata ulazi unutar granica pouzdanosti. U zadnjem koraku prikazali smo

reziduale i uočavamo jako rasipanje rezultata oko pravca regresije (Slika 9.). Na kraju smo

prikazali međuovisnost NT-proBNP i galektina-3. Korelaciju smo prikazali Pearsonovim

koeficijentom korelacije koji je iznosio 0,30 i prema Coltonu označava slabu povezanost

(Tablica 7.). Pristupanjem regresijskom modelu dobili smo koeficijent determinacije (R2) 0,04

što označava da 4 % mjerenja ukazuje na povezanost galektina-3 i NT-proBNP. Na Slici 10.

uočavamo da se veoma mali broj rezultata nalazi unutar granica pouzdanosti, dok prikazom

reziduala na Slici 11. još bolje uočavamo rasipanje rezultata oko pravca regresije, vidimo da

većina dobivenih rezultata u većoj mjeri varira oko pravca regresije.

Tablica 8. prikazuje međuovisnost NYHA stadija kao glavnog klasifikacijskog sustava kod

pacijenata sa progresivnim srčanim oboljenjima koji vode zatajenju srca s galektinom-3, NT-

proBNP i CA 125. P vrijednost je mjera statističke značajnosti, manja je od 0,0001 za

korelacijski koeficijent između NYHA stadija i NT-proBNP i CA 125 i time dokazuje njihovu

značaju korelaciju. NYHA stadij pokazuje izvrsnu povezanost sa NT-proBNP. Slabu

povezanost pokazuje sa galektinom-3, međutim u našoj ispitivanoj skupini manji broj

pacijenata ima vrijednosti galektina iznad preporučene vrijednosti te zato moramo kritički

postupiti tumačenju dobivenih statističkih rezultata. CA 125 je prognostički biljeg koji raste u

skladu s pogoršanjem srčane bolesti te se često navodi kao prediktivni biljeg terminale faze ili

rehospitalizacije (Bielecka-Dabrowa i sur., 2008). Zaključujemo da vrijednosti CA 125 prate

NYHA funkcionalnu klasifikaciju, što smo i potvrdili koeficijentom korelacije (r) 0,59

(Tablica 8.), koji predstavlja dobru do umjerenu povezanost tumačenu prema Coltonu

(Tablica 1.). NYHA stadij se objašnjava između ostalog variranjem i kompenzatornim

mehanizmima natrijuretskih peptida, što nam potvrđuje njihovu jako dobru međuovisnost

(r=0,77). Galektin-3 se sve više istražuje kao medijator razvoja srčanog oštećenja te je

potrebno njegovu međuovisnost s NYHA klasifikacijom dodatno istražiti kao i njegovu

varijabilnost u lučenju. Neke studije pokazuju povezanost povišene koncentracije galektina-3

s terminalnim stadijima NYHA klasifikacije, višim koncentracijama kreatinina i višim

koncentracijama NT-proBNP. Galektin-3 ima visoku prediktivnu vrijednost kao prognostički

biljeg preživljenja, te u kombinaciji s natrijuretskim peptidima povećava vrijednost kliničke

važnosti mjerenja natrijuretskih peptida (Hrynchyshyn i sur., 2013).

46

Tablica 9. prikazuje opis multiple regresije NYHA kao zavisne varijable i NT-proBNP, CA

125 i galektin-3 kao nezavisnih varijabli. Koeficijent determinacije je 0,46 što znači da 46 %

mjerenja u potpunosti slijedi navedeni regresijski model. Koeficijenti za NT-proBNP i CA

125 dobiveni iz regresijske jednadžbe pokazuju statističku značajnost jer im je P vrijednost

<0,05. Zato zaključujemo da nezavisne varijable pokazuju nezavisni utjecaj na zavisnu

varijablu. Multipli korelacijski koeficijent pokazuje koliko se podaci rasipaju oko pravca

regresije, on iznosi 0,68 što označava umjereno do dobru povezanost. Analizom varijance

(P<0,001) dokazali smo statističku značajnost multiplog korelacijskog koeficijenta. Također

vidimo da najveći koeficijent korelacije ima NT-proBNP, a najmanji galektin-3.

Wilcoxonovim testom usporedili smo određene NYHA stadije s izračunatim NYHA stadijima

prema regresijskom modelu i zaključili da ne postoji statistički značajna razlika između te

dvije varijable (P=0,78) (Slika 12.). Ukoliko koristimo sve tri varijable zajedno, za procjenu

odnosno izračun NYHA stadija, možemo očekivati dobru korelaciju s pravim, klinički

određenim NYHA stadijem.

Analiziranjem ovih podataka uočavamo slabu povezanost između biljega. Možemo je tumačiti

zbog manjka podataka koje imamo o samim pacijentima, ili možemo razmišljati o

patofiziološkim pozadinama kardiomiopatija te njihovih najčešćih ishoda, zatajenja srca. Kao

što je već navedeno najbolju međuovisnost odnosno povezanost, tumačenu prema Coltonu

pokazuju CA 125 i NT-proBNP. Ako razmišljamo o patofiziologiji možemo pretpostaviti da

njihove koncentracije rastu u skladu s progresijom bolesti, jer su oni takozvani svjedoci same

progresije. CA 125 kao dobro poznati tumorski biljeg, sve češće se koristi kao biljeg čiji

porast uočavamo kod nakupljanja tjelesnih tekućina, poput ascitesa, pleuralnog i

perikardijalnog izljeva, te kod citokinske aktivacije mezentelijalnih stanica. Dakle, njegova

uloga nije dovoljno razjašnjena, međutim koncentracija mu raste kao posljedica samih

događanja koji su doveli do komplikacija, promjene funkcije srca kao pumpe. Varol i

suradnici u svom istraživanju hipertrofične kardiomiopatije sa zatajenjem srca dobro opisuju

dosadašnje pretpostavke. Ključno je istaknuti da u njihovom istraživanju nije bilo pacijenata s

perikardijalnim niti pleuralnim nakupljanjem tekućine kao niti s ascitesom, također su imali i

kontrolnu skupinu te su svi bolesnici imali dijastoličku disfunkciju. Koncentracije CA 125

bile su znatno više kod bolesnika u odnosu na kontrolnu skupinu, te su koncentracije rasle sa

napredovanjem NYHA stadija. Važnost ovog istraživanja jest upravo zbog izbora pacijenata

bez nakupljanja tjelesnih tekućina. Dokazane su povišene vrijednosti CA 125 kod nemalignih

bolesti, posebno kod bolesti sa seroznim nakupljanjem; kronične jetrene bolesti, nefrotskog

47

sindroma, kronične bubrežne bolesti i hemodijalize. To otvara prostor za drugu hipotezu

nastanka CA 125 koja tumači citokinsku aktivaciju i stimulaciju samih stanica (Varol i

sur.,2007). Vrijednosti CA 125 koreliraju sa vrijednostima TNF-α, IL-6 i IL-10 kod pacijenata

sa zatajenjem srca (Kosar i sur.,2006). Dodatna prednost CA 125 jest u njegovom poluživotu

od tjedan dana što ga čini klinički značajnim u smislu poboljšanja terapijskog tretmana. Osim

dugog poluživota, prednosti su u njegovoj lako dostupnoj i dobro standardiziranoj analizi koja

ne zahtjeva veliki financijski izdatak, njegova koncentracija ne podliježe tolikim varijacijama

već dobro prati patofiziološku progresiju bolesti (Miñana i sur., 2010). Kod naših pacijenata

uočavamo povišene vrijednosti CA 125, sa srednjom vrijednošću od 120 U/ml. Ako

zbrojimo sve navedno CA 125 ima mnoštvo pozitivnih argumenata koji potvrđuju njegov

status kao novog biokemijskog biljega bolesti koja vodi do zatajenja srca te ima kliničku

vrijednost i potencijalnu iskoristivost za praćenje progresije i poboljšanje terapije.

U gotovo svoj dostupnoj literaturi i brojim istraživanjima dokazano je paralelno povećanje

vrijednosti CA 125 i natrijuretskih peptida u serumu. I naše istraživanje pokazuje njihovu

umjereno do dobru povezanost (Tablica 5.). Međutim regresijskim modelom dobili smo

koeficijent determinacije 0,19 što govori da samo 19 % mjerenja ukazuje na njihovu

povezanost, tj. da se 19 % vrijednosti jedne varijable može točno izračunati kroz vrijednosti

druge varijable, koristeći jednadžbu regresijskog pravca. Dosta nizak postotak tumačimo

prilagodbom na normalnu razdiobu logaritmiranjem kako bismo uopće mogli pristupiti

regresijskom modelu. Od tri biljega koje smo uzeli u naše istraživanje jedino je NT-proBNP

dokazani biljeg koji se koristi u kliničkoj praksi kod različitih uzroka srčane insuficijencije,

akutnog koronarnog sindroma te ventrikularne disfunkcije. NT-proBNP i BNP značajno

koreliraju sa NYHA stadijem, debljinom miokarda, indeksom mase lijevog ventrikula,

dimenzijama lijevog atrija te dijastoličkom funkcijom. Vrijednosti NT-proBNP u našoj

ispitivanoj skupini značajno variraju sa standardnom devijacijom od 5860 ng/L, a srednja

vrijednost uvelike premašuje granične vrijednosti (cut-off vrijednosti) (Tablica 2. i 3.). Zhang

i suradnici u svom istraživanju hipertrofične kardiomiopatije navode da osim što su povišene

vrijednosti NT-proBNP-a kod ove dijagnoze, također da pozitivno koreliraju sa simptomima

zatajenja srca, jačinom hipertrofije, dijastoličkom disfunkcijom lijevog ventrikula te imaju

prognostičku vrijednost u smislu predviđanja pojave terminalne faze i ostalih dugoročnih

događaja povezanih sa zatajenjem srca. Fibroza miokarda je glavno obilježje hipertrofične

kardiomiopatije, međutim točan mehanizam povezanosti povišenih natrijuretskih peptida i

fibroze srca ostaje nedovoljno razjašnjen. Prva pretpostavka govori o njihovom pozitivnom i

48

simultanom odnosu koji prati opseg ventrikularne hipertrofije. Fibroza miokarda povećava

krutost komora i dovodi do pasivne dijastoličke disfunkcije koja rezultira povećanjem

koncentracije natrijuretskih peptida. Fibroblasti u srcu vjerojatno luče natrijuretske peptide

kao kompenzatorni mehanizam i odgovor na progresiju fibroze (Zhang i sur., 2016).

Treći biljeg koji smo istraživali jest galektin-3 kao novi modulator srčanog remodeliranja jer

sudjeluje u brojim procesima poput apoptoze, fibroze i upale. U našoj ispitivanoj skupini

srednja vrijednost jest 9,8 ng/ml što ne prelazi preporučenu gornju granicu tj. cut-off

vrijednost (Tablica 2. i 3.). Ipak manji broj pacijenta ima povišene vrijednosti, koje najčešće

prate i povišene vrijednosti ostala dva biljega CA 125 i NT-proBNP. Prema dostupnoj

literaturi odnos galektina-3 i NT-proBNP značajno varira, najčešće pozitivno koreliraju, ili

jedan povećava kliničku korisnost drugog biljega (Hrynchyshyn i sur., 2013). Proučavanjem

patofizioloških procesa zatajenja srca otkriveno je da veliku ulogu u samom razvoju ima i

upala, koja je u svojoj podlozi povezana s aktivacijom makrofaga i razvojem fibroze.

Galektin-3 veže broje ligande kojima sudjeluje u patofiziološkim procesima, prije svega to su

laminin, integrini i kolagen. Također sudjeluje u upalnom odgovoru stanica, potiče

kemoatrakciju monocita i hiperprodukciju makrofaga, što se povezuje i s pojavom

aterosklerotskih plakova. Galektin-3 je prediktor potencijalnih ili budućih kardiovaskularnih i

fibrotičnih procesa. U nekim studijama pripisuju mu prediktivnu vrijednost smrtnosti u

generalnoj populaciji. Galektin-3 jako dobro korelira sa srčanim biljezima izvanstaničnog

matriksa. MMP-2 ima veću kliničku vrijednost od galektina-3 u predviđanju ishoda pacijenata

sa zatajenjem srca (Chang i sur.,2014).

Zatajenje srca jest jedan od glavnih uzroka smrti u svijetu. Iako ne postoji idealan biokemijski

biljeg koji ima 100 % prediktivnu vrijednost sve se više istražuje i testira kombinacija biljega

koji sudjeluju u imunološkom sustavu, proupalnim aktivacijama i endotelnoj funkciji. Berezin

i suradnici u svom članku opisuju pokušaj uvođenja novog prediktivnog „score-a“ odnosno

ocjene kao kombinacije biljega kod zatajenja srca. Kod pacijenata sa kroničnim stabilnim

zatajenjem srca, natrijuretski peptidi, galektin-3 i hsCRP su povezani sa kardiovaskularnim,

ali i svim ostalim uzrocima smrtnosti i zato su korisni za predviđanje prognoze bolesnika.

NT-proBNP i galektin-3 i dalje slove kao glavni indikatori biomehaničkih promjena i

povećanog rizika razvoja zatajenja srca, međutim nužno je naglasiti da ovise o dobi, spolu,

funkciji bubrega, pretilosti i dijabetesu (Berezin i sur.,2015). Iako smo pokazali slabu

korelaciju biljega međusobno, također smo pokazali statistički značaju multiplu korelaciju i

međuovisnost zavisne varijable NYHA stadija i nezavisnih varijabli galektina-3, NT-proBNP

49

i CA 125. Svaka nezavisna varijabla odnosno tri ispitivana biljega, daje svoj doprinos u

procjeni zavisne varijable, NYHA stadija.

Naše istraživanje bazirano je na koncentracijama triju biljega i klasifikaciji prema NYHA

stadiju, dok se u literaturi ovakva istraživanja nalaze s puno više općih podataka o

pacijentima, zbog toga ne možemo očekivati potpuno slaganje s literaturnim podacima,

također ova kombinacija biljega tek postaje sve češća tema istraživanja. Potvrdili smo

povišene vrijednosti ispitivanih biljega kod kardiomiopatija i njihovu korelaciju s NYHA

klasifikacijom. Galektin-3, NT-proBNP i CA 125 mogu biti dobri prognostički pokazatelji

razvoja zatajenja srca i imati kliničku vrijednost ako se interpretiraju u sklopu detaljnih

anamnestičkih podataka te uvidom u povijest bolesti.

50

5. ZAKLJUČCI

Određivanjem koncentracija CA 125, NT-proBNP i galektina-3 u bolesnika koji boluju od

kardiomiopatija različitih stadija možemo zaključiti:

Koncentracije CA 125, NT-proBNP i galektina-3 bile su povišene kod ispitivanih

pacijenata

Nije utvrđena međuovisnost CA 125 i NT-proBNP

Međuovisnost galektina-3 i CA 125 i NT-proBNP nismo dokazali

NYHA stadij pokazuje slabu povezanost s galektinom-3

NYHA stadij pokazuje umjereno do dobru povezanost s CA 125

NYHA stadij pokazuje dobru do izvrsnu povezanost s NT-proBNP

Matematički model multiple regresije u kojem su uključena sva tri biokemijska

pokazatelja najpouzdanija je metoda za procjenu stadija kardiomoipatije u skladu s

NYHA kriterijem.

51

6. LITERATURA

1. Ahmad T, Felker M. Galectin-3 in Heart Failure: More Answers or More Questions?

Journal of the American Heart Association, 2012; DOI:10.1161/JAHA.112.004374

2. Bielecka-Dabrowa A, Wierzbicka M, Dabrowa M, i Goch A, New methods in laboratory

diagnostics of dilated cardiomyopathy. Cardiology Journal, 2008, 15(4), 388-395

3. Berezin A, Kremzer AA, Martovitskaya YV, Samura TA, Berezina TA, Zulli A, Klimas J,

Kruzliak P. The utility of biomarker risk prediction score in patients with chronic heart

failure. International Journal of Clinical and Experimental Medicine 2015, 8(10): 18255-

18264

4. Bernstein LH Zions MY, Alam ME, Haq SA, Heitner JF, Zarich S, Seamonds B i Berger

S. What is the best approximation of reference normal for NT-proBNP? Clinical levels for

enhanced assessment of NT-proBNP (CLEAN). Journal of Medical Laboratory and

Diagnosis, 2011, 2(2), 16-21

5. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, Sawyer BG, Tietz Fundamentals of Clinical

Chemistry, Saunders Elsevier, St. Louis, Missouri, 2008; 353-355

6. Cardiomyopathy, www.heart.org, pristupljeno 14.6.2016

7. Cardiology Explained, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2209/, pristupljeno

12.6.2016

8. Chang YY, Chen A, Wu XM, Hsu TP, Liu LYD, Chen YH, Wu YWW, Lin HJ, Hsu RB,

Lee CM, Wang SS, Lo MT, hen MF, Lin YH. Comparison the Prognostic Value of

Galectin-3 and Serum Markers of Cardiac Extracellular Matrix Turnover in Patients with

Chronic Systolic Heart Failure. International Journal of Medical Science, 2014, 11(11),

1098-1106

9. Choosing cut-offs for NT-proBNP, www.acutecaretesting.org, pristupljeno 4.6.2016.

10. Cohn JN, Ferrari R, Sharpe N. Cardiac remodeling- concepts and clinical implications; a

consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. American Journal of

Cardiology, 2000, 35, 569-582

11. De Boer RA, Voors AA, Muntendam P, van Glist WH i van Veldhusein DJ. Galectin-3: a

novel mediatorr of heart failure development and progression. European Journal of Heart

Failure, 2009, 11, 811-817

12. Docekal J, Singh DK, Implantable Catdioverter-Defibrillator Discharge in a Patient whith

Dilated Cardiomyopathy: What Is the Mechanism? Cardiac Electrophysiology clinics

Journal, 2016, 8(1), 173-6

52

13. Dodig S, Imunologija, Zagreb, Medicinska naklada 2015, 151, 164

14. Dvornik Š. S09-3: BNP i kardiovaskularni biljezi u hitnoj laboratorijskoj dijagnostici.

Biochemia Medica 2009, 19(l1), 72-73

15. Duman D, Palit F, Simsek E, Bilgehan K. Serum carbohydrate antigen 125 levels in

advanced heart failure: relation to B type natriuretic peptide and left atrial volume.

European Journal of Heart Failure, 2008, 10, 556-559

16. Dumic J, Dabelic S, Flögel, Galectin-3: an open-ended story. Biochimica et Biophysics

Acta, 2006, 1760, 616–635

17. Eroglu S, Bozbas H, Muderrisoglu H. Dijagnostička vrijednost BNP-a kod dijastoličkog

zatajivanja srca. Biochemia Medica, 2008, 18(2), 183-9

18. Filipiak KJ, Folga A, Grabowski MS. Concomitant estimation of NT-pro-BNP and CA

125 for better outcome prognosis in congestive heart failure. European Journal of Heart

Failure Supplements, 2007, 6, 22

19. Hrynchyshyn N, Jourdain P, Desnos M, Diebold B, Funck F. Galectin-3: A new

biomarker for the diagnosis, analysis and prognosis of acute and chronic heart failure.

Archives of Cardiovascular Disease, 2013, 106, 541—546

20. Januzzi JL,Camargo CA, Anwaruddin S, Baggish AL, Chen AA, Krauser DG, Tung R,

Camerson R, Nagurney JT, Chae CU, Lloyed-Jones DM, Brown DF, Foran-Melanson S,

Sluss PM, Lee-Lewandrowski E i Lewandrowski KB. The N-Terminal Pro-BNP

Investigation of Dyspnea in the Emergency Department (PRIDE) Study. American

Journal of Cardiology, 2005, 95, 948-954

21. Kąraca O, Guler GB, Guler E, Gunes HM, Alizade E, Agus HZ, Gol G, Kahveci G,

Esen O, Esen AM, Turkmen M. Serum Carbohydrate Antigen 125 Levels in

Nonischemic Dilated Cardiomyopathy: A Useful Biomarker for Prognosis and

Functional Mitral Regurgitation. Congestive Heart Failure, 2012, 18, 144-150

22. Liu FT, Rabinovich GA. Galectins as modulators of tumor progressiom. Nature Reviews

Cancer, 2005, 5, 29-41

23. Liu YH, D'Ambrosio M, Liao TD, Peng H, Rhaleb NE, Sharma U, Andre S, Gabius HJ,

Carretero OA. N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline prevents cardiac remodeling and

dysfunction induced by galectin-3, a mammalian adhesion/growth-regulatory lectin.

American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology 2009, 296, 404-412

24. Miñana G, Palau P, Nuñez J, Sanchis J. The Tumor Marker CA 125 and Heart Failure.

Revisita Espanola de Cardiologia, 2010, 63(10), 1209-1216

53

25. Nägele H, Bahlo M, Klapdor R, Schaeperkoetter D, Rödiger W. CA 125 and its relation

to cardiac function. American Heart Journal, 1998, 137, 6

26. Raimond J, Zimonjic DB, Mignon C, Mattein M, Popescu NC, Monsigny M, Legrand

A. Mapping of the galectin-3 gene (LGALS3) to human chromosome 14 at region

14q21-22. 22. Mamm Genome, 1997, 8, 706-707

27. Raymond I, Groenning BA, Hildebrandt PR, Nilsson JC, Baumann M, Trawinski J,

Pedersen F. The influence of age, sex and other variables on the plasma level of N-

terminal pro brain natriuretic peptide in a large sample of the general population. Heart,

2003, 89, 745-751

28. Santoro F, Ferraretti A, Musaico F, Di Martino L, Tarantino N, Ieva R, Di Biase M i

Brunetti ND. Carbohydrate-antigen-125 levels predict hospital stay duration and adverse

events al long-term follow-up in Takotsubo cardiomyopathy. Internal and Emergency

Medicine, 2015, DOI 10.1007/s11739-016-1393-y

29. Sharma U, Rhaleb NE, Pokharel S, Harding P, Rasoul S, Peng H, Carretero OA. Novel

anti-inflammatory mechanisms of N-acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro in hypertnesion-induced

target organ damage. American Journal of Physiology, 2008, 294, 1226-1232

30. Štraus B, Čvorišćec D. Štrausova medicinska biokemija. Biokemija i dijagnostika

zloćudnih tumora. Zagreb, Medicinska naklada, 2009, str. 522-527

31. Thomas L, ed. Clinical laboratory diagnostics. Frankfurt/Main, TH-Books

Verlagsgesellschaft mbH, 1998, str. 114-116, 949-951

32. Uszenski HJ, Booker SM, Goliash IB, Meyer RL, Micheals LM, Peterson KJ, Spriggs

BL, Tempesta BJ. Hypertrophic cardiomyopathy: medical, surgical, and nursing

management. Cardiac electrophysiology clinics Journal, 2016, 8(1), 173-6

33. Varol E, Ozaydin M, Altinbas A, Aslan SM, Dogan A, Dede O. Elevated carbohydrate

antigen 125 levels in hypertrophic cardiomyopathy patients with heart failure. Heart

Vessels 2007, 22, 30-33

34. Zatajivanje srca i kardiomiopatije, MSD priručnik dijagnostike i terapije, 2014;

http://www.msd-prirucnici.placebo.hr, pristupljeno 14.6.2016.

35. Zhang C, Liu R, Yuan J, Cui J, Hu F, Yang W, Zhang Y, Chen Y, Qiao S. Predictive

Values of N-Terminal Pro-B-Type Natriuretic Peptide and Cardiac Troponin I for

Myocardial Fibrosis in Hypertrophic Obstructive Cardiomyopathy. PLoS ONE, 2016,

DOI:10.1371/journal.pone.0146572

54

7. SAŽETAK

Vrijednost galektina-3 i CA 125 kod procjene stadija kardiomiopatija

Kardiomiopatije su bolesti srčanog mišića koje posljedično vode do zatajenja srca.

Uvođenjem novih biokemijskih biljega kao laboratorijskih pretraga želi se poboljšati i ubrzati

dijagnostika bolesti te omogućiti točne i pouzdane podatke. Remodeliranje srca kao podloga

ove bolesti i dalje se istražuje. Brojne varijable utječu na sam razvoj ali i daljnju progresiju

bolesti. Te varijable često se dijele na „svjedoke“ i „krivce“, ovisno o tome jesu li dio uzroka

ili posljedica.

Na uzorku od 65 ispitanika, određene su koncentracije triju biljega: CA 125, NT-

proBNP i galektin-3. Cilj ovog istraživanja bio je potvrditi povišene koncentracije ova tri

biljega kod dijagnoze kardiomiopatija, te istražiti njihovu međuovisnost.

Statističkom obradom dobivenih rezultata potvrđena je međuovisnost CA 125 i NT-

proBNP, dok međuovisnost galektina-3 i preostala dva biljega nije potvrđena. Uočene su

povišene koncentracija svih biljega te njihova korelacija sa NYHA stadijem što potvrđuje

literaturne navode i otvara vrata novim opširnijim istraživanjima o njihovoj kliničkoj

korisnosti kao biljega dijagnoze, prognoze i praćenja terapije. Procjena NYHA stadija na

temelju biokemijskih pokazatelja pouzdana je samo kad se uvrste zajednički sva tri značajna

parametra – NT-proBNP, CA 125 i galektin-3.

55

7.1 SUMMARY

Value of galectin-3 and CA 125 in defining cardiomyopathy stages

Cardiomyopathy refers to diseases of heart muscle and it often leads to heart failure.

Trying to improve diagnosis of disease, laboratoy scientists are developing new biochemistry

markers that can be reliable and precise marker of the disease. Cardiac remodeling is the final

clue that is needed to be more explained. There are many different variables which take part

in development or progression of the cardiomyopathy. That variables also known as

biomarkers are considers as „culprit“ if they play role in development, or as a „bystander“ if

they represents result.

The study included 65 patients with cardiomyopathy. We determined concentrations

of CA 125, NT-proBNP and galectin-3. The aim of the work was to confirm increased

concentration of this there biomarkers in our grupe of patients and to assess their

interdependence.

Statistical analysis of variables confirmed interdependence between CA 125 and NT-

proBNP, but interdependence between galectin-3 and two another variables haven't been

confirmed in this study. We also confirmed elevated concentrations of these biomarkes and

their corelation with NYHA functional classification, which is already established in

literature, and it leads to new, bigger studies of the clincal utility as biomarkes of diagnosis,

prognossis and therapy treatment. Defining NYHA stages based on determination of

biochemistry markers is reliable only if we include together these three relevant variables -

NT-proBNO, CA 125 and galectin-3.

56

Temeljna dokumentacijska kartica

Sveučilište u Zagrebu

Farmaceutsko-biokemijski fakultet

Studij: Medicinska biokemija

Zavod za medicinsku biokemiju i hematologiju

Domagojeva 2, 10000 Zagreb, Hrvatska

Diplomski rad

VRIJEDNOST GALEKTINA-3 I CA 125 KOD PROCJENA STADIJA

KARDIOMIOPATIJA

Katarina Grdiša

SAŽETAK

Kardiomiopatije su bolesti srčanog mišića koje posljedično vode do zatajenja srca.

Uvođenjem novih biokemijskih biljega kao laboratorijskih pretraga želi se poboljšati i ubrzati

dijagnostika bolesti te omogućiti točne i pouzdane podatke. Remodeliranje srca kao podloga ove

bolesti i dalje se istražuje. Brojne varijable utječu na sam razvoj ali i daljnju progresiju bolesti. Te

varijable često se dijele na „svjedoke“ i „krivce“, ovisno o tome jesu li dio uzroka ili posljedica.

Na uzorku od 65 ispitanika, određene su koncentracije triju biljega: CA 125, NT-proBNP i

galektin-3. Cilj ovog istraživanja bio je potvrditi povišene koncentracije ova tri biljega kod

dijagnoze kardiomiopatija, te istražiti njihovu međuovisnost.

Statističkom obradom dobivenih rezultata potvrđena je međuovisnost CA 125 i NT-

proBNP, dok međuovisnost galektina-3 i preostala dva biljega nije potvrđena. Uočene su povišene

koncentracija svih biljega te njihova korelacija sa NYHA stadijem što potvrđuje literaturne navode

i otvara vrata novim opširnijim istraživanjima o njihovoj kliničkoj korisnosti kao biljega

dijagnoze, prognoze i praćenja terapije. Procjena NYHA stadija na temelju biokemijskih

pokazatelja pouzdana je samo kad se uvrste zajednički sva tri značajna parametra – NT-proBNP,

CA 125 i galektin-3.

Rad je pohranjen u Središnjoj knjižnici Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutsko-biokemijskog

fakulteta.

Rad sadrži: 57 stranica, 12 grafičkih prikaza, 9 tablica i 35 literaturnih navoda. Izvornik je na

hrvatskom jeziku.

Ključne

riječi:

Galektin-3, CA 125, NT-proBNP, kardiomiopatije, NYHA

Mentor: Dr. sc. Nada Vrkić, izvanredna profesorica Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu.

Ocjenjivači: Dr. sc. Nada Vrkić, izvanredna profesorica Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu .

Dr. sc. Roberta Petlevski, izvanredna profesorica Farmaceutsko-biokemijskog

fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

Dr. sc. Milena Jadrijević-Mladar Takač, izvanredna profesorica Farmaceutsko-

biokemijskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

Rad prihvaćen: srpanj, 2016.

57

Basic documentation card

University of Zagreb

Faculty of Pharmacy and Biochemistry

Study: Medical Biochemistry

Department of Medical Biochemistry and Hematology

Domagojeva 2, 10000 Zagreb, Croatia

Diploma thesis

VALUE OF GALECTIN-3 AND CA 125 IN DEFINING

CARDIOMYOPATHY STAGES

Katarina Grdiša

SUMMARY

Cardiomyopathy refers to diseases of heart muscle and it often leads to heart failure. Trying

to improve diagnosis of disease, laboratoy scientists are developing new biochemistry markers that

can be reliable and precise marker of the disease. Cardiac remodeling is the final clue that is

needed to be more explained. There are many different variables which take part in development

or progression of the cardiomyopathy. That variables also known as biomarkers are considers as

„culprit“ if they play role in development, or as a „bystander“ if they represents result.

The study included 65 patients with cardiomyopathy. We determined concentrations of CA

125, NT-proBNP and galectin-3. The aim of the work was to confirm increased concentration of

this there biomarkers in our grupe of patients and to assess their interdependence.

Statistical analysis of variables confirmed interdependence between CA 125 and NT-

proBNP, but interdependence between galectin-3 and two another variables haven't been

confirmed in this study. We also confirmed elevated concentrations of these biomarkes and their

corelation with NYHA functional classification, which is already established in literature, and it

leads to new, bigger studies of the clincal utility as biomarkes of diagnosis, prognossis and therapy

treatment. Defining NYHA stages based on determination of biochemistry markers is reliable only

if we include together these three relevant variables - NT-proBNO, CA 125 and galectin-3.

The thesis is deposited in the Central Library of the University of Zagreb Faculty of Pharmacy and

Biochemistry.

Thesis

includes:

57 pages, 12 figures, 9 tables and 35 references. Original is in Croatian language.

Keywords: Galectin-3, CA 125, NT-proBNP, cardiomyopathy, NYHA

Mentor: Nada Vrkić, Ph.D. Associate Professor, University of Zagreb Faculty of

Pharmacy and Biochemistry

Reviewers: Nada Vrkić, Ph.D. Associate Professor, University of Zagreb Faculty of

Pharmacy and Biochemistry

Roberta Petlevski, Ph.D. Associate Professor, University of Zagreb Faculty of

Pharmacy and Biochemistry

Milena Jadrijević-Mladar Takač, Ph.D. Associate Professor, University of

Zagreb Faculty of Pharmacy and Biochemistry

The thesis was accepted: July 2016.

58