divisão de biologia médica serviço de virologiaadenovírus) anticorpos monoclonais (flu-a, flu-b,...
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SimpSimpóósio Nacional de Vigilância:sio Nacional de Vigilância:Pneumococo e Influenza Pneumococo e Influenza
DiagnDiagnóósticostico Laboratorial das InfecLaboratorial das Infecçções Respiratões Respiratóórias Viraisrias Virais
Terezinha Maria de PaivaTerezinha Maria de Paiva
BM
BIOLOGIA MÉDICA
SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDECOORDENADORIA DE CONTROLE DE DOENÇAS
INSTITUTO ADOLFO LUTZ
SECRETARIA DE ESTADO DA SASECRETARIA DE ESTADO DA SAÚÚDEDECOORDENADORIA DE CONTROLE DE DOENCOORDENADORIA DE CONTROLE DE DOENÇÇASAS
INSTITUTO ADOLFO LUTZINSTITUTO ADOLFO LUTZ
Divisão de Biologia MDivisão de Biologia Méédica dica ServiServiçço de Virologiao de Virologia
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Infecções Respiratorias Agudas de Etiologia ViralInfecInfecçções ões RespiratoriasRespiratorias Agudas de Etiologia ViralAgudas de Etiologia Viral
Víírusrus NNºº subtipossubtipos Principais sPrincipais sííndromes clndromes clíínicas nicas
INFLUENZAINFLUENZA 33 Gripe, laringite, pneumonia, Gripe, laringite, pneumonia, laringotraqueobronquitelaringotraqueobronquitePARAINFLUENZAPARAINFLUENZA 44 Coriza, renite, Coriza, renite, rinofaringiterinofaringite, crupe , crupe CAXUMBACAXUMBA 11 DoenDoençça respirata respiratóória aguda indiferenciada, parotiditeria aguda indiferenciada, parotiditeSARAMPOSARAMPO 11 Broncopneumonia, Broncopneumonia, laringotraquelaringotraqueíítete, laringite , laringite RESPIRATRESPIRATÓÓRIORIOSINCICIALSINCICIAL
22 Bronquite, Bronquite, broncopneumonitebroncopneumonite intersticial intersticial
ADENOADENO 5252 DoenDoençça respirata respiratóória aguda indiferenciada, febre, ria aguda indiferenciada, febre, farfarííngongoconjuntivalconjuntival, pneumonia, faringite, conjuntivite, pneumonia, faringite, conjuntivite
RINOVRINOVÍÍRUSRUS >>100100 Resfriado comum, bronquite, faringite, broncopneumoniaResfriado comum, bronquite, faringite, broncopneumoniaCOXSACKIECOXSACKIE 22 Faringite, Faringite, herpanginaherpangina, amigdalite, amigdaliteECHOECHO 3333 DoenDoençça respirata respiratóória aguda indiferenciada, coriza, pneumoniaria aguda indiferenciada, coriza, pneumonia
infantil, faringiteinfantil, faringitePÓÓLIOLIO 33 AmigdalofaringiteAmigdalofaringiteCORONACORONA 33 Resfriado, DoenResfriado, Doençça respirata respiratóória aguda indiferenciada,ria aguda indiferenciada,HERPES SIMPLESHERPES SIMPLES 22 AmigdalofaringiteAmigdalofaringite com vescom vesíículas e culas e úúlceraslcerasCITOMCITOMÉÉGALOGALO 11 Faringite e tonsilite infantil (mononucleose)Faringite e tonsilite infantil (mononucleose)
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VÍRUS RESPIRATÓRIOS DE MAIOR IMPORTÂNCIA EM SAÚDE PUBLICAVVÍÍRUS RESPIRATRUS RESPIRATÓÓRIOS DE MAIOR RIOS DE MAIOR IMPORTÂNCIA EM SAIMPORTÂNCIA EM SAÚÚDE PUBLICADE PUBLICA
l Influenza
l Vírus respiratório sincicial (VRS)
l Parainfluenza
l Adenovírus
ll InfluenzaInfluenza
ll VVíírus respiratrus respiratóório sincicial (VRS)rio sincicial (VRS)
ll ParainfluenzaParainfluenza
ll AdenovAdenovíírusrus
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Rota de Rota de infecinfecççãoão
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IALIAL
EQUIPE RESPONSÁVEL PELA COLETAEQUIPE RESPONSEQUIPE RESPONSÁÁVEL PELA COLETAVEL PELA COLETA
l Receber educação e treinamento adequados, quanto a coleta de amostras biológicas
l Utilização de EPIs universais (aventais descartáveis, máscaras, luvas, óculos de proteção)
l Descarte apropriado
ll Receber educaReceber educaçção e treinamento adequados, ão e treinamento adequados, quanto a coleta de amostras biolquanto a coleta de amostras biolóógicasgicas
ll UtilizaUtilizaçção de ão de EPIsEPIs universais (aventais universais (aventais descartdescartááveis, mveis, mááscaras, luvas, scaras, luvas, óóculos de culos de proteproteçção)ão)
ll Descarte apropriadoDescarte apropriado
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IALIAL
FATORES IMPORTANTES PARA O SUCESSO DA INVESTIGAÇÃO
FATORES IMPORTANTES PARA O FATORES IMPORTANTES PARA O SUCESSO DA INVESTIGASUCESSO DA INVESTIGAÇÇÃOÃO
l Escolha da amostra e seu transporte adequado ao laboratório possibilitarão medidas de controle imediatas e medidas de prevenção ao longo do tempo
l Essa meta será obtida pela investigação epidemiológica acurada e os dados do laboratório
ll Escolha da amostra e seu transporte Escolha da amostra e seu transporte adequado ao laboratadequado ao laboratóório possibilitarão rio possibilitarão medidas de controle imediatas e medidas de medidas de controle imediatas e medidas de prevenprevençção ao longo do tempoão ao longo do tempo
ll Essa meta serEssa meta seráá obtida pela investigaobtida pela investigaçção ão epidemiolepidemiolóógica acurada e os dados do gica acurada e os dados do laboratlaboratóóriorio
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Procedimentos de ColetaProcedimentos de Coleta
AspiradoAspirado de nasofaringede nasofaringe
SwabSwab de nasofaringede nasofaringe SwabSwab de orofaringede orofaringe
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Aspirado da nasofaringe Aspirado da nasofaringe -- ANSANS
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l *Aspirado da nasofaringe (não congelar)l Swab nasall Swab da orofaringel Swab combinadol Lavado da orofaringe (gargarejo)*l Aspirado traqueall Lavado broncoalveolar
ll *Aspirado da nasofaringe (não congelar)*Aspirado da nasofaringe (não congelar)ll SwabSwab nasalnasalll SwabSwab da orofaringeda orofaringell SwabSwab combinadocombinadoll Lavado da orofaringe (gargarejo)*Lavado da orofaringe (gargarejo)*ll Aspirado traquealAspirado traquealll Lavado Lavado broncoalveolarbroncoalveolar
AMOSTRAS BIOLÓGICASAMOSTRAS BIOLAMOSTRAS BIOLÓÓGICASGICAS
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AMOSTRAS BIOLÓGICASAMOSTRAS BIOLAMOSTRAS BIOLÓÓGICASGICAS
l Sangue, amostras pareadas, fase aguda (primeira amostra) e convalescente (segundaamostra)
l Adulto de 5 a 10 mL de sangue total
l Crianças de 2 a 5 mL de sangue total
ØO sangue total deverá ser transportado àtemperatura ambiente
ll Sangue, amostras pareadas, fase aguda Sangue, amostras pareadas, fase aguda ((primeira amostraprimeira amostra) e convalescente () e convalescente (segundasegundaamostraamostra) )
ll Adulto de 5 a 10 mL de sangue totalAdulto de 5 a 10 mL de sangue total
ll CrianCriançças de 2 a 5 mL de sangue totalas de 2 a 5 mL de sangue total
ØØ O sangue total deverO sangue total deveráá ser transportado ser transportado ààtemperatura ambientetemperatura ambiente
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IALIAL
ACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRASACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRASACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRAS
l Frascos apropriados de polipropileno com tampa de rosca
l Meio de transporte adequadol Temperatura adequada*l Gelo secol Nitrogênio líquido
ll Frascos apropriados de polipropileno com Frascos apropriados de polipropileno com tampa de roscatampa de rosca
ll Meio de transporte adequadoMeio de transporte adequadoll Temperatura adequada*Temperatura adequada*ll Gelo secoGelo secoll Nitrogênio lNitrogênio lííquidoquido
Intercâmbio de informaIntercâmbio de informaçções ões constante com o laboratconstante com o laboratóóriorio
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IALIAL
AMOSTRAS BIOLÓGICASAMOSTRAS BIOLAMOSTRAS BIOLÓÓGICASGICAS
l Caldo comum volume de 3 mLl Soro fisiológico estéril volume de 3 mLØPara acondicionamento dos swabs (combinado)ØLavado da orofaringeØ *Aspirado da nasofaringeØTransporte para o lab. em banho de gelo, gelo seco ou
nitrogênio líquidoØ ** Tempo
l Cuidado na identificação da amostral Observar as normas nacionais e internacionais da IATAl Rastrear o envio da amostra desde o ponto de origem
até a chegada ao laboratório
ll Caldo comum volume de 3 mLCaldo comum volume de 3 mLll Soro fisiolSoro fisiolóógico estgico estééril volume de 3 ril volume de 3 mLmLØØPara acondicionamento dos swabs (combinado)Para acondicionamento dos swabs (combinado)ØØ Lavado da orofaringeLavado da orofaringeØØ *Aspirado da nasofaringe*Aspirado da nasofaringeØØ Transporte para o Transporte para o lablab. em banho de gelo, gelo seco ou . em banho de gelo, gelo seco ou
nitrogênio lnitrogênio lííquidoquidoØØ ** Tempo** Tempo
ll Cuidado na identificaCuidado na identificaçção da amostraão da amostrall Observar as normas nacionais e internacionais da IATAObservar as normas nacionais e internacionais da IATAll Rastrear o envio da amostra desde o ponto de origem Rastrear o envio da amostra desde o ponto de origem
atatéé a chegada ao laborata chegada ao laboratóóriorio
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TRANSPORTE DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS
TRANSPORTE DAS AMOSTRAS TRANSPORTE DAS AMOSTRAS BIOLBIOLÓÓGICASGICAS
l Cuidado na identificação da amostra
l Observar as normas nacionais e internacionais da IATA
l Rastrear o envio da amostra desde o ponto de origem até a chegada ao laboratório
ll Cuidado na identificaCuidado na identificaçção da amostraão da amostra
ll Observar as normas nacionais e Observar as normas nacionais e internacionais da IATAinternacionais da IATA
ll Rastrear o envio da amostra desde o ponto Rastrear o envio da amostra desde o ponto de origem atde origem atéé a chegada ao laborata chegada ao laboratóóriorio
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Transporte das Amostras Biológicas
O transporte das
amostras ao
laboratório, deve
ser realizado no
mesmo dia da
coleta em isopor
com gelox
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IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETATESTE RÁPIDO
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETAIMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETATESTE RTESTE RÁÁPIDOPIDO
Secreção respiratóriaSecreção respiratória
Conjugado marcado com fluoresceínaConjugado marcado com fluoresceína
Anticorpos monoclonais (Flu-A, Flu-B, PF1, PF2, PF3, VRS e Adenovírus
Anticorpos monoclonais (Flu-A, Flu-B, PF1, PF2, PF3, VRS e Adenovírus
COLETA DO ASPIRADO NASOFARINGEO
COLETA DO ASPIRADO COLETA DO ASPIRADO NASOFARINGEONASOFARINGEO
Amostra não congeladaAmostra não congeladaAmostra não congelada
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IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS POR IMUNOFLOURESCÊNCIA INDIRETA
IDENTIFICAIDENTIFICAÇÇÃO DE VÃO DE VÍÍRUS POR RUS POR IMUNOFLOURESCÊNCIA INDIRETAIMUNOFLOURESCÊNCIA INDIRETA
Cultura de cCultura de céélula normallula normal Cultura de cCultura de céélula infectadalula infectada
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Transporte Aéreo de Amostras BiológicasAssociação Internacional de Transporte Aéreo “IATA”
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TENTATIVA DE ISOLAMENTO EM CULTURAS DE CÉLULAS
TENTATIVA DE ISOLAMENTO EM TENTATIVA DE ISOLAMENTO EM CULTURAS DE CCULTURAS DE CÉÉLULASLULAS
Isolamento viralIsolamento viralIsolamento viral
Culturas celularesCulturas celularesCulturas celulares
HEp-2, Vero, MDCK, HEpHEp--2, 2, VeroVero, MDCK, , MDCK,
Leituras diáriasEfeito citopático (ECP)
Leituras diLeituras diááriasriasEfeito Efeito citopcitopááticotico (ECP)(ECP)
Presença de ECP
PresenPresençça a de ECPde ECP
Segunda passagem em tubos
Segunda passagem Segunda passagem em tubosem tubos
Anticorpos monoclonais (Flu-A, Flu-B, PF1, PF2, PF3, VRS e
Adenovírus)
Anticorpos Anticorpos monoclonaismonoclonais ((FluFlu--AA, , FluFlu--B, PF1, PF2, PF3, VRS e B, PF1, PF2, PF3, VRS e
AdenovAdenovíírusrus))
Identificação do agente etiológicoIdentificaIdentificaçção do ão do
agente etiolagente etiolóógicogico
Ausência do ECP
Ausência Ausência do ECPdo ECP
Segunda passagemSegunda Segunda
passagempassagem
Leituras diárias
Leituras Leituras didiááriasrias
Ausência do ECP
Ausência Ausência do ECPdo ECP
Terceira passagemTerceira Terceira
passagempassagem
ImunofluorescênciaIndireta (pool respiratório)
ImunofluorescênciaImunofluorescênciaIndireta Indireta (pool respirat(pool respiratóório)rio)
HEp-2HEpHEp--22 VeroVeroVero MDCKMDCKMDCK
IFIIFIIFI
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Alterações morfológicas decorrentes de replicação viral –sincícios - .Vírus Respiratório Sincicial; Vírus da Parainfluenza
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OVOS EMBRIONADOS DE GALINHAOVOS EMBRIONADOS DE GALINHAOVOS EMBRIONADOS DE GALINHA
InoculaInoculaçção Membrana ão Membrana corioalantcorioalantóóideide
AlbuminaAlbumina
22Cavidade Cavidade AlantAlantóóicaica
33MembranaMembranaCCóórioalantrioalantóóideideCascaCasca
Câmara de ArCâmara de Ar
11Cavidade AmniCavidade Amnióóticatica
InoculaInoculaçção Cavidade ão Cavidade AlantAlantóóicaica
Saco Saco VitelVitelííniconico
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IDENTIFICAÇÃO DO ISOLADO - INFLUENZAIDENTIFICAIDENTIFICAÇÇÃO DO ISOLADO ÃO DO ISOLADO -- INFLUENZAINFLUENZACultura de células (MDCK)Cultura de cCultura de céélulas (MDCK)lulas (MDCK)
Teste de hemadsorçãoTeste de Teste de hemadsorhemadsorççãoão
Tipagem (A e B)TipagemTipagem (A e B)(A e B)Imunofluorescência indiretaImunofluorescência indiretaImunofluorescência indireta
Subtipagem (H1 e H3)SubtipagemSubtipagem (H1 e H3)(H1 e H3)Inibição da hemaglutinaçãoSoros imune específicos (OMS)InibiInibiçção da hemaglutinaão da hemaglutinaççãoãoSoros imune especSoros imune especííficos (OMS)ficos (OMS)
CDC AtlantaCDC AtlantaCDC Atlanta
Organização Mundial de SaúdeOrganizaOrganizaçção Mundial de Saão Mundial de Saúúdede
Ovos embrionadosOvos embrionadosOvos embrionados
Teste de hemaglutinaçãoTeste de hemaglutinaTeste de hemaglutinaççãoão
Subtipagem (H1 e H3)SubtipagemSubtipagem (H1 e H3)(H1 e H3)Inibição da hemaglutinaçãoSoros imune específicos (OMS)InibiInibiçção da hemaglutinaão da hemaglutinaççãoãoSoros imune especSoros imune especííficos (OMS)ficos (OMS)
CDC AtlantaCDC AtlantaCDC Atlanta
Organização Mundial de SaúdeOrganizaOrganizaçção Mundial de Saão Mundial de Saúúdede
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Vírus da InfluenzaMicroscopia eletrônica
VVíírus da Influenzarus da InfluenzaMicroscopia eletrônicaMicroscopia eletrônica
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Identificação de um novo subtipo viralIdentificaIdentificaçção de um novo subtipo viralão de um novo subtipo viral
l RT – PCR
l PCR em Tempo Real
Ø Primers Universal A e BØ Subtipos H1, H3, H5, H7, H9
ll RT RT –– PCRPCR
ll PCR em Tempo RealPCR em Tempo Real
ØØ PrimersPrimers Universal A e BUniversal A e BØØ Subtipos H1, H3, H5, H7, H9Subtipos H1, H3, H5, H7, H9
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Primers A H3 H1 A H3 A H3 B B B B B A
AmostrasAmostras A B C D E A B C D E F G H H2OF G H H2OPaiva, TM; Santos, CLS Paiva, TM; Santos, CLS etet al (em publicaal (em publicaçção) Servião) Serviçço de Virologia, IALo de Virologia, IAL
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199619962%2%5%5%
25%25%
3%3%16%16%
28%28%
21%21%
19971997 18%18%
45%45%
37%37%
199819982%2% 0%0%
81%81%
17%17%
19991999 7%7%
79%79%
14%14%
2000200044%44%
9%9%25%25%
1%1%
14%14%6%6% 1%1%
A/Texas/36/91 (H1N1)A/Texas/36/91 (H1N1)A/A/BayernBayern/07/95 (H1N1)/07/95 (H1N1)A/Taiwan/01/86 (H1N1)A/Taiwan/01/86 (H1N1)A/New A/New CaledoniaCaledonia/20/99 (H1N1)/20/99 (H1N1)A/A/JohannesburgJohannesburg/82/99 (H1N1)/82/99 (H1N1)A/Alaska/10/95 (H3N2)A/Alaska/10/95 (H3N2)A/A/JohannesburgJohannesburg/33/94 (H3N2)/33/94 (H3N2)
A/A/WuhanWuhan/35/95 (H3N2)/35/95 (H3N2)A/Sydney/05/97 (H3N2)A/Sydney/05/97 (H3N2)A/Moscou/10/99 (H3N2)A/Moscou/10/99 (H3N2)A/A/PanamaPanama/2007/99 (H3N2)/2007/99 (H3N2)B/B/BeijingBeijing/184/93/184/93B/B/SichuanSichuan/379/99/379/99
VVíírus da rus da influenza influenza
isolados e isolados e caracterizados caracterizados no perno perííodo de odo de
19961996--2000.2000.
IAL IAL -- SPSP
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meses do ano
NEG
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DiagnDiagnóóstico rstico ráápido pelo teste de IFI, durante 2000 pido pelo teste de IFI, durante 2000 -- 20012001
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Investigação do Agente EtiológicoInvestigaInvestigaçção do Agente Etiolão do Agente Etiolóógicogico
Metodologias DiagnósticasMetodologias DiagnMetodologias Diagnóósticassticas
Amostra biológicaAmostra biolAmostra biolóógicagica
Microscopia eletrônica (ME)
(coloração negativa)
Microscopia Microscopia eletrônica (ME) eletrônica (ME)
(colora(coloraçção negativa)ão negativa)
PCRPCRPCR Imunofluorescênciaindireta (IFI)
ImunofluorescênciaImunofluorescênciaindireta (IFI)indireta (IFI)
Tentativa de isolamento viral
(IV)Culturas celulares
e ovos embrionados
Tentativa de Tentativa de isolamento viral isolamento viral
(IV)(IV)Culturas celularesCulturas celulares
e ovos e ovos embrionadosembrionados
SorologiaSorologiaSorologia
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