Directed enzyme evolution

一、自然进化与定向进化达尔文在《物种起源》中提出以自然选择为基础的进化学说，成为生物学史上的一个转折点。

1 、自然进化 （ 1 ）环境压力下物种朝着适应生存环境的方向发展；（ 2 ）漫长时间里通过 DNA 复制发生突变或通过重组，产生了遗传多样性；（ 3 ）自发、非常缓慢、自然选择；

2 、定向进化 在实验室中模仿自然进化的关键步

骤（突变、重组和筛选），在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效改造蛋白质，使之适于人类的需要。

人为引发、较短时间、人为选择。

3 、定向进化的一般过程

细菌

诱变

50 0C 培养

突变体库 选择压力（温度）

温度耐受型突变体

最适生长温度为370C

4 、酶定向进化的意义

酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的，但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。

选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。

二、酶分子定向进化的历史

在 20 世纪 60 年代利用 RNA 噬菌体 Q 进行实验，是第一次在分子水平上定向改造单一分子。

Sol Spiegelman

1981 年， B.G.Hall 等定向改变 E.coliK12 中 ebg 酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。

1993 年， Arnold 研究组提出易错 PCR 的方法。 1994 年， Stemmer 将 DNA 重组方法引用到酶分子的定

向进化中。 1999 年， Stemmer 等把 DNA 改组延伸到族改组。

三、酶分子的定向进化 从天然的或人为获得的酶出发，经过基因突变

和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。

定向进化 = 随机突变 + 正向重组 + 选择（或筛选）

1 、定向进化的过程 （ 1 ）通过随机突变和 ( 或 ) 基因体外重组创造基因多样性； （ 2 ）导入适当载体后构建突变文库； （ 3 ）通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。 这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶。

2 、多样性的产生

（ 1 ）易错 PCR(error-prone PCR)

通过改变 PCR 反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。

控制 DNA 的突变频率。 不足之处： 靶序列长度一般在 0.5-1.0kb ，应用范围

有限； 中性突变较多；且较为耗时、费力 获得的 DNA 序列中碱基的转换高于颠换。

此法突变具有一定的密码偏向性。

四、定向进化的策略

（ 2 ）连续易错 PCR(Sequential error-prone PCR)

将一次 PCR 扩增得到的有益突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。

（ 3 ） DNA 改组技术 (DNA shuffling)

又称有性 PCR ，指 DNA 分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。

通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。

分子育种。

（ a) 单个基因的 DNA 改组

从突变体基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶 I

随机切割得到的随机片段经过不加引物的多次 PCR 循环。

在 PCR 循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因片段之间的重组。

DNA 改组与常规定向进化的比较

（ b) 基因家族改组技术 (family shuffling)

(c ) DNA 改组原理

1. DNaseI 产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复 步后，可获得全长 DNA 片段 2-4 。

（ d ）随机引物体外重组法 (RPR)

单链DNA 为模板，随机序列引物 PCR ， DNA小片段互为模板扩增获得重新排布的突变基因

（ e ）交错延伸原理

采用基因家族的改组效果明显高于单个基因的改组效果。

特点：改组基因的效率高；提高基因突变机率。

五、基因文库的构建

1 、构建理想的基因文库要考虑的因素（ 1 ）基因文库的质量 (a) 文库的代表性（包容性） (b) 突变基因片段的序列完整性

（ 2 ）文库筛选可选择的方法 控制突变库的大小与特定的筛选容量相适应

2 、突变体基因的构建策略 DNA 随机酶切片段拼接 单链 DNA 随机拼接（提高不同亲代基因的同源片段重组形成嵌合体基因的效率）

限制性酶切片段随机拼接（防止 PCR 扩增产生相同的亲代基因）

3 、构建突变基因文库的载体系统（ 1 ）噬菌体载体系统； 插入片段的装载容量大，适合于大片段的克隆； 构建出的基因文库质量高、代表性好； 适合长期保存； 主要缺点是构建成基因文库后，可采用的文库筛选方法有限。

（ 2 ）质粒载体系统 载体选择 基因重组 组装突变基因文库。 体外操作简便，载体本身的设计上有很大可塑性； 最大优点是能实现对基因文库的功能性筛选； 缺点是插入片段的载体容量较小，含有长片段的重组克隆在文库的群体扩增过程中容易丢失；

转化效率普遍较低； 不适合文库的长期保存。

4 、文库的筛选 建立有效的搜索文库的方法是影响定向进化成功与否的关键；

采用的定向筛选方法必须灵敏，且应与目的性质相关；

借助检测仪器易实现高通量筛选。

5 、定向进化的筛选 活体筛选法 - 基于表形观察的筛选； 基于基因编码蛋白质的检测筛选表达文库； 噬菌体显示法； 细胞表面显示法（细菌、纤毛虫细胞表面）； 筛选方法根据各个蛋白质的性质而设计的，不具有通用性； 突变体基因筛选能否成功的关键是将基因的表型和能通过定量表征的

筛选手段紧密联系； 为加快分离目的基因的过程，已建立起多种在基因发现上具有“高通

量”性能的筛选方法。

6 、高通量筛选技术

（ 1 ）突变微生物分离 琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。

微球细胞固定法与数字成像系统结合：将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。

流式细胞计数法：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。

（ 2 ）酶活力检测 反应产物显色 pH指示剂显色 对硝基苯酚和伞形酮衍生物等显色底物 分光光度计和荧光酶标仪 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测 GC/HPLC ，使用较短的柱子以缩短分析时间 同位素标记底物 质谱 热力学红外检测

（ 3 ）噬菌体显示筛选模式

噬菌体表面展 示技术是 Sm

ith 等建立 的一种利用大 肠杆菌丝状单 DNA 噬菌体 为载体，在重 组噬菌体颗粒 表面展示外源 多肽分子的展 示技术链。

（ 4 ） pH 指示剂显色高通量筛选

（ 5 ）产物显色筛选 巨大芽孢杆菌 P450BM-3 ，最适底物为 C12-C1

8 的脂肪酸，对短链烷烃羟化活力较低两轮易错PCR ，最佳突变酶的比活提高了 5倍 Adv. Synth. Catal., 2001, 343: 601-606

（ 6 ）荧光产物筛选

通过定向进化，将 P450cam 的萘羟化活力提高 20倍野生型酶以 O2 为氧化剂，需要 NADPH ，而突变酶以 H2

O2 为氧化剂，无须辅酶。

（ 7 ）基于比色法和荧光检测的高通量筛选

六、酶定向进化技术应用 1 、提高酶的催化效率 2 、增强酶的稳定性 3 、改变酶的底物特异性