Disciplina: Introdução à Biotecnologia

Estratégias Moleculares na Avaliação da Diversidade Microbiana em Amostras

AmbientaisAluna: Catarina Macedo de

Figueirêdo

Orientadora: Margarida Matos de Mendonça

7 - 100 Milhões 7 - 100 Milhões ⇨ ⇨ estima-seestima-se ser o número ser o número real de seres vivos;real de seres vivos;

1,5 Milhões de organismos vivos 1,5 Milhões de organismos vivos ⇨ ⇨ identificados. identificados.

Diversidade Diversidade MicrobianaMicrobiana

• Bactérias ⇨ 5 mil espécies ⇨ 100 mil a 1 milhão de espécies

• Fungos ⇨ 100 mil espécies ⇨ 200 patogênicas aos seres vivos

• Protozoários ⇨ 20 mil espécies ⇨ poucas são patogênicas. (TORTORA, et al., (TORTORA, et al.,

2005)2005)

Ambientes da Diversidade Ambientes da Diversidade MicrobianaMicrobiana

Ampla MicrobiotaAmpla Microbiota• Solo RizósféricosSolo Rizósféricos• Águas ResiduaisÁguas Residuais• Sistemas de Lodo Sistemas de Lodo

AtivadoAtivado

Baixa MicrobiotaBaixa Microbiota• ArAr• Ambientes MarinhosAmbientes Marinhos• Águas DocesÁguas Doces• SoloSolo

Avaliação da Diversidade Microbiana

• Diversidade Microbiana⇨ fracamente conhecida ⇒ culturabilidade.

CULTURABILIDADE

CULTURA PURA

TÉCNICAS MOLECULAR

ES

NOVAS TÉCNICAS

DE CULTIVO

www.bdt.fat.orwww.bdt.fat.org.brg.br

Estratégias de Estratégias de DetecçãoDetecção

Técnicas- Detecção- Detecção

- - IdentificaçãoIdentificação

- - QuantificaçãoQuantificação

Dependente de Cultivo

Independente de Cultivo

Técnicas dependentes de Técnicas dependentes de cultivocultivo

• Culturas PurasCulturas Puras

• Isolamento

• Cultivo

• Identificação

• Falha na detecção de microrganismos.

• Complexa formulação dos meios de cultura.

• Técnicas clássicas: bioquímica e microbiologia ➭baixa determinação da biomassa e da estrutura.

• Falsa representação da diversidade microbiana em amostras ambientais.

• Tempo.(HURST, et al., (HURST, et al., 1997)1997)

Técnicas independentes de Técnicas independentes de cultivo cultivo

• Descrição da diversidade microbiana;

• Definição da estrutura e dinâmica de comunidades complexas;

• Técnicas moleculares;

• Desenvolvimento de novos métodos moleculares de identificação de microrganismos não cultiváveis.

(WALNER, et al., 1997; LEE, et al., 1999; NILSEN, et al., 1999; (WALNER, et al., 1997; LEE, et al., 1999; NILSEN, et al., 1999; FOSTER, et al., 2003)FOSTER, et al., 2003)

Águas Águas ResiduaisResiduais

EsgotoEsgoto::

“ Líquido caracterizado pelos despejos provenientes das diversas modalidades de uso e de origem das águas, tais como as de uso doméstico, comercial, industrial, utilidade pública, de áreas agrícolas, de superfície, de infiltrações, pluviais e de outros efluentes sanitários.”

(JORDÃO & PESSOA, 1995)(JORDÃO & PESSOA, 1995)

Esgotos

•Domésticos – Despejos domésticos, pluviais, infiltrações e pequenas parcelas industriais•Industriais – provêm de qualquer utilização da água para fins industriais.

Características do Esgoto

- Físicas

• Matéria sólida

• Odor

• Cor e turbidez (JORDÃO & PESSOA, (JORDÃO & PESSOA,

1995)1995)

- Químicas

•Matéria Orgânica: proteínas, carboidratos, gorduras e óleos, uréia, surfactantes, fenóis, pesticidas

•Matéria inorgânica: areia, substâncias minerais dissolvidas.

- Microbiológicas

• Bactérias• Fungos•Vírus•Algas•Protozoários

(JORDÃO & PESSOA, 1995)

Tratamento de Esgoto

Objetivo: “ Separar a água dos componentes sólidos, com a

intenção de purificar a água, tornando-a livre de patógenos e poluentes, podendo ser liberada ao meio ambiente.”

(HURST, et al., 1997) Etapas:

• Processo físico

• Processo químico

• Processo biológico (JORDÃO & PESSOA, (JORDÃO & PESSOA,

1995)1995)

Tratamento de Tratamento de EsgotoEsgoto

TratameTratamento nto

PrimárioPrimário

TratameTratamento nto

SecundárSecundárioio

TratameTratamento nto

TerciáriTerciárioo

ProcesProcesso so

QuímiQuímicoco

ProcessProcesso o

BiológiBiológicoco

ProcesProcesso so

FísicoFísico

Tratamento de Tratamento de EsgotoEsgoto

Processo biológico•Oxidação do lodo (aeróbia)

•Digestão do lodo (anaeróbia) Lodo

ativado É uma fase essencialmente biológica no sistema de tratamento de esgoto doméstico e industrial, realizada aerobicamente.“ O lodo ativado é composto por materiais sedimentados provenientes das seqüências de águas residuais e de sólidos gerados pelo processo de tratamento de esgoto” (DAVIS & CORNWELL,

1998)

Lodo Lodo AtivadoAtivado

• MicrorganismosMicrorganismos

Forma Forma livrelivre

Agregada - Agregada - flocosflocos

• AeraçãAeraçãoo

- Agitação- Agitação

- Suplemento de - Suplemento de OO22

- Dispersão - Dispersão microbianamicrobiana

• SedimentaçSedimentaçãoão

- Biomassa floculadaBiomassa floculada

-Sólidos Sólidos ⇨⇨ retornam ao retornam ao compartimento aeróbicocompartimento aeróbico

Lodo Ativado

Compostos orgânicos

[ O2 ]

Compostos inorgânicos

Multiplicação Crescimento celular

Produção de energia

Produção de CO2, NO3, O2, SO4, PO 4, H2O.

Lodo Ativado

• Características Físico-Químicas: Matéria orgânica, nutrientes, metais pesados, compostos inorgânicos potencialmente tóxicos.

• Finalização inadequada do tratamento:

Riscos à saúde, acúmulo de metais pesados ou compostos orgânicos no solo ou no efluente.

• Microbiologia do Lodo Ativado

(GONÇALVES, et al., 1999)

- Diversidade microbiana- Dinâmica das populações- Predomínio bacteriano

(GRAY, 1990)

Lodo Lodo AtivadoAtivado

Bactérias• Dispersas na fase líquida• Associadas ao floco e participando de sua

estrutura• Associadas ao floco, mas não participando da sua

formação• Bactérias do afluente ≠ bactérias do lodo

• Fatores

- pH- Temperatura- O2

- Nutrientes- Agitação- Carga afluente- Idade.

(HURST, et al., 1999; GRAY, (HURST, et al., 1999; GRAY, 1990)1990)

Lodo Ativado

Acinetobacter Hyphomicrobium

Alcaligenes Microbacterium

Bacillus Pseudomonas

Brevibacillus Sphaerotilus

Canlobacter Debaromyces

Comomonas Flavobacterium

Cytophaga

Gêneros envolvidos no consumo da matéria orgânica

(GRAY, 1990)

Lodo Lodo AtivadoAtivado

Nitrificantes DesnitrificantesUréia ⇨ NH4⇨ NO3 NO3 ⇨

N2Nitrosomonas Pseudomonas

Nitrospira Denitrobacillus

Nitrocystis Spirillum

Nitroglea Micrococcus

Nitrobacter Xanthomonas

Nitrococcus

Nitrospina

(GRAY, 1990)(GRAY, 1990)

Fungos• Pequena incidência;• Estão associados à estrutura do floco• Associado a Idade• pH < 6,0 ⇨ dominância fúngica

Protozoários• Componente comum;• Gêneros resistentes ⇨ Giardia e

Cryptosporidium

Lodo Ativado

Lodo Lodo AtivadoAtivado

Vírus• Organismos aquáticos ou patógenos ao

homem.• Grupos Presentes: Enterovirus Orthoreovirus Rotavirus Mastaadenovirus• Bacteriófagos ⇨ material fecal

Doenças entéricas

Técnicas Moleculares Utilizadas na Identificação Microbiana no

Lodo Ativado

Métodos Tradicionais

• Isolamento;

•Identificação: morfologia e bioquímica. (LIU, et al.,

2005)

Métodos Moleculares: Estudo das sequências de rRNA.

Identificação da microbiota

Técnica independente de

cultivo

Determinação da

diversidade

(DAHLLOF, 2002)

CULTURA

FISHFISH AMOSTRAMOSTRASAS

PCR in situ

EXTRAÇÃEXTRAÇÃOO

PCR

SEQÜÊNCIAMENTO

CLONAGEM DGGE, TGGE

MICROARRANJOS

HIBRIDIZAÇÃHIBRIDIZAÇÃOO

(DAHLLOF, (DAHLLOF, 2002)2002)

Hibridização in situ e FISH

Metodologia• Hibridização de uma seqüência alvo de DNA ou

de RNA com uma sonda de oligonucleotídeos marcada quimicamente ou radioativamente.

• Sondas ➭ Específicas Identificação dos ➭microrganismos.

FISH• Técnica Molecular ➭ Independente de cultivo• Possibilidade de identificação da diversidade

microbiana, sem alteração da sua estrutura espacial.

(COOPER, 2002; ALBERTS, et al., 2006)

FISH na avaliação da diversidade microbiana no

Lodo Ativado

Inúmeros trabalhos relatam a utilização da técnica de FISH na avaliação da diversidade microbiana nos sistemas de Lodo Ativado.

FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado

Chen et al., 2003

Análise de seqüências específicas de 16S rRNA

Estudo as alterações na prevalência de organismos de acordo com a concentração de cloro:

•Concentração de Cl- ⇒ 10 - 30 mg/L

•Oxidantes de NH4 ⇒ Predominância de Nitrossomonas

•Oxidantes de NO2 ⇒ Nitrobacter

•Redução do floco ⇒ ↑ da [ Cl-]

•Até 10 mg/L ⇒ mesma predominância ⇒ ↑ 10 mg/L diferentes espécies de Nitrossomonas

• Nitrobacter ⇒ Predominância contínua.

Fonte: CHEN, et al., Fonte: CHEN, et al., 20032003

Fonte: Chen et al., 2003

Liu et al., 2005

FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado

Análise de seqüências específicas das subunidades 16S do rRNA. Estudo para identificação das EBPR (bactérias removedoras de P).

• Análise do PPs intracelulares (PAOs) ⇒ DAPI• Sondas: EUB 338, GAM 42ª, ACA 23• Protebacteria ⇒ Prevalência de 70 % ⇒ -Proteobacteria ⇒ 60 %

• Gênero Acinetobacter ⇒ 31 % ⇒ Não caracterizada como PAO (organismo acumulador de polifosfatos)

• PAOs não foram caracterizados ⇒ sequênciamento ⇒ pequena similaridade com Banco de Genes.

Wong et al., 2005

FISH na avaliação da diversidade FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativadomicrobiana no Lodo Ativado

Hibridização de seqüências – alvo de rRNA com sondas fluorescência (FISH)

Estudo para identificação de EBPRs ⇒ PAOs, GBs

• Sondas: EUB mix, PAO mix, actino_1011

• EUB mix ⇒ 9 % de PAOs

• Rhodocyclus ⇒ β- Proteobacteria

predominância dentre as PAOs ⇒ 10-30% das Eubacteria

•Tretrasphera ⇒ Actinobacteria ⇒ actino_1011 ⇒ 7-10%;

• β- Proteobacteria apresentaram-se predominantes com 25%

• 30-60% da população ⇒ EBPRs

Conclusões

Vantagens da Utilização da Técnica de FISH:

• FISH possibilita a avaliação da diversidade microbiana sem a necessidade de cultivo;

• Possibilita a quantificação e determinação da estrutura da comunidade microbiana;

• Permite a detecção das alterações da prevalência microbiana nas comunidades estudadas;

• Diversas metodologias que podem ser específicas às células a serem hibridizadas;

• Técnicas de metodologias relativamente rápidas e de fácil execução, em relação às técnicas dependentes de cultivo.

Desvantagens da utilização da Técnica de FISH:

• Identificação de microrganismos específicos;• Na determinação da microbiota de uma comunidade ⇨

utilização de muitas sondas diferentes; • Custo relativamente alto;• Sobreposição das sondas hibridizadas ⇨ Alteração das

cores emitidas pelas sondas ⇨ dificuldade na identificação do microrganismo;

• Metodologias dependentes da permeabilidade dos microrganismos em relação a entrada das sondas.