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DIVERSIDAD GENÉTICA DE ESPECIES
FORESTALES:DE LOS ESTUDIOS DE PROCEDENCIAS A
UNA APROXIMACIÓN GENÓMICA EN PINOSIBÉRICOS
M.T. Cervera, Genética Forestal (INIA)
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Pinus longaeva
Prunus avium
Angiospermas
50 a.
100 a.
150 a.
250 a.
1.000 a.
1.500 a.
3.500 a.
5.000 a.
Sequoia gigantea
HOMBRE
Taxus bacata
Gimnospermas
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ADAPTACIÓN acambios medioambientales
factores bióticos y abióticosalternancia estacional
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árbolescalentamiento
misma escala temporal
Cambio climático
Cambio climático y vida de las especies forestales
Temperatura (°C)
Años
(Hughes, 2000)
• Incremento de Temperatura°• Diferencias marcadas entre estaciones• Incremento de tormentas • Alteraciones pluviométricas
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Las coníferas, especies modelo en genómica deorganismos alógamos
• Débil estructura genética poblacional y elevadonúmero efectivo de individuos
• Bajo nivel de domesticación y alta diversidadgenética dentro de individuos
• Fácil identificación de haplotipos (presencia de tejido haploide, el megagametófito, en la semilla)
• Algunas especies se pueden propagarvegetativamente incrementando la precisión dela evaluación fenotípica
• Amplio rango de distribución y existencia de interacción genotipo-ambiente (según muestranlos ensayos de campo multi-localidad)
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Pinus pinaster
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Desarrollo de herramientas moleculares
(Geada-López et al. 2002. Int J Plant Sci 163: 737 -747)
1. Transferencia
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Transferencia de microsatélites nucleares de P. taeda, P. sylvestris y P. radiata
Colaboración con Texas A&M University (USA) & ForestResearch (NZ) / INRA-Cestas (FR)Estudios comparativos entre coníferas36% to 42% (González-Martínez, Robledo-Arnuncio et al. TAG, 109:
103-111)54% (Chagné et al. TAG, in press)
cDNA-SSRs (librerías ESTs de P. pinaster y P. taeda )Colaboración con INRA-CestasEstudio del comportamiento frente a nc-SSRs65% to 87% (Chagné et al. TAG, in press)
(CA)n >10CACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTMicrosatélites (SSRs)
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Consorcio Internacional “Maritime Pine Microsatellite Consortium”>100 SSRsmapas saturados con marcadores co-dominantesselección (comparativo: mapeo / diversidad)
Poster: M.A. Guevara, D. Chagné, C. Collada, A. Soto de Viana, A. Ramboer, G. Vendramin, C. Plomion, Cervera MT
Obtención rápida de nSSRs combinando AFLPs con enriquecimiento basado en primers biotinilados
(CA)n >10CACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTMicrosatélites (SSRs)
2. Nueva obtención
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ESTs y genes candidatos
1. Transferencia
ESTPs de mapeo comparativo (CCGP)71.0% to 96.4% ESTs (Chagné et al. 2003 Mol Breed 12: 185-195)
GCs expresionales y posicionales (lignificación)81.5% Genes candidatos de propiedades de la madera(Chagné et al. 2003 Mol Breed 12: 185-195)
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respuesta al estímulo luminoso
Ajustar los ciclos decrecimiento estacional
respuesta al estrés hídrico
Crecimiento y supervivencia
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genes candidatos
2. Identificación de ortólogos
GCs funcionales (respuesta al estímulo luminoso)PHYP, PHYO, PHYN, CRY1, CRY2
PHYD
PHYA PHYP
PHYNPHYCPHYB
PHYO PHYE
AngiospermasConíferas
- Diseño de primer basados en análisis de secuencias en otras especies
- Amplificación y secuenciación en P. pinaster
- Diseño de GSPs basados en las secuencias
- RACE- Identificación de SNPs
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genes candidatos
3. Identificación ESTs
GCs de expersión (respuesta a sequía)
Colaboración con INRA-Cestas (FR)
Librerías acículas y raíces sometidas a estrés hídrico vs control
- cDNA –AFLPs
- secuenciación ESTs + análisis diferencial + 2DG
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Estudio del control genético de caracteres adaptativos
mapas genéticos
análisis de QTL
identificación de GCs mapeo comparativo(co-localización)
estudios de asociación
CGposicional
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Cruzamientos controlados
P. pinaster 14 P. pinaster 15X
F1 (120)
P. pinaster 15 P. pinaster 14X
F1 (57)
orden de marcadores - interacción QTL x genotipoP. pinaster 14 P. pinaster 32
X
F1 (62)
Construcción de mapas genéticos de pino rodeno (Pinus pinaster)
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XMapas genéticos
combinaciones primersseleccionados
Saturaciónmarcadores dominantes
AFLPs / SAMPLsF1
Análisis de segregación
Análisis de segregaciónmarcadores co-dominantesApprox 20: SSRsAppox 60: SNPs / ESTPs / STSs
SSCPs / DGGEs
SSR 1
SSR 2
F1
DNA(2n)
Nueva seleccióncp
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Construcción de mapas genéticos de especies alógamas
F1 especies leñosas ~ F2 o retrocruzamiento en cultivos
Estrategia de mapeoPseudo-cruzamiento prueba en dos sentidos
F1
1:1
1:1
3:1SSR
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1:1 / 3:1 / 1:2:11:1 / 3:1 / 1:2:1
3:1, SSRsESTPs, SNPs
P. pinaster 14 P. pinaster 15X
F1 (120)
1:1 / 3:1 / 1:2:1
P. pinaster 15 P. pinaster 14XF1 (57)
1:1 / 3:1 / 1:2:13:1, SSRsESTPs, SNPs
1:1 / 3:1 / 1:2:1
P. pinaster 14 P. pinaster 32XF1 (62)
1:1 / 3:1 / 1:2:13:1, SSRsESTPs, SNPs
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1 generación♂♀
Número degeneraciones
X
X
XX
X
X
X
DL
X X
Análisis de QTL
+ : número de marcadores + : intervalos de confianza- : intervalos de confianza - : número de marcadores o GCs
CG
Estudios de asociación
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A/AA/GG/G
T/TT/AA/A
Elementos de un estudio de asociaciónbasado en genes candidatos
SNP-1SNP-2 QTN
SNP-1
SNP-2
• Selección de genes candidatos• Descubrimiento de SNPs• Genotipado de una población
natural empleando SNPs y marcadores neutros
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Variación genética de P. pinaster en la P.I. (cpSSRs)(colaboración con C. Plomion y G.G. Vendramin)
C
A
B
Diversidad de P. pinaster en la Península Ibérica
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A/AA/GG/G
T/TT/AA/A
Elementos de un estudio de asociaciónbasado en genes candidatos
SNP-1SNP-2 QTN
SNP-1
SNP-2
• Selección de genes candidatos• Descubrimiento de SNPs• Genotipado de una población
natural• Fenotipado de una población
natural• Test de asociación
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La diversidad genética en pino es mayor que la observadaen humanos y soja pero menor que la de maíz o Drosophila
Species Reference Numberof loci θtot θsyn θnon-syn
Halushka et al. (1999) 75 8.3 ± 1.9 15.1 ± 3.6 5.7 ± 1.4HumansCargill et al. (1999) 106 5.3 ± 1.3 11.7 ± 2.9 3.4 ± 0.9
Soybean Zhu et al. (2003) 142 9.7 ± 3.3 10 ± 3.9 3.8 ± 1.5Cryptomeriajaponica Kado et al. (2003) 7 20 ± 14 34 ± 25 7 ± 5
Loblolly pine Wood properties candidategenes 18 42 ± 14 75 ± - 12 ± -
Loblolly pine Water deficit candidategenes (Gonzalez Martinez) 16 46 ± 26 71 ± 60 19 ± 18
Douglas-fir Krutovskii et al. (in prep.) 4 60 ± 23 117 ± 48 30 ± 17
Drosophila Moriyama and Powell(1996) 24 70 ± 58 130 ± 92 15 ± 14
Maize Tenaillon et al. (2001) 21 96 ± 32 173 ± 61 39 ± 14
Los valores de diversidad están multiplicados por 104
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Finlandia: Coord: Univ. OuluMETLA
Suecia: Univ. UppsalaFrancia: INRA CestásEspaña: INIA-ETSIM
SIA-ZaragozaItalia: Universidad de Udine
UK: SCRI, Escocia
Francia: INRA CestásEspaña: INIA-ETSIM
NEIKERAlemania: Univ. Göttingen
TREESNIPSDeveloping single nucleotide polymorphisms (SNP) markers
for adaptive variation in forest trees
CARACTERIZACIÓN Y MAPEO DE GCs
WP1
ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN FENOTÍPICA
WP2
DIVERSIDAD NUCLEOTÍDICA &DISEÑO DE SNPs
WP3
COMPARACIÓN DE LA VARIACIÓN ALÉLICA (SNPs) Y FENOTÍPICA
WP4
Sequía y fenologíaPinus pinaster
DIGENFORNaturally occurring nucleotide diversity in candidate genes for forest tree adaptation:
magnitude, distribution and association with quantitative trait variations
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Genes candidatos
Transducción de señalrd 21 A-2erd3
Respuesta a sequíalp3-1lp3-3lp5dhn 1Aquaporin MIP
Kinasas y fosfatasaspp2c
Enzimas de detoxificaciónSODcatalase
Ajuste osmóticoSusySPSPhosphofructokinaseProlin dehydrogenase
Control del fotoperiodoPHYPPHYOPHYNCRY1CRY2
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Descubrimiento de SNPs(colección de 30 megagametofitos)
0 500 1000
221 385
F1 R1
9
3
1
9
3
3
5
1
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
HAP1 G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
G G A
T G A
T G A
HAP2 T G A
T G A
T G A
HAP3 G G G
G G G
HAP4 G A A
• Amplificación de las regiones del GC
• Análisis de la diversidad de nucleótidos y el desequilibrio de ligamiento
• Diseño de primers para análisis de haplotipos frecuentes
• Genotipado de poblaciones que conforman el ensayo de progenies-procedencias empleando SNPs
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Tamrabta
TabarkaTabarkaTabarkaTabarkaTabarkaTabarkaTabarkaTabarkaTabarka
CuellarCuellarCuellarCuellarCuellarCuellarCuellarCuellarCuellarBayubas de AbajoCoca
San Leonardo de Yagüe
ValdemaquedaArenas de San Pedro
San Cipriano
Petrock
Le Verdon
Olonne/Mer
HourtinMimizan
CenicientosAhin
St Jean de Monts
Pleucadeuc
PinetaVero
Aulenne
Restonica
ZonzaPinia
Oria
Erdeven
Pinus pinastergeographic range
Francia
España
Túnez
Portugal
Marruecos
Localización de las poblaciones que conforman el ensayo de progenies-procedencias de Pinus pinaster
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Caracterización fenotípica de progenies y ensayos
Estandarización de los protocolos de:a) Evaluación de los caracteres de interésControl del fotoperiodo: evaluación fenológicaTolerancia al estrés hídrico: discriminación isotópica
Morfológicos: rectitud, altura y diámetro de fuste y ramificación
b) Propagación de material juvenilcon los que abordar evaluaciones destructivas
Selección de progenitores con comportamientos diferenciales para los caracteres adaptativos con los que generar
nuevas progenies para analizar la estabilidad de QTL en diversos fondos genéticos.
Ensayo de progenies-procedencias
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Grandes diferencias en tolerancia a sequía de los pinos mediterrános
(Geada-López et al. 2002. Int J Plant Sci 163: 737 -747)
P. halepensis
P. pinea
P. pinaster
P. canariensis
Transferencia
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INIA / ETSIM
Ma Ángeles Guevara Álvaro Soto
Santiago González - MartínezIria Fernández - SilvaZafeiro Vaxevanidou
Carmen ColladaMaría Teresa Cervera
Ismael ArandaDolores Agúndez
Juan José RobledoRegina Campbel
Luis GilRicardo Alía
DGCNSalus Iglesias
CITA
Carmen MaestroEduardo Notivol
CIFA-Lourizan
Rafael ZasEster Merlo
NEIKER
Pablo GoicoecheaEnrique Ritter
Univ. de Valencia / Oulu
Rosario García
INRA-Cestas (FR)
Christophe PlomionDavid ChagnéPauline Geré
Antoine Kremer
Univ. de Oulu, Oulu (FIN)
Outi Savolainen
Univ. Firence (It)
Giuseppe G. Vendramin
USDA / Univ. Davis (USA)
David Neale
Univ. de GottingenR. Finkeldey
O. GailingM. Ziehe
L. Leinemann