diseÑo de farmacoforos peptidicos con efecto …
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DISEÑO DE FARMACOFOROS PEPTIDICOS CON EFECTO
ANTIBACTERIAL
Paula Cortés García
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Carrera de Biología
Bogotá, Julio de 2001
DISEÑO DE FARMACOFOROS PEPTIDICOS CON EFECTO
ANTIBACTERIAL
Paula Cortés García
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para obtener el título de
BIÓLOGO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
Bogotá, D.C.
Julio de 2001
Nota de advertencia
Articulo 23 de la resolución N° 13 de julio de 1946: “La Universidad no se
hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus
trabajos de grado”.
DISEÑO DE FARMACOFOROS PEPTIDICOS CON EFECTO
ANTIBACTERIAL
Paula Cortés García
__________________________________________
Leonardo Rene Lareo. Msc., Director.
__________________________________________
Jurado 1
__________________________________________
Jurado 2
__________________________________________
Luz Mercedes Santamaría. Directora Carrera Biología
__________________________________________
Carlos Corredor, PhD., Decano Académico
TABLA DE CONTENIDOS
Página
INTRODUCCION
2 MARCO TEORICO 4
2.1 Historia De La Farmacología 4
2.2 Diseño Computacional De Fármacos 5
2.2.1 Diseño De Péptidos Miméticos 6
2.2.2 Diseño De Péptidos Análogos 6
2.2.3 Diseño Por Homología Y Similitud De
Estructuras 7
2.2.4 Diseño Por Enhebramiento De Las Familias
De Plegamientos 8
2.3 Herramientas De La Biología Molecular
Computacional 9
2.3.1 Alineamientos 12
2.3.2 Secuencias Consenso 13
2.4 Los Motivos 13
2.5 Estadística 14
2.6 Manipulación molecular en SpdbViewer 15
2.7 Mecanismos De Acción Peptídica 15
2.7.1 Péptidos Antimicrobianos Que Irrumpen En
Superficies Polianionicas 17
2.7.2 Péptidos Antimicrobianos Que Atraviesan La
Membrana 18
2.7.3 Péptidos Antimicrobianos Que Ocasionan
Estrés Hídrico Y Por Ello Curvatura En La
Membrana 18
2.7.4 Translocación De Péptidos Antimicrobianos
A Través De Las Bicapas Lipidicas 19
2.7.5 Asociación Péptido Péptido 20
2.7.6 Irrupción De Péptidos En La Membrana Como
Detergentes 20
2.7.7 Péptidos Inhibidores De La Síntesis De DNA 20
2.8 Antibióticos Y Péptidos Antimicrobianos 21
2.8.1 Antibióticos Medicinales 21
2.8.2 Péptidos Antimicrobianos (Antibacterianos) 22
2.9 Estructura De Los Péptidos Antibacterianos 23
2.9.1 Estructuras Peptídicas 23
2.9.2 Péptidos Antimicrobianos Con Hélice Alfa 25
2.9.3 Hélices Alfa Y Acido Alfaaminoisobutirico 27
2.9.4 Péptidos Antimicrobianos Y Pequeñas
Proteínas Con Laminas Beta 27
2.9.5 Péptidos Antimicrobianos Con Anillo Tioeter 28
2.9.6 Péptidos Macrociclicos Antimicrobianos Con
Nudo De Cisteina 29
2.10 Características Requeridas Para Invadir
Microorganismos Patógenos 29
3. FORMULACION DEL PROBLEMA 32
4. JUSTIFICACION 33
5. ANTECEDENTES 34
6. OBJETIVOS 35
6.1Objetivo General 35
6.2Objetivos Específicos 35
7. MATERIALES Y METODOS 36
8. RESULTADOS 39
9. DISCUSION 54
10. CONCLUSIONES 68
11. RECOMENDACIONES 69
BIBLIOGRAFIA
ANEXOS
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1: Arbol obtenido del agrupamiento de las secuencias. 43
Figura 2: Estructura de la Defensina 1Ica reportada en PDB,
esta presenta cuatro formaciones al azar, una hélice
alfa y un pliegue beta, estructura resuelta por
resonancia magnética nuclear NMR. 49
Figura 3: Segmento de la Defensina 1Ica, el cual equivale a la
zona donde se encuentra el motivo. 50
Figura 4: Estructura de la Defensina propuesta. 51
Figura 5: Cecropina 1bb9 hallada en PDB; presenta formaciones
al azar, cinco láminas beta y dos hélices alfa,
estructura resuelta por difracción de rayos X. 52
Figura 6: Segmento de cecropina 1bb9 que equivale a la zona
donde se encuentra el motivo, presenta un total de ocho
residuos. 53
Figura 7: Cecropina, diseñada con base en las restricciones
propuestas, presenta un total de once aminoácidos. 53
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1: Código de péptidos antibacterianos resultados de la
búsqueda de péptidos antibacterianos en la base de
datos del NCBI descritas con código locus. 40
Tabla 2: Primer banco de secuencias. 41
Tabla 3:Tabla de motivos encontrados en las diferentes familias
proteicas. Hallados en la base de datos PROSITE. 45
Tabla 4: Secuencias consenso. 46
Tabla 5: Péptidos diseñados. 48
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1: Alineamiento del primer banco de secuencias.
Anexo 2: Matriz de similitud obtenidos a partir del alineamiento con
ClustalW.
RESUMEN
Paula Cortés García y Leonardo Rene Lareo
Encontrar la solución a las enfermedades de carácter bacteriano es
inminente cuando las formas actuales no han podido vencer la
adaptabilidad de estos patógenos a los antibióticos existentes.
Por medio de una búsqueda de secuencias peptidicas con efecto
antibacteriano en la base de datos del National Center for Biotechnology
Information (NCBI) se estableció un banco de secuencias antibacterianas,
estas se alinearon y determinaron las similitudes entre ellas, luego estas
se agruparon en un árbol de vinculamiento simple. Las agrupaciones que
presentaron mayor cercanía en distancia de vínculo y similitudes
superiores al 50% se sometieron a la búsqueda de patrones comunes y
Motivos proteicos. Se buscaron los péptidos que salieron de la búsqueda
de motivos dentro del Protein Data Bank y con base en los
alineamientos, los datos de similitud de secuencias, los motivos y la
información estructural obtenida se diseñaron 20 péptidos con posible
efecto antibacteriano, a dos de estos se les predijo la estructura que en
general se mantuvo conservada respecto a sus homólogos.
INTRODUCCIÓN
En el siglo XIX la química analítica, en particular el aislamiento y
purificación de los compuestos activos de las plantas medicinales,
demostraron su valor a la medicina; descubrimientos como la morfina en
1815, y la papaverina en 1848, lograron brindar una nueva visión en el
campo farmacológico logrando despertar el interés de las compañías que
trabajaban en el descubrimiento, síntesis y comercialización de fármacos
(Rosamond & Allsop 2000).
La industria farmacéutica es relativamente nueva, pues nació con el
desarrollo de la química no hace más de 70 años (Normille & Marshall
2000). En 1939 Alexander Fleming descubrió la penicilina, hecho que
abrió las puertas a una nueva era en el tratamiento de las infecciones
bacterianas. Hoy en día la farmacología, es considerada no solo como
una ciencia que busca la solución más efectiva al tratamiento de toda
clase de enfermedades sino como el organismo encargado de
proporcionar al público los medicamentos menos contraproducentes.
La industria de los fármacos desde sus inicios a tenido un carácter muy
experimental y a través del tiempo se ha convertido en una área de
trabajo interdisciplinario para químicos, ingenieros, biólogos, veterinarios
y médicos entre otros que tienen que afrontar su problemática
permanentemente.
El diseño molecular de medicamentos a través de péptidos farmacóforos
es una de las vías que se esta implementando actualmente en los
diferentes laboratorios del mundo. Esta vía maneja por medios
computacionales la información molecular de cada sustancia. Tiene en
cuenta aspectos físicos, químicos y biológicos de las moléculas, que
luego de ser analizados pasan a una etapa de experimentación, trayendo
como ventaja la disminución de los costos y del tiempo de investigación;
por ello la podemos considerar como una herramienta indispensable que
actualmente contribuye al desarrollo de la industria farmacológica (Amzel
& Herbert 1999 en Zeng 1999).
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Historia de la farmacología
La farmacia se conoce actualmente como la ciencia que ocupa la
preparación de medicamentos. Inicialmente el ejercicio de la farmacia se
confundía con el de la medicina en general, siendo el médico, sacerdote
o curandero quien proporcionaba los medicamentos a los enfermos. Hacia
el año de 1300 antes de Cristo surgieron los herboristas, desarrollaron la
Doctrina de los Signos o medicina homeopática, que relaciona la
enfermedad con una planta, por la forma de sus hojas o flores; así por
ejemplo las hojas o flores con forma de corazón se recomendaban para
las enfermedades cardiacas (Bonnenmain & Bové, 1999).
La medicina moderna tiene sus raíces en las antiguas civilizaciones del
Oriente Medio y del Mediterráneo. El griego Hipócrates, que vivió unos
400 años antes de nuestra era, fue considerado el padre de la medicina,
en su época existían múltiples recetas y estas eran esculpidas en las
columnas de Grecia y Roma (Bonnenmain & Bové, 1999). Todos los
pueblos han encontrado medios para tratar las enfermedades, el uso de
plantas medicinales ha sido la forma más universal. El auge de las
farmacias ocurre entre los árabes quienes hacen de Bagdad la cuna de
la farmacia moderna.
En la edad Media la farmacia fue casi exclusivamente ejercida por los
monjes y durante siglos estuvo impregnada de superstición y
curanderismo. Poco a poco se fue estableciendo la diferencia entre el que
curaba las enfermedades y prescribía los medicamentos y quien los
preparaba. Desde antes de los 60s hasta finales de los 80s los
medicamentos no se volvieron a realizar en las farmacias, sino en los
laboratorios industriales; donde se preparaban medicamentos; éstos se
obtenían por medio de la experimentación con los compuestos activos
que hipotéticamente funcionaban en los organismos (Drew, 2000).
2.2 Diseño computacional de fármacos
Las drogas que se medican actualmente fueron encontradas luego de una
observación en la que se establecieron los efectos de éstas sobre los
humanos, y hoy en día estas substancias naturales o sintéticas son
usadas en el área medicinal. Los métodos tradicionales en el
descubrimiento de drogas están empezando a ser substituidos desde la
ultima década, por una aproximación más directa que hace posible
entender y probar las interacciones moleculares que se presentan en las
enfermedades (Bugg, Carson & Montgomery, 1993).
En el diseño computacional de medicamentos se emplean muchos
programas de modelación y construcción de sustancias que simulan la
estructura tridimensional de biomoléculas como las proteínas, estos
programas permiten explorar y realizar cambios conformacionales en las
moléculas, realizar mutaciones puntuales en DNA, crear o quitar puentes
de hidrógeno, cuantificar interacciones iónicas y establecer modelos con
altas probabilidades de uso en las condiciones requeridas que sirven
como base para hacer farmacóforos.
2.2.1 Diseño de péptidos miméticos
Para este estudio, se definen como péptidos que no conservan
necesariamente la composición de aminoácidos y los valores de energía
potencial del nativo, pero que simulan la estructura y función del péptido
original.
La simulación puede dar resultados favorables o desfavorables con
respecto a la estructura, a la actividad biológica y a la afinidad con el
receptor (Poveda, 2000).
2.2.2 Diseño de péptidos análogos
Son péptidos iguales al nativo en términos de composición de
aminoácidos, pero que pueden tener o no otras modificaciones, por
ejemplo cambios en la conformación D o L, afectando probablemente la
actividad biológica (Poveda, 2000).
2.2.3 Diseño por homología de secuencias y similitud de estructuras
Este se basa en la similitud existente entre una proteína estructuralmente
desconocida con proteínas estructuralmente conocidas; propone que
cuando se tiene una proteína a la cual no se le conoce la estructura pero
su secuencia presenta una alta homología con una secuencia a la que si
se le conoce la estructura, se puede predecir su conformación
tridimensional, pues predice que el plegamiento se debe realizar de
manera similar, en muchos casos se ha visto que la similitud de las
estructuras aumenta con el incremento de la similitud de las secuencias
(Rachelle, 1997); luego de esto se identifican las regiones variables y las
conservadas por medio de un alineamiento. Las regiones conservadas de
las secuencias serán los modelos para señalar las coordenadas atómicas
que corresponden a las regiones estructurales desconocidas; Y las
regiones variables, de poca certeza de predicción, requieren de la
acomodación del diseño, pues presenta intervalos ("Gaps") e inserciones
de vueltas ("Loops"). El ajuste del diseño para estas regiones consiste en
la búsqueda de la conformación en las bases de datos. Estas regiones se
caracterizan por ser las menos exactas del diseño por homología. Luego
de tener la conformación estructural de toda la secuencia se utiliza un
modelo de dinámica molecular con el que se obtiene la descripción de las
interacciones entre cada uno de los átomos, o sea los campos de fuerza.
Los modelos de dinámica molecular usualmente permiten solucionar los
problemas de discontinuidad de la estructura causados por "Gaps" y
"Loops".
2.2.4 Diseño por enhebramiento de las familias de plegamiento
Es otra alternativa de diseño que se basa en la premisa de que el número
posible de plegamientos proteicos es limitado, quizá 1000; estas
estructuras se han venido conociendo por medio de estudios
cristalográficos y de resonancia magnética nuclear; la información con la
que actualmente se cuenta se considera representativa de la mayoría de
los motivos plegados (Rachelle, 1997)
Una proteína con estructura desconocida se diseña por la identificación
de la familia de plegamiento a la que pertenece, para luego modificar su
estructura y acomodarle "Gaps", regiones "Loops" y moldear las
conformaciones de la cadena. Las áreas de la secuencia con estructura
desconocida son resueltas (enhebradas) a través de la búsqueda de
diferentes estructuras conocidas en bases de datos.
Una función de adaptabilidad calcula el puntaje para cada enhebramiento,
y este mide que tan parecida es la estructura a una secuencia en
particular. Hay varios programas qué realizan estos enhebramientos;
Estos tienen en cuenta diversas propiedades de las moléculas, y se
encargan de establecer el plegamiento de las diferentes regiones
basándose además en secuencias evolutivamente similares (Rachelle,
1997).
2.3 Herramientas de la biología molecular computacional
El Banco de Genes, (GenBank) es una base de datos que contienen toda
la información publicada de las secuencias de Ácido desoxirribonucleico
(DNA), Ácido ribonucleico (RNA) y proteínas. Esta información es
manejada por el National Center of Biotechonology Information (NCBI),
junto con el DNA DataBank of Japan (DDBJ), European Bioinformatics
Institute (EBI) y el European Molecular Biology Laboratorio (EMBL)
(Burcks, 1990). Este banco de información se encuentra disponible en
Internet, y ofrece la probabilidad de hacer diferentes clases de búsquedas
dependiendo de la necesidad del usuario.
La opción de búsqueda ENTREZ, ofrece estructuras tridimensionales de
diferentes moléculas mediante el acceso al Protein Data Bank (PDB),
además permite observar genomas completos; Estudios poblacionales
realizados, y hacer búsquedas de secuencias relacionadas por
composición y estructura (Burcks, 1990).
Los servidores de biocomputo que existen en Internet ofrecen información
biológica molecular y programas para el manejo de la misma, uno de los
mas utilizados es Expert Protein Analysis System (ExPASy) es una hoja
de Internet hecha en conjunto por investigadores de Suiza, China,
Taiwan, Australia y Canadá, que recopila diferentes programas y bases
de datos computacionales moleculares; Uno de sus vínculos es
Proteomics Tools, utilizado para el manejo de secuencias y estructuras de
proteínas, mutaciones, cálculos de energía, creación y diseño de modelos
moleculares, acoplamientos proteicos y análisis de características físico
químicas, además de la posibilidad de manipular directamente la
molécula, hallándole punto isoeléctrico, el peso molecular, los valores de
energía, la superposición de estructuras y secuencias, calculo de ángulos,
enlaces en una estructura y algunas herramientas más complejas para la
predicción de estructuras y el diseño de nuevas conformaciones
biológicas (Appel, Bairoch & Hochstrasser, 1994).
En ExPASy se ofrecen múltiples vínculos con programas para el manejo
molecular. ClustalW es un programa de biocómputo que sirve para
realizar alineamientos múltiples progresivos; éste se basa en el algoritmo
de Fasman el cual predice la clase de proteína que se tiene por medio de
su composición nucleotídica. Este procede en tres pasos. Primero todas
las secuencias son alineadas por pares; luego se construye un
dendrograma, que describe las agrupaciones que se forman basándose
en la similitud de las secuencias y finalmente el tercer paso que consiste
en la construcción del alineamiento múltiple el cual se guía por los
resultados del dendrograma. Este paso le otorga peso a las secuencias,
crea intervalos o espacios en determinadas posiciones que penaliza y les
da diferente peso en la matriz (Thompson, Higgins & Gibson, 1994).
Para comparar secuencias de aminoácidos, e identificar similitudes, se
utilizan algoritmos como el Basic Local Alignment Search Tool (Blast),
programa que usa el algoritmo de Altschul poca significancia estadística y
de gran potencial biológico, (Stephen, Altschul & Lipman, 1990) éste
trabaja con dos fragmentos de secuencias y luego del alineamiento da un
resultado de similitud. Blast calcula el porcentaje de homología de
secuencias alineadas y localiza regiones similares en estructura y función.
Fasta, fue creado por Wilburt y Lipman (1983), realiza análisis de
homologías con alineamientos locales, utilizando un algoritmo que
identifica el tamaño de las combinaciones posibles (k) para la correlación,
y brindar un valor de similaridad significativo en poco tiempo (Doolittle,
1996).
El Swiss Protein Data Bank Viewer® (Spd Viewer) es una aplicación de la
Glaxo Wellcome Experimental Research, que permite el análisis de
proteínas y deduce su estructura por medio de alineamientos y cálculos
energéticos, hace comparaciones de los sitios activos y generara modelos
moleculares en tercera dimensión (Junker, Apweiler & Bairoch, 1999).
Otro programa usado para el análisis de secuencias peptídicas es
Identificador de péptido señal (Signal IP) del Centro para el Análisis de
Secuencias Biológicas (CBS), que predice la presencia, ubicación del
péptido y el sitio de unión en la secuencia de aminoácidos, para
organismos Gram positivos y negativos, procariotes y eucariotes, este se
basa en la combinación de información de redes neurales
computacionales (Nielsen, et. al., 1997).
2.3.1 Alineamientos
Para encontrar patrones relacionados dentro de secuencias proteicas es
útil hacer medidas de similitud entre ellas. El Alineamiento es el método
usado para determinar las homologías sitio a sitio y detectar las
diferencias de las secuencias de DNA y de aminoácidos (Lio &
Goldman,1998) . El resultado del Alineamiento son los pares de
aminoácidos alineados. Cuando las secuencias no tienen el mismo largo
de códigos (aminoácidos o nucleótidos), es necesario hacer intervalos
("Gaps"), espacios de aminoácidos o nucleótidos que no tendrán
alineamiento (Stephen, Altschul & Lipman, 1990). Los patrones de
similitud, se hacen entre dos o más secuencias, estos alineamientos
permiten identificar propiedades de secuencias simples. Sin embargo hay
que tener en cuenta que no toda la importancia biológica de la secuencia
puede ser detectada por programas de búsqueda de similitudes y que
igualmente lo que encontramos puede llegar a ser irrelevante (Stephen ,
Altschul & Boguski, 1994).
Un alineamiento múltiple, compara todas las posiciones de los
aminoácidos o nucleótidos de las secuencias entre sí y las ordena por
patrones de similitud de mayor a menor.
2.3.2 Secuencias consenso
Las secuencias de aminoácidos, forman desde pequeños péptidos tan
importantes como la insulina hasta proteínas muy complejas necesarias
para la vida del hombre como la hemoglobina. Las secuencias extraídas
del GenBank fueron las herramientas principales para desarrollar este
trabajo.
Una secuencia consensual es la formada por un grupo aminoácidos con
un elevado porcentaje de conservación, resultado de la búsqueda del
patrón de similaridad entre un grupo específico de motivos. Se le llama
motivo al segmento ubicado dentro de una secuencia, con alguna
funcionalidad; Un motivo proteico consiste en una subsecuencia
constituída por unos aminoácidos consecutivos que corresponden a sitios
de importancia estructural y / o funcional de una secuencia total, además
es reconocido como zona de alta conservación evolutiva (Wang, Shapiro
& Shasha 1999).
2.4 Los motivos
El descubrimiento y la manipulación de motivos, ya sean de DNA, RNA o
de secuencias estructurales proteicas es muy útil para mejorar la
eficiencia y efectividad de los estudios de cristalografía de rayos X en
proteínas, para el diseño de drogas y para entender la evolución proteica
además para predecir las estructuras de las proteínas (Doolittle, 1999)
Los motivos son regiones homólogas de aminoácidos o de nucleótidos
ubicados dentro de una secuencia proteica, de RNA, o de DNA; Su
característica principal es mantener una alta conservación; No son
difíciles de encontrar; En proteínas su conformación está dada por
posiciones absolutas de algunos aminoácidos, dentro de ellos también
existen innumerables posibilidades de cambio aunque algunas veces las
posiciones están restringidas. Algunos en determinadas posiciones
presentan la opción de tener o no tener residuos. La longitud de estos
pueden variar de cuatro a treinta o mas residuos (Hoffman, et. al., 1999).
Los motivos se han estudiado mucho pues se ha comprobado su relación
directa con estructura, plegamiento y funciones de las proteínas. Los
motivos que se conocen actualmente están registrados en varias bases
de datos, que se encuentra en la hoja de Internet ExPASy, los bancos de
motivos son PROSITE, BLOCKS, ProDom, Prints y Pfam, que ofrecen la
información estructural y funcional de las secuencias motivo, además del
sitio de la secuencia en el que se ubican (Hoffman, et. al., 1999).
2.5 Estadística
Los datos estadísticos se pueden manejar por medio del programa
STATISTICA 6.0.®, que ofrece múltiples opciones de manejos de
información, permite trabajar problemas de estadística descriptiva,
pruebas de hipótesis, exploración de datos y búsqueda de estructuras y
clusters (agrupamientos); y cómputos estadísticos para control de calidad
industrial.
2.6 Manipulación molecular en SpdbViewer
Este programa nos permite por medio de las coordenadas estructurales
de una molécula conocida hallada en PDB, hacer las modificaciones
suficientes para simular otra.
Con las diversas opciones que nos ofrece el programa también podemos
hacer deleciones y mutaciones puntuales de diferentes aminoácidos y
así obtener la conformación de la molécula deseada, además da la
probabilidad de mostrar los cambios estructurales que se obtuvieron y la
conformación más probable que se puede tener después de la
manipulación total de la secuencia. Este programa también nos permite
luego de cada cambio equilibrar la molécula a nivel energético por medio
de la opción que halla la energía potencial para luego minimizarla y
obtener la forma más estable de la molécula que se esta diseñando
(Junker, Apweiler & Bairoch, 1999).
2.7 Mecanismos de acción peptídica
La más notable de las diferencias en las membranas citoplasmáticas
entre procariotas y eucariotas es la composición y el arreglo topológico de
los lípidos siendo esto es muy importante a la hora de la regulación de la
actividad y especificidad de los péptidos antimicrobianos (Matsuzaki,
1999).
La superficie externa de las células de los mamíferos está compuesta
exclusivamente de fosfolípidos neutrales de carácter zwiteriónico,
fosfatidilcolina y esfingomielina.
En bacterias hay fosfolípidos largos cargados negativamente como el
fosfatidilglicerol y la cardiolipina, con distribución asimétrica. La superficie
externa de Gram. positivas presenta una pared que está formada por una
capa compuesta de peptidoglicanos y polisacáridos, la capa es
homogénea. En Gram negativas la pared esta formada por una delgada
capa interior de peptidoglicanos y una capa exterior de lipoproteínas y
lipopolisacáridos polianiónicos que se asemejan en su conformación de
bicapa a una membrana celular. Otra gran diferencia en la composición
de la membrana de células eucariotas y procariotas es la abundancia de
esteroles. Algunos procariotas tienen esteroles o hepanoides (similares a
los esteroles); la presencia de colesterol es importante pues es un
estabilizante de las membranas además a mostrado la protección a los
eritrocitos humanos (Matsuzaki, 1999).
Los blancos potenciales de las bacterias son todos los mecanismos
capaces de inhibir su metabolismo y por lo tanto inhibir su crecimiento, o
aquellos que rápidamente le producen un fuerte desequilibrio iónico,
matándola. Los blancos más importantes son el DNA, las autolisinas, la
membrana citoplasmática y la superficie externa.
2.7.1 Péptidos antimicrobianos que irrumpen en superficies poli
aniónicas
Los microorganismos que están relacionados directamente con este
mecanismo son las bacterias Gram negativas pues tienen un mayor
componente de pared celular constituido por lipopolisacáridos
polianiónicos.
Los péptidos antimicrobianos inicialmente interactúan con las superficies
poli aniónicas y competitivamente desplazan cationes divalentes que
unían y en parte neutralizaban los lipopolisacáridos, causando irrupción
en la membrana externa por donde las moléculas peptídicas entran; luego
los péptidos asociados con las cargas negativas de los fosfolípidos de
membrana se orientan en paralelo con la membrana, y la molécula
antimicrobiana alcanza una concentración crítica, por lo que se forman
canales transmembranales agregados llamados complejo péptido
supramolecular o canales toroidales; estos presentan corto tiempo de vida
y cuando la permeabilidad que ocasionan es severa, provocan inhibición y
muerte celular (Epand & Vogal 1999).
2.7.2 Péptidos antimicrobianos que atraviesan la membrana
Muchos péptidos actúan directamente en la membrana atravesándola, los
antimicrobianos con estructura secundaria de carácter anfipático se
acomodan en la membrana con los aminoácidos hidrofóbicos; este lado
de la cadena queda embebido en el centro hidrocarbonado, y las partes
peptídicas polares interactúan fuera de la membrana con el agua. Por lo
tanto el péptido queda paralelo a la superficie de la membrana, aunque
también es posible que el péptido adopte una posición transmembranal
con una desfavorable posición polar hacia la zona hidrofóbica de la
membrana. Luego de la posición adoptada por el péptido se agrega, hay
un incremento de la permeabilidad y se forma un poro acuoso en el centro
(Epand & Vogal 1999).
2.7.3 Péptidos antimicrobianos que ocasionan estrés hídrico y por
ello curvatura en la membrana
La incorporación de un agente extraño, a la superficie externa de una
célula causa estrés en la bicapa lipídica ocasionando perturbación.
Cuando la energía empieza a ser desfavorable se incrementa la
permeabilidad, y las propiedades de la membrana como barrera se
pierden (Matsuzaki, 1999).
Un péptido con segmentos poco hidrofóbicos puede penetrar el centro
hidrocarbonado de la membrana, en esta conformación las cabezas
polares de los lípidos empujan hacia fuera formando un hueco en la
región hidrofóbica; la membrana se empieza a adelgazar y para llenar el
hueco creado induce la curvatura de la membrana, el incremento irregular
de la membrana desestabiliza la energía de las moléculas y el estado de
las superficies. Cuando la energía llega a un punto critico, el péptido
empieza a adoptar una posición transmembranal constituyendo un poro
acuoso por el que pasan algunos iones. Cuando los péptidos son
catiónicos causan una neutralización local de la membrana e impone una
fuerte curvatura negativa, que luego de la formación del poro ocasiona
una destrucción irreversible. Los poros toroidales tienen una curvatura
positiva, la dirección normal de la curvatura. El balance entre la curvatura
positiva y la negativa depende del tamaño del poro, los poros de gran
tamaño generalmente crean curvaturas positivas (Epand & Vogal 1999).
2.7.4 Translocación de péptidos antimicrobianos a través de las
bicapas lipídicas
Este es un proceso cooperativo en el que la fosfatidiletanolamina facilita la
permeabilidad de la membrana. La formación del poro por translocación
se da en segundos o minutos dependiendo del radio de acción del lípido.
Generalmente es un lípido el que se transloca con el péptido
antimicrobiano, el proceso se da cuando el lípido sale de su posición
original y ocupa el lugar del péptido, creando de esta manera un poro. La
translocación se finaliza con la formación del poro. Estos poros tienen un
tiempo de vida limitado (Epand & Vogal 1999).
2.7.5 Asociación péptido péptido
Se han registrado algunos péptidos que hacen pequeñas asociaciones
entre si y es posible que la formación de estas pequeñas fracciones de
agregados induzca la perturbación de la membrana provocando el
aumento de la permeabilidad. Esta agregación se ha reportado para la
Magainina 2 y la PGLa; péptidos que presentan el mismo origen (piel de
Xenopus sp) (Matsuzaki,1999).
2.7.6 Irrupción De Péptidos En La Membrana Como Detergente
En este mecanismo una gran acumulación de péptido cubre la superficie
de la membrana y la irrumpe, ocasionado en la bicapa desestabilización
electromagnética, similar a como actúa un detergente, por medio de
grupos fosfatidilserina y ácido fosfolipídico (Matsuzaki, 1999).
2.7.7 Péptidos Inhibidores De La Síntesis De DNA
Respecto a estos péptidos se conoce muy poco, la Indolisina, aislada de
neutrófilos Bovinos, perteneciente a la familia proteica de las Catelicinas
al ser sintetizado naturalmente no presenta actividad antibiótica, sin
embargo, al obtenerse de manera sintética, siendo químicamente idéntica
a la original, muestra actividad antifúngica, se ha visto su acción en
Candida albicans, C. utilis, C. neoformis y Saccharomyceps cerevisiae.
A partir de estudios con péptidos análogos a esta se demostró efectividad
antiviral contra el HIV 1. El mecanismo como actúa en las bacterias es
inhibiendo la síntesis de DNA, observado en Echericha coli, sin embargo,
esta inhibición no fue letal para las células observadas (Narasimhaiah &
Nagaraj, 1999).
2.8 Antibióticos Y Péptidos Antimicrobianos
2.8.1 Antibióticos Medicinales
La penicilina sintetizada por el hongo Penicillium nutatum fue el primer
antibiótico conocido; Por definición se dice que el antibiótico es una
sustancia química, producida por un organismo capaz de matar o inhibir el
crecimiento de otra especie. Los antibióticos son producidos en su
mayoría por los géneros Penicillium y Cephalosporium, microorganismos
que producen betalactanos, penicilinas y cefalosporinas. Los
Actinomicetos como Streptomyceps, producen las tetraciclinas, las
aminoglicosidas y estreptomicinas; macrólidos como erytromicina y
chloramphenicol, ivermictina, y rifamicina. Estos se utilizan actualmente y
se caracterizan en general por inhibir diferentes procesos metabólicos,
entre los cuales se encuentran: La Inhibición de la síntesis de pared
celular; La síntesis de proteínas de las subunidades ribosomales 30S y
50S; La síntesis de DNA girasa; La síntesis de RNA polimerasa; y la
inhibición del metabolismo de las enzimas que sintetizan ácido fólico
(Matsuzaki,1999).
2.8.2 Péptidos Antimicrobianos (Antibacterianos)
Los animales en general, producen substancias como mecanismo de
protección que contrarrestan el efecto ocasionado por el crecimiento de
diferentes microorganismos patógenos, el sistema inmune es el
encargado de esta función y la secreción de péptidos antimicrobianos es
una de las formas en que las células de defienden del hospedero.
Los péptidos antimicrobianos se encuentran reportados en plantas,
animales y hongos, muchos de éstos se han identificado con efecto
antibacteriano y antiviral simultáneamente. Sus tamaños varían, se han
identificado péptidos de 9 a hasta 100 aminoácidos.
Estos se han encontrado en piel de rana, intestino de cerdo, neutrófilos de
vaca, en peces, abejas, y toda clase de zonas en las que el sistema
inmune animal puede ser vulnerable. En general se conoce que los
péptidos antibacterianos presentan un alto peso molecular, que
generalmente son catiónicos y que existen unos demasiado tóxicos para
las células de los mamíferos, tales como la Melitina que proviene de las
abejas; Además se sabe que tienen como blanco atacar principalmente la
membrana celular de los microorganismos e impedir de esta manera
muchos de sus procesos metabólicos (Matsuzaki,1999).
2.9 Estructura De Los Péptidos Antibacterianos
2.9.1 Estructuras peptídicas
Las secuencias peptídicas y proteicas se caracterizan por estar formadas
por una línea consecutiva de aminoácidos, que de acuerdo a su forma,
Estructura y composición química le dan características especiales a cada
proteína; Las principales interacciones o fuerzas que determinan el
plegamiento y la formación de la estructura tridimensional son:
Interacciones covalentes: Son las interacciones dadas por la formación de
enlaces covalentes. Los principales enlaces covalentes en las proteínas
son los enlaces peptídicos, los enlaces disulfuro y los enlaces éster y
amida.
Interacciones no covalentes: Entre este grupo se encuentran los enlaces
iónicos, puentes de hidrógeno, fuerzas atractivas de Van der Walls o
fuerzas de London, fuerzas repulsivas de Van der Walls, repulsión
electrostática y el efecto hidrofóbico. Los enlaces iónicos se forman por la
atracción entre residuos con carga opuesta (positiva y negativa). Los
puentes de hidrógeno se forman cuando se comparte un átomo de
hidrógeno entre dos átomos electronegativos que no tienen electrones
enlazados; se forman enlaces de hidrógeno entre el esqueleto
polipeptídico y el agua, entre las cadenas laterales de los aminoácidos
polares, entre aminoácidos polares y agua. Las
fuerzas atractivas son el resultado de un dipolo fijo que ejerce con el
extremo positivo atracción en una nube electrónica de otra molécula, y
con el extremo negativo la repele. Estas interacciones proporcionan
fuerzas atractivas entre las cadenas laterales no polares de las proteínas.
Las fuerzas repulsivas actúan entre átomos a distancias muy cortas y se
dan cuando átomos no enlazados tratan de aproximarse más
estrechamente. La repulsión electrostática es lo contrario a las fuerzas
iónicas y sucede entre grupos cargados con el mismo signo; Depende de
la distancia y las cargas de los grupos que interactúan.
Las interacciones hidrofóbicas hacen que los grupos apolares de la
cadena polipeptídica queden protegidos del disolvente en el interior de la
proteína cuando se pliega. Para que se produzcan y se mantengan todas
estas interacciones que determinan la estructura tridimensional de la
proteína es necesario que se suministre energía (por ejemplo, se necesita
de energía para la formación de los enlaces, para mantenerlos y para su
ruptura), esta energía proviene de los átomos que constituyen la
estructura. (Creigton, 1983)
Se llama estructura primaria la secuencia lineal de aminoácidos,
estructura secundaria a la conformación que adoptan los aminoácidos
cercanos que por sus características químicas, dan una conformación
especial como la forma alfa, la beta y enrollamientos; y la estructura
terciaria de las proteínas determina su función biológica, si actuara como
enzima, como hormona o cualquier otro propósito.
Es importante tener gran resolución en la estructura tridimensional
disponible cuando se esta diseñando una proteína con una nueva función.
Además es esencial adquirir la información estructural de la proteína
creada cuando se diseña la hipótesis, entonces los nuevos elementos
estructurales pueden ser relacionados con la alteración de la función
(Thomas & Dale, 1994)
2.9.2 Péptidos Antimicrobianos Con Hélices Alfa
Los péptidos antimicrobianos con conformación estructural alfa son de
carácter catiónico, anfipático y citotóxicos en su mayoría; de ellos se ha
establecido que la propiedad conformacional de ser anfipático y presentar
hélice alfa no es requerido para la actividad microbiana (Epand & Vogel,
1999), sin embargo, numerosos estudios han permitido concluir que la
carga positiva neta de las hélices alfa anfipáticas es un prerrequisito para
la actividad antibacteriana de algunos péptidos (Shai & Oren, 1996).
De los péptidos existentes con hélice alfa los que más se han estudiado
son: Alamethicina, que es un péptido que forma agrupaciones
moleculares de hélices alfa que atraviesan la bicapa lipídica de la
membrana y forman un poro acuoso, utilizado para transportar iones; Este
poro está recubierto internamente por el péptido.
La Gramicidina A, es otro péptido de conformación hélice, de carácter
hidrofílico y su estructura se halla atravesando la membrana, la hélice
de este péptido se caracteriza por dirigirse hacia la izquierda.
Las Pardaxinas se encontraron en peces, son anfipáticas y helicoidales
se les ha registrado actividad lítica en células microbianas y de
mamíferos, de ellas se sabe que la incorporación de aminoácidos D a
la estructura alfa hélice la convierte en láminas beta, la cual la hace
perder su actividad hemolíticas pero no la antimicrobiana.
Las Magaininas son péptidos con estructura hélice alfa, de polaridad
catiónica y bioquímicamente anfipáticas, poseen generalmente 23
residuos o aminoácidos, carecen de cisteina y provienen de la piel de la
rana Xenopus laevis . La hélice de esta proteína forma un gran poro que
no tiene estadios separados de entrada y salida como los poros
conductores tradicionales, el poro formado está cubierto en su interior
por lípido y péptido debido a estimulación de la proteína a realizar
movimientos transmembranales, su tamaño no permite pasar tripsina,
proteína de 24 KDa, y su conformación no resulta en la lisis completa
de la membrana.
2.9.3 Hélices alfa y ácido alfa aminoisobutirico
Existen lipopéptidos hechos de una gran proporción del ácido alfa
amnoisobutirico, que favorecen la partición de la membrana, la
Alamethicina forma canales de membrana a través de una autoasociación
en un anillo transmembranal de hélices, los canales formados por estos
péptidos citotóxicos forman grupos de hélices paralelas a la normalidad
de la bicapa (Matsuzaki,1999).
2.9.4 Péptidos Antimicrobianos Y Pequeñas Proteínas Con Laminas
Beta.
Los péptidos helicoidales pueden existir en la membrana como
monómeros con puentes de hidrogeno. En las láminas beta, los
monómeros se agrupan para que al doblarse le permitan establecer
estructuras intramoleculares antiparalelas, sin embargo esta situación no
ocurre con los péptidos pequeños debido a que pierden entropía no
compensada por las interacciones favorables que le resulten de las
uniones que realice ( Epand & Vogal, 1999).
Muchos péptidos antimicrobianos forman láminas monoméricas beta
capaces, con solo dos partes peptídicas interactuantes, de mantener la
mitad de su potencial de formar puentes de hidrógeno con la zonas
vacías. Algunas veces los péptidos con láminas beta se cíclan y esta
estructura les permite disminuir la entropía en la formación de las láminas;
la estructura del anillo es formada por puentes disulfuro como en las
Tachyplesinas, Protegrinas y Lactoferrinas. Un estudio realizado con las
Protegrinas estableció que la orientación de los péptidos en las
membranas depende de la concentración del péptido y de la naturaleza
de los lípidos de la membrana.
Las Tachyplesinas tienen laminas antiparalelas beta cíclica, sostenidas
por puentes disulfuro, capaces de permeabilizar las membranas
bacterianas y crear poros (Dathe & Wieprech 1999).
Las Defensinas tienen un promedio de 50 aminoácidos y su potencial
antibacteriano es elevado son creados por el sistema inmune innato,
estos péptidos se caracterizan por presentar laminas beta, su motivo
estructural contiene una hélice alfa y estructuralmente son anfipáticos.
2.9.5 Péptidos antimicrobianos con anillo tioéster
Existen péptidos realizados por bacterias, con anillos estructurales
cerrados tioéter, se han llamado lantibióticos y por su estructura y
propiedades actualmente se utilizan como antimicrobianos en la comida,
como la nisina, que abre los canales de conductancia eléctrica de la
membrana lipídica induciendo la salida rápida de iones y de pequeños
metabolitos bacterianos de la célula.
2.9.6 Péptidos macrocíclicos antimicrobianos con nudo de cisteina
Los péptidos antimicrobianos con estructura cíclica generalmente están
hechos de 15 aminoácidos máximo envueltos en ella, la familia botánica
Rubiacea presenta cuatro péptidos con 30 residuos; estos forman una
estructura macrocíclica con potente actividad antimicrobiana. Estas cuatro
proteínas, Kalata, Circulin A y B y Ciclopsychotride tienen un motivo
estructural común, un nudo de cisteina el cual se anuda al motivo
aumentando porque los puentes disulfuro se enlazan con los otros dos
(Matsuzaki 1999).
2.10 Características requeridas para invadir microorganismos
patógenos
Durante la última década un gran número de péptidos antimicrobianos
han sido descubiertos en plantas y animales. Estas moléculas son
reconocidas como componentes de los mecanismos de defensa innata,
están presentes en la superficie de las mucosas, en la superficie del
cuerpo y en los gránulos de los favoritos, y típicamente se componen de
12 a 45 aminoácidos.
Los mecanismos de acción de los péptidos funcionan en su mayoría en la
membrana citoplasmática de las células. Por la forma como actúan la
mayoría de estos péptidos se puede decir que tienen unas propiedades
físico-químicas comunes, pues son altamente básicos (catiónicos) debido
a que tienen múltiples aminoácidos como lisina y arginina y forman
estructuras antipáticas secundarias en su mayoría hélices alfa y pliegues
beta que se acomodan fácilmente en las membranas (Matsuzaki, 1999).
Toxicidad selectiva: Los péptidos pueden y deben discriminar siempre
entre el hospedero y las células microbianas, además para la selectividad
es necesario conocer la amplitud del espectro del péptido que se va a
usar. El desarrollo de resistencia es considerado como una dificultad ya
que el péptido no puede acceder a la célula.
Aniquilamiento rápido: El tiempo necesitado para matar las bacterias
podría ser mas corto que el doble del tiempo en que se llega al blanco
dentro de la bacteria, como en Eschericha coli es de 20 minutos. Para un
rápido aniquilamiento bacteriano, el sitio de acción preferiblemente debe
ser la superficie celular, que el interior de la célula (Matsuzaki, 1999).
Amplio espectro antimicrobiano: Es más deseable trabajar con péptidos
capaces de funcionar contra varias especies de microorganismos; entre
mas especies ataque se dice que tienen un mayor espectro; existen
péptidos ya mencionados como los derivados o análogos de las
Indolicinas que son antifúngicos y antibacterianos que cumplen a
cabalidad este requisito de presentar amplio espectro.
Desarrollo de resistencia nula: El péptido puede tener cada mecanismo de
acción, que la bacteria no pueda desarrollar resistencia contra el
rápidamente.
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
Es posible encontrar soluciones a las enfermedades de carácter
bacteriano cuando las formas actuales como Penicilinas, Eritromicinas,
Vancomicinas, Sulfonamidas y Quinolonas, no han podido vencer la
adaptabilidad de estos patógenos hábiles en desarrollar resistencia?
Es importante por medio del biocómputo promover la búsqueda de
nuevas alternativas; en este caso el diseño de péptidos antibacterianos a
través de una de las diferentes técnicas biocomputacionales como
mecanismo para generar nuevas propuestas.
4. JUSTIFICACION
En el mundo las compañías farmacéuticas buscan optimizar el proceso de
producción de nuevos medicamentos empleando la aproximación
computacional como una fuente económica de moléculas promisorias;
estas empresas manejan grandes cantidades de producto y dinero, las
más importantes de ellas en Norteamérica produjeron más de 150 billones
de dólares en 1999 (Normille & Marshall, 2000).
El gran potencial de los péptidos antibióticos como agentes terapéuticos
es importante debido no-solo a sus características antimicrobianas sino a
su amplio espectro, matan las bacterias rápidamente, no están afectados
por las mutaciones clásicas que producen resistencia, neutralizan las
endotoxinas y son funcionales en modelos animales (Hancock & Scott,
2000).
Dada la importancia de crear nuevas formas para combatir las bacterias
patógenas resistentes, es necesario iniciar una era de producción de
medicamentos diseñados computacionalmente por medio de programas
especializados, pues probablemente ofrezcan nuevas soluciones a la
problemática que la industria farmacéutica enfrenta, tales como la
resistencia bacteriana, los efectos secundarios de los antibióticos y los
altos costos de los mismos.
5. ANTECEDENTES
La resistencia bacteriana es un mecanismo adaptativo de las bacterias
hacia un antibiótico, este problema ha generado una gran dificultad a la
hora de realizar tratamientos en contra de las enfermedades infecciosas
que ellas producen, sin embargo, se continúan haciendo investigaciones
para evitar este dilema médico (Californian Association of psychiatric
Technicians,1997).
Las penicilinas, como las cefalosporinas, rifaminas, y otros antibióticos
interfieren en la estabilidad de la pared celular o con la síntesis de
macromoléculas bacterianas, aunque se ha comprobado que su
efectividad no supera el 60% (Canadian Lung Association, 1999), las
penicilinasas bacterianas por ejemplo, son substancias que evitan el
daño de la pared celular y hacen que los microorganismos sean
resistentes al antibiótico.
Las Magaininas, Cecropinas y Defensinas son algunos de los péptidos
antibacteriales que actúan de manera diferente a como lo hacen los
antibióticos comunes (Saberwal & Nagaraj, 1993). Existen péptidos
antibacterianos de gran importancia como las Cecropinas, presentes en
intestino, que funcionan como barrera antimicrobiana en la mucosa
animal. Unos de los péptidos antibacterianos mas estudiados son las
Magaininas que han demostrado actividad contra bacterias gram positivas
y gram negativas in vitro, inhibición del crecimiento de hongo y se ha
comprobado también que inducen lísis osmótica en protozoos. (Schuster
& Jacobs, 1992).
6.OBJETIVOS
6.1 Objetivo general
♦ Diseñar, con base en herramientas computacionales, péptidos con
posible efecto antibacteriano
6.2 Objetivos específicos
♦ Generar una base de datos con las secuencias reportadas con
actividad antibacteriana.
♦ Proponer modelos explicativos de la actividad antibacteriana de las
secuencias consenso encontradas.
♦ Predecir la estructura tridimensional de algunos de los péptidos con
actividad antibacteriana diseñados.
7. MATERIALES Y METODOS.
Para el diseño de péptidos con posible efecto antibacteriano, la
metodología que se siguió fué el diseño por homología de secuencias y
similitud de estructuras; en esta se siguieron tres fases:
FASE A
1. Identificación de péptidos y proteínas, con función antibacteriana.
2.Muestreo en la base de datos GenBank del NCBI por medio del
programa ENTREZ, de proteínas los péptidos reportados con efecto
antibacteriano. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ .
3.Eliminacion de secuencias sin antecedentes bibliográficos, y de
secuencias incompletas o de fragmentos. Además, la sustracción de
secuencias reportadas como posibles candidatas antibacterianas y
eliminacion del péptido señal. http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP.
Luego con la información obtenida, se creó el primer banco de
secuencias. La revisión bibliográfica en la que se pudieron establecer
los reportes para las secuencias se realizó en Medline y otras bases de
datos s vinculadas al NCBI.
4.Comparación de los péptidos obtenidos, e identificación de similitudes
de fragmentos comunes entre secuencias, por medio de la matriz
Blosum 64 de ClustalW que además de hacer alineamientos múltiples
nos arroja los datos de similitud entre cada una de las secuencias,
gracias a las opciones de manejo de datos que presenta.
http://www.ebi.ac.uk/clustalw/
FASE B
1. Realización de un árbol de vinculamiento simple con los datos de
similitud entre secuencias obtenidas de ClustalW, por medio del
programa Cluster (agrupamiento) de STATISTICA®
http://www.stasoft.com.
3 Identificación de las áreas de alta similitud que presentaron los
agrupamientos y dentro de ellas se hizo una búsqueda de patrones
comunes, como motivos proteicos; El programa usado para la
búsqueda de motivos fue http://www.motif.genome.ad.jp/. Los
agrupamientos tomados en cuenta para el análisis fueron aquellos
que presentaban una distancia de vinculo cercana y similitud
elevada entre las secuencias.
Obtención de la estructura de los motivos proteicos encontrados de
PROSITE, por medio de la búsqueda de ellos en los reportes del Protein
Data Bank. http://www.rcsb.org/pdb.
Establecimiento de las secuencias consenso de los péptidos con el
motivo resuelto estructuralmente en PDB e identificación de zonas
conservadas dentro del motivo.
http://www.bork.embl-heidelberg.de:8080/Alignment/consensus.html
FASE C
Diseño de 10 péptidos con cada motivo encontrado que presentó
estructura en PDB, y proposición de restricciones en él con base en las
observaciones realizadas en los alineamientos, en las secuencias
consenso y en la información obtenida a través de la literatura.
Modelación con base en las coordenadas estructurales de las
secuencias extraídas de PDB, para identificar estructuras de motivos
aislados dentro de una la molécula completa, y para hallar la estructura
de una de las secuencias diseñadas para cada grupo. Este proceso fué
realizado por medio de deleciones y mutaciones en el programa Swiss-
Pdb Viewer®,
8. RESULTADOS
Las secuencias peptídicas encontradas son originarias de organismos de
múltiples taxa, tales como mamíferos, artrópodos, anfibios, y hongos,
estas tienen en común además de su efecto antibacteriano ser parte de
sus diferentes sistemas inmunológicos. De la búsqueda de péptidos
antimicrobianos, se obtuvieron 154 secuencias como resultado del patrón
de búsqueda, "antibacterial peptide" el 13 de Abril del 2000 (Tabla Nº1).
Los péptidos encontrados pertenecen a diferentes agrupaciones definidas
de acuerdo a las especies géneros o familias proteicas a las que
pertenecen, Aunque también pueden estar definidas por la función que
cumplen en los organismos; Las Apiadecinas, pertenecen a los
organismos del genero Apis (Abejas) y las Defensinas que son
secuencias antibióticas se encuentran en escorpiones, chinches,
escarabajos, moscas, lagartos, humanos y serpientes
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
AAA31103 AAA31109 BAA34260 P56238 P49928 AAD40115AAA63447 AAB35810 BAA36402 P56239 P49929 AAD40116AAA87381 AAA31070 AA77338 P56240 P51542 AAD40117CAA60023 AAB36306 P21663 P56241 P37364 CAB75948AAA93036 AAB37723 Q27906 P56242 P37363 CAB75949CAA79936 AAB39000 P81463 P56243 P80230 CAB75950CAA67062 AAB39001 P81464 P56244 P56231 CAB75951CAA40046 AAB39002 P14661 P81251 P56232 P81313CAA34842 AAB39003 P14666 P81251 BAA36401 P083752105311A AAB46807 P01507 P81462 CAB63924 P560292110242A AAB46808 P80032 CAB57822 P18684 P56425AAB12663 AAB46809 P48821 P36501 P36193 B41711AAB20744 AAB46810 P56227 P80408 P37362 C41711AAB30910 JN0899 P56228 P80409 P54684 A47103AAB28180 S57331 P56228 P80410 Q27905 A53421AAB30186 BAA08395 P80033 P80411 P81437 S40463AAB32789 BAA08667 P41965 P54228 P81438 S41731
AAA31103 AAA31109 BAA34260 P56238 P49928 AAD40115AAB35157 BAA11943 P80407 P54229 P55796 S57330AAB35157 AAB91455 Q10745 P49930 P81602 S68232AAB35158 AAC02238 P56230 P49931 P81603 S68967AAB35159 AAC05493 P56233 P49932 AAD40112 S74248AAB35218 CAA76328 P56235 Q54957 AAD40113 JE0161AAB35385 2LEU P56237 P80054 AAD40114 S04634A41711 S36841 JN0613 JC4247 T09004 S74112JC5665 S13450 P81369
Tabla N°1.Código de péptidos antibacterianos.Resultado de la búsqueda de péptidos antibacterianos en la base de datos del NCBI,
descritas con código Locus.
Estos 154 péptidos se depuraron, bajo algunos criterios de eliminación,
tales como la extracción de secuencias incompletas y fragmentos;
obteniendo como resultado un total de 42 secuencias caracterizadas no
solo por pertenecer a múltiples taxa si no por ser de tamaños diferentes,
el péptido más largo P51524 presentó 212 aminoácidos y el mas corto,
P81438 con solo 16.
N° Código Locus Código del GenBank GI
N° de Aa Iniciales
N° de Aa del péptido señal.
N° de Aa Finales.
Definición del grupo peptídico según el NCBI
1 S13450 7511807 57 23 34 Andropina 12 S04634 85277 83 0 83 Diptericina 63 S41731 1085428 166 29 137 Catelicidina4 S40463 543099 228 29 199 Catelicidina5 P36193 544189 64 19 45 Drosoicina6 TO9004 7446308 51 0 51 Streptococcin 27 S36841 480426 32 0 32 Caenohabiditis 138 A41711 102880 74 0 74 Defensina 4 9 S74248 7438228 170 34 136 Catelicidina 510 S68967 2136473 167 29 138 Catelicidina11 S68232 2136470 172 29 143 Catelicidina12 P56425 3024115 165 29 136 Catelicidina13 B41711 102881 43 0 43 Defensina14 A53421 539725 153 29 124 Catelicidina15 P18313 134214 94 23 71 Defensina16 P08375 134859 63 23 40 Cecropina 7 17 P81438 3913673 16 0 16 Drosoicina 818 P81602 6225250 40 0 40 Defensina19 AAB36306 1481023 43 0 43 Defensina20 P37362 585769 20 0 20 Drosoicina21 P51524 1730500 212 0 212 Catelicidina22 P37364 585042 43 0 43 Defensina23 P37363 585245 133 0 133 Drosoicina24 P56231 3023565 24 0 24 Caerina 925 P54229 1708946 159 29 130 Catelicidina
N° Código Locus Código del GenBank GI
N° de Aa Iniciales
N° de Aa del péptido señal.
N° de Aa Finales.
Definición del grupo peptídico según el NCBI
26 P56242 3023576 23 0 23 Caerina27 P41965 1169262 38 0 38 Defensina28 Q10745 1706353 43 0 43 Defensina29 P01507 116087 64 22 42 Cecropina30 P56227 3023542 25 0 25 Caerina31 P14666 116082 35 0 35 Cecropina32 P81464 3913075 17 0 17 Apiadecina 333 BAA11943 1731734 93 18 75 Antibacterial34 AAB46808 1835985 98 19 79 Defensina35 BAA36401 4115517 79 20 59 Defensina36 AAB35810 1246017 42 0 42 Moricina 1037 AAB35218 1168069 179 20 159 Lebocina 11 38 AAB35157 1168022 32 0 32 Lebocina39 AAA93036 1236982 63 22 41 Cecropina40 AAA87381 755005 71 0 71 Ceratotoxina 1241 AAB20869 242304 39 0 39 Cecropina42 AAB28178 415513 55 0 55 Cecropina
Tabla Nº 2 Primer banco de secuencias;
En la Tabla N° 2 observamos los códigos de las 42 proteínas. El código
Locus ocupa la segunda columna y el código del GenBank la tercera. En
la cuarta columna se encuentra el número de aminoácidos total de la
proteína. La columna cinco muestra el número de aminoácidos que
presenta el péptido señal de cada proteína. Las proteínas a las que el
programa no les encontró el péptido señal aparecen con un valor de cero.
En la sexta columna se encuentra el número de aminoácidos con los que
la secuencia quedó luego del proceso de eliminación del péptido señal.
En la séptima columna se encuentran los datos de los grupos, familias, a
los que pertenecen las proteínas halladas según el NCBI y la numeración
que va de 1 hasta 13 dentro de esta columna, equivale al total de grupos
definidos; cada número se encuentra frente a uno de sus representantes.
El árbol de agrupamiento simple se obtuvo con la matriz establecida con
los datos de similitud de todas las secuencias arrojados a partir del
alineamiento realizado con ClustalW, (Anexos N°1 y 2); el árbol esta
hecho por ligamiento simple, y fué obtenido a partir de distancias
Euclidianas, muestra cinco agrupamientos con distancia de vínculo,
cercana, menor de 100. Los otros grupos forman parte de una gran
politomía en los que la distancia de vinculo va de 120 a 140 (Figura Nº 1).
El grupo de secuencias número uno presenta distancias de vinculo
menores de 100, corresponde al grupo de las Defensinas, estas
pertenecen a un grupo multitaxa, nueve secuencias conformaron el
agrupamiento y entre ellas la similitud mas alta correspondió a la
secuencias Q10745 y AAB36306 con una similitud de 86; La similitud mas
baja la presentó la secuencia P41965 respecto a las otras ocho
integrantes de este agrupamiento. Sin embargo hay una secuencia, la
A41711 reportada como Defensina perteneciente a coleóptero que no fue
incluida dentro del grupoLa segunda asociación formada fué la del grupo
de las Catelicidinas, con nueve secuencias, La mayor similitud fue de 74
entre las secuencias S68967
Figura N°1: Árbol obtenido del grupamiento de las secuencias
y S41731; la similitud mas baja del grupo fue la de la secuencia P68232.
El tercer grupo con alta similitud fué el de las Caerinas, dos secuencias
P56227 y P56231 con una similitud de 83 estas fueron obtenidas de
ranas, sin embargo, la secuencia P56242 Caerina, esta alejada del
agrupamiento de este grupo. Estas Caerinas al ser comparadas con las
otras secuencia del banco revelaron bajas similitudes. El cuarto grupo se
formó por dos Lebocinas, en el alineamiento de estas dos secuencias se
encuentra que el péptido AAB35157 presenta 32 aminoácidos y está
contenido dentro de la AAB35218 con 159 aminoácidos motivo por el cual
la similitud entre ellos es la máxima entre segmentos, o sea 100, y la
distancia de vínculo entre ellas es aproximadamente de 50, juntas
pertenecen a un gusano de seda Bombix mori. El quinto grupo está
formado por dos Cecropinas, entre estas secuencias hay una similitud de
85. La similitud de estas dos con el resto de las secuencias analizadas es
muy baja, excepto con la secuencia que le antecede a P14666, la
AAB93036 con una similitud de 48, las otras Cecropinas se alejaron
respecto al patrón distancia, vínculo y similitud. Las secuencias restantes
presentaron unas distancias de vínculo muy alejadas, entre 100 y 120 lo
cual indica la aparente ausencia de patrones comunes entre ellas y entre
las familias ya nombradas.
Con los cinco agrupamientos aislados, Defensinas, Catelicidinas,
Caerinas, Lebocinas y Cecropinas se procedió al hallazgo de sus motivos
proteicos. Encontrando 1 para todas las Defensinas, dos en las
Catelicidinas y uno para todas las Cecropinas (Tabla Nº3). Los motivos
fueron las regiones mas comunes entre las secuencias analizadas por ello
se usaron como patrón para el diseño de los péptidos, estos se
representan bajo los siguientes patrones: símbolo - es el espacio entre
aminoácidos; x representa cualquier aminoácido, [DE] significa cualquier
aminoácido entre D o E. {FWY} cualquier aminoácido excepto F, W y Y.
A(2,3) significa que A aparece 2 a 3 veces consecutivamente. La
terminación del patrón se da con un punto.
Nombre de la faimilia a la que pertenece el motivo
Motivos hallados en la secuencias.
Defensinas
Motivo 1 C-x(2,3)-[HN]-C-x(3,4)-[GR]-x(2)-G-G-x-C-x(4,7)-C-x-C.
Catelicidinas
Motivo 1 Y-x-[ED]-x-V-x-[RQ]-A-[LIVMA]-[DQG]-x-[LIVMFY]-N-[EQ].
Motivo 2
F-x-[LIVM]-K-E-T-x-C-x(10)-C-x-F-[KR]-[KE].
Cecropinas
Motivo 1 W-x(0,2)-[KDN]-x(2)-K-[KRE]-[LI]-E-[RKN].
Tabla Nº3: Tabla de Motivos encontrados en las diferentes familias proteicas. hallados en la base de datos PROSITE.
De las tres agrupaciones que manifestaron motivos, Defensinas,
Catelicidinas y Cecropinas, dos aparecieron dentro de los reportes de
moléculas con estructura en el Protein Data Bank, las Defensinas con el
péptido 1ica y las Cecropinas con el 1bb9, siendo estas las moléculas
seleccionadas para el diseño y modelamiento de los fármacos.
Se encontró un motivo para las Defensinas, y este presenta la opción de
tener desde 22 a 27 aminoácidos; y un motivo para la Cecropina con la
posibilidad de tener de 9 a 11 residuos.
Se hallaron las secuencias consenso para cada una de las
agrupaciones y se encontraron diferentes porcentajes de conservación,
la mas conservada es la de 90% y la secuencia consenso más variable
es de 50% (Tabla Nº4).
Defensinasconsenso/90%...................hh..spuhCthHCh.ht.+GG.Ct...t.sChCh..
consenso/50%........sTCDLLSFputGFulNHSACAAHCLAlGRRGGYCs..sptVCVCRc.Cecropinasconsenso/90% ... .+WK lFKKIEK VGQNIRDGIlKAGPAVAVVGQAsp I... consenso/50% APE PKWK IFKKIEK VGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQAAQ IAKG
Tabla Nª4 Secuencias consenso.
La nomenclatura usada para interpretar el consenso es: los aminoácidos
están representados en mayúscula por código de una letra; la
codificación en letra minúscula equivale al grupo de aminoácidos más
probable de encontrar en esa posición.
Aromático = [ a , [ F, Y, W, H ]. Alifático = [ i , [ I, V, L ]. Hidrofóbico =
[ h , alifático aromático A, G, M, C, K, R, T ]. Positivo = [ + , [ H, K, R ].
Negativo = [ - , [ D, E ]. Cargado = [ c , positivo o negativo]. Polar = [ p ,
cargado, Q, N, S, T, C ]. Alcohol = [ o , [ S, T ]]; Pequeños = [ u , [ G, A,
S ]]; Medianos = [ s , V, T, D, N, P, C ]. Probable = [ t , pequeño o polar].
Cualquiera = [ . , [ G,A,V,I,L,M,F,Y,W,H,C,P,K,R,D,E,Q,N,S,T ]].
Teniendo en cuenta los alineamientos realizados, la información de los
consensos y la literatura revisada se diseñaron 10 péptidos con base en
cada motivo proteico, (Tabla N°5). Las restricciones para las Defensinas y
Cecropinas que propone cada motivo originalmente se conservaron en su
totalidad,
En esta propuesta las Defensinas conservan los aminoácidos fijos, las
cisteínas de la posición uno, seis, diecisiete, veinticinco y veintisiete. Las
Glicinas catorce y quince y, las posiciones en las que se encuentra la
opción de dos aminoácidos; la posición 5 va entre his y asn y la once va
entre gly y Arg. Las restricciones propuestas para la posición dos, tres,
cuatro siete y ocho son cualquiera de los aminoácidos hidrofóbicos ala,
val, leu, ile, phe, trp y met. Para la posición nueve, diez y dieciocho
aminoácidos catiónicos lys arg his. En la posición doce, aminoácidos
polares y básicos thr, cys, asn, gln tyr, his, lys arg. En la posición trece,
aminoácidos catiónicos his lys arg. En la posición dieciséis, aminoácidos
polares tyr, gln, asn, cys, thr. La posición diecinueve, veinte, veintidós y
veintitrés van con aminoácidos neutros o catiónicos gly, ser, hys, lys y arg.
La posición veintiuno con aminoácidos pequeños o polares gly, ala, ser,
gln, asn, thr y cys. La posición veinticuatro con aminoácidos pequeños y
medianos, val, thr, asp, asn, pro y cys. La posición veintiséis con
cargados his lys arg y aminoácidos pequeños gly, ser y ala.
Las secuencias diseñadas con base en el motivo de las Cecropinas
también conservan las restricciones establecidas en Motif. Las posiciones
de aminoácidos que se sugieren están en la posición dos, residuos
cargados asp, glu, arg lys y his; En la posición cinco y seis, los
hidrofóbicos Ala Val leu ile phe trp met y pro.
Motivo Secuencia diseñada AaDefensina C A V F H C K K P L R K G G K C K R R Q C K C 24Defensina C V L M N C L F A V G R K G G Y C K A L V C K C 24Defensina C L V F H C M A V L G K L G G Q C L G S T C G C 24Defensina C M A A N C N A V I G H R G G N C R R L C C S C 24Defensina C W F I H C F L I V G R K G G C C K G T R K K D C A C 27Defensina C I V A N C M A V I R H L G G Y C L S C G S R N C K C 27Defensina C F A M H C L I V A R K R G G Q C R A G K G S P C G C 27Defensina C M L A N C M A L A R R K G G N C K G A L S K C C S C 27Defensina C K W I H C W A L I R K L G G Q C L R S R A L V C A C 27Defensina C R A V H C R A H A R H R G G T C R S Q A S L T C K C 27Cecropina W E D D L P K R L E N 11Cecropina W K R N P A R E I E N 11Cecropina W E R N V I K R I E K 11Cecropina W K D D I A K E L E N 11Cecropina W R E N P V K K I E R 11Cecropina W H H K M A K R L E K 11Cecropina W D K D W A K E L E N 11Cecropina W E H D P I K K I E R 11Cecropina W K D N M F K R L E K 11Cecropina W R E K F W K E I E N 11
Tabla N°5: Péptidos diseñados.
Se encontró una estructura molecular para la Familia de las Defensinas
con el motivo requerido, su código de PDB es 1Ica, esta proteína fue
aislada de un insecto y extraída de Protophormia terraenovae, clasificada
como antibacteriana, su estructura fue establecida por medio de
Resonancia Magnética Nuclear (NMR), Incluye 40 residuos
ATCDLLSGTG INHSACAAHC LLRGNRGGYC NGGVCVCRN, con 279
átomos y un peso molecular de 4049 kDa. La proteína 1Ica presenta una
estructura conformada por cuatro formaciones al azar o Coils, el primero
va del aminoácido número 1 que es Ala hasta el 13 his; El segundo es en
la posición 25 y 26 asp y arg; el siguiente va de la gly 32 a la gly 34 y el
último es el aminoácido 40 asp. Presenta una hélice alfa que consta de 10
aminoácidos, se inicia con la Ser 14 y termina con la gly 24; Y dos
Pliegues Beta que van del aminoácido 27 gly al 31 asp y el segundo de la
val35 a la arg 39 (Figura N°2).
Figura N°2 Estructura de la Defensina 1Ica reportada en PDB, esta presenta cuatro formaciones al azar, una hélice alfa y un pliegue beta, estructura resuelta por
Resonancia Magnética Nuclear NMR.
El motivo de Defensina dentro de la proteína 1Ica, completa.
Este va del aminoácido 16 cys hasta el 38 cys, con un total de 23
aminoácidos, Conformado por dos alfa Hélices, la primera va desde 1Cys
hasta 9 gly y la segunda va desde 17 gly hasta 19 gly. Un Coil formado
por los aminoácidos 10 asn y 11 arg. Y dos pliegues Beta, el primero es
desde 12 gly hasta 16 gly y el segundo va desde el 20 val hasta el 23
cys.
Secuencia del motivo aislado de la Defensina 1Ica.
Luego de la deleción de los 17 aminoácidos que no hacían parte del
motivo,
la estructura dio 4 formaciones al azar o Coils el primero en el
aminoácido 8 cys, el segundo va desde 9 gly hasta el 13 gly, el tercero va
del 17 gly al 19 gly y la cuarta formación la hace la cys 23. 1 Hélice, que
va desde el aminoácido 2 ala al 8 arg y 2 Pliegues Beta, el primero va
desde el 14 tyr hasta el 16 asn, y el segundo va del 20 val hasta el 22 val
(Figura N°3).
Figura N° 3 Segmento de Defensina 1Ica, que equivale a la zona donde se encuentra el motivo
Estructura de Defensina para la secuencia propuesta.
La estructura peptídica se obtuvo luego de 16 deleciones y 19
mutaciones de la secuencia original 1Ica; La secuencia propuesta es cys
ala val phe his cys lys lys pro leu arg lys arg gly gly lys cys lys arg arg gln
cys lys cys, y el resultado presentó, 4 Coils, el primero lo formó el
aminoácido 1 cys; el segundo va del residuo 9 pro al 13 arg; el tercero se
forma desde 17 cys hasta 19 arg y el cuarto va en 23 lys y 24 cys. 1
Hélice alfa, que va de 2 ala hasta 8 lys. Y dos laminas Beta; la primera
va desde 14 gly hasta 16 lys; y la segunda desde 20 arg hasta 22 cys
(Figura N°4).
Figura N°4 Estructura de la Defensina propuesta.
La Cecropinas también fueron buscadas entre un grupo de proteínas
cristalizadas reportadas como tal, de las cuales no todas mostraron el
motivo requerido; la encontrada presenta el código 1bb9, clasificada
como transferasa, molécula llamada Amphiphysin, extraída de Rattus
norvegicus, Su estructura fue establecida por Difracción de Rayos X, a
una resolución de 2.20 Å. Formada por un total de 115 aminoácidos
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MATVNGAVEG ST TTGRLDLP PGFM
FKVQAQ HDYTATDTDE LQLKAGDVVL VIPFQNPEEQ DEGWLMGVKE
SDWNQHKELE KCRGVFPENF TERVQ, con 729 átomos y un peso
molecular de 12844 kDa.
Los primeros 37 aminoácidos no se encuentran definidos
estructuralmente por dificultades en el proceso de resolución (Figura N°
5).
Estructuralmente la proteína 1bb9 esta caracterizada por formaciones al
azar o Coils, cinco plegamientos beta y dos hélices alfa. Las láminas beta
se encuentran en los aminoácidos 45phe a 50gln, 67asp a 72ile,83 gly a
89glu, 103gly a 108 glu y 109phe a 113val. las hélices alfa van de 90glu,a
94asn y de 99leu a 102 cis (Figura N° 5).
Figura N°5 Cecropina 1bb9 hallada en PDB; Presenta formaciones al azar, cinco laminas beta y
dos hélices alfa, estructura resuelta por difracción de rayos X.
Secuencia con el motivo aislado de la Cecropina 1bb9.
Después de realizar 73 deleciones en la molécula 1bb9, para obtener
aislado el motivo estructural; se obtuvo un cambio conformacional en el
que se perdió la hélice de los primeros aminoácidos, convirtiéndose toda
la estructura de la molécula en una formación al azar (Figura N°6).
Figura N° 6 Segmento de Cecropina 1bb9, que equivale a la zona donde se encuentra el motivo, presenta un total de ocho residuos
Estructura de Cecropina para las secuencias propuestas.
La Cecropina propuesta es trp glu asp asp leu pro lys arg leu glu asn ;
Para su modelamiento se hicieron 62 deleciones y 4 mutaciones, su
estructura dio una hélice alfa desde el aminoácido 1 trp hasta el 4 asp, y
un Coil del aminoácido 5 leu al 11asn (Figura Nº7).
Figura N° 7 Cecropina, diseñada con base en las restricciones propuestas, presenta un total de once aminoácidos.
9. DISCUSIÓN
La metodología nos permitió crear como primer paso un banco de datos
del cual se pudo depurar la información poco referenciada o incompleta y
a partir de ella iniciar una propuesta de diseño. Esta metodología partió
de una visión amplia del problema, y se acercó a él a través de
parámetros que auto seleccionaron la información existente,
disminuyendo las variables de trabajo y haciendo posible instaurar grupos
de datos manipulables. Cada uno de estos grupos fue analizado de
acuerdo a sus condiciones, y con ellas se estableció el método para
diseñar cada una de las secuencias propuestas.
Es importante hacer siempre una buena selección de los resultados
obtenidos a partir de las bases de datos, sobre todo de aquellas que
ofrecen información de secuencias proteicas, pues en general proyectan
mucha redundancia. Los 154 péptidos obtenidos de la búsqueda
"antibacterial peptide" arrojaron varias secuencias completamente iguales
reportadas bajo códigos diferentes, fragmentos reportados como
secuencias completas y clasificaciones un poco confusas. Actualmente no
hay personas encargadas de hacer curatorías de las bases debido a que
este es un proceso bastante complejo y específico (Ellis & Attwood,
2001). Por ello es necesario en general eliminar información bien
referenciada bibliográficamente que nos permita extraer la información
más confiable.
Respecto al banco de secuencias, este agrupó 42 péptidos; Fue
necesario hacer la eliminación del péptido señal de cada proteína. Blobel
(1980) demostró que el proceso en que participan los péptidos señal es
de carácter universal, que actúan igual en plantas, levaduras y células
animales; como cada proteína lleva en él la información necesaria a nivel
estructural de especificidad y su propia localización en la célula,
determinan por donde debe pasar la proteína, a través de la membrana o
por cual organelo en particular. Señalizan si la molécula debe ser
exportada o no de la célula, debido a esto y a que un gran número de
enfermedades que son causadas por errores en este tipo de señaladores,
enfermedades tales como la diabetes tipo I, la fibrosis quística, y que
están asociados a enfermedades neurales como el Alzheimer, y
Parkinson (Blobel, 1999).
La matriz para hallar similitud entre las 42 secuencias se obtuvo del
programa ClustalW; que realiza una serie de alineamientos en bloques
que representan las regiones mas conservadas en las proteínas. Este
proceso usó la matriz BLOSUM 64 que tiene un carácter más estadístico
que las matrices que extrapolan ratas de mutación como la de Dayhoff o
PAM, que nos habrían sido de poca utilidad ya que no estábamos
buscando relaciones evolutivas entre las secuencias, y además, la
ventaja de BLOSUM 64 también es que solo depende de la identidad y
composición de los grupos (Henikoff & Henikoff 1992).
De las cinco agrupaciones de péptidos antibacterianos obtenidas,
podemos decir que la alta similitud entre las secuencias de las familias
demuestra una clara relación de tipo evolutivo entre ellas, y en algunas
de símilaridad estructural, como se observó entre las secuencias de
Defensinas, y de Cecropinas.
Las cinco agrupaciones se seleccionaron por que sus distancias de
vínculo eran menores a 100, se escogieron porque en este corte todavía
se observaban secuencias con homologías, y además dentro de estas
agrupaciones las secuencias aún mostraban altas similitudes, en general
mayor del 50% que son las consideradas confiables y exitosas
(Sternberg, 1996). Sin embargo este patrón de agrupamiento simple, al
ser usado para observar las diferencias entre unas y otras, no fue muy
efectivo, puesto que en él no se contemplaron otras variables,
características importantes, como el efecto de los péptidos en la célula,
cantidad de aminoácidos que lo conforman y áreas de acción, entre
otras, que probablemente acerquen a su agrupamiento aquellas
secuencias que con este método no se juntaron con su familia o grupo
definido; como en el caso de la secuencia de Coleóptero A41711,
perteneciente a la misma subfamilia Dynastinae, conformada por
AAB36306 Q10745 Y BBA36401, que además fue el agrupamiento con
mas vínculo dentro del grupo de las Defensinas; Esta secuencia, A41711,
se alejó bastante del agrupamiento al que pertenece.
En medio de la depuración de los datos es importante tener en cuenta
que cuando las secuencias muestran una similitud inferior al 50% y se
están buscando patrones comunes como motivos hay que tener en
cuenta el tamaño de las secuencias y el del motivo, pues es probable que
las secuencias por cantidad de aminoácidos tienen una baja similitud
pero que dentro de estas moléculas se encuentre el patrón que las define.
El conocimiento de la estructura de los péptidos es de vital importancia
para el diseño de drogas (Krisztof , en Veerapandian 1998) pues es por
medio de esta que se establecen las probables conformaciones de las
moléculas diseñadas, y porque permiten observar los cambios de las
diferentes estructuras bajo diferentes situaciones moleculares.
Los motivos son una herramienta importante a la hora del diseño de
moléculas pues nos ofrecen la opción de ser modificados de una u otra
forma, nos pueden permitir aumentar potencialmente afinidad hacia un
receptor. También por ser tan conservados estructural y funcionalmente
permiten hacer híbridos que creen nuevas alternativas moleculares
además de que se prestan para estudios de creación de librerías
combinatorias gracias a las múltiples regiones variables que revelan .
Las secuencias AAB36306 y Q10745 presentaron el mayor porcentaje de
similitud (97%), debido a que ellas están relacionadas entre sí. Las dos
fueron aisladas de la misma especie de Coleóptero, Allomyrina
dichotoma; fueron extraídas en diferentes estados de maduración del
animal, larva y adulto; Y además su elevada similitud es por que se
diferencian tan solo en un aminoácido.
Dentro del agrupamiento de las Defensinas, las secuencias de insectos
en general muestran una gran similitud entre sí, sin embargo la P37364
de hemíptero se alejó del grupo con una distancia aproximadamente de
90 y la P41965 de escorpión presentó la distancia de vinculo más alejada
del grupo, 95; Probablemente por que las diferencias entre los
aminoácidos de estas secuencias estén reflejando distancias evolutivas.
En la manera de agruparse estos péptidos se observa una pequeña
diferenciación taxonómica debido a que las dos de la misma especie de
coleóptero quedaron juntas en un agrupamiento; las cuatro de dípteros
formaron otro; la secuencia de hemíptero formó otro agrupamiento que lo
relacionó con todos los insectos en general, y la secuencia del arácnido,
fué la mas alejada; De tal manera que esta se relaciona con todas las
secuencias de insecto, y aunque su distancia de vínculo no es muy
cercana, con la de los insectos, su secuencia conserva el motivo
perteneciente a todas las Defensinas.
Dentro del agrupamiento de las Defensinas , la secuencia A41711 no fue
incluida; Probablemente se deba a que los patrones por los cuales fue
establecida como Defensina no obedecen a una simple agrupación
estadística, además esta secuencia no presentó el motivo estricto de
Defensina de la manera en que indica la base de datos PROSITE; Y el
lugar donde se ubicó en el agrupamiento, corresponde a un área de
politomía, donde las secuencias no reflejan una relación clara.
Las Defensinas observadas presentaron una gran cantidad de
aminoácidos polares y básicos como la Arginina; Estos por su
composición, en especial la Arginina por sus grupos Amino confieren a los
péptidos un pronunciado carácter catiónico y se ha comprobado que
estos son necesarios para incrementar la adhesión de los péptidos
antibióticos a las bacterias Gram positivas (Matsuzaki,1999). Esta fue
una de las razones que se tuvieron en cuenta en el momento de hacer las
restricciones sobre los péptidos de Defensinas propuestos, además de la
información que arrojó el consenso respecto a tamaño y patrón químico
más conservado para cada posición.
La mayoría de Defensinas revelaron una secuencia patrón diferente al
motivo; una región de once aminoácidos que parece muy conservada, y
que también aparece en el consenso antes de iniciar el consenso donde
se encuentra el motivo. Esta región sTCDLLSFputG no aparece como un
motivo registrado, según la base de datos PROSITE, pero es probable
que tenga alguna relación con la actividad, estructura y / o función de los
péptidos .
Respecto a la estructura de la Defensina 1Ica, y la predicción de la
estructura de la Defensina diseñada, los cambios consistieron en la
perdida de dos aminoácidos en la primera hélice alfa de 1Ica, estos se
convirtieron en Coils. El segundo cambio consistió en el crecimiento del
primer Coil que presentaba 2 aminoácidos en 1Ica,a uno de 5 residuos en
la secuencia propuesta. El tercero es la perdida de dos aminoácidos en la
primera lamina beta de la secuencia cristalizada 1Ica. El cuarto es la
pérdida de la segunda alfa hélice compuesta por tres aminoácidos en
1Ica, por un Coil de tres aminoácidos en la secuencia diseñada; y la
pérdida de un aminoácido en la estructura de 1Ica en la segunda lámina
beta. Luego de todas estas modificaciones estructurales descritas
observamos que se conservó la estructura que identificaba la familia; La
estructura que define la familia Defensina que esta compuesta por una
hélice inicial y dos láminas beta consecutivas , y como la secuencia
diseñada la mantiene es muy probable que esta mantenga su efecto
antibacteriano; Además la secuencia diseñada conserva las 3 cisteinas
iniciales que estabilizan la molécula. Además las modificaciones
propuestas para las áreas variables de los motivos se hicieron con el
propósito de aumentar el carácter catiónico, bastante importante para
potenciar la actividad de cada péptido (Yang, Mitta, Chavanieu et. al.,
2000).
Todas las Defensinas diseñadas conservaron las tres cisteínas
estabilizadoras, puesto que ellas pertenecen a los aminoácidos fijos del
motivo y porque modificar el motivo no fue el objetivo de este trabajo,
razón por la cual es factible encontrar la hélice inicial y las dos laminas
beta que continúan incluidas en cada péptido.
De la actividad de las Defensinas en general se puede decir que el motivo
de esta familia en general ataca las bacterias Gram positivas, pues ellas
aunque muestran un amplio rango de acción los reportes de actividad de
Defensinas hacia Gram negativas son pocos hasta ahora, y dentro de
estos se encuentra el de la Defensina de ratón mBD1 (Bals, Goldman &
Wilson, 1998).
Es bastante probable que las nueve Defensinas que no se sometieron a la
predicción de la estructura también conserven la hélice inicial y las dos
betas siguientes, pues las características bioquímicas en las áreas
variables del motivo se trataron de mantener lo mas conservadas con
relación a las Defensinas existentes
De las 42 secuencias del banco peptídico, 6 pertenecían a la familia de
las Cecropinas. Estas se caracterizaron por presentar un motivo pequeño,
razón por la cual las similitudes entre ellas no fueron lo suficientemente
altas como para que hubieran podido quedar fácilmente diferenciadas
como grupo luego del agrupamiento realizado por STATISTICA®; Por ello
aunque cuatro de las secuencias no hayan quedado dentro del patrón de
distancia de vinculo menor de 100, tres de estas que se alejaron
AAA93036, P08375 y AAB87381 también tienen el motivo característico
de la familia; además, estas se ubicaron muy cerca del agrupamiento al
que pertenecían.
De las secuencias pertenecientes a la familia de las Cecropinas, la
AAB28178 también se alejó de su grupo; Esta no se alcanzó a introducir
dentro del agrupamiento; Y aunque esta secuencia está clasificada como
tal, no presenta el motivo que define a la familia. Sin embargo su
secuencia muestra una región de alta homología de siete aminoácidos
que coincide con las siete primeras posiciones del motivo, probablemente
esta sea una de las razones por la cual se agrupo en esta familia. Por lo
tanto al tener menor homología, las similitudes de esta contra las del resto
del banco son muy bajas y no fueron suficientes para agruparla como
Cecropina. Además esta familia peptídica por mostrar un motivo pequeño,
en general de 8 residuos entre secuencias con un promedio de 40
aminoácidos ya venía con valores bajos de similitud entre sus
secuencias.
Respecto a los aminoácidos de esta familia es fácil identificar en el
alineamiento la abundancia de residuos hidrofóbicos ubicados como
parches entre pequeños segmentos polares y pequeños segmentos
cargados de aminoácidos positivos y negativos, dándole al péptido un
carácter bioquímico anfipático, característica particular de esta familia de
proteínas (Friedrich, et.al.,1999).
El motivo del péptido 1bb9 se inicia con una hélice que se viene
formando tres aminoácidos atrás de él; por ello la hélice alfa inicial se
conserva estable dentro del motivo, esta, es la principal razón por la cual
se introdujeron los dos aminoácidos en la posición dos y tres que eran
opcionales, dentro de las secuencias diseñadas, obteniendo como
resultado péptidos de 11 residuos. Como es necesario mantener esta
hélice inicial dentro del motivo no tomar la opción que ofrece el motivo
impediría la formación helicoidal, así como se observa en el motivo de
1bb9 de nueve aminoácidos que luego de ser aislado de los aminoácidos
laterales del motivo perdió por completo su conformación.
La estructura de los péptidos de esta familia se ha establecido en general
como alfa helicoidales de carácter anfipático (Friedrich, et.al.,1999). Y / o
alfa helicoidales hidrofóbicos (Hung, et. al.,1999).La secuencia propuesta
a la que se le predijo la estructura se ajusta a estos patrones
conformacionales de anfipaticidad, la primera hélice del péptido con
restricciones empieza con un 1Trp, residuo grande e hidrofóbico unido
a tres aminoácidos hidrofílicos 2Glu, 3Asp y 4Asp, seguido de un Coil
cargado positivamente en las posiciones 7Lys y 8Arg , el Coil se inicia
con dos aminoácidos hidrofóbicos 5Leu y 6Pro, y este termina con 9Leu
hidrofóbica y 10Glu que con 11Asn le dan una finalización hidrofílica.
Es importante tener en cuenta que el motivo de Cecropina 1bb9 presenta
otra alfa hélice al final, y su carácter es hidrofílico, pero esta no se pudo
mantener en la secuencia propuesta probablemente porque la
conformación espacial de los átomos no se prestó para ello, a que el
número de residuos no fue suficiente para establecerla y a que carece del
entorno que le ofrece una macromolécula como 1bb9 por medio de sus
interacciones electrostáticas, además los residuos finales de la propuesta
son inmodificables dentro del motivo.
Conservar cada residuo fijo del motivo dentro de las moléculas
propuestas es de vital importancia para mantener la estructura,
estabilidad y funcionalidad de los péptidos ya que ellos son los
aminoácidos mas conservados dentro de las familias observadas. En el
caso de las Defensinas pudimos observar que las tres primeras cisteínas
del motivo efectivamente son muy importantes para la determinación de
su estructura; Y en el caso de las Cecropinas el triptófano es el
aminoácido más indispensable para la actividad pues él es el encargado
de interactuar con las membranas celulares ocasionando la lísis celular,
(Friedrich, et.al.,1999)
Respecto a la actividad de los péptidos de Cecropina diseñados podemos
decir que en general ataca organismos Gram negativos como
Escherichia coli , (Friedrich et. al.,1999). El motivo de esta molécula en
general está reportado como lítico por agregación y cooperativismo
(Hung, et.al.,1999), o sea que las moléculas matan la célula luego de un
proceso en el que se agregan y al unirse en diferentes partes de la
membrana desestabilizan su mecanismo de permeabilidad incrementando
la formación de poros. (Friedrich, et. al.,1999).
Todas las secuencias encontradas en la familia Cathelicidina ,pertenecen
a mamíferos, se hallaron en intestinos y mucosas, en animales como el
cerdo Sus scrofa, la vaca Bos taurus y en hombre Homo sapiens. El
número de residuos promedio es 150, presentan una alta homología ente
ellas y una buena y cercana distancia de vínculo que refleja una relación
evolutiva entre ellas.
Además de revelar dos motivos en sus secuencias, estas moléculas
parecen estar muy conservadas en general pues en el alineamiento se
pueden observar otras regiones de las que probablemente se podrían
introducir mas motivos, como lo es el área que se encuentra entre los dos
motivos ya establecidos; que probablemente estén muy relacionadas con
su estructura.
Tres de las Catelicidinas trabajadas presentaron una región muy
interesante en el alineamiento; es la zona conformada por los últimos 70
aminoácidos, esta se inicia con una valina, dos argininas seguidas de
una fenilalanina y luego tres triptófanos, después está compuesta en su
gran mayoría por prolinas y argininas y los residuos restantes están
cargados negativamente, o son apolares; este segmento dentro de la
secuencia es demasiado grande y probablemente sea muy importante no
solo para función sino para estructura. Sin embargo se sabe que una de
sus partes aunque no ha sido reportada como motivo contiene un
segmento rico en triptófanos. los 13 aminoácidos de esta zona son
VRRFPWWWPFLRR estos han sido caracterizados como
antimicrobianos muy fuertes de amplio espectro y ha mostrado actividad
potencial contra Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
pneumonia, Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis ,y el grupo de
los Streptococcus y Aspergillus fumigatus (Lawyer, et.al.,1996) Como
estas secuencias aún no tienen sus coordenadas estructurales en PDB,
no se pudo establecer si esta área era similar estructuralmente, pero lo
más probable es que esta región sea muy grande y probablemente un
segmento muy reactivo dentro de la molécula.
Las Lebocinas se agruparon con una similitud del 100% puesto que la
secuencia AAB35218 esta contenida dentro de AAB35157, lo que las
separo en la distancia de vínculo fueron los 118 aminoácidos de más del
péptido AAB35218, que influyeron en diferenciar las similitudes de esta
contra el resto del grupo,
La secuencia AAB35157 no está referenciada como proteína precursora,
esta pasó por el proceso de eliminación de péptido señal donde se le
extrajeron sus 20 aminoácidos señal, por lo que no podríamos pensar que
la relación de estas fuera la de ser AAB 35157 premolécula de
AAB35218.
Las dos Caerinas fueron aisladas de ranas, éstas presentaron una
similitud del 83%, las dos secuencias tuvieron 20 aminoácidos ubicados
en la misma posición dentro del alineamiento y probablemente esta
homología es uno de los factores que las agrupa dentro de la misma
familia; Juntas fueron aisladas de la especie Litoria splendida; y no tenian
motivos en PROSITE.
10. CONCLUSIONES
1. Es posible diseñar péptidos antibacterianos con base en la homología
de secuencias, pero diferenciándolas según las características de las
familias.
2. Cada familia presenta propiedades fisicoquímicas y biológicas propias
para su actividad antibacteriana que fue posible modelar.
3. Es posible generar secuencias consenso según las familias
considerando los motivos encontrados.
4. Se lograron identificar especificidades entre secuencias consenso que
se pueden emplear como modelo explicativo para los diferentes
mecanismos de acción que les proporcionan la actividad
antibacteriana .
5. Con base en las similitudes estructurales se predijo la estructura
terciaria de los péptidos diseñados.
11. RECOMENDACIONES
1. Por medio de la mecánica molecular optimizar los modelos peptídicos
propuestos e identificar cuáles son los que ofrecen mayor estabilidad
estructural.
2. Sintetizar los péptidos propuestos y evaluar su actividad.
3. Estudiar la relación de los péptidos diseñados con sus posibles
receptores.
BIBLIOGRAFÍA
Appel R, D., Bairoch A. & Hochstrasser D. F.,1994. A new generation of
information retrieval tools for biologist: the example of EXPASY www
server. Trends Biochem. Sci (19) 258-260.
Bals R., Goldman M. J. & Wilson J. M., 1998. Mouse beta-defensin 1 is a
salt-sensitive antimicrobial peptide present in epithelia of the lung and
urogenital tract. Infect Immun; 66(3):1225-32
Blobel G., 1999. Nobel e Museum Home page: www.nobel.se.
http://www.nobel.se/medicine/laureates/1999/press.html
Blobel G.,1999. Nobel e Museum. Home page: www.nobel.se
http://www.nobel.se/medicine/press/1980/.html
Bonnenmain H. & Bové J. F.,1999. Histoire de la pharmacie et de l"
industrie pharmaceutique. Botika (3): 2-5.
Burcks C.1990. GENBANK Current status and future directions . En
Methods in Enzimology .(Doolittle,1996) Methods in Enzimology Volume
183. Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid
Sequences. 1ª ed. California Academic Press. p.p. 3-32.
Bugg E. C., Carson M. W. & Montgomery A. J., 1993. Drugs by design.
Sci Am 269(6): 92-8, December.
Californian Association of psychiatric Technicians.,1997. Vancomycin
Resistant staphaureus www.phych-health.com.staph.htm
Canadian lung association., 1999. Home page: www.Lung.ca
http://www.lung.ca/antibiotics/index.html
Creigton E. T., 1983. Proteins, Structure and Molecular principles. 1ª ed.
W. H. Freeman And Company. New York. p.p. 37-152
Dathe M & Wieprech. 1999. Structural features of helical antimicrobial
peptides . Biochimica et Biophysica Acta 1462 p.p 71-87
Drew J., 2000. Drug Discovery: A Historical Perspective. Science 17
(287): 1960-1963.
Doolittle R., 1996. Methods in Enzimology Volume 183. Molecular
Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences. 1ª
ed. California Academic Press. p.p. 32-70.
Ellis B.M. & Attwood K. T., 2001. Molecular biology databases: today and
tomorrow. Drug Discovey 6, (10): 509-513.
Epand M. R. & Vogal J. H., 1999. Diversity of antimicrobial peptides and
their mechanism of action. Biochimica et Biophisica Acta 1462 p.p. 11-28.
Friedrich C., Scott M. G., Karunaratne N., Yan H. & Hancock R.E., 1999.
Salt-resistant alpha-helical cationic antimicrobial peptides. Antimicrob
Agents Chemother 43(7):1542-1548
Henikoff S. & Henikoff G. J.,1992. Aminoacid substitution matrices from
protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (89): 10915-10919.
Hancock W. E. & Scott. G. M., 2000. The role of antimicrobial peptides in
animal defenses. PNAS 97 (16): 8856- 8861.
Hung S. C., Wang W., Chan S.I. & Chen. H.M., 1999. Membrane lysis by
the antibacterial peptides cecropins B1 and B3: A spin-label electron spin
resonance study on phospholipid bilayers. Biophys J. 77(6):3120-33.
Hoffman K., Bucher P., Falquet L. & Balroch A. 1999.The PROSITE data
bases, its status in 1999. Nucleic Acids Res (27):215-219.
Junker V. L., Apweiler R. & Bairoch A., 1999. Representation of
functional information in the SWISS-PROTdata bank. Bioinformatic
(15):1066-1067
Liò P. & Goldman N.,1998. Models of molecular evolution and phylogeny.
Genome Research (8):1233-1244
Lawyer C., Pai S., Watabe M., Borgia P., Mashimo T., Eagleton L. &
Watabe K., 1996. Antimicrobial activity of a 13 amino acid tryptophan-rich
peptide derived from a putative porcine precursor protein of a novel family
of antibacterial peptides. FEBS Lett 15;390(1):95-8
Matsuzaki K., 1999. Why and how are peptide lipid interactions utilized for
self defense ? Magainins and Tachyplesins as archetypes. Bioch et
Biophisic Acta 1462 p.p.1-10
National Center of Biotechnology Information.1988. NCBI. Home page:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Nielsen H., Engelbrecht J., Bruna K. S., & von Heigne G., 1997.
Identification of procariotic and eucariotic signal peptides and prediction
of their cleavaje sites. Protein Engineering (10):1-6
Normille D. & Marshall E., 2000. When Pharma Merges, R&D Is the
dowry. Science 17 (287) 1952-1959.
Narasimhaiah S. & Nagaraj R., 1999. Interaction of antimicrobial
peptides with biological and model membrane: structural and charge
requirements for activity. Biochimica et Biophysica Acta 1462. p.p. 29-54.
Poveda E. E., 2000. Diseño teórico de péptidos miméticos de leptina
como farmacóforo para el tratamiento de la obesidad. Santa fe de
Bogotá. Tesis de Maestría en Biología. Pontificia Universidad Javeriana.
Facultad de Ciencias.
Rosamond J. &, Allsop A., 2000. Harnessing the Power of the Genome in
the Search for NewAntibiotics. Science 17 (287): 1973-1976.
Rachelle J. B., 1997. Molecular modeling of protein structures. Science &
Medicine January/February p.p. 54-63.
Saberwal G. & Nagaraj R., 1994. Cell lytic and antibacterial peptides that
act by perturbing the barrier function of membranes: facets of their
conformational features, structure -function correlations and membrane
perturbing abilities. Biochimica et Biophysica Acta 1197. p.p. 109-131.
Shai Y. & Oren Z., 1983. Diasteromers of citolysins, a novel class of
potent antibacterial peptides. J Biol Chem 271 (13): 7305-7308.
Shuster F.L.,& Jacobs L.S.,1992. Effects of Magainins on ameba and Cys
stages of Acanthamoeba polyphaga. Antimicrob Agents Chemother
36(6):1236-1271
Sternberg M., 1996. Protein Structure Pediction A Practical Approach . 1ª
ed. New York. Oxford University Press. p.p.49-77.
Stephen F., Altschul M. & Lipman D., 1990. Protein database searches for
multiples alignments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (87): 5509-5513.
Stephen F., Altschul M. & Boguski. 1994. Issues en searching molecular
secuence database. Nature Genetics (6): 119-129
Swiss institute of bioinformatic, ExPASy., 1993. Expert Protein Analysis
System Home: www.expasy.ch
Thomas J. G. & Dale L. O., 1994. Concepts in protein engineering and
desing . 1ª ed. New York. Walter de Gruyter. Editors Paul Wreder, Gisbert
Scheider. p.p. 75-110.
Thompson J. D., Higgins D. G. & Gibson T. J. 1994. ClustalW: Improving
the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through
sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix
choice. Nucleic Acids Res (22) 4673-4680.
Veerapandian P,1998. Structure-Based Drug DESING. 1ª ed. New York.
Marcel Deker Inc . p.p. 3-40.
Wang L. T., Shapiro A. B. & Shasha D., 1999. Pattern discovery in
biomolecular data. New York. Oxford University Press.
Yang Y. S., Mitta G., Chavanieu A., Calas B., Sanchez J. F., Roch P. &
Aumelas A., 2000. Solution structure and activity of the synthetic four-
disulfide bond Mediterranean mussel defensin (MGD-1). Biochemistry
39(47):14436-47.
Zeng J., Herbert R & Treutlein., 1999. A method for computational
combinatorial peptide desing of Inhibitors of Ras proteins. Protein Eng;
12(6):457-468.
Anexo 1: Alineamiento del primer banco de secuencias.
10 20 30 40 50 60 | | | | | |AAB35218 --------------------QRFIQPTFRPPPTQRPIIRTARQAGQEPLWLYQGDNVPRAAAB35157 ------------------------------------------------------------UNK_645428619 ------------------------------------------------------------P37362 ------------------------------------------------------------S68967 -------------QALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKAD-EDPGTPKPS41731 -------------QALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKAD-EDPGTPKPA53421 -------------QALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKAD-EDPGTPKPS40463 -------------QALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKAD-EDPGTPKPP51524 LLLLALVVPSASAQALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKAD-EDPGTPKPP56425 -------------QDLSYREAVLRAVDQFNERSSEANLYRLLELDPPPEQDVEHPGARKPP54229 -------------QALSYREAVLRAVDQLNEKSSEANLYRLLELDPPPKEDDENPNIPKPS74248 -----------------YKEAVLRAIDGINQRSSDANLYRLLDLDPRPTMD-GDPDTPKPS68232 -----------------YREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKAD-EDPGTPKPAAB20869 ------------------------------------------------------------P36193 -----------------------------------------------------TPGKPRPP81438 -------------------------------------------------------GRPNPQ10745 ------------------------------------------------------------AAB36306 ------------------------------------------------------------BAA36401 ------------------------------------------------------------B41711 ------------------------------------------------------------P81602 ------------------------------------------------------------AAB46808 ------------------------------------------------------------P18313 ------------------------------------------------------------P37364 ------------------------------------------------------------P41965 ------------------------------------------------------------P01507 ------------------------------------------------------------P14666 ------------------------------------------------------------AAA93036 ------------------------------------------------------------P56231 ------------------------------------------------------------P56227 ------------------------------------------------------------P56242 ------------------------------------------------------------BAA11943 ------------------------------------------------------------S04634 ------------------------------------------------------------P08375 ------------------------------------------------------------AAA87381 ------------------------------------------------------------S13450 ------------------------------------------------------------A41711 ------------------------------------------------------------P37363 ---------------------------DVELKGKGGENEGFVGLKAQRNLYEDDRTSLSGAAB35810 ------------------------------------------------------------S36841 ------------------------------------------------------------T09004 ------------------------------------------------------------AAB28178 ------------------------------------------------------------ <FONT COLOR=deeppink> Prim.cons. LLLLALVVPSASAQALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKAD4EDPGTPKP
70 80 90 100 110 120 | | | | | |AAB35218 PSTADHPILPSKIDDVQLDPNRRYVRSVTNPENNEASIEHSHHTVDTGLDQPIESHR---AAB35157 ------------------------------------------------------------UNK_645428619 ------------------------------------------------------------P37362 ------------------------------------------------------------S68967 VSFTVKETVCPRPTWRPPELCDFKENGRVKQCVGTVTLDQIKDPLDITCNEIQSVG----S41731 VSFTVKETVCPRPTWRPPELCDFKENGRVKQCVGTVTLNPSNDPLDINCDEIQSVG----A53421 VSFTVKETVCPRPTRQPPELCDFKENGRVKQCVGTVTLKEIRGNFDITCNQLQSVR----S40463 VSFTVKETVCPRPTRRPPELCDFKENGRVKQCVGTVTLDQIKDPLDITCNEGVRRFPWWWP51524 VSFTVKETVCPRPTRQPPELCDFKENGRVKQCVGTVTLDQIKDPLDITCNEGVRRFPWWWP56425 VSFTVKETVCPRTTPQPPEQCDFKENGLVKQCVGTVTRYWIRGDFDITCNNIQSAG----P54229 VSFRVKETVCPRTSQQSPEQCDFKENGLLKECVGTVTLDQVGSNFDITCAVPQSVG----S74248 VSFTVKETVCPRTTQQSPEDCDFKKDGLVKRCMGTVNLNQARGSFDISCDKDNKRF----S68232 VSFTVKETVCPRPTRQPPELCDFK-NGRVKQCVGTVTLNPSIHSLDISCNEIQSVR----AAB20869 -------------------------------------------------------R----P36193 YSP--RPTSHPRPIRVRREALAIE------------------------DHLAQAAI----P81438 VNN--KPTPHPRL-----------------------------------------------Q10745 ----------------------------------------------VTCDLLSFEA----AAB36306 ----------------------------------------------VTCDLLSFEA----BAA36401 ------------------------------APAPEALEASVIRQKRLTCDLLSFEA----B41711 ----------------------------------------------FTCDVLGFEI----P81602 ----------------------------------------------ATCDLLS-------AAB46808 -------AYPQEPVLADEARPFANSLFDELPEETYQAAVENFRLKRATCDLLS-------P18313 ---------------SPAAAAEESKFVDGLHALKTIEPELHGRYKRATCDLLS-------P37364 ----------------------------------------------ATCDILSFQS----P41965 -------------------------------------------------------G----P01507 ---------------------------------------------------APEPK----P14666 -------------------------------------------------------R----AAA93036 --------------------------------------------------APDMPR----P56231 ------------------------------------------------------------P56227 ------------------------------------------------------------
P56242 ------------------------------------------------------------BAA11943 -----------------AVDFSSCARMDVPGLSKVAQGLCISSCKFQNCGTGHCEK----S04634 ----DEKPKLILPTPAPPNLPQLVGGGGGNRKDGFGVSVDAHQKVWTSDNGRHSIG----P08375 -------------------------------------------------GWLKKIG----AAA87381 ---------------------MANLKAVFLICIVAFIALQCVVAEPAAEDSVVVKR----S13450 ------------------------------------------------------------A41711 ---------------------SLQGGAPNFPQPSQQNGGWQVSPDLGRDDKGNTRG----P37363 TVKGQSQWKDPYPAQHAGMARLDGTRTLIENDRTKVTGSGFAQREVATGMRPHDSFGVGVAAB35810 --------------------------------------------AKIPIKAIKTVG----S36841 -----------------------------------------------RADTQTYQP----T09004 -----------------------------------------MEKNNEVINSIQEVS----AAB28178 ------------------------------------KQATVGDINTERPGILDLKG---- <FONT COLOR=deeppink> Prim.cons. VSFTVKETVCPRPTRQPPELCDFKENGRVKQCVGTVTLDQI3DPLDITCDLLQSVGPWWW
130 140 150 160 170 180 | | | | | |AAB35218 NTRDLRFLYPRGKLPVPTPPPFNPKPIYIDMGNRYRRHASDDQEELRQYNEHFLIPRDIFAAB35157 ---DLRFLYPRGKLPVPTPPPFNPKPIYIDMGNRY-------------------------UNK_645428619 -----------GNRPVYIPPPRPPHPRL--------------------------------P37362 -----------VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN-----------------------------S68967 LLSRLRDFLSDRGRRLGEKIERIGQKIKD-LSEFFQS-----------------------S41731 RFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWIPPIVGS-IPLGCG------------------------A53421 IIDLLWRVRRPQKPKFVTVWVR--------------------------------------S40463 PFLRRPRLRRQAFPPPNVPGPRFPPPNVP-GPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPP51524 PFLRRPRLRRQAFPPPNVPGPRFPPPNFP-GPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPP56425 LFRRLRDSIRRGQQKILEKARRIGERIKD-IFRG--------------------------P54229 GLRSLG-------RKILRAWKKYGPIIVP-IIRIG-------------------------S74248 ALLG--DFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKD-FLRNLVPRTES-------------------S68232 RRPR--PPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFPGKR-----------------AAB20869 RRPR--PPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP--------------------P36193 ---------------RPPPILPA-------------------------------------P81438 ------------------------------------------------------------Q10745 -K-GFAANHSLCAAHCLAIGRRGGSCER---GVCICRR----------------------AAB36306 -K-GFAANHSLCAAHCLAIGRRGGSCER---GVCICRE----------------------BAA36401 -K-GFAANHSLCAAHCLAIGRKGGACQN---GVCVCRR----------------------B41711 -A-GTKLNSAACGAHCLALGRRGGYCNSK--SVCVCR-----------------------P81602 ---GFGVGDSACAAHCIARGNRGGYCNSQ--KVCVCRN----------------------AAB46808 ---GFGVGDSACAAHCIARGNRGGYCNSK--KVCVCRN----------------------P18313 ---GTGINHSACAAHCLLRGNRGGYCNGK--AVCVCRN----------------------P37364 -Q-WVTPNHAGCALHCVIKGYKGGQCKI---TVCHCRR----------------------P41965 -F-GCPLNQGACHRHCRSIRRRGGYCAGFFKQTCTCYRN---------------------P01507 -W-KLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAKG---------------------P14666 -W-KIFKKIEKVGQNIRDGIVKAGPAVAVVGQAATI------------------------AAA93036 -W-RLFRRIDRVGKQIKQGILRAGPAIALVGDARAVG-----------------------P56231 ---GLFSVLGAVAKHVLPHVV---PVIAEK------------------------------P56227 ---GLLGVLGSVAKHVLPHVV---PVIAEHL-----------------------------P56242 ---GLWQKIKSAAGDLASGIVEGIKS----------------------------------BAA11943 ---RGGRPTCVCDRCGRGGGEWPSVPMPKGRSSRGRRHS---------------------S04634 -----VTPGYSQHLGGPYGNSRPDYRIGAGYSYNFG------------------------P08375 ------KKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATARG---------------------AAA87381 ---SIGSALKKALPVAKKIGKIALPIAKAALPVAAGLVG---------------------S13450 ---VFIDILDKVENAIHNAAQVGIGFAKPFEKLINPK-----------------------A41711 QIEIQNKGKDHDFNAGWGKVIRGPNKAKPTWHVGGTYRR---------------------P37363 EATHNIYKGKNGEVDVFGGVQRQWNTPDRHQARGGIRWRF--------------------AAB35810 ------KAVGKGLRAINIASTANDVFNFLKPKKRKH------------------------S36841 ------YNKDWIKEKIYVLLRRQAQQAGK-------------------------------T09004 -LEELDQIIGAGKNGVFKTISHECHLNTWAFLATCCS-----------------------AAB28178 ---KAKWDAWNGLKGTSKEDAMKAYINKVEELKKKYGI---------------------- <FONT COLOR=deeppink> Prim.cons. RFRGLGKNIS2CARHILA2GPRGGPCIKPGGPVCVCRRFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFP
190 200 210 | | |AAB35218 QE--------------------------------AAB35157 ----------------------------------UNK_645428619 ----------------------------------P37362 ----------------------------------S68967 ----------------------------------S41731 ----------------------------------A53421 ----------------------------------S40463 GPPFPPPIFPGPWFPPPPPFRPPPFGPPRFPGRRP51524 GPPFPPPIFPGPWFPPPPPFRPPPFGPPRFPGRRP56425 ----------------------------------P54229 ----------------------------------S74248 ----------------------------------S68232 ----------------------------------AAB20869 ----------------------------------P36193 ----------------------------------
P81438 ----------------------------------Q10745 ----------------------------------AAB36306 ----------------------------------BAA36401 ----------------------------------B41711 ----------------------------------P81602 ----------------------------------AAB46808 ----------------------------------P18313 ----------------------------------P37364 ----------------------------------P41965 ----------------------------------P01507 ----------------------------------P14666 ----------------------------------AAA93036 ----------------------------------P56231 ----------------------------------P56227 ----------------------------------P56242 ----------------------------------BAA11943 ----------------------------------S04634 ----------------------------------P08375 ----------------------------------AAA87381 ----------------------------------S13450 ----------------------------------A41711 ----------------------------------P37363 ----------------------------------AAB35810 ----------------------------------S36841 ----------------------------------T09004 ----------------------------------AAB28178 ---------------------------------- <FONT COLOR=deeppink> </FONT>Prim.cons. GPPFPPPIFPGPWFPPPPPFRPPPFGPPRFPGRR
</CODE></PRE><HR><B>Alignment data :</B><BR>Alignment length : 214<BR>Identity (*) : 0 is 0.00 %<BR>Strongly similar (:) : 0 is 0.00 %<BR>Weakly similar (.) : 0 is 0.00 %<BR>Different : 214 is 100.00 %<BR>Sequence 0001 : AAB35218 ( 159 residues).<BR>Sequence 0002 : AAB35157 ( 32 residues).<BR>Sequence 0003 : UNK_645428619 ( 17 residues).<BR>Sequence 0004 : P37362 ( 20 residues).<BR>Sequence 0005 : S68967 ( 138 residues).<BR>Sequence 0006 : S41731 ( 137 residues).<BR>Sequence 0007 : A53421 ( 124 residues).<BR>Sequence 0008 : S40463 ( 199 residues).<BR>Sequence 0009 : P51524 ( 212 residues).<BR>Sequence 0010 : P56425 ( 136 residues).<BR>Sequence 0011 : P54229 ( 130 residues).<BR>Sequence 0012 : S74248 ( 136 residues).<BR>Sequence 0013 : S68232 ( 138 residues).<BR>Sequence 0014 : AAB20869 ( 39 residues).<BR>Sequence 0015 : P36193 ( 45 residues).<BR>Sequence 0016 : P81438 ( 16 residues).<BR>Sequence 0017 : Q10745 ( 43 residues).<BR>Sequence 0018 : AAB36306 ( 43 residues).<BR>Sequence 0019 : BAA36401 ( 59 residues).<BR>Sequence 0020 : B41711 ( 43 residues).<BR>Sequence 0021 : P81602 ( 40 residues).<BR>Sequence 0022 : AAB46808 ( 79 residues).<BR>Sequence 0023 : P18313 ( 71 residues).<BR>Sequence 0024 : P37364 ( 43 residues).<BR>Sequence 0025 : P41965 ( 38 residues).<BR>Sequence 0026 : P01507 ( 42 residues).<BR>Sequence 0027 : P14666 ( 35 residues).<BR>Sequence 0028 : AAA93036 ( 41 residues).<BR>Sequence 0029 : P56231 ( 24 residues).<BR>Sequence 0030 : P56227 ( 25 residues).<BR>Sequence 0031 : P56242 ( 23 residues).<BR>Sequence 0032 : BAA11943 ( 75 residues).<BR>Sequence 0033 : S04634 ( 83 residues).<BR>Sequence 0034 : P08375 ( 40 residues).<BR>Sequence 0035 : AAA87381 ( 71 residues).<BR>Sequence 0036 : S13450 ( 34 residues).<BR>Sequence 0037 : A41711 ( 74 residues).<BR>Sequence 0038 : P37363 ( 133 residues).<BR>Sequence 0039 : AAB35810 ( 42 residues).<BR>Sequence 0040 : S36841 ( 32 residues).<BR>Sequence 0041 : T09004 ( 51 residues).<BR>
Sequence 0042 : AAB28178 ( 55 residues).<BR><HR><B>CLUSTALW options used :</B><BR>endgaps=1<BR>gapdist=8<BR>gapext=0.2<BR>gapopen=10.0<BR>hgapresidues=GPSNDQERK<BR>ktuple=1<BR>matrix=blosum<BR>maxdiv=30<BR>outorder=aligned<BR>pairgap=3<BR>score=percent<BR>topdiags=5<BR>type=PROTEIN<BR>window=5<BR>
Anexo 2: Matriz de similitud obtenidos a partir del alineamiento con
ClustalW.
S13450 S04634 S41731 S40463 P36193 TO9004 S36841 A41711 S74248 S68967
S13450 100 8 8 8 5 8 6 5 8 11S04634 8 100 7 7 11 9 6 12 4 13S41731 8 7 100 65 26 13 12 4 52 74S40463 8 7 65 100 35 7 12 8 46 69P36193 5 11 26 35 100 6 15 8 13 24TO9004 8 9 13 7 6 100 6 7 3 13S36841 6 6 12 12 15 6 100 6 9 12A41711 5 12 4 8 8 7 6 100 14 4S74248 8 4 52 46 13 3 9 14 100 50S68967 11 13 74 69 24 13 12 4 50 100S68232 8 9 71 8 35 7 12 2 45 66P56425 11 6 63 10 13 3 12 9 55 66B41711 11 6 4 4 4 6 3 4 4 4A53421 11 7 74 71 24 9 6 8 50 74P18313 8 8 4 4 11 9 6 4 11 4P08375 14 7 7 7 7 10 6 15 17 20P81438 18 25 25 31 50 18 12 31 31 25P81602 5 15 12 12 5 10 6 7 12 12AAB36306 8 8 3 10 8 9 3 5 3 3P37362 10 25 15 30 30 5 15 15 15 15P51524 8 7 64 98 35 7 12 8 47 68P37364 2 11 9 6 4 13 3 4 9 9P37363 8 10 4 3 15 4 3 14 6 7P56231 8 16 20 8 8 12 8 12 20 8P54229 14 10 61 56 13 5 12 13 46 63P56224 13 17 8 8 4 13 13 8 30 21P41965 8 21 5 5 13 13 18 10 13 5Q10745 8 9 4 4 6 4 9 9 4 4P01507 8 9 16 11 4 19 6 4 14 26P56227 8 16 24 8 8 16 12 8 16 8P14666 8 11 14 2 2 17 9 5 17 20P81464 11 23 23 41 29 11 11 17 29 23BAA11943 8 6 8 13 11 3 3 9 6 8AAB46808 11 7 7 4 8 9 6 5 6 4BAA36401 8 9 4 4 11 4 3 9 4 4AAB35810 14 11 11 11 9 4 3 7 16 11AAB35218 17 7 7 9 22 15 9 6 8 7AAB35157 6 18 21 28 12 9 9 9 15 21AAA93036 8 4 17 19 12 7 12 17 9 17AAA87381 20 9 8 8 6 7 9 2 8 8AAB20869 8 17 10 48 28 7 9 7 17 10AAB28178 2 12 7 9 6 5 3 9 12 4
S68232 P56425 B41711 A53421 P18313 P08375 P81438 P81602 AAB36306 P37362 P51524
8 11 11 11 8 14 18 5 8 10 89 6 6 7 8 7 25 15 8 25 7
71 63 4 74 4 7 25 12 3 15 648 10 4 71 4 7 31 12 10 30 98
35 13 4 24 11 7 50 5 8 30 357 3 6 9 9 10 18 10 9 5 7
12 12 3 6 6 6 12 6 3 15 122 9 4 8 4 15 31 7 5 15 8
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20 15 10 7 22 100 12 15 7 10 743 25 12 25 18 12 100 12 18 18 3112 12 50 12 77 15 12 100 60 10 1218 6 55 10 47 7 18 60 100 10 1035 30 10 30 10 10 18 10 10 100 3076 55 4 72 4 7 31 12 10 30 1004 11 41 6 46 2 12 45 51 10 61 4 6 8 5 10 18 15 8 10 3
12 20 8 20 12 16 18 16 20 15 1656 62 4 62 7 15 18 10 6 20 568 17 17 13 30 13 6 26 13 0 85 10 42 5 39 10 12 31 34 10 54 4 55 4 58 5 12 60 86 10 40 11 4 0 4 32 12 7 7 10 11
16 20 12 20 12 24 25 16 16 15 160 17 5 0 11 31 18 5 8 5 2
47 17 17 41 23 11 43 23 11 35 416 6 18 6 14 7 25 20 15 15 155 7 48 5 49 15 6 97 45 10 44 4 55 4 58 5 12 60 83 10 4
11 11 7 11 9 15 31 12 11 5 1114 9 4 8 8 5 31 10 6 30 925 15 6 21 6 3 31 12 9 30 2812 9 12 12 9 10 12 7 9 15 197 9 2 12 1 25 6 7 8 20 14
100 10 5 15 7 2 25 5 5 35 489 7 2 9 10 5 10 5 5 10 9
P37364 P37363 P56231 P54229 P56242 P41965 Q10745 PO1507 P56227 P14666 P81464 BAA11943
2 8 8 14 13 8 8 8 8 8 11 811 10 16 10 17 21 9 9 16 11 23 6
9 4 20 61 8 5 4 16 24 14 23 86 3 8 56 8 5 4 11 8 2 41 134 15 8 13 4 13 6 4 8 2 29 11
13 4 12 5 13 13 4 19 16 17 11 33 3 8 12 13 18 9 6 12 9 11 34 14 12 13 8 10 9 4 8 5 17 99 6 20 46 30 13 4 14 16 17 29 69 7 8 63 21 5 4 26 8 20 23 84 1 12 56 8 5 4 0 16 0 47 6
11 4 20 62 17 10 4 11 20 17 17 641 6 8 4 17 42 55 4 12 5 17 18
6 8 20 62 13 5 4 0 20 0 41 646 5 12 7 30 39 58 4 12 11 23 14
2 10 16 15 13 10 5 32 24 31 11 712 18 18 18 6 12 12 12 25 18 43 2545 15 16 10 26 31 60 7 16 5 23 2051 8 20 6 13 34 86 7 16 8 11 1510 10 15 20 0 10 10 10 15 5 35 15
6 3 16 56 8 5 4 11 16 2 41 15100 25 12 6 17 26 48 2 12 2 5 16
25 100 16 5 17 10 11 11 16 5 1 1412 16 100 16 21 12 20 12 83 12 17 12
6 5 16 100 8 7 9 11 32 14 17 217 17 21 8 100 8 13 21 26 21 5 1726 10 12 7 8 100 36 5 8 5 5 2348 11 20 9 13 36 100 7 16 8 11 23
2 11 12 11 21 5 7 100 8 85 11 912 16 83 32 26 8 16 8 100 12 17 16
2 5 12 14 21 5 8 85 12 100 11 115 1 17 17 5 5 11 11 17 11 100 17
16 14 12 2 17 23 23 9 16 11 17 10041 7 12 4 30 34 55 9 12 14 23 1046 11 20 9 13 97 97 7 16 8 11 20
4 9 12 11 13 5 9 7 20 14 11 42 3 12 10 17 15 4 6 12 8 47 66 9 12 12 8 6 6 8 12 6 47 62 7 16 21 17 13 9 14 20 48 17 79 4 20 11 26 10 6 14 20 20 11 45 5 12 15 13 5 5 5 12 5 47 72 5 8 9 8 2 9 4 12 2 17 9
AAB46808 BAA36401 AAB35810 AAB35218 AAB35157 AAA93036 AAA87381 AAB20869 AAB28178
11 8 14 17 6 8 20 8 27 9 11 7 18 4 9 17 127 4 11 7 21 17 8 10 74 4 11 9 28 19 8 48 98 11 9 22 12 12 6 28 69 4 4 15 9 7 7 7 56 3 3 9 9 12 9 9 35 9 7 6 9 17 2 7 96 4 16 8 15 9 8 17 124 4 11 7 21 17 8 10 45 4 11 14 25 12 7 100 97 4 11 9 15 9 9 10 7
48 55 7 4 6 12 2 5 25 4 11 8 21 12 12 15 9
49 58 9 8 6 9 1 7 1015 5 15 5 3 10 25 2 56 12 31 31 31 12 6 25 10
97 60 12 10 12 7 7 5 545 83 11 6 9 9 8 5 510 10 5 30 30 15 20 35 104 4 11 9 28 19 14 48 9
41 46 4 2 6 2 9 5 27 11 9 3 9 7 4 5 5
12 20 12 12 12 16 20 12 84 9 11 10 12 21 11 15 9
30 13 13 17 8 17 26 13 834 97 5 15 6 13 10 5 255 97 9 4 6 9 6 5 99 7 7 6 8 14 14 5 4
12 16 20 12 12 20 20 12 1214 8 14 8 6 48 20 5 223 11 11 47 47 17 11 47 1710 20 4 6 6 7 4 7 9
100 20 9 4 12 7 14 10 720 100 9 4 6 9 6 5 99 9 100 16 9 12 9 5 114 4 16 100 100 7 5 20 12
12 6 9 100 100 6 12 25 67 9 12 7 6 100 7 7 4
14 6 9 5 12 7 100 7 710 5 5 20 25 7 7 100 57 9 11 12 6 4 7 5 100
DISEÑO DE FARMACÓFOROS PEPTíDICOS CON EFECTO ANTIBACTERIAL
Paula Cortés García
Director: Leonardo Lareo, MSc
Facultad de Ciencias Departamento de BiologíaPontificia Universidad Javeriana
INTRODUCCIÓN
Plantas Plantas medicinalesmedicinales
Fittonia sp PenicilinaPenicilinaAlexander Fleming 1939
BiocómputBiocómputooHerramienta actual de
la farmacología
Es posible encontrar soluciones a las enfermedades causadas por agentes bacterianos, hábiles en desarrollar resistencia a los medicamentos, por medio de la Biología Molecular Computacional ?
EL PROBLEMA
JUSTIFICACIÓN• Dificultad para el tratamiento de enfermedades infecciosas, debido a la resistencia bacteriana.
• Potencial de los péptidos debido a su amplio espectro (Hancock y Scott, 2000).
• Necesidad de optimizar la producción de medicamentos a través del biocómputo
• La inversión en creación de fármacos antibacterianos supera 150 billones de dólares / año (Normille y Marshall, 2000).
Diseñar con base en herramientas computacionales, péptidos con posible efecto antibacteriano.
OBJETIVO GENERAL
• Generar una base de datos con las secuencias peptídicas reportadas con actividad antibacteriana.
• Proponer modelos explicativos de la actividad antibacteriana de las secuencias consenso.
• Predecir la estructura tridimensional de algunos de los péptidos diseñados.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
MATERIALES Y MÉTODOSFase A: • Identificación y muestreo en la base de datos del NCBI de las secuencias reportadas como péptidos antibacteriales (Burks, 1990).
MATERIALES Y MÉTODOS• Depuración de las secuencias y eliminación del péptido señal (Blobel, 1999).
• Identificación del primer banco de secuencias y obtención de sus similitudes y alineamientos (Stephen, Altchul & Lipman, 1990).
MATERIALES Y MÉTODOS
Fase B:• Realización de un árbol de agrupamiento simple, con los datos de similitud entre las secuencias.
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS• Identificación de áreas de alta similitud entre secuencias (Hoffman et. al., 1999)
• Obtención de la estructura de las moléculas (Junker, Apweiler & Bairoch, 1999).
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
•Establecimiento de las secuencias consenso del grupo de péptidos a los que se les encontró estructura (Wang, Shapiro & Shasha, 1999)
MATERIALES Y MÉTODOS
FASE C:• Diseño de péptidos con base en las áreas variables de los motivos, en las observaciones hechas en los alineamientos y en la literatura.
.[RK]-x(3)-G-T- [PSGY]-x(6).
•Secuencia 1 R L L K G T G P R H RRH•Secuencia 2 K LM R G T S P D K KKH•Secuencia 3 R LM H G T S P E E KHR•S.consenso R LM + G T S P c c K+H
•Secuencia diseñada: RACHGTSPEKHRH
MATERIALES Y MÉTODOS
• Predicción de la estructura tridimensional de algunas secuencias propuestas (Junker Apweiler & Bairoch, 1999).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
PÉPTIDOS REPORTADOS COMO AGENTES ANTIBACTERIANOS
AAA31103 AAA31109 BAA34260 P56238 P49928 AAD40115AAA63447 AAB35810 BAA36402 P56239 P49929 AAD40116AAA87381 AAA31070 AA77338 P56240 P51542 AAD40117CAA60023 AAB36306 P21663 P56241 P37364 CAB75948AAA93036 AAB37723 Q27906 P56242 P37363 CAB75949CAA79936 AAB39000 P81463 P56243 P80230 CAB75950CAA67062 AAB39001 P81464 P56244 P56231 CAB75951CAA40046 AAB39002 P14661 P81251 P56232 P81313CAA34842 AAB39003 P14666 P81251 BAA36401 P083752105311A AAB46807 P01507 P81462 CAB63924 P560292110242A AAB46808 P80032 CAB57822 P18684 P56425AAB12663 AAB46809 P48821 P36501 P36193 B41711AAB20744 AAB46810 P56227 P80408 P37362 C41711AAB30910 JN0899 P56228 P80409 P54684 A47103AAB28180 S57331 P56228 P80410 Q27905 A53421AAB30186 BAA08395 P80033 P80411 P81437 S40463AAB32789 BAA08667 P41965 P54228 P81438 S41731AAB35157 BAA11943 P80407 P54229 P55796 S57330AAB35157 AAB91455 Q10745 P49930 P81602 S68232AAB35158 AAC02238 P56230 P49931 P81603 S68967AAB35159 AAC05493 P56233 P49932 AAD40112 S74248AAB35218 CAA76328 P56235 Q54957 AAD40113 JE0161AAB35385 2LEU P56237 P80054 AAD40114 S04634
A41711 S36841 JN0613 JC4247 T09004 S74112JC5665 S13450 P81369
PRIMER BANCO DE SECUENCIASN° Código
LocusCódigo del
GenBank GIN° de
Aa InicialesN° de Aa del
péptidoseñal.
N° de Aa Finales. Definición del grupopeptídico según el NCBI
1 S13450 7511807 57 23 34 Andropina 12 S04634 85277 83 0 83 Diptericina 63 S41731 1085428 166 29 137 Catelicidina4 S40463 543099 228 29 199 Catelicidina5 P36193 544189 64 19 45 Drosoicina6 TO9004 7446308 51 0 51 Streptococcin 27 S36841 480426 32 0 32 Caenohabiditis 138 A41711 102880 74 0 74 Defensina 49 S74248 7438228 170 34 136 Catelicidina 5
10 S68967 2136473 167 29 138 Catelicidina11 S68232 2136470 172 29 143 Catelicidina12 P56425 3024115 165 29 136 Catelicidina13 B41711 102881 43 0 43 Defensina14 A53421 539725 153 29 124 Catelicidina15 P18313 134214 94 23 71 Defensina16 P08375 134859 63 23 40 Cecropina 717 P81438 3913673 16 0 16 Drosoicina 818 P81602 6225250 40 0 40 Defensina19 AAB36306 1481023 43 0 43 Defensina20 P37362 585769 20 0 20 Drosoicina21 P51524 1730500 212 0 212 Catelicidina
22 P37364 585042 43 0 43 Defensina23 P37363 585245 133 0 133 Drosoicina24 P56231 3023565 24 0 24 Caerina 925 P54229 1708946 159 29 130 Catelicidina26 P56242 3023576 23 0 23 Caerina27 P41965 1169262 38 0 38 Defensina28 Q10745 1706353 43 0 43 Defensina29 P01507 116087 64 22 42 Cecropina30 P56227 3023542 25 0 25 Caerina31 P14666 116082 35 0 35 Cecropina32 P81464 3913075 17 0 17 Apiadecina 333 BAA11943 1731734 93 18 75 Antibacterial34 AAB46808 1835985 98 19 79 Defensina35 BAA36401 4115517 79 20 59 Defensina36 AAB35810 1246017 42 0 42 Moricina 1037 AAB35218 1168069 179 20 159 Lebocina 1138 AAB35157 1168022 32 0 32 Lebocina39 AAA93036 1236982 63 22 41 Cecropina40 AAA87381 755005 71 0 71 Ceratotoxina 1241 AAB20869 242304 39 0 39 Cecropina42 AAB28178 415513 55 0 55 Cecropina
PRIMER BANCO DE SECUENCIAS
ÁRBOL DE AGRUPAMIENTO DEL PRIMER BANCO DE SECUENCIAS
MOTIVOS DE LASFAMILIAS PROTEICAS SELECCIONADAS
Nombre de lafamilia a la que
pertenece el motivo Motivos hallados en la secuencias.Defensinas
Motivo 1 C-x(2,3)-[HN]-C-x(3,4)-[GR]-x(2)-G-G-x-C-x(4,7)-C-x-C.Catelicidinas
Motivo 1 Y-x-[ED]-x-V-x-[RQ]-A-[LIVMA]-[DQG]-x-[LIVMFY]-N-[EQ].
Motivo 2 F-x-[LIVM]-K-E-T-x-C-x(10)-C-x-F-[KR]-[KE].
CecropinasMotivo 1 W-x(0,2)-[KDN]-x(2)-K-[KRE]-[LI]-E-[RKN].
ESTRUCTURAS ENCONTRADAS EN EL PROTEIN DATA BANK
Defensina 1Ica Cecropina 1bb9
PÉPTIDOS DISEÑADOS
SECUENCIA CONSENSO DE DEFENSINAS
Aromático = [ a , [ F, Y, W, H ]. Alifático = [ i , [ I, V, L ]. Hidrofóbico = [ h , alifático
aromático A, G, M, C, K, R, T ]. Positivo = [ + , [ H, K, R ]. Negativo = [ - , [ D, E
]. Cargado = [ c , positivo o negativo]. Polar = [ p , cargado, Q, N, S, T, C ].
Alcohol = [ o , [ S, T ]]; Pequeños = [ u , [ G, A, S ]]; Medianos = [ s , V, T, D, N, P, C
]. Probable = [ t , pequeño o polar]. Cualquiera = [ . , [
G,A,V,I,L,M,F,Y,W,H,C,P,K,R,D,E,Q,N,S,T ]].
Consenso 50%. CAAHCLAlGRRGGYCs..sptVCVC
C-x(2,3)-[HN]-C-x(3,4)-[GR]-x(2)-G-G-x-C-x(4,7)-C-x-C.
ALINEAMIENTOS DE DEFENSINAS
C-x(2,3)-[HN]-C-x(3,4)-[GR]-x(2)-G-G-x-C-x(4,7)-C-x-C.
RESTRICCIONES PROPUESTAS PARA LAS DEFENSINAS
C-x(2,3)-[HN]-C-x(3,4)-[GR]-x(2)-G-G-x-C-x(4,7)-C-x-C.
C1_2 _3 _4 H5 C6_7 _8 _9 _10 G11 _12 _13 G14 G15 _16 C17_18 _19 _ 20_21 _ 22 _23 _ 24 C25_ C27
N R
POSICIONES AMINOÁCIDOS2 3 4 7 8 ( h ) Ala Val Leu Ile Phe Trp Met9 10 13 18 ( c ) Lys Arg His
12 ( p b) Thr Cys Asn Gln Tyr His Lys Arg16 ( p ) Tyr Gln Asn Cys Thr
19 20 22 23 (n c) ) Gly Ser Hys Lys Arg21 ( p ¨p ) Gly Ala Ser Gln Asn Thr Cys24 ( m ´p ) Val Thr Asp Asn Pro Cys26 ( c ´p) His Lys Arg Gly Ser Ala
DEFENSINAS PROPUESTAS
Motivo Secuencia diseñada aaDefensina C A V F H C K K P L R K G G K C K R R Q C K C 24Defensina C V L M N C L F A V G R K G G Y C K A L V C K C 24Defensina C L V F H C M A V L G K L G G Q C L G S T C G C 24Defensina C M A A N C N A V I G H R G G N C R R L C C S C 24Defensina C W F I H C F L I V G R K G G C C K G T R K K D C A C 27Defensina C I V A N C M A V I R H L G G Y C L S C G S R N C K C 27Defensina C F A M H C L I V A R K R G G Q C R A G K G S P C G C 27Defensina C M L A N C M A L A R R K G G N C K G A L S K C C S C 27Defensina C K W I H C W A L I R K L G G Q C L R S R A L V C A C 27Defensina C R A V H C R A H A R H R G G T C R S Q A S L T C K C 27
ESTRUCTURA DE DEFENSINA 1Ica Y SU MOTIVO AISLADO
Protophormia terraenovae40 residuos, Una hélice alfa, dos láminas beta, cuatro formaciones al azar, 4049 KDa. Estructura resuelta por NMR. Reportada en el Protein Data Bank.
Segmento de 1Ica, equivalente estructural de la secuencia donde se encuentra el motivo, una hélice alfa y dos láminas beta. Determinado luego de la manipulación de 1Ica en Spdbv.
ESTRUCTURA DE UNA DEFENSINA PROPUESTA
Se obtuvo luego de 16 deleciones y 19 mutaciones sobre la secuencia original 1Ica. El resultado estructural es una hélice, va desde 2 Ala al 8 His; Las láminas beta, de 14 Gly a 16 Lys y de 20 Arg a 22 Cys.
SecuenciaCys Ala Val Phe His Cys Lys Lys Pro Leu Arg Lys Arg Gly Gly Lys Cys Lys Arg Arg Gln Cys Lys Cys ( 24 aa )
SECUENCIAS CONSENSO DE CECROPINAS
Consenso 90% ... .+W K lFKKIEK
Aromático = [ a , [ F, Y, W, H ]. Alifático = [ i , [ I, V, L ]. Hidrofóbico = [ h , alifático
aromático A, G, M, C, K, R, T ]. Positivo = [ + , [ H, K, R ]. Negativo = [ - , [ D, E
]. Cargado = [ c , positivo o negativo]. Polar = [ p , cargado, Q, N, S, T, C ].
Alcohol = [ o , [ S, T ]]; Pequeños = [ u , [ G, A, S ]]; Medianos = [ s , V, T, D, N, P, C
]. Probable = [ t , pequeño o polar]. Cualquiera = [ . , [
G,A,V,I,L,M,F,Y,W,H,C,P,K,R,D,E,Q,N,S,T ]].
W-x(0,2)-[KDN]-x(2)-K-[KRE]-[LI]-E-[RKN].
ALINEAMIENTOS DE CECROPINAS
W-x(0,2)-[KDN]-x(2)-K-[KRE]-[LI]-E-[RKN].
RESTRICCIONES PROPUESTAS PARA LAS CECROPINAS
W-x(0,2)-[KDN]-x(2)-K-[KRE]-[LI]-E-[RKN].
W1 _2 _ 3 K4 _ 5 _6 K7 _ K8 L9 E10 R11
D R I K N E N
POSICIONES AMINOÁCIDOS
2 3 ( c ) Asp Glu Arg Lys His
5 6 ( h ) Ala Val Leu Ile Phe Trp Met Pro
CECROPINAS PROPUESTAS
Motivos Secuencia aaCecropina W E D D L P K R L E N 11Cecropina W K R N P A R E I E N 11Cecropina W E R N V I K R I E K 11Cecropina W K D D I A K E L E N 11Cecropina W R E N P V K K I E R 11Cecropina W H H K M A K R L E K 11Cecropina W D K D W A K E L E N 11Cecropina W E H D P I K K I E R 11Cecropina W K D N M F K R L E K 11Cecropina W R E K F W K E I E N 11
ESTRUCTURA DECECROPINA 1bb9 Y SU MOTIVO AISLADO
Rattus norvegicus115 residuos, dos hélices alfa, cinco láminas beta, cuatro formaciones al azar, 12844 KDa. Estructura resuelta por Difracción Rayos X.Reportada en el Protein Data Bank.
Segmento de 1bb9 equivalente estructural de la secuencia donde se encuentra el motivo. Dos hélices alfa y un coil. Resultado, una formación al azar . Determinado luego de la manipulación de 1bb9 en Spdbv.
ESTRUCTURA DE UNACECROPINA PROPUESTA
SecuenciaTrp Glu Asp Asp Leu Pro Lys Arg Leu Glu Asn ( 11 aa )
Se obtuvo luego de 62 deleciones y 4 mutaciones sobre la secuencia original 1bb9. El resultado estructural es una hélice que va desde el Trp 1 al residuo 4 Asp y Un coil desde el 5 Leu al 11 Asn.
CONCLUSIONES
• Es posible diseñar péptidos antibacterianos con base en la homología de secuencias.
• El diseño por homología nos permite restringir las opciones variables combinatorias que presenta un motivo.
• Las secuencias consenso permiten refinar los parámetros de restricción a proponer, dentro de los segmentos variables de un motivo.
CONCLUSIONES
• Las altas similitudes entre segmentos peptídicos no implican la existencia de un motivo dentro de las moléculas.
• Los modelos tridimensionales de moléculas, nos permiten observar que tanto se modifican las moléculas propuestas respecto a la estructura de las reales.
CONCLUSIONES
• Es posible diseñar farmacóforos peptídicos con base en los alineamientos y en secuencias consenso usando el motivo como patron a modificar.
• Con las regiones variables de un motivo se pueden hacer propuestas que hagan el péptido más reactivo.
RECOMENDACIONES
• Optimizar los modelos peptídicos propuestos e identificar los que presentan mayor actividad estructural por medio de la mecánica molecular.
• Sintetizar los péptidos propuestos y evaluar su actividad.
• Estudiar la relación de los péptidos diseñados con sus posibles receptores.
AGRADECIMIENTOS
Especialmente a Leonardo R. Lareo. Orlando Acevedo, Edgar Reyes, Raul Poutu, David Restrepo, Luisa Gelvéz, María Martínez, María K Mejia, Eduardo Malagón, Magda Gaviria Carlos Estevez-Breton, Pilar Trujillo, Elpidia Poveda, Lucy Rivera, Mireya Cortés, Gerardo Moreno, Jesus Daza, Ludis Morales, Rosalia Perez, Zulma Casas y Nirmala.. A Gilberto Castillo, a toda mi familia a mis compañeros de clase y a mis amigos .Al departamento de Nutrición y Bioquímica de la Pontificia Universidad Javeriana y a mis profesores.
• Péptido señal
MKIILWLCVF GLFLATLFPI SWQMPVESGL SSEDSASSES FASKIKR HGE GTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSS GAPPPSG
• Alineamiento
Determina homologías, similitudes y diferencias sitio a sitio dentro de la secuencias proteicas.
Secuencia 1: GIVEQCCAATSICS….Secuencia 2: ALYECCQAERCLY…
GIVEQCCAATSICSALYE_CCQA_SICLY
•Motivos proteicosSegmentos altamente conservados son llamados “Motivos” [AL]-x(3)-G-T- [PSGY]-x(10)L APS G T S WRTKHGNCVY.
• Secuencia consensoUna secuencia resultante de las homologías encontradas dentro de un grupo de secuencias•Secuencia 1 R L L K S G G P L T•Secuencia 2 K LM R G V S P P V•Secuencia 3 R LM H G G S P T Y•S.consenso R LM + G p S P _ _