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Dissertação
TERAPIA GÊNICA PARA ANGIOGÊNESE NA ANGINA REFRATÁRIA:
ENSAIO CLÍNICO CONTROLADO FASE I/II
Imarilde Inês Giusti
2
INSTITTUTO DE CARDIOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL
FUNDAÇÃO UNIVERSITÁRIA DE CARDIOLOGIA
Programa de Pós-Graduação em Medicina:
Área de Concentração: Cardiologia e
Ciências Cardiovasculares
TERAPIA GÊNICA PARA ANGIOGÊNESE NA ANGINA REFRATÁRIA:
ENSAIO CLÍNICO CONTROLADO FASE I/II
Autor: Imarilde Inês Giusti
Orientador: Dr. Renato Abdala Karam Kalil
Dissertação submetida como requisito para
obtenção do grau de mestre ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Área
de concentração: Cardiologia e Ciências
Cardiovasculares, da Fundação Universitária
de Cardiologia / Instituto de Cardiologia do
Rio Grande do Sul.
Porto Alegre, 2011
3
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela vida.
À minha família, meus filhos e meu marido pelo apoio, carinho e compreensão.
Ao meu orientador, Dr. Renato Abdala Karam Kalil, sem ele, este trabalho não
aconteceria, agradeço pela orientação, pela amizade e pelo exemplo a ser seguido.
Aos colaboradores do trabalho, aos diferentes setores do Instituto de Cardiologia, que de
alguma forma contribuíram para a realização do mesmo.
À equipe da terapia gênica, Clarissa Garcia Rodrigues, Felipe Borsu de Salles, Roberto
Sant’Ana, Nance Beyer Nardi, Melissa Medeiros Markoski, Andrés Delgado Cañedo e Bruna
Eibel.
Aos pacientes, pela paciência com o estudo e por confiarem na equipe da terapia gênica.
Ao Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul/Fundação Universitária de Cardiologia
pela oportunidade na realização deste trabalho.
Às pessoas que direta ou indiretamente auxiliaram no desenvolvimento e conclusão deste
trabalho.
5
SUMÁRIO
BASE TEÓRICA
1. Introdução................................................................................................... 7
2. Cardiopatia Isquêmica .............................................................................. 9
2.1. Tratamento da Cardiopatia Isquêmica.......................................................... 11
3. Terapia Gênica para Cardiopatia Isquêmica.......................................... 12
3.1. Bases Moleculares da Angiogênese............................................................. 12
3.2. Papel do Endotélio....................................................................................... 16
4. Terapia Gênica com VEGF165............................................................... 19
4.1. Vetor Plasmidial........................................................................................... 28
4.2. Vias de Administração................................................................................. 30
4.3. População, Segurança, Benefícios e Potenciais Riscos do Uso da Terapia
Gênica...........................................................................................................
31
5. Ensaios Clínicos Controlados de Terapia Gênica................................... 32
6. Nossa Experiência com Terapia Gênica................................................... 38
7. Justificativa................................................................................................. 44
8. Hipótese de Pesquisa.................................................................................. 45
9. Objetivos..................................................................................................... 46
9.1. Objetivo Geral.............................................................................................. 46
9.2. Objetivos Específicos................................................................................... 46
10. Referências.................................................................................................. 47
ARTIGO
Resumo........................................................................................................ 57
6
Introdução..................................................................................................
Métodos.......................................................................................................
Análise Estatística......................................................................................
Resultados...................................................................................................
Discussão.....................................................................................................
Referências..................................................................................................
Tabela 1........................................................................................................
Figura 1........................................................................................................
Figura 2........................................................................................................
Figura 3................................................................................................... .....
Figura 4........................................................................................................
Figura 5........................................................................................................
Figura 6........................................................................................................
59
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84
7
1. INTRODUÇÃO
A demonstração de que alguns fatores de crescimento vascular têm o potencial de induzir
angiogênese no tecido isquêmico1-3
tem estimulado a investigação de novas técnicas de
tratamento para pacientes com doença arterial coronariana (DAC). Isso se deve à possibilidade de
induzir angiogênese miocárdica e estabelecer circulação colateral, especialmente nos casos de
angina refratária à terapêutica convencional e inviáveis para as técnicas de revascularização
miocárdica tradicionais, percutânea e cirúrgica.
A complexa cascata de eventos que ocorre durante a neovascularização em resposta à
isquemia envolve diversos fatores de crescimento e receptores4. O fator de crescimento endotelial
vascular (vascular endothelial growth factor - VEGF) tem sido foco de diversos estudos5, 6
e seus
efeitos vêm sendo testados em pacientes com DAC grave7-20
. Nos últimos anos, foram realizados
estudos que utilizaram diferentes doses, vetores e vias de administração do VEGF. Ensaios
clínicos trazem resultados controversos, muitos demonstrando melhora clínica e evidência de
angiogênese8-19
e outros não apresentando diferenças na perfusão miocárdica quando comparados
aos seus controles7-20
. Dessa forma, apesar de promissores, os efeitos clínicos e sobre a
vascularização do miocárdio proporcionados pela terapia gênica com VEGF permanecem não
esclarecidos totalmente.
A terapia gênica com o VEGF representa uma potencial alternativa de tratamento para
angina refratária, pela possibilidade do desenvolvimento de circulação colateral e melhora da
perfusão miocárdica. O VEGF funciona tanto como um importante marcador de dano endotelial
quanto como mediador de reparo. Em casos de injúria como isquemia, inflamação e infarto tem
sua expressão aumentada e estimula a manutenção, mobilização e recrutamento das células
8
progenitoras endoteliais (CPE) da medula óssea21
. Seu potencial angiogênico estimula a produção
endotelial de óxido nítrico (NO).
Estas observações salientam a importância do estudo da segurança, viabilidade e os
efeitos iniciais (ensaio clínico fase I/II), clínicos e sobre a perfusão do miocárdio do gene que
codifica a proteína VEGF em pacientes com DAC avançada e angina refratária, não passíveis de
revascularização percutânea e cirúrgica, visando a possível formação de novos vasos colaterais.
No presente estudo, a administração transtorácica de VEGF165 plasmidial representa o primeiro
ensaio clínico com terapia gênica no Brasil.
9
2. CARDIOPATIA ISQUÊMICA
As doenças cardiovasculares (DCV) são a primeira causa de morte no Brasil,
especialmente entre os idosos. As doenças cerebrovasculares (DCBV) e as doenças isquêmicas
do coração (DIC) totalizam mais de 60% dos óbitos por DCV. Em 2002, a mortalidade
proporcional por DIC, no Brasil, foi de 30,5% das mortes por DCV, sendo que, na faixa etária
acima de 60 anos, foi de 27,4% para o sexo feminino, e para o sexo masculino foi de 32,0% dos
óbitos por DCV22
.
Na fisiopatologia da cardiopatia isquêmica dois processos estão implicados: a oferta e a
demanda de oxigênio pelo miocárdio. A isquemia miocárdica ocorre quando há desequilíbrio na
oferta e na demanda de oxigênio. Por outro lado, duas situações alteram a oferta de oxigênio para
o miocárdio: a isquemia e a hipoxemia. Em algumas condições, o comprometimento da oferta de
oxigênio é secundário à diminuição do fluxo sanguíneo, sendo essa a fisiopatologia da maioria
dos casos de infarto agudo do miocárdio (IAM) e dos episódios de angina instável. Em outras
situações, como a hipertrofia ventricular, o aumento na demanda de oxigênio é o principal
responsável pela isquemia miocárdica23
.
Além disso, o sinergismo desses dois mecanismos é o principal fator na determinação de
isquemia nos casos de angina crônica estável. Esforço físico, estresse emocional, taquicardia ou
hipertensão arterial associados à obstrução coronária alteram não só a demanda como a oferta de
oxigênio, desencadeando isquemia miocárdica. A hipoxemia, por sua vez, caracteriza-se pela
redução da oferta de oxigênio, mas com perfusão sanguínea adequada. Alguns exemplos desse
quadro são as cardiopatias congênitas cianóticas, asfixia, a insuficiência respiratória e a
intoxicação por monóxido de carbono24
. Fatores que alteram a demanda e a oferta de oxigênio,
portanto, são os responsáveis pela evolução do paciente para síndrome coronária aguda e angina
10
crônica estável. De acordo com estatísticas do American Heart Association, 201025
, a prevalência
de angina na população americana é de 4,6%, afetando 58% dos pacientes com DAC25
e
crescendo rapidamente com o aumento da idade.
As opções não convencionais de tratamento para angina refratária são limitadas e incluem
terapia gênica, terapia celular com células tronco e revascularização transmiocárdica com laser.
Alguns pacientes são extensivamente revisados e acabam fazendo algum tipo de
revascularização, mesmo que parcial, com o objetivo de aliviar os sintomas. Entretanto, a longo
prazo, os riscos de eventos adversos são bastante altos26
.
O grau de obstrução da artéria responsável pelo episódio agudo, a ocorrência de lesões em
outros vasos e o grau de circulação colateral são os determinantes mais importantes da
diminuição da oferta de oxigênio; a pressão arterial sistêmica, a freqüência cardíaca e a
hipertrofia e contratilidade ventricular são as variáveis mais importantes na determinação da
demanda de oxigênio. Apesar da contribuição de todos esses fatores na determinação da isquemia
miocárdica, a doença aterosclerótica coronária é o substrato anatômico mais importante na
fisiopatogenia da cardiopatia isquêmica24
.
A partir de estudos destacados da literatura27-30
, sabemos hoje da importância do processo
aterotrombótico não só no desencadeamento da isquemia aguda como também na progressão da
doença aterosclerótica com relação à gravidade da obstrução da luz vascular31, 32
.
Dentre os principais fatores de risco, destacam-se o tabagismo, a hipertensão arterial
sistêmica, a dislipidemia, diabetes melito, intolerância à glicose, resistência à insulina,
insuficiência renal crônica, obesidade, sedentarismo e deficiência de estrógeno. Surgem a cada
ano novos fatores de risco para a DAC, onde várias substâncias dosadas no sangue têm
demonstrado relação com risco coronário maior. Entre essas, as mais estudadas são os valores
totais de homocisteína, lipoproteína, marcadores da função fibrinolítica (PAI-1, t-PA e d-dímero),
11
fibrinogênio e marcadores inflamatórios (proteína C reativa, interleucina 6, fatores de adesão
celular – ICAM-1 e fator de necrose tumoral – TNFα)33, 34
.
A progressão da DAC causa seqüelas como necrose por infarto do miocárdio e fibrose por
isquemia crônica severa, levando à perda progressiva da função contrátil e do relaxamento, à
miocardiopatia isquêmica, com sintomas de insuficiência cardíaca, arritmias e morte35
. O
miocárdio tem capacidade de regeneração limitada, pois embora tenham sido demonstradas
células-tronco cardíacas, estas não são suficientes para compensar grandes perdas de tecido,
como ocorre em infartos do miocárdio, mesmo clinicamente pequenos. Como resultado disso,
isquemia irreversível (infarto) resulta em progressiva substituição das células miocárdicas mortas
por fibrose (cicatriz) com redução da função sistólica e diastólica do coração e iniciando a
síndrome clínica da insuficiência cardíaca com início de toda a ativação neuro-hormonal própria
da doença.
2.1. Tratamento da Cardiopatia Isquêmica
O objetivo do tratamento da angina em pacientes crônicos é aliviar os sintomas, reduzir a
progressão do processo de aterosclerose, diminuir o risco de infarto do miocárdio e morte.
Tradicionalmente é realizado com nitratos, beta-bloqueadores, estatinas, bloqueadores do cálcio e
anti-agregantes plaquetários. Anti-anginosos menos usais como trimetazidina36-38
, ranolazina39,40
,
ivabradina41,42
e nicorandil43-45
eventualmente são associados em situações especiais.
Ainda, entre as opções de tratamento da cardiopatia isquêmica estão a revascularização
percutânea por cateter e a cirurgia de revascularização do miocárdio46
. Com os avanços
tecnológicos e das técnicas cirúrgicas, a cirurgia de revascularização miocárdica é considerada a
melhor opção para o alívio dos sintomas e para a melhora da qualidade de vida dos portadores de
12
DAC46
. Outra opção é a angioplastia coronária transluminal percutânea (ACTP), a qual visa
desobstruir as artérias comprometidas e permitir que o sangue volte a circular livremente47
.
3. TERAPIA GÊNICA PARA CARDIOPATIA ISQUÊMICA
3.1. Bases Moleculares da Angiogênese
Recursos de biologia molecular e terapia gênica têm sido desenvolvidos para aplicação na
terapêutica cardiovascular, em situações nas quais não há opções, ou quando estas apresentam
limitações, pelos métodos convencionais. A principal área de desenvolvimento de terapia gênica
em cardiologia é na indução de angiogênese miocárdica, com potenciais benefícios na cardiopatia
isquêmica em fase terminal, após esgotados os recursos farmacológicos, intervencionistas por
cateter e cirúrgicos, ou seja, naqueles casos refratários a todas as formas de tratamento, onde
restaria apenas o recurso do transplante cardíaco48
.
Angiogênese, a formação de novos vasos a partir do endotélio de vasos já existentes, possui
papel essencial no desenvolvimento embrionário, reparo tissular e progressão de uma variedade
de processos patológicos1, 2
. A angiogênese induzida pela administração do gene que codifica a
proteína VEGF destina-se a promover a formação de novos vasos, capilares e arteríolas.
A idéia de que fatores angiogênicos possam promover revascularização de tecidos
isquêmicos, uma estratégia chamada angiogênese terapêutica49
, foi investigada primeiramente em
indivíduos com doença arterial periférica, especificamente, isquemia crítica de membros. A
transferência de VEGF plasmidial trouxe alguns benefícios clínicos, como a abolição da dor em
repouso e cicatrização das úlceras isquêmicas, salvando membros inferiores. Esses benefícios
foram associados com evidência angiográfica de novos vasos colaterais e do aumento do fluxo
13
sanguíneo para a perna50
. O conceito de angiogênese terapêutica em humanos, através de ensaios
clínicos fase I, levou adiante a idéia de testar esta estratégia em cardiopatas isquêmicos. Portanto,
a angiogênese terapêutica é uma estratégia desenvolvida para amplificar o processo natural da
angiogênese e reperfundir tecidos isquêmicos, podendo representar um novo processo de
revascularização nesses pacientes de alto risco51
.
O mecanismo da angiogênese pode ser iniciado por alguns fatores de natureza mecânica,
por processos inflamatórios ou por hipóxia (desbalanço energético). O processo de angiogênese
ocorre por estágios (Figura 1) que compreendem: dilatação do vaso, ativação de células
endoteliais, ativação de plaquetas, secreção de ativadores do plasminogênio e enzimas
proteolíticas, desgranulação de mastócitos, ativação de macrófagos, ruptura da membrana basal e
aumento de permeabilidade com saída de fibrina e outras proteínas (estágio 1). A seguir, ocorre
formação de pseudópodos, degradação da matriz extracelular, migração de células endoteliais
para o espaço extravascular com proliferação das mesmas e formação de brotos de tecido
vascular (estágio 2). Por fim, forma-se nova membrana basal e maturação da nova parede
vascular para estabelecimento do fluxo sangüíneo, formação de tubos e conexões, estabelecendo-
se os novos vasos (estágio 3)52
.
14
Figura 1 - Seqüência de eventos no processo da angiogênese.
O processo pelo qual a hipóxia e a inflamação induzem à angiogênese vem sendo
intensamente estudado53, 54
. A inflamação aumenta a produção do peptídeo derivado de
macrófagos PR-39, este inibe a degradação do hypoxia-inducible factor 1-alfa (HIF 1-alfa)
levando ao aumento da expressão do VEGF e seus receptores55
. Por outro lado, o PR-39 aumenta
a produção de fatores de crescimento dos fibroblastos (FGF), os quais têm poder angiogênico.
Ainda por outro caminho, a inflamação induz a produção de citoquinas promotoras de
angiogênese56
. Fatores mecânicos podem atuar ativando o mesmo mecanismo e resultando em
angiogênese57
(Figura 2).
15
Figura 2 - Mediadores bioquímicos envolvidos no processo pelo qual a hipóxia e a inflamação
levam à angiogênese. HIF: hypoxia-inducible factor 1; VEGF: vascular endothelial growth
factor; TGF: transforming growth factor; TNF: tumor necrosis factor; FGF: fibroblast growth
factor; IL: interleucina57
.
As duas famílias de fatores identificados e isolados que participam do processo acima
descrito, são do VEGF e do FGF. O membro melhor identificado da família do VEGF é VEGF-
A, que consiste de 5 isoformas, resultantes de divisões alternativas de um gen único, ou sejam:
VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 e VEGF206. A família FGF compreende pelo menos 9
polipeptídeos, incluindo FGF básico e FGF ácido. Diferentemente do VEGF, FGF atua na
mitogênese de células endoteliais, de fibroblastos e de células musculares lisas56
. Ainda, o fator
16
de crescimento do hepatócito (HGF) é um potente mitógeno para uma grande variedade de
células, sendo angiogênico, antiapoptótico e possuindo propriedades antifibróticas58, 59
.
A disponibilidade maior de FGF fez com que o emprego desse gene tenha sido mais
estudado. Entre os estudos experimentais, cabe destacar o relatado por Kawasuji e colaboradores
em um modelo de infarto agudo do miocárdio, onde se demonstrou a eficácia do bFGF em
aumentar o número de vasos capilares na zona limítrofe e no epicárdio da área infartada, no
aumento do fluxo sangüíneo nessas áreas e na melhora da fração de ejeção do ventrículo
esquerdo, 7 dias após o infarto60
. Estudo de longo prazo, de tratamento com FGF-1 ácido como
adjunto de revascularização cirúrgica do miocárdio, em injeção intramiocárdica, por controles
cinecoronariográficos, demonstrou maior densidade de contraste no miocárdio das regiões
tratadas desde o primeiro exame, após 3 meses, mantendo-se de forma semelhante após 3 anos. A
fração de ejeção ventricular esquerda melhorou significativamente no grupo tratado, em relação
ao controle. O mesmo ocorreu na melhora da função segmentar da parede ventricular esquerda da
região apical, tratada com FGF61
.
3.2. Papel do Endotélio
O endotélio sintetiza importantes substâncias desempenhando papel fundamental sobre o
controle vascular, tanto em situações fisiológicas quanto em processos patológicos como as
síndromes coronarianas. Sabe-se que a monocamada de células endoteliais atua como uma
superfície não aderente para plaquetas e leucócitos produzindo uma variedade de importantes
fatores regulatórios como o NO62
. Dessa forma, influencia não somente o tono vascular, mas
também o seu remodelamento, por meio da produção de substâncias promotoras e inibidoras do
seu crescimento63
.
17
A disfunção nas células endoteliais leva a uma perda das propriedades antitrombóticas da
parede vascular e corresponde ao início do processo aterosclerótico62
. Pacientes com doença
coronariana têm importante disfunção endotelial e diminuição da disponibilidade de NO,
particularmente quando a DAC é severa e difusa64,65
.
A reconstrução endotelial ocorre pela migração e proliferação de células endoteliais
maduras circulantes. Entretanto, essas células têm baixo potencial proliferativo e sua capacidade
de reparo é limitada. Evidências indicam que a circulação periférica contém subtipos celulares da
medula óssea com propriedades similares aos angioblastos embrionários. As CPE possuem
capacidade proliferativa e de diferenciação em células endoteliais maduras, podendo ser
induzidas por diferentes citocinas ou fatores de crescimento, como por exemplo, VEGF,
adquirindo diferentes fenótipos62
.
As CPE caracterizam-se pela expressão de diversos marcadores, como CD133, CD34 e
KDR, entre outros. Durante a diferenciação, diminuem os níveis de CD133 e aumenta a
expressão de CD31, CD34, KDR, fator de Von Willebrand, entre outros. As CPE possuem a
habilidade de homing em sítios de lesão vascular e contribuem para a neoangiogênese66
. CPE são
consideradas poderosos marcadores biológicos para a função vascular. Os mecanismos que
estimulam a proliferação e migração dessas células ainda são parcialmente conhecidos62
.
A aplicação de genes recombinantes ou fatores de crescimento sob forma de proteína
recombinante é eficaz tanto pela injeção intramiocárdica como pela via intracoronariana. A
primeira, ainda que implique em toracotomia, tem como vantagem a entrega localizada e com
menor extravasamento sistêmico. O principal alvo do VEGF é a célula endotelial. O receptor
comum para o VEGF-1 e VEGF-2 é o KDR67
, que faz a transdução do sinal angiogênico. O papel
do receptor do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGFR-1) (Flt-1) na angiogênese é
controverso. Hipóxia aumenta a expressão de KDR e a produção de VEGF pelas células
18
endoteliais; este mecanismo com o loop autócrino, juntamente com a proliferação de células
endoteliais após estímulo, pode amplificar e prolongar a resposta ao VEGF administrado. Um
importante papel adicional do VEGF é que ele aumenta o número de células endoteliais
progenitoras circulantes, um efeito que foi documentado em camundongos e seres humanos66,68
.
Estudos experimentais recentes em mamíferos de médio porte como modelo de isquemia
miocárdica investigaram o efeito do VEGF165 intramiocárdico na proliferação de vasos com
musculatura lisa - arteriogênese, visto que a perfusão tecidual depende principalmente da árvore
arteriolar. Além disso, foi avaliado o efeito do tratamento no crescimento capilar, perfusão
miocárdica e função miocárdica. Cinco semanas após o tratamento, o grupo tratado com VEGF165
mostrou alta densidade de pequenos vasos com musculatura lisa, alta densidade de capilares e
melhora na função miocárdica, com diferença significativa em relação ao grupo controle. Esse
estudo mostra um efeito arteriogênico do VEGF165 em um modelo de mamífero com cardiopatia
isquêmica, encorajando seu uso como promotor de crescimento arteriolar em pacientes com
doença coronariana grave69
. Não está claro o método mais adequado para avaliar os efeitos na
perfusão tecidual. A angiografia simples não é capaz de detectar mudanças em nível
microvascular, mas a ecocardiografia miocárdica contrastada, em conjunto com microesferas
radiomarcadas, foi utilizada com sucesso para avaliar os benefícios da terapia com VEGF12170
.
Para a proteção de miocárdio isquêmico, é conhecida a função angiogênica através de
fatores pró-angiogênicos como VEGF, FGF e HGF, os quais podem ser usados para o tratamento
da isquemia71
. Atualmente salienta-se também o uso de enzimas antioxidantes que inibem a
ativação de células endoteliais tanto para tratamento de infarto agudo do miocárdio como para
imunossupressão no transplante cardíaco, além de transferência de genes anticoagulantes visando
à estabilização da placa de ateroma. Esses tratamentos são apresentados como forma de
19
prevenção de eventos agudos, visto que seu tempo de ação ultrapassa o tempo previsto para a
intervenção durante o evento clínico.
Em um estudo piloto de terapia gênica em pacientes com DAC, Yang et al.72
relataram a
crescente evidência dos efeitos benéficos do HGF no infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca
e doença arterial obstrutiva periférica. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da
administração intracoronariana de um vetor de adenovirus que codifica o gene HGF humano (Ad-
HGF) sobre os níveis séricos de citocinas e mobilização de células CD34 (+) e CD117 (+) em
pacientes com doença cardíaca. Diante dos achados, concluiu-se que a terapia gênica com HGF
pode desempenhar um papel importante na regulação das citocinas inflamatórias e indução da
mobilização de CPE em pacientes com DAC.
Por outro lado, na terapia gênica de resgate do miocárdio, a manipulação de proteínas
reguladoras do cálcio e de receptores beta-adrenérgicos sinalizam melhora na contratilidade
miocárdica73
.
Atualmente, estuda-se a associação de terapia gênica e terapia celular frente a diferentes
patologias cardíacas. Um exemplo recente é o estudo de Matsumoto et al.74
, que avaliaram a
expressão de VEGF após transplante de células tronco mesenquimais (MSC) e verificaram o
possível aumento de efeitos cardioprotetores destas células seguido da angiogênese, na
recuperação do miocárdio isquêmico. Diante disso, demonstra-se a possibilidade da análise cada
vez mais apurada da expressão de biomarcadores diante de tais terapias75
.
4. TERAPIA GÊNICA COM VEGF165
Com o intuito de induzir a angiogênese miocárdica, a terapia gênica utilizando o VEGF
poderia representar uma nova modalidade de tratamento para a DAC. Isso se deve à possibilidade
de desenvolver novos vasos arteriais ou promover a reformação dos vasos existentes76
.
20
O VEGF165 contém 165 aminoácidos e funciona interagindo com receptores específicos
das células endoteliais, iniciando a cascata de eventos que culmina com a migração de células
endoteliais, proliferação e agregação em microtúbulos que acabarão por formar uma rede de
sistemas arteriais e venosos. Transferência de genes representa uma maneira de transportá-los
para o coração, onde o DNA codificador de VEGF é liberado na célula miocárdica, a qual
começa secretar VEGF. Nos ensaios realizados até o momento, não existem dados concretos
sobre a dose adequada e segura de fator angiogênico a ser administrada. Na maior parte dos
estudos com VEGF165, a dose variou entre 125 - 500 μg.
A disponibilidade de vetores com tropismo pelo miocárdio, capazes de uma expressão
protéica longa e estável, e o isolamento de células progenitoras com potencial angiogênico e
regenerativo oferece possibilidades de desenvolvimento de terapia baseada em proteção e
regeneração do miocárdio isquêmico e insuficiente. A terapia gênica em doenças
cardiovasculares não visa a substituir um gene anormal, mas supra-regular a expressão de uma
proteína útil aumentando o conteúdo de DNA. Sua efetividade depende do gene, do vetor e da
forma de administração utilizados77
.
Vetores genéticos são todas as moléculas de DNA com potencial de replicação
autonômica dentro da célula hospedeira, na qual seqüências de DNA podem ser inseridas e
ampliadas. A origem do vetor permite classificar em plasmidiais, bacteriófagos ou virais78
. Eles
são utilizados para transportar genes para células receptoras. Possuem não apenas marcadores
para facilitar seu reconhecimento, como também seqüências replicadoras. Em modelos animais, o
uso de plasmídeos demonstrou uma expressão duradoura após vários meses, apesar de baixa taxa
de transfecção efetiva79
. A aplicação de adenovírus apresenta taxas de transfecção, durando de
dias a semanas, com contraditória curta expressão gênica. Ademais, anticorpos circulantes,
21
freqüentemente encontrados na população adulta, podem reduzir a taxa de transfecção efetiva de
0,04% até 5,0% de células positivas em análise histológica80
.
Além disso, o uso de vetores virais requerem cuidados de biossegurança, medidas
desnecessárias com vetores não-virais. Estudos apontam eventos temporários relacionados com
utilização de adenovírus, tais como febre, ou elevação sérica de proteína C reativa, das enzimas
hepáticas e da titulação de anticorpos81
. Hao et al.82
, publicaram em 2007 um estudo
experimental sobre angiogênese miocárdica por VEGF165 comparando vetores adenovirais com
plasmidiais. Estes autores demonstraram benefícios equivalentes em termos de função ventricular
(p<0,05) para plasmídeos e adenovírus após quatro semanas, entretanto, neste trabalho a técnica
TUNEL, que detecta quebras do DNA que ocorrem durante o processo de apoptose, demonstrou
um aumento da freqüência de apoptose de cardiomiócitos no grupo adenovírus (p<0,02).
A terapia gênica sofreu um revés importante quando da ocorrência de um óbito em sujeito
de pesquisa, provavelmente devido à alta carga viral administrada, tendo havido cancelamento de
vários projetos clínicos e retorno à pesquisa laboratorial. Desde 2000, poucos projetos de
aplicação clínica foram desenvolvidos. Entretanto, nenhuma complicação de gravidade notável
foi observada nos projetos que não utilizaram vetores virais. As formas de administração por
lipossomas ou por DNA plasmidial desnudo não estão relacionadas à morbidade nos relatos
disponíveis na literatura82
.
A formação de novos vasos responde ao estímulo de fatores angiogênicos, os quais
regulam a migração endotelial, proliferação, sobrevida e atividade proteolítica. Entre os fatores
descritos na literatura, o VEGF e as angiopoietinas (Ang) têm emergido como reguladores
críticos do processo pró-angiogênico3,7,83
. Essas moléculas promovem a formação de novos vasos
e sua morfogênese, por meio de um complexo processo de eventos angiorregulatórios8,81
.
22
VEGF, membro da família do VEGF A, é um fator de crescimento específico do
endotélio9,10
. Ele age, principalmente, ativando dois receptores do tipo tirosina quinase Flt-1
(fms-like tyrosine kinase-1, VEGF receptor-1)11
e KDR (kinase-insert domain-containing
receptor, VEGF receptor-2)12
, mas também pode ativar outros receptores como neuropilin-1 e 281
.
VEGF165 tem sido intensamente pesquisado. Inicialmente administrado por injeção intramuscular
direta do DNA plasmidial, em doença arterial periférica de membros inferiores, demonstrou
produzir melhora da circulação colateral e da perfusão das extremidades84
. Mais recentemente foi
conduzido um estudo clínico para avaliar a segurança e a bioatividade da transfecção
intramiocárdica de DNA plasmidial em pacientes considerados “inoperáveis” por cardiopatia
isquêmica avançada. O gene foi injetado diretamente no miocárdio, por minitoracotomia
esquerda, em 20 pacientes, como única terapêutica. Não ocorreram complicações. Todos os 16
pacientes acompanhados até 90 dias apresentaram redução significativa da angina e 100% dos
que completaram 6 meses estavam livres de angina. A cintilografia miocárdica mostrou redução
dos defeitos isquêmicos em 13 de 17 pacientes aos 60 dias16,17,85
.
Em 1998, Losordo et al.18
conduziram o primeiro ensaio clínico testando terapia gênica
com VEGF165 em pacientes com angina refratária. Este estudo demonstrou as primeiras
evidências de segurança e dados observacionais sobre sintomas e perfusão miocárdica.
Em estudo subseqüente, Laitinen et al.86
, demonstraram um método menos invasivo de
administração VEGF165 plasmidial, via infusão intra-coronariana, sendo este método, seguro e
executável.
O estudo KAT81
(Kuopio Angiogenesis Trial), teve como objetivo avaliar a segurança da
terapia gênica com VEGF165 intracoronária, quando administrada ao tempo da angioplastia
coronariana com stent, avaliando o quanto a terapêutica com VEGF165 pode prevenir a reestenose
e melhorar a perfusão miocárdica. Foram randomizados 103 pacientes sintomáticos que iriam
23
realizar angioplastia coronariana para receber infusões intracoronárias de VEGF165 adenoviral,
VEGF165 plasmidial ou placebo, no momento da angioplastia. Concluíram que a terapia com
VEGF165 durante angioplastia parece segura, mas os investigadores não encontraram diferenças
na taxa de reestenose 6 meses após o tratamento. Em relação à perfusão miocárdica, entretanto,
houve aumento em 6 meses de acompanhamento nos pacientes submetidos a administração de
VEGF165 adenoviral81
.
O Euroinject One Trial7 foi um estudo randomizado, duplo-cego, placebo-controlado em
pacientes com DAC sintomática, que não eram candidatos a revascularização cirúrgica. Oitenta
pacientes foram eleitos para receber injeção de VEGF165 plasmidial ou plasmídeo placebo na área
miocárdica isquêmica identificada por mapeamento eletromecânico (MEM) e SPECT. O
plasmídeo foi administrado por injeção via endocárdica utilizando-se o sistema NOGA. Após 3
meses de acompanhamento, a perfusão miocárdica avaliada em estresse e a classe de angina
(CCS) não foram diferentes entre os dois grupos, mas escores de movimentação regional da
parede miocárdica e a função ventricular esquerda melhoraram no grupo tratado com VEGF1657.
Ao final do estudo, uma análise utilizando um método alternativo de interpretação do escore de
movimentação regional da parede miocárdica e da perfusão miocárdica revelou alguma evidência
de melhora nos pacientes tratados com VEGF16587
.
Ripa et al.83
realizaram um estudo piloto com o uso combinado de terapia gênica com
VEGF165 e mobilização de células tronco em pacientes com DAC, sendo estes, sintomáticos e
não candidatos à revascularização. Dezesseis pacientes receberam injeções intramiocárdica de
VEGF165 plasmidial seguido da administração, uma semana após, do fator de estimulação de
colônias de granulócitos (G-CSF) visando à mobilização de células progenitoras da medula óssea
no grupo tratado. O grupo controle foram os 16 pacientes tratados com VEGF165 e os 16 tratados
com plasmídeo placebo do estudo Euroinject One Trial. O número de células progenitoras
24
(identificadas via CD34) aumentou consideravelmente após o tratamento com G-CSF, mas não
houve melhora nos desfechos primários de mudança na perfusão miocárdica de estresse83
.
Recentemente, relato de Reilly apresentou resultados de terapia gênica com VEGF em
pacientes sem outras opções terapêuticas. Foram 30 pacientes com angina classe III ou IV que
receberam injeção intramiocárdica via toracotomia de VEGF2. Esses pacientes foram seguidos
para eventos clínicos depois de um ano por registros hospitalares, visitas ou contato telefônico.
Um paciente teve óbito perioperatório. A média de seguimento foi de 751±102,5 dias. Houve 4
óbitos (13,8%), 5 infartos do miocárdio (17,2%) e 7 procedimentos de revascularização (24,1%).
Também houve 15 hospitalizações em 12 pacientes. No fim do seguimento nenhum paciente se
encontrava em classe IV de angina, 3 pacientes (11,5%) estavam em classe III e 23 pacientes
(88,5%) estavam em classe I ou II. Esse estudo permitiu associar a terapia gênica com VEGF2
com a melhora dos sintomas de angina na maioria dos pacientes após o primeiro ano de
tratamento. Eventos clínicos maiores como óbito, infarto do miocárdio e novos procedimentos de
revascularização foram incomuns durante o primeiro ano, mas tornaram-se mais frequentes após
esse período. A maioria desses eventos em longo prazo seriam resultado da progressão da doença
de base em áreas cardíacas afastadas dos locais de infusão de terapia gênica88
.
Em abril de 2008, Marc Ruel publicou um estudo realizado na Universidade de Otawa, no
Canadá, onde investigou a associação entre VEGF165 e L-arginina. Participaram do estudo 19
pacientes cardiopatas isquêmicos graves que foram randomizados da seguinte forma: grupo 1:
Placebo para injeção intramiocárdica de VEGF165 + placebo para suplementação pós-operatória
de L-arginina; grupo 2: Injeção intramiocárdica de VEGF165 + placebo para suplementação pós-
operatória de L-arginina; grupo 3: Placebo para injeção intramiocárdica de VEGF165 +
suplementação pós-operatória de L-arginina e grupo 4: Injeção intramiocárdica de VEGF165 +
suplementação pós-operatória de L-arginina. A suplementação com L-arginina foi realizada via
25
oral por três meses. Foram avaliadas mudanças na perfusão e contratilidade miocárdica anterior
através de tomografia por emissão de pósitrons (PET scan) e ecocardiografia. Pacientes que
receberam a combinação de VEGF e L-arginina demonstraram melhora na perfusão da parede
anterior observada no PET scan (p=0,02) e melhora da contratilidade da parede anterior (p=0,02)
em três meses quando comparados ao começo do estudo. Os resultados sugerem segurança e
eficácia na intervenção. De fato, foi demonstrado que a L-arginina é clinicamente segura e tem
efeitos benéficos sobre o NO19
.
Em estudo multicêntrico recente (Northern Trial), Stewart e cols (2009)20
, realizaram um
estudo duplo-cego, controlado por placebo. Este envolveu sete centros do Canadá e um total de
93 pacientes com CCS 3 ou 4, os quais foram randomizados para receber 2.000 g de VEGF165
plasmidial ou placebo por via endocárdica sob orientação do cateter eletroanatômico NOGA. Não
houve diferença entre o grupo tratado com VEGF e placebo em relação à perfusão miocárdica no
período basal, 3 e 6 meses, avaliados por SPECT. Observou-se redução significativa da área
isquêmica observada em ambos os grupos. Melhoras no tempo do teste ergométrico e sintomas
anginosos foram observados em ambos os grupos em 3 e 6 meses, não havendo diferença entre os
grupos20
.
A eficácia da angiogênese terapêutica por injeção intramiocárdica de pCK-VEGF165 em
modelo suíno de infarto agudo do miocárdio foi relatada por Choi e colaboradores em 200689
.
Aos 30 dias após o infarto e injeção de pCK-VEGF165 na sua zona de transição, não houve
diferença nos parâmetros de perfusão segmentar, espessamento parietal e contratilidade entre os
grupos controle e tratado. Aos 60 dias, entretanto, o grupo tratado mostrou melhora significativa,
tanto em relação ao 30º dia (p<0,05) nos parâmetros citados, como em relação ao grupo controle
para perfusão segmentar (p=0,018), contratilidade (p=0,004) e espessura (p=0,068). A análise
26
histológica mostrou aumento significativo na microvasculatura do grupo tratado em relação ao
controle (p<0,001)89
.
Evidencia-se desse modo a aplicabilidade clínica do VEGF165 em humanos, visto que
estudos experimentais mostram resultados favoráveis e estudos iniciais em humanos não relatam
efeitos adversos relacionados. Ensaios atuais relatam que o uso de altas doses de rhVEGF,
quando comparado com baixas doses e com placebo, melhora a perfusão miocárdica em
pacientes com angina estável severa e fornece evidências de um efeito positivo dose-
dependente90, 91
. Também como alternativa a pacientes sem outras possibilidades terapêuticas foi
desenvolvido o estudo The VIVA Trial, designado a avaliar a segurança e eficácia da infusão
intracoronariana e intravenosa de rhVEGF (recombinante humano de fator de crescimento
endotelial vascular). Assim, 178 pacientes foram randomizados para receberem placebo, baixa
dose de rhVEGF ou alta dose de rhVEGF por infusão intracoronariana no dia 0, seguido por
infusão intravenosa nos dias 3, 6 e 9. Teste ergométrico em esteira e avaliações da classe de
angina e da qualidade de vida foram realizados no início dos procedimentos, dia 60 e dia 120.
Imagens de perfusão miocárdica foram obtidas no início dos procedimentos e no dia 60. Esse
estudo mostrou que rhVEGF é seguro e bem tolerado. Nas mensurações feitas no dia 60, rhVEGF
não ofereceu melhora além do placebo em nenhum dos testes. Porém no dia 120, altas doses de
rhVEGF resultaram em significativa melhora na angina dos pacientes e tendência favorável no
tempo de teste de esteira ergométrica e na freqüência de episódios de angina90
.
Quanto à via de injeção do VEGF, não se pode ainda estabelecer qual o método mais
adequado. Foi demonstrada segurança e melhora na perfusão miocárdica em pacientes tratados
com VEGF – adenovírus injetado por cateter durante ACTP após 6 meses de seguimento81
. Por
outro lado, a injeção intramiocárdica apresentou melhora na contratilidade da parede ventricular
tanto na avaliação pelo método NOGA, quanto pela ventriculografia – podendo indicar um
27
provável efeito anti-isquemia, mesmo sem apresentar evidência de melhora na perfusão
miocárdica induzida por estresse7.
Na pesquisa experimental há sugestões de outros papéis para o VEGF. Foi descoberto
efeito mitogênico em cardiomiócitos adultos, induzido por terapia gênica com VEGF. Estudo
posterior pesquisou hiperplasia de cardiomiócitos induzida pelo VEGF através de citocinese de
cardiomiócitos. Cinco semanas após indução de isquemia e injeção intramiocárdica de VEGF, o
grupo tratado apresentou 22% mais cardiomiócitos por unidade de volume além de um número
significativamente maior de cardiomiócitos oligonucleados (1 ou 2 núcleos) quando comparado
com o grupo controle. Desse modo, a transferência gênica de VEGF induziu citocinese de
cardiomiócitos em porcos com miocardiopatia isquêmica crônica, como revelado pela hiperplasia
de cardiomiócitos. Esse estudo confirma o já reportado efeito mitogênico de VEGF em
cardiomiócitos adultos e dá suporte à hipótese que o VEGF pode ter um papel terapêutico em
doenças caracterizadas por perda de células miocárdicas92
.
Quanto à angiogênese por terapia celular, estudo experimental de Huang et al.93
investigou a ação das célula-tronco mesenquimais (MSCs) do miométrio e a contribuição da
progesterona sobre a indução à angiogênese e a melhora da perfusão em miocárdio isquêmico.
Constatou-se a significativa capacidade de indução de angiogênese, principalmente nos vasos
arteriolares e melhora da função cardíaca após tratamento.
É de suma importância relatar as limitações dos modelos pré-clínicos e as diferenças entre
os modelos animais e os pacientes incluídos em ensaios clínicos de terapêutica cardiovascular. Os
animais utilizados em estudos pré-clínicos são geralmente jovens e saudáveis, enquanto os
pacientes são tipicamente idosos com múltiplas comorbidades. Estudos clínicos e
epidemiológicos indicam que a idade é um forte preditor de doença avançada94, 95
da mesma
forma, animais com idade têm menos probabilidade de se recuperar de doenças vasculares e
28
isquêmicas96
. Esse comprometimento parece evoluir, pelo menos em parte, quanto as deficiências
no recrutamento de células angiogênicas e quanto à expressão do fator de crescimento97, 98
.
A eficácia da terapia gênica pode ser prejudicada pela espécie, idade e em relação as
diferentes condições de saúde entre os modelos animais e populações clínicas, mas também por
diferenças biológicas na expressão genética. Além disso, a incapacidade para quantificar
precisamente a expressão do gene prejudica o projeto experimental48
.
Os estudos realizados até o momento não apresentavam o número de pacientes necessário
para quantificar o potencial benefício da terapia gênica, com parâmetros inequívocos como a
mortalidade ou o salvamento do membro, no caso de isquemia periférica. Em vez disso, os
pesquisadores têm procurado identificar outros parâmetros e desfechos que podem fornecer
evidências objetivas da bioatividade e melhora clínica48
.
4.1. Vetor Plasmidial
Transferência gênica para o miocárdio tem sido utilizada como estratégia alternativa para
se obter uma expressão local sustentada das proteínas angiogênicas99
.
Vetores comuns para transporte incluem plasmídeos carreadores de cDNA “nu” e vetores
virais como adenovírus, lentivírus e retrovírus. Vantagens e desvantagens em relação ao vetor
empregado incluem o tamanho do gene inserido, o sítio de incorporação no núcleo, a duração da
expressão, a eficiência da transferência e o grau de resposta imune do organismo100
. O vetor
plasmidial é expresso por apenas alguns dias após administração e o vetor viral apresenta
expressão do gene por algumas semanas101
. Assim, os estudos clínicos que tentam tratar a fase
final da doença isquêmica através da terapia gênica podem ser limitados por duração inadequada
da exposição ao agente angiogênico48
.
29
O vetor ideal seria aquele que combinaria baixa imunogenicidade e um perfil de
segurança satisfatório, com alta eficiência de transfecção e expressão do transgene para períodos
de tempo específicos48
.
Vetores plasmidiais não têm limite de tamanho de gene a ser inserido e induzem mínima
resposta imune, o que resulta em expressão transgênica sustentada. A desvantagem é a baixa taxa
de transferência do gene codificador do fator angiogênico. Em contraste, vetores virais têm alta
eficiência na transferência dos genes de fator angiogênico para as células alvo, mas podem
induzir significativa resposta imune do organismo hospedeiro, o qual limita a expressão
transgênica sustentada102
.
A transferência de VEGF165 plasmidial tem se mostrado segura, segundo a literatura. Em
séries de terapia gênica, como já citado anteriormente, a única morte acontecida foi reportada
num paciente de 18 anos em setembro de 1999. Neste caso, o óbito foi devido a um processo
inflamatório contra o vetor usado (vetor viral baseado em adenovírus, em doses altas). O paciente
era portador de um distúrbio metabólico, de origem genética, denominada deficiência de ornitina
transcarbamilase (OTC), que tem como principal conseqüência a não eliminação de amônia e foi
convidado pelo seu pediatra para participar de um projeto de pesquisa fase I, envolvendo terapia
gênica para este distúrbio, no Institute for Human Gene Therapy (IHGT) da Universidade da
Pennsylvania/EUA, em conjunto com a empresa Genovo. Foi administrada uma infusão, na
artéria hepática, do gene de correção da OTC, utilizando vetor adenoviral. Ele teve uma séria
reação imunológica atribuída ao vetor e faleceu quatro dias após, quando foi constatada sua morte
encefálica, sendo o primeiro paciente a morrer em um ensaio clínico de terapia gênica103
.
Já outra paciente tratada com uma dose similar (a dose mais alta do tratamento) não
apresentou efeitos colaterais. Uma das explicações desta resposta imunológica foi que,
provavelmente, o paciente tinha sido infectado anteriormente com um adenovírus do mesmo
30
sorotipo ou algum outro que apresentou reação cruzada. Casos de leucemia desenvolvida em 2 de
10 pacientes com a doença SCID-XI na França, também aconteceram em procedimentos de
terapia gênica com vetores virais.
O plasmídeo pode ser aplicado na sua forma mais pura, diluído em solução fisiológica e,
por este motivo, a metodologia é conhecida como DNA desnudo, já que ele não está coberto por
nenhum material, sejam estes materiais compostos catiônicos ou as estruturas virais dos vetores
virais104
. Por outro lado, este plasmídeo atua na forma epissomal, ou seja, ele não se integra no
genoma. Este é um ponto importante, pois os problemas relacionados com a ativação de proto-
oncogenes durante a integração são mínimos. Ao mesmo tempo, a sua não-integração permite
que a expressão do transgene (proteína VEGF165) seja transitória devido a sua degradação e/ou
diluição ao longo do tempo. Vários estudos utilizando plasmídeos epissomais mostraram que a
expressão do transgene é mantida entre 1 e 2 meses, o que representa uma vantagem deste
sistema no tratamento com VEGF78
.
4.2. Vias de Administração
A efetividade da terapia gênica depende dos genes, dos vetores e da forma de
administração. Na terapêutica cardiovascular, as formas possíveis são: injeção por cateter
intraventricular, injeção pericárdica, via epicárdica, injeção intramiocárdica, intra-arterial
coronariana associada ou não a angioplastia e adventicial em vasos ou enxertos de veia safena.
Na indução de angiogênese miocárdica, as vias mais utilizadas têm sido a epicárdica por
lipossomas e a intramiocárdica78
. Há precauções em relação à injeção intra-arterial, pela
possibilidade de difusão dos vetores na corrente sangüínea, embora haja estudos, tanto isolados
31
como multicêntricos, com administração intracoronária e intravenosa de FGF e VEGF, utilizando
proteína recombinante e vetores adenovirais.
Estudos anteriores sobre terapia gênica sugerem que a administração intracoronária e
periférica entregam de forma inadequada quantidades do vetor para o sítio de destino105, 106
. Já a
injeção intramuscular oferece a possibilidade de uma oferta mais eficiente em áreas focais de
músculo isquêmico48
.
4.3. População, Segurança, Benefícios e Potenciais Riscos do Uso da Terapia Gênica
Quase todos os ensaios clínicos de terapia gênica têm como população de estudo
pacientes em fase terminal da doença isquêmica, cujas opções terapêuticas convencionais já se
esgotaram, uma vez que o possível maior risco em relação ao benefício associado aos novos
tratamentos são mais aceitáveis. Entretanto, os pacientes com doença cardiovascular avançada,
muitas vezes têm sofrido décadas de deterioração sistêmica, onde a terapia pode não conduzir a
uma melhoria mensurável, mesmo quando o tratamento é benéfico48, 107
.
Mais de 1.000 pacientes foram incluídos em ensaios clínicos controlados de terapia
gênica, abrangendo mais de uma década e até agora, com exceção dos casos relatados
anteriormente e que tem explicações específicas, nenhum sinal de segurança adversa foi
detectado. Relatórios de retinopatia, câncer, ou outras doenças que podem ser impulsionadas pelo
crescimento vascular foram percebidos como igualmente distribuídos em grupos tratado e
placebo. Conclusões mais definitivas sobre riscos e complicações exigirão maiores tempo de
acompanhamento e número de pacientes submetidos à terapia48
.
Quinze anos se passaram desde os primeiros relatos de terapia gênica em humanos. O
amplo número de estudos pré-clínicos demonstram a bioatividade dos genes transplantados e
32
vários ensaios clínicos indicam que a terapia é segura, viável, e potencialmente eficaz, embora
não tenham produzido evidências conclusivas de benefício. Assim, para continuar a desenvolver
esta abordagem terapêutica promissora, devemos avaliar criticamente os resultados experimentais
e os protocolos para identificar fatores que podem ter prejudicado a eficácia da terapia ou dados
confundidores de interpretação48
.
A terapia gênica pode resultar na desregulação da expressão da proteína inoculada e a
expressão contínua do VEGF tem sido associada com a formação de tumores vasculares
intramurais e na diminuição da sobrevida em modelos animais108
. Com o avanço da engenharia
genética e o maior conhecimento das técnicas de purificação, espera-se que tais complicações
sejam controladas108
. Existem questionamentos em relação à segurança da transferência de
fatores angiogênicos, e também em relação ao tempo de expressão109
, onde se sabe que os
plasmídeos carreadores de proteínas de fatores angiogênicos, por terem expressão mais curta e
não se incorporarem ao DNA da célula à qual vão se ligar, têm menor risco deste efeito adverso.
A gênese, crescimento e manutenção da neovascularização ocorrem através de interações
complexas e entre mecanismos envolvidos na vasculogênese, angiogênese e arteriogenêse110,111
.
As direções futuras da terapia gênica apontam prováveis combinações de fatores angiogênicos,
ou fatores individuais (HIF-1α) que ativam diversas vias de neovascularização. As combinações
de terapia celular e de fatores angiogênicos, bem como o uso de biomateriais para melhorar o
microambiente são outras estratégias promissoras para o reparo isquêmico tecidual48
.
5. ENSAIOS CLÍNICOS CONTROLADOS DE TERAPIA GÊNICA
Na tabela abaixo, procuramos sintetizar a experiência existente, nesta relação de ensaios
clínicos controlados envolvendo terapia gênica visando à terapêutica cardiovascular.
33
Autor Tratamento Administração Grupo ativo
(n)/
Placebo (n)
Características
pacientes
Acompa-
nhamento
Desfechos Resultados
Phase I/II
VEGF
Losordo
et al10
Ensaio Clínico
Controlado
VEGF2
plasmidial
Intramiocárdica
percutânea via
mapeamento
eletromecânico
12/7 Doença arterial
coronariana, não
passíveis de
revascularização,
angina refratária, CCS
(3/4)
12 semanas Mudança da CCS
e tolerância ao
exercício
Melhora da
CCS - grupo
VEGF2 versus
placebo (-1.3
versus -0.1,
P=0.04);
tolerância ao
exercício (91.8
versus 3.9
segundos)
Mäkinen
et al84
Ensaio Clínico
Controlado
VEGF165
adenoviral e
plasmidial
Percutânea intra-
arterial seguida de
angioplastia
VEGF-ad (18)
VEGF- P (17)
Placebo (19)
Doença arterial
periférica adequada
para angioplastia
3 meses Angiografia
digital
Angiografia
digital revelou
aumento da
vascularização
distalmente do
local de
tranferência de
genes no
grupo VEGF-
P e na região
isquêmica no
grupo VEGF-
ad (VEGF-ad
P=0.03;
VEGF-P
P=0.02)
RAVE
Rajagopalan
et al112
Ensaio Clínico
Controlado
VEGF121
adenoviral
Intramuscular Alta dose (40)
Baixa Dose (32)
Placebo (33)
Doença arterial
periférica, limitação ao
exercício, claudicação
12 semanas Mudança do pico
e do tempo de
andar em relação
à linha de base
A mudança do
pico e do
tempo de
andar não
diferiram entre
os grupos alta
dose (1.5+/-
3.1 minutos),
baixa dose
(1.6+/-1.9
minutos) e
placebo
34
(1.8+/-3.2
minutos)
KAT
Hedman
et al81
Ensaio Clínico
Controlado
VEGF165
adenoviral e
plasmidial
Intracoronária após
intervenção
coronária
percutânea
VEGF-ad (37)
VEGF-P (28)
Placebo (38)
Doença arterial
coronariana, CCS (2/3),
intervenção coronária
percutânea
6 meses % de estenose do
diâmetro luminal
mínimo pela
angiografia
coronária
Taxa de
reestenose
clínica: 6%;
diâmetro
mínimo e o
percentual de
estenose não
diferiram entre
os grupos;
perfusão
miocárdica
mostrou uma
melhora
significativa
no grupo
VEGF-ad
Euroinject
One
Kastrup
et al7
Ensaio Clínico
Controlado
VEGF165
plasmidial
Intramiocárdica
percutânea via
mapeamento
eletromecânico
40 / 40 Doença arterial
coronariana, não
passíveis de
revascularização,
angina refratária, CCS
(3/4)
3 meses Perfusão
miocárdica,
mapeamento do
movimento da
parede por
NOGA,
ventriculografia
esquerda e CCS
Perfusão
miocárdica
não diferiu
entre o grupo
VEGF 165 e
placebo (38
+/- 3%; 44 +/-
2%); movi-
mento da
parede por
NOGA
(P=0.04) e
ventriculogra-
fia esquerda
(P=0.03)
melhoraram
em relação ao
placebo;
melhora da
CCS, mas sem
diferença entre
os grupos
REVASC VEGF121 Intramiocárdica 32 / 35 Doença arterial 26 semanas Tempo no teste Tempo no
35
Stewart
et al13
Ensaio Clínico
Controlado
adenoviral via mini-
toracotomia
coronariana, não
passíveis de
revascularização,
angina refratária, CCS
(2/4)
ergométrico e
depressão do
segmento S-T em
1mm de diâmetro
teste
ergométrico e
depressão do
segmento S-T
em 1mm de
diâmetrofoi
significativa-
mente maior
no grupo
VEGF 121-ad
(P=0.026);
CCS melhorou
no grupo
VEGF 121-ad
(P<ou =0.001)
Ripa et al83
Ensaio Clínico
Controlado
VEGF165
plasmidial e
G-CSF
Intramiocárdica
percutânea de
VEGF165 usando
mapeamento
eletromecânico e
injeção subcutânea
de
G-CSF
VEGF165+G-
CSF (16)
VEGF165 (16)
Placebo (16)
Doença arterial
coronariana, não
passíveis de
revascularização,
angina refratária, CCS
(3/4)
3 meses Mudança dos
defeitos de
perfusão, avaliado
por SPECT
Não houve
melhora da
perfusão
miocárdica em
ambos os
grupos
tratados e
sintomas
clínicos não
foram
alterados
Kusumanto
et al113
Ensaio Clínico
Controlado
VEGF165
plasmidial
Intramuscular 27 / 27 Doença arterial
periférica, diabetes
mellitus, isquemia
crítica do membro, não
passíveis de
revascularização
100 dias Amputações 6 amputações
grupo placebo
versus 3
amputações
grupo VEGF
165 plasmidial,
melhora
hemodinâmi-
ca, das úlceras
e diminuição
da dor foram
maiores no
grupo VEGF
165 plasmidial
36
FGF
AGENT
Grines
et al114
Ensaio Clínico
Controlado
Ad5-FGF4 Intracoronária 60 / 19 Doença arterial
coronariana, CCS (2/3)
12 semanas Segurança e
tempo do teste
ergométrico
Administração
única de Ad5-
FGF4
mostrou-se
segura e bem
tolerada;
grupo Ad5-
FGF4
apresentou
melhora no
tempo do teste
ergométrico
em análise de
subgrupo (1.6
versus 0.6
minutos,
P=0.01, n=50)
AGENT-2
Grines
et al115
Ensaio Clínico
Controlado
Ad5-FGF4 Intracoronária 35 / 17 Doença arterial
coronariana, não
passíveis de
revascularização,
angina refratária, CCS
(2/4)
12 meses Mudança dos
defeitos de
perfusão, avaliado
por SPECT
adenosina em 8
semanas
Ad5-FGF4
resultou em
uma
significativa
redução da
isquemia
(4,2%
absoluta, 21%
relativa;
P < 0,001),
enquanto
placebo não
apresentou
melhora (P =
0,32).
Talisman
201
Nikol et al116
Ensaio Clínico
Controlado
FGF-1
plasmidial
Intramuscular 51 / 56 Doença arterial
periférica, isquemia
crítica do membro, não
passíveis de
revascularização
1 ano Cicatrização da
úlcera isquêmica
Melhorias na
cicatrização da
úlcera foram
semelhantes
para uso de
FGF-1
plasmidial
(19,6%) e
37
placebo
(14,3%, P =
0,514); o
grupo FGF-1
obteve
redução do
risco de
amputação
(HR= 0,498; P
= 0,015) e
amputações
maiores (HR=
0,371; P =
0,015)
HIF
Rajagopalan
et al54
Ensaio Clínico
Controlado
Ad2/HIF-
1α/VP16
Intramuscular 34 / 7 Doença arterial
periférica, isquemia
crítica do membro, não
passíveis de
revascularização
1 ano Segurança Os pacientes
HIF-1α
apresentaram
resolução
completa da
dor em
repouso nos
membros (14
de 32) e
cicatrização da
úlcera (5 de
18)
Del-1
DELTA-1
Grossman
et al117
Ensaio Clínico
Controlado
Del-1
plasmidial
Intramuscular 52 / 53 Doença arterial
periférica, pico do
tempo de caminhada de
1–10 em teste
ergométrico
180 dias Pico do tempo de
caminhada em 90
dias
Aumento do
tempo de
início da
claudicação na
caminhada em
30, 90 e 180
dias em ambos
os grupos, sem
diferença
significativa
HGF
HGF-Stat
Powell
et al118
HGF
plasmidial
Intramuscular Alta dose (27)
Média dose (25)
Baixa dose (26)
Placebo (26)
Doença arterial
periférica, isquemia
crítica do membro, não
passíveis de
revascularização e
12 meses Mudança na
TcPo2 em 6 meses
TcPo2
aumentou em
6 meses no
grupo alta
dose (24.0+/-
38
Ensaio Clínico
Controlado
tensão de oxigênio
transcutâneo (TcPO2) <
40 mm Hg
ou pressão do dedo do
pé < 50 mm Hg ou
pressão do tornozelo
< 70 mm Hg
4.2 mmHg)
comparando
ao placebo
(9.4+/-4.2
mmHg), ao
grupo baixa
dose (11.1+/-
3.7 mmHg) e
ao grupo
média dose
(7.3+/-4.8
mmHg)
Phase III
FGF
AGENT-3
AGENT-4
Henry
et al119
Ensaio Clínico
Controlado
Ad5-FGF4 Intracoronária Alta dose (175)
Baixa dose
(180)
Placebo (177)
Doença arterial
coronariana, angina
refratária, CCS (2/4)
AGENT 3: sem
necessidade imediata de
revascularização
AGENT 4: não
passíveis de
revascularização
12 meses Mudança no
tempo do teste
ergométrico em
12 semanas
Significativo
efeito benéfico
do gênero, as
mulheres
apresentaram
melhora no
tempo do teste
ergométrico e
melhora
quanto à CCS
6. NOSSA EXPERIÊNCIA COM TERAPIA GÊNICA
Em nosso centro (Instituto de Cardiologia do RS/FUC) desenvolvemos experimentos em
modelo canino de infarto do miocárdio nas fases aguda e crônica, na tentativa de acompanhar os
processos de terapia gênica. Primeiramente testamos a transfecção do gene responsável pela
produção da proteína verde fluorescente (GFP) em um modelo canino, demonstrando a efetiva
produção da proteína verde fluorescente na área tratada e, portanto, a eficácia do processo de
transfecção gênica desse modelo120
.
39
Posteriormente, utilizando um modelo canino de cardiopatia isquêmica com controle
cintilográfico121
, verificamos a indução de angiogênese miocárdica pela injeção transmural de
plasmídeo VEGF165 (Genentech/ USA) em zonas do infarto agudo do miocárdio (IAM). Nesse
modelo, IAM era provocado por ligadura coronariana, seguido da injeção imediata
intramiocárdica de plasmídeo contendo VEGF165 no grupo tratado e de solução salina no grupo
controle. Cintilograficamente, não foram percebidas diferenças da perfusão miocárdica entre os
grupos controle e tratado, tanto no estudo imediato como no de 15 dias após IAM, sendo que os
dois grupos mostraram uma recuperação de 70 a 90 % da hipoperfusão demonstrada no primeiro
exame. No experimento com infarto do miocárdio em fase aguda, a injeção de VEGF165 resultou
em importante aumento no número total de vasos nos cães tratados. Este aumento se deveu quase
exclusivamente à formação de capilares e, em menor escala, de arteríolas. Quando examinadas as
diversas zonas do coração, foi encontrada maior proliferação de capilares nas zonas de transição
entre o infarto e o miocárdio normal. Por outro lado, foi interessante notar que, nestas mesmas
zonas de transição, o número de arteríolas foi menor do que nas zonas de miocárdio normal, não
tratado pela injeção de VEGF165 (Figuras 3 e 4)121
. Técnica semelhante foi utilizada por Kawasuji
e cols, porém com injeção intramiocárdica do fator básico de crescimento de fibroblastos
(bFGF)60
.
40
Figura 3 - Número de vasos por cm2: comparação entre o grupo controle e tratado, no infarto
agudo do miocárdio.
Figura 4 - Número de vasos por cm2: comparação entre a área de transição do infarto agudo do
miocárdio e de área normal da parede ventricular posterior do grupo tratado.
41
Em estudo seguinte, aplicamos a mesma técnica deste modelo experimental, porém em
fase crônica do infarto do miocárdio, quando foi feita injeção intramiocárdica de plasmídeo
contendo VEGF165 no sétimo dia após a indução de infarto. Esse grupo foi comparado com um
controle, no qual foi injetada solução salina. A função ventricular esquerda foi avaliada por
ecocardiogramas pré e pós-tratamento e foi realizada análise histológica para contagem de vasos.
Encontramos aumento significativo do número de capilares no grupo tratado, além de
estabilização da fração de ejeção ventricular do grupo tratado 14 dias após o tratamento com
VEGF165, em contraste com o grupo controle, no qual ocorreu diminuição significativa da fração
de ejeção ventricular esquerda (Figuras 5, 6, 7, 8)122
.
Figura 5 - Medida eletrônica de vasos em corte histológico
42
Figura 6 - FE pré e 14 dias após injeção de plasmídeo (grupo tratado) e de solução salina (grupo
controle). FE: fração de ejeção do ventrículo esquerdo.
Figura 7 - Número de capilares por cm2 de área analisada em ambos os grupos de infarto do
miocárdio em fase crônica.
43
Figura 8 - Número de arteríolas por cm2 de área analisada em ambos os grupos de infarto do
miocárdio em fase crônica.
Em continuidade a esta linha de pesquisa, foi realizado o ensaio clínico para testar o uso
exclusivo de terapia gênica em pacientes com angina refratária. O estudo proposto neste projeto
trata-se do primeiro ensaio clínico fase I/II realizado no Brasil investigando a terapia gênica com
VEGF165 para revascularização miocárdica, em relação à segurança e viabilidade da mesma em
pacientes cardiopatas isquêmicos inoperáveis pelos métodos convencionais.
Adicionalmente, este estudo proposto se caracteriza por utilizar um plasmídeo produzido
inteiramente em nosso país, desenvolvido em universidade brasileira e produzido por empresa de
biotecnologia essencialmente nacional, como está descrito em mais detalhes abaixo.
44
7. JUSTIFICATIVA
Apesar de mais de uma década da realização do primeiro ensaio clínico sobre terapia
gênica, os reais benefícios clínicos dessa terapêutica permanecem não totalmente esclarecidos.
Princípios e experiências anteriormente citados podem ser aplicadas à revascularização
miocárdica em pacientes sem opção por método convencional. Alguns fatores justificam a
utilização da angiogênese em doenças vasculares oclusivas. Apesar da isquemia advinda da
oclusão vascular aumentar a expressão de fatores de crescimento angiogênicos, o fato dos
pacientes se apresentarem com angina incapacitante indica que o processo natural compensatório
nem sempre é suficiente, indicando que a produção de citocinas é inadequada e/ou a resposta a
elas está diminuída.
Parece estar demonstrada experimentalmente a eficácia da terapia gênica com VEGF para
produção de angiogênese, melhora da perfusão miocárdica e preservação da função ventricular
esquerda. Por outro lado, as experiências clínicas em pequenas séries de casos e estudos
randomizados demonstram ser um método seguro, com baixa morbidade quando se utilizam
vetores plasmidiais. A eficácia clínica foi demonstrada em maior ou menor grau, nos diferentes
relatos, de acordo com o agente utilizado, as doses e as vias de administração. Há carência de
estudos randomizados controlados para verificar o efeito da terapia gênica nas diversas situações
clínicas decorrentes de cardiopatia isquêmica. Por esses motivos, justifica-se testar a segurança e
a eficácia de um método de indução de angiogênese terapêutica por DNA plasmidial desnudo
(VEGF165) através de injeção intramiocárdica, em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica
avançada que demonstrem refratariedade ao tratamento clínico e inviabilidade às técnicas
disponíveis de revascularização, percutâneas e cirúrgicas.
45
8. HIPÓTESE DE PESQUISA
A administração intramiocárdica, transtorácica de VEGF165 plasmidial em pacientes com
DAC avançada e angina refratária, não passíveis de revascularização percutânea e cirúrgica,
proporciona a formação de novos vasos, melhora a perfusão miocárdica em áreas isquêmicas, a
capacidade funcional e as classes de angina e de insuficiência cardíaca, refletindo na melhora da
qualidade de vida dos pacientes.
46
9. OBJETIVOS
9.1. Objetivo Geral
Avaliar os efeitos clínicos e sobre a perfusão miocárdica da administração
intramiocárdica, transtorácica de VEGF165 plasmidial em pacientes com DAC avançada e angina
refratária, não passíveis de revascularização percutânea e cirúrgica.
9.2. Objetivos Específicos
Nos pacientes descritos acima, avaliar os efeitos:
1. Sobre a perfusão miocárdica por meio de cintilografia.
2. Sobre a capacidade funcional por meio de teste ergométrico.
3. Clínicos por meio da análise da classe angina e insuficiência cardíaca e do questionário
de qualidade de vida de Minnesota.
47
10. REFERÊNCIAS
1. Kastrup J. Therapeutic angiogenesis in ischemic heart disease: Gene or recombinant vascular growth factor protein therapy? Current Gene Therapy2003;3(3):197-206.
2. Isner J. Myocardial gene therapy. Nature2002;415(6868):234-9. 3. Lewis B, Flugelman M, Weisz A, Keren-Tal I, Schaper W. Angiogenesis by gene therapy:
a new horizon for myocardial revascularization? Cardiovascular research1997;35(3):490. 4. Conway E, Collen D, Carmeliet P. Molecular mechanisms of blood vessel growth.
Cardiovascular research2001;49(3):507. 5. Klagsbrun M. The fibroblast growth factor family: structural and biological properties.
Progress in Growth Factor Research1989;1(4):207-35. 6. Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch S, Poltorak Z. Vascular endothelial growth factor
(VEGF) and its receptors. The FASEB Journal1999;13(1):9. 7. Kastrup J, Jørgensen E, Rück A, Tägil K, Glogar D, Ruzyllo W, et al. Direct
intramyocardial plasmid vascular endothelial growth factor-A165 gene therapy in patients with stable severe angina pectoris:: A randomized double-blind placebo-controlled study: The
Euroinject One trial. Journal of the American College of Cardiology2005;45(7):982-8. 8. Eppler S, Combs D, Henry T, Lopez J, Ellis S, Yi J, et al. A target-mediated model to
describe the pharmacokinetics and hemodynamic effects of recombinant human vascular endothelial growth factor in humans. Clinical Pharmacology & Therapeutics2002;72(1):20-32.
9. Simons M, Annex B, Laham R, Kleiman N, Henry T, Dauerman H, et al. Pharmacological treatment of coronary artery disease with recombinant fibroblast growth factor-
2: double-blind, randomized, controlled clinical trial. Circulation2002;105(7):788. 10. Losordo D, Vale P, Hendel R, Milliken C, Fortuin F, Cummings N, et al. Phase 1/2
placebo-controlled, double-blind, dose-escalating trial of myocardial vascular endothelial growth factor 2 gene transfer by catheter delivery in patients with chronic myocardial ischemia.
Circulation2002;105(17):2012-8. 11. Sylvén C, Sarkar N, Rück A, Drvota V. Myocardial Doppler tissue velocity improves
following myocardial gene therapy with VEGF-A165 plasmid in patients with inoperable angina pectoris. Coronary Artery Disease2001;12(3):239.
12. Rosengart T, Lee L, Patel S, Sanborn T, Parikh M, Bergman G, et al. Angiogenesis gene therapy: phase I assessment of direct intramyocardial administration of an adenovirus vector
expressing VEGF121 cDNA to individuals with clinically significant severe coronary artery disease. Circulation1999;100(5):468.
13. Stewart D, Hilton J, Arnold J, Gregoire J, Rivard A, Archer S, et al. Angiogenic gene therapy in patients with nonrevascularizable ischemic heart disease: a phase 2 randomized,
controlled trial of AdVEGF (121)(AdVEGF121) versus maximum medical treatment. Gene therapy2006;13(21):1503.
14. Bokeriya L, Golukhova E, Eremeeva M, Aslanidi I, Merzlyakov V, Georgiev G, et al. Use of Human VEGF 165 Gene for Therapeutic Angiogenesis in Coronary Patients: First Results.
Bulletin of Experimental Biology and Medicine2005;140(1):106-12. 15. Kolsut P, Ma ecki M, Zelazny P, Teresi ska A, Firek B, Janik P, et al. Gene therapy of
coronary artery disease with phvegf165--early outcome. Kardiologia Polska2004;59(11):373-84. 16. Vale P, Losordo D, Milliken C, Maysky M, Esakof D, Symes J, et al. Left ventricular
electromechanical mapping to assess efficacy of phVEGF165 gene transfer for therapeutic angiogenesis in chronic myocardial ischemia. Circulation2000;102(9):965.
48
17. Symes J, Losordo D, Vale P, Lathi K, Esakof D, Mayskiy M, et al. Gene therapy with
vascular endothelial growth factor for inoperable coronary artery disease. The Annals of thoracic surgery1999;68(3):830-6.
18. Losordo D, Vale P, Symes J, Dunnington C, Esakof D, Maysky M, et al. Gene therapy for myocardial angiogenesis: initial clinical results with direct myocardial injection of phVEGF165
as sole therapy for myocardial ischemia. Circulation1998;98(25):2800. 19. Ruel M, Beanlands R, Lortie M, Chan V, Camack N, dekemp R, et al. Concomitant
treatment with oral L-arginine improves the efficacy of surgical angiogenesis in patients with severe diffuse coronary artery disease: The Endothelial Modulation in Angiogenic Therapy
randomized controlled trial. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery2008;135(4):762.
20. Stewart D, Kutryk M, Fitchett D, Freeman M, Camack N, Su Y, et al. VEGF gene therapy fails to improve perfusion of ischemic myocardium in patients with advanced coronary disease:
results of the NORTHERN trial. Molecular Therapy2009;17(6):1109-15. 21. Heiss C, Amabile N, Lee A, Real W, Schick S, Lao D, et al. Brief Secondhand Smoke
Exposure Depresses Endothelial Progenitor Cells Activity and Endothelial Function:: Sustained Vascular Injury and Blunted Nitric Oxide Production. Journal of the American College of
Cardiology2008;51(18):1760-71. 22. Ministério da Saúde MdS. Análise dos dados de mortalidade de 2002. [Acesso em 2010
nov 30 Disponível em: http://portalsaudegovbr/portal/saude/visualizar_textocfm?idtxt=213772002.
23. Lotufo P. Mortalidade precoce por doenças do coração no Brasil. Comparação com outros países. Arquivos Brasileiros de Cardiologia1998;70(5):321-5.
24. Braunwald E. Myocardial oxygen consumption: the quest for its determinants and some clinical fallout. Journal of the American College of Cardiology2000;35:45-8.
25. Lloyd-Jones D, Hong Y, Labarthe D, Mozaffarian D, Appel L, Van Horn L, et al. American Heart Association Strategic Planning Task Force and Statistics Committee. Defining
and setting national goals for cardiovascular health promotion and disease reduction: the American Heart Association’s strategic Impact Goal through 2020 and beyond.
Circulation2010;121(4):586-613. 26. Jax T, Peters A, Khattab A, Heintzen M, Schoebel F. Percutaneous coronary
revascularization in patients with formerly" refractory angina pectoris in end-stage coronary artery disease" – Not" end-stage" after all. BMC Cardiovascular Disorders2009;9(1):42.
27. DeWood M, Leimgruber P, Shields J, Kunkel R, Hensley G, Reisig Jr A. Thrombosis in acute myocardial infarction and sudden death: angiographic aspects. Cardiovascular
clinics1987;18(1):195. 28. Falk E, Shah P, Fuster V. Coronary plaque disruption. Circulation1995;92(3):657.
29. Davies M, Thomas A. Plaque fissuring--the cause of acute myocardial infarction, sudden ischaemic death, and crescendo angina. British Heart Journal1985;53(4):363.
30. Falk E. Morphologic features of unstable atherothrombotic plaques underlying acute coronary syndromes* 1. The American Journal of Cardiology1989;63(10):114-20.
31. Burke A, Kolodgie F, Farb A, Weber D, Malcom G, Smialek J, et al. Healed plaque ruptures and sudden coronary death: evidence that subclinical rupture has a role in plaque
progression. Circulation2001;103(7):934. 32. Mann J, Davies M. Mechanisms of progression in native coronary artery disease: role of
healed plaque disruption. Heart1999;82(3):265.
49
33. Carvalho A, Sousa J. Cardiopatia isquêmica. Revista Brasileira de
Hipertensão2001;8(3):297-305. 34. Deardorff R, Spinale F. Cytokines and matrix metalloproteinases as potential biomarkers
in chronic heart failure. Biomarkers in Medicine2009;3(5):513-23. 35. Gandhi M, Lampe F, Wood D. Incidence, clinical characteristics, and short-term
prognosis of angina pectoris. British Medical Journal1995;73(2):193. 36. Stanley W, Marzilli M. Metabolic therapy in the treatment of ischaemic heart disease: the
pharmacology of trimetazidine. Fundamental & clinical pharmacology2003;17(2):133-45. 37. Kantor P, Lucien A, Kozak R, Lopaschuk G. The antianginal drug trimetazidine shifts
cardiac energy metabolism from fatty acid oxidation to glucose oxidation by inhibiting mitochondrial long-chain 3-ketoacyl coenzyme A thiolase. Circulation research2000;86(5):580.
38. Chazov E, Lepakchin V, Zharova E, Fitilev S, Levin A, Rumiantzeva E, et al. Trimetazidine in Angina Combination Therapy-the TACT study: trimetazidine versus
conventional treatment in patients with stable angina pectoris in a randomized, placebo-controlled, multicenter study. American journal of therapeutics2005;12(1):35.
39. Pepine C, Wolff A. A controlled trial with a novel anti-ischemic agent, ranolazine, in chronic stable angina pectoris that is responsive to conventional antianginal agents* 1. The
American Journal of Cardiology1999;84(1):46-50. 40. Rousseau M, Pouleur H, Cocco G, Wolff A. Comparative efficacy of ranolazine versus
atenolol for chronic angina pectoris. The American Journal of Cardiology2005;95(3):311-6. 41. Tardif J, Ford I, Tendera M, Bourassa M, Fox K. Efficacy of ivabradine, a new selective
If inhibitor, compared with atenolol in patients with chronic stable angina. European heart journal2005;26(23):2529.
42. Ruzyllo W, Tendera M, Ford I, Fox K. Antianginal efficacy and safety of ivabradine compared with amlodipine in patients with stable effort angina pectoris: a 3-month randomised,
double-blind, multicentre, noninferiority trial. Drugs2007;67(3):393-405. 43. Jahangir A, Shen W, Terzic A. Potassium channel openers: therapeutic potential in
cardiology and medicine. Expert Opinion on Pharmacotherapy2001;2(12):1995-2010. 44. Zingman L, Alekseev A, Hodgson-Zingman D, Terzic A. ATP-sensitive potassium
channels: metabolic sensing and cardioprotection. Journal of Applied Physiology2007;103(5):1888.
45. Jahangir A, Terzic A. KATP channel therapeutics at the bedside. Journal of molecular and cellular cardiology2005;39(1):99-112.
46. Braunwald E, Zipes DP, Libby, P. Tratado de Medicina Cardiovascular. 2003;2(6ª ed). 47. Gottschall C, Miler V, Arié S, editors. Angioplastia coronariana transluminal percutânea
(ACTP) em paciente com oclusão completa de artéria descendente anterior1982. 48. Gupta R, Tongers J, Losordo D. Human studies of angiogenic gene therapy. Circulation
research2009;105(8):724. 49. Takeshita S, Zheng L, Brogi E, Kearney M, Pu L, Bunting S, et al. Therapeutic
angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical
Investigation1994;93(2):662. 50. Baumgartner I, Pieczek A, Manor O, Blair R, Kearney M, Walsh K, et al. Constitutive
expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation1998;97(12):1114.
50
51. Kones R. Recent advances in the management of chronic stable angina I: Approach to the
patient, diagnosis, pathophysiology, risk stratification, and gender disparities. Vascular Health and Risk Management;6:635.
52. Rakusan K. Coronary angiogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences1995;752(1):257-66.
53. Pugh C, Ratcliffe P. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. Nature Medicine2003;9(6):677-84.
54. Rajagopalan S, Olin J, Deitcher S, Pieczek A, Laird J, Grossman P, et al. Use of a constitutively active hypoxia-inducible factor-1 {alpha} transgene as a therapeutic strategy in no-
option critical limb ischemia patients: phase I dose-escalation experience. Circulation2007;115(10):1234.
55. Armstrong E, Bischoff J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circulation research2004;95(5):459.
56. Habeck M. Wielding more power over angiogenesis. Molecular medicine today2000;6(4):138.
57. Rafii S, Lyden D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine2003;9(6):702-12.
58. Azuma J, Taniyama Y, Takeya Y, Iekushi K, Aoki M, Dosaka N, et al. Angiogenic and antifibrotic actions of hepatocyte growth factor improve cardiac dysfunction in porcine ischemic
cardiomyopathy. Gene therapy2006;13(16):1206-13. 59. Morishita R, Aoki M, Hashiya N, Yamasaki K, Kurinami H, Shimizu S, et al. Therapeutic
angiogenesis using hepatocyte growth factor (HGF). Current Gene Therapy2004;4(2):199-206. 60. Kawasuji M, Nagamine H, Ikeda M, Sakakibara N, Takemura H, Fujii S, et al.
Therapeutic angiogenesis with intramyocardial administration of basic fibroblast growth factor. The Annals of thoracic surgery2000;69(4):1155.
61. Pecher P, Schumacher B. Angiogenesis in ischemic human myocardium: clinical results after 3 years. The Annals of thoracic surgery2000;69(5):1414-9.
62. Hristov M, Erl W, Weber P. Endothelial progenitor cells: mobilization, differentiation, and homing. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology2003;23(7):1185.
63. Hambrecht R, Wolf A, Gielen S, Linke A, Hofer J, Erbs S, et al. Effect of exercise on coronary endothelial function in patients with coronary artery disease. New England Journal of
Medicine2000;342(7):454. 64. Quyyumi M, MRCP, FACC, AA, Dakak M, N, Mulcahy M, MRCPI, D, Andrews M, NP,
Husain M, S, Panza M, FACC, JA, et al. Nitric oxide activity in the atherosclerotic human coronary circulation. Journal of the American College of Cardiology1997;29(2):308-17.
65. Zeiher A, Schachlinger V, Hohnloser S, Saurbier B, Just H. Coronary atherosclerotic wall thickening and vascular reactivity in humans. Elevated high-density lipoprotein levels ameliorate
abnormal vasoconstriction in early atherosclerosis. Circulation1994;89(6):2525. 66. Asahara T, Masuda H, Takahashi T, Kalka C, Pastore C, Silver M, et al. Bone marrow
origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circulation research1999;85(3):221.
67. Shalaby F, Rossant J, Yamaguchi T, Gertsenstein M, Wu X, Breitman M, et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature1995;376(6535):62-6.
68. Kalka C, Masuda H, Takahashi T, Gordon R, Tepper O, Gravereaux E, et al. Vascular endothelial growth factor165 gene transfer augments circulating endothelial progenitor cells in
human subjects. Circulation research2000;86(12):1198.
51
69. Crottogini A, Meckert P, Vera Janavel G, Lascano E, Negroni J, Del Valle H, et al.
Arteriogenesis induced by intramyocardial vascular endothelial growth factor 165 gene transfer in chronically ischemic pigs. Human gene therapy2003;14(14):1307-18.
70. Villanueva F, Abraham J, Schreiner G, Csikari M, Fischer D, Mills J, et al. Myocardial contrast echocardiography can be used to assess the microvascular response to vascular
endothelial growth factor-121. Circulation2002;105(6):759. 71. Holladay C, O'Brien T, Pandit A. Non viral gene therapy for myocardial engineering.
Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology2010;2(3):232-48. 72. Yang Z, Xu S, Chen B, Zhang S, Zhang Y, Wei W, et al. Hepatocyte growth factor plays
a critical role in the regulation of cytokine production and induction of endothelial progenitor cell mobilization: a pilot gene therapy study in patients with coronary heart disease. Clinical and
Experimental Pharmacology and Physiology2009;36(8):790-6. 73. Melo L, Pachori A, Gnecchi M, Dzau V. Genetic therapies for cardiovascular diseases.
Trends in Molecular Medicine2005;11(5):240-50. 74. Matsumoto R, Omura T, Yoshiyama M, Hayashi T, Inamoto S, Koh K, et al. Vascular
endothelial growth factor-expressing mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology2005;25(6):1168.
75. Yau T, Kim C, Li G, Zhang Y, Weisel R, Li R. Maximizing ventricular function with multimodal cell-based gene therapy. Circulation2005;112(9).
76. Kalil R. Terapia gênica aplicada à cirurgia cardiovascular. Revista da Sociedade de Cardiologia do Rio Grande do Sul2001;3:61-6.
77. Kalil R, Sant'Anna R. Terapia Gênica aplicada às doenças cardiovasculares. Revista da Sociedade de Cardiologia do Rio Grande do Sul2004;3:213-19.
78. Bae J, Cho M. Gene Therapy for Heart Failure. Korean Circulation Journal2005;35(5):345-52.
79. Nikol S, Engelmann M, Pelisek J, Fuchs A, Golda A, Shimizu M, et al. Local perivascular application of low amounts of a plasmid encoding for vascular endothelial growth factor
(VEGF165) is efficient for therapeutic angiogenesis in pigs. Acta Physiologica Scandinavica2002;176(2):151-9.
80. Laitinen M, Mäkinen K, Manninen H, Matsi P, Kossila M, Agrawal R, et al. Adenovirus-mediated gene transfer to lower limb artery of patients with chronic critical leg ischemia. Human
gene therapy1998;9(10):1481-6. 81. Hedman M, Hartikainen J, Syvanne M, Stjernvall J, Hedman A, Kivela A, et al. Safety
and feasibility of catheter-based local intracoronary vascular endothelial growth factor gene transfer in the prevention of postangioplasty and in-stent restenosis and in the treatment of
chronic myocardial ischemia: phase II results of the Kuopio Angiogenesis Trial (KAT). Circulation2003;107(21):2677.
82. Hao X, Mansson-Broberg A, Grinnemo K, Siddiqui A, Dellgren G, Brodin L, et al. Myocardial angiogenesis after plasmid or adenoviral VEGF-A165 gene transfer in rat myocardial
infarction model. Cardiovascular research2007;73(3):481. 83. Ripa R, Wang Y, Jorgensen E, Johnsen H, Hesse B, Kastrup J. Intramyocardial injection
of vascular endothelial growth factor-A165 plasmid followed by granulocyte-colony stimulating factor to induce angiogenesis in patients with severe chronic ischaemic heart disease. European
heart journal2006;27(15):1785. 84. Mäkinen K, Manninen H, Hedman M, Matsi P, Mussalo H, Alhava E, et al. Increased
vascularity detected by digital subtraction angiography after VEGF gene transfer to human lower
52
limb artery: a randomized, placebo-controlled, double-blinded phase II study. Molecular
Therapy2002;6(1):127-33. 85. Flamme I, Risau W. Induction of vasculogenesis and hematopoiesis in vitro.
Development1992;116(2):435. 86. Laitinen M, Hartikainen J, Hiltunen M, Eranen J, Kiviniemi M, Narvanen O, et al.
Catheter-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer to human coronary arteries after angioplasty. Human gene therapy2000;11(2):263-70.
87. Gyongyosi M, Khorsand A, Zamini S, Sperker W, Strehblow C, Kastrup J, et al. NOGA-guided analysis of regional myocardial perfusion abnormalities treated with intramyocardial
injections of plasmid encoding vascular endothelial growth factor A-165 in patients with chronic myocardial ischemia: subanalysis of the EUROINJECT-ONE multicenter double-blind
randomized study. Circulation2005;112(9). 88. Reilly J, Grise M, Fortuin F, Vale P, Schaer G, Lopez J, et al. Long-term (2-year) clinical
events following transthoracic intramyocardial gene transfer of VEGF-2 in no-option patients. Journal of Interventional Cardiology2005;18(1):27-31.
89. Choi J, Kim K, Han W, Kim D, Park J, Lee J, et al. Efficacy of therapeutic angiogenesis by intramyocardial injection of pCK-VEGF165 in pigs. The Annals of thoracic
surgery2006;82(2):679-86. 90. Henry T, Annex B, McKendall G, Azrin M, Lopez J, Giordano F, et al. The VIVA trial:
Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation2003;107(10):1359.
91. Hendel R, Henry T, Rocha-Singh K, Isner J, Kereiakes D, Giordano F, et al. Effect of intracoronary recombinant human vascular endothelial growth factor on myocardial perfusion:
evidence for a dose-dependent effect. Circulation2000;101(2):118. 92. Laguens R, Cabeza Meckert P, Vera Janavel G, De Lorenzi A, Lascano E, Negroni J, et
al. Cardiomyocyte hyperplasia after plasmid mediated vascular endothelial growth factor gene transfer in pigs with chronic myocardial ischemia. The Journal of Gene Medicine2004;6(2):222-
7. 93. Huang M, Tian H, Wu J, Matsubayashi K, Weisel R, Li R. Myometrial cells induce
angiogenesis and salvage damaged myocardium. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology2006;291(5):2057.
94. Eagle K, Lim M, Dabbous O, Pieper K, Goldberg R, Van de Werf F, et al. A validated prediction model for all forms of acute coronary syndrome: estimating the risk of 6-month
postdischarge death in an international registry. Jama2004;291(22):2727. 95. Hasdai D, Holmes D. Age and outcome after acute coronary syndromes without persistent
ST-segment elevation* 1. American Heart Journal2000;139(5):858-66. 96. Rivard A, Fabre J, Silver M, Chen D, Murohara T, Kearney M, et al. Age-dependent
impairment of angiogenesis. Circulation1999;99(1):111. 97. Rivard A, Berthou-Soulie L, Principe N, Kearney M, Curry C, Branellec D, et al. Age-
dependent defect in vascular endothelial growth factor expression is associated with reduced hypoxia-inducible factor 1 activity. Journal of Biological Chemistry2000;275(38):29643.
98. Bosch-Marce M, Okuyama H, Wesley J, Sarkar K, Kimura H, Liu Y, et al. Effects of aging and hypoxia-inducible factor-1 activity on angiogenic cell mobilization and recovery of
perfusion after limb ischemia. Circulation research2007;101(12):1310. 99. Mack C, Patel S, Schwarz E, Zanzonico P, Hahn R, Ilercil A, et al. Biologic bypass with
the use of adenovirus-mediated gene transfer of the complementary deoxyribonucleic acid for
53
vascular endothelial growth factor 121 improves myocardial perfusion and function in the
ischemic porcine heart. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery1998;115(1):168-77. 100. Giordano F, Ping P, McKirnan M, Nozaki S, Demaria A, Dillmann W, et al. Intracoronary
gene transfer of fibroblast growth factor–5 increases blood flow and contractile function in an ischemic region of the heart. Nature Medicine1996;2(5):534-9.
101. Wright M, Wightman L, Lilley C, de Alwis M, Hart S, Miller A, et al. In vivo myocardial gene transfer: optimization, evaluation and direct comparison of gene transfer vectors. Basic
Research in Cardiology2001;96(3):227-36. 102. O'Donnell J, Sumbilla C, Ma H, Farrance I, Cavagna M, Klein M, et al. Tight control of
exogenous SERCA expression is required to obtain acceleration of calcium transients with minimal cytotoxic effects in cardiac myocytes. Circulation research2001;88(4):415.
103. www.ufrgs.br/bioetica/jesse.htm. Acesso em 26 de dezembro de 2010. 104. Seppo Y, John F. Cardiovascular gene therapy. Lancet2000;355:213.
105. Logeart D, Hatem S, Rücker-Martin C, Chossat N, Nevo N, Haddada H, et al. Highly efficient adenovirus-mediated gene transfer to cardiac myocytes after single-pass coronary
delivery. Human gene therapy2000;11(7):1015-22. 106. Biswas S, Hughes G, Scarborough J, Domkowski P, Diodato L, Smith M, et al.
Intramyocardial and intracoronary basic fibroblast growth factor in porcine hibernating myocardium: a comparative study* 1. Journal of Thoracic and Cardiovascular
Surgery2004;127(1):34-43. 107. Rana J, Mannam A, Donnell-Fink L, Gervino E, Sellke F, Laham R. Longevity of the
placebo effect in the therapeutic angiogenesis and laser myocardial revascularization trials in patients with coronary heart disease. The American Journal of Cardiology2005;95(12):1456-9.
108. Lee R, Springer M, Blanco-Bose W, Shaw R, Ursell P, Blau H. VEGF gene delivery to myocardium: deleterious effects of unregulated expression. Circulation2000;102(8):898.
109. Hamawy A, Lee L, Crystal R, Rosengart T. Cardiac angiogenesis and gene therapy: a strategy for myocardial revascularization. Current Opinion in Cardiology1999;14(6):515.
110. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine2000;6(4):389.
111. Semenza G. Vasculogenesis, angiogenesis, and arteriogenesis: mechanisms of blood vessel formation and remodeling. Journal of cellular biochemistry2007;102(4):840-7.
112. Rajagopalan S, Mohler III E, Lederman R, Mendelsohn F, Saucedo J, Goldman C, et al. Regional angiogenesis with vascular endothelial growth factor in peripheral arterial disease: a
phase II randomized, double-blind, controlled study of adenoviral delivery of vascular endothelial growth factor 121 in patients with disabling intermittent claudication.
Circulation2003;108(16):1933. 113. Kusumanto Y, Van Weel V, Mulder N, Smit A, Van den Dungen J, Hooymans J, et al.
Treatment with intramuscular vascular endothelial growth factor gene compared with placebo for patients with diabetes mellitus and critical limb ischemia: a double-blind randomized trial.
Human gene therapy2006;17(6):683-91. 114. Grines C, Watkins M, Helmer G, Penny W, Brinker J, Marmur J, et al. Angiogenic Gene
Therapy (AGENT) trial in patients with stable angina pectoris. Circulation2002;105(11):1291. 115. Grines C, Watkins M, Mahmarian J, Iskandrian A, Rade J, Marrott P, et al. A randomized,
double-blind, placebo-controlled trial of Ad5FGF-4 gene therapy and its effect on myocardial perfusion in patients with stable angina. Journal of the American College of
Cardiology2003;42(8):1339.
54
116. Nikol S, Baumgartner I, Van Belle E, Diehm C, Visoná A, Capogrossi M, et al.
Therapeutic angiogenesis with intramuscular NV1FGF improves amputation-free survival in patients with critical limb ischemia. Molecular Therapy2008;16(5):972-8.
117. Grossman P, Mendelsohn F, Henry T, Hermiller J, Litt M, Saucedo J, et al. Results from a phase II multicenter, double-blind placebo-controlled study of Del-1 (VLTS-589) for intermittent
claudication in subjects with peripheral arterial disease. American Heart Journal2007;153(5):874-80.
118. Powell R, Simons M, Mendelsohn F, Daniel G, Henry T, Koga M, et al. Results of a double-blind, placebo-controlled study to assess the safety of intramuscular injection of
hepatocyte growth factor plasmid to improve limb perfusion in patients with critical limb ischemia. Circulation2008;118(1):58.
119. Henry T, Grines C, Watkins M, Dib N, Barbeau G, Moreadith R, et al. Effects of Ad5FGF-4 in Patients With Angina:: An Analysis of Pooled Data From the AGENT-3 and
AGENT-4 Trials. Journal of the American College of Cardiology2007;50(11):1038-46. 120. Kalil R, Teixeira L, Mastalir E, Moreno P, Fricke C, Nardi N. Experimental model of
gene transfection in healthy canine myocardium: perspectives of gene therapy for ischemic heart disease. Arquivos Brasileiros de Cardiologia2002;79:228-32.
121. Sant'Anna R, Kalil R, Moreno P, Anflor L, Correa D, Ludwig R, et al. Gene therapy with VEGF 165 for angiogenesis in experimental acute myocardial infarction. Revista Brasileira de
Cirurgia Cardiovascular2003;18:142-7. 122. Furlani A, Kalil R, Castro I, Cañedo-Delgado A, Barra M, Prates P, et al. Effects of
therapeutic angiogenesis with plasmid VEGF165 on ventricular function in a canine model of chronic myocardial infarction. Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular2009;24:143-9.
55
High doses of VEGF165 as sole gene therapy for patients with inoperable coronary artery
disease and refractory angina: 1-year follow-up from a phase I/II clinical trial
Imarilde I. Giusti – Cardiologist - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação
Universitária de Cardiologia – Brazil
Short title: VEGF 165 Sole Gene Therapy for Refractory Angina
Clarissa G. Rodrigues – Spec RN - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação
Universitária de Cardiologia – Brazil and Research on Research Group, Duke University, USA.
Felipe B. Salles – MD- Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação Universitária
de Cardiologia – Brazil.
Roberto T. Sant’Anna –MD; Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação
Universitária de Cardiologia – Brazil.
Bruna Eibel – Physiotherapist - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação
Universitária de Cardiologia – Brazil.
Sang W. Han – PhD – Universidade Federal de São Paulo.
Eduardo Ludwig – MD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação Universitária
de Cardiologia – Brazil.
Gabriel Grossman – MD, PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação
Universitária de Cardiologia – Brazil.
Paulo Roberto L. Prates – MD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação
Universitária de Cardiologia – Brazil.
56
João Ricardo M. Sant’Anna – MD, PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul /
Fundação Universitária de Cardiologia – Brazil.
Guaracy F. Teixeira Filho – MD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação
Universitária de Cardiologia – Brazil.
Melissa Medeiros Markoski – PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação
Universitária de Cardiologia – Brazil.
Ivo A. Nesralla – MD, PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação
Universitária de Cardiologia – Brazil.
Nance B. Nardi – PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação Universitária
de Cardiologia – Brazil.
Renato A. K. Kalil – MD, PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação
Universitária de Cardiologia – Brazil and Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto
Alegre – Brazil.
Corresponding Author:
Renato A. K. Kalil
Research Unit of Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação Universitária de
Cardiologia – Brazil. Av. Princesa Isabel, 370 Porto Alegre, RS. Zip code: 90620-001.
[email protected], [email protected]
Telephone: +55 (51) 3230-3600 Fax: +55 (51) 3217-2035
Total word count: 5.050 words.
57
Abstract
Background - Gene therapy has the potential to aid development of angiogenesis and collateral
circulation in the ischemic tissue. The aim of this study was to assess the safety and feasibility
and to evaluate the initial results, both clinical and on myocardial perfusion, of gene therapy with
2000 µg of VEGF165 in patients with ischemic heart disease and refractory angina.
Methods and Results – This was a Phase I/II, prospective, temporal-controlled series, clinical
trial. Thirteen patients were maintained for a minimum of 6 months under optimized clinical
management, then received transthoracic intramyocardial injections of 2000 µg plasmid
VEGF165 and were followed by single photon emission computed tomography (SPECT) scans,
treadmill tests, Minnesotta Quality of Life Questionnaire (QOL) and New York Heart
Association (NYHA) and Canadian Cardiovascular Society (CCS) angina classifications. There
were no deaths, early or late. During the optimized clinical treatment, it was observed worsening
of rest ischemia scores on SPECT (P<0.05). After treatment, there was a transitory increase in
myocardial perfusion at 3rd
month SPECT under stress (pre-op 18.38±7.51 vs. 3 months
15.31±7.30; P<0.01) and at 6th month under rest (pre-op 13.23±7.98 vs. 6 months: 16.92±7.27;
P<0.01). One year after, there were improvements in treadmill test steps (pre-op 2.46±2.07 vs.12
months 4.15±2.23; P<0.01) and oxygen consumption (pre-op 7.66±4.47 vs.12 months
10.89±4.65; P<0.05), QOL (pre-op 48.23±18.35 vs.12 months 28.31±18.14; P<0.01) scores and
CCS (pre-op 3(3-3.5) vs.12 months 2(1-2.5); P<0.01) and NYHA (pre-op 3(3-3) vs. 2(2-2) vs. 12
months 2(1-2); P<0.01) classes.
Conclusions – Gene therapy demonstrated to be feasible and safe in this advanced ischemic
cardiomyopathy patient sample. There were improvements in clinical evaluation parameters and
a transitory increase in myocardial perfusion detectable by SPECT scintigraphy.
58
Clinical Trial Registration: NCT00744315
http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00744315?term=Induced+Angiogenesis+by+Genic+Thera
py+in+Advanced+Ischemic+Cardiomyopathy+(THEANGIOGEN)&rank=1
Key Words: gene therapy, angiogenesis, myocardial perfusion, angina.
59
It is estimated that about 900,000 individuals in the United States have refractory angina.
This syndrome is defined as severe symptomatic coronary artery disease (CAD), not manageable
by conventional treatment, including coronary artery bypass grafting (CABG), percutaneous
coronary intervention (PCI) and optimized clinical treatment1,2
. Moreover, there are about 25,000
to 75,000 new cases diagnosed each year1,2
. In Europe, about 15% of the total cases of angina can
be characterized as refractory angina2. With increasing population age and CAD mortality
reduction, it is believed that the incidence of refractory angina will increase.
In order to improve quality of life for these patients, alternative revascularization
strategies have been evaluated. In this context, given its potential for aiding the development
myocardial angiogenesis and formation of collateral circulation in the ischemic myocardium3,
gene therapy using the vascular endothelial growth factor (VEGF) could represent a new
therapeutic option3,4
. In 1998, Losordo et al5 conducted the first clinical trial using gene therapy
with VEGF165 for patients with refractory angina. Over a decade later, however, the real benefits
of the therapy as well as the most appropriate and effective dose are still controversial.
Clinical trials of gene therapy with VEGF165 as the sole therapy for patients with
refractory angina have used low gene vector doses (125-400 µg)5-7
. Higher doses have been used
in some studies, although in combination with well-established techniques of myocardial
revascularization, such as CABG and PCI8-13
. Additionally, such trials have demonstrated the
safety and feasibility of this type of therapy, evidencing myocardial angiogenesis and improved
functional capacity. However, the effect of high doses in patients with refractory angina remains
unclear.
The aim of this study was to assess the safety and feasibility and to evaluate the initial
results, both clinical and over the myocardial perfusion, of gene therapy with 2000 µg of plasmid
VEGF165 in patients with advanced ischemic heart disease and refractory angina.
60
METHODS
Clinical Study Design and Patients Selection
This trial was designed as a prospective temporal-controlled clinical series study and
enrolled 13 patients (Table 1) with refractory angina selected from 134 candidates screened in a
dedicated outpatient clinic during a 2-year period. All 13 patients had advanced ischemic heart
disease, inoperable by CABG or PCI, as assessed by independent cardiovascular surgeons and
interventionist cardiologists. The inclusion criteria were: signs and symptoms of angina and/or
heart failure despite maximum medical treatment, myocardial ischemic area of at least 5% as
assessed by single photon emission computed tomography (SPECT) scans and diffuse coronary
artery disease with vessels unfeasible for CABG or PCI. The exclusion criteria were: age over 65
years, left ventricular ejection fraction less than 25% and diagnosed neoplasms. After selection,
the patients had their medical treatment optimized following current clinical guidelines and were
followed for a minimum of 6 months (259.6±167.3 days) in a dedicated outpatient clinic, under
the research group supervision. During this period, the plasmid VEGF solution was prepared by
the supplier. Immediately before intervention, the patients underwent a preoperative evaluation
that included all of the described parameters, with emphasis on a new SPECT scan. Patients who
responded well to medical treatment or who showed improvements in myocardial SPECT scan
perfusion were discarded from the study and not submitted to gene therapy.
Study Registrations and Approvals
This study was registered at ClinicalTrials.gov under the registration number NCT
00744315 and was carried out in a reference cardiology hospital in southern Brazil. This is the
first clinical trial using gene therapy in Brazil for the treatment of refractory angina patients and
the first one to use a vector entirely developed in this country, by Excellion, Petropolis, RJ,
61
Brazil. The project was designed according to the Guidelines and Norms Regulating Research
Involving Human Subjects (Declaration of Helsinki World Medical Association, 1964). It was
approved by the National and Local Ethics Committee under number 3849/06, as well as by the
National Technical Commission on Biosafety (CTNBio) for the surgical center and the supplier
of the plasmid vector. All the patients signed informed consents. Figure 1 demonstrates the study
phases flow diagram.
Intervention
The patients were submitted to surgical intervention under general anesthesia at a
reference cardiovascular surgery center. The ischemic area of the myocardium previously
identified by a SPECT scan was approached through a small anterolateral thoracotomy with an
incision of approximately 5 cm in the 4th or 5th left intercostal space, according to the area to be
treated, followed by a corresponding T-shaped pericardiotomy. This area received injections of
the plasmid vector solution under direct vision, distributed over ten points of the ischemic
myocardium, with a total of 2000 µg of plasmid VEGF165, diluted in 5 mL saline solution, using
a 5 mL syringe and a 25 F Butterfly injection needle. Prior to thoracic closure, a thoracic tube
was put in place and maintained for 12 h. Postoperative pain was treated with intercostal neural
block with local marcaine solution and postoperatively with injectable analgesics.
Plasmidial Vector
The plasmid backbone used was developed by one of the authors (SWH) at the Federal
University of São Paulo and produced commercially by Excellion Serviços Biomédicos in
Petropolis, RJ, Brazil. The PEX-HV5 plasmid backbone is composed of cytomegalovirus (CMV)
intron 1 with its promoter and splicing signals. The human VEGF165 cDNA was inserted
62
between the CMV promoter and the bovine polyA sequence. This vector also contains a pUC
origin of replication and kanamycin resistance sequences for propagation in bacteria. The
solution is considered stable if kept under refrigeration for 6 months; it must be discarded after
this period.
Hypersensibility Test
All patients were tested for hypersensitivity to the VEGF165 plasmid vector solution.
The test consisted of a 0.5 mL subcutaneous injection containing a 500 ng dose of vector PEX-
HV5 (containing the human gene VEGF165) in 0.5 mL of sodium chloride 0.9% in the left
forearm at least 2 weeks before the intervention. The application was performed in the outpatient
clinic, where the patients remained and were reassessed 6 hours after the injection. Thereafter, the
patients received instructions to return to the hospital in case of adverse events. No type of
adverse event was observed in any of the patients studied.
Myocardial Perfusion
All patients underwent ECG-gated myocardial perfusion studies. The protocol involved a
2 day (rest/stress) technetium 99m sestamibi imaging approach(SPECT). All patients were
submitted to pharmacological stress using dipyridamole (0.56 mg/Kg in 4 minutes). A stress
injection of Tc-99m sestamibi was administered at the seventh minute of the beginning of
dipyridamole infusion. The images were acquired with a low-energy high-resolution collimator
using a 180º non-circular orbit from 45º right anterior oblique to left posterior oblique, with a 64
× 64 matrix. The rest and stress studies were reconstructed using a Butterworth filter with a
critical frequency of 0.5 Nyquist, with an order of 5.
63
An Emory Cardiac Toolbox (ECTb) was used to identify left ventricular landmarks from
short axis slices which were then verified by an operator. The ejection fraction and left
ventricular volume values were calculated using the ECTb and the extent and severity of the
ischemic area were obtained using Cedars-Sinai QPS software. In this software, the left ventricle
is divided into segments and each receives scores between 0 and 4 (0 = normal perfusion and 4 =
absence of perfusion). The severity scores obtained were: summed stress score (SSS), summed
rest score (SRS) and summed difference score (SDS). The extent of ischemia was calculated by
comparing the perfusion of the patient with a database of normal patients. The final examination
result was defined via a consensus between two experts.
Functional Capacity
A treadmill test with the Naughton protocol was used, which provides an estimated
oxygen consumption of 1 MET per stage. This protocol is often used in post-myocardial
infarction exercise testing to classify patients into high-risk or low-risk categories and to
determine optimal treatment strategies. The protocol begins with a belt speed of 1.0 mph with
zero elevation, followed by an increase to 2.0 mph, keeping the elevation zero. From this stage,
the rate is fixed at 2 mph and the elevation of the ramp increases in 3.5% increments every 3
minutes.
Quality of Life
The Minnesota quality of life (QOL) questionnaire is comprised of 21 questions related to
limitations that are often associated with how much heart failure (HF) prevents patients from
living as they would like to, considering questions related to the previous months. The responses
to each question range from 0 (no) to 5 (yes), where 0 represents no limitation and 5 maximal
64
limitation. This questionnaire was specifically developed for heart failure, making it closer to
reality for this class of patient.
Heart Failure (NYHA) and Angina (CCS) Functional Classification
Scores of angina according to the Canadian Cardiovascular Society (CCS), and heart
failure according to the New York Heart Association (NYHA), were assigned at each interval
evaluation.
Outcomes
For the above described parameters, the patients were evaluated at the study inclusion,
after at least 6 months of optimized clinical treatment (pre-intervention period), and at 1, 3, 6 and
12 months after intervention, observing the following outcomes;
Primary outcome: ischemia extension evaluated by serial SPECT scans
Secondary outcomes: angina class by CCS classification, heart failure class by NYHA
classification, quality of life by the Minnesota questionnaire, functional capacity and estimated
oxygen consumption by treadmill tests.
Statistical Analysis
Continuous variables are expressed as means and standard deviation and categorical
variables as absolute and relative frequencies. Friedman´s nonparametric test and ANOVA were
used to compare the same variables at different times in relation to the same group. Analyses
were performed using the SPSS 18.0 statistical package.
RESULTS
65
Safety and Feasibility
There were no deaths or surgical re-interventions during the study period. There was
a case of prolonged postoperative hospitalization due to decompensated diabetes. One patient
had premature ventricular contractions in the immediate postoperative period. It is noteworthy
that this same patient had already presented the same arrhythmia in a previous treadmill test, with
spontaneous reversion. Another patient developed bacteremia associated with pneumonia within
12 hours post-op. Microbiological analysis of the plasmid solution used in this patient was
negative for bacterial or fungal growth until the fifth day of observation. This same patient
required assistance in the emergency unit in the fourth month after the intervention due to stress
caused by family illness, but no cardiovascular abnormalities were observed. At the tenth month,
this patient presented with thoracic discomfort, was submitted to a new coronary artery
cineangiogram that identified a new lesion, and was treated with PCI with good results. Another
patient required hospitalization for signs of heart failure and was managed clinically.
Myocardial Perfusion
During the previous optimal drug treatment period, there was no difference in stress and
differential ischemia SPECT scores. However, an increase in the rest ischemia SPECT score
(baseline 10.23±7.06 vs. pre-op 13.23±7.98; P<0.05) was observed. Three months after
VEGF165 gene therapy, analyses of ischemia SPECT scores showed a reduction in the number
of ischemic segments under stress (pre-op 18.38±7.51 vs. 3 months 15.31±7.30; P<0.01) and at
rest (pre-op 13.23±7.98 vs. 3 months 8.77±6.82; P<0.01). There was no difference in the
differential score in the same time period. Six months after intervention, there was a significant
difference only in the rest ischemia score (6 months: 16.92±7.27; P<0.01).
66
One year after gene therapy, the ischemia scores were similar to the preoperative values.
Figure 2 demonstrates the ischemia scores throughout follow-up and Figure 3 presents the
variation in myocardial perfusion as assessed by SPECT scans for one of the patients included
this study.
Functional Capacity
One month after VEGF165 gene therapy, there was improvement in the number of steps
taken in the treadmill test (pre-op 2.46±2.07 vs. 1 month 3.31±1.75, P<0.05), which was
maintained at 1 year after intervention (3 months 3.77±2.13, P<0.05; 6 months 3.92±2.14, P<0.05
and 12 months 4.15±2.23, P<0.01). Oxygen consumption in the patients was improved three
months after intervention (pre-op 7.66±4.47 vs. 3 months 10.30 ±4.36, P<0.05), and this effect
remained at 1 year after gene therapy (12 months 10.89±4.65; P<0.05). During the optimal drug
treatment period, there was no difference in the number of steps (baseline 2.00±2.27 vs. pre-op
2.46±2.07; P=NS) or in oxygen consumption (baseline 6.70±4.54 vs. pre-op 7.67±4.47; P=NS) in
the treadmill tests. These results are presented in Figure 4.
Quality of Life
During the optimal drug treatment, there was no difference in quality of life (baseline
49.77±20.85 vs. pre-op 48.23±18.35; P=NS). One month after VEGF165 gene therapy, a
decrease in these scores was observed, showing an improvement in quality of life (1 month
31.00±15.71; P<0.01). The same decrease was observed 3 (3 months 30.15±20.13; P<0.01), 6 (6
months 27.62±18.47; P<0.01) and 12 months (12 months 28.31±18.14; P<0.01) after gene
therapy, indicating an improvement in the quality of life throughout follow-up (Figure 5).
67
Angina (CCS) and Heart Failure (NYHA) Classification
One month after VEGF165 gene therapy, the patients showed an improvement in angina
classification (pre-op 3(3-3.5) vs. 1 month 2(2-2)), which remained constant until one year after
intervention (12 months 2(1-2.5); P<0.01). The same results were observed for heart failure
classification (pre-op 3(3-3) vs. 2(2-2) and 12 months 2(1-2); P<0.01). During the optimal drug
treatment period there was no change in either angina (baseline 2.69±0.63 vs. pre-op 3.08±0.64)
or heart failure classification (baseline 3(2-3) vs. pre-op 3(3-3)) (Figure 6).
Individual patients clinical assessments showed improvements in angina symptoms
evaluated by CCS classification in 10 patients, whereas no improvements were noticed in three
patients. There was no case of clinical worsening after gene therapy. During the previous optimal
drug treatment period, five patients reported worsening of angina symptoms and eight reported
no difference. One year after gene therapy, 11 patients showed improvements in NYHA heart
failure classes, whereas 2 patients reported no changes. Similar to the angina symptoms, no
worsening after intervention was observed. During the previous optimized clinical treatment
period, there were five cases of worsening and eight patients reported no difference in relation to
NYHA heart failure classes.
DISCUSSION
In this trial, we assessed the effect of high doses of VEGF165 as sole gene therapy for
patients with severe coronary artery disease and refractory angina. The best or more adequate
clinical dose is not yet known. We chose this high dose based on experimental studies in which
injection of 200 mcg plasmidial solution in dogs of 7-10 Kg provided significant increase in
capillary density of treated areas14
. The intervention was shown to be safe and feasible. There
were objective and subjective significant changes related to the intervention. A transitory
68
improvement in ischemic SPECT scores and an increase in the number of steps taken and oxygen
consumption in the treadmill test, an improvement in quality of life and angina and heart failure
classifications were observed in the patients immediately after treatment.
Only minor complications were observed during the follow-up period of 1 year. Six
months after the study began, there were two cases of hospitalization, but only non-invasive
management, such as clinical treatment, were necessary to control the situation. There was one
case of angina 10 months after gene therapy, which demanded PCI in a new developed coronary
lesion. Previous studies have demonstrated the safety and feasibility of high-dose gene therapy in
combination with other revascularization techniques13
. Studies with lone gene therapy employed
usually low doses5-7
.
When the SPECT images were evaluated, we observed an improvement in the perfusion
scores in the treated area at 3 and 6 months after the injections of plasmid VEGF165, whereas
after 1 month an improvement was not yet evident. While the scores of segmental ischemia under
stress and at rest, SSS and SRS, respectively, which assess both the extent and intensity of
myocardial ischemia, showed myocardial perfusion improvements, the differential scores (SDS)
for individual observations did not change in this period. The proposed treatment aims to
improve perfusion scores in regions with a viable myocardium rather than recover inactive areas.
Thus, an improvement in the scores reflects a real decrease in ischemia severity in the treated
areas.
The improvement in the scores of ischemia at rest in this series of patients suggests that
myocardial perfusion was also improved, but not enough to provide normal perfusion, so that
evidence of stress-induced ischemia remained during stress. Nevertheless, these results show a
clear angiogenic effect of gene therapy in these myocardial areas. One year after gene therapy,
the SPECT scores were similar to baseline parameters, showing a transient effect of the
69
treatment. However, no cases of worsening perfusion scores were observed; therefore,
considering the severity of the coronary artery disease in this class of patients, one year without
worsening of the clinical picture may be seen as a favorable result.
Two previous studies5-7
similar to ours showed different results, with improvements in
myocardial perfusion and angina in one and only an improvement in angina in the other.
However, the number of patients in these studies was also small and, in addition, different doses
of VEGF165 were used. A recent randomized clinical trial using gene therapy combined with
CABG surgery and supplemental oral L-arginine treatment showed promising results for the
association of different treatments, also suggesting that endothelial dysfunction may be
associated with the pathophysiology of these patients8.
Two larger studies, using a similar patient profile, compared injection of plasmid VEGF-
165 with placebo using NOGA technique9,15
. Kastrup et al used 500 mcg of plasmid solution.
Three months after procedure, myocardial stress perfusion defects (primary endpoint) and angina
classs did not differ significantly between the VEGF gene transfer and
placebo groups
15. VEGF
gene transfer improved the local wall motion disturbances, assessed both by
NOGA and contrast
ventriculography. No VEGF related adverse events were observed; however, NOGA procedure-
related adverse events occurred in five patients and one patient died during diagnostic NOGA
before randomization. Stewart et al9, randomized 93 patients with CCS class 3 ou 4 angina, to
2,000 mcg of VEGF plasmid DNA or placebo (buffered saline) delivered via the endocardial
route using a percutaneous electroanatomical NOGA guidance catheter. Despite the
intramyocardial administration of a “high dose" of plasmid DNA, there was no benefit of VEGF
gene therapy at 3 or 6 months for the studied end points.
Evaluation of the exercise test results in this series of patients showed improved oxygen
consumption at three months and up to one year after the intervention. For some of the patients
70
the exercise test had to be interrupted due to claudication and fatigue, which represent a
limitation of the test. In a clinical trial using a VEGF-2 plasmid, Losordo et al16
observed an
increase in the average duration of physical activity in the treated group compared to the placebo
group. A similar study17
with intramyocardial administration of a VEGF121 adenonoviral vector
showed improvements in exercise time at week 26 after gene therapy in the treated patients, but
not in the control patients treated with maximum medical therapy. In this series of patients,
quality of life was improved from one month up to one year after gene therapy with VEGF165,
but not in the patients receiving maximum medical treatment. A previous study16
that included
patients with angina classes III and IV showed a significant reduction in these classes after 12
weeks of treatment with phVEGF2, which did not occur in the control group. Most of larger
therapeutic angiogenesis trials showed non-substantial benefit for cardiovascular disease and the
early promising results of preclinical studies are yet to be translated to the clinic18,19
.
A possible interference of the placebo effect in this series of patients may change their
perception of the symptoms of the disease, representing a confounding variable. However, the
improvements observed in both SPECT scans and exercise treadmill tests were objective
indications of the relevance of the findings on quality of life and of CCS and NYHA
classification. It should also be noted that no improvements were observed in the previous period
of optimal medical treatment, which supports the hypothesis that angiogenesis and improved
myocardial perfusion were gene therapy-induced.
Study limitations: It is recognized that the method of a clinical series with prospective
temporal control model, instead of a parallel control group, might be a limitation of this study.
We chose the temporal control series model, where the patient is his/her own control in the period
prior to treatment, given the heterogeneity and variability of coronary artery disease and
considering the small sample size. In this case, the method could be appropriate for analysis of
71
the effects of gene therapy. All patients remained under optimal medical treatment for at least 6
months before the intervention, which would be a conventional treatment option for patients who
were not undergoing gene therapy. Improvement in symptoms or ischemia parameters such as
SPECT during that period were criteria for excluding patients from treatment. It was therefore
possible to compare the results obtained with the optimal medical treatment and those after
treatment with VEGF165 by considering each patient as his/her own control. It should be
recognized, however, that ischemic heart disease has its own natural history and this could
influence the outcomes, irrespective of the treatment options.
We used a more conventional surgical approach instead of the less invasive NOGA
technique. There are no randomized studies comparing these two approaches in terms of safety
and results. NOGA is attractive since it allows electromechanical mapping of the left ventricle,
facilitating injection in appropriate areas. But there is a risk of perforation, which is not negligible
as demonstrated by the occurrence of cases of pericardial tamponade requiring cardiac surgery17
.
It is, also, difficult to be certain that the DNA product was indeed injected into the myocardium.
A surgical approach is more traumatic, requiring a 5 cm incision, but allows direct injection and
the presence of a thoracic tube reduces the risk of tamponade. With proper SPECT scan analysis
and surgical planning, all areas of the left ventricular free wall can be approached through this
small incision in the 4th or 5
th intercostals spaces. Limitations in this approach are related to the
ventricular septum. With modern anesthetic techniques and meticulous patient care, this approach
has demonstrated to be safe even in high risk patients. However, it renders impossible to perform
blind, placebo-controlled studies.
Gene therapy with the VEGF165 plasmid was shown to be safe and feasible in this patient
group. Three months after gene therapy, the clinical results demonstrated an improvement in the
intensity of myocardial ischemia in the treated areas. One year after treatment, the ischemia
72
scores were similar to the preoperative levels, but no patient showed worsening of ischemia
during this period. Improvements in quality of life and classes of angina and heart failure were
observed in the same one-month period after gene therapy and were maintained for one year after
treatment.
ACKNOWLEDGMENTS
We would like to acknowledge the staff of the Surgical Unit, Postoperative Unit and
Outpatient Department of Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul/Fundação Universitária
de Cardiologia, where this study took place, for their help in assisting with the patients.
Additionally, we would also like to thank the Research Unit at the same Institution for their
efficient assistance throughout this study.
FUNDING SOURCES
FAPERGS – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul(State of Rio
Grande do Sul Research Foundation).
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(National Council for
Scientific and Technological Development).
DISCLOSURES
The authors had no relations whatsoever with any laboratory, industry or company with interests
in the subject of this study. The trial was designed and conducted independently by the authors,
with financial support from the government agencies cited above (FAPERGS and CNPq).
73
REFERENCES
1. McGillion M, Watt-Watson J, LeFort S, Stevens B. Positive shifts in the perceived
meaning of cardiac pain following a psychoeducation program for chronic stable angina.
Can J Nurs Res. 2007; 39:48-65.
2. Yang EH, Barsness GW, Gersh BJ, Chandrasekaran K, Lerman A. Current and future
treatment strategies for refractory angina. Mayo Clin Proc. 2004; 79:1284-1292.
3. Kalil RA, Salles FB, Giusti II, Rodrigues CG, Han SW, Sant'anna RT, Ludwig E,
Grossman G, Prates PR, Sant'anna JR, Teixeira Filho GF, Nardi NB, Nesralla IA. [vegf
gene therapy for angiogenesis in refractory angina: Phase i/ii clinical trial.]. Rev Bras Cir
Cardiovasc. 2010; 25:311-321.
4. Bokeriya LA, Golukhova EZ, Eremeeva MV, Aslanidi IP, Merzlyakov VY, Georgiev GP,
Kiselev SL, Berishvili, II, Vakhromeeva MN, Serov RA, Artyukhina TV, Basarab YS,
Polyakova ES, Lukashkin MA. Use of human vegf(165) gene for therapeutic
angiogenesis in coronary patients: First results. Bull Exp Biol Med. 2005; 140:106-112.
5. Losordo DW, Vale PR, Symes JF, Dunnington CH, Esakof DD, Maysky M, Ashare AB,
Lathi K, Isner JM. Gene therapy for myocardial angiogenesis: Initial clinical results with
direct myocardial injection of phvegf165 as sole therapy for myocardial ischemia.
Circulation. 1998; 98:2800-2804.
6. Symes JF, Losordo DW, Vale PR, Lathi KG, Esakof DD, Mayskiy M, Isner JM. Gene
therapy with vascular endothelial growth factor for inoperable coronary artery disease.
Ann Thorac Surg. 1999; 68:830-836; discussion 836-837.
7. Sarkar N, Rück A, Källner G, Y-Hassan S, Blomberg P, Islam KB, van der Linden J,
Lindblom D, Nygren AT, Lind B, Brodin LA, Drvota V, Sylven C. Effects of
74
intramyocardial injection of phvegf-a165 as sole therapy in patients with refractory
coronary artery disease--12-month follow-up: Angiogenic gene therapy. J Intern Med.
2001; 250:373-381.
8. Ruel M, Beanlands RS, Lortie M, Chan V, Camack N, deKemp RA, Suuronen EJ,
Rubens FD, DaSilva JN, Sellke FW, Stewart DJ, Mesana TG. Concomitant treatment
with oral l-arginine improves the efficacy of surgical angiogenesis in patients with severe
diffuse coronary artery disease: The endothelial modulation in angiogenic therapy
randomized controlled trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 2008; 135:762-770, 770.e761.
9. Stewart DJ, Kutryk MJ, Fitchett D, Freeman M, Camack N, Su Y, Della Siega A,
Bilodeau L, Burton JR, Proulx G, Radhakrishnan S. Vegf gene therapy fails to improve
perfusion of ischemic myocardium in patients with advanced coronary disease: Results of
the northern trial. Mol Ther. 2009; 17:1109-1115.
10. Vale PR, Losordo DW, Milliken CE, Maysky M, Esakof DD, Symes JF, Isner JM. Left
ventricular electromechanical mapping to assess efficacy of phvegf(165) gene transfer for
therapeutic angiogenesis in chronic myocardial ischemia. Circulation. 2000; 102:965-974.
11. Bokeriia LA, Golukhova EZ, Eremeeva MV, Kiselev SL, Aslanidi IP, Vakhromeeva MN,
Kliueva AF, Poliakova ES, Lukashkin MA. [new approaches to the treatment of ischemic
heart disease: Therapeutic angiogenesis in combination with surgical revascularization of
the myocardium]. Ter Arkh. 2004; 76:25-30.
12. Kołsut P, Małecki M, Firek B, Teresińska A, Janik P, Religa Z. [gene therapy with
phvegf165 plasmid--preliminary report]. Kardiol Pol. 2004; 60 Suppl 1:I-82-89.
13. Fortuin FD, Vale P, Losordo DW, Symes J, DeLaria GA, Tyner JJ, Schaer GL, March R,
Snell RJ, Henry TD, Van Camp J, Lopez JJ, Richenbacher W, Isner JM, Schatz RA. One-
year follow-up of direct myocardial gene transfer of vascular endothelial growth factor-2
75
using naked plasmid deoxyribonucleic acid by way of thoracotomy in no-option patients.
Am J Cardiol. 2003; 92:436-439.
14. Furlani AP, Kalil RA, Castro I, Cañedo-Delgado A, Barra M, Prates PR, Sant'Anna RT,
Nesralla IA. Effects of therapeutic angiogenesis with plasmid VEGF165 on ventricular
function in a canine model of chronic myocardial infarction. Rev Bras Cir Cardiovasc.
2009 Jun;24(2):143-9.
15. Kastrup J, Jorgensen E, Ruck A, et al., on behalf of Euroinject One Group. Direct
intramyocardial plasmid vascular endothelial growth factor-A165 gene therapy in patients
with stable severe angina pectoris. A randomized double-blind placebo-controlled study:
the Euroinject One trial. J Am Coll Cardiol 2005;45:982–8.
16. Losordo DW, Vale PR, Hendel RC, Milliken CE, Fortuin FD, Cummings N, Schatz RA,
Asahara T, Isner JM, Kuntz RE. Phase 1/2 placebo-controlled, double-blind, dose-
escalating trial of myocardial vascular endothelial growth factor 2 gene transfer by
catheter delivery in patients with chronic myocardial ischemia. Circulation. 2002;
105:2012-2018.
17. Stewart DJ, Hilton JD, Arnold JM, Gregoire J, Rivard A, Archer SL, Charbonneau F,
Cohen E, Curtis M, Buller CE, Mendelsohn FO, Dib N, Page P, Ducas J, Plante S,
Sullivan J, Macko J, Rasmussen C, Kessler PD, Rasmussen HS. Angiogenic gene therapy
in patients with nonrevascularizable ischemic heart disease: A phase 2 randomized,
controlled trial of advegf(121) (advegf121) versus maximum medical treatment. Gene
Ther. 2006; 13:1503-1511.
18. Zachary I, Morgan RD. Therapeutic angiogenesis for cardiovascular disease: biological
context, challenges, prospects. Heart. 2011 Feb;97(3):181-9.
19. Kastrup J. Gene therapy and angiogenesis in patients with coronary artery disease. Expert
76
Rev Cardiovasc Ther. 2010 Aug;8(8):1127-38.
77
FIGURE LEGENDS
Figure 1: CAD: coronary artery disease, CAGB: coronary artery bypass grafting, PCI:
percutaneous coronary disease, SPECT: single photon emission computed tomography, QOL:
quality of life, NYHA classification: New York Heart Association classification, CCS
classification: Canadian Cardiovascular Society classification, VEGF165: vascular endothelial
growth factor 165.
Figure 2: SSS: summed stress score. SRS: summed rest score. Pre-op: pre-operative.
Figure 3: -
Figure 4: Pre-op: pre-operative.
Figure 5: Pre-op: pre-operative.
Figure 6: NYHA: New York Heart Association classification. CCS: Canadian Cardiovascular
Society Angina classification. Pre-op: pre-operative.
78
TABLES
Table 1: Sample characteristics.
Characteristics Patients (n=13)
Age (years) * 58.7±5.9
Male † 12 (92.3%)
Hypertension † 12 (92.3%)
Diabetes † 6 (46.2%)
Previous myocardial infarction † 13 (100%)
Previous stroke † 2 (15.4%)
Peripheral vascular disease † 2 (15.4%)
Previous CABG † 11 (84.6%)
Previous ICP † 12 (92.3%)
Left ventricular ejection fraction * 56.0±14.5
CCS Angina classification †
I 0 (0%)
II 2 (15.4%)
III 8 (61.5%)
IV 3 (23.1%)
NYHA Heart failure classification †
I 0 (0%)
II 0 (0%)
III 11 (84.6%)
IV 2 (15.4%)
* Mean and standard deviation. † Absolute and relative frequencies. CABG: coronary artery bypass graft. ICP:
intervention coronary percutaneous. CCS: Canadian Cardiovascular Society. NYHA: New York Heart Association
79
FIGURES
Figure 1: Study phases diagram.
L
80
Figure 2: Ischemia scores in the SPECT.
81
Figure 3: Variation in myocardial perfusion as assessed by the SPECT scans of one patient
included in this study.
82
Figure 4: Steps taken and oxygen consumption (METs) in treadmill tests.
83
Figure 5: Scores obtained in Minnesota questionnaire.
84
Figure 6: Angina (CCS) and heart failure (NYHA) classification.