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MARIA EMANUELA MARTINS DOS REIS
DISTRIBUIÇÃO DE NEURÔNIOS NITRÉRGICOS NO DIENCÉFALO
DO MOCÓ (Kerodon rupestris)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Natal-RN
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL
DISTRIBUIÇÃO DE NEURÔNIOS NITRÉRGICOS NO DIENCÉFALO
DO MOCÓ (Kerodon rupestris)
ORIENTADOR
Judney Cley Cavalcante
Natal-RN
2016
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas – SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências – CB
Reis, Maria Emanuela Martins dos.
Distribuição de neurônios nitrérgicos no diencéfalo do mocó (Kerodon rupestris) / Maria Emanuela Martins dos Reis. - Natal,
2016.
92 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional.
Orientador: Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante.
1. Óxido nítrico - Dissertação. 2. Kerodon rupestris - Dissertação. 3. Diencéfalo - Dissertação. I. Cavalcante, Judney Cley. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III.
Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 661.982
REIS, M. E. M. Distribuição de neurônios nitrérgicos no diencéfalo do mocó
(Kerodon rupestris). Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio
Grande do Norte para obtenção do título de Mestre em Biologia Estrutural e
Funcional.
Aprovado em: 20/12/2016
Banca Examinadora
Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante. Instituição: UFRN
Julgamento: _________________________ Assinatura: ______________________
Prof. Dr. Ruthnaldo Rodrigues Melo de Lima. Instituição: UFRN
Julgamento: _________________________ Assinatura: ______________________
Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior. Instituição: UNESP
Julgamento: _________________________ Assinatura: ______________________
AGRADECIMENTOS
A meus pais, Horácio por ter abdicado de muitas coisas para que eu realizasse meu sonho de fazer um mestrado, e minha mãe Ione, por tudo que faz por mim, sem você eu não seria quem sou hoje. A minha avó “Dona Nena” que me ajudou nos meus primeiros meses em Natal e por todo o seu amor. Ao professor Judney, meu orientador, por ter me apresentado ao mundo científico e ter disponibilizado seu tempo e paciência para tornar este trabalho concreto. A professora Miriam por ter ajudado a mim e aos meninos doando parte do seu projeto para que pudéssemos concluir nosso mestrado. Ao professor Expedito por todos momentos de descontração no LabNeuro e todas dúvidas tiradas durante todo o período do mestrado. Ao professor Ruthnaldo por aceitar meu convite para membro da banca da qualificação e defesa, e pelas sugestões feitas a mim para melhorar a qualidade desta dissertação. Ao professor José de Anchieta por vir de tão longe fazer parte da banca examinadora. A meus dois grandes “irmãos de orientação”, Wylqui por toda paciência que teve em me ensinar as técnicas necessárias para nosso trabalho, por ser amigo e me fazer dar muitas risadas e a Mario, por sempre que pode estar junto comigo nos experimentos, nas várias tentativas e erros, se tornando um grande amigo. A minhas amigas Ana Lídia, Larissa, Jéssica e Dandara, agradeço todos os dias, por tornarem a vida mais leve e me fazer esquecer os problemas (pelo menos por um momento). Aos colegas do LabNeuro, Fladjany, Joacil, Melqui, Nelyane, Nayana, Mayara, Brena, Paloma, Ana, Naryllene, Daniel (Tiago), Paulão e Hélder pelos momentos de descontração e risadas. E especialmente a Nayra, colegas de laboratório e da turma do mestrado, que sou eternamente grata por ter cedido parte de seu projeto, e por ter se tornado uma grande amiga. A dona Regina agradeço e peço desculpa pelas várias vezes em que esqueci de marcar antecipadamente os experimentos.
A CAPES e ao CNPQ pelo apoio financeiro.
RESUMO
O óxido nítrico (NO) é uma molécula muito simples (N=O), gasosa, com propriedades químicas de um radical livre e até meados da década de 1980 era considerado apenas membro de uma família de poluentes ambientais indesejáveis e carcinógenos potenciais. Desde sua descoberta no sistema nervoso, NO tem sido implicado em diversas funções, o que condiz com sua ampla distribuição no encéfalo. NO também tem sido descrito no encéfalo de diversas espécies animais, mas ainda não foi descrito em mocó (Kerodon rupestris), um roedor endêmico da caatinga brasileira que habita áreas rochosas e tem hábitos crepusculares. Devido a estas características interessantes objetivamos descrever a distribuição do NO do diencéfalo do mocó. Através das técnicas de imunoperoxidase padrão contra a óxido nítrico sintase (NOS), enzima de síntese de NO, e histoquímica para NADPH-diaforase pudemos identificar de forma indireta a presença de neurônios nitrérgicos ao longo de todo diencéfalo. O hipotálamo apresentou uma densidade alta de neurônios imunorreativos a NOS (NOS-IR) em vários núcleos, dentre eles alguns como o núcleo supraóptico, decussação supraóptica e a parte lateral da área retroquiasmática. Com densidade moderada temos a área pré-óptica lateral, o núcleo pré-óptico magnocelular, a parte parvocelular anterior e a parte parvocelular medial do núcleo paraventricular do hipotálamo, o núcleo ventrolateral do hipotálamo, a parte peduncular da área hipotalâmica lateral e o núcleo posterior do hipotálamo. A divisão anterior do núcleo ventromedial do hipotálamo e a área hipotalâmica dorsal apresentaram densidade baixa, e a parte lateral do núcleo pré-óptico medial apresentou densidade muito baixa. No tálamo, neurônios NOS-IR estiveram presentes no núcleo geniculado ventral com densidade alta. Na parte lateral do núcleo habenular lateral, o núcleo talâmico posterodorsal ventral e a parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior com densidade moderada. O núcleo paraventricular do tálamo, zona incerta e o núcleo talâmico parafascicular, apresentaram densidade baixa. Comparando nossos resultados com o descrito em outros animais podemos dizer que o sistema nitrégico é um sistema de neurotransmissor evolutivamente bem conservado.
Palavras-chave: Óxido nítrico, Mocó, Kerodon rupestris, Diencéfalo, Óxido nítrico
sintase.
ABSTRACT
Nitric oxide (NO) is a simple molecule (N=O), a gas with a free radical property whose until the 80s was considered a member of a family of environmental pollutants and a potential carcinogen. Since its discovery in the nervous system, NO has been implicated in several functions, what suits with its wide distribution in the brain. NO has been described in the brain of many animal species, but it was not described in the brain of the rocky cave (Kerodon rupestris), an endemic rodent of the Brazilian caatinga that inhabits rocky areas and have crepuscular habits. Due to these interesting characteristics we aim to describe the NO distribution of the rocky cavy diencephalon. Using standard immunoperoxidase against nitric oxide synthase (NOS), the NO synthesis enzyme, and histochemistry for NADPH-diaphorase, we were able to indirectly identify the presence of nitrergic neurons throughout the entire diencephalon. The hypothalamus showed a high density of NOS-IR neurons in several nuclei, among them the supraoptic nucleus, supraoptic decussation and the lateral part of the retrochiasmatic area. With moderate density we have the lateral pre-optic area, the preocular magnocellular nucleus, the anterior parvocellular part and the medial parvocellular part of the paraventricular nucleus of the hypothalamus, the ventrolateral nucleus of the hypothalamus, the peduncular part of the lateral hypothalamic area and the posterior nucleus of the hypothalamus. The anterior division of the ventromedial nucleus of the hypothalamus and the dorsal hypothalamic area presented low density, and the lateral part of the medial pre-optic nucleus presented very low density. In the thalamus, NOS-IR neurons were present in the ventral geniculate nucleus with high density. In the lateral part of the lateral habenular nucleus, the ventral posterodorsal thalamic nucleus and the mediocaudal part of the posterior thalamic nucleus with moderate density. The paraventricular nucleus of the thalamus, zona incerta and the parafascicular thalamic nucleus, presented low density. Comparing our results with those described in other animals we can say that the nitric system is an evolutionarily well-conserved neurotransmitter system.
Keywords: Nitric oxide, Rock cavy, Kerodon rupestris, Diencephalon, Nitric oxide
synthase.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Densidade e intensidade dos núcleos imunorreativos a NOS. (pag. 38)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Modelo linear da sequência de reconhecimento de fatores dentro do cDNA
de NOS. Nele temos área para a fosforilase da proteína cinase A (PKAP), ligante de calmodulina (CaM), ligante de flavinas (FMN e FAD) e de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) (Adaptado de Knowles e Moncada, 1994). (pag. 20) Figura 2. Síntese, liberação e terminação do NO (Adaptado de Knowles e Moncada, 1994). (pag. 21) Figura 3. Reação catalisada pela NOS (Retirado de Calabrese et al., 2007). (pag. 22) Figura 4. Esquema dos principais núcleos do tálamo. DL, núcleo dorsal lateral; GL,
núcleo geniculado lateral; GM, núcleo geniculado medial; GNA, grupo nuclear anterior; LP, núcleo lateral posterior; MD, núcleo mediodorsal; P, pulvinar; R, núcleo reticular; VA, núcleo ventral anterior; VL, núcleo ventral lateral; VPL, núcleo ventral posterolateral; VPM, núcleo ventral posteromedial. (Adaptado de Standring, 2010). (pag. 24) Figura 5. Esquema dos principais núcleos e subdivisões do hipotálamo em regiões no encéfalo de rato. ac, comissura anterior; AHA, área hipotalâmica anterior; ArC, núcleo arqueado; DA, área hipotalâmica dorsal; DLPO, área pré-óptica dorsolateral; DMH, núcleo dorsomedial; LHA, área hipotalâmica lateral; MM, núcleo mamilar medial; MnPO, núcleo pré-óptico mediano; MPA, área pré-óptica medial; och, quiasma óptico; PHA, área hipotalâmica posterior; PaV, núcleo paraventricular do hipotálamo; SCh, núcleo supraquiasmático; SO, núcleo supraóptico; RMM, núcleo retromamilar medial; VLPO, núcleo pré-óptico ventrolateral; VMH, núcleo ventromedial. (Adaptado de Saper e Lowell, 2014). (pag. 26) Figura 6. O mocó (Kerodon rupestris) em ambiente natural. (pag. 29) Figura 7. Encéfalo do mocó em vista ventral, lateral e dorsal. Escala de régua em centímetros. (pag. 33) Figura 8. Exemplos das diferentes intensidades de marcação celular das células
marcadas por imunoistoquímica para NOS dentro de cada núcleo. (pag. 37) Figura 9. Exemplos da quantificação subjetiva da densidade das células marcadas por imunoistoquímica para NOS dentro de cada núcleo. (pag. 37) Figura 10. Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó
ilustrando a morfologia e a distribuição dos neurônios NOS-IR do diencéfalo e de fotomicrografias submetidas ao método de coloração de Nissl no nível correspondente. Representação do nível mais rostral em (A) e do nível mais caudal em (M). Ver lista de abreviações. (pag. 42) Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de
mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região pré-
óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-óptico mediano (MnPO). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo septohipotalâmico (SHy). f, fórnice; ac, comissura anterior; 3V, terceiro ventrículo; LV, ventrículo lateral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 48) Figura 12. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de
mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região pré-óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a divisão medial do núcleo pré-óptico medial (MPOM). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a área pré-óptica lateral (LPO). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo supraóptico. (E) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-óptico magnocelular (MCPO). f, fórnice; LV, ventrículo lateral; 3V, terceiro ventrículo; och, quiasma óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C, D e E. (pag. 49) Figura 13. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região anterior com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte parvocelular anterior (PaAP). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte peduncular do hipotálamo lateral (PLH). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo ventrolateral do hipotálamo (VLH). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D. (pag. 50) Figura 14. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região anterior com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a divisão anterior do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHa). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral da área retroquiasmática (RChL). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 51) Figura 15. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de
mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região tuberal com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsomedial do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHdm). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventrolateral do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHvl). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral da área retroquiasmática (RChL). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; EM, eminência mediana. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B ,C e D. (pag. 52) Figura 16. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de
mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região tuberal com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte compacta do núcleo
dorsomedial (DMC). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventral do núcleo dorsomedial (DMV). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte posterior do núcleo ventromedial do hipotálamo (VMHp). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; mt, trato mamilotalâmico; ic, cápsula interna. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 53) Figura 17. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo posterior do hipotálamo (PH). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo premamilar dorsal (PMD). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo premamilar ventral (PMV). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; cp, pedúnculo cerebral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D. (pag. 54) Figura 18. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de
mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo posterior do hipotálamo (PH). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente as partes medial e lateral do núcleo retromamilar (RMM e RML). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral do núcleo mamilar medial (ML). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; cp, pedúnculo cerebral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D. (pag. 55) Figura 19. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de
mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo retromamilar lateral (RML). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo retromamilar medial (RMM). 3V, terceiro ventrículo; cp, pedúnculo cerebral; MM, parte medial do núcleo mamilar medial. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 56) Figura 20. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo geniculado ventral (VG). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte caudal da zona incerta (ZIC). APTD, parte dorsal do núcleo pré-tectal anterior; APTV, parte ventral do núcleo pré-tectal anterior; MHb, núcleo habenular medial; PrC, núcleo pré comissural; opt, trato óptico; ic, cápsula interna. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 58) Figura 21. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior lateral (LPMC). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente
ao núcleo geniculado ventral (VG). bsc, braço do colículo superior MCPC, núcleo magnocelular da comissura posterior; MGV, parte ventral do núcleo geniculado medial; SNR, parte reticulada da substância negra. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C. (pag. 59) Figura 22. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD). csc, comissura do colículo superior; DMPAG, substância cinzenta periaquedutal dorsomedial; Aq, aqueduto; opt, trato óptico; MGV, parte ventral do núcleo geniculado medial; PP, núcleo peripeduncular. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B. (pag. 60) Figura 23. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de
mocó submetidas à histoquimica para NADPH-diaforase (A) e imunoistoquimica para NOS (B). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventrolateral do núcleo ventromedial do hipotálamo (VMHvl). (D) Ampliação de caixa homônima em B com área correspondente ao VMHvl. opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A e B, 100 µm em C e D. (pag. 61) Figura 24. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à histoquimica para NADPH-diaforase. (A) Menor aumento da região pré-óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NADPH-diaforase. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte parvocelular anterior do núcleo paraventricular do hipotálamo (PaAP) (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte peduncular da área hipotalâmica lateral (PLH). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a decussação supraóptica (sox). f, fórnice; opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D. (pag. 62) Figura 25. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à histoquimica para NADPH-diaforase. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NADPH-diaforase. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD). opt, trato óptico; DMPAG, substância cinzenta periaquedutal dorsomedial Aq, aqueduto; csc, comissura do colículo superior . Barra: 500 µm em A, 100 µm em B. (pag. 63)
LISTA DE ABREVIATURAS
AC - comissura anterior
AHA - área hipotalâmica anterior
ARC - núcleo arqueado
AvP - arginina vasopressina
CaM - calmodulina
cGMP - guanosina monofosfato cíclico
CRH - hormônio liberador da corticotrofina
DHA - área hipotalâmica dorsal
DL - núcleo dorsal lateral
DLPO - área pré-óptica dorsolateral
DMC - divisão compacta do núcleo dorsomedial do hipotálamo
DMD - divisão dorsal do núcleo dorsomedial do hipotálamo
DMH - núcleo dorsomedial núcleus
DMV - divisão ventral do núcleo dorsomedial do hipotálamo
EDRF - endothelial-derivated relaxing factor
eNOS - óxido nítrico sintase endotelial
FAD - flavina adenina dinucleotídeo
FMN - flavina mononucleotídeo
GC - guanilato ciclase
GL - núcleo geniculado lateral
GM - núcleo geniculado medial
GNA - grupo nuclear anterior
GnRH - hormônio liberador de gonadotrofina
GTP - guanosina trifosfato
LHA - área hipotalâmica lateral
LHbL - parte lateral do núcleo habenular lateral
LM - núcleo mamilar lateral
LM - núcleos da linha média
LP - núcleo lateral posterior
LPMC - parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior lateral
LPO - área pré-óptica lateral
LTD - long-term depression
LTP - long-term potentiation
macNOS - óxido nítrico sintase dos macrófagos
MAM - núcleo mamilar
MCPO - núcleo pré-óptico magnocelular
MD - núcleo mediodorsal
MGD - parte dorsal do núcleo geniculado medial
MGV - parte ventral do núcleo geniculado medial
ML - divisão lateral do núcleo mamilar medial
MNPO - núcleo pré-óptico mediano
MnPO - núcleo pré-óptico mediano
MPA - área pré-óptica medial
MPO - área pré-óptica medial
MPO - núcleo pré-óptico medial
MPOL - divisão lateral do do núcleo pré-óptico medial
MPOM - divisão medial do núcleo pré-óptico medial
N₂O - óxido nitroso
NADPH - nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NADPHd - NADPH-diaforase
NMDA - N-metil-d-aspartato
nNOS - óxido nítrico sintase neuronal
NO - óxido nítrico
NOS - óxido nítrico sintase
NOS-IR - neurônios imunorreativos para NOS
och - quiasma óptico
P - pulvinar
PaAP - parte parvocelular anterior do núcleo paraventricular do hipotálamo
PaMM - parte parvocelular medial do núcleo paraventricular do hipotálamo
PaV - parte ventral do núcleo paraventricular do hipotálamo
Pe - núcleo periventricular do hipotálamo
PF - núcleo talâmico parafascicular
PH - núcleo posterior do hipotálamo
PHA - área hipotalâmica posterior
PHA - área hipotalâmica posterior
PKAP - fosforilase da proteína cinase A
PLH - área hipotalâmica lateral (parte peduncular)
PMD - núcleo pré-mamilar dorsal
PMV - núcleo pré-mamilar ventral
PV - núcleo paraventricular do hipotálamo
PVA - divisão anterior do núcleo paraventricular do tálamo
PVH - núcleo paraventricular do hipotálamo
PVM - divisão medial do núcleo paraventricular do tálamo
PVP - divisão posterior do núcleo paraventricular do tálamo
PVT - núcleo paraventricular do tálamo
R - núcleo reticular
RChL - área retroquiasmática (parte lateral)
RML - divisão lateral do núcleo retromamilar
RMM - divisão medial do núcleo retromamilar
RMM - núcleo retromamilar medial
SCN - núcleo supraquiasmático
SHy - núcleo septohipotalâmico
SO - núcleo supraóptico
SON - núcleo supraóptico
sox - decussação supraóptica
TMN - núcleo tuberomammilar
TuLH - área hipotalâmica lateral (parte tuberal)
VA - núcleo ventral anterior
VG - núcleo geniculado ventral
VL - núcleo ventral lateral
VLH - núcleo ventrolateral do hipotálamo
VLPO - núcleo pré-óptico ventrolateral
VLPO - núcleo pré-óptico ventrolateral
VMH - núcleo ventromedial
VMH - núcleo ventromedial do hipotálamo
VMHa - divisão anterior do núcleo ventromedial do hipotálamo
VMHc - divisão central do núcleo ventromedial do hipotálamo
VMHdm - divisão dorsomedial do núcleo ventromedial do hipotálamo
VMHvl - divisão ventrolateral do núcleo ventromedial do hipotálamo
VPL - núcleo ventral posterolateral
VPM - núcleo talâmico posterodorsal ventral
ZI - zona incerta
ZIC - parte central da zona incerta
SUMÁRIO
RESUMO........................................................................................................................... 6
ABSTRACT ...................................................................................................................... 7
1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................................19
1.1 Óxido nítrico.........................................................................................................19
1.1.1 Síntese do Óxido Nítrico .............................................................................20
1.1.3 Implicações funcionais ...............................................................................23
1.2 Diencéfalo .............................................................................................................25
1.2.1 Tálamo ............................................................................................................25
1.2.2 Hipotálamo ....................................................................................................26
1.2.3 Subtálamo ...................................................................................................28
1.2.4 Epitálamo ....................................................................................................28
1.3 Modelo experimental ..........................................................................................29
2. OBJETIVOS ................................................................................................................32
2.1 Objetivo Geral ......................................................................................................32
2.2 Objetivos específicos .........................................................................................32
3. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................33
3.1 Sujeitos .................................................................................................................33
3.2 Anestesia ..............................................................................................................33
3.3 Perfusão ................................................................................................................33
3.4 Remoção dos encéfalos ....................................................................................34
3.5 Microtomia ............................................................................................................35
3.6 Método de Nissl ...................................................................................................35
3.7 Imunoistoquímica ...............................................................................................36
3.8 Histoquímica ........................................................................................................36
3.9 Análise e documentação das imagens ...........................................................37
4. RESULTADOS ............................................................................................................39
4.1 Imunoistoquímica ...............................................................................................39
4.1.1 Hipotálamo ....................................................................................................41
Região pré-óptica ....................................................................................................41
Região anterior.........................................................................................................42
Região tuberal ..........................................................................................................46
Região mamilar ........................................................................................................47
4.1.2 Tálamo ............................................................................................................58
4.2 Histoquímica ........................................................................................................62
5. DISCUSSÃO ................................................................................................................65
5.1 O NO nos vertebrados........................................................................................66
5.2 Aspectos neuroanatômicos do diencéfalo do Mocó ....................................67
5.3 Aspectos funcionais do NO no diencéfalo .....................................................71
6. CONCLUSÃO ..............................................................................................................77
REFERÊNCIAS ...............................................................................................................78
ANEXOS ................................................................................ Erro! Indicador não definido.
19
1. INTRODUÇÃO
1.1 Óxido nítrico
O óxido nítrico (NO) é uma molécula muito simples (N=O), gasosa, com
propriedades químicas de um radical livre e frequentemente confundida com o gás
óxido nitroso (N₂O) que é conhecido como gás hilariante e terapeuticamente usado
como anestésico e ansiolítico (Snyder, 1992). Até meados da década de 1980, o NO
era considerado apenas membro de uma família de poluentes ambientais
indesejáveis e carcinógenos potenciais (James, 1995). A descoberta das funções
biológicas do NO foi quase simultânea em três diferentes estudos.
O primeiro estudo constava da investigação do papel do endotélio vascular
no processo de relaxamento do vaso sanguíneo. O interesse por esta questão teve
origem nas conclusões de Furchgott e colaboradores (1980) de que a ação de
alguns vasodilatadores, como a acetilcolina, era inteiramente dependente da
presença do endotélio intacto e envolvia a liberação do então chamado endothelial-
derivated relaxing factor (EDRF) devido a sua ação relaxante vascular, promovendo
vasodilatação pela ativação de guanilato ciclase, portanto produzindo um aumento
de guanosina monofosfato cíclico (cGMP). Cerca de sete anos após a descoberta do
EDRF, estudos detalhados da sua ação biológica nos vasos (Ignarro et al., 1987;
Palmer et al., 1987; Moncada et al., 1988) e nas plaquetas (Radomski et al., 1987)
demonstraram que este composto era idêntico ao NO.
O segundo estudo tratava da questão da produção de óxidos de nitrogênio
pelos mamíferos. Schmidt e Walter (1994) relataram que no início do século XX foi
sugerido que os mamíferos produziam óxidos de nitrogênio, quando se demonstrou
que a quantidade eliminada destes compostos excedia a quantidade ingerida. Esta
observação, entretanto, foi ignorada até o final da década de 1970. Durante todo
este período, acreditou-se que óxidos de nitrogênio inorgânicos eram produzidos
somente por bactérias, via reações de nitrificação e denitrificação, e que em
mamíferos estes compostos derivavam da dieta (Szabó, 1995). Depois de diversos
estudos sobre o tema (Green et al., 1981; Hegesh e Shiloah, 1982; Stuehr e
Marletta, 1985; Hibbs et al., 1987; Snyder e Bredt, 1992), esta hipótese foi
comprovada e ficou demonstrado que o NO é o principal mediador citotóxico de
20
células imunes efetoras ativadas e constitui a mais importante molécula reguladora
do sistema imune (Hibbs et al., 1988; Marletta et al., 1988).
O último estudo estava associado à investigação do mecanismo de ação de
neurotransmissores. Ferrendelli e colaboradores (1974) demonstraram que o
glutamato, um conhecido neurotransmissor, provocava um aumento de cGMP na
parte central do sistema nervoso. Miki e colaboradores (1977) demonstraram a
ativação da guanilato ciclase cerebral pelo NO. Em 1989, foi confirmada a produção
de NO no sistema nervoso (Bredt e Snyder, 1989; Knowles et al., 1989) e
demonstrado que o glutamato é o mediador da liberação de NO por receptores N-
metil-d-aspartato (NMDA) (Garthwaite et al., 1989). No ano seguinte, foi isolada do
cerebelo de rato e purificada uma isoforma da enzima responsável pela formação de
NO, a óxido nítrico sintase (NOS). O desfecho comum desses três estudos fez com
que o NO passasse da condição de molécula sem importância biológica e pouco
estudada para a de um dos mais importantes mediadores de processos intra e
extracelulares.
Apesar de estar presente em neurônios e satisfazer diversos critérios quanto
a sua ação como neurotransmissor, NO está longe de se assemelhar com outros
neurotransmissores. A maioria dos neurotransmissores conhecidos são pequenas
moléculas hidrofílicas, acumuladas, concentradas e transportadas em vesículas,
liberadas na fenda sináptica por exocitose, agem em receptores na membrana pós-
sináptica e são degradadas na fenda e/ou recaptadas para o interior do neurônio ou
glia. NO não obedece nenhum desses fenômenos, ele é uma molécula gasosa de
livre trânsito através da membrana celular, não possui um receptor de membrana,
não é acumulado em vesículas ou está associado com membranas, parecendo ser
amplamente citoplasmático (Knowles e Moncada, 1994). Mas assim como a maioria
dos outros neurotransmissores sua síntese é enzimática.
1.1.1 Síntese do Óxido Nítrico
A NOS converte arginina em citrulina e NO. Existem três tipos de NOS: a
produzida pelos macrófagos (macNOS); a produzida pelas células endoteliais dos
vasos (eNOS); e a neuronal (nNOS), sendo as duas últimas muito semelhantes
(Palmer et al., 1987; Ignarro et al., 1987; Marletta et al., 1988; Garthwaite et al.,
21
1988). Como nos destinamos apenas ao estudo do NO no sistema nervoso
passaremos a nos referir a nNOS apenas como NOS.
Estudos químicos mostraram que NOS é um complexo enzimático que
requer vários co-fatores e para isso existem áreas que reconhecem esse co-fatores
em sua sequência (Fig. 1).
Figura 1. Modelo linear da sequência de reconhecimento de fatores dentro do cDNA de
NOS. Nele temos área para a fosforilase da proteína cinase A (PKAP), ligante de calmodulina (CaM), ligante de flavinas (FMN e FAD) e de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) (Adaptado de Knowles e Moncada, 1994).
Entre estes estão nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH),
flavinas e Ca⁺/calmodulina (Bredt et al., 1991; Mayer, 1995). A síntese de NO
neuronal é estimulada pelo glutamato que é liberado de vesículas do neurônio pré-
sináptico e liga-se aos receptores, principalmente os do tipo NMDA do neurônio pós-
sináptico. Esta ligação abre um canal no receptor permitindo a entrada de Ca²⁺ para
o interior da célula. O aumento na concentração de íons cálcio no neurônio pós-
sináptico gera a ativação da proteína quinase dependente de cálcio, a calmodulina
(CaM) – uma proteína de baixo peso molecular e que age como uma subunidade
para muitas enzimas dependentes de Ca²⁺ (Fig. 2). Esta ativação cria o complexo
Ca²⁺/ calmodulina que se liga a NOS. A síntese de NO ocorre pelo transporte de
elétrons catalisado pela NOS e seus co-fatores, reação essa onde a L-arginina é
convertida em L-citrulina e NO (Fig. 3) (Saavedra, 1997).
Difundindo para o neurônio pré-sináptico, o NO ativa a enzima guanilato
ciclase (GC). GC é um heterodímero de aproximadamente 143kDa de massa
molecular. GC está livre no citoplasma onde converte guanosina trifosfato (GTP) em
cGMP, que é uma importante molécula sinalizadora envolvida em vários eventos
intracelulares (Koesling et al., 1995).
22
Figura 2. Síntese, liberação e terminação do NO (Adaptado de Knowles e Moncada, 1994).
GC possui um domínio ligado a uma molécula de ferro onde NO se liga com
especificidade, removendo a molécula de ferro e ativando-a (Koesling et al., 1995).
Como citado acima GC formará cGMP. cGMP é uma grande família de proteínas
que podem ser basicamente divididas em três: cGMP cinases, cGMP reguladores de
fosfodiesterases e cGMP reguladores de canais de íons. cGMP cinase promove
fosforilação de outras proteínas que podem dar sequência a uma cadeia de
sinalização intracelular ou regular canais de íons; cGMP reguladora de canais de
íons promove a regulação de um canal específico, não seletivo de íons; cGMP
reguladora de fosfodiesterase regula fosfodiesterases, que são importantes em
cadeias intracelulares (Lincoln, 1995).
Por ser uma molécula que atravessa membrana celular, NO naturalmente se
difunde do neurônio em que é produzido para o neurônio pré-sináptico, cuja ativação
de GC leva a liberação de glutamato, realizando a regulação de LTP (long-term
potentiation) (Moncada e Higgs, 1993). A ação do NO é então finalizada com a sua
difusão para outras áreas, onde por reação com oxigênio será convertido em
nitrito/nitrato (Dawson e Snyder, 1994).
23
Figura 3. Reação catalisada pela NOS (Retirado de Calabrese et al., 2007).
Devido ao NO ter uma ação rápida, meia-vida curta e não ter enzima de
degradação, a ação da NOS tem que ser precisa e muito bem regulada. O principal
limitante da ação da NOS, como já citado, é a disponibilidade de arginina e
CA⁺/calmodulina. Porém, a disponibilidade e ação de outros co-fatores são
essenciais para regulação da NOS (Knowles et al., 1989; Tayeh e Marletta, 1989;
Know et al., 1990; Leone et al., 1991).
Estudos têm demonstrado que neurônios nitrégicos e que apresentam
atividade NADPH-diaforase (NADPHd) são os mesmos (Bredt et al., 1991; Dawson
et al., 1991) e que NADPHd agiria como uma NOS (Hope et al., 1991), portanto a
marcação histoquímica de NADPHd é uma excelente ferramenta para o estudo da
distribuição de NO, assim como a imunoistoquímica contra a NOS. Utilizando estas
técnicas foi possível observar que neurônios nitrégicos estão distribuídos por toda a
extensão da parte central do sistema nervoso desde o telencéfalo até a medula
espinal (Bredt et al., 1990; Bredt et al., 1991; Vincent & Kimura, 1992; Vincent,
1995).
1.1.3 Implicações funcionais
Desde sua descoberta no sistema nervoso, NO tem sido implicado em
diversas funções, o que condiz com sua ampla distribuição na parte central do
sistema nervoso. Assim como em macrófagos, NO neuronal também tem uma
função citotóxica (em altas concentrações) ao mesmo tempo que neurônios
24
nitrérgicos são resistentes a isquemia cerebral e doenças neurodegenerativas,
sugerindo assim um papel neuroprotetor ao NO (Varner e Beckman, 1995). Diante
disso, alguns autores como Schmidt e Walter (1994) denominam muito
apropriadamente o NO como uma “faca de dois gumes”.
Como mencionado anteriormente, NO tem um papel fundamental na
elevação dos níveis de cGMP após ativação celular por aminoácidos excitatórios,
principalmente via receptor NMDA (Garthwaite et al., 1988; Snyder, 1992), e isso
tem sido bastante relacionado ao papel de NO na LTP, que é um aumento da
transmissão sináptica que ocorre enquanto neurônios pós-sinápticos experimentam
uma despolarização acoplado com o aumento da atividade pré-sináptica (Kang e
Schuman, 1995).
A LTP foi primeiramente demonstrada por Böhme em um experimento com
camundongos, em que o bloqueio de formação de NO levou à ausência de
condicionamento e de resposta olfatória (Böhme et al., 1991 e 1993). A LTP tem
sido observada em diversas áreas da parte central do sistema nervoso, mas tem
sido estudada mais intensamente no hipocampo onde tem sido relacionada com
mecanismos de aprendizado e memória (Bon e Garthwaite, 2003). NO também tem
sido relacionado a LTD (long-term depression), que é um enfraquecimento
persistente da sinapse (Kang e Schuman, 1995). NO, por ser uma molécula de livre
trânsito através dos neurônios, pode promover uma sinapse retrógrada, ou seja,
dendro-axonal, e esta característica parece fundamental para os fenômenos na
envolvido na LTP e LTD.
O NO parece funcionar como um estimulador geral de neurônios
hipotalâmicos (Costa et al., 1993; Yasin, 1993; Tringali et al., 2006), mas também
como um grande regulador de sua atividade neurosecretora, pois o mesmo está
localizado em neurônios dos núcleos supraóptico e paraventricular do hipotálamo
que produzem o hormônio liberador da corticotrofina (CRH), arginina vasopressina
(AvP) e ocitocina (Stern, 2004; Toni et al., 2003), entre outros neurotransmissores.
Outro papel importante de NO no hipotálamo seria no eixo reprodutivo,
funcionando como regulador central da liberação do hormônio liberador de
gonadotrofina (GnRH) (Brann et al., 1997) e na ereção peniana (Argiolas e Melis,
2005).
25
1.2 Diencéfalo
O diencéfalo corresponde largamente às estruturas que se desenvolvem
inferolateralmente ao terceiro ventrículo. As paredes laterais do diencéfalo formam o
epitálamo mais superiormente, o tálamo centralmente, e o subtálamo e o hipotálamo
mais inferiormente.
1.2.1 Tálamo
O tálamo é constituído, na maioria dos mamíferos, por duas grandes massas
ovoides de tecido nervoso, situando-se na porção laterodorsal do diencéfalo, acima
do sulco hipotalâmico (Fig. 4).
Figura 4. Esquema dos principais núcleos do tálamo. DL, núcleo dorsal lateral; GL, núcleo geniculado lateral; GM, núcleo geniculado medial; GNA, grupo nuclear anterior; LP, núcleo lateral posterior; MD, núcleo mediodorsal; P, pulvinar; R, núcleo reticular; VA, núcleo ventral anterior; VL, núcleo ventral lateral; VPL, núcleo ventral posterolateral; VPM, núcleo talâmico
posterodorsal ventral. (Adaptado de Standring, 2010).
O tálamo é fundamentalmente constituído de substância cinzenta, na qual se
distinguem vários núcleos. Sua superfície dorsal é revestida por uma lâmina de
substância branca, o extrato zonal, que se estende à sua face lateral onde recebe o
nome de lâmina medular externa. O extrato zonal penetra no tálamo formando um
verdadeiro septo, a lâmina medular interna, que o percorre longitudinalmente e que
representa um ponto de referência para a divisão do tálamo em grupos nucleares
(Parent, 1996; Jones, 2007).
26
O tálamo pode ser dividido em quatro porções, a partir da lâmina medular
interna, sendo um grupo nuclear anterior, no polo anterior, um grupo nuclear medial,
localizado medialmente à lâmina medular interna, grupo nuclear ventrolateral e um
grupo nuclear posterior, ambos localizados lateralmente à lâmina medular interna.
Há ainda um grupamento de neurônios localizados intrinsecamente à lâmina
medular interna, os quais são denominados intralaminares (Kandel et al., 2000).
Lateralmente à esta massa ovoide está uma lâmina de substância branca chamada
lâmina medular externa e lateralmente a ela está o núcleo reticular do tálamo,
grupamento mais lateral de neurônios do tálamo (Kandel et al., 2000).
De uma forma geral, os grupos nucleares talâmicos desempenham um
dominante papel na regulação e manutenção do estado de consciência, alerta e
atenção, isso tudo integrado com correlatos emocionais que acompanham as
experiências sensoriais, que chegam massivamente ao tálamo em seu trajeto para
os córtices sensoriais primários. Determinados núcleos talâmicos integram
informações motoras e límbicas através de projeções para os núcleos da base,
cerebelo e estruturas límbicas (Deecke et al., 1973; Schlag-Rey e Schlag, 1984;
Freedman e Cassel, 1991; Bentivoglio et al., 1991; Burk e Mair, 2001; Glimcher e
Lau, 2005). Estudos afirmam também a participação do tálamo em circuitos de
processamento de memória (Aggleton e Brown, 1999; Aggleton et al., 2011;
Hembrook e Mair, 2011).
1.2.2 Hipotálamo
O hipotálamo ocupa a metade ventral do diencéfalo em ambos os lados do
terceiro ventrículo e encontra-se imediatamente acima da glândula pituitária.
Dorsalmente, o hipotálamo é delimitado ao longo de seu comprimento pela zona
incerta e borda medial do pedúnculo cerebral. Caudalmente, o hipotálamo funde-se
com a substância cinzenta periaquedutal e área tegmental ventral do mesencéfalo
(Simerly, 2004).
Anatomicamente podemos dividir o hipotálamo no sentido rostro-caudal em:
região pré-óptica, região anterior (supra-óptica), região tuberal e região mamilar
(Clark, 1938). Crosby e Woodburne (1939) reconheceram que o hipotálamo é
27
dividido em três zonas distintas longitudinais (periventriculares, medial e lateral) e
esta perspectiva é suportada pela fisiologia e análises comportamentais (Swanson,
1987).
O esquema na figura 5 mostra as subdivisões em regiões do hipotalâmico
sugerido por Saper e Lowell (2014).
Figura 5. Esquema dos principais núcleos e subdivisões do hipotálamo em regiões no
encéfalo de rato. ac, comissura anterior; AHA, área hipotalâmica anterior; ArC, núcleo arqueado; DHA, área hipotalâmica dorsal; DLPO, área pré-óptica dorsolateral; DMH, núcleo dorsomedial; LHA, área hipotalâmica lateral; MM, núcleo mamilar medial; MnPO, núcleo pré-óptico mediano; MPA, área pré-óptica medial; och, quiasma óptico; PHA, área hipotalâmica posterior; PaV, núcleo paraventricular do hipotálamo; SCh, núcleo supraquiasmático; SO, núcleo supraóptico; RMM, núcleo retromamilar medial; VLPO, núcleo pré-óptico ventrolateral; VMH, núcleo ventromedial. (Adaptado de Saper e Lowell, 2014).
Esta nomenclatura e esquema organizacional é o mais comumente usado e
em geral é suportado pela neuroquímica e estudos hodológicos. Mas certas
exceções e modificações são sugeridas por dados anatômicos recentes. O
hipotálamo é um centro integrador essencial para a sobrevivência de um organismo
e reprodução de sua espécie. Sistemas de regulação emergiram em cada organismo
adaptado ao seu ambiente e evoluíram para controle das interações complexas da
fisiologia e comportamento (Swanson, 2000).
28
A diversidade na função reguladora do hipotálamo é refletida em sua
estrutura, neuroquímica e conexões. Quase todas as principais subdivisões da parte
central do sistema nervoso se comunicam com o hipotálamo e estão sujeito à sua
influência. Além disso, o hipotálamo comunica-se com sistemas de órgãos
periféricos, convertendo informação sináptica em sinais hormonais transmitidos pelo
sangue. Por sua vez, o hipotálamo responde ao feedback dos sistemas periféricos
que regula (Squire et al., 2008).
Resumindo, o hipotálamo é conhecido como o centro integrativo de sistemas
neurais responsáveis pela manutenção de funções homeostáticas como o equilíbrio
eletrolítico, controle da ingestão de alimentos, consumo hídrico, metabolismo
energético, reprodução, regulação térmica e controle de estados emocionais,
regulação do ciclo sono-vigília e controle da secreção hormonal pela glândula
hipófise. O hipotálamo atua também como centro integrador entre as vias simpáticas
e parassimpáticas (Parent, 1996; Swanson, 1987).
1.2.3 Subtálamo
O subtálamo é uma complexa região de grupos nucleares e tratos de fibras
localizado no diencéfalo, ventralmente ao tálamo e dorsolateral ao hipotálamo. A sua
estrutura mais proeminente é o núcleo subtalâmico. O subtálamo é formado por
esse, pelo núcleo reticular, pela zona incerta, os campos de Forel e pelo núcleo pré-
geniculado. O subtálamo apresenta conexões eferentes para o estriado (núcleo
caudado e putamen) no telencéfalo, para o tálamo dorsal (grupos nucleares lateral e
medial) no diencéfalo, e para a substância negra e núcleo rubro do mesencéfalo. Ele
recebe aferentes da substância negra e estriado (Carpenter, 1991).
1.2.4 Epitálamo
O epitálamo é um segmento posterior do diencéfalo. O epitálamo
compreende o trígono das habênulas, a glândula pineal e comissura habenular. Ele
está ligado com o sistema límbico e os núcleos da base e algumas funções de seus
componentes incluem a secreção de melatonina pela glândula pineal (envolvida nos
ritmos circadiano) a regulação de vias motoras e emocionais (Carpenter, 1991).
29
1.3 Modelo experimental
O mocó (Kerodon rupestris) é um roedor encontrado nos estados do
Nordeste do Brasil e norte de Minas Gerais, habitando preferencialmente a caatinga
do semi-árido do Nordeste Brasileiro (Cabrera, 1961; Lacher Jr, 1981).
Taxonomicamente pode ser classificado como membro da superfamília
Cavioidea, família Caviidea, subfamília Caviinae, gênero Kerodon, juntamente com
os gêneros Cavia, Galea e Microcavia (Moojen, 1952; Cabrera, 1961; Lacher Jr,
1981). A este grupo pertencem pequenos animais já reconhecidamente domésticos,
como porquinho da índia (Cavia porcellus), os que vivem em pequenas colônias
feitas em buracos na terra ou usam cavidades nas bordas das rochas. Possuem
hábitos gregários e diurnos (Crandall, 1964). A família Caviinae apresenta animais
adaptáveis a diversos tipos de ambientes, podendo ser arborícolas, rupícolas e
terrícolas; costumam ser herbívoros em consequência de sua dentição ser
desprovida de caninos (Moojen, 1952).
O mocó é um animal que habita locais rochosos com diversas fendas onde
se abriga dos predadores e passam boa parte do tempo. São facilmente adaptáveis
às condições ecológicas locais como calor, escassez de água e de alimentos,
especialmente nos períodos de grandes secas do semi-árido nordestino. Extraem
sua alimentação de galhos de árvores e rochas, principalmente por serem
excelentes saltadores e escaladores. Tal alimentação é constituída de cascas de
árvores e gramíneas em geral, sendo as árvores mais procuradas o mufumbo
(Cobretum leprosum), faveleira (Cnidoscolus phyllacanthus) e a parreira brava
(Cissampelos parreira) (De Melo Carvalho, 1969; Lacher Jr, 1981; Mendes, 1985;
1987). Em cativeiro aceitam bem frutas (maçã, banana, melão, melancia, manga) e
raízes.
Apresenta coloração cinza clara com pelos pretos e amarelos ou
esbranquiçados na região dorsal, castanho ferruginoso na região caudal, um pouco
acastanhado nas patas e branco na cervical (Fig. 6). Suas patas possuem coxins
calosos pouco excedidos pelas unhas rígidas que lhes proporciona a habilidade de
saltar e escalar (Moojen, 1952). Seu olfato e audição são bastante aguçados,
detectando seu predador a longas distâncias (De Melo Carvalho, 1969). Atingem a
30
fase adulta aos 200 dias, podendo alcançar até 50 cm de comprimento e 1 quilo de
peso corporal (Moojen, 1952; De Melo Carvalho, 1969; Roberts et al., 1984).
A reprodução ocorre durante todo o ano, com exceção do período que vai de
abril a junho. Dentre os cavinnaes, o Kerodon possui a gestação mais longa (65
±1,34 dias), a menor média de tamanho da prole (1,28±0,09), o mais baixo peso de
filhotes e o mais longo tempo de maturidade sexual (Roberts et al., 1984). Apesar
das poucas crias por parto, o curto período de gestacional garante uma elevada
produção de crias durante o ano (Lacker Jr, 1981).
Figura 6. O mocó (Kerodon rupestris) em ambiente natural.
Com relação ao seu padrão de atividade locomotora, tem sido relatado que
nos dias mais escuros o mocó sai para se alimentar pela manhã e à tarde, enquanto
nos dias mais claros sua atividade se concentra no período noturno (De Melo
Carvalho, 1969). Estudos realizados por Sousa e Menezes (2006) elucidaram que
embora o mocó apresente atividade ao longo de 24 horas, os períodos de transição
de fases claro-escuro são os de maior concentração de atividade, sugerindo,
portanto, comportamento predominantemente crepuscular.
Nesse sentido, em consequência das singularidades morfofuncionais e
hábitos comportamentais do mocó em relação a outros animais da ordem Rodentia é
31
que este animal vem sendo adotado como modelo para estudos neuroanatômicos
do Laboratório de Neuroanatomia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
– UFRN.
Considerando a importância de estudar os sistemas neurais do ponto de vista
comparativo-evolutivo e do papel do NO em funções diencefálicas, achamos
interessante ampliar o conhecimento acerca da distribuição de NO no diencéfalo de
mamíferos e pra isto lançamos mão do estudo em mocó, um roedor da fauna local
com características comportamentais próprias e interessantes.
32
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Descrever de forma indireta a distribuição de óxido nítrico no diencéfalo do
mocó.
2.2 Objetivos específicos
Descrever a distribuição de NOS no diencéfalo do mocó;
Descrever a distribuição de NADPH-diaforase no diencéfalo de mocó;
Caracterizar qualitativamente o nível de marcação dos neurônios nitrérgicos e
a densidade destes neurônios nos diversos núcleos diencefálicos.
33
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Sujeitos
Foram utilizados sete mocós adultos jovens (quatro machos e três fêmeas)
obtidos através de captura no município de Jucurutu (RN), mediante autorização do
IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis,
SISBIO no. 42960-3). O processo de captura se realizou a partir do uso de
armadilhas e/ou contenção química (ketamina + xilazina) a fim de reduzir o estresse
causado ao animal. Os animais foram mantidos na fazenda Samisa, no município de
Extremoz-RN.
É importante ressaltar que os animais utilizados nesse projeto foram os
mesmos de outro projeto em andamento no laboratório, previamente aprovado pelo
comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA), voltado para o mapeamento
neuroquímico deste animal sobre o protocolo 004/2004.
3.2 Anestesia
Os sete animais utilizados neste trabalho foram anestesiados com ketamina
e xilazina via intramuscular na dosagem de 20mg/kg e 2mg/kg respectivamente.
3.3 Perfusão
Ao atingir o plano anestésico, cada animal foi submetido à perfusão
transcardíaca, que compreende os seguintes passos:
1. Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame sob ponto
de água.
2. Toracotomia, com incisão de pele, músculos e arco costal, sendo estes
removidos em bloco, para exposição do coração.
3. Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha de 17 mm x 1,5
mm, a qual é direcionada para a aorta, seguindo-se uma incisão no átrio
direito. A agulha é conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer),
34
passando-se 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4
com heparina (Parinex, Hipolabor, 2ml/1000 ml de solução salina), seguido de
700 ml de solução paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7.4.
3.4 Remoção dos encéfalos
Após concluída a perfusão, os animais foram posicionados no aparelho
estereotáxico para roedores. Depois de fazer uma incisão longitudinal na pele e
rebatê-la lateralmente, foi feita a limpeza da superfície óssea, facilitando a
visualização do bregma e do lambda, os quais foram nivelados na mesma altura,
ajustando-se a barra dos incisivos, padronizando assim o plano de corte coronal
para todos os animais. Após anotação das coordenadas do bregma e lambda, o
osso da calota craniana foi removido com o uso de uma broca expondo-se o
encéfalo. Ainda no aparelho estereotáxico, o encéfalo foi seccionado em três blocos,
através de duas secções coronais: uma no nível do bregma e outra no nível do
lambda. Os encéfalos foram retirados delicadamente para evitar danos (Fig. 7). Logo
após, os três blocos foram armazenados em uma solução de sacarose a 30% em
tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 a 4°C, até serem submetidos a microtomia.
Figura 7. Encéfalo do mocó em vista dorsal, lateral e ventral. Escala de régua em centímetros.
35
3.5 Microtomia
Terminada a etapa de pós-fixação e imersão em tampão sacarose 30%, os
encéfalos foram submetidos à microtomia cuja espessura dos cortes foi padronizada
em 30 µm. Os encéfalos foram congelados por gelo seco e seccionados em
micrótomo de deslizamento, obtendo-se secções coronais. Estas foram coletadas
em um meio líquido de tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 distribuídas sequencialmente
em 6 compartimentos, de maneira cíclica e sequenciada, de modo a manter a
distância de aproximadamente 180 µm entre uma secção e a outra imediatamente
seguinte de um mesmo compartimento. Os cortes de um compartimento foram
imediatamente montados em lâminas de vidro gelatinizadas e submetidas à
coloração pelo método de Nissl para permitir uma melhor demarcação das
estruturas. Os cortes dos demais compartimentos foram transferidos para solução
anticongelante e conservados a -20°C para utilização.
3.6 Método de Nissl
A coloração pelo método de Nissl é constituída por uma série de etapas que
se iniciam com a desidratação do tecido passando-o em concentrações crescentes
de álcoois etílicos (70% - 1 vez, por 1h, 95% - 2 vezes, 3 minutos cada, 100% - 2
vezes, 3 minutos cada). Posteriormente são deslipidificados em dois recipientes com
xilol, por 3 e 30 minutos, nessa ordem. Na sequência, o tecido é reidratado em
concentrações decrescentes de álcoois (mesmo processo anterior, mas no sentido
inverso), submergido em água destilada por 2 minutos, colocado 1 minuto na
solução thionina a 0,25%. Por fim os cortes foram rapidamente submergidos e
emergidos por 1 minuto em água destilada e novamente desidratados e
deslipidificados como descrito anteriormente, sendo acrescentada apenas uma
etapa (antes da desidratação em álcool 100%). Os cortes foram deslipidificados em
xilol em dois recipientes (2 e 4 minutos, respectivamente) e finalmente cobertos com
lamínula utilizando como meio de montagem o ERV-Mount.
36
3.7 Imunoistoquímica
A técnica consistiu de uma imunoperoxidase padrão pelo método ABC,
onde, após quatro lavagens com duração de dez minutos cada em tampão fosfato
0,1M (PB), pH 7,4, os cortes free floating foram submetidos a um pré-tratamento
com uma solução de peróxido de hidrogênio a 0,03% em PB 0,1M durante 20
minutos em agitador orbital para inativação da peroxidase endógena. Após mais
quatro lavagens de dez minutos, os cortes então foram incubados em tampão
fosfato contendo tampão Triton X-100 a 0,4% (TXPB) com anticorpo primário anti-
nNOS feito em camundongo (1:1000, Sigma) e soro normal de cabra a 2% (Jackson
Laboratories) permanecendo em incubação por 16 a 24 horas em agitador orbital.
No dia seguinte, os cortes foram lavados em PB, por quatro vezes, e incubados em
anticorpo secundário biotilinado anti-camundongo feito em cabra (Jackson
Laboratories) diluído a 1:1000 e TXPB por 2 horas em agitador orbital. Os cortes
foram novamente lavados em PB e incubados em solução avidina-biotina-
peroxidase (kit ABC, Vector, 1:100) diluídos em TXPB a 0,4% contendo NaCl por
noventa minutos. Em seguida, os cortes foram lavados e para a visualização da
reação, as secções foram postas em meio contendo PB e H2O2 0,03% como
substrato e o cromógeno diaminobenzidina (DAB) 0,05% por aproximadamente 10
minutos. A reação foi parada com lavagens em PB em agitador orbital. Os cortes
finalmente foram montados em lâminas gelatinizadas, mergulhados em tetróxido de
ósmio 0,05% para intensificar a reação, desidratadas em uma sequência crescente
de álcoois e deslipidicados em xilol e cobertos com ERV-Mount e lamínula.
3.8 Histoquímica
Foi utilizado o método histoquímico para marcação de NADPH-diaforase.
Esse processo iniciou-se diluindo 45 mg de azul de nitrotetrazólio em 1,5 ml de
dimetil sulfóxido, formando a solução I. Em seguida acrescentou-se 900 mg de ácido
málico em um béquer contendo 150 ml de tampão TRIS 0,05M, ajustando o pH da
solução resultante para 8,0. Após o ajuste do pH foi acrescentado 150 mg do
composto β-NADP e 60 mg de cloreto de manganês, formando a solução II. Após a
37
homogeinização desta última, as duas soluções foram misturadas, acrescentando
em seguida 4,5 ml de Triton-X100. Uma vez que a solução resultante é fotossensível
ela foi sempre protegida da luz. As secções foram imersas nessa solução e
colocadas para reagir sob agitação manual constante a 39°C em banho maria e
protegidos da luz. A duração tem uma alta variabilidade que depende da
temperatura e da iluminação passando aproximadamente quatro horas em reação.
No entanto passado um período de 90 minutos foi observado em microscópio óptico
o grau de marcação em intervalos de 10 minutos. Após a reação foi feito 3 lavagens
sucessivas em PB de 3 minutos cada e por fim as lâminas foram cobertas com
lamínula usando ERV-Mount.
3.9 Análise e documentação das imagens
As secções do diencéfalo, coradas pelo método de Nissl e as submetidas à
imunoistoquímica e histoquímica foram examinadas e mapeadas ao microscópio
óptico (Nikon Eclipse Ci-L) em campo claro. Imagens digitais foram obtidas de
secções representativas usando uma videocâmera digital (Nikon DS-Ri1). As
imagens foram corrigidas minimamente para brilho e contraste e documentadas em
fotomicrografias e esquemas construídos utilizando Canvas (versão 12.0; ACD
Systems of America, Inc.; 2010).
Para a análise referente a densidade e intensidade de marcação dos
neurônios imunorreativos a NOS foram usados até o momento valores subjetivos
como mostrado nas figuras 8 e 9. Foram construídos esquemas no Canvas tendo
por base os cortes submetidos a técnica de Nissl e o atlas de Paxinos e Watson
(2007) de rato, Paxinos e colaboradores de sagui (2012) e Paxinos e Franklin (2008)
de camundongo.
38
Figura 8. Exemplos das diferentes intensidades de marcação celular das células marcadas
por imunoistoquímica para NOS dentro de cada núcleo.
Figura 9. Exemplos da quantificação subjetiva da densidade das células marcadas por
imunoistoquímica para NOS dentro de cada núcleo.
39
4. RESULTADOS
No presente estudo a imunoistoquímica para NOS e a histoquímica para a
NADPH-diaforase foram utilizadas. Encontramos neurônios imunorreativos para
NOS (NOS-IR) e coloração NADPH-diaforase (NADPHd) ao longo de todo
diencéfalo. A imunoistoquímica apresentou uma coloração castanha bem definida
onde neurônios NOS-IR apresentaram uma marcação que definiu bem o citoplasma,
enquanto que a NADPHd apresentou uma coloração azul com graus de intensidade
que variaram dependendo da atividade da enzima.
A descrição da distribuição de neurônios nitrérgicos será baseada na
imunoistoquímica e está listada na Tabela 1.
4.1 Imunoistoquímica
No sentido rostrocaudal, os neurônios corados no diencéfalo do mocó
apareceram desde a região pré-óptica até o nível do núcleo geniculado medial. O
padrão de distribuição dos neurônios marcados pelas técnicas de imunoistoquímica
foi bastante semelhantes entre os diferentes animais.
Tabela 1. Densidade e intensidade dos núcleos imunorreativos a NOS.
Núcleos e Regiões Densidade das células
Intensidade da
marcação
HIPOTÁLAMO
Região pré-óptica
Núcleo septohipotalâmico (SHy) +++ ++
Núcleo pré-óptico mediano (MnPO) +++ ++
Área pré-óptica lateral (LPO) ++ +++
Área pré-óptica medial (MPA) + ++
Núcleo pré-óptico magnocelular (MCPO) ++ ++
Núcleo pré-óptico medial (parte medial) (MPOM) ++ +
Núcleo pré-óptico medial (parte lateral) (MPOL) +/- +
Região anterior
Núcleo supraóptico (SO) +++ ++/+++
40
Decussação supraóptica (sox) +++ +++
Núcleo paraventricular do hipotálamo (PV)
- Parte parvocelular anterior (PaAP) ++ ++
- Parte ventral (PaV) +++ ++
- Parte parvocelular medial (PaMP) ++ ++
Núcleo periventricular do hipotálamo (Pe) +/- +++
Núcleo ventrolateral do hipotálamo (VLH) ++ ++
Área hipotalâmica lateral (parte peduncular) (PLH) ++ ++
Área retroquiasmática (parte lateral) (RChL) +++ ++/+++
Região tuberal
Área hipotalâmica lateral (parte tuberal) (TuLH) + ++
Núcleo ventromedial do hipotálamo (VMH)
- Divisão anterior (VMHa) + +
- Divisão ventrolateral (VMHvl) +++ ++
- Divisão dorsomedial (VMHdm) ++ +
Núcleo dorsomedial do hipotálamo
- Divisão dorsal (DMD) ++ +
- Divisão compacta (DMC) ++ +/++
- Divisão ventral (DMV) ++ +/++
Área hipotalâmica dorsal (DA) + +
Região mamilar
Núcleo pré-mamilar ventral (PMV) +++ ++
Núcleo pré-mamilar dorsal (PMD) +++ ++
Núcleo posterior do hipotálamo (PH) ++ ++
Núcleo retromamilar
- Divisão lateral (RML) +++ ++
- Divisão medial (RMM) +++ ++
Núcleo mamilar medial (divisão lateral) (ML) +++ +
Núcleo mamilar lateral (LM) +++ ++
Área hipotalâmica posterior (PHA) +++ ++
TÁLAMO
Núcleo paraventricular do tálamo (PVT) + +
41
Zona incerta (ZI) + +
Parte lateral do núcleo habenular lateral (LHbL) ++ ++
Núcleo talâmico parafascicular (PF) + ++
Núcleo talâmico posterodorsal ventral (VPM) ++ ++
Núcleo geniculado ventral (VG) +++ +++
Parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior lateral (LPMC) ++ ++
Parte dorsal do núcleo geniculado medial ++ +++
Regiões marcadas com NOS-IR. Nível da densidade dos neurônios nos núcleos: +++ Alta, ++ Moderada, + Baixa +/- Muito baixa; e da intensidade da marcação: +++ Forte, ++ Média, + Fraca (Baseado em observações subjetivas da densidade e intensidade de neurônios corados pelos métodos de imunoistoquímica em cada núcleo. Ver figura 8 e 9).
4.1.1 Hipotálamo
O hipotálamo apresentou células NOS-IR desde a sua região pré-óptica até
a região mamilar. Descrevemos a distribuição das células marcadas no hipotálamo
por regiões segundo Clark (1938).
Região pré-óptica
Os primeiros neurônios NOS-IR no diencéfalo do mocó apareceram
formando um grupamento situado entre o núcleo septal lateral e medial, e
inferiormente ao núcleo septal paralambdóide. Pela localização e relações,
identificamos esse grupamento como o núcleo septohipotalâmico (SHy), o qual se
estende caudamente até o nível da lâmina terminal, início da entrada do fórnice no
hipotálamo e fim da comissura anterior (Fig. 10 A; 11 A e C). Os neurônios NOS-IR
foram encontrados em toda a extensão desse núcleo, porém sua porção anterior
apresentou um número menor de células coradas. Tais células apresentaram
densidade alta e média marcação.
Neurônios NOS-IR também estavam presentes em outras regiões nesse
mesmo nível. O núcleo pré-óptico mediano (MnPO) apresentou células NOS-IR com
intensidade de marcação média em toda sua extensão, sendo menos numerosas na
porção anterior, diferente das demais que apresentaram densidade alta. O MnPO foi
42
bem delimitado pelo fórnice, comissura anterior e pelas células levemente mais
claras do SHy, laterais a ele em sua porção mais caudal (Fig. 10 A; 11 A e B).
Algumas fibras começaram a surgir na área pré-óptica lateral (LPO) e alguns
neurônios na área pré-óptica medial (MPA). Com exceção das porções mais rostrais
que apresentaram fibras e alguns neurônios NOS-IR corados fracamente, a LPO
apresentou uma densidade moderada de neurônios NOS-IR e com marcação forte
(Fig. 10 A e B; 12 A e C). A MPA apresentou neurônios NOS-IR com baixa
densidade e coloração média (Fig. 10 A e B).
O núcleo pré-óptico magnocelular (MCPO) apresentou células com
coloração média e densidade moderada em toda a extensão do núcleo, estando
medialmente à área amígdalóide anterior (Fig. 10 A e B; 12 A e E).
O núcleo pré-óptico medial (MPO) apresentou células NOS-IR em sua
divisão medial (MPOM) e lateral (MPOL) tendo uma densidade moderada para a
MPOM e muito baixa para a MPOL, ambos com células fracamente marcadas (Fig.
10 A e B; 12 A e B). Ambas subdivisões do MPO estiveram presentes nos mesmos
níveis do núcleo da banda diagonal de Broca e do núcleo supraquiasmático que não
apresentou células NOS-IR.
Região anterior
O núcleo supraóptico (SO) se destacou na expressão de NOS dentro do
hipotálamo, apresentando neurônios NOS-IR em toda sua extensão, com densidade
de células alta e intensidade da marcação de média a alta (Fig. 10 A-C; 12 A e D).
Esse núcleo foi bem delimitado pelo núcleo pré-óptico ventrolateral (VLPO) que não
apresentou células NOS-IR, e este delimitado por alguns neurônios NOS-IR corados
da MPA. A decussação supraóptica (sox) apresentou neurônios NOS-IR com
densidade alta e marcação forte (Fig. 10 C).
No núcleo paraventricular do hipotálamo (PV), neurônios NOS-IR estiveram
presentes em algumas de suas subdivisões, porém com diferentes densidades. Os
níveis rostrais que correspondem a parte parvocelular anterior (PaAP) apresentaram
marcação média e densidade moderada de neurônios NOS-IR (Fig.10 B e C; 13 A e
B). Os primeiros neurônios NOS-IR com maior densidade foram os neurônios da
parte ventral (PaV) desse núcleo, e assim permaneceu até as porções mais caudais
43
(Fig. 10 D). A parte parvocelular medial (PaMP) apresentou neurônios NOS-IR com
densidade moderada e intensidade da marcação média (Fig. 10 E).
Figura 10. Reconstrução esquemática das secções coronais do encéfalo do mocó ilustrando
a morfologia e a distribuição dos neurônios NOS-IR do diencéfalo e de fotomicrografias de cortes submetidos ao método de coloração de Nissl no nível correspondente. Representação do nível mais rostral em (A) e do nível mais caudal em (M) com distância de 360 µm entre cada imagem. Ver lista de abreviações.
44
Figura 10. Continuação.
45
Figura 10. Continuação.
46
Figura 10. Continuação.
Alguns neurônios estiveram presentes próximo às paredes laterais do
terceiro ventrículo, estes fazem parte da divisão parvocelular periventricular do PV
que é contínua com o núcleo periventricular (Pe) adjacente ao PV, e que apresentou
neurônios com intensidade da marcação alta (Fig. 10 A; 14 A e B).
Um núcleo bem pequeno entre duas regiões com neurônios NOS-IR (núcleo
da banda diagonal de Broca e a parte peduncular do hipotálamo lateral) apresentou
densidade moderada e intensidade da marcação média, trata-se do núcleo
ventrolateral do hipotálamo (VLH) (Fig. 10 C; 13 A e D).
Já o hipotálamo lateral apresentou neurônios NOS-IR em suas partes
peduncular (PLH) e tuberal. O PLH (Fig. 10 C-H; 13 A e C) apresentou neurônios
NOS-IR com marcação média distribuídos em toda sua extensão com densidade
baixa por ser uma área extensa. Porém, seus neurônios eram visto agrupados em
regiões especificas, como por exemplo laterais ao fórnice. A parte lateral da área
retroquiasmática (RChL) apresentou células NOS-IR com densidade alta e
intensidade da marcação de média a alta (Fig. 10 D-G; 14 A e C; 15 A e D).
Região tuberal
A parte tuberal da área hipotalâmica lateral (TuLH; Fig. 10 D) apresentou
densidade baixa, com coloração média de seus neurônios. O núcleo ventromedial do
47
hipotálamo apresentou células NOS-IR com coloração fraca na divisão anterior
(VMHa; Fig. 10 D; 14 A e B), onde ainda não está subdivido nas suas partes
ventrolateral (VMHvl), central (VMHc) e dorsomedial (VMHdm). O VHMdm
apresentou densidade moderada e padrão de coloração fraca. Já o VMHvl
apresentou neurônios NOS-IR com densidade alta e intensidade da marcação média
(Fig. 10 E e F; 15 A-C). A porção posterior desse núcleo (VMHp) apresentou uma
neurópila intensa, delimitando bem o núcleo (Fig. 16 A e D). Nenhum neurônio NOS-
IR foi encontrado no VHMc.
O núcleo dorsomedial do hipotálamo apresentou células NOS-IR nas sua
subdivisões dorsal (DMD), compacta (DMC) e ventral (DMV). O DMD apresentou
densidade moderada na sua porção anterior, nas demais, densidade baixa e
marcação fraca (Fig. 10 F). Ao contrário, o DMC e o DMV apresentaram densidade
moderada e neurônios com intensidade fraca da marcação, porém com alguns
neurônios com intensidade média (Fig. 16 A-C).
A área hipotalâmica dorsal (DA) apresentou alguns neurônios NOS-IR com
densidade baixa e marcação fraca (Fig. 10 F).
Região mamilar
No núcleo pré-mamilar ventral (PMV) uma neurópila intensa demarcou o
núcleo que apresentou densidade alta e intensidade da marcação citoplasmática
média (Fig. 10 G; 17 A e D). O mesmo valor para intensidade da marcação e
desidade vai para o pré-mamilar dorsal (PMD) que também apresentou uma
neurópila que delimitou o núcleo (Fig. 17 A e C). O núcleo posterior do hipotálamo
(PH) apresentou neurônios NOS-IR nas suas porções mais posteriores, com uma
neurópila intensa na sua borda ventral. Seus neurônios marcados apresentaram
densidade moderada e intensidade da marcação média (Fig. 10 G e H; 17 e 18 A e
B).
O núcleo retromamilar apresentou neurônios NOS-IR com intensidade da
marcação média nas suas divisões lateral (RML) e medial (RMM), sendo a RML com
uma densidade alta de neurônios NOS-IR em toda sua extensão, ao contrário da
RMM que apresentou uma densidade pequena na sua porção rostral e densidade
alta na sua porção caudal (Fig. 10 H e I; 18 A e C; 19 A-C). O núcleo mamilar medial
48
apresentou células NOS-IR com intensidade da coloração fraca e densidade alta na
sua divisão lateral (ML) (Fig. 10 H-J; 18 A e D). O núcleo mamilar lateral (LM)
apresentou neurônios NOS-IR com densidade alta e intensidade da marcação média
(Fig. 10 H e I). Ambos ML e LM não apresenta neurônios NOS-IR em suas porções
posteriores (Fig. 10 I e J).
A área hipotalâmica posterior (PHA) apresentou neurônios NOS-IR
concentrados medialmente, onde apresentou densidade alta e marcação moderada
(Fig. 10 I).
49
Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região pré-óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-óptico mediano (MnPO). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo septohipotalâmico (SHy). f, fórnice; ac, comissura anterior; 3V, terceiro ventrículo; LV, ventrículo lateral. Barra em C correspondente a 500 µm em A, 100 µm em B e C.
50
Figura 12. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó
submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região pré-óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a divisão medial do núcleo pré-óptico medial (MPOM). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a área pré-óptica lateral (LPO). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo supraóptico. (E) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-óptico magnocelular (MCPO). f, fórnice; LV, ventrículo lateral; 3V, terceiro ventrículo; och, quiasma óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C, D e E.
51
Figura 13. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região anterior com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A
com área correspondente a parte parvocelular anterior (PaAP). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte peduncular do hipotálamo lateral (PLH). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo ventrolateral do hipotálamo (VLH). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; opt, trato óptico. Barra em D correspondente a 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.
52
Figura 14. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó
submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região anterior com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a divisão anterior do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHa). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral da área retroquiasmática (RChL). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; opt, trato óptico. Barra em C correspondente a 500 µm em A, 100 µm em B e C.
53
Figura 15. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região tuberal com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsomedial do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHdm). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventrolateral do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMHvl). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral da área retroquiasmática (RChL). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; EM, eminência mediana. Barra em D correspondente a 500 µm em A, 100 µm em B ,C e D.
54
Figura 16. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região tuberal com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte compacta do núcleo dorsomedial (DMC). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventral do núcleo dorsomedial (DMV). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte posterior do núcleo ventromedial do hipotálamo (VMHp). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; mt, trato mamilotalâmico; ic, cápsula interna. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.
55
Figura 17. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo posterior do hipotálamo (PH). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-mamilar dorsal (PMD). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo pré-mamilar ventral (PMV). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; cp, pedúnculo cerebral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.
56
Figura 18. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo posterior do hipotálamo (PH). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente as partes medial e lateral do núcleo retromamilar (RMM e RML). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte lateral do núcleo mamilar medial (ML). 3V, terceiro ventrículo; f, fórnice; cp, pedúnculo cerebral. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.
57
Figura 19. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó
submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento da região mamilar com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo retromamilar lateral (RML). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo retromamilar medial (RMM). 3V, terceiro ventrículo; cp, pedúnculo cerebral; MM, parte medial do núcleo mamilar medial. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.
58
4.1.2 Tálamo
No tálamo, os primeiros neurônios NOS-IR surgiram em sua porção
dorsomedial, no núcleo paraventricular do tálamo (PVT), na sua porção anterior
(PVA), media (PVM) e posterior (PVP) (Fig. 10 C-H). Esse núcleo e suas subdivisões
apresentaram uma densidade baixa, visto que poucos neurônios foram visíveis
dentro de sua borda, estes apresentaram uma marcação fraca. O mesmo aconteceu
com a zona incerta (ZI) e sua subdivisão caudal (ZIC) (Fig. 10 E-H; Fig. 20 A e C).
A habênula apresentou neurônios NOS-IR na porção lateral do núcleo
habenulal lateral (LHbL), estes com densidade moderada e intensidade da marcação
média (Fig. 10 J). O núcleo talâmico parafascicular (PF) apresentou um pequeno
número de neurônios NOS-IR com marcação média (Fig. 10 I).
Na região lateral, encontramos neurônios NOS-IR no núcleo talâmico
posterodorsal ventral (VPM), que foi muito bem delimitado por suas fibras. Ele
apresentou densidade moderada e intensidade da marcação média em toda sua
extensão (Fig. 10 H e I). Lateral ao VPM, uma densidade alta de neurônios NOS-IR
esteve presente na divisão ventral do núcleo geniculado lateral (VG) (Fig. 10 H-J;
Fig. 20 e 21 A e C). Estes estiveram presentes em suas 3 camadas e apresentaram
uma intensidade de marcação alta, com neurópila contornando a borda lateral (Fig.
20 A e B).
A parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior lateral (LPMC) apresentou
neurônios NOS-IR com densidade moderada e média marcação (Fig. 10. K e L; Fig.
21 A e B).
E finalmente, os últimos neurônios NOS-IR encontrados no diencéfalo foram
os da parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD), que apresentou densidade
moderada de neurônios fortemente marcados (Fig. 10 K-M; Fig. 22 A e B), sendo
que alguns neurônios estiveram presentes espalhados na parte ventral do
geniculado medial (MGV) (Fig. 10 M).
59
Figura 20. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó
submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo geniculado ventral (VG). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte caudal da zona incerta (ZIC). APTD, parte dorsal do núcleo pré-tectal anterior; APTV, parte ventral do núcleo pré-tectal anterior; MHb, núcleo habenular medial; PrC, núcleo pré comissural; opt, trato óptico; ic, cápsula interna. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.
60
Figura 21. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó
submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte mediocaudal do núcleo talâmico posterior lateral (LPMC). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente ao núcleo geniculado ventral (VG). bsc, braço do colículo superior MCPC, núcleo magnocelular da comissura posterior; MGV, parte ventral do núcleo geniculado medial; SNR, parte reticulada da substância negra. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B e C.
61
Figura 22. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó
submetidas à imunoistoquimica para NOS. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NOS-IR. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD). csc, comissura do colículo superior; DMPAG, substância cinzenta periaquedutal dorsomedial; Aq, aqueduto; opt, trato óptico; MGV, parte ventral do núcleo geniculado medial; PP, núcleo peripeduncular. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B.
62
4.2 Histoquímica
A histoquímica para NAPDH-diaforase no diencéfalo apresentou uma
coloração azul característica da técnica. No entanto, nem sempre os neurônios
ficaram visíveis. O que pudemos observar foi que áreas e núcleos cujos neurônios
estiveram mais intensamente marcados pela imunoistoquímica contra NOS foram as
que os neurônios foram melhor marcados também pela NADPHd e puderam ser
observados, como mostram as figuras 23, 24 e 25, enquanto que áreas com
marcações mais fracas tenderam a ter uma marcação apenas residual pela técnica
de NADPHd.
Figura 23. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó
submetidas à imunoistoquímica para NOS (A) e histoquímica para NADPHd (B). (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte ventrolateral do núcleo ventromedial do hipotálamo (VMHvl). (D) Ampliação de caixa homônima em B com área correspondente ao VMHvl. opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A e B, 100 µm em C e D.
63
Figura 24. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó
submetidas à histoquímica para NADPH-diaforase. (A) Menor aumento da região pré-óptica com alguns núcleos apresentando neurônios NADPH-diaforase. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte parvocelular anterior do núcleo paraventricular do hipotálamo (PaAP) (C) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte peduncular da área hipotalâmica lateral (PLH). (D) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a decussação supraóptica (sox). f, fórnice; opt, trato óptico. Barra: 500 µm em A, 100 µm em B, C e D.
64
Figura 25. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de mocó
submetidas à histoquímica para NADPH-diaforase. (A) Menor aumento do tálamo com alguns núcleos apresentando neurônios NADPH-diaforase. (B) Ampliação de caixa homônima em A com área correspondente a parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD). opt, trato óptico; DMPAG, substância cinzenta periaquedutal dorsomedial Aq, aqueduto; csc, comissura do colículo superior . Barra: 500 µm em A, 100 µm em B.
65
4. DISCUSSÃO
O NO é um mensageiro molecular responsável pelo controle de uma grande
variedade de funções biológicas, que abrange da vasodilatação a mecanismos de
aprendizado e memória. Visto de uma perspectiva mecanicista, o NO não está de
acordo com muitas das regras que regem a neurotransmissão mais convencional,
em particular do tipo metabotrópica. Mas se destaca dos demais neurotransmissores
por ser mais econômico e versátil, atributos que, presumivelmente, são responsáveis
por seu sucesso evolutivo, sendo muito bem conservado entre as espécies.
Salvo alguns núcleos como o supraquiasmático, folheto intergeniculado e a
zona incerta que já foram descritos em outros trabalhos do nosso grupo de pesquisa
(Nascimento et al., 2010; de Góis Morais et al., 2014), a distribuição da NOS ou
NADPH no diencéfalo do mocó, um roedor típico da região Nordeste do Brasil ainda
não havia sido investigada, o que confere relevância e ineditismo aos nossos
resultados.
A imunoistoquímica contra NOS mostrou neurônios marcados em todo o
diencéfalo, especialmente no hipotálamo que apresentou um alto número de núcleos
nitrérgicos. Já a histoquímica para a NADPH não apresentou marcação em todos os
núcleos descritos na imunoistoquímica. Isso possivelmente aconteceu pois, segundo
a evidência de Hope e colaboradores (1991), a marcação histoquímica para
NADPHd só marca neurônios que contêm atividade NADPHd naquele momento,
enquanto que a imunoistoquímica revela todos os neurónios que contêm NOS,
independente de estarem sendo ou não sintetizados. Além disto, foi demostrado por
Matsumoto e colaboradores (1993), através de um estudo usando tecidos frescos de
oito diferentes regiões do cérebro de ratos, que durante a fixação a atividade da
NADPHd é reduzida ou pode ser inativada. Sendo assim, nem todos os neurônios
NOS-IR mostram atividade NADPHd em tecido fixado.
Pudemos evidenciar no presente estudo que a intensidade da marcação
histoquímica está diretamente relacionada com a imunoistoquímica, ou seja, os
núcleos com neurônios com mais forte marcação para NOS foram os que
apresentaram melhor marcação para NADPHd. Portanto, alguns neurônios podem
ter falhado na marcação histoquímica por não conter atividade atividade NADPHd no
momento da perfusão. Contudo, em alguns casos pudemos evidenciar uma
66
coloração azulada (característica da histoquímica para NADPHd) mais forte em
certos núcleos que tem neurônios NOS-IR. No entanto, estas marcações não foram
fortes suficientemente para delimitar os o citoplasma neuronal.
5.1 O NO nos vertebrados
O NO está presente nos vertebrados desde peixes até mamíferos,
parecendo ser bem conservado entre essas classes.
Em peixes, encontramos estudos da distribuição do NO no encéfalo da tenca
(Tinca tinca) (Arévalo et al., 1995), peixe-japonês (Carassius auratus) (Bruning et al.,
1995; Villani e Guarnieri, 1995), espada (Xiphophorus hellerii) (Anken and Rahmann,
1995) e paulistinha (Danio rerio) (Holmqvist et al., 2000). Outros estudos tratam da
distribuição do NO em áreas mais restritas do encéfalo, como no diencéfalo da truta-
arco-íris (Oncorhynchus mykiss) (Schober et al., 1993).
Estudos em anfíbios mostram a distribuição do NO no encéfalo da rã verde
(Rana perezi) (Muñoz et al., 1996), rã-de-unhas-africana (Xenopus laevis) (Bruning e
Mayer, 1996) e na salamandra-dos-poços (Pleurodeles waltl) (González et al., 1996)
e em répteis como a tartaruga-do-ouvido-vermelho (Pseudemys scripta elegans)
(Bruning et al., 1994), lagartixa-tokay (Gekko gecko) (Smeets et al., 1997) e a cobra
habu (Trimeresurus flavoviridis) (Jiang e Terashima, 1996).
Nas aves, estudos com a galinha doméstica (Gallus gallus) (Bruning, 1993),
codorna japonesa (Coturnix japonica) (Panzica et al., 1994), periquito (Melopsittacus
undulatus) (Cozzi et al., 1996) e no mandarim (Taeniopygia guttata) (Wallhãusser-
Franke et al., 1995) demonstram a distribuição do NO no encéfalo dessa classe.
E nos mamíferos, o NO apresentou-se presente no diencéfalo do nosso
modelo animal conforme demonstrado em outros animais na literatura, estando de
acordo com roedores (Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994; Ng et al., 1999;
Gotti et al., 2005), gato (Mizukawa et al., 1989), primatas não-humanos (Gerlach et
al., 1995) e humanos (Sangruchi e Kowall, 1991; Egberongbe et al., 1994).
67
5.2 Aspectos neuroanatômicos do diencéfalo do Mocó
O hipotálamo é uma das menores e filogeneticamente melhor conservada
partes do cérebro. Porém, esta pequena área contém um circuito altamente
conservado entre as espécies que controla funções básicas da vida, e o óxido nítrico
está envolvindo em muitos desses mecanismos.
Na região pré-óptica, encontramos neurônios NOS-IR nos núcleos:
septohipotalâmico, pré-óptico mediano, pré-óptico magnocelular e medial, e as áreas
pré-óptica lateral e medial. Sendo que destes os núcleos septohipotalâmico e o
núcleo pré-óptico mediano apresentaram maior densidade de células NOS-IR.
Em sentido rostrocaudal os primeiros neurônios NOS-IR no diencéfalo
surgiram no SHy, assim como descreve alguns estudos com ratos (Vincent e
Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994). Esses neurônios surgiram formando um
grupamento situado entre o núcleo septal lateral e medial, e inferiormente ao núcleo
septal paralambdóide.
No MnPO de mocó, células NOS-IR formaram um aglomerado que se
estendeu ao longo da porção superior da comissura anterior e da borda superior do
terceiro ventrículo, sendo contornado superiormente pelo fórnice e inferiomente pelo
núcleo septohipotalâmico, formando uma pequena área triangular, corroborando
trabalhos prévios (Simerly, 2004; Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994;
Yamada et al., 1996) no hipotálamo de ratos. Assim como no camundongo (Gotti et
al., 2005), o MnPO do mocó apresentou marcação média de suas células.
A LPO do mocó apresenta algumas fibras com alguns neurônios NOS-IR
que foram aumentando em número conforme o núcleo seguia no sentido posterior,
onde classificamos uma densidade moderada dos neurônios que apresentaram
marcação forte. Para Rodrigo e colaboradores (1994) estes neurônios estiveram
presentes na LPO de ratos de forma dispersa. Vincent e Kimura (1992) encontraram
apenas fibras espessas, tanto na LPO como na MPA de ratos e Gotti e
colaboradores (2005) encontraram na LPO de camundongos algumas fibras e vários
neurônios nitrérgicos.
A MPA de camundongos apresentou muitos neurônios fracamente marcados
(Gotti et al., 2005), mas em ratos apenas alguns neurônios (Rodrigo et al., 1994). No
68
mocó, classificamos a densidade desses neurônios como baixa e a marcação
média.
O MCPO do mocó apresenta neurônios NOS-IR com coloração média e
densidade moderada em toda a extensão do núcleo. O MPO apresentou células
NOS-IR em sua divisão medial (MPOM) com densidade moderada e na divisão
lateral (MPOL) com densidade muito baixa, ambos com coloração fraca de suas
células. Estudos com roedores descrevem a presença de neurônios nitrérgicos no
MCPO e no MPO de ratos (Rodrigo et al., 1994; Yamada et al., 1996) e no MPO de
camundongos (Ng et al., 1999).
Na região anterior, os núcleos que apresentaram o maior número de
neurônios NOS-IR foram os núcleos supraóptico (SO), paraventricular do hipotálamo
(PV) e a parte lateral da área retroquiasmática (RChL).
O SO, formado por células magnocelulares, está presente no mocó nas
bordas laterais do quiasma óptico e assim permane até os primeiros níveis do trato
óptico. Estão presente neurônios NOS-IR em toda sua extensão, sendo este bem
delimitado pelo núcleo pré-óptico ventrolateral que não apresentou células NOS-IR.
Ng e colaboradores (1999) descrevem os neurônios NOS-IR do SO de
camundongos como estando dispostos em cachos de células, semelhante ao que foi
visto no mocó. Gotti e colaboradores (2005) descrevem os neurônios NOS-IR do SO
do camundongo com marcação média. Dentro do SO de mocó vimos que cerca de
metade dos neurônios nitrérgicos foram intensamente corados, enquanto os outros
exibiram apenas uma fraca reação. Este fato também foi relatado por Vincent e
Kimura (1992) e por Yamada e colaboradores (1996) em seus estudos com ratos.
Já o PV de mocó apresenta neurônios NOS-IR na parte ventral parvocelular,
parte parvocelular anterior e medial. Todas suas subdivisões foram bem delimitadas
pelos neurônios NOS-IR. Os neurônios NOS-IR do PV do mocó se apresentou mais
semelhante aos do camundongo do estudo de Gotti e colaboradores (2005), com
células mais dispersas e marcação média, diferente do rato que apresentou
densidade e intensidade elevadas (Yamada et al., 1996; Ng et al., 1999).
A RChL apresentou células NOS-IR com densidade alta conforme descreve
Rodrigo e colaboradores (1994). Ng e colaboradores (1999) não encontraram
neurônios NOS-IR no RChL em seu estudo com ratos e camundongos. Os demais
neurônios NOS-IR que encontramos na região anterior do hipotálamo foram a
69
decussação supraóptica, onde Vincent e Kimura (1992) encontraram um número alto
de fibras em ratos, o núcleo periventricular do hipotálamo descrito em vários estudos
com roedores (Leigh et al., 1990; Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994; Gotti
et al., 2005), o núcleo ventrolateral do hipotálamo e na parte peduncular da área
hipotalâmica lateral também descrito em diversos trabalhos com roedores (Leigh et
al., 1990; Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994; Yamada et al., 1996; Ng et
al., 1999; Gotti et al., 2005).
Na região tuberal de mocó, neurônios NOS-IR estão presentes
principalmente na divisão ventrolateral do núcleo ventromedial do hipotálamo.
Também esteve presente em mocó neurônios nitrérgicos na parte tuberal da área
hipotalâmica lateral (Leigh et al., 1990; Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994;
Yamada et al., 1996; Ng et al., 1999; Gotti et al., 2005), no núcleo dorsomedial
(Vincent e Kimura, 1992; Yamada et al., 1996) e na área hipotalâmica posterior
(Vincent e Kimura, 1992; Yamada et al., 1996; Gotti et al., 2005).
Citoarquitetonicamente o VMH do mocó se apresentou muito semelhante
ao do camundongo, rato e sagui, como todas as suas divisões como está descrito
nos atlas utilizados para comparação (Paxinos e Watson, 2007; Paxinos et al., 2012;
Paxinos e Franklin, 2008). Um número considerável de fibras foi visto no VMHa e
alguns neurônios NOS-IR foram encontrados entre estas fibras nervosas no estudo
de Ng e colaboradores (1999) usando rato e camundongo e Vincent e Kimura (1992)
com ratos. O mesmo aconteceu com o mocó não apenas no VMHa como também
no VMHp. O VMHvl de mocó apresentou neurônios NOS-IR com densidade alta e
intensidade da marcação média, assim como descreve Vincent e Kimura (1992) em
rato. O VHMdm apresentou densidade moderada e padrão de coloração fraca.
Alguns estudos mostram a presença de neurônios nitrérgicos no VMH, sem
descrever suas subdivisões (Yamada et al., 1999; Iwaze et al., 1998; Gotti et al.,
2005), e Rodrigo e colaboradores (1994) não encontraram neurônios NOS-IR no
VMHdm.
A região mamilar apresentou os maiores valores de densidade de neurônios
NOS-IR. As marcações para NO delimitaram bem os núcleos pré-mamilar ventral
(PMV) e dorsal (PMD) de mocó, o que está de acordo com a maior parte da
bibliografia (Leigh et al., 1990; Vincent e Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994; Yamada
et al., 1996). No entanto, Yamada e colaboradores (1996) descrevem o PMV de
70
ratos com densidade moderada e marcação fraca. Estão presente no mocó
neurônios nitrérgicos ainda na divisão lateral e medial do núcleo retromamilar, na
divisão lateral do núcleo mamilar medial, no núcleo mamilar lateral e na área
hipotalâmica posterior, o que condiz com diversos estudos com roedores (Vincent e
Kimura, 1992; Rodrigo et al., 1994; Yamada et al., 1996; Iwaze et al., 1998; Ng et al.,
1999; Gotti et al., 2005).
No tálamo, os primeiros neurônios NOS-IR surgiram em sua porção
dorsomedial, nas porções anterior, média e posterior do núcleo paraventricular do
tálamo (PVT). Este núcleo e suas subdivisões apresentaram uma densidade baixa,
visto que poucos neurônios foram visíveis dentro de suas bordas e estes
apresentaram uma marcação fraca. Para Rodrigo e colaboradores (1994), em seu
estudo com ratos, estes neurônios estiveram mais presentes na porção anterior, já
Vincent e Kimura (1992) descrevem uma maior quantidade de neurônios NOS-IR na
porção posterior do PVT de ratos. Iwaze e colaboradores (1998) encontraram no
rato um rico número de células nesse núcleo, e Gotti e colaboradores (2005)
encontraram no camundongo apenas alguns neurônios fracamente corados.
A zona incerta (ZI) apresentou no mocó um número pequeno de neurônios
NOS-IR em sua subdivisão caudal (ZIC), com marcação de fraca a média. Rodrigo e
colaboradores (1994) descrevem em ratos uma rede de fibras imunorreativas na
parte ventral desse núcleo. Leigh e colaboradores (1990) encontraram na ZI de ratos
um grupo de células com coloração intensa, já no trabalho de Vincent e Kimura
(1992) também com ratos essas células eram levemente coradas.
Na habênula do mocó, neurônios NOS-IR estiveram presentes apenas na
porção lateral do núcleo habenulal lateral (LHbL), estes com densidade moderada e
intensidade da marcação média. Vincent e Kimura (1992) descreve a LHbL de ratos
com um plexo denso de fibras finas, fortemente corados, e Gotti e colaboradores
(2005), descrevem apenas poucos neurônios levemente corados em camundongos.
O núcleo talâmico parafascicular (PF) apresentou um pequeno número de
neurônios NOS-IR com marcação média. Vincent e Kimura (1992) descrevem no
rato fibras densas nesse núcleo. Rodrigo e colaboradores (1994) também
encontraram neurônios NOS-IR no PF de ratos.
Ainda no tálamo do mocó, neurônios NOS-IR estiveram presentes no núcleo
talâmico posterodorsal ventral (VPM) e na parte mediocaudal do núcleo talâmico
71
posterior lateral (LPMC), o que corrobora com os estudos de Vincent e Kimura
(1992) e Rodrigo e colaboradores (1994) em ratos.
O núcleo geniculado ventral (VG) é um núcleo visual do tálamo que recebe
projeções direta da retina (Hickey e Spear, 1976) e do córtex visual (Pasquier e
Villar, 1982; Brauer et al., 1983). Este núcleo, junto com o núcleo geniculado lateral
dorsal e o folheto intergeniculado (FIG) formam o complexo geniculado lateral. No
mocó, o VG apresenta uma densidade alta de neurônios NOS-IR, com intensidade
de marcação alta e neurópila contornando a borda lateral. O trabalho de Vincent e
Kimura (1992) mostra o VG de ratos com muitas células fortemente coradas e uma
neurópila densa fortemente corada. Trabalho prévio de nosso grupo, ao investigar a
presença de NOS no sistema de temporização circadiana verificou que não há
neurônios NOS-IR no FIG, mas mostrou claramente neurônios NOS-IR no VG
(Nascimento et al., 2010), corroborando os dados do atual trabalho.
A parte dorsal do núcleo geniculado medial (MGD) apresentou uma rede de
fibras com neurônios NOS-IR assim como descreve Vincent e Kimura (1992) em
ratos e Gotti e colaboradores (2005) em camundongos. Outros trabalhos de
distribuição também descrevem a presença do NO no MGD (Leigh et al., 1990;
Rodrigo et al., 1994).
A maioria dos estudos de distribuição do NO no encéfalo trazem as técnicas
imunoistoquímicas e histoquímicas para NADPHd. Porém, Iwaze e colaboradores
(1998) investigaram a distribuição do RNAm de NOS no encéfalo de ratos por
hibridização in situ, e, segundo descrevem seus resultados, a distribuição desses
neurônios foi semelhante aos demais estudos. Logo, foi semelhante com a
distribuição presente no mocó.
4.3 Aspectos funcionais do NO no diencéfalo
Para ajudar na compreensão das funções biológicas de NO, fontes
exógenas doadoras e inibidoras deste neurotransmissor têm sido desenvolvidas
como ferramentas de pesquisa. Então, antes de discutir a funcionalidade do NO, faz-
se necessário entender um pouco sobre o tema, visto que este é predominante na
maioria dos estudos que serão discutidos adiante.
72
Para aumentar os níveis de NO, compostos doadores são usados e vários já
foram descritos, como por exemplo o nitroprussiato de sódio (SNP), um fármaco
vasoativo. Quimicamente, todos os doadores têm a funcionalidade nitrato na
molécula e um grupo funcional nitroso está presente em todos estes compostos
(Yamamoto 2000).
Além de doadores, a produção endógena de NO pode ser controlada pelo
uso de inibidores da NOS. Estes inibidores funcionam como falsos substratos
através de sua ligação no local de ligação da L-arginina (Bryk e Wolff 1999). Uma
centena de inibidores de NOS foram descritos como possíveis ferramentas
farmacológicas (Moore e Handy, 1997), mas a N(Omega)-nitro-L-arginina metil éster
(L-NAME) é o inibidor de NOS não seletivo mais utilizado nesses estudos. Sendo
assim, muitos estudos usando doadores e inibidores foram realizados para
investigar a ação do NO no encéfalo.
O MnPO é conhecido por desempenhar um papel crítico em circuitos neurais
que controlam as respostas cardiovasculares e a homeostase dos fluidos (Saper e
Levisohn, 1983; Saper, 2003). Ele envia amplas projeções para o PV e grupos de
células magnocelulares, bem como para o núcleo dorsomedial do hipotálamo (Gu e
Simerly, 1997; Thompson e Swanson, 1998). Saad e colaboradores (2003)
investigaram o efeito do inibidor L-NAME e do doador SNP nas alterações induzidas
por pilocarpina no fluxo salivar, pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca
(FC) em ratos adultos. A pilocarpina é um agonista colinérgico muscarínico que
induz vasodilatação e salivação copiosa quando administrado sistemicamente
através da ativação do sistema parassimpático (Baum, 1987; Garret et al., 1991;
Ferguson, 1993). Eles implantaram uma cânula no MnPO e injetaram pilocarpina em
doses crescentes. Com isso eles viram que a pilocarpina injetada no MnPO induziu
um aumento na secreção salivar e na PAM, e diminuição da FC. A injeção de L-
NAME antes da pilocarpina no MnPO ou via intraperitoneal (IP) também aumentou a
secreção salivar e a PAM, e diminuiu a FC. As mesmas injeções utilizando SNP
antes da pilocarpina provocaram um efeito contrário na secreção salivar e na PAM.
Já via IP, a pilocarpina promove uma diminuição da PAM e um aumento da FC.
Conclui-se com esse estudo que no rato, o NO presente no MnPO atua no
mecanismo do fluxo salivar e que ele interfere com os efeitos colaterais da
pilocarpina na PAM e FC. Logo, pela presença de neurônios NOS-IR no MnPO do
73
mocó, hipotetizamos que nosso modelo animal apresenta a mesma função do NO
no MnPO que está presente em ratos.
Os neurônios NOS-IR do SO e o PV ganham destaque na região anterior do
hipotálamo. O NO participa da modulação neuroendócrina da liberação de
vasopressina e ocitocina, dois hormônios sintetizados principalmente nesses
núcleos (Du Vigneaud, 1953; George e Jacobowitz, 1975; Cunningham e
Sawchenko, 1991). Os estímulos mais potentes para liberação desses hormônios
são aumento de osmolaridade plasmática, hipotensão e hipovolemia (Dunn et al.,
1973; Cunningham e Sawchenko 1991) e estudos de co-localização têm
demonstrado que uma proporção de neurônios magnocelulares no PV e SO que
contém NOS também expressam os peptídeos vasopressina (Calka e Block, 1993) e
ocitocina (Miyagawa et al., 1994). A ocitocina é um hormônio muito importante no
parto e na ejeção de leite, e usado como indutor dos mesmos (Tortora e Grabowski,
2010; Lent, 2001).
Okere e colaboradores (1996) demonstraram que a injeção subcutânea ou
intracerebroventricular (icv) do doador de NO SNP em ratas no final da gravidez e
parturientes provocou o prolongamento do tempo total do parto e a inibição da
expressão do comportamento maternal. E que mesmo a injeção central de ocitocina
não conseguiu reduzir o tempo de parto provocada pela injeção de SNP, mas o
comportamento materno foi restaurado (Okere et al., 1996a). Estas observações
sugerem que o NO afeta o parto e a iniciação do comportamento materno, através
da interferência na liberação de ocitocina dentro do cérebro. O mesmo foi visto para
a ejeção do leite onde filhotes de ratas que receberam injeções crônicas de SNP
apresentaram um baixo peso corporal quando comparados aos filhotes das mães
que receberam solução salina ou L-arginina (Okere et al., 1996b e 1999).
A partir de registros eletrofisiológicos da atividade de neurônios do SO in
vitro usando o inibidor da NO L-NAME, Liu e colaboradores (1997) viram um
aumento na frequência de disparos desses neurônios. Nesse mesmo trabalho
também foi utilizado o SNP e foi percebida uma queda na frequência de disparos
dos neurônios do SO demonstrando assim um efeito inibitório do NO na atividade
desses neurônios. No entanto, existem alguns trabalhos na literatura que mostram o
contrário, ou seja, que o NO atua na liberação de vasopressina e ocitocina, como o
estudo de Ota e colaboradores (1993), onde eles sugerem que o NO pode agir
74
centralmente para estimular a liberação de vasopressina. Eles concluiram isso a
partir de seu estudo onde foi utilizado uma injeção icv do doador de NO S-Nitroso-N-
Acetilpenicilamina (SNAP) em ratos conscientes, que promoveu o aumento de
vasopressima no plasma desses animais. Outro estudo semelhante a este foi o de
Cao e colaboradores (1996), que utilizaram L-arginina, o precursor de NO, e L-
NAME, administrados via icv em ratos anestesiados com pentobarbital. Seus
resultados mostram que a concentração plasmática de vasopressina aumentou após
a injeção de L-arginina e diminuiu após a administração com L-NAME, mostrando
assim um efeito excitatório do NO na liberação de vasopressina.
Injeção de ocitocina no PV de ratos machos induz tanto ereção peniana
quanto bocejo (Argiolas, 1994; Argiolas e Melis, 1994 e 1998; Melis e Argiolas,
1997), o mesmo acontece com a injeção dos doadores de NO SNP, SNAP,
hidroxilamina e nitrito de isoamila no PV (Melis e Argiolas, 1995), e tratamento com
bloqueadores dos receptores de ocitocina pode eliminar os efeitos de doadores de
NO nesses comportamentos (Melis et al., 1999). Por fim, os agonistas da dopamina
e do NMDA (receptor de glutamato) induzem a ereção peniana e bocejo, agindo
sobre os receptores D2 que aumentam a atividade da NOS nos corpos celulares dos
neurônios do PV projetando para áreas extra-hipotalâmicas do cérebro (Melis et al.,
1994 e 1996).
Apesar da controvérsia entre alguns estudos, fica claro que NO tem um
papel nas funções endócrinas, fisiológicas e comportamentais dos núcleos SO e PV,
o que especulamos que também possa acontecer em mocó. Por exemplo, por ser
um animal que habita o semi-árido e enfrenta períodos longos de seca e escassez
de água, provavelmente a vasopressina tem um papel muito importante no controle
do balanço hídrico do mocó. Talvez até maior que em roedores que habitam
ambiente com menor excassez de água. Outro ponto importante é a ausência de NO
em neurônios magnocelulares do PV de mocó. Mocó é um roedor com baixa taxa de
reprodução e isto pode ser influenciado pela ausência de NO em neurônios
ocitocinérgicos.
Na região tuberal de mocó, neurônios NOS-IR estiveram presentes
principalmente no VMHvl. Já faz muito tempo que o VMH vem sendo descrito como
um grande "centro" de reações afetivas (Wheatley, 1944, Zwischenhirn, 1949),
funções hormonais (Sawyer, 1960) e comportamento alimentar (Hetherington e
75
Ranson, 1942). O VMHvl desempenha um papel na lordose, comportamento sexual
de ratas em resposta a estimulação sexual (Kow e Pfaff, 1998), e esse
comportamento pode ser modulado pelo NO. Mani e colaboradores (1994) viram que
a injeção icv de NG-monometil-L-arginina impede a lordose facilitada por
progesterona injetada também via icv. Já a injeção icv de SNP facilita o
comportamento de lordose em ratas. E lordose facilitada por progesterona ou SNP
foi bloqueada por injeção icv do anti-soro de LHRH. Esses resultados mostram que a
progesterona provoca a liberação de NO, o que estimula a libertação de LHRH, que
facilita a lordose. Assim, os resultados indicam que o NO induz a liberação de
LHRH, e que, em seguida, o LHRH desempenha um papel crucial na mediação do
comportamento sexual em ratas. Este efeito pode ser mediado pela produção de
cGMP, porque bloqueadores de cGMP também suprimem o comportamento de
lordose (Chu e Etgen, 1996, 1997). Até hoje nenhum estudo do comportamento
sexual em mocó foi publicado, no entanto podemos especular que neurônios NO no
VMH de mocó deve estar envolvido neste tipo de comportamento, como está em
outros roedores.
Ceccatelli e colaboradores (1996) investigaram o papel do estrogênio na
produção do RNAm de NOS por hibridização in situ. A análise quantitativa mostrou
um aumento em RNAm da NOS no VMH de ratas ovariectomizadas tratadas com
benzoato de estradiol durante 7 dias. O aumento foi principalmente no VMHvl. Esses
dados sugerem que a expressão de RNAm de NOS no VMH pode ser regulada pelo
estrogênio. Além disso, mais de 70% dos neurônios nitrérgicos do VMH contém
receptores para estrogênio (Okamura et al., 1994). Esses dados evidenciam um
relação anatômica entre estrogênio e a NOS no VMH, sugerindo que a atividade da
NOS pode ser modulada pelo estradiol em neurônios sensíveis a estrogênio. Logo, a
NOS está presente em áreas relevantes para o comportamento da lordose e é
modulado por níveis de esteróides ovarianos circulantes (Rachman et al., 1996,
1998), sugerindo um papel relevante de NO no comportamento sexual feminino, que
pode estar presente no mocó, visto a presença de neurônios NOS-IR no VMH.
A região mamilar apresentou a maior densidade de neurônios NOS-IR,
sendo que destes abrimos destaque ao PMV. Neurônios no PMV expressam um
grande número de receptores de esteróides sexuais e mantem conexões recíprocas
com áreas relacionadas com a reprodução, responsivas à feromônios e que são
76
sexualmente dimórficas (Simerly et al., 1990; Canteras et al., 1992; Cavalcante et
al., 2006; 2014; Leshan et al., 2009). Os feromônios tem acesso ao encéfalo através
do órgão vomeronasal que envia a informação olfativa para o bulbo olfatório
acessório, de onde será retransmitido para o núcleo medial da amígdala. Por fim, a
informação chega a núcleos hipotalâmicos, como o VMH e o PMV (Scalia e Winans,
1975; Canteras et al., 1995; Halpern e Martinez-Marcos, 2003). Donato e
colaboradores (2010) expuseram ratos machos sexualmente inexperientes a odores
de ratas e ratos, e avaliaram a atividade da proteína Fos (um indicador de atividade
neuronal) em neurônios que expressam NO no PMV. Os odores provocaram
expressão de Fos em neurônios NADPHd do PMV. Além disso, viu-se que esses
neurônios co-expressam o neurotransmissor chamado Transcrito Regulado pela
Cocaína e Anfetamina (CART). Logo, eles concluem que no PMV, neurônios
NADPHd/CART respondem a odores masculinos e femininos, sugerindo um papel
na regulação neuroendócrina e comportamental em resposta a estímulos olfativos.
Pela efusiva presença de neurônios nitrérgicos no PMV do mocó, hipotetizamos que
estes neurônios sejam importantes na resposta a odores de co-específicos de
ambos os sexos, assim como se apresenta em ratos.
No tálamo de mocó, especialmente no complexo geniculado lateral,
neurônios NOS-IR estiveram presentes apenas no VG (presente trabalho;
Nascimento Jr et al., 2010). Nos demais roedores, neurônios NOS-IR foram
descritos no VG e no núcleo geniculado lateral dorsal (DLG) (Vincent e Kimura,
1992; Rodrigo et al., 1994; Iwaze et al., 1998; Gotti et al., 2005). Sugere-se que o
VG esteja envolvido com o reflexo pupilar, detecção de cores, modulação dos ritmos
circadianos e integração visuomotora devido a uma grande entrada retiniana
elusivando estas funções visuais. Há também uma segunda possibilidade para as
conexões, como a do VG estar conectado ao colículo superior, pretecto, núcleo
óptico acessório, cerebelo e complexo vestibular (Jones, 2007). Meng e
colaboradores (1998) observaram que 96% dos neurônios nitrérgicos do VG
projetam para o núcleo pretectal ipsilateral o que sugere que esse núcleo é o
principal alvo dos neurônios nitrérgicos do VG de ratos. Hipotetizamos que os
neurônios NOS-IR encontrados no VG possam estar atuando no sistema visual. A
ausência de neurônios NOS-IR no DLG nos faz pensar que o NO no mocó tenha um
papel menor na função visual quando comparado com outros roedores.
77
5. CONCLUSÃO
A distribuição de NO no diencéfalo de mocó é bem semelhantes às
distribuições previamente descritas em outros roedores, mostrando que há uma
conservação deste sistema pelo menos em parte do sistema nervoso de mamíferos.
Isto também aponta para uma conservação da funcionalidade deste sistema,
indicando que em mocó NO tem funções importantes e diversas como tem em
outros animais estudados até o momento. Concluímos também que a atividade
NADPHd e o nível de imunorreatividade são diretamente proporcionais em mocó e
que a técnica de NADPHd não é a ideal para um estudo de mapeamento de
neurônios nitrérgicos em mocó.
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