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DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
“PROYECTO FINAL DE INVESTIGACIÓN”Análisis fitoquímico y ac tivid ad insecticida d e C ercidium praecox
Alumna:García Solórzano María del Consuelo
Asesoras:M. en C. Elisa Vega Avila
Biol. Marías del Carmen Herrera Fuentes
24 de marzo del 2003.
A MI PADRE:
Eduardo García Ortiz, que me dio el apoyo moral y económico durante toda micarrera, que me animó cuando desfallecía y me impulso ha seguir adelantehasta obtener el éxito anhelado.
A MI MADRE:
María Angelina Solórzano Alvarado, que siempre me impulso ha seguiradelante para obtener el éxito anhelado y aunque ya no se encuentra a mi lado,se que en donde se encuentra siempre voy a seguir contando con su apoyo ysu bendición.
A MIS ASESORAS:
Elisa Vega Ávila y María del Carmen Herrera Fuentes, que con sus ampliosconocimientos y sus sabias enseñanzas, hicieron posible la realización de estéproyecto, corrigiéndome incansablemente mis errores y alentándome en misaciertos llevándome al feliz término de este proyecto .
A MIS PROFESORES:
Que durante toda mi carrera la nutrieron no solo de conocimientos teóricos,sino con el ejemplo para lograr mis ideales.
A MIS AMIGOS Y FAMILIARES Y A TODAS LAS PERSONAS QUE HANDEPOSITADO TODA SU CONFIANZA EN MI, Y ME ALENTARON EN LOSMOMENTOS DIFÍCILES.
PROYECTO FINAL DE INVESTIGACIÓN
Análisis fitoquímico y actividad insecticida de Cercidium praecox.
Asesores: M. en C. Elisa Vega Ávila M. en B. Maria del Carmen Herrera Fuentes
MARCO TEORICO:
El reino vegetal en sus distintas formas ha sido factor decisivo en los diferentes
estudios que se han llevado a cabo de los fenómenos de la naturaleza
(Oyama, 1989) .
La identificación de algunas plantas útiles y otras dañinas muestra semejanzas
y diferencias entre vegetales y otras formas de vida, dando origen a la relación
Biología –Botánica, que con sus métodos de investigación y sistematización
hacen posible junto con la Química, crear la FITOQUIMICA, disciplina que
proporciona de manera integral el conocimiento de algunos de los distintos
productos químicos naturales de las plantas que pueden ser extraídos,
separados, purificados y determinados fisicoquímicamente (Domínguez, 1989).
La Fitoquímica estudia la multitud de compuestos químicos que se encuentran
en la complejidad de las células vegetales, pero no solo como entidades
químicas, sino también como productos de una serie de mecanismos que
intervienen en su biogénesis, como sustancias activas que desempeñan una
función en los procesos bioquímicos de las células o bien como elementos que
pueden provocar alteraciones fisiológicas en humanos y en animales
(Domínguez, 1989).
1
INTRODUCCIÓN
Esta disciplina ha impulsado el avance sustancial en el conocimiento de las
plantas medicinales en nuestro país, con el surgimiento de una sólida y
prometedora tecnología basada en la química de síntesis, el interés de la
industria farmacéutica es cada vez más elevado (Kumate, 1993 ) .
En general, las plantas suelen tener una cantidad considerable de compuestos
que siempre han originado confusión acerca de la bioquímica y fisiología de las
plantas, debido a su imposibilidad de huir frente a agresiones. A estos
compuestos se les ha denominado compuestos secundarios(Oyama, 1989).
El término compuesto secundario engloba sustancias químicamente muy
diversas y se establece como contraposición a los productos del metabolismo
primario, que aparecen en el citoplasma de todas las células vegetales y cuyas
diferencias entre plantas son únicamente de índole cuantitativo.
En términos generales, se ha propuesto denominar a los compuestos
secundarios sustancias ecológicamente eficaces, frente a los compuestos
primarios que serían sustancias fisiológicamente eficaces (Augner, 1994).
Ahora bien, debido al elevado costo energético que implica su síntesis, las
plantas encauzan su metabolismo hacia un tipo u otro de compuesto
secundario dependiendo de los recursos disponibles (Bryant et al; 1992), en
general, frente a condiciones severas, como las que se dan en climas áridos,
las plantas tienden a aumentar sus defensas, sobretodo de tipo cualitativo
(alcaloides, glucósidos cianogéneticos, etc ), ya que en estos casos, les resulta
mucho más difícil regenerar los tejidos dañados por los herbívoros (Barry et al;
1987).Casi siempre en una misma planta existen varios componentes
biológicamente activos, en donde el principal determina las aplicaciones que
tendrá la especie en cuestión. Sin embargo, el grado en el que los
componentes secundarios influyen sobre la acción biológica queda puesto de
manifiesto al aislar el principio activo principal. Los principios activos no se
distribuyen de una manera uniforme por toda la planta; si no que se concentran
preferentemente en las flores y las hojas (Pawlow, 1985).
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Sin duda alguna, el tipo de compuestos secundarios más abundantes desde el
punto de vista de variedad, es el constituido por los alcaloides, que son un
grupo muy heterogéneo de bases nitrogenadas (carácter básico), con acción
fisiológica sobre el organismo de los animales (específicamente sobre el
sistema nervioso central), y merecen mención especial la cafeína, morfina y
ácido lisérgico (Maldoni, 1991).
Los alcaloides se encuentran en las plantas en forma de sales, son solubles en
agua y poco solubles en disolventes orgánicos. Con estas propiedades se
fundan los procedimientos que se siguen para su extracción, así como para su
purificación (Muñoz, 1996).
Al margen de los metabolitos secundarios nitrogenados, existen también otros
compuestos que carecen de este elemento y que pueden ser utilizados por las
plantas con una clara función defensiva. En este sentido los terpenoides
incluyen a un elevado número de compuestos entre los que cabe destacar a los
aceites esenciales, monoterpenos, etc; sin embargo, son igual de importantes
que los alcaloides. Otros compuestos secundarios importantes son :
Taninos: Sustancias no definidas químicamente, pero que se agrupan debido
a que tienen algunas propiedades comunes. Comprenden una pequeña parte
del tan amplio como diverso grupo de los compuestos fenólicos vegetales, que
abarca los ácidos fenólicos de 7 a 9 átomos de carbono, tales como los ácidos
gálico y p- cumarico, los flavanos de 15 átomos de carbono, y las ligninas. A
pesar de su indefinición química, generalmente los taninos se dividen en
hidrolizables y condensados, aunque ambos tipos pueden tener procesos
hidrolíticos en medio acuoso (Austin, 1989 ). Los taninos hidrolizables están
constituidos por un núcleo compuesto por un glúcido, cuyos grupos hidroxilo se
encuentran esterificados con ácidos carboxílicos fenólicos.
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Por su lado los llamados taninos condensados son polimeros no ramificados de
hidroxiflavonoles (FLAVAN 3,4- diol), tanto unos como otros son insolubles en
solventes no polares (éter, cloroformo, hexano, benceno) y solubles en agua y
alcohol (Austin, 1989).
La gran cantidad de grupos hidroxilo fenólicos que poseen los taninos les hace
ser muy reactivos, proporcionándoles numerosos puntos de anclaje
susceptibles de formar puentes de hidrógeno, siendo éste el motivo por el que
forman asociaciones reversibles con otras moléculas, demostrando mayor
afinidad por las proteínas debido a la fuerte tendencia a formar puentes de
hidrógeno entre los grupos hidroxilo de los taninos y el oxígeno del grupo
carbonilo de los péptidos. Tanto los taninos hidrolizables como los
condensados se encuentran principalmente en hojas de árboles, arbustos y
leguminosas herbáceas.
Cumarinas: Son compuestos heterocíclicos derivados del ácido cinámico con
un núcleo formado por un anillo bencénico condensado con un anillo tiránico,
aunque en muchas se fusiona un tercer anillo heterocíclico (Berembaum,
1991). Las cumarinas se encuentran en leguminosas y rutáceas, poseen
propiedades fotosensibilizadoras, esto es, su acción tóxica se refuerza en
presencia de la luz ultravioleta, algunas son causantes de fotodermatitis cuya
acción retardada podría no ser suficiente para evitar la ingestión de las plantas
por los herbívoros.
Saponinas: Las saponinas se han empleado como detergentes naturales ya
que son sustancias que rebajan la tensión superficial y producen espuma al
contacto con el agua. Cuentan además con la capacidad de unirse al colesterol
impidiendo su absorción.
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La mayoría de las plantas que contienen saponinas no tienen un solo
compuesto sino una mezcla compleja, con diferencias en la aglicona o en la
longitud y composición de la cadena glucídica, lo que influye en sus
propiedades. Cabe mencionar que puede alterar la permeabilidad de las
membranas.
Las saponinas son muy frecuentes en las plantas medicinales y debido a su
capacidad espumante resultan unos excelentes emulsivos, producen la
hemólisis de los glóbulos rojos (eritrocitos); es decir, liberan hemoglobina lo
que explica el efecto tóxico de algunas de ellas. Algunas saponinas han
mostrado diversas actividades biológicas (antimicrobiana, citotóxica,antitumoral
e insecticida).
Aunque los aminoácidos son conocidos especialmente por su papel estructural
como los pilares básicos de las proteínas animales y vegetales, ciertas plantas
poseen aminoácidos no proteicos que pueden emplear con fines defensivos.
Así por ejemplo, las leguminosas disponen de ellos, muchos de los cuales
pueden ser utilizados como mecanismo de defensa contra insectos y otros
depredadores (Argilis, et al. 1990).
Una característica importante en la estrategia de defensa de las plantas es la
distribución variable de los compuestos secundarios en los diferentes tejidos
vegetales, dependiendo de su valía para la planta, así como su redistribución
según avanza el desarrollo fenológico (Cheeke, 1995).
Los metabolitos secundarios aparentemente no tienen un propósito fijo en el
metabolismo de las plantas; sin embargo, algunos de estos compuestos son
empleados por la planta con distintas funciones. Así, intervienen en relaciones
de competencia con otras plantas actuando como agentes alelopaticos; como
moléculas portadoras de información relacionada con posibles funciones
defensivas; además actúan como sustancias naturales que son repelentes o
inhibidores del crecimiento, desarrollo y alimentación de los insectos.
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En este sentido, se estudia como una alternativa el uso de extractos vegetales
que contienen una gran diversidad de metabolitos secundarios que pueden
actuar como insecticidas, debido a que los insectos se han ido adaptando y
resisten cada vez más a los efectos de los insecticidas químicos a
concentraciones cada vez mayores. Pero recientemente los insecticidas han
sido objeto de innumerables criticas, principalmente por sus efectos adversos
(Ramírez, 1984) como:
1. El envenenamiento directo de los humanos y el peligro que representan
los residuos de productos químicos que quedan en los alimentos.
2. El riesgo de contaminación general del medio ambiente.
3. El desarrollo de resistencia a los plaguicidas en insectos.
Estos hechos han obligado a reflexionar sobre las ventajas de utilizar otros
productos con propiedades insecticidas que no causen contaminación, que
sean económicos y fáciles de aplicar, una alternativa lo constituye el uso de
plantas como agentes insecticidas.
Así como las plantas proporcionan compuestos que son una alternativa para la
preparación de nuevos insecticidas, en la naturaleza existen numerosos
ejemplos donde se muestran herbívoros adaptados a alimentarse de plantas
que presentan compuestos secundarios, debido a que son capaces de
metabolizar y almacenar los compuestos que pueden ser sumamente tóxicos y
ocuparlos para su protección en contra de sus depredadores (Oyama, 1989)
Normalmente estas substancias no se encuentran en las plantas en estado
puro, sino en forma de complejos moleculares y en cantidades muy pequeñas
(Farnsworth, et al.1999).
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A. Cercidium praecox "PALO VERDE"
1.- Características Botánicas y distribución en México
La planta en estudio pertenece a la familia Leguminosae, es una especie con
distribución muy localizada, se encuentra en zonas áridas y semiáridas en el
sur de México, específicamente en el Valle de Zapotitlán Tehuacán, Puebla. Es
un arbusto de 10- 12 m, pubescente. Tronco corto de 30 cm de diámetro, tiene
espinas de 0.5-1 cm de largo. Hojas bipinnadas, con ápice redondeado.
Semillas 1-2, pardogrisáceas de 1 cm de largo. Fruto en forma de legumbre de
3-6 cm de largo (figura 1). Sus flores de 1-6 con pedicelos de 5-10 mm de
largo; cáliz estrecho y profundo hacia la base; pétalos pálidos o profundamente
amarillos (Ruiz, 1989).
El área de estudio se encuentra ubicada dentro de las coordenadas 18020” de
latitud norte y 97028” de longitud oeste, con una superficie de 86.74Km2. Está
enclavado en la sierra del mismo nombre que forma el límite suroeste del valle
de Tehuacan en el estado de Puebla, México (Vite et al; 1992)
El clima determinado para el valle de Zapotitlán corresponde a un clima seco
con régimen de lluvias de verano, con dos máximas de lluvias separados por
dos estaciones secas. Se puede decir, que la vegetación de esta área ocupa
un poco más de la mitad de la extensión total del valle de Tehuacán. Es una
vegetación que corresponde al matorral espinoso; es decir , la vegetación es
básicamente de leguminosas arbustivas espinosas (Zavala, 1982).
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ANTECEDENTES
2. Etnobotánica
Existen pocos reportes sobre el uso de esta planta, en 1992 Ramírez, reporta
el uso de esta planta para el tratamiento del dolor de cabeza y del oído por los
pobladores de la zona de Tehuacan. También se ha reportado su uso contra
afecciones cardiacas (Lara, 1996).
B. ESTUDIOS QUÍMICOS DE Cercidium praecox
Análisis previos de Cercidium praecox muestran la presencia de polisacáridos,
resinas, alto contenido en compuestos nitrogenados, glicina y una mayor
proporción de ácido galacturónico y xilosa. Las soluciones acuosas presentan
una apariencia viscosa semejante a la "goma arábiga" (Ramírez, 1996).
Algunos estudios fitoquímicos que se están llevando a cabo en la Universidad
de Puebla demuestran que entre los metabolitos secundarios, los taninos están
presentes en gran cantidad, por lo que se están llevando a cabo pruebas
químicas que demuestren el papel que juegan estos compuestos en la relación
biológica entre plantas y animales (Ramírez, 1996).
C. LAS PLANTAS COMO FUENTE DE INSECTICIDAS
Los insecticidas de origen vegetal están considerados dentro de la primera
generación de plaguicidas, ya que su uso como tal se remonta a siglos antes
de la era cristiana (Jacobson y Crosby, 1971).
De las casi 700,000 especies de plantas que hay en el mundo (la mayoría en
los tropicos), solamente algunas se conocen y se ha investigado con fines de
aprovechamiento, según investigaciones más de 2000 especies en el mundoi
tienen propiedades plaguicidas (Munich,1988).
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Solamente pocas de estas especies han sido aprovechadas hasta el momento
para el control de plagas y enfermedades.
El uso de extractos vegetales para el control de insectos no es nuevo. Su
aplicación se registra desde antes de la segunda guerra mundial, la cual fue
descontinuado por el surgimiento del DDT y compuestos organoclorados, los
cuales a pesar de ser baratos son muy tóxicos y persistentes en el ambiente.
La utilización de extractos vegetales para el control de plagas tiene la ventaja
de no provocar contaminación debido a que estas substancias se degradan
rápidamente en el medio (Fersth,1978).
Existen muchas plantas cuyos extractos poseen propiedades insecticidas; sin
embargo, desde el punto de vista comercial, sólo algunas se han aprovechado
como la Ryania, Lenchocarpus, Chrisantemum y Nicotiana tabacum (Lagunes y
Rodríguez, 1990). A continuación se describen algunas de estas.
Nicotiana tabacum: El extracto de la hoja del tabaco ha sido usado en
aspersiones para controlar insectos. La nicotina es el alcaloide principal,
destruye a los insectos al penetrar en la cutícula y las vías respiratorias,
estimulando y deprimiendo la actividad del sistema nervioso; la muerte se
presenta en poco tiempo (Vélez,1988). Desafortunadamente, los alcaloides que
presenta son muy tóxicos inclusive para los mamíferos.
Lonchocarpus: Su principio activo es la rotenona; la cual es inocua para las
plantas, sumamente tóxica para muchos insectos y relativamente inofensiva
para los mamíferos (Velez, 1988).
Ryania Speciosa: Los polvos obtenidos de la molienda de los tallos y raíces de
la planta se han utilizado para el combate de algunos insectos, y en los años
1940-1950 fueron desplazados por compuestos organoclorados que eran más
baratos.
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Chrysantemus cinerariafolum: El uso del piretro como insecticida se remonta
desde el siglo XIX. Sus principios activos son las piretrinas, las cuales deben su
importancia a su alta toxicidad para artrópodos y baja toxicidad para animales
mamíferos; tienen acción inmediata y sus residuos son de vida corta (Casida,
1973). Actualmente son los plaguicidas de origen vegetal más utilizados en el
mundo, por lo cual se siembran grandes extensiones de esta planta.
Ahora bien, el efecto de un plaguicida vegetal, depende de algunos factores
como los son: la especie y variedad de la planta, época de
recolección,influencia del ambiente, forma de preparación, forma de extracción
y aplicación del plaguicida. Comúnmente, no se conoce el modo exacto de
aplicación de los plaguicidas vegetales, razón por la que se debe mantener una
experimentación constante (Girón,1994).
1. plantas insecticidas en México
En México, el uso de plantas como insecticidas es muy antiguo. Existen dos
referencias de principios de siglo que nos informan del uso de plantas contra la
mosca y el gusano de la naranja y mango, así como contra el picudo del
algodonero (Román, 1990). En la primera se asperjaban soluciones preparadas
con la hierba de la cucaracha Haplophyton cinicidum y en la segunda se
menciona el uso de una solución acuosa de la raíz del chichicamole para matar
mosquitos.
Actualmente los campesinos continúan empleando diversas plantas para el
control de plagas. En la región de Ixtapan de la Sal, Estado de México, es
costumbre intercalar plantas secas de Artemisa luduviana entre costales de
maíz para evitar el daño del gorgojo del maíz (Lagunes, 1990). Existen plantas
con propiedades insecticidas poco conocidas, que representan una esperanza
futura para el combate de plagas insectiles sin el eventual problema de
contaminación que pueden presentar algunos insecticidas orgánicos modernos.
Entre ellas encontramos a la especie Hippocratea excelsa, que en México es
conocida como “cancerina”.
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Por lo general, ninguna de las especies vegetales insecticidas tienen la
actividad fulminante de los insecticidas químicos. Es por esto que la población
de insectos no disminuye rápidamente con el uso de insecticidas extraídos de
plantas.
Entre los efectos que causan los insecticidas naturales se encuentran los
siguientes:
a) Repelencia en larvas y adultos
b) Suspensión de la alimentación
c) Bloqueo de la muda en larvas
d) Bloqueo del desarrollo
e) Causa esterilidad en las hembras
f) Suspensión de la ovoposición.
Como se observa, la gran mayoría de los efectos de los insecticidas vegetales
son fisiológicos, por lo que el insecto tiene que adquirirlos a través de su
alimentación (Solórzano, 1993).
Los plaguicidas extraídos de plantas no representan el remedio universal para
proteger las plantas contra insectos. Existen también plantas que producen
plaguicidas que pueden ser tóxicos. Para que una protección vegetal sea
realmente ecológica, esta se logra no solo con la sustitución de plaguicidas
sintéticos por plaguicidas naturales, se necesitan buenos conocimientos acerca
de las relaciones biológicas y ecológicas entre planta y plaga y plaga -
ambiente. Estos conocimientos deben ser obtenidos y divulgados a través de
instituciones, de manera que estén disponibles para el uso de la población
(Munich, 1988).
Por lo general, para probar insecticidas de tipo vegetal, se realizan pruebas
antialimentarias; las cuales, entre sus principales ventajas esta que no
perjudican la fauna benéfica, tienen poca toxicidad y pueden ser aplicados con
equipos convencionales.
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D. PRODUCTOS NATURALES CON ACTIVIDAD ANTIALIMENTARIA
Hoy en día la protección de cultivos de plantas y la conservación de granos y
semillas almacenados, contra las plagas de insectos es un problema relevante
para el desarrollo de la agricultura. Los primeros productos naturales utilizados
para detener dichas plagas fueron arena, ceniza y sal, los cuales eran
espolvoreados en las plantas. El agente ideal que proteja los cultivos deberá
ser un compuesto que repele o mate a las plagas y que prevenga que estos
puedan desarrollarse o alimentarse de las plantas.
Los fumigantes e insecticidas de contacto utilizados en el control de plagas en
los productos almacenados y en los cultivos no cumplen con éstos criterios;
por ello, se buscan nuevas plantas con actividad insecticida o nuevas
alternativas antialimentarias. Los compuestos con actividad antialimentaria se
definen como factores que inhiben la alimentación o causan la suspensión de la
actividad alimenticia.
Los metabolitos secundarios con propiedades antialimentarias pueden causar
cambios fisiológicos en el desarrollo del insecto ; es decir, causan inhibición de
las mudas o reducen la fecundidad en las hembras (Nawrot et al; 1989). Dentro
de los metabolitos secundarios con actividad antialimentaria se encuentran los
taninos, alcaloides y los triterpenos. Estos últimos, poseen diferentes
propiedades biológicas como son: actividad antifúngica, alelopática y
protección contra herbívoros; además, se les ha atribuido propiedades
antialimentarias que pueden hacer que se les utilice como insecticidas de
origen vegetal (Rosenthal y Janzen, 1979).
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Por otro lado, es bien sabido que los insectos son las principales plagas de las
plantas y de algunos alimentos en almacenamiento. En general, son muchos
los ordenes de insectos que atacan a las plantas ; entre ellos se encuentran la
Coleóptera y Lepidóptera (Díaz, 1985).
En este sentido, Tenebrio molitor cultivado ó en su forma silvestre es un buen
modelo para estudiar la actividad insecticida de extractos vegetales, debido a
que este insecto tiene hábitos alimenticios muy variados; además, tiene un
ciclo de vida corto que puede ser manejado perfectamente en los estudios de
laboratorio y finalmente porque en la naturaleza son los que causan el mayor
daño dada su voracidad.
E. Tenebrio molitor “EL GUSANO DE LA HARINA”
1. Clasificación
La clasificación de Tenebrio molitor de acuerdo a Borror et al (1981) es :
Phylum: Arthropoda
Subphylum: Uniramia
Clase: Insecta
Orden :Coleóptera
Suborden: Polyphaga
Superfamilia: Tenebrionoidea
Familia :Tenebrionidae
Género y especie: Tenebrio molitor
2. Ciclo de vida de T. molitor
El ciclo de vida del Tenebrio puede dividirse en cuatro fases: huevecillo, larva,
pupa y adulto. En la vida silvestre este ciclo puede variar de 6 a 12 meses; sin
embargo, bajo circunstancias de criadero, este ciclo se reduce de 6 a 7
semanas; es decir, los huevecillos se desarrollan de 5 a 7 días, las larvas de 2
a 3 semanas y el adulto emerge alrededor de la quinta semana .
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JUSTIFICACION
Dado que los insecticidas de origen vegetal están considerados dentro de la
primera generación de plaguicidas con actividad tóxica contra insectos, y desde
el punto de vista comercial solo se ha aprovechado algunas plantas como la
Ryana, Lonchocarpus, Chrisanthemun y Nicotiana tabacum , con el presente
estudio se desea encontrar nuevas plantas que puedan ser usadas como
insecticidas naturales. Para esto se eligió Cercidium praecox ya que presenta
baja depredación; además, de que no existen estudios previos que muestren
alguna actividad biológica. Esta investigación se dirigió para determinar las
familias de los compuestos presentes en los diversos extractos, aqsí como
evaluar la actividad antialimentaria de estos y proponer el uso de esta planta
como insecticida natural.
Ahora bien, dado que los compuestos de las hojas de Cercidium praecox que
podrían actuar como insecticidas naturales no han sido determinados,
decidimos investigarlos planteando los siguientes objetivos.
OBJETIVO GENERAL
Determinar las familias de los compuestos presentes en Cercidium praecox y
su efecto biológico sobre insectos.
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OBJETIVOS PARTICULARES
-Obtención y caracterización de Cercidium praecox
-Obtención de los extractos de Cercidium praecox
v Hexánico
v Acetato de etilo
v Metanólico
v Acuoso
-Determinar las familias de compuestos presentes en Cercidium praecox a
través de pruebas fitoquímicas cualitativas
-Determinar la actividad insecticida de los extractos de Cercidium praecox
sobre larvas de Tenebrio molitor.
HIPOTESIS:
Considerando que Cercidium praecox es una especie vegetal que no muestra
presencia de depredadores, es posible que contenga compuestos que le
confieran esta protección y además le den la capacidad de tener actividad
insecticida. Por lo que un estudio fitoquímico permitirá conocer las familias de
compuestos responsables que intervienen en estos procesos.
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a) COLECTA
1. Se realizó una salida de campo a Zapotitlán de las Salinas en Tehuacán
Puebla; donde se colectaron las hojas de Cercidium praecox .
2. Las hojas se pesaron en fresco y se transportaron en bolsas de papel al
laboratorio de la Universidad.
3. El material vegetal se dejó secar a temperatura ambiente en el laboratorio y
se determinó su peso seco.
4. Las hojas secas se trituraron mecánicamente y con este material se
prepararon los extractos.
b) OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES
1. Se tomaron 300g del material vegetal triturado y se colocaron en un matraz
erlenmeyer de 4 L.
2. Se agregó 1.5 L de hexano, se tapó y cubrió con papel para protegerlo de la
luz.
3. Se maceró durante 48 hrs a temperatura ambiente.
4. Se filtró y evaporó el disolvente empleando un rotavapor.
5. La planta residual se dejó secar a temperatura ambiente en una campana
de extracción para eliminar restos del disolvente anterior (hexano) y una vez
seca se trató con acetato de etilo como segundo disolvente, metanol (como
tercer disolvente) y agua (como cuarto disolvente).
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MATERIAL Y METODOS
Para cada uno de los solventes empleados se siguieron los puntos 2, 3 y 4
antes mencionados, el último disolvente se eliminó por liofilización.
El uso de los diferentes disolventes es para separar los compuestos con
características de polaridad similar a la de los disolventes. Los principios
activos deben pasar de la planta al disolvente de manera que se obtenga un
extracto líquido. Posteriormente dicho extracto se puede concentrar eliminando
mayor o menor cantidad del disolvente ( Kuklinsky, 2000).
c) ANÁLISIS FITOQUÍMICO DE LOS EXTRACTOS
Se tomaron alícuotas de cada uno de los extractos y se realizaron diluciones en
los disolventes adecuados con el fin de solubilizar e identificar la presencia de
alcaloides, flavonoides, saponinas, cumarinas, terpenoides y taninos, cuyas
pruebas consisten en la evaluación cualitativa por cambios de coloración ó
formación de precipitado como se describen a continuación:
Alcaloides: Se tomo 0.1 g de cada uno de los extractos y se disolvió con 5 ml
de HCl 2 M, se calentó en un baño María y se filtró. Se colocaron 1.5 ml del
filtrado en tres tubos de ensayo, los cuales se marcaron como A1, A2, y A3. Al
tubo A1 no se le adicionó nada, puesto que es el control, al tubo A2 se le
adicionaron 0.2 ml del reactivo de Mayer y al tubo A3 se le adicionaron 0.2 ml
del reactivo de Wagner. Ambos reactivos forman un precipitado que indica la
presencia de alcaloides. La preparación de los reactivos están en el apéndice
A.
Flavonoides: 0.2 g del extracto se disolvió en 10 mL de etanol y se le agregó
0.5 mL de HCl concentrado y 0.5 g de magnesio. La reacción se consideró
positiva cuando se formo una coloración rosa o morada dentro de los tres
primeros minutos.
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taninos: se tomó una porción de cada uno de los extractos y se disolvió con 10
mL de cloruro de sodio al 0.85% caliente, se filtró y dividió en dos partes
iguales. A una parte se le adicionó solamente solución de gelatina 1%
(apéndice A); a una segunda porción se le adicionó cloruro férrico. Debido a
que los taninos precipitan proteínas y forman complejos coloridos con Fe 3+; es
por eso que se utiliza el cloruro férrico para corroborar la presencia de taninos
(Harborne, 1989).
En este sentido, la coloración verde nos indica la presencia de taninos
condensados y la coloración azul nos indica la presencia de taninos
hidrolizables (Barba, 1997).
Saponinas: Se disolvió en un tubo de ensaye 0.3 g del extracto con agua
caliente y se agitó vigorosamente por algunos minutos. La formación de
espuma por algunos minutos se consideró positiva la prueba (Harborne, 1989),
como se muestra a continuación:
No espuma La prueba es negativa
Espuma < 1 cm La prueba es ligeramente positiva
Espuma de 2 cm La prueba es positiva
Espuma> 2 cm La prueba es fuertemente positiva
Cumarinas: 0.2 g de cada uno de los extractos se colocaron con 1 ml de agua
a baño maría durante 5 minutos, posteriormente se colocó en la parte superior
una tira de papel filtro impregnado con NaOH 0.1 M. Esta tira se observa con
luz ultravioleta; la aparición de manchas amarillas fosforescentes nos indica
que la prueba es positiva (Rizk,1982). Cabe mencionar que el análisis se hace
para todos los extractos obtenidos; es decir, el extracto hexánico, el extracto
tratado con acetato de etilo, el extracto metanólico y el extracto acuoso.
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d) PRUEBAS BIOLÓGICAS
La actividad biológica se examinó mediante la alimentación forzada de larvas
de Tenebrio molitor del mismo peso y fase del desarrollo (segunda etapa
larvaria). Para ello, las larvas fueron puestas a dieta 2-3 horas antes de realizar
las pruebas y se les proporcionó como alimento una dieta artificial de obleas de
harina trituradas.
Preparación del alimento artificial
El alimento se elaboró triturando obleas de harina en la licuadora; este alimento
fue impregnado con cada uno de los extractos obtenidos a una concentración
del 1%. Cabe mencionar que cada uno de los extractos fue solubilizado
nuevamente en los disolventes adecuados; es decir, el extracto hexánico y
acetato de etilo fueron solubilizados en acetona, el extracto metanólico en
etanol y el acuoso en agua.
El alimento con su respectivo extracto, fue colocado en cajas petri para cada
uno de los extractos y se dejó volatilizar el disolvente por 24 horas.
Posteriormente se colocaron 10 larvas por cada extracto. Cada tratamiento
consistió de 3 replicas y su respectivo control (tratamiento sin extracto y
tratamiento con el solvente .
A las 24 horas se contabilizaron las excretas y para ello la caja de petri fue
colocada en el microscopio estereoscópico para proceder al conteo de las
excretas. Una vez teniendo el conteo se obtuvo el promedio y se determinó el
índice de actividad antialimentaria (IAA) mediante la fórmula :
IAA = 100 - (media de la muestra de alimentación/ media de la muestra del
control de alimentación) 100
Cabe mencionar, que para corroborar que hubo actividad antialimentaria se
pesaron las larvas todos los días.
20
Porcentaje de Mortalidad
Se identificó el número de individuos muertos en los tratamientos cada 24
horas. Para la evaluación de la mortalidad de las larvas se utilizó la formula:
MC= (Y- X/ 100- X) 100
Donde MC es mortalidad corregida
Y es % de mortalidad del tratamiento y
X es % de mortalidad del testigo.
A. ANÁLISIS QUÍMICO DE Cercidium praecox
El rendimiento de los extractos de las hojas de Cercidium praecox se muestranen la tabla 1. El extracto acuoso presentó el mayor rendimiento (4.31 %) y elmenor fue el de hexano (0.64 %).
EXTRACTO Rendimiento (% )
Hexánico 0.645Acetato de Etilo 0.678
Metabólico 2.051Acuoso 4.314
Tabla 1. Rendimiento de los extractos de Cercidium praecox
21
RESULTADOS
En la tabla 2 se puede apreciar a aquellos compuestos secundarios detectadosen Cercidium praecox mediante el estudio fitoquímico cualitativo.
EXTRACTO ALCALOIDESMR WR
CUMARINAS FLAVONOIDES TERPENOS SAPONINAS TANINOSFeCl3 G
Hexánico _ _ _ _ +++ ++ +++ CV/TC ↓
Acetato deEtilo
_ _ _ _ +++ ++ +++ CV/TC ↓
Metanólico + + _ _ + ++ +++ CA/TH ↓
Acuoso + + _ _ _ _ +++ CA/TH ↓
Tabla 2. Datos obtenidos del estudio fitoquímico de Cercidium praecox.
MR: Reactivo de Mayer WR: Reactivo de Wagner +++: Abundante +:Poco abundante-: No presencia G: Reactivo de Gelatina : precipitado CV/TC: Una coloración verdeindica la presencia de taninos condensados CA/TH: Una coloración azul indica lapresencia de taninos hidrolizables
Como se puede observar, los extractos extraídos de las hojas de Cercidium
praecox que presentaron mayor cantidad de compuestos, fueron el metanólico
y el acuoso; ya que se detectó la presencia de alcaloides, poca presencia de
terpenos, saponinas y taninos, siendo estos últimos de tipo hidrolizable; es
decir, son compuestos que se hidrolizan en medio ácido formando una
coloración azul. Cabe mencionar, que los taninos fueron los de mayor
abundancia.Por otra parte, los extractos hexánico y Acetato de etilo que son
poco polares, presentaron compuestos como saponinas en muy pequeña
cantidad, y los de mayor abundancia fueron los taninos y los terpenos; estos
últimos se volatilizaron muy rápido; sin embargo se detecto su presencia.
Es factible mencionar, que los taninos que se detectaron en los dos extractos
(hexánico y Acetato de etilo), son de tipo condensado, ya que, en medio ácido
se polimerizaron formando una coloración verde intensa.
22
Finalmente, es importante mencionar que los cuatro extractos no presentaron
Cumarinas y flavonoides; además, cuando se sometieron al reactivo de
gelatina, los cuatro extractos precipitaron; por lo tanto, se puede decir que esta
alternativa nos ayudó a corroborar que había presencia de taninos.
B. ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE Cercidium praecox
Con respecto a las pruebas biológicas realizadas con los diferentes extractos,los resultados se resumen en la tabla 3.
EXTRACTO % IAA %MCControl
(tratamiento sin extracto)0.0 0.0
Control(tratamiento con el solvente)
0.0 0.0
Hexánico 61.34 45.9
Acetato de etilo 9.96 3.0
Metabólico 41.45 47.2
Acuoso 3.56 0.0
Tabla 3. Índice de Actividad Antialimentaria (IAA) y mortalidad corregida (%MC)de Cercidium praecox contra Tenebrio molitor
Como se puede observar, los extractos de las hojas de Cercidium praecox
mostraron resultados favorables para dos de ellos (tabla 3). La mayor actividad
la presentó el extracto hexánico (61.34%), seguido por el extracto metanólico
(51.45 %), mientras que los demás extractos mostraron valores menores al
10%.Con respecto al índice de mortalidad ó actividad insecticida, ésta fue de
baja a nula en los extractos acetato de etilo y acuoso; el valor más alto fue el
del extracto metanólico (47.2 %), mientras que el extracto hexánico fue de
45.9%. Sin embargo, todos los extractos redujeron la alimentación de los
insectos y esto se pudo observar al pesar a los insectos diariamente, ya que se
observó un decremento de los pesos de estos.
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Dados los antecedentes, es muy grato comentar que los resultados obtenidos
de esta investigación fueron satisfactorios, ya que se encontró que Cercidium
praecox posee tanto actividad antialimentaria como insecticida.
En el caso de la actividad antialimentaria (IAA), se observó que el extracto
hexánico a pesar de presentar un bajo rendimiento(0.64%), esté mostró el
mayor índice de actividad antialimentaria (61.34%), seguido por el extracto
metanólico que presento actividad alimentaria del 51.45%; mientras que los
extractos de acetato de etilo y acuoso presentaron muy baja actividad. En el
caso del extracto hexánico, su actividad se debe quizás a la presencia de
terpenoides que se detectaron en el estudio fitoquímico, ya que de acuerdo a la
bibliografía se ha comprobado que estos compuestos pueden actuar como
agentes antialimentarios e insecticidas; sin embargo, es muy aventurado
atribuir la actividad biológica únicamente a estos compuestos pues se
identificaron también saponinas y taninos. Con respecto a la actividad
insecticida se obtuvieron valores mayores al 40 %; el valor más alto fue el del
extracto metanólico con el 47.2% mientras que el extracto hexánico presentó el
45.9%.
Ahora bien, es factible mencionar que la actividad antialimentaria se encontró
en el extracto menos polar, mientras que el extracto más polar presentó la
actividad insecticida; lo que sugiere que los alcaloides detectados en el estudio
fitoquimico pueden ser los responsables de esta actividad; dado que a este tipo
de compuestos se les conoce por su capacidad tóxica.
Aunque los extractos acetato de etilo y acuoso tuvieron nula actividad
insecticida y baja actividad antialimentaria, presentaron compuestos
secundarios muy importantes sobretodo el extracto acuoso que presentó
saponinas, alcaloides y taninos; quizás con un estudio más detallado que nos
permita detectar alguna actividad biológica importante, ya que se requiere de
nuevas plantas para el tratamiento y control de algunas enfermedades.
24
DISCUSIÓN
Con los resultados de esta investigación, se deben buscar alternativas para
que Cercidium praecox pueda ser utilizado como un agente insecticida para
proteger los cultivos de plantas de diferentes insectos; además, se deben de
encontrar las estructuras químicas de los compuestos responsables de la
actividad; sin embargo, se debe evitar la explotación de esta planta para evitar
que se extinga. La ventaja de Cercidium praecox, es que los compuestos
activos se encontraron en las hojas y al cortarlas se seguirían produciéndose y
no necesariamente se tendría que obtener la planta completa.
De acuerdo a los objetivos planteados es muy satisfactorio concluir que :
Ø Las hojas de Cercidium praecox presentaron compuestos secundarios del
tipo de los alcaloides, terpenoides, saponinas y taninos.
Ø El extracto metanólico presentó mayor variedad de compuestos, ya que se
determinaron alcaloides, taninos, saponinas y terpenos en muy poca
cantidad.
Ø En los extractos hexánico y acetato de etilo, presentaron compuestos del
tipo terpenoides.
Ø Dos de los extractos de las hojas de Cercidium praecox presentaron tanto
actividad antialimentaria como insecticida.
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CONCLUSIONES
Ø La actividad antialimentaria se encontró en el extracto menos polar (extracto
hexánico), su actividad se debe quizás a la presencia de terpenoides.
Ø El extracto más polar (extracto metanólico) presentó la actividad insecticida;
lo que sugiere que los alcaloides pueden ser los responsables de esta
actividad; dado que a este tipo de compuestos se les conoce por su
capacidad tóxica.
Cabe mencionar que es necesario que dichos extractos sean sometidos a
procesos de purificación para que estos estudios nos conduzcan a encontrar
las estructuras químicas responsables de dicha actividad.
26
± Reactivo de Mayer: En un matraz Erlenmeyer de 125 mL se colocan
1.36 g de cloruro de mercurio con 50 ml de agua. En otro matraz se
disuelven 5 g de yoduro de potasio con 50 ml de agua y se mezclaron
las dos soluciones aforando a 100 ml.
± Reactivo de Wagner: En un matraz volumétrico se disuelven1.27 g de
yodo (resublimado) y 2 g de yoduro de potasio en 20 ml de agua y se
afora a 100 ml.
± Reactivo de Gelatina al 1%: En un matraz volumétrico se colocan 100
mL de agua destilada y se agrega 1 g de gelatina y se agita
vigorosamente para deshacer los grumos.
± Reactivo de cloruro férrico: En un matraz volumétrico de 100 mL se
colocan 50 mL de agua destilada y se adiciona 0.8 mL de HCl
concentrado, se agita la solución, se añade 1g de cloruro férrico y se
afora a un volumen de 100mL.
27
Apéndice A. preparación de reactivos
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