direction des sciences du vivant institut de biologie et de technologies de saclay service de...
TRANSCRIPT
Direction des Sciences du VivantInstitut de Biologie et de Technologies de SaclayService de Bioénergétique, Biologie Structurale et MécanismesCEA Saclay
URA 2096Protéines MembranairesTransductrices d’Energie
ATPsynthase
année 2006-2007
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
H2O
PS2complexe I
cyt b6fcyt bc
PCcyt c
PS1cyt oxydase
ATP synthase
NADH NADP+
O2
Q pool
H+
H+
H+H+
H+
H+
ADP + Pi ATP + H20
e-
e-
e-
e-
e-
e-e-
e-
e-
STROMAMATRICE
LUMENESPACE INTERMEMBRANAIRE
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
33
(E.coli, chloroplaste)
(mitochondrie)
(E.coli, chloroplaste)
b2 (E.coli)
b+b’ (chloroplaste)
b (mitochondrie)
a c10-15
H+
H+
F1
F0
(Mg)ADP + P
(Mg)ATP + H2O
OSCP (mitochondrie)
membrane
sous-unités des ATP-synthases
partie membranaire F0E.Coli Chloroplaste Mito animale Fonction position
a 30 (1) 27 (1) 25 (1) protons? statorb 17 (2) 19 (1) 25 (1) connexion F0F1 statorb’ (0) 16 (1) (0) connexion F0F1 statorc 8 (9-12) 8 (9-12) 8 (9-12) protons rotorOSCP (0) (0) 21 (1-2) connexion F0F1 statorA6L (0) (0) 8 ? statorF6 (0) (0) 9 ? statord (0) (0) 19 ? statore (0) (0) 8 ? statorf (0) (0) 10 ? statorg (0) (0) 11 ? statorh (0) (0) 10 ? stator
partie extrinsèque F1E.Coli Chloroplaste Mito animale Fonction position
55 (3) 55 (3) 55 (3) nucléotides stator 50 (3) 53 (3) 52 (3) nucléotides stator 32 (1) 35 (1) 30 (1) énergie rotor 19 (1) 20 (1) 15 (1) connexion F0F1 rotor
(mitochondrie)stator (E.coli,chloroplaste)
15 (1) 15 (1) 6-7 (1) inhibit ion(E.Coli,Chlor)connexion F0F1
rotor
IF1 (0) (0) 12 inhibit ion dissociable
codageprocaryotique
codagenucléaire
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
H+
H+
pHe=6
pHi=6
K+
K+
a) incubation acide
H+
H+
pHe=8
pHi=6
K+
K+
ADP + Pi
ATP
H+
b) transfert à pH élevésynthèse d'ATP
pHe=8
pHi=8
c) nouvel équilibre
Les expériences historiques de Jagendorf ont montré qu’une force protomotrice complètement artificielle
pouvait induire la synthèse de l’ATP[Jagendorf A.T. et Uribe E., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1966) 55, 170-177]
Hypothèse (abandonnée) du «proton substrat» (d’après P. Mitchell)[Mitchell P., FEBS Lett. (1974) 43, 189-194]
MgADP- O OO- P O P Ad O Mg O
OPO-O- OH
HPO42-
F0F1
O OO- P O P Ad O Mg O
OP+
OHOH
3 H+
H2O
O OO- P O P Ad O Mg O
O P+
OHOH
O OO- P O P Ad O Mg O
O-
POH
O-
2 H+
MgATP2-
Les ATP synthases peuvent être fragmentées en un « canal à protons » F0 et une ATPase soluble F1
F0
H+F1
ATP+H2O
ADP + Pi
énergieH2O
Coopérativité (modèle à 2 sites)Pi + ADP
ATP ATP
PiADP
ATP
Pi ADP
Hypothèse du changement d’affinité ( P. Boyer)
ADP P
ATP
ADP P
ATP
H2O
H+
H+
~
[Boyer P.D., Cross R.L. et Momsen W. PNAS (1973) 70, 2837-2839]
E E.ATP E: EADPPi
ADP
Pi
H20ATP
a) échanges isotopiques18O 32P
H+
O-
O-
O
OH
P1
2
3
H
HO
b) oxygènes échangeables du phosphate
[D’après Gresser M.J., Myers J.A. et Boyer, P.D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 12030-12038]
ATP
EF0F1
9 nm
11 nm
4.5 nm
MF1
2 nm
D’après Boekema E.J., Berden J.A. et Heel M. G., Biochim. Biophys. Acta (1986) 851, 353-360
D’après Gogol E.P., Lucken U. et Capaldi R.A., FEBS Lett. (1987) 219, 274-278
D’après Wilkens S. et Capaldi R.A., Nature (1998) 393, 29
NUCLEOTIDES ET ANALOGUES
Analogues photoactivables
-O
3 ’-arylazido-ATP
O O
O
H HH
OH
CO
CH2
NH
N3
N
N
CHC
C N CH
C N
NH2
H
CH2O P
O
O-
O P
O
O-
P
O
O-
NO2
N
C
NH2
O O
OH
H HH
OH
N
N
CHC
C
H
CH2O P
O
O-
O P
O
O-
-O P
O
O-
C
N
N3
2-azido-ATP
N
C
NH2
O O
OH
H HH
OH
N
N
CC
C
H
CH2O P
O
O-
O P
O
O-
-O P
O
O-
CH
NN3
8-azido-ATP
CH
-O O O
OH
H HH
OH
N
N
CHC
C N
C N
NH2
H
CH2O P
O
O-
NH P
O
O-
P
O
O-
analogue non hydrolysable AMP-PNP
-O O O
OH
H HH
OH
N
N
CHC
C N
C N
NH2
H
CH2O P
O
O-
O P
O
O-
P
O
O-
NH2C
analogue hydrolysable GTP
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
MARQUAGE DES RESIDUS CATALYTIQUES DE PAR 2-azido-ANP
origine du F1 résidu modifié Peptide marqué
Mitochondrie boeufChloroplaste épinardEscherichia coli
Tyr-345Tyr-362Tyr-331
A I A E L G I Y* P A V D P L D S T S R G I Y* P A V D P L D S T S T M L Q P RQ I A S L G I Y* P A V D P L D S T S R
I M P N I V G S E H Y* D V A R I V G E E H Y* E I A Q R Q L D P L V V G Q E H Y* D T A R
MARQUAGE DES RESIDUS NON CATALYTIQUES DE PAR 2-azido-ANP
origine du F1 résidu modifié Peptide marqué
Mitochondrie boeufChloroplaste épinardEscherichia coli
Tyr-368Tyr-385Tyr-354
D’après Wise J.G., Hicke B.J. et Boyer P.D., FEBS Lett. (1987) 223, 395-401
-R272
-Y368
F357
Mg
P363
R362 Q432
S177
Q172
D269
D270
E328
K273
Q208
Y203
P-loop (QTGKTS)
SITE NON CATALYTIQUE(par défaut, les résidus sont situés sur )
F424A121
F418
Y345
T425
E192
V164
R189
-R373
E188-S344
G159D256P-loop
(GVGLTV) Mg
SITE CATALYTIQUE(par défaut, les résidus sont situés sur )
D ’après Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R. et Walker J.E., Nature (1994) 370, 621-628
EDP
20 Å
DP
TP
E
DP
TP
E
DPTP
DP
TP
E
DP
TP
E
TPE
DP
TP
E
DP
TP
E
DP
TP
EDP
TP
E
Interfaces catalytiques
Interfaces non catalytiques
D’après Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R. et Walker J.E., Nature (1994) 370, 621-628
TPE
Le pontage de sous-unités proches permet de savoir si elles bougent l’une par rapport à l’autre durant le cycle catalytique.
Double mutation en
cystéine
PontageINACTIVATION
Quand la topologie n’est pas connue avec certitude, il permet aussi d’établir des proximités (étude du secteur membranaire F0).
(Aggeler R., Haughton M. A. & Capaldi R. A.(1995) J. Biol Chem. 270, 9185-9191)
Structure de la partie centrale du sous-complexe F1
dans le complexe F1 entier (mito)
de mitochondrie dans le complexe entier
éLa sous-unité (bactérie, chloroplaste) ou (mitochondrie) est formée essentiellement d’un tonneau et de 2 hélices . La sous-unité bactérienne isolée, solubilisée (RMN) ou cristallisée (RX) a la même configuration que son homologue dans l’ATPase mitochondriale, c’est-à-dire que les deux hélices forment une épingle à cheveux. En revanche, dans le complexe de E.coli cristallisé, la boucle entre les deux hélices s’ouvre largement et la deuxième hélice est plaquée contre la sous-unité .
complexe de E.coli
de E. coli en solution ou cristallisé
D’après Gibbons C., Montgomery M.G., Leslie A.G. et Walker J.E., Nat. Struct Biol. (2000)7,1055-1061
Rodgers A.J. et Wilce M. C., Nat. Struct. Biol. (2000) 7, 1051-1054.
Uhlin U., Cox G.B. and Guss J.M., Structure (1997) 5, 1219-1230
Désénergisé
Energisé
µH+~
S S199 205
S S
SH SH
S S
+DTT
+maléimide
SH89
SH322
SH SH
+monomaléimide +dimaléimide
S S SH SH
bloqué découplé 6 Å <d< 19 Å
Réactivité des thiols de la sous-unité de l ’ATPase des chloroplastes
(d’après Moroney J.V., Warncke K. et McCarty R.E, J. Bioenerg. Biomembr. (1982) 14, 347-359
cys322
cys89
70 Ådistance entre Cys89 et Cys322 en
se basant sur les domaines homologues dans la mitochondrie et
dans E. coli
LE PROBLEME DE LA SOUS-UNITE
CHLOROPLASTIQUE
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
Asp61
oligomèresous-unités c
RECONSTRUCTION PARTIELLE DU COMPLEXE F0F1 MITOCHONDRIAL
[d’après Stock D., Leslie A.G. et Walker J.E., Science (1999) 286, 1700-1705] et Dickson, K., Silvester, J. A., Fearnley, I. A., Leslie, A.G.W. et Walker, J.E. (2006)
EMBO J. 25, 2911-2918]
b
d
F6OSCP
[d’après Girvin M.E., Rastogi V.K., Abildgaard F., Markley J.L. et Fillingame R.H.,
Biochemistry (1998) 37, 8817-8824]
Asp61
Structure (RMN) de la sous-unité c de E.coli
La structure de la sous-unité a de E. coli à travers les âgesQuelques exemples
Auteurs Méthode RésultatSenior et al., 1983 prédiction de structure 7 hélices transmembranairesHermolin et al., 1983 prédiction de structure
digestion partielle trypsine6 hélices transmembranairesextrémités périplasmiques
Walker et al., 1984 prédiction de structure 6 hélices transmembranairesCox et al., 1986 prédiction de structure
règle empirique des résidusbasiques internes
5 hélices transmembranairesextrémité C-terminalecytoplasmique
BjØrbaek et al., 1990 Fusion de gènes 8 hélices transmembranairesextrémités cytoplasmiques
Lewis et al., 1990 Fusion de gènes 8 hélices transmembranairesextrémités cytoplasmiques
Vik et Dao, 1992 prédiction de structure 6 hélices transmembranairesYamada et al., 1996 réaction aux anticorps 6 hélices transmembranaires
extrémités cytoplasmiquesJäger et al., 1998 réaction aux anticorps après
insertion d'épitopes6 hélices transmembranairesextrémités cytoplasmiques
Valiyaveetil & Fillingame,1998
réaction aux anticorps aprèsinsertion d'épitopesFusion de gènes
5 hélices transmembranairesextrémité C-terminalecytoplasmique
Long et al., 1998 introduction et marquage decystéines
5 hélices transmembranairesextrémité C-terminalecytoplasmique
sous-unité a, hélice 4 sous-unité c, hélice 2
AD
IL
NM
IG
LI YL
I
202
229
52
79
structure vraisemblable de la sous-unite a [d’après Long J.C, DeLeon-Rangel, J. et Vik S.B., J. Biol. Chem. (2002) 277, 27288-27293;
Zhang, D.et Vik, S.B., J. Biol. Chem. (2003) 278, 12319-12324 ]
pontages XnC entre a et c [d’après Jiang W. et Fillingame R.H., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1998) 95, 6607-6612]
L
F
166100LIAP LAL TIFV WVF LMNL MDL LPI
DLLP
AVSR FLV LL
V
FGLV
SF MSD INIT WFT
FP
APPNQ
D V L S T R L D
GL
QL
NN
L
HH
I
YD Q P T M N E S A M
37
64
VIG
F V N
K
L
KATSG
VPGK
F Q TA
IE G
VK
D
S
YM
HG
KS
K
123
SE
E
ISYF LL I
IFVG LAM SLTV NV
DAS
P V VRL
SKPV SG L
LRLF GNM YAGE L IF IL IA GLL
K M K G
AFF
FI G G
T K EL T L QN H W
P IV
LEGV
NLISL
L
YV
ITL
M V F IF AQLT I IL IH
F I AWP VNL I
LS
MA
H H H H H H C
P W WS Q
W
AL PGY IA
E H
V L
147
202
229233
260
Pinteraction
avec cinteractionavec b
F17
F14
Q10
T6N4
W26 (cycle // mb)P27-28 (torsion 30°)
organisation dimérique de la sous-unité bhélice N-terminale transmembranaire(mutagenèse cystéines et pontage)
[d’après Dmitriev O., Jones P.C., Jiang W. et Fillingame R.H., J. Biol. Chem. (1999) 274,
15598-15604]
sous-unité b, ATPsynthase E.coli
81 KRRSQILDEA KAEAEQERTK IVAQAQAEIE AERKRAREEL
1 MNLNATILGQ AIAFVLFVLF CMKYVWPPLM AAIEKRQKEI
interface du dimère
clusteraromatique
Hélice transmembranaire
pas de pontage
cycle parallèleà la membrane
torsion rigide30°
début hélice soluble
Réf. 1
ADGLASAERA HKDLDLAKAS ATDQLKKAKA EAQVIIEQAN41
zone où des délétions importantespeuvent être faites sans dommages Réf.2
tronquer jusqu’ici n’empêche pas la
dimérisation
Réf.3
tronquer jusqu’ici empêche la
dimérisation
Réf.3
pontages XnC dimériquesRéf.3
XnC ne ponte pasRéf.4
RKQVAILAVA GAEKIIERSV DEAANSDIVD KLVAEL121
XnC pontages dimériques
Réf.4Réf.5
inteface dimère
Réfs.4-6XnC pontages dimériques
Réf.3E155C pontage avec Réf.7
Réf. 1 Dmitriev et al. (1999) JBC 274, 15598-15604; fragment N-terminal; RMN, mutagenèse, pontage et modélisation
Réf. 2 Sorgen et al. (1998) JBC 273, 27873-27878; complexe entier, délétion, tests fonctionnels
Réf. 3 McLachlin & Dunn (1997) JBC 272, 21233-21239; tronquage N-terminal, mutagenèse et pontage, chromatographie d’affinité, ultracentrifugation
Réf.4 Rodgers et al. (1997) JBC 272, 31058-31064; domaine soluble, mutagenèse et pontage, dichroïsme circulaire
Réf. 5 Rodgers & Capaldi (1998) JBC 273, 29406-29410; complexe entier, mutagenèse et pontage, tests fonctionnels
Réf. 6 Howitt et al. (1996) JBC 271, 7038-7042, domaine soluble, mutagenèse (sans pontage), ultracentrifugation
Réf. 7 McLachlin et al. (1998) JBC 273, 15162-15168; domaine soluble, mutagenèse et pontage
L156C pontage avec et découple
Réf.5
membrane
contact avec et
(sommet du complexe F0F1)
contact avec adimérisation
2, 6, 10
P 27-28
pontage 59, 60, 61, 65, 67heptades 53-79
54-60peut être raccourci (-2, -4, -7)
peut être rallongé (+7,+11,+14)peut être rendu boiteux (+7,-7)
dimère de sous-unité b (E.coli)(modèle largement spéculatif)
heptades 106-123
pontage 84, 104
pontage 124
pontage 128,131,132,140pontage 144, 146
le pédoncule latéral de l'ATP synthase de E.coli serait plutôt flexible
Sous-unité b
Sous-unité d
Sous-unité F6
Sous-unité bNter côté matriciel
Structure RX du com
plexe b-d-F6(m
itochondrie animale)
membrane
[d’après Dickson, K., Silvester, J. A., Fearnley, I. A., Leslie, A.G.W. et Walker, J.E. (2006) EMBO J. 25,
2911-2918]
le pédoncule latéral de l'ATP synthase mitochondriale serait plutôt rigide
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
SH SHSH
SH
S SHS
SH
oxydation
S
SDissociation des
sous-unités
S SHS
SH
*
*
Réassociation avec des sous-unités
radioactives
SS
SS
*
SS *
Dissociation des sous-unités
séparation
comptage radioactif
[d’après: Duncan T.M., Bulygin V.V., Zhou Y., Hutcheon M.L. et Cross R.L., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1995) 92, 10964-10968]
*
SS
*
SH
SH
* SH SH *
SH
SH
*
Réduction
turnover catalytique (+ATP)
oxydation
SS
SS *
Sens de rotation de l'ATP synthase
vide
.AMPPNP .ADP
synthèse d'ATP
vers membrane
a) Prédit par l'occupation des sites dans le cristal de MF1
b) Observé lors de l'hydrolyse d'ATP par le TF1 ou le EF0EF1
vers membrane
[D ’après Noji H., Yasuda R., Yoshida M. et Kinosita K., Nature (1997) 386, 299-302]
[D’après Sambongi Y., Iko Y., Tanabe M., Omote H., Iwamoto-Kihara A., Ueda I., Yanagida T. et Wada Y., Science (1999) 286, 1722-1724]
Ni-NTA sur plaque de verre
streptavidine
His-tag
Actine fluorescente
Sous-unité Sous-unité
Sous-unités c
Actine fluorescente
[D ’après Noji H., Yasuda R., Yoshida M. et Kinosita K., Nature (1997) 386, 299-302]
Petit fluorochrome
Lumière polarisée
Sous-unité
V
H
[D’après Adachi K., Yasuda R., Noji H., Itoh H., Harada Y., Yoshida M. et Kinosita K., Proc. Natl Acad. Sci. USA. (2000) 97, 7243-7247]
[d’après Yasuda R., Noji H., Yoshida M., Kinosita K. et Itoh H., Nature (2001) 410, 898-904]
BSA
Bille (or colloïdal)
détection
intervalles de temps: 0,5 ms
ROTATION DE ET CYCLE CATALYTIQUE (HYDROLYSE D ’ATP)
ATP fort
ATP moyen
ATP faible
360
°
temps
2/ détection directe de la rotation de en molécule unique de TF1 [d’après Yasuda R., Noji H., Yoshida M.,
Kinosita K. et Itoh H., Nature (2001) 410, 898-904]
[d’après Itoh H., Takahashi A., Adachi K., Noji H., Yasuda R., Yoshida M. et Kinosita
K., Nature (2004) 427, 465-468]
h
ATP + luciférine
+ O2
+ AMP + PPi + oxyluciférine
+ CO2
LL
B
bille magnétiqueØ 700 nm
échantillon
observation
électro-aimants
détection par réflection
détection par fluorescence(lumière polarisée tournante)
[d’après Nishizaka T., Oiwa K., Noji H., Kimura S., Muneyuki E., Yoshida M et Kinosita K., Nat. Struct. Mol. Biol. (2004) 11, 142-148]
Rotation due à la force protomotrice
[d’après Zhang Y., Wang J., Cui Y., Yue J. et Fang X., Biochem. Biophys. Res. Commun. 331 (2005) 370-374]
suppression de la sous-unité
H+H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
bactériorhodopsineLIPOSOME
libre rotation de
ATPhyd
ADP + P
80° 40°
40°
ADP + P
ATP
80°
tri-site
bi-site
Le mécanisme d'hydrolyse (et de synthèse) d'ATP est-il "tri-site"
ou "bi-site"?
occupation des sites nucléotidiques dans les cristaux de MF1
MF1 de coeur de boeuf cristallisé dans D2O en présence d’azide, d’AMP-PNP, d’ADP (non saturant) et de Mg2+
MF1 de foie de rat cristallisé dans H2O en présence d’ATP et de Pi
AMP-PNPMg
AMP-PNPMg AMP-
PNPMg
AMP-PNPMg
ADPMg
ATPMg
ADPPi
ATPMg
ATPMg
ADPADP
Pi
MF1 de coeur de boeuf cristallisé dans D2O en présence d’AMP-PNP, d’ADP, de fluoroaluminate, de sulfate et de Mg2+
AMP-PNPMg
AMP-PNPMg
AMP-PNPMg
ADPMgAlF4
ADPSO4Mg
ADPMgAlF4 site fermé
site « semi-fermé »
site ouvert
[D’après Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R. et Walker J.E., Nature (1994) 370, 621-628]
[D’après Bianchet M.A., Hullihen J., Pedersen P.L. et Amzel L.M., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1998) 95, 11065-11070]
[D’après Menz R.I., Walker J.E. et Leslie A.G., Cell (2001) 106, 331-341]
Tyr345(MF1)
ATP
Stacking de l’ATP avec la Tyr 345 du site catalytique
(ATPsynthase mitochondriale), homologue de Tyr 331 de E.coli
320 340 360 380, nm
Y331 ou W331+ATP saturant
W331
Spectres de différence (x3)spectre 1 - spectre 21 site occupé - spectre 22 sites occupés - spectre 22 sites occupés - spectre 2
Fluorescence du mutant bW331 (TyrTrp et extinction par la fixation de nucléotides
aux sites catalytiques (E.coli)
0 1 2 3
Vitesse d ’hydrolyse d ’ATP en fonction du nombre de
sites occupés (E.coli)
[D’après Weber J., Wilke-Mounts S., Hammond S.T. et Senior A.E., Biochemistry (1998) 37, 12042-10250 et Lobau S., Weber J. et Senior A.E., Biochemistry (1998) 37, 10846-10853]
PPi
ANP
PPi
PPi
ANP
ATP
ADP + P
système enzymatique
régénérant l'ATPF1-ATPase
mesure des nucléotides libres mesure de la vitesse d'hydrolyse d'ATP
calcul des nucléotides liés
0
1
0.5
1.5
site
s ca
taly
tique
s oc
cupé
s
0.01 0.1 1 10 100 1000
[ANP] libre, µM
1
0.5
0
V / Vmax
[D’après Milgrom Y.M. et Cross R.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 102, 13831-13836]
Scénario pour la synthèse d’ATP
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
Mécanisme de rotation basé sur la combinaison du
mouvement brownien et des contraintes électrostatiques [d’après Junge W., Lill H. et
Engelbrecht S., Trends Biochem. Sci. (1997) 22, 420-423]
mécanisme possible par torsion proton-induite de la sous-unité c [D’après Rastogi V.K. et Girvin M.E., Nature (1999) 402, 263-268]
P43
F54
Y73
D61A24
P43
F54
Y73
D61 A24
pH 8 pH 5
H+
H+ H+H+H+
H+
H+
H+ H+
H+
H+ H+
H+
H+H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+H+
H+
H+
H+H+
H+H+
H+
H+
H+
H+H+
H+
H+H+
H+
H+
H+
H+
H+H+
H+H+
H+
H+
H+
H+ H+
H+
H+H+H+
H+
H+
H+
H+H+
H+
H+H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+H+
H+
H+
H+
H+
H+
déprotoné protoné
La 4ème hélice de la sous-unité a (stator) pourrait jouer un rôle particulier
dans la canalisation des protons[D’après Fillingame R.H., Angevine C. M. & Dmitriev O. Y., Biochim. Biophys. Acta (2002) 1555, 29-36)]
R210R210
résidus accessible à Ag+ après mutation en cystéine
résidus accessible à Ag+ et NEM après mutation en cystéine
[D’après Fillingame R.H., Angevine C. M. & Dmitriev O. Y., Biochim. Biophys. Acta (2002) 1555, 29-36)]
rotation concertée c-H2rotation a-H4mouvement des sous-unités c
+
conformation« bas pH »
conformation« haut pH »
déprotonationde c
+
conformation« bas pH »
conformation «haut pH» contrainte
CYTOPLASME
PÉRIPLASME
tunnel côtécytoplasme cH1
cH2
cH1cH2
aH4
rotation de aH4
+
conformation« bas pH »
conformation« haut pH »
tunnel côtépériplasme
conformation« bas pH »
protonationde c
+
+
conformation« haut pH »
conformation« bas pH »
=
Arg210 Asp61
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
Synthèse d'ATP si n H
~ >Gp
Hydrolyse d'ATP si n H
~ <Gp
Equilibre si n H
~ = Gp
n est la stoechiométrie H +/ATP
H+
H+
ADP + P ATP + H2O
H+
Gp
c c cc
H+ = F - 2,3 RT pH
Gp = G0’+ 2.3 RT log[ATP]
[ADP][Pi]
Equilibre: Gp = n H+ ~
~
~
ADP + PATPADP + PATP
ATP
ADP
Transfert d’électrons
µH+
lumière ADP + P
Différents régimes fonctionnels de l’ATP
synthase(thylacoïdes isolés)
QUELQUES STOECHIOMETRIES H+/ATP
Value Method System Reference Remark3 Flow-flow
proton flow estimatedfrom electron flow
thylakoids withoxidized ATPase
Portis andMcCarty, 1976
overcorrection of theextra proton flow?
3 Flow-flowproton flow estimatedfrom electron flow
thylakoids withoxidized ATPase
Rathenow andRumberg, 1980
time-response?
3.4 [2.4] inintactmitochondria (1)2.2 in smp
Force-force atequilibrium
mung beanmitochondria andsubmitochondrialparticles (smp)
Moore andBonner, 1981
optical probes forpH and.1 proton should besubtracted due to theATP/ADP/P transport
at least 3 Force-force out ofequilibrium (pH and K+jump)Geq extrapolated
thylakoids withoxidized ATPase
Hangarter andGood, 1982
3°CExtrapolationquestionable
3 Force-force atequilibrium
bovine heartsubmitochondrialparticles
Berry andHinkle, 1983
Equilibriuminterpolated morethan really reached;important correctionsfor probe binding
3 [2] Force-force atequilibrium
rat livermitochondria
Woelders et al.,1985
1 proton should besubtracted due to theATP/ADP/P transport
4.5 Force-force out ofequilibrium (light-induced) (1)Geq interpolated
thylakoids withreduced ATPase
Gräber et al.,1987
3 Force-force atequilibrium
thylakoids withreduced ATPase
Strotmann andLohse, 1988Lohse et al.,1989
pH measured with9-AA fluorescence;actinic effect of theanalytic beam
4 Flow-flowproton flow estimatedfrom electron flowForce-force atequilibrium and out ofequilibrium (with Geq
interpolated)
thylakoids withoxidized ATPase
Rumberg et al.,1990
2.7 [1.7],increasd upto 5.5 [4.5]byalmitrine
Flow-flowproton flow estimated byelectrophoretic K+diffusion
yeastmitochondria
Rigoulet et al.,1990
1 proton should besubtracted due to theATP/ADP/P transport
QUELQUES STOECHIOMETRIES H+/ATP (suite)
Value Method System Reference Remark4 [3] Flow-flow
proton flow estimatedfrom electron flow
rat livermitochondria
Hinkle et al.,1991
1 proton should besubtracted due to theATP/ADP/P transport
increasingwith pH,from 3.2 to3.8 (1)decreasingwith pH,from 4.7 to3.3 (2)
Force-force out ofequilibrium (pH jump)Geq extrapolated
vesicles fromSynechococcus(1)chromatophoresfrom R. Rubrum(2)
Krenn et al.,1993
Extrapolationquestionable
4 Flow-flowProton flow estimatedby pH relaxation
Spinachthylakoidmembranes, CF1
in oxidized state
Berry andRumberg, 1996
Initial rates difficultto measure; a lot ofcorrections (justified)
4 Force-force atequilibrium
proteoliposomeswithbacteriorhodopsin and TF0TF1
Pitard et al.,1996
Stoichiometryactually increasingwith BRconcentration.
4 Force-force out ofequilibrium (light-induced) (1)Geq interpolated
thylakoids withreduced ATPase(1)
Van Walravenet al., 1996
A mix of selecteddata from differentgroups, some of thembeing corrected
Force-force atequilibrium (2)
thylakoids withreduced ATPase(2)
Force-force out ofequilibrium (pH jump)(3)Geq interpolated
thylakoids withreduced ATPase(3)
Force-force out ofequilibrium (pH jump)(4)Geq extrapolated
vesicles fromSynechococcus(4)
from 3 to 4,dependingon growthconditions
Force-force out ofequilibrium (light-induced and pH jump)Geq extrapolated
vesicles fromSynechococcus
Van Walravenet al., 1997
Extrapolationquestionablecorrection for kinaseactivity?
4 Force-force out ofequilibrium (pH jump)
CF0CF1-liposomes
Turina et al.,2003
The only publishedvalue posterior to thedetermination of thenumber of c subunits
1
2
3
4 5 6
7
8
910
Nombre de sous-unités c
Structure 3D de MF0MF1 de levure [d’après Stock D., Leslie A.G. et Walker J.E., Science (1999) 286, 1700-1705]
n=10
123
4
5
6
78 9
10
11
12
13
14
Cristal 2D de sous-unités c de CF0CF1. Microscopie de force atomique [d’après Seelert H., Poetsch A., Dencher N.A., Engel A., Stahlberg H. et Müller, D. J., Nature (2000) 405, 418-419]
n=14
Cristal 2D de sous-unités c de Ilyobacter Tartaricus. Microscopie
électronique par transmission [d’après Stahlberg H., Müller D.J., Suda K., Fotiadis D., Engel A., Meier T., Matthey U. et Dimroth P.,
EMBO Rep.(2001)2, 229-233]
n=11
1 23
4
2 nm
5
678910
11
12
13
1415
Cristal 2D de sous-unités c de F0F1 de Spirulina platensis Microscopie de force atomique [d’après Pogoryelov D., Yu J., Meier T., Vonck J., Peter P. & Muller D. J., EMBO Reports (2005)]
n=15
c
total
puits dénergie
LE FAIT QUE LE NOMBRE DE SOUS-UNITES c NE SOIT PAS UN MULTIPLE DE 3 AMELIORE-T-IL LES PERFORMANCES CINETIQUES?
9 sous-unités c
rotation
c
total
rotation
puits dénergie
10 sous-unités c
1
2
+
+
rotation partiellede 33torsion de b
translocation de H
+
rotation de c10 rotation partielleet torsion de 3-4 H
3-4 H
(Mg)ADP + P
(Mg)ATP + H2O
3
relaxation de retour de 33relaxation de b
fixation d’ADPlibération d’ATP
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
Einactif
Eactif
µH+~
µH+~
ADP +Pi
ATP
Le gradient électrochimique de protons a un doublerôle: activateur et énergétique
Evènements liés à l’activation:Changements structuraux de et (CF0CF1)Expulsion d ’ADP fortement lié (CF0CF1)Dissociation ou changement de position du peptide IF1 (MF0MF1)
Facteurs synergiques:Nucléotides non catalytiques ?Réduction de la sous-unité(CF0CF1)
Einactif: ATP synthase inactive en synthèse comme en hydrolyse d ’ATP
100 %
0amplitude du gradient de protons
proportiond’ATPasesactivées
100 %
0amplitude du gradient de protons
proportiond’ATPasesactivées
oxydé réduit
La réduction de la sous-unité , catalysée par une thiorédoxine, facilite l’activation de l’ATPase
thiorédoxine oxydée (E.coli)
thiorédoxine réduite
domaine d’ interaction avec la thiorédoxine (spécifique du CF1,
structure non résolue)
pédo
ncul
e ex
tern
e (s
tato
r)
masqué
ATPsynthasedésactivée
démasqué
ATPsynthaseactivée par legradient de
protons
Une hypothèse de démasquage du site de fixation de la thiorédoxine
en accord avec le mécanisme rotatif
ATPsynthasesynthétisant
de l’ATP
alternativementmasqué et démasqué
[D’après He, X., Miginiac-Maslow, M.., Sigalat, C., Keryer, E. et Haraux, F., J. Biol. Chem. (2000) 275, 13250-13258]
LA SOUS-UNITE bactérienne et chloroplastique est-elle un cliquet moléculaire?
c10
Pontage cQ42C-A117Cactif en hydrolyse d ’ATPactif en synthèse d ’ATP
(d’après Tsunoda et al., 2001)
c10
Pontage L99C-A118Cinactif en hydrolyse d ’ATPactif en synthèse d ’ATP
Interaction possible
CLIQUET
[D ’après Tsunoda S.P., Rodgers A.J., Aggeler R., Wilce M.C., Yoshida M. et Capaldi R.A., Proc Natl Acad. Sci. USA (2001) 98, 6560-6564]
ENLEVER LES RESIDUS CORRESPONDANTS DE LA SOUS-UNITE DE L’ATP SYNTHASE CHLOROPLASTIQUE N ’AFFECTE PAS LA FONCTION ATP SYNTHASE, MAIS DIMINUE LE POUVOIR INHIBITEUR DE (Nowak et al., Biochemistry 41 (2002),15130-15134)
CONFIRMATION DU RÔLE REGULATEUR DE LA PARTIE C-TERMINALE DE LA SOUS-UNITE BACTERIENNE ET CHLOROPLASTIQUE
DANS E.COLI, NE GARDER QUE CETTE PARTIE DE CONSERVE AU MOINS PARTIELLEMENT SON EFFET INHIBITEUR
SI L’ON NE GARDE QUE CETTE PARTIE DE L’ATP SYNTHASE RESTE FONCTIONNELLE MAIS N ’EST PLUS INHIBITEUR
(Kuki et al., J. Biol.Chem. 263 (1988),17437-17442)
REGULATION DES ATP SYNTHASES DE E.COLI ET DE CHLOROPLASTE
Dans E.coli, la régulation fait intervenir la sous-unité , qui peut exister au moins sous deux conformations différentes, haute et basse, de sa partie C-terminale. En conformation haute, l’hydrolyse d’ATP est inhibée, mais pas sa synthèse.L’ADP et le gradient de protons favoriseraient la position haute.L’ATP favoriserait la position basse.Un détecteur d ’ATP pourrait être présent sur la sous-unité .
Dans l’ATPase chloroplastique, la sous-unité inhibe l’hydrolyse d’ATP, également par sa partie C-terminale.Le gradient de protons favorise l’activation de l’enzyme, à la fois pour la synthèse et l’hydrolyse d’ATP. L’hydrolyse d ’ATP est totalement inhibée en absence de gradient de protons. L’ADP, ajouté directement ou provenant de l ’hydrolyse d ’ATP, est inhibiteur.La régulation fait également intervenir la sous-unité . La réduction du pont disulfure de favorise l’activation de l’enzyme. Dans les membranes, cette activation (ou levée d’inhibition) porterait à la fois sur la synthèse et l’hydrolyse de l’ATP.La réduction de a probablement deux effets activateurs différents: un effet direct dû à un changement de conformation de , et un effet indirect de sur la sous-unité diminuant son pouvoir inhibiteur. Il n’y a pas encore d’interprétation structurale de ces effets.
La fonction de cette régulation pourrait être d’adapter l’ATP synthase aux besoins de la cellule, en lui faisant, selon les conditions, synthétiser de l’ATP ou maintenir le gradient de protons à travers la membrane cytoplasmique si celui-ci tend à diminuer. Mais par ailleurs, la disparition totale du gradient de protons conduit à l’inactivation de l’ATPase en présence d’ADP, ce qui est paradoxal.
La fonction de cette régulation pourrait être d’éviter l’hydrolyse de l’ATP en inactivant l’enzyme durant les périodes où la chaîne de transfert d’électrons ne génère pas de force protomotrice, par exemple la nuit.
Toutefois, le rôle de la forme oxydée et de la forme réduite n’est pas clair. In vivo, la forme réduite pourrait être constamment active.
Conclusion: malgré la parenté structurale et fonctionnelle évidente entre les sous-unités bactérienne et chloroplastique, les modalités de la régulation de l’activité ATPasique peuvent différer notablement. De plus, cette régulation n’a peut-être pas le même rôle physiologique dans ces deux systèmes.
c10
c10
IF1
Dans le cas de l'ATPase mitochondriale, seule existe la configuration où les deux hélices de la sous-unité sont plaquées sur la couronne des sous-unités c. Cette configuration est non inhibitrice. Même si les hélices avaient envie de basculer vers le haut, la présence de la sous-unité additionnelle les en empêche.
Dans ce cas, le rôle inhibiteur est rempli par
une sous-unité dissociable, IF1
La force protomotrice (ou la rotation de l’enzyme dans le sens de la synthèse d ’ATP?) favorise la dissociation de IF1, ou éventuellement sa fixation sur un site non inhibiteur. La dissipation de la force protomotrice (ou plutôt la rotation dans le sens de l ’hydrolyse?) entraîne l’inhibition.
INHIBITION DES F1-ATPases MITOCHONDRIALES
LES EFFECTEURS CONNUS DE L’INTERACTION IF1-MF0MF1
Nter
Cter
Nter
Cter
Nter
Cter
Cter
Nter
Tétramère de IF1 animal (Cabezon et al., 2001)
force protomotricepH élevé
ATP
pH faible
IF1 8-49
DPDP
E
ETP
TP
DPDP
IF1 8-49
Gledhill, J. R.., Montgomery, M.G., Leslie, G. W. & Walker, J. E. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 15671-15676
REGULATION DES ATP SYNTHASES MITOCHONDRIALES
Dans les mitochondries, l’hydrolyse d ’ATP est inhibée par un peptide inhibiteur appelé IF1. IF1 inhibe l’ATPase de façon stoechiométrique.L’inhibiteur IF1 (de boeuf) se fixe sur l ’ATPase à l ’interface et interagit aussi avec , quoique plus faiblement.La composante électrique du gradient de protons () favorise la dissociation de IF1.Un pH élevé favorise la dissociation de IF1.L’ATPase ne peut fixer IF1 que si elle est en train d’hydrolyser de l ’ATP.
Il a été proposé que IF1 pourrait rester fixé sur l’ATP synthase en n’inhibant que l’hydrolyse de l’ATP, mais pas sa synthèse.
Propriétés spécifiques au modèle bovinLe peptide IF1 de boeuf existe sous forme dimérique et tétramérique. Le tétramère serait inactif.Un pH élevé favorise la tétramérisation du IF1. In vitro (sous-complexe MF1 purifié), la fixation de IF1 favorise la formation de dimères d’ATPase. Cette propriété n ’est pas nécessairement extrapolable au complexe lié à la membrane.
Propriétés spécifiques au modèle levureSaccharomyces cerevisiae possède deux peptides inhibiteurs de l’ATPase mitochondriale, IF1 et STF1. Leurs séquences sont très proches.Les propriétés d’oligomérisation de ces deux peptides sont différentes de celles du IF1 de boeuf.La seule différence fonctionnelle claire entre IF1 et STF1 est que l’affinité de STF1 pour l’ATP synthase est nettement plus faible que celle de IF1.A l’heure actuelle, personne ne sait à quoi sert STF1, ni même s’il sert à quelque chose.
Le rôle physiologique de l’inhibition de l’hydrolyse d’ATP par IF1 pourrait être d’éviter l’hydrolyse d’ATP lors d’arrêts de la chaîne respiratoire.
Cependant, d’autres phénomènes limitent déjà sévèrement l’hydrolyse de l’ATP dans les mitochondries. IF1 pourrait devenir réellement nécessaire si la membrane mitochondriale devenait in vivo très perméable aux protons (ouverture du «MPT», situations pré-apoptotiques, etc).
On pourrait imaginer que IF1, en empêchant la génération d’un gradient de protons lors d’arrêts de la chaîne respiratoire, limite l’apparition de radicaux libres.
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
V0
V1
nomenclature MM correspondanceF0F1
rôle
A 73 nucléotidescatalytique
B 58 nucléotidenon
catalytiqueC 40D 34 E 33F 14
1003819
c 17 c protons
Modèle structural de l’ATPase des vésicules tapissées [d’après Arata Y., Nishi T., Kawasaki-Nishi S., Shao E., Wilkens S. & Forgac M., Biochim. Biophys. Acta (2001) 1555, 71-74]
Les cousins proches: les ATPases vacuolaires et apparentées
UI
U
UI
sous-unité c
-type V0 (6 copies)
type F0 ou A0
(9-12 copies)
U
I I-
Structure de l’ATPase de Clostridium fervidus vue en microscopie électronique [D’après Boekema E.J.,
Ubbink-Kok T., Lolkema J.S., Brisson A. et Konings W.N., Proc. Natl Acad. Sci. USA. (1997) 94, 14291-
14293]
H
CB A
B
A
a
E d
B
D
A
G2
c4c’c’’
F
c c c cc
b
F-ATPase
a
V-ATPase
cc’’
A BB
cc
GE
d F
A A
D
B
c c’
C
H
a
c4-5c’c’’
adapté d’après [Wilkens S., Inoue T. et Forgac M. (2004) J. Biol. Chem. 279, 41942-41949]
appartiennent au rotor (expérience de rotation)
structure de la sous-unité C (Iwata M., Imamura H., Stambouli E., Ikeda C., Tamakoshi M., NagataK., Makyio H., Hankamer B., Barber J., Yoshida M., Yokoyama K. et Iwata S. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 59-64)
C
non essentielle pour l’assemblage (rôle activateur ?)
appartient au pédoncule périphérique pour tout le monde, sauf pour un groupe qui pense qu’elle appartient à l’axe central (Lolkema J. S., Chaban Y. et Boekema E. (2003) J. Bioenerg. Biomembr. 35, 323-335; Chaban Y. L., Coskun Ü, Keegstra W., Oostergetel G. T., Boekema E. J. et Grüber G. (2004) J. Biol. Chem., sous presse
appartient au stator (expérience de rotation)
structure de la sous-unité H (Sagerann M., Stevens T. H. et Matthews B. W. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 7134-7139)
H
c c c cca
b
F1 et F0 actifs
Dissociation F0 F1 biochimique
c c c cca
bH+
ATP
iADP+P
cc’’
A BB
cc
GE
d F
A A
D
B
c c’
C
H
a
Dissociation V0 V1 physiologique
A BB
G
F
A A
D
B
H
cc’’cc
d
c c’a
EC ??
V1 et V0 inactifs
F D
BA A
bille
His-Tag
[d’après Imamura H., Nakano M., Noji H., Muneyuki E., Ohkuma S., et Yoshida M. et Yokoyama K. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2312-2315]
intervalles de temps: 33 ms
c
ABB
c
G EF
A A
D
B
ca His-Tag
[d’après Hirata T., Iwamoto-Kihara A., Sun-Wada G.-H., Okajima T, Wada Y. et Futai M. (2003) J. Biol. Chem. 278, 23714-23719]
actineintervalles de temps: 10 ms
côté V1
La sous-unité c de la V-ATPase de S. cerevisiae
E137A
A
GI I
IY
GL
V70V
S
S
V
VL
CY
AKSGVGICATCVLRPD
L50L
FK
TG
N IV
PYA
AG
V IM
LS
TF
II
AA
A
S
CG
G
I
FF
P
P
AYV
M T E LC
LG
80QK
Q A L Y T G FIQ90LGA
G
G
LS
V
L
S100G
LA
AGF
AI
GI 110
VG DAG
VR
G S S Q Q P R LF VG
I 130
LL
L
F A
VG 140
L
L
Y G
IV A
L LLNSRATQ D V V C 160
I
I
M
sous-unité c sous-unité c’
sous-unité c’’
M1
P12
E145
I II III IV
A39 S59
L84 C101
V124 G136
N159
E164
E137
I II III IV
M1
P6
A33N53
L78 A93
V116 G128
N151
C160
F80
L62
M1
?
M100
E108
L125 A148
A171 K183
A206
Q213
[D’après Nelson N. et Harvey W.R., Physiol. Rev. (1999) 79, 361-385]
Quelques fonctions des ATPases de type V
1. Dans la membrane cytoplasmique de certaines cellules.
Energisation de la membrane apicale de l’épithélium de l’intestin moyenchez les Lépidoptères. Excrétion de potassium par un échangeur électrophorétiqueH+/K+
Energisation de la membrane apicale de l’épiderme de grenouille.Absorption de Na+ par un antiport H+/Na+, et du Cl - par un échangeurélectrophorétique Cl-/HCO3
-
Excrétion d’ions H+ de plusieurs types de cellules : cellules rénales,macrophages, ostéoclastes.
Acidification des phagosomes (activation des protéases et des lipases).
Acidification des vésicules chromaffines et des vésicules synaptiquesconduisant à l’accumulation de neurotransmetteurs.
Energisation de la membrane des vacuoles de plantes pour effectuer destransports secondaires (Na+, Ca2+, métabolites).
Acidification des endosomes (dissociation pH-dépendante des ligands deleurs récepteurs).
Acidification des lysosomes (activation des réactions de dégradation).
Quelques modes de régulation des ATPases de type V
Régulation rédox : pontage de deux cystéines situées dans les sous-unitéscatalytiques. La forme oxydée (pontée) est inactive.
Dissociation réversible de la partie V 0 et de la partie V 1, produisant deuxsous-complexes inactifs.
Interaction avec des effecteurs spécifiques.
2. Dans les différents compartiments cellulaires
lumenATPADP + Pi
H+
2 H+
K+cellule
épithéliale
Déconnexion de V0 et V1 dans l’épithélium de l’intestin moyen d’une chenille durant la mue
[d’après Sumner J.P., Dow J.A., Earley F.G., Klein U., Jager D. et Wieczorek H., J. Biol. Chem. (1995) 270, 5649-5653]
(La chenille photographiée n’est pas de la même espèce que celle de l’expérience; elle provient d’un site WEB:
http://www.univ-lille1.fr/orchid/frichorc/orinjava.htm#../premices/prem_p11.htm)
RER
Golgi
vésicule de tri
lysosome
vésicule d’endocytose
vésicule d’exocytose
recyclage des récepteurs
vésicule de
transport
recyclage des récepteurs
Vésicules et trafic cellulaire
H+
H+
Cl-
H+
Cl-
H+
H+
H+H+ H+
H+
Cl- Cl-
Cl-
vésicule tapissée
endosomeprécoce
endosometardif
lysosome pH 5
compartiment de découplage ligand-récepteur pH 5,5
fusion
recyclage des récepteurs
membrane plasmique
[d’après Forgac M., Adv. Mol. Cell Biol. (1998) 23B, 403-453]
clathrine
récepteur
ligand
membrane
adaptateurV-ATPase
Un modèle (contesté) d ’internalisation de la V-ATPase lors des étapes précoces de l’endocytose
[d’après Forgac M., Adv. Mol. Cell Biol. (1998) 23B, 403-453]
La stoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon ?
pignon à6 dents
sous-unité de typeATPase vacuolairegroupe protonable
modèle biochimique à6 groupes protonables
sous-unité de typeATP synthasegroupe protonable
pignon à12 dents
modèle biochimique à12 groupes protonables
Glu139
Glu139
Le rotor de la V-ATPase d’Enterococcus hirae contient dix segments protonables
[Murata T., Yamato I., Kakinuma Y., Leslie A.G. & Walker J.E. Science (2005) 308, 654-659]
Localisation et fonction des ATP synthases
Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme
Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité
Structure détaillée de la partie F1
Les sites nucléotidiquesL’axe central
Structure de la partie F0
Architecture du complexe F0F1
Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b
Mécanisme de la partie F1
Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif
Mécanisme de la partie F0
Couplage entre F0 et F1
Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes
Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli
Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste
Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1
Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon
Les hélicases hexamériques
Les cousins éloignés: les hélicases
hélicase hexamérique de papillomavirus
[d’après Fouts E.T., Yu X., Egelman E.H. et Botchan M.R., J. Biol. Chem. (1999) 274, 4447-4458]
5 ’
3 ’
H2OATP
ATP
ADP + Pi ATP
ATP ATP
ADP + Pi
ADP + Pi
ATP ATP ATP
Changement de conformation
Une hélicase hexamérique au travail [D’après Ahnert P. et Patel S.S., J Biol Chem. (1997) 272, 32267-32273]
Mécanisme proposé pour une hélicase hexamérique, comparable à celui de la F1-ATPase
[d’après Hingorani M.M., Washington M.T., Moore K.C. et Patel S.S., Proc. Natl Acad. Sci. USA. (1997) 94, 5012-5017]
?
brin retardé
brin direct
protéines
fragment d'Okazaki
polymérase
clamp
clamp
Facteur
primasepolymérase
hélicase
La fourche de réplication (ou réplisome en langage moderne) est composée de moteurs moléculaires synchronisés
Léonard de Vinci (1452-1519)
Etude des vertèbres cervicales de la base du crâne (Royal Collection, Londres)
Etude des vertèbres cervicales; analogie avec un mât de navire (Royal Collection,
Londres)