dizerta ČnÍ prÁcemedia1.mistecko.cz/files/media1:50f81cb892f37.pdf.upl/disermed.pdf ·...

1

Univerzita Karlova v Praze

Přírodov ědecká fakulta

Katedra genetiky a mikrobiologie

DIZERTAČNÍ PRÁCE

Rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům

u koaguláza negativních stafylokoků v ČR

Mgr. Gabriela Novotná

Praha 2007

2

Tato dizertační práce byla vypracována v Mikrobiologickém ústavu Akademie věd České republiky v

Laboratoři biologie sekundárního metabolismu pod odborným vedením Ing. Jiřího Janaty, CSc. v

období říjen 2000 - září 2007.

Práce vznikla za podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy (148/2005/B-Bio/PřF), Grantové

agentury ČR (GA204/04/0801), Grantové agentury Akademie věd ČR (IAA600200519) a Ministerstva

školství, mládeže a tělovýchovy ČR (1M06011)

Prohlašuji, že jsem předloženou práci vypracovala samostatně a použila jen prameny, které cituji a

uvádím v seznamu použité literatury.

Dále prohlašuji, že tato práce, ani její podstatná část, nebyla předložena k získání jiného titulu

V Praze, září 2007 .......................................

Mgr. Gabriela Novotná

3

Především bych chtěla poděkovat svému školiteli Ing. Jiřímu Janatovi, CSc. za vedení práce,

odborné diskuze, cenné rady a kritické připomínky. Dále děkuji RNDr. Petru Petrášovi za konzultace týkající se diagnostiky koaguláza negativních

stafylokoků a MVDr. Otu Melterovi, Ph.D. za pomoc při genotypizování izolátů S. haemolyticus. Anně Matuškové děkuji za praktické rady při práci s rekombinantní DNA a s heterologními proteiny.

Děkuji též všem ostatním členům laboratoře Biologie sekundárního metabolismu, kteří svými radami a pomocí přispěli ke vzniku této práce. Spolustolovníkům v jídelně MBÚ děkuji za příjemné chvilky.

Velký dík pak patří mému Alešovi za to, že to se mnou vydržel.

Obsah

4

I. ÚVOD 6

II. LITERÁRNÍ ÚVOD 8

1. Koaguláza negativní stafylokoky - nozokomiální infekce, rezis tence a terapeutické možnosti. 9

2. Makrolidy, linkosamidy a streptograminy (MLS) 12 2.1. Makrolidy 12 2.2. Linkosamidy 14 2.3. Streptograminy 15

3. Mechanismy rezistence k makrolid ům, linkosamid ům a streptogramin ům u stafylokok ů 17 3.1. Změna zásahového místa 17

3.1.1. MLSB rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2058 17 3.1.2. PhLOPSA rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2503 20 3.1.3. Rezistence k MLS antibiotik ům mutacemi v zásahovém míst ě 20

3.2. Inaktivace MLS antibiotik 21 3.2.1. Inaktivace makrolid ů 21 3.2.2. Inaktivace linkosamid ů 22 3.2.3. Inaktivace streptogramin ů A 22 3.2.4. Inaktivace streptogramin ů B 23

3.3. Transportní rezistence 23 3.3.1. ABC-transportéry 24 3.3.2. Rezistence k MLS antibiotik ům = 2. třída ABC protein ů 24 3.3.3. Jedná se skute čně o transport? 27 3.3.4. Regulace: atenuace translace nebo terminace transkripc e? 27

4. Frekvence MLS rezistencí u CoNS a klinický význam jednotli vých rezisten čních mechanism ů

29 4.1. Rezistence k makrolid ům a linkosamid ům 29 4.2. Inducibilní rezistence 31 4.3. Rezistence ke streptogramin ům 31 4.4. Mobilní elementy nesoucí MLS rezisten ční geny 33

III.VÝSLEDKY 34

1. Rozšíření mechanism ů rezistence k makrolid ům a linkosamid ům u methicilin rezistentních koaguláza negativních stafylokok ů v České republice a výskyt neznámého mechanismu rezistence k linkosamid ům 35

2. Nová varianta proteinu streptograminové rezistence, Vga(A) LC, ze Staphylococcus haemolyticus se změnou substrátové specifity sm ěrem k linkosamid ům 36

3. In vitro účinnost telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu proti methicilin rezi stentním koaguláza negativním stafylokok ům s definovaným rezisten čním genotypem 37

4. Sekvenční analýza okolí rezisten čního genu msr (A) u S. haemolyticus (data pro připravovanou publikaci) 38

IV. DISKUZE 46

V. REFERENCE 51

Zkratky

5

Seznam zkratek:

ABC protein (ATP-binding casette) ATP-vazebný protein ARE rodina (antibiotic resistance) rodina ABC proteinů CLI klindamycin

cMLSB konstitutivní MLSB rezistence CoNS koaguláza negativní stafylokoky CSLI Clinical Standard Laboratory Institute DDM disková difúzní metoda ERY erythromycin

iMLSB inducibilní MLSB rezistence IR invertovaná repetice IS inzerční sekvence ISLE inzerčním sekvencím podobný element LIN linkomycin

LSA rezistence k linkosamidům a streptograminům A

MLSB rezistence k makrolidům linkosamidům a streptograminům B

MSB rezistence k makrolidům a linkosamidům PFGE pulzní gelová elektroforéza

PhLOPSA rezistence k florfenikolům, linkosamidům, oxazolidinonům pleuromutilinům a streptograminům A

PIIA Pristinamycin IIA Q/D quinupristin a dalfopristin SgA streptograminy A SgB streptograminy B SÚKL Státní ústav pro kontrolu léčiv TEL telithromycin TIRL levá terminální invertovaná repetice CFU RBS (ribosom binding site) vazebné místo pro ribozóm TIRR pravá terminální invertovaná repetice TM doména transmembránová doména

ÚVOD

6

I. ÚVOD

ÚVOD

7

Na počátku dvacátého století byly infekce celosvětově hlavní příčinou úmrtí. Teprve s nástupem

antibiotické éry významně klesla mortalita způsobená bakteriálními infekcemi. Všeobecně se

předpokládalo, že problém infekčních chorob je objevem antibiotik definitivně vyřešen. Při slyšení v

Kongresu v r. 1969 hlavní lékař zdravotnických zařízení USA William H. Stewart prohlásil: „Přišel čas

uzavřít kapitolu infekčních nemocí.“ (44). Protože existující spektrum antibiotik bylo v té době pro

kontrolu infekčních chorob dostatečné, obrátila se pozornost farmaceutických firem na výzkum

lukrativnějších skupin léčiv zaměřených na léčbu chronických chorob. Za posledních třicet let tak byla

na trh uvedena pouze dvě skutečně nová antibiotika linezolid a daptomycin (139, 191). V souvislosti s

celosvětovým nárůstem používání antibiotik se však u mikroorganismů začaly objevovat a hromadit

rezistence k těmto látkám. Zatím ke každé skupině antibiotik, která byla do roku 2004 uvedena na trh,

se časem u patogenních mikroorganizmů objevil rezistenční mechanismus, který je důvodem řady

terapeutických selhání (94). Enormní a často neuvážené používání antibiotik vedlo k selekci

multirezistentních baktérií, zejména v nemocnicích kde jsou ideální podmínky pro jejich vznik a šíření.

Ve Spojených státech byla zaznamenána rezistence alespoň k jednomu antibiotiku u 70% původců

nosokomiálních infekcí (90). Dokonce i vankomycin používaný pouze jako antibiotikum poslední volby

zejména proti problematickým methicilin rezistentním stafylokokům ztrácí svoji účinnost. V roce 1997

byly objeveny první částečně rezistentní kmeny Staphylococcus aureus (61). O dva roky později byl

dokonce popsán první klinický případ plně vankomycin rezistentního kmene tohoto původce vážných

postoperačních infekcích (16). Methicilin rezistentní stafylokoky jsou běžně rezistentní i k ostatním

beta-laktamům, gentamicinu. 80% z nich je také rezistentní alespoň k jednomu z pěti následujících

antibiotik: erythromycinu, klindamycinu, cotrimoxazolu, ciprofloxacinu a tetracyklinu. Zatímco biologie

a způsob šíření methicilin rezistentních kmenů Staphylococcus aureus (MSRA) byly podrobně

studovány jak ve světě tak i na území ČR (114, 115), rezistence u koaguláza negativních stafylokoků

(CoNS) je prostudována jen okrajově. Přitom právě tyto blízce příbuzné mikroorganismy mohou sloužit

jako zdroj nových rezistenčních determinant pro klinicky významnější patogen. Mimoto jsou CoNS

důležitým infekčním agens u hospitalizovaných imunokomprimovaných pacientů a stejně tak u

pacientů s intravenózními katétry.

V roce 1996 byl v rámci rozsáhlé epidemiologické studie rezistence k methicilinu Národní referenční

laboratoří pro stafylokoky shromážděn soubor 2234 klinických izolátů stafylokoků (1315 izolátů S.

aureus a 919 izolátů CoNS). Hlavním záměrem epidemiologické studie, která byla realizována

Národní referenční laboratoří pro antibiotika, bylo zmapovat klonální strukturu methicilin rezistentních

izolátů Staphylococcus aureus na území ČR (113-115). My jsme využili tutéž sbírku izolátů pro

studium mechanismů rezistence k makrolidům a linkosamidům u methicilin rezistentních CoNS.

Protože jsme mezi izoláty zjistili neobvyklou distribuci rezistenčních mechanismů a také jsme objevili

nový rezistenční fenotyp naznačující přítomnost doposud neznámé rezistenční determinanty rozhodli

jsme se pokračovat v podrobnějším studiu těchto jevů. Výsledky studia jsou shrnuty ve třech přijatých

a jedné připravované publikaci, které jsou prezentovány v předkládané disertační práci. Uplatněním

postupů klinické mikrobiologie, molekulární biologie i bakteriální genetiky jsme se pokusili o ucelený

pohled na problematiku vzniku a šíření rezistencí k antibiotikům u klinicky významných

mikroorganizmů

8

II. LITERÁRNÍ ÚVOD

LITERÁRNÍ ÚVOD Koaguláza negativní stafylokoky

9

1. Koaguláza negativní stafylokoky - nozokomiální i nfekce,

rezistence a terapeutické možnosti.

Koaguláza negativní stafylokoky (CoNS) patří mezi nejčastěji izolované mikroorganismy v

laboratořích klinické mikrobiologie. Vzhledem ke své všudypřítomnosti a relativně nízké virulenci byly

dlouho považovány za klinicky nevýznamné kontaminanty klinických vzorků. Avšak postupem času

začaly být CoNS vnímány jako důležité etologické agens nozokomiálních infekcí a nyní patří dokonce

mezi nejčastější příčinu infekcí u hospitalizovaných pacientů s intravenózními katétry a u

imunokomprimovaných pacientů. Podle studie National Nosocomial Infections Surveillance System

byly v letech 1990-1999 CoNS nejčastějšími pozorovanými patogeny (37,7 %, v porovnání s 12,6 %

pro S. aureus) izolovanými z infekcí krevního řečiště na jednotkách intenzivní péče (189). Jejich

význam jako etiologické agens nozokomiálních infekcí je dán zejména výskytem na površích lidského

těla ve velkých koncentracích, až 103 - 106 CFU/cm2 (82), dále pak selekcí, která je výsledkem

používání širokospektrých antibiotik v nemocnicích, schopností adherovat a tvořit biofilm na površích

intravaskulárních katétrů a jiných lékařských nástrojů a relativně nízkými nutričními nároky (137).

Protože až 85 % izolátů CoNS je výsledkem kontaminace, zejména při odběru krve, je velmi

problematické odlišení takovýchto kontaminací od skutečných původců infekcí krevního řečiště (195).

Pokud je tentýž mikroorganismus alespoň dvakrát po sobě izolován z nezávislých hemokultur, může

být považován za původce infekce. U katétrové infekce je nutný průkaz stejného mikroorganismu z

hemokultury a kultury z povrchu katétru. Pro druh S. epidermidis je pro potvrzení nutné kromě

druhové identifikace také ověření totožnosti kmene jeho typizací (81). Mezi nejčastěji izolované

stafylokokové izoláty v Evropě v letech 2002-2004 patřily tyto druhy: S. epidermidis, S. haemolyticus,

S. hominis, S. capitis, S. warnerii, S. xylosis (156). Jednotlivé druhy CoNS se liší svojí virulencí. Velké

zastoupení izolátů identifikovaných jako infekční agens bylo pozorováno u S. lugundensis (91 % z

celkového počtu izolátů tohoto druhu) a S. saprophyticus (88 %), naproti tomu poměr klinicky

významných izolátů ke kontaminantům byl menší u S. epidermidis (52 %) a S. haemolyticus (11 %)

(180). Tyto dva posledně zmíněné druhy však často tvoří většinu (až 90 %) všech CoNS izolátů.

Zatímco patogenita druhu S. epidermidis je spojena zejména se schopností adheze a tvorby biofilmu

na polymerních površích zdravotnického materiálu, u podstatně virulentnějších druhů S. lugdunensis a

S. schleiferi, které způsobují agresivní a až život ohrožující infekce, jsou patogenní mechanismy

podobné těm z S. aureus (produkce clumping faktoru a termostabilní DNásy (189)). S. saprophyticus

je významným oportunním patogenem způsobujícím infekce močových cest. Specifická afinita k

uroepitealním buňkám je dána řadou povrchových proteinů typických pro tento druh.

Problémem nozokomiálních infekcí je vysoký výskyt kmenů mnohočetně rezistentních k

antibiotikům. Stejně jako u S. aureus je hlavním problémem infekcí způsobených CoNS rezistence k

oxacilinu. Zatímco u S. aureus se rezistence vyskytuje u necelých 30 %, u CoNS to je až 77 %

rezistentních izolátů (Tab. 1.1.). Navíc rezistence k oxacilinu s sebou nese výrazně vyšší podíl

rezistence k dalším antibiotikům. Kromě všech β-laktamů jsou oxacilin-rezistentní CoNS často

rezistentní také k erythromycinu (72,7 %), ciprofloxacinu (67,5 %), levofloxacinu (62,9 %),


10

trimethoprim-sulfamethoxazolu (47,4 %) a klindamycinu (32,5 %). Naopak některá novější antibiotika

vankomycin a teikoplanin (glykopeptidy), quinupristin/dalfopristin (streptograminy), linezolid

(oxazilidony) a daptomycin (lipopeptidy) si zachovávají dobrou účinnost, a jsou tedy považovány za

antibiotika poslední volby pro léčbu nozokomiálních stafylokokových infekcí (Tab. 1.2.).

Tab.1.1. Evropský pr ůměr četností rezistence k oxacilinu u CoNS a S. aureus. Da ta převzata z rozsáhlých studií SENTRY antimicrobial surveillance programme.

CoNS S. aureus Izolovány v

letech: Počet izolátů

Oxacilin rezistentní

(%) Počet izolátů

Oxacilin rezistentní

(%)

Reference:

1997-1999 2068 73,1 3477 26,9 (35) 2002-2004 1942 77 4842 26,7 (156) 2005 941 71,5 2746 29,1 (157)

Nicméně i k těmto antibiotikům se u stafylokoků vyvíjí rezistence. Rezistence ke

glykopeptidům u klinických izolátů byla poprvé pozorována již v roce 1979 a 1983 u S. epidermidis

(175) a v roce 1986 u S. haemolyticus (168). Teprve v roce 1997 byly objeveny částečně rezistentní

kmeny S. aureus (61) a o dva roky později byl dokonce popsán první klinický případ plně vankomycin

rezistentního kmene tohoto původce vážných postoperačních infekcí (16). Mechanismus intermediární

glykopeptidové rezistence u stafylokoků je způsoben strukturními změnami v buněčné stěně,

konkrétně zvýšením počtu vazebných míst pro vankomycin. To má za následek jeho "vychytání" ještě

před navázáním do zásahového místa, jímž je prekurzor buněčné stěny (59). Rezistence k vysokým

hladinám glykopeptidů je u stafylokoků způsobena získáním enterokokového shluku genů vanA, které

kódují alternativní část biosyntetické dráhy buněčné stěny (194). Také mechanismy rezistence ke

streptograminům jsou poměrně dobře prostudovány. I přes dlouholeté používání streptograminových

antibiotik ve veterinární praxi si kombinace streptograminů A a B quinupristin/dalfopristin zachovává

dobrou účinnost. A to díky synergistickému účinku obou antibiotik, který je zachován i přes získání

rezistence k jednomu ze streptograminů (25). Linezolid a daptomycin jsou prvními zástupci dvou

nových skupin antibiotik oxazilidonů a cyklických lipopeptidů. Mechanismus antibakteriálního účinku

oxazolidinových antibiotik spočívá v jejich vazbě na 50S podjednotku bakteriálního ribozómu v

peptidyl-tRNA vazebném místě P, což zabraňuje vazbě molekuly fMet-tRNA a tvorby iniciačního

komplexu (176). Rezistence k linezolidu u S. aureus je popisována ojediněle a to v souvislosti s

dlouhodobou linezolidovou léčbou a přítomností cizorodých materiálů (133). Výskyt rezistence u

CoNS se dle různých surveillančních programů pohybuje pod 0,1 %, avšak lokálně může být i vyšší a

to díky šíření linezolid-rezistentních klonů v nemocničním prostředí (138). Daptomycin je proti CoNS,

včetně oxacilin rezistentních izolátů, neúčinnějším z výše popsaných "nových" antibiotik. Jeho

mechanismus účinku spočívá ve vazbě na membránu a tvorbě pórů propustných pro ionty, následná

depolarizace membrány způsobuje narušení energetického metabolismu buňky a její smrt. Doposud

bylo popsáno pouze pár ojedinělých případů daptomycin-rezistentních klinických izolátů S. aureus, u

nichž se rezistence vyvinula během antibiotické léčby (101, 105).


11

Tab.1.2. Četnosti rezistencí k antibiotik ům u klinických izolát ů CoNS a S. aureus citlivých nebo rezistentních k oxacilinu v Evrop ě. Data z rozsáhlých studií SENTRY antimicrobial survei llance programme

Rezistentní (%) Organismus 1997-1999a 2002-2004b 2005c

Koaguláza negativní stafylokoky Oxacilin citlivé (počet izolátů) (556) (447) (268) Erythromycin 30,6 28 44 Ciprofloxacin 10,1 8,7 11,9 Tetracyklin 15,8 16,2 - Levofloxacin - 7,8 10,4 Trimethoprim-sulfamethoxazol - 11 8,2 Klindamycin 9,7 3,8 4,5 Rifampin 2,7 - 2,6 Chloramfenikol 6,3 - 2,6 Vankomycin 0 0 0 Teikoplanin 0,4 0 0 Quinupristin-Dalfopristin - 0 0 Linezolid - 0 0 Daptomycin - 0 0 Oxacilin rezistentní (počet izolátů) (1512) (1495) (673) Erythromycin 72 70,5 72,7 Ciprofloxacin 50,5 63,9 67,5 Tetracyklin 22,2 17,4 - Levofloxacin - 58,7 62,9 Trimethoprim-sulfamethoxazol - 49,1 47,4 Klindamycin 47,9 36,6 32,5 Rifampin 15,1 - 13,4 Chloramfenikol 24,5 - 13 Vankomycin 0 0 0 Teikoplanin 0,5 0,6 0,6 Quinupristin-Dalfopristin - 0,5 0,4 Linezolid - 0 0 Daptomycin - 0 0

a Diekema, DJ a kol., 2001 (35) b Sader, HS a kol., 2006 (156) c Sader, HS a kol., 2007(157)

LITERÁRNÍ ÚVOD Makrolidy, linkosamidy a streptograminy

12

2. Makrolidy, linkosamidy a streptograminy (MLS) Makrolidy, linkosamidy a streptograminy jsou chemicky velmi různorodé antibakteriální látky,

které mají podobný mechanismus účinku spočívající ve vazbě antibiotika na velkou podjednotku

bakteriálního ribozómu. V souvislosti s tím se vyvinuly i některé společné mechanismy rezistence

bakterií k těmto antibiotikům. Producenty těchto látek jsou mikroorganismy rodu Streptomyces spp.

Biologická aktivita těchto tří skupin látek je také velice podobná.

2.1. Makrolidy

V letech 1999-2005 byly makrolidy třetí nejpoužívanější skupinou antibiotik v České republice

a jejich spotřeba stále stoupá (SÚKL). Tyto antibiotika jsou tvořena 14-, 15-, nebo 16-členným

laktonovým kruhem nesoucím jeden nebo více cukrů a několik dalších substitucí. Nejznámějším

zástupcem makrolidů je erythromycin A (Obr.2.1.), který byl zaveden do klinické praxe již v roce 1952.

Od té doby bylo vyvinuto několik generací makrolidů lišících se schopností indukovat rezistenci,

rozšířeným spektrem účinku a lepší stabilitou v kyselém prostředí (198) (Tab. 2.1.). Tyto antibiotika

jsou účinná hlavně proti grampozitivním kokům.

Tab.2.1. Přehled vlastností nej častěji používaných makrolidových antibiotik.

Generace Velikost

laktonového kruhu

Název antibiotika

Producent Charakteristické vlastnosti

erythromycin Saccharopolyspora erythraea 1. generace 14 členný

oleandomycin Streptomyces antibioticus

indukce rezistence, malá stabilita v kyselém prostředí

spiramycin Streptomyces ambofaciens

tylosin Streptomyces fradiae

2. generace 16 členný

karbomycin A Streptomyces thermotolerans

neindukují rezistenci, malá stabilita v kyselém prostředí

klarithromycin semisyntetický 14 členný

roxithromycin semisyntetický 3. generace

15 členný azithromycin semisyntetický

indukují rezistenci, vylepšená stabilita v kyselém prostředí, širší antimikrobiální spektrum také proti mykobakteriím a chlamydiím.

4. generace (ketolidy) 14 členný telithromycin semisyntetický

neindukují rezistenci, dobrá stabilita v kyselém prostředí, účinné i proti některým erythromycin rezistentním kmenům


13

Mechanismus účinku makrolidů spočívá ve vazbě antibiotika na velkou ribozomální

podjednotku v blízkosti peptidyltransferasového místa, čímž inhibuje proteosyntézu (197). Avšak

detailní mechanismus inhibice nebyl ještě zcela objasněn. Nedávno publikované krystalové struktury

velké podjednotky ribozómu s navázanými antibiotiky potvrdily již dřívější biochemické analýzy vazby

makrolidů na ribozóm (14, 51, 52, 162). Důležitým místem pro vazbu je interakce C5 mono- nebo

disacharidového postranního řetězce 14-, 15- a 16-členných makrolidů s dusíkovými bázemi

nukleotidů v pozicích A2058 a A2059 v doméně V molekuly 23S rRNA (E. coli číslování). Toto místo je

pro vazbu antibiotik klíčové a vysvětluje, proč mutace či modifikace v tomto místě způsobují rezistenci

k makrolidům. Na vazbě makrolidů se podílejí také ribozomální proteiny L4 a L22, což opět vysvětluje,

proč mutace v těchto proteinech způsobují částečnou rezistenci (46). U makrolidů byly popsány čtyři různé mechanismy inhibice proteosyntézy: 1) Inhibice

Obr. 2.1. Chemické struktury n ěkterých makrolidových, linkosamidových a streptograminových antibiotik (PubChem, NCBI)


14

prodlužování nascentního peptidu, 2) Stimulace disociace peptidyl-tRNA z ribozómu 3) Inhibice tvorby

peptidové vazby a 4) zabránění správného složení velké ribozomální podjednotky. Všechny tyto

mechanismy přispívají k celkovému účinku makrolidů. Nejdůležitější mechanismus inhibice

pravděpodobně souvisí s vazbou makrolidů do tunelu, který vytváří velká podjednotka ribozómu (Obr.

2.2. a 2.3.). Dříve se předpokládalo, že tento tunel je pouze inertní struktura, kterou prochází právě

syntetizovaný peptid, avšak nyní se zdá, že jde o dynamickou strukturu ovlivňující průběh

proteosyntézy. Ačkoli je tento tunel relativně široký, obsahuje dvě zúžení, která jsou tvořena proteiny

L4 a L22. Makrolidy vázající se do tohoto zúžení tak můžou blokovat cestu pro rostoucí peptid.

2.2. Linkosamidy

Tato skupina antibiotik zahrnuje linkomycin a jeho semisyntetické deriváty (Obr. 2.1.).

Linkomycin byl poprvé izolován v roce 1963 z kmene Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis

(106). Skládá se ze dvou stavebních jednotek, cukerné (methylthiolinkosaminid) a aminokyselinové

(derivát prolinu), spojených amidovou vazbou. Jedinými používanými antibiotiky této skupiny v klinické

praxi jsou linkomycin a mnohem účinnější klindamycin. Klindamycin je semisyntetický derivát

připravený chlorací linkomycinu na sedmém uhlíku aminocukerné části. Derivátem klindamycinu je

pirlimycin, který je používán výhradně ve veterinární medicíně.

Mechanismus účinku linkosamidů je stejný jako u makrolidů a je způsoben disociací peptidyl-

tRNA z ribozómu. Rozdíl spočívá ve vzdálenosti místa vazby antibiotika od peptidyltransferasového

místa, a tedy i v délce disociovaného nascentního peptidu (Obr. 2.2.) (182). Kromě grampozitivních

koků jsou linkosamidy účinné také proti anaerobním bakteriím.


15

2.3. Streptograminy

Streptograminy jsou přírodní látky produkované mikroorganismy rodu Streptomyces. Tuto

skupinu antibiotik tvoří dva typy látek, streptograminy A (polysaturované cyklické peptidy, SgA) a

streptograminy B (cyklické hexadepsipeptidy, SgB), které jsou současně produkovány jednou bakterií

v přibližném poměru 7:3 (134). Jednotlivě mají SgA a SgB bakteriostatické účinky proti grampozitivním

kokům, avšak při společném působení obou látek vykazují silný baktericidní efekt (67). Ačkoli byly

streptograminy objeveny již v roce 1950, v klinické praxi nebyly příliš hojně využívány. Donedávna byl

užíván pouze pristinamycin (kombinace pristinamycinu IA a pristinamycinu IIA), a to pouze ve Francii

pro léčbu stafylokokových infekcí. Klinický význam těchto antibiotik vzrostl až s vývojem

semisyntetických derivátů dalfopristinu (streptogramin A) a quinupristinu (streptogramin B), které jsou

Obr. 2.2. Struktura 50S podjednotky v komplexu s analogem peptidyl-tRNA a s různými MLS antibiotiky. Z obrázku je patrná různá vzdálenost antibiotik od peptidyltransferasového místa, konkrétně od dusíku N3 adeninu v pozici A2451(adenin - ČEVENĚ, N3 - ŽLUTĚ) V tabulce je vzdálenost vyjádřená v Å. Různá vzdálenost antibiotika od peptidyltransferasového místa se projevuje v různé délce peptidu disociujícího z ribozómu účinkem antibiotika. V experimentu byly použity dvě různé mRNA: MS mRNA a erm mRNA kódující různé polypeptidy (délka disociujících peptidů hlavní frakce je zvýrazněná v tabulce tlustě). ZELENÉ - nukleotidy A2058, A2059 a A2062 23S rRNA, které jsou důležité pro vazbu makrolidových antibiotik MODŘE A ŽLUTĚ -proteiny L4 a L22 tvořící zúžení tunelu. a) 50S podjednotka v komplexu s analogem tRNA b) - f) 50S podjednotka s navázanými antibiotiky. ČERVENĚ případně i FIALOVĚ, A ČERNĚ (jsou pro odlišení zvýrazněny jednotlivé struktury sloučenin). Struktura 50S podjednotky v komplexu s pristinamycinem IA (SgB) chybí, avšak shodná velikost disociovaného peptidu s erythromycinem naznačuje podobné místo vazby na ribozóm Převzato z Tenson et al, 2003 (182)


16

podávány jako alternativní antibiotikum proti vankomycin rezistentním grampozitivním kokům. V

současné době je testován nový semisyntetický derivát XRP2868, který vykazuje až čtyřikrát větší

účinnost in vitro než kombinace dalfopristinu a quinupristinu (38).

Streptogramin A se váže do peptidyltransferasového místa ribozómu, pouze pokud zde není

navázána aminoacyl-tRNA, a blokuje tak její navázání. Navíc vazba streptograminu A způsobuje

konformační změny velké ribozomální podjednotky tak, že zvyšuje aktivitu streptograminu B a to více

jak 100-krát (188). Streptogramin B naopak zabraňuje podobně jako makrolidy a linkosamidy

prodlužování peptidu tím, že zabrání jeho prostupu tunelem (Obr. 2.3.). na rozdíl od streptograminu A

je streptogramin B schopen se k ribozómu vázat ve všech stadiích translace.

Obr. 2.3. Struktura dalfoprisitinu a quinupristinu navázaných na vel kou 50S podjednotku bakteriálního ribozómu. A) Elektronová densita dalfopristinu a quinupristinu navázaných na ribozóm B) Pozice dalfopristinu, quinupristinu a peptidyl-tRNA. Na obrázku je dobře vidět zablokování zúžení tunelu quinupristinem. Převzato z Mukhtar et al., 2005 (119)

LITERÁRNÍ ÚVOD Mechanismy rezistence

17

3. Mechanismy rezistence k makrolid ům, linkosamid ům a

streptogramin ům u stafylokok ů Tři základní mechanismy rezistence k MLS antibiotikům byly popsány u stafylokoků: Změna

zásahového místa může být způsobena jednak posttranskripční modifikací 23S rRNA, jednak

mutacemi v 23S rRNA nebo v ribozomálních proteinech. Jiným mechanismem je inaktivace antibiotika

buď jeho modifikací navázáním jiné sloučeniny, nebo jeho degradací. Třetím mechanismem je aktivní

transport antibiotika ven z buňky.

3.1. Změna zásahového místa

Tento mechanismus rezistence úzce souvisí s místem vazby a mechanismem účinku

antibiotik. Protože se vazebná místa MLS antibiotik z velké části překrývají, také rezistence

způsobená změnou zásahového místa je společná. V některých případech se může rezistence

překrývat i s dalšími skupinami antibiotik, jež se váží na ribozóm a inhibují translaci.

3.1.1. MLSB rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2058

Nejčastějším typem rezistence k MLS antibiotikům je posttranskripční modifikace 23S rRNA,

způsobená S-adenosylmethionin-dependentní methyltransferasou. Enzym methyluje adenin v pozici

A2058 (E. coli číslování), která je esenciální pro vazbu antibiotik na ribozóm (86, 196-198). Methylace

probíhá pouze během krátkého časového úseku během sestavování velké podjednotky, kdy je 23S

rRNA přístupná enzymu. Sestavený ribozóm již nemůže být substrátem pro methyltransferasu, neboť

molekula 23S rRNA je uložená hluboko uvnitř velké podjednotky (174). Modifikace na adeninu stericky

brání vazbě antibiotika do svého zásahového místa. Protože se vazebná místa pro makrolidy,

linkosamidy a streptograminy B překrývají, je tento mechanismus rezistence pro tyto antibiotika

společný a je označován jako MLSB rezistence.

Existují dva základní typy methyltransferas. Prvním typem jsou monomethyltransferázy, jejichž

příkladem jsou Lmr(B) u producenta linkomycinu Streptomyces lincolnensis (135), Crl u producenta

celesticetinu Streptomyces caelestis (29) nebo Lrm u Streptomyces lividans (73). Druhým typem jsou

dimethyltransferasy, např. Erm(E) u producenta erythromycinu Saccharopolyspora erythrea nebo

Erm(C) u stafylokoků. Zatímco monomethylace adeninu udílí rezistenci k vysokým koncentracím (>

1000 µg/ml) linkosamidů a nižším koncentracím (50-200 µg/ml) erythromycinu, tylosinu a

karbomycinu, dimethylace způsobuje rezistenci k vysokým koncentracím (> 1000 µg/ml) všech pěti

antibiotik (28, 29).

3.1.1.2. Regulace MLS B rezistence

Geny erm kódující methyltransferasu mohou být exprimovány konstitutivně, nebo inducibilně

za přítomnosti subinhibičních koncentrací induktoru. Inducibilní MLSB rezistence (iMLSB) byla poprvé

popsána u Staphylococcus sp. v roce 1956, šest let po zavedení erythromycinu do klinické praxe (66).

Účinnými induktory exprese iMLSB rezistence jsou pouze 14-členné a 15-členné makrolidy.


18

Neindukující 16-členné makrolidy, ketolidy, linkosamidy a streptograminy zůstávají i nadále účinné

(197). Konstitutivní MLSB rezistence (cMLSB) byla poprvé popsána až v roce 1972. V důsledku

používání neindukujících 16-členných makrolidů došlo k selekci konstitutivních mutant, které jsou

rezistentní ke všem makrolidům, linkosamidům a streptograminům typu B (198). Fenotypový projev

iMLSB rezistence lze pozorovat diskovým indukčním testem. Vedle disku s neindukujícím antibiotikem

je položen disk s induktorem (erythromycinem) ve vzdálenosti max. 20 mm. Difúze erythromycinu

směrem k disku s neindukujícím antibiotikem indukuje expresi erm genů, což se projeví tvorbou

inhibiční zóny deformované do tvaru písmene "D" (Obr. 3.1.) (40).

Mechanismem regulace genové exprese MLSB rezistence je atenuace translace (37), která je

řízena regulační oblastí předcházející oblast strukturního genu. Mechanismus byl poprvé popsán pro

gen erm(C) nesený na plazmidu pE194 (64). Sekvence před genem obsahuje dvě Shine-Dalgarno

(SD) sekvence pro dva otevřené čtecí rámce. První, SD-1 oblast, slouží pro přepis 14-aminokyselin

dlouhého kontrolního peptidu a SD-2 pro přepis genu erm(C). Díky 4 invertovaným repeticím, které

tvoří vlásenky, může tato kontrolní oblast zaujímat dva konformační stavy, neaktivní konformaci I a

aktivní konformaci II (Obr. 3.2.). Při nepřítomnosti vhodného induktoru se párují repetice 1 + 2 a

repetice 3 + 4. Vlásenka vzniklá párováním repetic 3 a 4 brání vazbě ribozómu v oblasti SD-2 a

přepisu genu erm(C). V této neaktivní konformaci je SD-1 volně přístupná pro ribozómy, což umožňuje

konstitutivní přepis kontrolního peptidu kódovaného úsekem I. Jakmile je přítomen vhodný induktor,

který se naváže na ribozóm přepisující kontrolní peptid, ribozóm se zastaví, což způsobí přeskupení

konformace I do konformace II. Tímto přeskupením se uvolní repetice 4 a odkryje SD-2. Volná

Shine-Dalgarno sekvence oblasti 2 umožní nasednutí funkčních ribozómů a přepis genu erm(C).

Zároveň se prodlouží životnost mRNA, což je pravděpodobně způsobeno stojícími ribozómy, které

chrání transkript před degradací RNasou (158). Jestli je antibiotikum induktorem či ne, závisí na

struktuře atenuátoru (112), avšak doposud není úplně jasné, jakým mechanismem je tato specifita

indukce způsobena. Pro zastavení ribozómu ve správném místě, které způsobí změnu konformace, je

kritická interakce mezi makrolidem, kontrolním peptidem a ribozómem. Bylo zjištěno, že pro správnou

Obr. 3.1. Diskový induk ční test. E - erythromycin (15 ug) DA - klindamycin (2 ug)


19

funkci kontrolního peptidu atenuátoru genu erm(C) jsou esenciální 4 aminokyseliny, IFVI (197).

Podobná sekvence aminokyselin byla nalezena u E. coli ve specifických malých peptidech

kódovaných tzv. minigeny na 23S rRNA (183). Tyto peptidy udílejí nízkou hladinu rezistence k různým

makrolidovým antibiotikům mechanismem "bottle brush", kdy nascentní peptid interaguje v

ribozomálním tunelu s antibiotikem a aktivně jej odstraňuje ze svého vazebného místa (120, 184).

Podobná interakce pravděpodobně probíhá také během syntézy kontrolního peptidu.

Exprese genů erm(A) a erm(B) je regulována stejným mechanismem atenuace translace jako

gen erm(C), avšak struktura regulačních oblastí těchto genů je mnohem složitější (62, 120).

Ačkoli mechanismem regulace exprese iMLSB rezistence je ve většině případů výše popsaná

atenuace translace, regulace exprese genu erm(K) z Bacillus licheniformis je řízena mechanismem

atenuace transkripce. Regulační oblast před genem erm(K) obsahuje, podobně jako kontrolní oblast

pro gen erm(C), ribozomální vazebné místo pro otevřený čtecí rámec kódující 14 aminokyselin dlouhý

kontrolní peptid. Také tato oblast se může vyskytovat ve dvou konformacích. Konformace vzniklá za

nepřítomnosti induktoru dává vznik dvěma ρ-nezávislým transkripčním terminačním faktorům, které

předčasně ukončí transkripci mRNA genu erm(K). Za přítomnosti induktoru dojde k přeskupení

kontrolní oblasti, které umožní přepsání terminačních faktorů a syntézu celé délky mRNA kódující

rezistenční methyltransferasu (85).

Konstitutivní exprese MLSB rezistence vyplývá z narušení sekundární struktury mRNA. V

laboratorních podmínkách byly kultivací iMLSB rezistentních kmenů za přítomnosti neindukujícího

antibiotika vyselektovány konstitutivní mutanty s různými delecemi (30, 87), duplikacemi (95, 129) či

bodovými mutacemi (163). Konstitutivní mutanty byly získány kultivací v přítomnosti téměř všech

neindukujících MLSB antibiotik, zahrnující karbomycin, tylosin, linkomycin, klindamycin, ketolidy

telithromycin a ABT-773 či streptogramin B, quinupristin. Quinupristinem však bylo možné selektovat

konstitutivní rezistenci pouze v nepřítomnosti dalfopristinu (163). Regulační oblasti genů erm(A) a

Obr. 3.2. Alternativní konformace mRNA inducibiln ě exprimovaného genu erm (C) z plazmidu pE194. Konformace mRNA v nepřítomnosti A), nebo v přítomnosti B) erythromycinu. RBS, vazebné místo pro ribozóm; LP, kontrolní peptid; ORF, otevřený čtecí rámec; 1, 2, 3, a 4, invertované repetice. Zelená a červená čára, kódující sekvence. Převzato z Depardieu et al., 2007 (34)


20

erm(C) u konstitutivně rezistentních klinických izolátů vykazují tytéž změny, které byly pozorovány

během selekce konstitutivních mutant in vitro. Delece v regulační oblasti byly nalezeny u konstitutivně

rezistentních klinických izolátů S. epidermidis a S. aureus (87, 164, 199). Bodové mutace byly

nalezeny v atenuátoru před genem erm(A) u S. aureus (199) a tandemové duplikace v atenuátoru

genu erm(C) u klinických izolátů S. aureus, S. saprophyticus a S. equorum a v atenuátoru genu

erm(A) u S. aureus (57, 96, 129, 164, 200).

3.1.1.3. erm geny u stafylokok ů

Během posledních třiceti let bylo popsáno velké množství adenin-N6-methyltransferas jak u

producentů antibiotik, kteří se takto chrání před účinky produkovaného antibiotika, tak i u širokého

spektra klinicky významných mikroorganismů (147). U stafylokoků byly doposud nalezeny tyto erm

geny: erm(A), erm(B), erm(C), erm(33), erm(F) a erm(Y). Zatímco první tři zmíněné geny erm(A, B, C)

jsou pro stafylokoky typické, ostatní byly detekovány ojediněle spíše jako důsledek intenzivního

horizontálního genového přenosu mezi mikroorganismy.

Geny erm(A) (120) a erm(C) (48, 64), jejichž nukleotidové sekvence jsou ze 62 % identické,

jsou nejčastějšími nositeli MLSB rezistence u klinických izolátů stafylokoků. Zatímco erm(A) převládá u

S. aureus, gen erm(C) je dominantní u CoNS. Gen erm(B) (160) je typický pro zvířecí stafylokokové

izoláty a v klinické praxi je detekován jen ojediněle (39). Gen erm(33) ze S. scurii je zajímavým

příkladem možné rekombinace mezi erm geny (konkrétně mezi erm(C) a erm(A)), která vede k plně

funkčnímu proteinu (169). Gen erm(Y) byl popsán na plazmidu pMS97 z S. aureus, který nese i další

dva geny makrolidové rezistence, msr(A) a mph(C) (108). Nukleotidová sekvence tohoto genu je z 81

% identická se sekvencí genu erm(T) z Lactobacillus reuteri a ze 77 % se sekvencí stafylokokového

genu erm(C).

3.1.2. PhLOPS A rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2503

Methyltransferasa Cfr byla popsána teprve nedávno u S. sciuri a S. simulans během

surveillanční studie florfenikolové rezistence u stafylokoků ze zvířat (77, 170). Rezistence je

způsobená methylací adeninu v pozici A2503 (79), která se nachází v oblasti peptidyl-tRNA

vazebného místa (místo P). Modifikace v této pozici interferuje s vazbou mnohem různorodější

skupiny antibiotik než je tomu u Erm methyltransferas. Bylo prokázáno, že gen cfr snižuje citlivost k

florfenikolům (chloramfenikol, florfenikol), linkosamidům, oxazolidinonům (linezolid), pleuromutilinům

(tiamulin, valnemulin) a ke streptograminům A (PhLOSA rezistence; (97)). Studie uvádí, že tento gen

byl během rozsáhlé surveillanční studie zvířecích stafylokokových izolátů nalezen pouze u 6 kmenů.

Avšak již byl také izolován klinický methicilin rezistentní S. aureus, který nese tento cfr gen udílející

rezistenci k antibiotikům poslední volby pro léčbu multirezistentních grampozitivních koků (78).

3.1.3. Rezistence k MLS antibiotik ům mutacemi v zásahovém míst ě

Mutace na ribozómu zabraňující vazbě MLS antibiotik mohou vznikat jednak na ribozomálních

proteinech a jednak na 23S rRNA. Mutace v proteinu L4 přímo ovlivňují vazbu antibiotika (47). Mutace

v proteinu L22 působí nepřímo tak, že vlivem této mutace dojde k rozšíření ribozomálního tunelu a


21

nascentní peptid tak může "proklouznout" vedle navázaného antibiotika (43). Zatímco mutace v

proteinech se vyskytují poměrně často, mutace v genu pro 23S rRNA způsobující rezistenci jsou

vzácnější (178). Důvodem je nutnost nahromadění mutací v jednotlivých kopiích genu pro ribozomální

RNA. Proto je tato rezistence významná pouze u mikroorganismů s nízkým počtem kopií genu pro

23S rRNA jako třeba u Helicobacter pylori nebo Mycobacterium sp., které mají pouze dvě kopie rrn

operonu. Naproti tomu druhy rodu Staphylococcus můžou mít až šest kopií genu pro 23S rRNA na

buňku. I přes takto velký počet byla u S. aureus popsána rezistence k MLSB antibiotikům způsobená

mutacemi A2058G, A2058T, A2059G ve třech nebo čtyřech operonech z šesti. U jednoho izolátu této

studie byly mutace v genu pro 23S rRNA kombinovány s mutacemi v proteinu L22. Tento izolát byl

rezistentní také ke kombinaci quinupristin/dalfopristin (140). Jiné izoláty S. aureus získané během

léčby streptograminovou kombinací quinupristin/dalfopristin se staly k tomuto antibiotiku rezistentní

pouze díky mutacím v proteinu L22 (100).

3.2. Inaktivace MLS antibiotik

Zatímco rezistence způsobená změnou zásahového místa postihuje široké spektrum

antibiotických látek vázajících se do stejného místa účinku, rezistence způsobená inaktivací antibiotika

je specifická pro úzkou skupinu chemicky podobných látek. U MLS antibiotik můžeme rozlišit

rezistenci způsobenou inaktivací makrolidů (M-rezistence), linkosamidů (L-rezistence), streptograminů

A (SgA-rezistence) nebo inaktivací streptograminů B (SgB-rezistence).

3.2.1. Inaktivace makrolid ů

Doposud byly popsány dva mechanismy inaktivace makrolidů, modifikace fosforylací a

inaktivace hydrolytickým štěpením laktonového kruhu. Oba tyto rezistenční mechanismy jsou typické

pro gramnegativní tyčinky a k makrolidové rezistenci u stafylokoků přispívají spíše okrajově.

U E. coli byly popsány dva typy makrolid 2'-fosfotransferas. První, Mph(2')I, je kódovaná

genem mph(A) a inaktivuje 14- a 15-členné makrolidy a ketolidy efektivněji než 16-členné makrolidy

(70, 129). Druhá fosfotransferasa, Mph(2')II, kódovaná genem mph(B), nevykazuje žádnou

substrátovou preferenci (83). Navzájem tyto dva enzymy vykazují 37% identitu aminokyselinových

sekvencí, a pouze gen mph(B) inaktivoval makrolidy po přenosu do heterologního hostitele S. aureus

(122). Gen mph(B) má podobný obsah GC párů jako je v chromozómu stafylokoků, je tedy možné, že

odtud gen původně pochází. U stafylokoků byl nalezen gen mph(C), jehož proteinový produkt je

podobný fosfotransferase Mph(B) (49% identita, (108)). Tento gen byl identifikován na plazmidu

pMS97 společně s rezistenčními geny msr(A') a erm(Y). Analýza exprese této trojice genů odhalila, že

exprese genu mph(C) na tomto plazmidu závisí na upstream lokalizovaném genu msr(A) (109).

Experimenty s přenosem genu mph(C) do citlivého S. aureus RN4220 potvrdily toto pozorování, jehož

příčina nebyla zatím objasněna (70). Gen mph(C) byl detekován v klinických či zvířecích izolátech

různých studií buď v těsné blízkosti genu msr(A) (98, 179), nebo samostatně, udílející pouze střední

hladinu rezistence k erythromycinu (MIC = 2-16 mg/l) (98, 165).

Na rozdíl od fosforylace, inaktivace erythromycinu hydrolýzou laktonového kruhu postihuje

pouze 14- a 15-členné makrolidy, nikoli však ketolidy a 16-členné makrolidy (15, 19). U E. coli, byly


22

nalezeny dva typy esteráz kódované geny ere(A) nebo ere(B) (12, 130). Jejich aminokyselinové

sekvence vykazují velmi malou podobnost (25% identita). Také obsah G+C párů genu ere(B) (36 %)

se výrazně liší od ere(A) (50 %) a také od GC obsahu v chromozómu E. coli (50 %). To naznačuje, že

gen ere(B) je exogenního původu a byl získán pravděpodobně od grampozitivních koků (12).

Přítomnost genu ere u stafylokoků byla prokázána pouze v jednom případě. V roce 1996 byl popsán

kmen S. aureus nesoucí gen ere(B) spolu s genem msr(A) (202). Tento kmen inaktivoval 14- a 16-

členné nikoli však 15-členné makrolidy, čímž se fenotypově lišil od exprese ere(B) genu v E. coli.

3.2.2. Inaktivace linkosamid ů

Inaktivace linkosamidů fosforylací nebo nukleotidylací hydroxylové skupiny na pozici 3 byla

popsána u různých druhů rodu Streptomyces (11, 102). U klinických a zvířecích izolátů je inaktivace

linkosamidů způsobena jejich adenylací linkosamid-O-nukleotidyltransferasou. Dvě

nukleotidyltransferasy lišící se 14 aminokyselinovými zbytky byly poprvé popsány u S. haemolyticus a

S. aureus a jsou kódovány geny lnu(A) nebo lnu(A') (26, 27). Dalších pět variant genů lnu bylo

popsáno u grampozitivních (lnu(C), lnu(B), (1, 24) a gramnegativních mikroorganismů (lnu(F) a

lnu(AN2); (58, 192). Proteiny kódované geny lnu(AN2) a lnu(C) vykazují 50-52% a 26% identitu

aminokyselinových sekvencí s proteiny Lnu(A) ze stafylokoků. Naopak protein Lnu(B) je podobný

pouze proteinu Lnu(F) z E. coli (34,9 % identity aminokyselinových sekvencí). Ačkoli proteinové

produkty lnu genů inaktivují oba linkosamidy, udílejí významnou rezistenci pouze k linkomycinu (1,

88). To je pravděpodobně způsobeno vyšší účinností klindamycinu, jenž je schopen buňky usmrtit

ještě před tím než je zcela inaktivován. Výjimkou je gen lnu(F) u E. coli, který udílí rezistenci také ke

klindamycinu.

3.2.3. Inaktivace streptogramin ů A

Streptograminy A jsou modifikovány O-acetyltransferasami, které přenáší acetyl z

acetylkoenzymu A na sekundární hydroxyl antibiotika. Tento hydroxyl je v kontaktu s 23S rRNA v

pozici G2505 (E. coli číslování) a jeho acetylace znemožní vazbu antibiotika na ribozóm (53). Několik

acetyltransferas kódovaných geny vat (virginiamycin A acetyltransferasa) bylo doposud identifikováno

u klinických a zvířecích izolátů stafylokoků a enterokoků (Tab. 3.1.). Aminokyselinové sekvence těchto

enzymů jsou vysoce podobné sekvencím kódovaných na chromozómech dalších mikroorganismů což

naznačuje jejich velké rozšíření (Tab. 3.1.).


23

Tab. 3.1. Porovnání aminokyselinových sekvencí virginamycin A acetyltransferas ze stafylokok ů a enterokok ů a příklady podobných sekvencí z genom ů jiných mikroorganism ů. Mikroorganismus Acetyltransferasa Identita Podobnost Lokalizace Reference S. aureus Vat(A) 100 % 100 % plazmid pIP680 (8) S. cohnii Vat(C) 70 % 85 % plazmid pIP1714 (6) Bacillus cereus ATCC10987 AAS41570.1 62 % 80 % chromozóm GenBank Enterococcus faecum Vat(D) 61 % 77 % plazmid (143) Enterococcus faecum Vat(E) 58 % (54) S. aureus Vat(B) 53 % 72 % plazmid (4) Desulfitobacterium hafniense Y51 BAE82934.1 54 % 71 % chromozóm GenBank Clostridium botulinum F str. Langeland ABS40829.1 52 % 71 % chromozóm GenBank

3.2.4. Inaktivace streptogramin ů B

Streptograminy B jsou inaktivovány intramolekulárními lyasami, které linearizují cyklický

depsipeptid štěpením esterové vazby, čímž je zrušena bioaktivní konformace nutná pro vazbu

antibiotika na ribozóm (118). U stafylokoků byly popsány dva geny vgb(A) (7) a vgb(B) (6) kódující

lyasy, jejichž aminokyselinové sekvence jsou z 67 % identické. Navíc bylo prokázáno, že enzymy Vgb

jsou součástí velké rodiny streptogramin B lyas, které jsou přítomné nejenom v rezistentních klinických

izolátech, ale také v chromozómu mnoha bakterií, jež mohou sloužit jako zdroj rezistenčních genů pro

klinicky významné stafylokoky (Tab. 3.2.). Konkrétně byly v nukleotidové databázi vytipovány ortologní

geny z chromozómu Streptomyces coelicolor a Bordetella pertusis, jejichž aktivita štěpení

streptograminů B byla prokázána expresí v heterologním hostiteli E. coli (118).

Tab. 3.2. Porovnání aminokyselinových sekvencí lyasy Vgb(A) ze Staphylococcus aureus se sekvencemi dostupnými v GenBank databázi použitím BLAST(tblastn ). protein ID identita podobnost Staphylococcus aureus Vgb(A) a AAA98349.1 100 % 100 % plazmid pIP680 Staphylococcus cohnii Vgb(B)a AF24088.1 67 % 82 % plazmid pIP1714 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 ABR35734.1 53 % 70 % genom Bacillus licheniformis ATCC 14580 AAU21870.1 51 % 69 % genom Bacillus licheniformis DSM 13 AAU39223.1 51 % 69 % genom Streptomyces coelicolor A3(2)a CAB88456.1 41 % 59 % genom Saccharopolyspora erythraea NRRL2338

CAM02658.1 42 % 62 % genom

Bordetella bronchiseptica strain RB50 CAE30921.1 41 % 57 % genom Bordetella pertussis strain Tohama I a CAE40592.1 39 % 56 % genom Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 ABM12711.1 38 % 56 % genom

a Inaktivační aktivita těchto proteinů byla testována v E. coli (118)

3.3. Transportní rezistence

Mikrobiální transportní mechanismy zprostředkovávající rezistenci k antibiotikům lze rozdělit

do pěti rodin (142). Mezi sekundární transportéry, využívající pro export toxických látek protonový

gradient, patří: MFS (major facilitator superfamily) rodina proteinů, RND (resistance-nodulation-

division) rodina proteinů, SMR (small multidrug resistance) rodina proteinů a MATE (multidrug and


24

toxic compound extrusion) rodina proteinů. Z nich u grampozitivních mikroorganismů byly detekovány

pouze dvě rodiny (MFS a SMR). MFS rodina zahrnuje tyto transportéry MLS antibiotik: Mfe ze

streptokoků (161), LmrP z Lactococcus lactis (141) a MdeA z S. aureus (65), Lmr(A) ze Streptomyces

lincolnensis (205).

Superrodina ABC-proteinů (ATP-binding casette) zahrnuje transportéry, které získávají energii

pro export z hydrolýzy ATP. Tato rodina zahrnuje kromě klasických transportérů také skupinu, která se

významně podílí na rezistenci k MLS antibiotikům u stafylokoků, avšak u které, jak bude zmíněno

níže, nebyl transportní mechanismus zcela prokázán.

3.3.1. ABC-transportéry

Obecně ABC transportéry vyžadují pro svoji funkci dvě hydrofilní cytoplazmatické domény,

které váží a hydrolyzují ATP, a dvě hydrofobní transmembránové (TM) domény, které jsou většinou

složeny ze šesti transmembránových α-helixů. Hydrofilní doména, označovaná také jako NBD

(nukleotid binding domain), má dva typické motivy Walker A a Walker B (190), které jsou společné pro

všechny ATPasy plus další konzervované motivy charakteristické pro ABC transportéry: konzervovaná

sekvence společná pro všechny ABC transportéry (ABC transporter signature motif), konzervovaná

oblast obsahující aromatické aminokyseliny (Tyr-loop), konzervovaná glutaminová smyčka (Gln-loop)

a konzervovaná histidinová smyčka (His-loop). Walker A, nebo-li fosfát vazebná smyčka, je oblast

bohatá na glycin se strukturou: GXXGXGK(S,T), kde X je libovolná aminokyselina. Kromě ABC-

transportérů se tento motiv nachází také u ostatních ATP- nebo GTP-vazebných proteinů. Walker B

motiv vázající hořčík je hydrofobní oblast s několika nabitými aminokyselinami s touto strukturou:

hhhhD(D,E,S)(P,A) kde h je hydrofobní aminokyselina. Jednotlivé domény mohou být syntetizovány

jako samostatné proteiny nebo mohou být fúzovány v multidoménové peptidy kódované jedním

genem. U ABC proteinů jiné než transportní funkce TM doména chybí. Na základě fylogenetické

analýzy sekvencí ABC proteinů lze rozlišit tři třídy (32). 1. třída zahrnuje většinu známých transportérů,

které mají NDB doménu a TM doménu fúzovanou v jeden polypeptid. 2. třída zahrnuje rezistenční

proteiny a proteiny účastnící se jiných buněčných procesů než je transport. Tato třída proteinů má

fúzované dvě NBD domény a postrádá transmembránovou doménu. 3. třída obsahuje proteiny závislé

na vazebném proteinu (BPD, binding protein dependent) většinou s importní funkcí.

3.3.2. Rezistence k MLS antibiotik ům = 2. třída ABC protein ů

ABC proteiny udílející rezistenci k MLS antibiotikům spadají do třídy 2 a patří mezi ně proteiny

producentů MLS antibiotik i proteiny udílející rezistenci k těmto antibiotikům u klinicky významných

mikroorganismů a zejména pak u stafylokoků. Jak bylo zmíněno výše, tato fylogenetická třída ABC

proteinů má dvě fúzované NBD domény, avšak postrádá jakoukoli TM doménu. Kromě rezistenčních

proteinů, které tvoří tzv. ARE podrodinu (antibiotic resistance), jsou do této skupiny řazeny i proteiny

účastnící se regulace translace (elongační faktor hub EF-3 (68) nebo proteiny GCN1 a GCN20.

Podílejí se na regulaci proteosyntézy skrze regulaci fosforylace eukaryotického iniciačního faktoru

eIF2 (104), u mnoha dalších proteinů této skupiny zůstává funkce nejasná.


25

3.3.2.1. Msr(A) - rezistence k makrolid ům a streptogramin ům B

Přítomnost ABC proteinu Msr(A) je druhou nejčastější příčinou rezistence k makrolidům u

stafylokoků. Msr(A) udílí rezistenci k 14- a 15-členným makrolidům a po indukci snižuje citlivost také

ke ketolidům a streptograminům B (MSB rezistence). Mechanismus této rezistence byl poprvé popsán

u S. epidermidis (150, 151) a u S. aureus (111). 488 aminokyselin dlouhý peptid obsahuje dvě ATP-

vazebné domény a postrádá jakoukoli transmembránovou doménu. NDB domény jsou separovány

nezvykle dlouhým mezerníkem, který je bohatý na glutamin a ostatní polární aminokyseliny, což je

typické pro tzv. Q-linker - flexibilní spojku mezi doménami, jež propojuje rozdílné, ale interagující

domény proteinů, které se často vyskytují u prokaryotických dvousložkových regulačních a signál

transdukujících systémů (203). Ačkoli gen msr(A) nekóduje žádnou transmembránovou doménu,

přenos pouze tohoto genu do citlivého kmene S. aureus RN4220 byl dostatečný pro expresi

rezistence k erythromycinu. Navíc buňky S. aureus RN4220 produkující Msr(A) akumulovaly méně

radioaktivně značeného antibiotika než buňky bez Msr(A), což by mohlo svědčit o aktivním exportu

antibiotika ven z buňky. Na základě tohoto pozorování bylo předpovězeno, že tento transportní protein

pravděpodobně využívá pro svoji funkci TM doménu přítomnou v recipientním kmeni (150).

Downstream od genu msr(A) byly na původním plazmidu pUL5050 z S. epidermidis nalezeny dva

geny, které by mohly být součástí předpokládaného transportního systému. Gen stpA kóduje ATP-

vazebnou doménu a gen smpA kóduje hydrofobní transmembránovou doménu. Tyto geny byly

hybridizačně potvrzeny také u všech 35 MSB rezistentních CoNS analyzovaných v této studii. Navíc

velmi podobné geny, stpC a smpC byly nalezeny v chromozómu recipientního erythromycin citlivého

S. aureus RN4220. Inaktivace těchto genů však neměla žádný vliv na schopnost msr(A) udílet MSB

rezistenci (149). Mechanismus funkce Msr(A) zůstává i nadále nejasný. Kromě stafylokoků byl gen

msr(A) identifikován v mnoha dalších rodech grampozitivních i gramnegativních mikroorganismů:

Streptococcus spp., Enterococcus spp., Corynebacterium spp. a Pseudomonas spp. Tyto geny

vykazovaly navzájem 99 - 100% identitu (127).

V chromozómu Enterococcus faecium byl objeven gen msr(C) kódující protein, jehož

aminokyselinová sekvence vykazovala 42% identitu s Msr(A). Pokud byl tento gen inaktivován u E.

faecium, citlivost k MSB antibiotikům se snížila pouze nepatrně (172). Avšak pokud byl tento gen

přenesen do citlivého S. aureus RN4220, udílel vysoké hladiny rezistence k MSB antibiotikům (145).

Gen msr(D) byl objeven jako součást velkého chromozomálního genetického elementu v

Streptococcus pneumoniae kódující také dva MDR transportéry makrolidů Mef(E) a Mef(A).

Aminokyselinová sekvence Msr(D) je ze 75 % identická s Msr(A) a ze 78 % identická s Msr(C). Tento

protein v S. pneumonie udílel pouze nízkou hladinu rezistence k 14-členným makrolidům a ketolidům

(10) a po přenosu do S. aureus RN4220 citlivost k MSB antibiotikům výrazně nesnižoval (145).

3.3.2.2. Vga proteiny - rezistence k streptogramin ům A (a linkosamid ům)

Proteiny Vga(A), Vga(A)v a Vga(B) byly původně objeveny jako rezistenční determinanty

udílející rezistenci k streptograminům A u stafylokoků. Stejně jako Msr(A) patří do rodiny ARE

proteinů, pro kterou je typická přítomnost dvou NBD domén a absence transmembránové domény.

Aminokyselinové sekvence proteinů Vga(A) a Vga(B) jsou si navzájem z 48.3 % identické a s


26

proteinem Msr(A) jsou identické z 35,2 % a 34,4 %. Typický Q-linker bohatý na glutamin lze nalézt u

proteinu Vga(B), avšak protein Vga(A) má poměr glutaminů stejný v celé délce polypeptidu.

Schopnost těchto proteinů udílet rezistenci k MLS antibiotikům byla porovnávána po přenosu

do citlivých recipientů S. aureus RN4220 a S. epidermidis BM3302 (69). Proteiny Vga(A) a Vga(A)v

byly schopny udílet kromě rezistence ke streptograminům A také nízkou hladinu rezistence k

linkomycinu. Protein Vga(B) udílel nízkou hladinu rezistence ke streptograminu A avšak podstatně

zvýšenou rezistenci ke kombinaci streptograminů A a B. Kromě toho byla pozorována různá

schopnost Vga proteinů udílet rezistenci v závislosti na hostiteli: v S. epidermidis BM3302 dosahovaly

minimální inhibiční koncentrace vyšších hodnot než u S. aureus RN4220. Naše práce (124) popisuje

novou variantu genu, vga(A)LC, která udílí střední hladinu rezistence k oběma linkosamidům (MICLIN =

32 mg/l a MICCLI = 8 mg/l) u S. haemolyticus, avšak po přenosu do heterologního S. aureus RN4220

dosahovaly minimální inhibiční koncentrace hodnot nižších, které však zůstaly vyšší v porovnání s

genem vga(A).

3.3.2.3. Ostatní rezisten ční proteiny ARE rodiny

Další dva proteiny příbuzné s Msr(A) a udílející přirozenou rezistenci k linkosamidům a

streptograminům byly nalezeny při analýze ABC transportních systémů ze sekvenovaných genomů E.

faecalis a B. subtilis. U E. faecalis, který je na rozdíl od ostatních druhů enterokoků přirozeně

rezistentní linkosamidům a streptograminům A (LSA rezistence), byl nalezen gen lsa, jehož inaktivací

došlo ke zvýšení citlivosti ke klindamycinu, dalfopristinu (streptogramin A) a ke kombinaci

quinupristin/dalfopristin. Současně komplementací delece (zavedením genu lsa na plazmidu) byl

rezistenční fenotyp obnoven (172, 173). Protein Lsa z E. faecalis je z 42 % podobný proteinu Msr(C) a

z 41 % podobný proteinu Vga(A). U dvou izolátů E. faecalis citlivých k oběma linkosamidům a ke

quinupristinu/dalfopristinu byly v genu lsa nalezeny bodové mutace vedoucí k předčasnému ukončení

translace (36) Gen lsa byl přítomen ve všech LS rezistentních izolátech E. faecalis a zároveň nebyl

detekován v žádném z izolátů ostatních enterokokových druhů (173).

Na plazmidu pSCFS1 z S. sciuri byl objeven gen lsa(B) kódující protein, který je z 41 %

identický s proteinem Lsa. Přenosem do citlivého S. aureus RN4220 bylo prokázáno, že tento protein

udílí rezistenci ke klindamycinu. Potenciální rezistence k streptograminům A nebyla v tomto případě

testována (77). Velká podobnost proteinu Lsa(B) s předpokládaným ABC transportérem z B. anthracis

(82% identita) naznačuje, že další příbuzné proteiny, které pravděpodobně udílejí rezistenci k MLS

antibiotikům, jsou obecně rozšířeny u grampozitivních baktérií.

Další protein, který snižuje citlivost k linkosamidům a streptograminům A byl charakterizován v

genomu Bacillus subtilis. Protein Vml(R) vykazuje 33% identitu s Vga(A). Exprese tohoto genu je

inducibilní a je pravděpodobně řízena předčasnou terminací transkripce v nepřítomnosti antibiotika

(126).

Velkou podskupinou ARE rodiny jsou ABC proteiny vyskytující se v biosynthetických shlucích

producentů MLS antibiotik (Tab. 3.3. (116)). Analýza aminokyselinových sekvencí těchto proteinů

odhalila překvapivou souvislost počtu aminokyselin mezi Walker A a B motivy v druhé ABC doméně a


27

substrátovou specifitou proteinu: u všech makrolidových transportérů je vzdálenost mezi oběma

konzervovanými Walker motivy konstantní (Tab. 3.3. (116)).

Tab. 3.3. Přehled ABC transportér ů ARE rodiny z producent ů antibiotik (převzato z (116))

Antibiotikum Produkční organizmus

rodu Streptomyces Protein Průkaz

rezistence Vzdálenost mezi Walker motivya Reference

Karbomycin S. thermotolerans Car(A) ano 149/100 (166) Spiramycin S. ambofaciens Srm(B) ano 148/100 (166) Tylosin S. fradiae Tlr(C) ano 145/100 (152) Oleandomycin S. antibioticus Ole(B) ano 144/100 (128) Linkomycin S. lincolnensis Lmr(C) ano 119/113 (135) Frenolicin S. roseofulvus Fnr(D) netestováno 131/117 AF05832 Virginiamycin S. viginiae Var(M) netestováno 122/102 (76)

a Počet aminokyselin mezi konzervovaným lysinem ve Walker A motivu a kys. asparagovou v motivu Walker B u obou domén oddělené lomítkem.

3.3.3. Jedná se skute čně o transport?

Rezistenční proteiny ARE rodiny ABC transportérů postrádají transmembránovou doménu, a

ačkoli u Vga(A) byla potvrzena membránová lokalizace (69), nebyl doposud identifikován žádný

interagující membránový protein. Nelze tedy vyloučit ani jiný mechanismus funkce, kterým tyto

proteiny udílejí rezistenci k MLS antibiotikům. Za důkaz aktivního effluxu erythromycinu proteinem

Msr(A) je považována snížená akumulace radioaktivně značeného antibiotika uvnitř rezistentních

buněk v porovnání s buňkami citlivými. Avšak tento zdánlivý efflux lze interpretovat i jiným způsobem.

Erythromycin vstupuje pasivní difúzí do buněk, kde se navázáním na ribozómy akumuluje (144).

Přidáním neznačeného antibiotika k buňkám saturovaným (C14)-erythromycinem, dochází ke

kompetici o vazebné místo a k uvolnění (C14)-erythromycinu, který difunduje po směru koncentračního

gradientu ven z buňky (144). Podobný efekt by mohl být způsoben také zabráněním vazby antibiotik

na ribozóm nebo aktivním odstraněním antibiotika z vazebného místa, což by mohly být alternativní

mechanismy funkce proteinů ARE rodiny (80, 144). Tuto hypotézu potvrzuje také fylogenetická

analýza ABC transportérů, podle níž tyto rezistenční proteiny spadají do stejné skupiny jako

eukaryotické ABC proteiny účastnící se kontroly iniciace translace a elongace (80). Navíc je velmi

zajímavá korelace specifity ARE rezistenčních proteinů s překrývajícími se vazebnými místy MLS

antibiotik, konkrétně specifita proteinů Msr(A), Msr(C) a Msr(D) k makrolidům a streptograminům B a

proteinů Vga, Lsa, Vml(R) k linkosamidům a streptograminům A.

Zda ARE proteiny interagují s membránovým proteinem a aktivně transportují antibiotika ven

z buňky, či zda zabraňují vazbě antibiotika na ribozóm (nebo jej z ribozómu odstraňují), zůstává

předmětem dalších výzkumů.

3.3.4. Regulace: atenuace translace nebo terminace transkripce?

U genů msr(A), msr(C), msr(D), vml(R), byla pozorována inducibilní exprese v závislosti na

přítomnosti indukujícího antibiotika – erythromycinu (u genů msr) nebo linkomycinu a virginiamycinu M

(u vml(R)) (10, 126, 145, 150). U některých dalších genů kódujících rezistenční ABC proteiny lze

identifikovat upstream sekvence vykazující některé rysy regulačních oblastí jiných rezistenčních genů.


28

Na základě strukturní podobnosti regulační oblasti genu msr(A) s regulační oblastí genu

MLSB rezistence erm(C) bylo předpovězeno, že inducibilní exprese je řízena mechanismem atenuace

translace (150), avšak toto tvrzení nebylo nikdy experimentálně potvrzeno. Regulační oblast msr(A)

(320 bp) obsahuje promotor, čtyři invertované repetice a dvě ribozomální vazebná místa. Jedno před

samotným genem msr(A) a druhé před sekvencí kódující osmiaminokyselinový peptid. Narušení

sekundární struktury regulační oblasti vede stejně jako v případě genů erm ke konstitutivní expresi

(145). Podobná kontrolní oblast se nachází u genu msr(C) z E. faecium (172). Regulační oblast genu

msr(D) obsahuje RBS předcházející sekvenci kódující šestiaminokyselinový peptid a sadu 4

invertovaných repetic,,avšak žádná z repetic nepřekrývá RBS. Navíc konsensus -10 a -35 sekvence

promotoru překrývají místo kódující domnělý kontrolní peptid, před kterým naopak žádný promotor

nalezen nebyl. Není tedy pravděpodobné, že by gen msr(D) byl regulován stejným mechanismem jako

msr(A) a msr(C) (145). Důvodem může být to, že je tento gen trasnkripčně spojen s upstream

lokalizovaným rezistenčním genem mef(E) (33). Struktura podobná erm(C) atenuátoru byla popsána

také před genem lsa(B) ze S. sciuri. Regulační oblast obsahuje dva čtecí rámce pro krátké peptidy (26

a 7 aminokyselin), první dvojice invertovaných repetic leží v sekvenci pro 26-aminokyselinový peptid.

Druhá sada IR částečně zasahuje do sekvence kódující kratší peptid a zahrnuje v sobě také RBS

(77).

U genu vml(R) byl prokázán odlišný mechanismus regulace inducibilní exprese, který je

založený na předčasné terminaci transkripce. Bylo zjištěno, že 225 nukleotidů dlouhá 5'

nepřepisovaná oblast genu vml(R) obsahuje několik invertovaných repetic, u nichž jedna tvoří ρ-

nezávislý terminátor. Pokud není přítomno indukující antibiotikum, dochází k předčasnému ukončení

transkripce právě v místě tohoto terminátoru lokalizovaného před genem. V přítomnosti induktoru

dochází k částečnému pročtení tohoto terminátoru a transkripce může být ukončena až v místě

druhého ρ-nezávislého terminátoru umístěného za strukturním genem. Terminátor doprovází druhá

vlásenka, jejíž 3' konec je schopen se párovat s 5' koncem terminátoru a vytvářet tak alternativní

sekundární strukturu. Avšak delece této vlásenky nemá žádný vliv na regulaci exprese rezistence

(126). Přestože přesný mechanismus indukce rezistence není stále objasněn, na základě strukturní

podobnosti s regulačními oblastmi ostatních genů je možné, že by tento mechanismus indukce mohl

být pro tyto příbuzné geny společný.

LITERÁRNÍ ÚVOD Frekvence MLS rezistencí

29

4. Frekvence MLS rezistencí u CoNS a klinický význa m jednotlivých

rezisten čních mechanism ů

4.1. Rezistence k makrolid ům a linkosamid ům

Dle různých studií se četnost rezistence k erythromycinu u CoNS pohybuje mezi 21,5 - 44 %

klinických izolátů citlivých k oxacilinu a mezi 66 - 72% u oxacilin rezistentních. Také četnost rezistence

ke klindamycinu je nižší u oxacilin citlivých izolátů (2,8 - 14 %) než u oxacilin rezistentních CoNS, kde

se poměr klindamycin rezistentních izolátů pohybuje v rozmezí 32,5 - 52,6 % (35, 156, 157).

U S. aureus je rezistence k makrolidům a linkosamidům v naprosté většině případů

způsobena přítomností genů erm(A) nebo erm(C) udílející konstitutivní nebo inducibilní MLSB

rezistenci. Rezistence MSB způsobená genem msr(A) nebo inaktivační rezistence geny mph(C) nebo

lnu(A) jsou u S. aureus vzácné (13, 50, 92, 93).

I u CoNS převládá MLSB rezistence, třebaže ostatní typy rezistence jsou přítomny častěji než

u S. aureus. Jednotlivé rezistenční mechanismy a jejich kombinace lze předpovědět diskovým

indukčním testem použitím ERY, LIN a CLI disku (Obr. 4.1.) (40, 123). Diskovou indukční metodou

byly první MSB rezistentní izoláty (rezistence k erythromycinu avšak citlivost ke klindamycinu; Obr.4.1.

- MSB) detekovány ještě před objasněním genetické podstaty této transportní rezistence. Mezi 78 ERY

rezistentními CoNS bylo nalezeno 11 kmenů (14 %) s tímto fenotypem (74). Četnost genu msr(A) se v

různých studiích pohybuje od 6 % u S. epidermidis, (103) až po 41 % u CoNS, (39). V naší studii (123)

gen msr(A) dokonce převažuje nad erm geny (53 % vs. 43 %). Fenotypově se však MSB rezistence

projevuje v daleko menší míře než je četnost genu msr(A) a to proto, že gen msr(A) bývá často

přítomen spolu s geny erm, které překrývají fenotypový projev MSB rezistence svým dominantním

fenotypem. Ve studii (93) byl gen msr(A) přítomen u 35 ze 150 izolátů, ale pouze u 19 z nich nebyl

detekován v přítomnosti erm genů. V naší studii byl msr(A) detekován spolu s erm geny u 16 z

celkového počtu 52 msr(A) pozitivních izolátů (123). MLSB rezistence u CoNS je způsobena geny

erm(C) a erm(A), gen erm(A) však bývá přítomen pouze v malém procentu erythromycin rezistentních

izolátů: 7,5 %, (39); 3 % (201); 4,8 %, (103). V některých studiích však byla četnost erm(A) o něco

vyšší: 27.2 % izolátů CoNS ve studii (92) a 18 % izolátů ve studii (93). Gen erm(B), typický pro

streptokoky a enterokoky, se u stafylokoků vyskytuje zejména u zvířecích izolátů, (39) u lidí byl

detekován pouze v ojedinělých případech (92, 93, 103). Inaktivační rezistence byla u stafylokoků

dlouhou dobu na okraji pozornosti, proto existuje pouze omezený počet studií dokumentující výskyt

genů lnu(A) (inaktivace linkomycinu) nebo mph(C) (inaktivace makrolidů) u stafylokoků. Ačkoli je

význam těchto rezistencí díky svému specifickému účinku na úzkou skupinu antibiotik spíše minoritní,

jejich četnost v některých populacích CoNS není zcela zanedbatelná. Ve studii (93) byl gen lnu(A)

(dříve linA) detekován pouze u 4,6 % stafylokoků rezistentních alespoň k jednomu MLS antibiotiku.

Avšak v naší studii (123) byl gen lnu(A) detekován ve 24 % všech izolátů CoNS rezistentních k

erythromycinu, linkomycinu nebo klindamycinu. Ve studii (98) se lnu(A) vyskytoval u 8 z 31 (29 %)

erythromycin nebo pirlimycin (linkosamid) rezistentních CoNS z mastitidy krav.


30

Gen mph(C) byl poprvé detekován u stafylokoků na plazmidu pMS97 v těsné blízkosti upstream

lokalizovaného genu msr(A) (108). Tyto geny byly nalezeny v těsném sousedství také v mnoha

dalších studií u klinických izolátů ((45, 179) nebo u zvířecích izolátů (98, 165). V klinické studii z

Německa byl gen mph(C) detekován u 37,9 % erythromycin rezistentních kmenů, vždy v kombinaci

buď s genem msr(A) (24,5 %) či erm(C) (12 %) (45).

CoNS jsou většinou hodnoceny jako homogenní skupina nehledě na druhovou skladbu, jež

může být ovlivněna parametry výběru studovaného souboru: výběr rezistentních kmenů, klinická

relevance izolátů, typ klinického vzorku atd. Druhové zastoupení pak může ovlivnit četnosti

rezistenčních genů. Tak například MSB rezistence bývá nejčastěji detekována u druhů S.

haemolyticus, S. hominis nebo u S. cohnii (39, 45, 74, 93, 123). Podrobnější studie zabývající se

rezistenčními charakteristikami jednotlivých druhů však chybí.

LI CL

ERY

iMLSB + L

MSB

LSA

cMLSB

(MSB + LSA)

MSB + L

iMLSB

L

Typ rezistence

Obr. 4 .1 Předpov ěď fenotypov ě dominantních rezisten čních mechanism ů a jejich kombinací diskovým induk čním testem LIN, linkomycin; CLI, klindamycin; ERY, erythromycin; cMLSB, konstitutivní rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům; iMLSB, inducibilní rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům B; MSB, rezistence k makrolidům a streptograminům B; L rezistence k linkomycinu; LSA, rezistence k linkosamidům a streptograminu A.


31

4.2. Inducibilní rezistence

Stafylokokové izoláty s inducibilním genem erm(A) nebo erm(C) jsou rezistentní k 14-členným

(klarithromycin, dirithromycin, erythromycin a roxithromycin) a 15-členným (azithromycin) makrolidům,

které jsou účinnými induktory. Naopak, neindukující ketolidy (telithromycin), 16-členné makrolidy

(josamycin, midecamycin, miocamycin, rokitamycin, spiramycin a tylosin), linkosamidy (linkomycin,

klindamycin, pirlimycin) a streptograminy B (pristinamycin IA a quinupristin) zůstávají aktivní. cMLSB

rezistence se vyvinula z iMLSB rezistence v důsledku selekčního tlaku neindukujících antibiotik. U

klinických izolátů CoNS se výskyt konstitutivní MLSB rezistence pohybuje mezi 25 a 41 %

erythromycin rezistentních kmenů (41, 45, 50, 93, 167). Přestože byla několikrát prokázána selekce

spontánních konstitutivních mutant in vivo během léčby klindamycinem, není úplně jasné, zda léčba

inducibilní rezistence neindukujícím antibiotikem představuje skutečné riziko. Existuje pouze několik

popsaných případů klinického selhání při léčbě infekcí způsobených inducibilně rezistentními kmeny

neindukujícím antibiotikem. Nicméně i přes úspěšnou léčbu takovýchto infekcí neindukujícím

antibiotikem je vytvářen nežádoucí tlak na selekci konstitutivních mutant. V roce 2004 byl diskový

indukční test doporučen laboratoří CSLI (Clinical Standard Laboratory Institute) pro detekci iMLSB

rezistence u stafylokoků. Izoláty vykazující inducibilní rezistenci ke klindamycinu jsou dle doporučení

CSLI interpretovány jako rezistentní (121). Tatáž interpretace platí také pro ostatní neindukující

antibiotika.

4.3. Rezistence ke streptogramin ům

Díky synergistickému účinku streptograminu A a B, vyžaduje rezistence k jejich kombinaci u

stafylokoků získání rezistence ke SgA avšak ne nezbytně získání rezistence ke SgB (3, 56).

Přítomnost obou typů rezistencí v jednom izolátu však nemusí vždy znamenat rezistenci ke kombinaci

(50, 93). Také in vivo selekce izolátů rezistentních ke quinupristinu-dalfopristinu (QD) v

experimentálním modelu králičí endokarditidy souvisela se selekcí rezistence k jednotlivým

komponentám (204). Do nedávné doby byl ze streptograminů v klinické praxi používán pouze

pristinamycin (kombinace pristinamycinu IIA a pristinamycinu IA), který byl dlouhá léta používán pro

kontrolu stafylokokových infekcí ve francouzských nemocnicích. Studie týkající se rozšíření Sg

rezistence u stafylokoků se tedy omezovaly pouze na tuto zemi, kde se četnost rezistence k

pristinamycinu v jednotlivých nemocnicích pohybuje mezi 0 - 44 % (56). Dvě studie sledovaly

zastoupení genů streptograminové rezistence u většího souboru SgA rezistentních izolátů (3, 56).

První studie zahrnuje 126 klinických izolátů stafylokoků izolovaných ve francouzských nemocnicích v

letech 1975-1993, z nichž 36 S. aureus a 20 CoNS izolátů bylo rezistentních k pristinamycinu IIA

(SgA) (3). V té době nebyly známy některé rezistenční geny, a tak informace o jejich výskytu v tomto

souboru byly postupně doplněny (5, 55). U PIIA rezistentních izolátů S. aureus byla nejpočetnější

trojkombinace genů vat(B), vga(B) a vga(A)v, která se vyskytovala u 20 z 36 izolátů (62,5 %). Všechny

izoláty s touto kombinací tří SgA rezistenčních genů byly rezistentní k pristinamycinu nehledě na

rezistenci k SgB, která nebyla přítomna u 8 izolátů citlivých také k makrolidům. Druhým nejčastějším

genem byl gen vga(A), který se nacházel u 8 izolátů (25 %). U šesti z nich byl vga(A) přítomen spolu s


32

dvojkombinací SgA a SgB rezistenčních genů vat(A) a vgb(A). Tyto izoláty byly rezistentní k SgA, SgB

a také k jejich kombinaci.

U PIIA rezistentních CoNS byl nejpočetnějším genem vga(A), který se nacházel téměř u všech

(95 %) izolátů. U čtyřech z nich byl přítomen s dvojkombinací vat(A) a vgb(A). Jediný izolát bez genu

vga(A) obsahoval dvojkombinaci vat(B), vga(B) a byl rezistentní k MLSB antibiotikům a pristinamycinu.

Trojkombinace genů vga(A), vat(A) a vgb(A) udílela rezistenci k pristinamycinu nezávisle na

přítomnosti cMLSB rezistence. Gen vga(A) udílel vyšší hladiny rezistence k pristinamycinu (MIC = 2-8

mg/l) pouze u izolátů současně rezistentních k MLSB antibiotikům.

Druhá studie zahrnuje 62 klinických PIIA rezistentních izolátů S. aureus z francouzských

nemocnic izolovaných v letech 1981-2000 (56). V této druhé studii, která neobsahuje CoNS, se gen

vga(A) vyskytoval pouze u jednoho izolátu, který byl rezistentní k pristinamycinu. Tento izolát byl

současně konstitutivně MLSB rezistentní. Nejpočetnějším byl gen vga(A)v, který byl nalezen u 37

izolátů (59,7 %), u 15 z nich byl přítomen spolu s geny vat(A) a vga(B). Pokud byl vga(A)v přítomen

sám, záleželo na přítomnosti cMLSB rezistence, zda byly tyto izoláty rezistentní také k pristinamycinu.

Všechny vga(A)v pozitivní izoláty až na jeden byly rezistentní také k linkomycinu. Druhou

nejpočetnější byla dvojkombinace genů vat(A) a vgb(A) přítomna u 26 izolátů (42 %) a udílející

rezistenci ke streptograminové kombinaci nehledě na přítomnost cMLSB rezistence. Souhrnný přehled

častých kombinací genů streptograminové rezistence a jejich schopnost udílet rezistenci k

pristinamycinu v závislosti na citlivosti k MLSB antibitokům je uveden v tabulce 4.1.

Tab. 4.1. Přehled častých kombinací Sg rezisten čních gen ů a schopnost udílet rezistenci k pristinamycinu v závisloti na citlivosti k MLS B antibiotik ům

Zjištěný genotyp Na pozadí fenotypua

Gen nebo kombinace

genů

Mechanismus rezistence

V kombinaci s dalším genem

cMLSB LIN SgA SgB

Rezistence k pristinamycinu

(MIC mg/l) Druh Citace

+ + + + (16) S. epidemidis

(3, 56)

vga(A)v + + + + + (8-32) S. aureus (3, 56) vat(B), vga(B)

inaktivace SgA a efflux SgA

vga(A)v - + + - + (2-4) S. aureus (3, 56)

+ + + + S. aureus (3, 56)

- + + + S. aureus (56) vat(A), vgb(A)

inaktivace SgA

a inaktivace SgB

vga(A) - +/- + + + (8-32) S. aureus, CoNS

(3)

- + + - (1-2) CoNS (3) vga(A) efflux SgA

+ + + + (4) S. aureus, CoNS

(3)

+ + + + + S.aureus (56) vga(A)v efflux SgA

- + + - - S.aureus (56) a Přítomnost rezistence je značena plusem; cMLSB, konstitutivní rezistence k makrolidům linkosamidům a streptograminům B; LIN, rezistence k linkomycinu; SgA, rezistence ke streptograminu A; SgB, rezistence ke streptograminu B

Teprve až po zavedení quinupristin/dalfopristinu do klinické praxe je streptograminová

rezistence sledována celosvětově. Dle různých surveillančních studií je výskyt Q/D rezistentních

izolátů prozatím velmi nízký (0-5 %, viz. kap. 1 literárního úvodu). Ve studii z Kanady (75) se mezi 658


33

klinickými izoláty CoNS rezistence ke Q/D vyskytovala u 15 izolátů (2,3 %). Z toho bylo 9 izolátů

identifikováno jako S. cohnii. V jiné studii byly u tohoto druhu identifikovány dva nové rezistenční geny

vat(C) a vgb(B), které nebyly doposud nalezeny v izolátech jiných druhů (6). Je tedy možné že za

tento nezvykle vysoký výskyt Q/D rezistentních izolátů je zodpovědná tato, pravděpodobně druhově

specifická, dvojice rezistenčních genů. V Koreji byla rezistence ke quinupristinu/dalfopristinu nalezena

častěji u klinických izolátů S. aureus (26 %) než u izolátů CoNS 9,1 % (92). Naopak v Řecku nebyla

rezistence ke Q/D nelezena u žádného z 350 izolátů S. aureus avšak mezi 500 izoláty CoNS bylo

nalezeno 10 izolátů S. hominis rezistentních k nízkým hladinám Q/D (MIC=1-3 mg/l). U všech těchto

QD rezistentních izolátů byl nalezen gen vga(A) spolu s konstitutivně exprimovaným genem erm(A)

(136).

4.4. Mobilní elementy nesoucí MLS rezisten ční geny Gen erm(C) byl poprvé popsán na 3,7 kb velkém plazmidu pE194 (63). Častěji je však gen

kódován na plazmidu o velikosti cca 2,5 kb nebo jeho kratších konstitutivních variant (185, 201).

Prototypem plazmidu této velikosti je plazmid pNE131, který byl poprvé popsán u S. epidermidis. Oba

tyto typy plazmidů jsou řazeny mezi malé nekonjugativní, mnohakopiové plazmidy replikující se

mechanismem valivé kružnice (RC plazmidy), které mohou být přenášeny mobilizací se spolu

přítomnými konjugativními plazmidy (89). Strukturně podobné plazmidy byly popsány také u

stafylokoků zvířecího původu, což naznačuje jejich všeobecné rozšíření a také možný přenos

rezistence mezi lidskými a zvířecími izoláty (96).

Gen erm(A) je asociován s transpozonem Tn554 (6,7 kb), který současně nese rezistenci ke

spektinomycinu (17, 120). Primární inzerční místo, att554, bylo lokalizováno ve specifické oblasti na

chromozómu (84), byly však detekovány i kmeny se dvěma (S. aureus) a více (u CoNS) inzerty (185,

186). Transpozon Tn554 může být lokalizován také na konjugativních plazmidech (187) a je také

součástí chromozomální kazety methicilinové rezistence typu II (71).

Gen msr(A) byl lokalizován buď na velkých (20 - 30 kb) plazmidech (107, 110, 111, 150) u S.

epidermidis a S. aureus, nebo na chromozómu u S. hominis (148). U S. haemolyticus JCSC1435 je

gen msr(A) součástí plazmidu integrovaného do chromozómu (179).

Gen lnu(A) je obvykle nesen na malých (2,3 - 4 kb) plazmidech replikujících se mechanismem

valivé kružnice (RC plazmidy) (26, 27, 99). Devět různých, avšak příbuzných plazmidů bylo popsáno v

izolátech CoNS z klinické mastitidy krav (99). Devět vysoce podobných lnu(A) genů (92,8 - 100 %

identity) je obklopeno přímými repeticemi, které tvoří kazetu. Ta je pravděpodobně volně přenositelná

mezi různými plazmidy rodiny pC194. To vysvětluje, proč jsou tyto velmi příbuzné geny neseny na

plazmidech s rep geny, které navzájem vykazují 47,9 až 100 % identity. Stejné přímé repetice byly

nalezeny i na stafylokokových plazmidech nesoucí jiné rezistenční geny (20, 21, 23).

34

III.VÝSLEDKY

VÝSLEDKY Makrolidová a linkosamidová rezistence v ČR

35

1. Rozšíření mechanism ů rezistence k makrolid ům a linkosamid ům u methicilin

rezistentních koaguláza negativních stafylokok ů v České republice a výskyt

neznámého mechanismu rezistence k linkosamid ům

Cíle: Cílem práce bylo analyzovat rozšíření mechanismů rezistence k makrolidům a

linkosamidům u klinických izolátů methicilin rezistentních koaguláza negativních stafylokoků (CoNS)

izolovaných v České republice.

Metody: Celkem 919 klinických izolátů CoNS bylo shromážděno během roku 1996 v sedmi

českých nemocnicích a zasláno do Státního zdravotního ústavu, kde byly izoláty druhově

identifikovány. Citlivost k antibiotikům byla testována diskovou difúzní metodou (DDM) a diskovým

indukčním testem. Přítomnost rezistenčních genů erm(A), erm(C), msr(A), lnu(A)/lnu(A)' byla

testována Southern blot hybridizací EcoRI štěpené celkové DNA se specifickými sondami značenými

digoxigeninem. Izoláty S. haemolyticus pozitivní na gen msr(A) byly genotypizovány pulzní gelovou

elektroforézou (PFGE) SmaI restrikčních fragmentů.

Výsledky: Z celkového počtu bylo 98 izolátů (S. haemolyticus n=62, S. epidermidis n=27, S.

hominis n=5, S. capitis n=3, S. warnerii n=1) současně rezistentních k oxacilinu a alespoň k jednomu z

následujících antibiotik: erythromycin, linkomycin a klindamycin. Přestože rezistence k makrolidům a

linkosamidům bývá často zkřížená, více jak polovina z 98 izolátů zůstala, dokonce i za indukčních

podmínek, citlivá alespoň k jednomu z testovaných antibiotik. Tomu odpovídaly i výsledky genetické

analýzy, jež potvrdily vysoký výskyt rezistenčních genů msr(A) (53 %) a lnu(A) 30 % udílejících

rezistenci pouze k některým MLS antibiotikům. Neobvyklá byla také přítomnost více genů v jednom

izolátu. Obvzláště kombinace genů msr(A) a lnu(A), která částečně fenotypově napodobuje přítomnost

genů erm, byla frekventovaná. Distribuce rezistenčních genů byla druhově specifická. Vysoký výskyt

genu msr(A) byl typický pro S. haemolyticus (u 43 z 62 izolátů) zatímco u izolátů S. epidermidis

převládala přítomnost genů erm (u 16 z 27 izolátů). msr(A) pozitivní izoláty S. haemolyticus tvořily

poměrně heterogenní skupinu co se týče místa izolace, rezistenčního genotypu a msr(A)

hybridizačních profilů. Heterogenita izolátů, která byla potvrzena také PFGE genotypizací, vylučuje

klonální šíření této rezistence během outbreaku. Zcela nový rezistenční fenotyp (citlivost k

erythromycinu a rezistence k oběma linkosamidům), který byl pozorován u deseti klonálně příbuzných

izolátů S. haemolyticus, u nichž nebyl detekován žádný z testovaných rezistenčních genů, nasvědčuje

přítomnosti nového rezistenčního mechanismu.

VÝSLEDKY Nový rezistenční protein Vga(A)LC

36

2. Nová varianta proteinu streptograminové rezisten ce, Vga(A) LC, ze

Staphylococcus haemolyticus se změnou substrátové specifity sm ěrem k

linkosamid ům

Cíle: Otestovat potenciální mechanismy nové rezistence k linkosamidům u klinických izolátů

S. haemolyticus rezistentních k oběma linkosamidům avšak citlivých k erythromycinu, u kterých nebyl

nalezen žádný odpovídající rezistenční gen, a určit genetickou podstatu této rezistence.

Metody: Přítomnost mutací ve vazebném místě linkosamidů byla testována PCR amplifikací a

sekvenací relevantních úseků na 23S rRNA. Inaktivace linkomycinu byla testována použitím citlivého

mikroorganismu. Proteiny příbuzné ABC rezistenčním proteinům byly vyhledávány použitím

degenerovaných PCR primerů navržených podle konzervovaných úseků této rodiny proteinů.

Souvislost nalezených sekvencí s rezistenčním fenotypem byla prokázána hybridizací s DNA

rezistentních a citlivých izolátů. Konstrukty kódující Vga proteiny a jejich hybridní varianty byly

transformovány do citlivého S. aureus RN4220, kde byla porovnávána schopnost udílet rezistenci k

linkosamidům a streptograminům. Minimální inhibiční koncentrace antibiotik byly stanoveny agarovou

diluční metodou. Radioaktivně značený linkomycin byl připraven enzymaticky s využitím proteinu

LmbJ katalyzujícím methylaci N-demethyllinkomycinu v závěrečném kroku biosyntézy linkomycinu.

Akumulace [3H]-linkomycinu v buňkách byla měřena scintilačně.

Výsledky: Experimentálně byla vyloučena chromozomální a inaktivační rezistence.

Degenerovanými PCR primery byl nalezen a osekvenován kandidátní gen vga(A)LC kódující ABC

protein, jenž se od proteinu Vga(A), udílející rezistenci ke streptograminům A, liší pouze sedmi

aminokyselinovými záměnami. Tento gen byl přítomen pouze v izolátech rezistentních k oběma

linkosamidům a streptograminu A. Porovnáním obou proteinů v hostiteli citlivém k antibiotikům byl

prokázán rozdíl ve schopnosti udílet rezistenci k linkosamidům. Vliv aminokyselinových záměn na

substrátovou specifitu proteinů Vga(A) a Vga(A)LC byl dále testován. Mutační analýzou byl

identifikován shluk čtyř aminokyselin v centrální části proteinu zodpovědný za rozdílný fenotypový

projev. Měřením akumulace [3H]-linkomycinu bylo prokázáno, že mechanismus linkosamidové

rezistence u S. haemolyticus je identický s mechanismem popsaným u rezistenčního proteinu Msr(A),

udílející rezistenci vůči makrolidům a streptograminům............................................................................

VÝSLEDKY Účinnost telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu

37

3. In vitro účinnost telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu proti methicilin

rezistentním koaguláza negativním stafylokok ům s definovaným rezisten čním

genotypem

Cíle: Otestovat účinnost nově zavedených antibiotik telithromycinu (TEL, ketolid) a

quinupristinu/dalfopristinu (Q/D, streptograminy) proti dříve charakterizovaným klinickým izolátům

methicilin rezistentních koaguláza negativních stafylokoků se zřetelem na specifický výskyt jinde spíše

minoritních rezistenčních mechanismů, jejich kombinací a obzvláště pak se zřetelem na přítomnost

nového rezistenčního genu vga(A)LC udílejícího rezistenci k linkosamidům a streptograminu A u S.

haemolyticus (124).

Metody: V této studii bylo zahrnuto 88 klinických izolátů koaguláza negativních stafylokoků

pocházejících ze sbírky fenotypově a geneticky charakterizovaných izolátů rezistentních k makrolidům

a/nebo linkosamidům (123). Citlivost k TEL a QD byla testována diskovou difúzní metodou (DDM) a

indukčním diskovým testem s použitím erythromycinu jako induktoru. Rezistence k TEL za indukčních

podmínek byla testována DDM v přítomnosti subinhibičních koncentrací erythromycinu v médiu.

Minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro Q/D byly stanoveny E testem a MIC pro PIIA agarovou

diluční metodou. Citlivosti k antibiotikům byly vyhodnocovány dle kritérií CSLI (31). Přítomnost

rezistenčních genů mph(C) a vga(A)/vga(A)LC byla detekována PCR amplifikací ze specifických

primerů. Totožnost vga(A) varianty byla ověřena osekvenováním PCR produktu.

Výsledky: Citlivost k telithromycinu u testovaného souboru byla ovlivněna stejnými

rezistenčními mechanismy jako rezistence k erythromycinu. TEL byl plně aktivní pouze proti všem 15

erythromycin senzitivním izolátům a naopak všech 73 erythromycin rezistentních izolátů bylo buď

konstitutivně rezistentních k TEL (13 izolátů s konstitutivním genem erm), nebo u nich byla

detekována deformovaná inhibiční zóna znamenající indukci rezistence (u 25 izolátů s inducibilním

genem erm a u 35 izolátů s genem msr(A)). Nicméně, úroveň rezistence k TEL udílená genem msr(A)

byla i za indukčních podmínek hraniční. Inaktivační gen mph(C) byl nalezen u všech 21 testovaných

izolátů (16 S. haemolyticus a 5 S. epidermidis) v sousedství genu msr(A).

Pokud byla pro testování citlivosti ke Q/D použita DDM, nebyl detekován žádný rezistentní

izolát. Avšak pokud byl pro testování použit E test, 18 izolátů bylo intermediárně rezistentních (MIC =

1-3 mg/l) ke Q/D a dva byly dokonce rezistentní (MIC = 8 mg/l). Všechny tyto izoláty byly současně

rezistentní ke streptograminu A a obsahovaly geny vga(A) (1 izolát) nebo gen vga(A)LC (19 izolátů).

MIC pro Q/D byla vyšší (3-8 mg/l) u izolátů rezistentních současně ke streptograminu B než u izolátů k

tomuto antibiotiku citlivých (MIC = 0,5-2 mg/l). Kromě S. haemolyticus byl gen vga(A)LC nalezen u S.

epidermidis a S. warnerii, což naznačuje jeho rozšíření.

Q/D byl účinnější než TEL díky synergistickému účinku Q/D, který byl zachován i přes získání

rezistence k jedné složce streptograminu, a také díky nízkému výskytu rezistence ke streptograminu

A. Nesprávná identifikace izolátů rezistentních k nízkým koncentracím Q/D může přispět k šíření

rezistence ke streptograminu A.

VÝSLEDKY Analýza okolí genu msr(A)

38

4. Sekven ční analýza okolí rezisten čního genu msr (A) u S. haemolyticus (data

pro p řipravovanou publikaci)

V publikaci (123) jsme charakterizovali zastoupení mechanismů rezistence k makrolidům a

linkosamidům u klinických izolátů methicilin rezistentních CoNS izolovaných v českých nemocnicích

během roku 1996. Soubor studovaných izolátů byl vybrán na základě zkřížené rezistence alespoň k

jednomu z následujících antibiotik: erythromycin, linkomycin a klindamycin. V souboru byla nalezena

velmi neobvyklá převaha jinde spíše minoritních genů msr(A) a lnu(A). Neobvyklá byla také častá

přítomnost více genů v jednom izolátu. Jedním z faktorů ovlivňujícím toto v porovnání s jinými studiemi

netypické rozložení rezistenčních genů může být převaha izolátů S. haemolyticus (63 % všech

izolátů). S. haemolyticus je velmi často mnohočetně rezistentní k antibiotikům a má vyšší podíl

methicilin rezistentních izolátů v porovnání s obvykle dominantním S. epidermidis. Mimoto byla u

tohoto druhu pozorována vyšší četnost MSB rezistence udílené genem msr(A) (45, 74, 93, 123).

Selekce methicilin rezistentních izolátů, současně rezistentních alespoň k jednomu z testovaných MLS

antibiotik, je tedy nejspíš důvodem převahy S. haemolyticus a současně také genu msr(A) v našem

souboru. Nicméně i mezi izoláty ostatních druhů byla četnost msr(A) vyšší než bývá uváděno v

literatuře.

Gen msr(A) byl přítomen u 43 z 62 izolátů S. haemolyticus (69 %) tvořících velmi heterogenní

skupinu co se týče velikostí EcoRI fragmentů hybridizujících se sondou specifickou pro msr(A) a počtu

různých genotypů pozorovaných PFGE analýzou SmaI restrikčních fragmentů (123). Tato pozorování

vylučují klonální rozšíření izolátů s genem msr(A) během outbreaku a jsou nejspíš důsledkem

horizontálního šíření genu msr(A) mezi izoláty S. haemolyticus. Cílem této práce bylo lokalizovat a

identifikovat mobilní element(y) nesoucí gen msr(A) a objasnit tak příčinu neobvykle velkého rozšíření

tohoto genu u S. haemolyticus v České republice a také příčinu diverzity msr(A) hybridizačních profilů.

Gen msr( A) je většinou kódován chromozomáln ě

Hybridizací neštěpené celkové DNA a plazmidové DNA se sondou specifickou pro gen msr(A)

jsme zjistili, že rezistenční gen je s výjimkou dvou izolátů kódován chromozomálně. Southern blot

analýza SmaI štěpené genomické DNA dělené pulzní gelovou elektroforézou ukázala, že gen je ve

všech případech lokalizován na stejném fragmentu o velikosti přibližně 35 kb (Obr. 5.1.). Pouze u

dvou izolátů byl gen msr(A) nalezen na velkém plazmidu.

Okolí chromozomáln ě lokalizovaného genu msr (A) u KM45

Pro sekvenční analýzu okolí chromozomálně kódovaného genu msr(A) jsme vybrali kmen

KM45, který zastupuje nejpočetnější hybridizační profil, kdy msr(A) sonda hybridizuje s EcoRI

fragmentem o velikosti 5 kb. Kraje ClaI restrikčního fragmentu obsahujícího gen msr(A) byly po

vložení do vektoru pBluescript II SK+ sekvenovány z univerzálních vektorových primerů. Sekvence

obou konců byly identické s chromozomální sekvencí kmene S. haemolyticus JCSC1435 (mezi

nukleotidy 2333473-2338226) jehož genom byl nedávno osekvenován (přístupové č. AP006716).

Tento úsek je součástí plazmidu πSh1 integrovaného v chromozómu JCSC1435 (lokusy SH2296 -


39

SH2326) (179). Identické uspořádání genů v celé oblasti odpovídající plazmidu πSh1 a také jeho

umístění v genomu bylo pro kmen KM45 potvrzeno PCR mapováním (Obr. 5.2.B). V této oblasti (22

kb) se nachází 30 otevřených čtecích rámců (ORF), mezi nimiž lze identifikovat 10 genů se známou

nebo hypotetickou funkcí (Obr. 5.2.A.):

Geny smp a stp kódující předpokládanou hydrofobní transmembránovou doménu a ATP

vazebný protein jsou lokalizovány těsně před genem msr(A). Umístění těchto genů v sousedství

msr(A) bylo popsáno na plazmidech z S. aureus a S. epidermidis nebo na chromozómu u S. hominis

(110, 148). Původně se předpokládalo, že produkty těchto genů, jejichž homology (85 % a 65 %

identity) byly nalezeny i u citlivého S. aureus RN4220, interagují s Msr(A) a tvoří tak funkční

transportní systém. Inaktivace těchto genů v S. aureus RN4220 však neměla vliv na schopnost msr(A)

udílet rezistenci v tomto hostiteli (149).

Těsně za genem msr(A) je lokalizován rezistenční gen mph(C) kódující enzym inaktivující

makrolidy. Tato fosfotransferasa MPH(2')II je totožná s Mph(C) kódovanou na plazmidu pSR1

(AF167161), kde se nachází stejně jako u JCSC1435 v těsném sousedství genu msr(A), a je téměř

identická (jedna aminokyselinová záměna) s fosfotransferasou ze Stenotrophomonas maltophilia (9).

Kromě plazmidu pSR1, kde jsou geny msr(A) a mph(C) odděleny 97bp dlouhou nekódující oblastí, se

tato dvojice sousedících genů nachází také na plazmidu pMS97 z S. aureus. V tomto případě oba dva

geny odděluje nekódující oblast o velikosti 341bp (108). Proteinové produkty genů msr(A) a mph(C)

se od proteinů z S. haemolyticus JCSC1435 liší 7 a 4 aminokyselinami (98% identita).

Geny binR a sin lokalizované downstream od dvojice msr(A)-mph(C) kódují stafylokokovou

resolvasu a rekombinasu, obě z velké rodiny serinových rekombinas, jež jsou důležité pro horizontální

přenos u grampozitivních baktérií. Geny binR a sin jsou mezi stafylokoky hojně rozšířeny a často jsou

asociovány s transpozonem Tn552 nesoucí geny pro ß-laktamasu a s geny rezistence ke kvartérním

amoniovým sloučeninám (131, 132, 154, 171).

Obr. 5.1. PFGE SmaI restrik čních profil ů a hybridizac e se sondou specifickou pro gen msr (A). Dráhy 1a 16 Low range PFG marker, dráhy 2, 9 a 15 CCM7296 negativní kontrola, dráha 14 izolát bez msr(A), dráhy 3-8 a 10,11 a13 izoláty s msr(A) na chromozómu, dráha 12 izolát s msr(A) na plazmidu

48.5 kb

23.1 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16


40

Na 3´konci plazmidu πSh1 se nacházejí gen kadmiové rezistence cadD, jeho regulátor cadX a

inzerční sekvence IS431 (nebo IS257) kódující transposasu.

Na 5´konci integrovaného plazmidu je gen (lokus SH2296) pro replikační protein RC rodiny

(rolling circle) plazmidů, které bývají často integrovány ve velkých konjugativních plazmidech (18).

První polovina rep genu je zkrácena 147bp dlouhou sekvencí, jež je vysoce homologní s ISLE39

(insertion sequence like element) z S. aureus SH39 (95% identita) (2) a z S. epidermidis RP62A (94%

identita). Tento element má, podobně jako inzerční sekvence (IS), na obou koncích invertované

repetice (IR) avšak na rozdíl od IS nekódují žádnou transposasu. Nepřesná převrácená kopie ISLE39

se nalézá na témže integrovaném plazmidu mezi lokusy SH2321 a SH2322. Oba elementy mají 21bp

dlouhé IR jejichž část (16bp) je totožná s IR inzerční sekvence IS431. ISLE elementy, jež byly

nalezeny v různých stafylokokových izolátech by mohly být pozůstatky inzerčních sekvencí avšak není

také vyloučeno, že se tyto elementy můžou účastnit mobilizace sekvencí, jež obklopují (22).

Okolí genu msr (A) u izolát ů s jiným msr (A) hybridiza čním profilem

Přestože bylo prokázáno, že gen msr(A) je u všech izolátů nesen na chromozómu ve stejném

místě, msr(A) specifická sonda hybridizovala s různými velikostmi EcoRI fragmentů DNA 43 msr(A)-

pozitivních izolátů (123). Abychom zjistili, co je důvodem této diverzity, vybrali jsme 14 izolátů lišících

se svým EcoRI hybridizačním a PFGE profilem (Tab. 5.1.). Tyto izoláty byly podobně jako KM45

podrobeny PCR mapování. Produkty amplifikace, které se svou velikostí lišily od velikosti

předpovězené ze sekvence S. haemolyticus JCSC1435, byly sekvenovány. Mezi izoláty bylo nalezeno

několik rozdílů v uspořádání oblasti, která je jinak vysoce homologní s plazmidem πSh1 (Obr. 5.2.C).

Tab. 5.1. Výběr izolát ů pro PCR mapování okolí genu msr(A) a PCR produkty l išící se od JCSC1435

Izolát

Původní označení izolátua

SmaI restrikční profil Detekované rezistenční geny

Velikost EcoRI fragmentu

hybridizujícího s msr(A) sondou b

PCR produkty lišící se od JCSC1435 (kb)

KM45 1032UL B2 msr (A), lnu (A) 5 kb

KM71 33OL A2 msr(A), erm(C) 7,7 kb mph(C)-sin (1,4)

KM49 1065UL A3 msr(A), erm(C), lnu(A) 4,7 kb mph(C)-sin (3,8)c

KM33 78BB A5 msr(A), lnu(A), vga(A)LC 5 kb argS-isle39 (2,8)

KM30 65OL A5 erm(C), msr(A), vga(A)LC 5 kb argS-isle39 (2,8)

KM57 141KV B5 msr(A), lnu(A) 5 kb

KM36 111KR C msr(A) 11 kb mph(C)-sin (3,8)c

KM89 155OL D msr(A) 7,2 kb binR-EcoRI (3,8)

KM78 88OL F msr(A) 3,5 kb plazmid

KM35 103OL I msr(A) 7,2 kb binR-EcoRI (3,8)

KM2 131UL L1 msr(A), erm(C) 7,2 kb binR-EcoRI (3,8)

KM37 15OL L2 msr(A), lnu(A) 7,2 kb binR-EcoRI (3,8)

KM27 32UL nd msr(A), lnu(A), vga(A)LC 5 kb argS-isle39 (2,8)

KM38 33KR T2 msr(A) 7,2 kb binR-EcoRI (3,8)

KM50 1079UL U msr(A) 7,2 kb binR-EcoRI (3,8)

KM88 14KR X msr(A) 3,5 kb plazmid

KM68 233OL Y msr(A) 5 kb a Zkratka označuje město, v němž byl klinický izolát získán: BB - Brno, KR - Praha, KV - Praha, OL - Olomouc, UL - Ústí nad Labem b Velikosti fragmentů byly stanoveny pomocí programu AIDA (Advanced Image Data Analyzer, v.3.28) c Tyto PCR produkty se od JCSC1435 nelišily svojí velikostí, ale nukleotidovou sekvencí


41


42

Amplifikace s použitím primerů 13F a 14R (Obr. 5.2.) velmi dobře odrážela pozorované

hybridizační typy. Zatímco u kmenů s msr(A) hybridizujícím EcoRI fragmentem o velikosti 5 kb byl

amplifikován produkt o velikosti 1,4 kb, což odpovídá sekvenci S. haemolyticus JCSC1435, u kmenů s

msr(A) hybridizujícím EcoRI fragmentem o velikosti 7,2 kb byl amplifikován PCR produkt o velikosti

3,8 kb (Tab. 5.1.). Sekvenací produktů izolátů KM2 a KM50 jsme zjistili inzerci levé poloviny

transpozonu Tn552 (binL-tnpA-tnpB-TIRL), který se vložil downstream od genu sin namísto genu binR

(Obr. 5.2.C). Tímto vložením došlo k rekonstrukci plazmidu Tn5404.

Použitím stejné dvojice primerů však nedošlo k žádné amplifikaci u izolátů KM49 (4,7kb EcoRI

fragment), KM71 (7,7kb EcoRI fragment) a KM36 (15kb EcoRI fragment). Odpovídající DNA úseky

jsme u těchto izolátů s úspěchem amplifikovali použitím dvojice primerů 9F a 15R, specifických pro

geny mph(C) a sin (Obr. 5.2.). Velikost PCR produktů pro izoláty KM49, KM36 byla stejná (3,8 kb) jako

pro JCSC1435. Sekvenací obou produktů jsme zjistili stejné uspořádání genů mph(C), binR a sin jako

u JCSC1435, avšak oba PCR produkty se lišily v nukleotidových sekvencích genů binR a sin, včetně

jejich okolí (Obr. 5.3.). Velikost PCR produktu z kmene KM71 byla pouze 1,6kb a sekvence ukázala

absenci pravé části transpozonu Tn5404 a genu binR. Touto delecí se formuje uspořádání genů

msr(A)-mph(C)-sin, jež je identické s uspořádáním těchto genů na plazmidu pSR1 (AF167161).

Nicméně sekvence genu sin u KM71 je totožná se sekvencí z JCSC1435.

Další odlišnosti v uspořádání msr(A) oblasti na chromozómu byly nalezeny u izolátů KM27,

KM30 a KM33. PCR amplifikací z primerů 1F a 2R došlo k amplifikaci 2,8kb velkého PCR produktu

namísto předpokládaných 1,3 kb, což bylo způsobeno vložením inzerční sekvence ISSha1 do lokusu

SH2295. Inzerční sekvence je ohraničená osminukleotidovými přímými repeticemi, jež jsou výsledkem

duplikace cílového místa během integrace této inzerční sekvence z ISL3 rodiny (193).

Plazmid nesoucí gen msr (A)

Pro analýzu okolí genu msr(A) neseného na plazmidu jsme vybrali kmen KM88, který

obsahoval pouze jediný plazmid. Konce BsaBI/HindIII fragmentu, obsahujícího gen msr(A), byly po

vložení do vektoru sekvenovány z univerzálních vektorových primerů. Sekvence obou konců

fragmentu byly totožné s úsekem plazmidu pSR1 z S. aureus (3417-8591bp). Shodné uspořádání

genů tnpIS431, msr(A), mph(C) a sin bylo v tomto fragmentu potvrzeno sekvenováním z primerů

navržených uvnitř fragmentu. Nukleotidové sekvence genů msr(A) a mph(C) jsou téměř totožné s

geny z JCSC1435, v genu msr(A) byla nalezena pouze jediná nukleotidová záměna, která se

projevuje také na úrovni proteinu. Geny pro rekombinasu Sin jsou si podobné méně: 87% identita na

úrovni DNA a 95% identita na proteinové úrovni.

Kromě fragmentu s genem msr(A) jsme do vektoru vložili i některé další BsaBI/HindIII nebo

HindIII fragmenty plazmidu p88 a jejich konce jsme opět sekvenovali z univerzálních primerů. Ačkoli

nebyl osekvenován celý plazmid, z částí sekvencí (Tab. 5.2.), které odpovídají několika různým

stafylokokovým plazmidům, vyplývá, že p88 je složeným plazmidem, který vznikl kointegrací celých

nebo částí plazmidů zprostředkovanou IS431 (označována také IS257). Tyto IS jsou lokalizovány na

krajích integrovaných plazmidů (18, 91).


43

Tab. 5.2. Výsledky BLAST analýzy sekvenovaných částí plazmidu p88

Vložený úsek (kb)

Sekvenováno z primeru (bp)

Úsek sek. fragmentu

Nejlepší výsledek BLAST analýzy (% identity)

Pořadí genů v celém

vloženém fragmentu a

(5'-3')

GenBank přístupové číslo

Reference, poznámky

1-263 pSR1 3420-3682 (100 %)

263-591 žádná významná podobnost M13F (1009)

591-1009 pSR1 1-419 (100 %)

1-582 pSR1 1274-1855 (100 %)

HindIII/HindIII (2,8)

M13R (876) 583-876 pSR1 2894-3187 (100 %)

tnp431 , orf1, ofr2, tnp431

M13R (950) 1-950 pSR1 3417-4366(100 %) BsaBI/HindIII (5)

M13F (936) 1-636 pSR1 7656-8591 (100 %)

tnp431 , msr(A),

mph(C), sin

AF167161 S. aureus

1-301 pSERP 16804-17104 (99 %) M13R (907)

295-907 pSERP 17180-17792 (100 %) HindIII/HindIII

(3,5)

M13F (915) 1-915 pSERP 19546-20461 (100 %)

M13F (945) 1-945 pSERP 23181-24125 (98 %) BsaBI/HindIII (2)

M13R (958) 1-958 pSERP 24166-25123 (99 %)

tnp431 , rep, spm, rlx, mob,

tnp431 CP000028 S. epidermidis RP62A

genom

M13R (860) 1-860 pT181 818-1677 (100 %)

HindIII/HindIII (2,3) M13F (872) 1-872 pT181 2039-3177 (99 %)

repC, tet, pre CP000045

Staphylococcus aureus subsp. aureus COL (pT181 bývá součástí mozaikových plazmidů, a také SCCmec kazety typu III)

M13F (982) 1-982 Tn5405 402-1383 (99 %)

1-680 Tn5405 1802-2480 (99 %)

úsek nic nekóduje SAU73027 sekvence Tn5405 mezi

aphA-3 and IS1182right HindIII/HindIII

(2,3) M13R (974) 681-974 pST6 (200-494) 100 % tnp AY028780 tnp431 100 % i s dalšími

plazmidy

a Pokud délka úseku mezi osekvenovanými konci vložených fragmentů plazmidu p88 odpovídala vzdálenostem v sekvenci z databáze, byl vložený fragment považován za celistvý.

Hlavním zdrojem variability msr (A) oblasti je aktivita resolvasy a transposasy

Mezi 15 izoláty jsme PCR mapováním a sekvenováním nalezli 6 různých typů uspořádání

okolí genu msr(A). U pěti z nich byla variabilita soustředěna do oblasti genů binR a sin (Obr. 5.2. a

5.3). Jak již bylo zmíněno, resolvasa Bin a rekombinasa Sin patří do velké rodiny serinových

rekombinas. Regulace rekombinace je spojená s vysokým stupněm topologické selektivity. Tyto

rekombinasy působí v rekombinačních místech (res site), jež jsou uspořádána jako přímé repetice v

rámci jednoho plazmidu. Selektivita je pravděpodobně dána formováním katalyticky aktivní synapse

tvořené rekombinasami a dalšími regulačními proteiny navázanými v oblasti res místa (153).

Rekombinační místo pro bin (resbin) má tři vazebná místa, místo křížení molekuly (resbin site I), které je

tvořeno nepřesnou invertovanou repeticí a další dvě místa pro navázání dalších dimerů resolvás

(resbin siteII a III) (159). Rekombinační místo pro sin (ressin) má pouze dvě vazebná místa (ressin site I

a II) a stejně jako u resbin je místo štěpení DNA uprostřed nepřesných invertovaných repetic v místě

ressin site I (155).


44

Z porovnání sekvencí úseků lišících se u jednotlivých izolátů (Obr. 5.3.) jsou patrná místa, kde

pravděpodobně došlo k rekombinacím, jež mají za následek většinu rozdílů nalezených v msr(A)

oblasti. Všechny sekvence na obrázku 5.3. jsou identické až do místa rekombinace v ressin site I. U

izolátu KM71 a plazmidu pSR1 (a pravděpodobně také u p88), které nemají resolvásu binR pokračuje

sekvence pravým ramenem ressin site I a dále pak sekvencí odpovídající ressin site II a genem sin. U

sekvence JCSC1435 a izolátů KM36 a KM49 je v tomto místě vložen úsek pravého ramena ressin siteI,

avšak na něj nenavazuje ressin site II, ale terminální invertovaná repetice TIRRa a otevřené čtecí

rámce orfB a orfA, jež jsou součástí transpozonu Tn5404. Dále pak sekvence pokračuje

rekombinačním místem pro resolvásu resbin. V místě resbin site I došlo pravděpodobně k resolvasou

řízené rekombinaci, jež má za následek odlišné sekvence genů binR a pravděpodobně také sin u

izolátů KM36 a KM49. Za genem binR následuje úsek, jenž je v obrázku 5.3. označen jako ∆ressin site

I, u kterého levé rameno palindromu chybí podobně jako u plazmidu pI9789, u kterého byla

nefunkčnost tohoto ressin místa s chybějícím levým ramenem prokázána (155). U izolátu KM50, který

se od JCSC1435 liší vložením levé poloviny transpozonu Tn552, začínají rozdíly teprve až v genu

binL (Obr. 5.3.), který je z 94 % identický s binR. V genomu JCSC1435 se vyskytují dvě binL

resolvasy, které jsou s binL z izolátu KM50 identické. První, v pozici JCSC1435 1826963-1826434, je

Obr. 5.3. Porovnání sekvencí rekombina čních míst gen ů bin a sin a jejich okolí u JCSC1435 a izolát ů s odlišným uspo řádáním v tomto úseku msr (A) oblasti. První řádek: sekvence u JCSC1435; nukleotidová sekvence genů a terminálních invertovanýh repetic je vynechána. Sekvence, jež tvoří rekombinační místa ressin a resbin, jsou zvýrazněny tlustě. Neúplné palindromy uvnitř rekombinačních míst jsou podtrženy a místo rekombinace je vyznačeno lomítkem. U ostatních sekvencí jsou zobrazeny pouze nukleotidové záměny v nekódujících oblastech a identita nukleotidových sekvencí genů (%). U sekvence izolátu KM50 jsou zeleně vyznačeny jediné dvě nukleotidové záměny uvnitř TIRRa a přerušovanou čárou je vyznačena vložená sekvence odpovídající levé části Tn552. Sekvence mezi TIRRa a TIRLa odpovídá transpozonu Tn5404. Sekvence izolátu KM71 a plazmidu pSR1 mezi rekombinačními místy ressin site I chybí. Červeně s černě zvýrazněnými záměnami uvnitř je vyznačená zdvojená sekvence pravého ramena ressin site I.


45

součástí kompletního transpozonu Tn552 a s rekombinačním místem resbinR je identická až k místu

rekombinace (resbinR site I). Druhá, v pozici JCSC1435 261884-2618311, je součástí sekvence

transpozonu Tn5404. Kompletní transpozon Tn5404 je na vnějších okrajích ohraničen 7 bp dlouhou

přímou repeticí (AGTAACT), jež vznikla zdvojením místa inzerce transpozonu (Obr. 5.3.), stejné

inzerční místo pro Tn552 bylo pozorováno v chromozómu Entereococcus faecalis CH116 (146, 155).

Shrnutí výsledk ů:

• Gen msr(A) byl u 41 izolátů lokalizován na chromozómu ve společném místě, pouze u dvou

izolátů byl gen lokalizován na plazmidu.

• Oblast chromozomálně kódovaného genu msr(A) je u všech patnácti podrobněji studovaných

izolátů (Tab. 5.1.) vysoce homologní s plazmidem πSh1, integrovaným v genomu S.

haemolyticus JCSC1435 izolovaného v Japonsku (179).

• Uspořádání genů na tomto plazmidu je konzervovaným souborem jednotlivých genových

motivů, jehož menší fragmenty byly odděleně popsány v několika dřívějších studiích.

• Rozdíly v msr(A) hybridizačních profilech jsou dány výhradně variabilitou v úseku kódujícím

resolvasu Bin a rekombinasu Sin.

• Nalezli jsme pět různých typů uspořádání msr(A) oblastí, které se liší od JCSC1435 tímto:

i) vložením části transpozonu Tn552 (typ KM50 ; 7,2kb msr(A) hybridizující fragment)

ii) delecí části transpozonu Tn5404 (typ KM71 ; 7,7kb msr(A) hybridizující fragment)

Oba tyto blízce příbuzné transpozony náleží do rodiny Tn21. Preferenčními místy vkládání

těchto transpozonů jsou rekombinační místa ressin a resbin, jsou proto označovány jako "res-

site hunters" (117).

iii) sekvencí genů binR a sin, včetně jejich okolí (typ KM36 ; 11kb msr(A) hybridizující fragment

a typ KM49 , 4,6kb msr(A) hybridizující fragment), jenž je pravděpodobně důsledkem

rekombinace v místě resbin.

iv) vložením ISSha1 do stejného místa, jež leží za 5' koncem plazmidu πSh1 (typ KM27 ; 5kb

msr(A) hybridizující fragment). Všechny izoláty s touto IS (KM27, KM30 a KM33) náleží

stejnému hybridizačnímu typu jako JCSC1435

• Okolí genu msr(A) na plazmidu p88 je identické s plazmidem pSR1 izolovaným z S. aureus a

uspořádání genů msr(A)-mph(C)-sin je totožné s msr(A) okolím u izolátu KM71.

46

IV. DISKUZE

DISKUZE

47

Ve třech přijatých a jedné připravované publikaci jsou shrnuty výsledky studia mechanismů

rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům u methicilin rezistentních koaguláza

negativních stafylokoků. Pilotní práce (123) definovala soubor rezistentních klinických izolátů z ČR, u

něhož byl stanoven rezistenční profil na fenotypové i genové úrovni. Velmi neobvyklá distribuce

rezistenčních genů a pozorování nového rezistenčního fenotypu, jenž implikuje přítomnost doposud

neznámé rezistenční determinanty, byly důvodem v pokračování výzkumu tohoto tématu. Výsledkem

bylo objevení nové varianty rezistenčního ABC proteinu Vga(A)LC s rozšířeným substrátovým

spektrem, u kterého jsme určili aminokyseliny zodpovědné za tuto změnu v substrátové specificitě

(124). Dále jsme charakterizovali mobilní elementy nesoucí dominantní rezistenční gen msr(A)

kódující protein ze stejné rodiny ABC proteinů jako Vga(A)LC (Novotná, v přípravě). Poslední publikace

(125) využívá tento z hlediska MLS rezistencí detailně prostudovaný souboru izolátů CoNS k

otestování účinnosti nových antibiotik telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu na pozadí

rezistenčního profilu charakteristického pro ČR.

Z klinického hlediska je převaha rezistenčních mechanismů udílející rezistenci pouze k

některým MLS antibiotikům velmi zajímavá, dochází totiž k dělení původně společné MLSB rezistenční

skupiny: v testovaném souboru bylo dokonce i za indukčních podmínek pouze 44 % izolátů

rezistentních ke všem třem testovaným antibiotikům. To znamená, že alespoň některé z MLS

antibiotik zůstává účinné proti více jak polovině izolátů CoNS. Otázkou je, zda je toto v jiných zemí

zcela neobvyklé rozložení rezistenčních mechanismů mezi methicilin-rezistentními CoNS typické pro

Českou republiku (či region střední či východní Evropy), nebo zda došlo k lokálnímu šíření (outbreaku)

klonů s těmito typy rezistence. Prvotní MSB rezistentní izoláty CoNS (S. hominis, S. cohnii) s genem

msr(A) byly izolovány v Československu v roce 1976 (39) a první S. aureus s tímto genem byl

izolován v Maďarsku v roce 1977 (72). Také inaktivace linkosamidů byla poprvé pozorována u izolátů

S. aureus a S. intermedius zvířecího původu z Československa (49, 88). Je tedy možné, že se tyto

rezistenční mechanismy vyvinuly právě v tomto regionu. Důvodem však také může být intenzivní

výzkum stafylokoků Prof. Václavem Hájkem, působícím na Palackého univerzitě v Olomouci, který

mnohé z těchto raných rezistentních stafylokoků izoloval.

Klonálnímu šíření rezistence nasvědčuje fakt, že většina msr(A) pozitivních izolátů (43 z 52) a

více jak polovina lnu(A) pozitivních izolátů (19 z 29) byla identifikována jako S. haemolyticus. Zároveň

S. haemolyticus jasně převažoval (63 %) ve výběru methicilin-rezistentních izolátů se zkříženou

rezistencí k MLS antibiotikům, přestože v původním souboru 919 izolátů byl nejčastějším druhem S.

epidermidis. Genotypizace izolátů S. haemolyticus však tuto hypotézu potvrdila pouze velmi omezeně:

Mezi 46 erythromycin rezistentními izoláty bylo pozorováno 34 rozdílných genotypů, z nichž pouze

některé se dle klasifikace Tenover et al. (181) zdají být klonálně příbuzné (nepublikovaná data). Díky

své schopnosti akumulovat rezistence, bývá S. haemolyticus často rezistentní k mnoha antibiotikům, a

dokonce i první methicilin a glykopeptid rezistentní izoláty náležely tomuto druhu (42, 60). Sekvenace

genomu S. haemolyticus JCSC1435 odhalila přítomnost velkého množství funkčních inzerčních

sekvencí (IS), jež jsou důvodem extrémní plasticity genomu zlepšující jeho adaptabilitu na prostředí

hostitelského organizmu včetně získávání odolnosti k mnoha antibakteriálním látkám (179).

DISKUZE

48

Gen msr(A) byl u naprosté většiny našich izolátů lokalizován na chromozómu v rámci

integrovaného plazmidu, stejně jako u sekvenovaného kmene JCSC1435 (179). Tento plazmid

postrádá geny kódující mobilizační proteiny a nelze u něj nalézt ani žádné struktury charakteristické

pro transpozon nebo chromozomální kazetu, které by naznačovaly možný mechanismus

horizontálního přenosu msr(A)-mph(C) lokusu. Otázkou tedy je, zda se msr(A) šíří horizontálním

přenosem, anebo pouze klonálně. Jednou z možností horizontálního šíření je mobilizace pomocí v

genomu hojně se vyskytujících IS, jejichž přítomnost v okolí msr(A)-mph(C) lokusu by mohla způsobit

přenesení genů do konjugativního plazmidu. Tomu nasvědčuje přítomnost msr(A)-mph(C) na

mozaikovém plazmidu u dvou izolátů v naší sbírce a také přítomnost inzerčních sekvencí IS431

upstream od genů cadD a cadX a ISha1 u kmenů KM27, 30 a 33. V tomto předpokládaném procesu

mobilizace by se mohla uplatňovat také nalezená dvojice ISLE39 elementů. Alternativně, podobnou

funkci může mít i rekombinasa sin, která se jako jediná vyskytuje v sousedství msr(A)-mph(C) i na

obou plazmidech. Není však vyloučeno, že k takovýmto událostem dochází pouze výjimečně a že je

tato oblast relativně stabilní součástí jinak velmi tvárného genomu. Tomu nasvědčuje fakt, že

JCSC1435, který byl izolován v Japonsku v roce 2000 má identickou msr(A) oblast s některými izoláty

získanými v České republice v roce 1996 a naopak, že v rámci epidemiologicky příbuzných izolátů

existují rozdíly. Jednotlivé genové motivy byly nalezeny v mnoha stafylokokových izolátech v různých

studiích: kombinace genů smp-stp-msr(A) byla nalezena na plazmidu S. epidermidis a v chromozómu

S. hominis (148), tatáž kombinace genů navíc se sekvencí upstream od msr(A), byla nalezena u

izolátů S. aureus (110). Kombinace genů msr(A)-mph(C)-sin se vyskytuje na plazmidu pSR1

(AF167161) a dvojice genů msr(A)-mph(C) na plazmidu pMS97 z S. aureus (108) a také v mnoha

dalších izolátech (45, 179). Téměř identická kombinace genů mph(C)-sin byla dokonce nalezena u

gramnegativní Stenotrophomonas maltophilia (9). Až do sekvenace genomu JCSC1435 nebyla

publikována jediná sekvence kódující všechny tyto geny. Analýza širšího okolí genu msr(A) v těchto

izolátech by byla zapotřebí, aby bylo možné shrnout, zda je uspořádání genů smp-stp-msr(A)-mph(A)-

sin opakující se součástí mobilních elementů nesoucích gen msr(A). Eventuálně jestli se do ostatních

stafylokokových druhů a i do jiných rodů šíří pouze jednotlivé části této oblasti náhodně.

Identita sekvence části plazmidu p88 obsahující IS431-msr(A)-mph(C)-sin s úsekem na

plazmidu pSR1 z S. aureus a to včetně rekombinasy, která je hlavním zdrojem variability v msr(A)

oblasti izolátů v souboru, je dokladem přímé spojitosti přenosu msr(A) a mph(C) rezistenčních genů

mezi těmito druhy. Multirezistentní S. haemolyticus tak může sloužit jako zdroj rezistencí pro

virulentnější S. aureus, což by mohlo mít vliv i na vyšší podíl genu msr(A) u izolátů tohoto druhu.

Avšak mezi stovkou methicilin rezistentních S. aureus izolovaných v českých nemocnicích v letech

2000-2002 byly nalezeny pouze dva msr(A) pozitivní izoláty (113).

Teprve vyšetření aktuálního souboru klinických izolátů CoNS může potvrdit, zda je výskyt

"alternativních" mechanismů udílejících rezistenci pouze k některým MLS antibiotikům v České

republice stále významný. Se stoupající spotřebou makrolidů a linkosamidů (Obr. 6.1.) lze obecně

očekávat nárůst rezistence k těmto antibiotikům, otázkou však je, jaké rezistenční mechanismy se u

CoNS uplatňují. V případě, že by byl výskyt alternativních rezistencí u CoNS stále aktuální, má velký

význam v klinické praxi rutině testovat citlivost k MLS antibiotikům diskovým indukčním testem (Obr.

DISKUZE

49

4.1.). Použití disků s oběma linkosamidy, linkomycinem a klindamycinem, umožní identifikovat

inaktivaci linkomycinu, která by v případě použití pouze doporučené kombinace disků s

erythromycinem a klindamycinem (40, 121) zůstala skrytá.

Díky tomu, že výběr studované sbírky CoNS nebyl omezen pouze na erythromycin rezistentní

izoláty, jako u většiny podobných studií, podařilo se zachytit i 10 izolátů S. haemolyticus rezistentních

k oběma linkosamidům, avšak citlivých k erythromycinu, u kterých jsme později charakterizovali novou

rezistenční determinantu vga(A)LC udílející rezistenci k linkosamidům a streptograminům A (124).

Později se ukázalo, že tento gen je kromě těchto deseti izolátů přítomen také u dalších 9 erythromycin

rezistentních izolátů S. haemolyticus, S. epidermidis a S. warnerii, u nichž byla LSA rezistence

částečně maskována přítomností jiných rezistenčních determinant.

Spolu s genem vga(A) nalezeným u jednoho izolátu S. epidermidis je to celkem 20 izolátů

rezistentních ke streptograminu A. Ačkoli z tohoto počtu byly pouze dva izoláty rezistentní ke

kombinaci streptograminů quinupristin/dalfopristin, je toto číslo alarmující, zejména proto, že izoláty

pocházejí z doby, kdy v humánní medicíně streptograminy nebyly v České republice používány.

Důvodem relativně vysokého počtu může být selekční tlak linkosamidů na gen vga(A)LC s

pozměněnou substrátovou specifitou a nebo používání virginiamycinu jako přídavku do krmných

směsí. Intravenózní quinupristin/dalfopristin je vzhledem ke své dobré účinnosti i proti erythromycin

rezistentním izolátům vynikající alternativou proti rezistentním stafylokokům, navíc je v současné době

testován nový orální derivát, který in vitro vykazuje až čtyřnásobně vyšší účinnost dokonce i proti

izolátům s rezistenčními geny (38). Lze tedy očekávat nárůst spotřeby těchto antibiotik, který se

projeví zvýšeným selekčním tlakem na streptograminovou rezistenci. Do budoucna bude proto

nezbytné zahrnout mezi sledované MLS rezistence také ty, které jsou specifické pro streptograminy.

Obr. 6.1 Porovnání spot řeby MLS antibiotik v letech 1989 - 2005 a

1989 1990 1991 1992

1993

1994 1995 1996 1997 1998 1999

2000 2001 2002

2003 2004

2005

0 0,5

1 1,5

2 2,5

3 3,5

DD

D/1

000/

db

a údaje z let 1989-1998 převzaty z (177), údaje z let 1999-2005 poskytnuty SÚKL b spotřeba je uváděna v počtu doporučených denních dávek na 1000 obyvatel za jeden den

DISKUZE

50

Vzhledem k možnému selhání testování citlivosti ke kombinaci quinupristin/dalfopristin diskovým

difúzním testem (125, 136) by bylo užitečné v klinické praxi testovat citlivost také k jednotlivým

komponentám.

Nově nalezený rezistenční protein Vga(A)LC se od proteinu Vga(A) udílejícího rezistenci ke

streptograminu A liší pouhými sedmi aminokyselinami. Porovnáním rezistenčního profilu obou variant

proteinů v citlivém hostiteli jsme prokázali, že protein Vga(A)LC udílí vyšší hladiny rezistence k oběma

linkosamidům. Avšak hodnoty MIC nedosahovali hodnot naměřených v původním hostiteli, což by

mohlo naznačovat potřebnost další komponenty systému. Nelze však vyloučit ani další rezistenční

determinanty. Přestože chybí přímý důkaz, spočívající v inaktivaci genu vga(A)LC a s tím spojenou

ztrátou LSA fenotypu, domníváme se, že je tento rezistenční gen plně zodpovědný za linkosamidovou

rezistenci u těchto izolátů. Tomu nasvědčuje úplná korelace LSA rezistenčního fenotypu s přítomností

genu vga(A)LC a stejné průběhy akumulace radioaktivně značeného linkomycinu v buňkách LSA

rezistentního S. haemolyticus s genem vga(A)LC a erythromycinu v buňkách s genem msr(A) (110),

který kóduje protein ze stejné rodiny ARE ABC transportérů. Navíc posun v substrátové specifitě

směrem k linkosamidům není překvapivý vzhledem k existenci několika dalších proteinů s překrývající

se specifitou k linkosamidům a streptograminu A, která pravděpodobně souvisí s překryvem

ribozomálním vazebným místem těchto antibiotik (80) a kap.3.3.3.

Porovnáváním hybridních proteinů odvozených od Vga(A)LC a Vga(A) jsme zjistili, že pouze

čtyři ze sedmi aminokyselinových zbytků, kterými se oba proteiny liší, jsou zodpovědné za změnu

substrátové specifity (124). Tyto čtyři aminokyseliny jsou nahloučené v krátkém úseku 15

aminokyselin situovaných v oblasti spojující obě ATP vazebné domény. To naznačuje, že tato část by

mohla být zodpovědná za rozpoznání a vazbu substrátu. V současné době je připravovaná nová sada

mutantních proteinů Vga(A) a Vga(A)LC s bodovými mutacemi kombinujícími výše zmíněnou čtveřici

aminokyselin, což by mělo dále upřesnit jejich konkrétní význam v určení substrátové specifity. Dvojice

téměř identických proteinů Vga(A) a Vga(A)LC s odlišnou substrátovou specifitou je ideálním modelem

pro studium mechanismu funkce ARE rodiny rezistenčních proteinů, jež se díky sekvenačním

genomovým projektům rychle rozrůstá.

51

V. REFERENCE

REFERENCE

52

1. Achard, A., C. Villers, V. Pichereau, and R. Leclercq. 2005. New lnu(C) gene conferring resistance to lincomycin by nucleotidylation in Streptococcus agalactiae UCN36. Antimicrob Agents Chemother 49:2716-9.

2. Alam, M. M., N. Kobayashi, N. Uehara, and N. Watanabe. 2003. Analysis on distribution and genomic diversity of high-level antiseptic resistance genes qacA and qacB in human clinical isolates of Staphylococcus aureus. Microb Drug Resist 9:109-21.

3. Allignet, J., S. Aubert, A. Morvan, and N. el Solh. 1996. Distribution of genes encoding resistance to streptogramin A and related compounds among staphylococci resistant to these antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 40:2523-8.

4. Allignet, J., and N. el Solh. 1995. Diversity among the gram-positive acetyltransferases inactivating streptogramin A and structurally related compounds and characterization of a new staphylococcal determinant, vatB. Antimicrob Agents Chemother 39:2027-36.

5. Allignet, J., and N. El Solh. 1997. Characterization of a new staphylococcal gene, vgaB, encoding a putative ABC transporter conferring resistance to streptogramin A and related compounds. Gene 202:133-8.

6. Allignet, J., N. Liassine, and N. el Solh. 1998. Characterization of a staphylococcal plasmid related to pUB110 and carrying two novel genes, vatC and vgbB, encoding resistance to streptogramins A and B and similar antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 42:1794-8.

7. Allignet, J., V. Loncle, P. Mazodier, and N. el Solh. 1988. Nucleotide sequence of a staphylococcal plasmid gene, vgb, encoding a hydrolase inactivating the B components of virginiamycin-like antibiotics. Plasmid 20:271-5.

8. Allignet, J., V. Loncle, C. Simenel, M. Delepierre, and N. e l Solh. 1993. Sequence of a staphylococcal gene, vat, encoding an acetyltransferase inactivating the A-type compounds of virginiamycin-like antibiotics. Gene 130:91-8.

9. Alonso, A., P. Sanchez, and J. L. Martinez. 2000. Stenotrophomonas maltophilia D457R contains a cluster of genes from gram-positive bacteria involved in antibiotic and heavy metal resistance. Antimicrob Agents Chemother 44:1778-82.

10. Ambrose, K. D., R. Nisbet, and D. S. Stephens. 2005. Macrolide efflux in Streptococcus pneumoniae is mediated by a dual efflux pump (mel and mef) and is erythromycin inducible. Antimicrob Agents Chemother 49:4203-9.

11. Argoudelis, A. D., J. H. Coats, and S. A. Mizsak. 1977. Microbial transformation of antibiotics. Clindamycin ribonucleotides. J Antibiot (Tokyo) 30:474-87.

12. Arthur, M., D. Autissier, and P. Courvalin. 1986. Analysis of the nucleotide sequence of the ereB gene encoding the erythromycin esterase type II. Nucleic Acids Res 14:4987-99.

13. Azap, O. K., H. Arslan, F. Timurkaynak, G. Yapar, E. Oruc, and U. Gagir. 2005. Incidence of inducible clindamycin resistance in staphylococci: first results from Turkey. Clin Microbiol Infect 11:582-4.

14. Ban, N., P. Nissen, J. Hansen, P. B. Moore, and T. A. Steit z. 2000. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289:905-20.

15. Barthelemy, P., D. Autissier, G. Gerbaud, and P. Courvalin. 1984. Enzymic hydrolysis of erythromycin by a strain of Escherichia coli. A new mechanism of resistance. J Antibiot (Tokyo) 37:1692-6.

16. Bartley, J. 2002. First case of VRSA identified in Michigan. Infect Control Hosp Epidemiol 23:480.

17. Bastos, M. C., and E. Murphy. 1988. Transposon Tn554 encodes three products required for transposition. Embo J 7:2935-41.

18. Berg, T., N. Firth, S. Apisiridej, A. Hettiaratchi, A. Leel aporn, and R. A. Skurray. 1998. Complete nucleotide sequence of pSK41: evolution of staphylococcal conjugative multiresistance plasmids. J Bacteriol 180:4350-9.

19. Biskri, L., and D. Mazel. 2003. Erythromycin esterase gene ere(A) is located in a functional gene cassette in an unusual class 2 integron. Antimicrob Agents Chemother 47:3326-31.

20. Bjorland, J., M. S. Bratlie, and T. Steinum. 2007. The smr gene resides on a novel plasmid pSP187 identified in a Staphylococcus pasteuri isolate recovered from unpasteurized milk. Plasmid 57:145-55.

21. Bjorland, J., T. Steinum, M. Sunde, S. Waage, and E. Heir. 2003. Novel plasmid-borne gene qacJ mediates resistance to quaternary ammonium compounds in equine Staphylococcus aureus, Staphylococcus simulans, and Staphylococcus intermedius. Antimicrob Agents Chemother 47:3046-52.

REFERENCE

53

22. Bjorland, J., T. Steinum, M. Sunde, S. Waage, S. Sviland, H. O ppegaard, and E. Heir. 2006. Deletion of pT181-like sequence in an smr-encoding mosaic plasmid harboured by a persistent bovine Staphylococcus warneri strain. J Antimicrob Chemother 57:46-51.

23. Bjorland, J., M. Sunde, and S. Waage. 2001. Plasmid-borne smr gene causes resistance to quaternary ammonium compounds in bovine Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 39:3999-4004.

24. Bozdogan, B., L. Berrezouga, M. S. Kuo, D. A. Yurek, K. A. Far ley, B. J. Stockman, and R. Leclercq. 1999. A new resistance gene, linB, conferring resistance to lincosamides by nucleotidylation in Enterococcus faecium HM1025. Antimicrob Agents Chemother 43:925-9.

25. Bozdogan, B., and R. Leclercq. 1999. Effects of genes encoding resistance to streptogramins A and B on the activity of quinupristin-dalfopristin against Enterococcus faecium. Antimicrob Agents Chemother 43:2720-5.

26. Brisson-Noel, A., and P. Courvalin. 1986. Nucleotide sequence of gene linA encoding resistance to lincosamides in Staphylococcus haemolyticus. Gene 43:247-53.

27. Brisson-Noel, A., P. Delrieu, D. Samain, and P. Courvalin. 1988. Inactivation of lincosaminide antibiotics in Staphylococcus. Identification of lincosaminide O-nucleotidyltransferases and comparison of the corresponding resistance genes. J Biol Chem 263:15880-7.

28. Buriankova, K., F. Doucet-Populaire, O. Dorson, A. Gondran, J. C. Ghnassia, J. Weiser, and J. L. Pernodet. 2004. Molecular basis of intrinsic macrolide resistance in the Mycobacterium tuberculosis complex. Antimicrob Agents Chemother 48:143-50.

29. Calcutt, M. J., and E. Cundliffe. 1990. Cloning of a lincosamide resistance determinant from Streptomyces caelestis, the producer of celesticetin, and characterization of the resistance mechanism. J Bacteriol 172:4710-4.

30. Catchpole, I., and K. G. Dyke. 1990. A Staphylococcus aureus plasmid that specifies constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance contains a novel deletion in the ermC attenuator. FEMS Microbiol Lett 57:43-7.

31. CLSI. 2007. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Seventeenth informational supplement M100-S17. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898.

32. Dassa, E., and P. Bouige. 2001. The ABC of ABCS: a phylogenetic and functional classification of ABC systems in living organisms. Res Microbiol 152:211-29.

33. Del Grosso, M., R. Camilli, F. Iannelli, G. Pozzi, and A. Pantosti. 2006. The mef(E)-carrying genetic element (mega) of Streptococcus pneumoniae: insertion sites and association with other genetic elements. Antimicrob Agents Chemother 50:3361-6.

34. Depardieu, F., I. Podglajen, R. Leclercq, E. Collatz, and P. Cour valin. 2007. Modes and modulations of antibiotic resistance gene expression. Clin Microbiol Rev 20:79-114.

35. Diekema, D. J., M. A. Pfaller, F. J. Schmitz, J. Sma yevsky, J. Bell, R. N. Jones, and M. Beach. 2001. Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada, Latin America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997-1999. Clin Infect Dis 32 Suppl 2: S114-32.

36. Dina, J., B. Malbruny, and R. Leclercq. 2003. Nonsense mutations in the lsa-like gene in Enterococcus faecalis isolates susceptible to lincosamides and Streptogramins A. Antimicrob Agents Chemother 47:2307-9.

37. Dubnau, D. 1984. Translational attenuation: the regulation of bacterial resistance to the macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. CRC Crit Rev Biochem 16:103-32.

38. Dupuis, M., and R. Leclercq. 2006. Activity of a new oral streptogramin, XRP2868, against gram-positive cocci harboring various mechanisms of resistance to streptogramins. Antimicrob Agents Chemother 50:237-42.

39. Eady, E. A., J. I. Ross, J. L. Tipper, C. E. Walters, J. H. Cove, and W. C. Noble. 1993. Distribution of genes encoding erythromycin ribosomal methylases and an erythromycin efflux pump in epidemiologically distinct groups of staphylococci. J Antimicrob Chemother 31:211-7.

40. Fiebelkorn, K. R., S. A. Crawford, M. L. McElmeel, and J. H . Jorgensen. 2003. Practical disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. J Clin Microbiol 41:4740-4.

41. Fokas, S., S. Fokas, M. Tsironi, M. Kalkani, and M. Dionysopouloy. 2005. Prevalence of inducible clindamycin resistance in macrolide-resistant Staphylococcus spp. Clin Microbiol Infect 11:337-40.

REFERENCE

54

42. Froggatt, J. W., J. L. Johnston, D. W. Galetto, and G. L. Archer. 1989. Antimicrobial resistance in nosocomial isolates of Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents Chemother 33:460-6.

43. Gabashvili, I. S., S. T. Gregory, M. Valle, R. Grassucci , M. Worbs, M. C. Wahl, A. E. Dahlberg, and J. Frank. 2001. The polypeptide tunnel system in the ribosome and its gating in erythromycin resistance mutants of L4 and L22. Mol Cell 8:181-8.

44. Garrett, L. 1995. The coming plaque: Newly emerging diseases in a world out of balance. Penguin.

45. Gatermann, S. G., T. Koschinski, and S. Friedrich. 2007. Distribution and expression of macrolide resistance genes in coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Infect 13:777-81.

46. Gaynor, M., and A. S. Mankin. 2005. Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance. Frontiers in Medicinal Chemistry 2:21-35.

47. Gregory, S. T., and A. E. Dahlberg. 1999. Erythromycin resistance mutations in ribosomal proteins L22 and L4 perturb the higher order structure of 23 S ribosomal RNA. J Mol Biol 289:827-34.

48. Gryczan, T. J., G. Grandi, J. Hahn, R. Grandi, and D. Dubnau. 1980. Conformational alteration of mRNA structure and the posttranscriptional regulation of erythromycin-induced drug resistance. Nucleic Acids Res 8:6081-97.

49. Hajek, V. 1976. Staphylococcus intermedius, a new species isolated from animals. Int. J. Syst. Bacteriol. 26:401-408.

50. Hamilton-Miller, J. M., and S. Shah. 2000. Patterns of phenotypic resistance to the macrolide-lincosamide-ketolide-streptogramin group of antibiotics in staphylococci. J Antimicrob Chemother 46:941-9.

51. Hansen, J. L., J. A. Ippolito, N. Ban, P. Nissen, P. B. Moore, and T. A. Steitz. 2002. The structures of four macrolide antibiotics bound to the large ribosomal subunit. Mol Cell 10:117-28.

52. Harms, J., F. Schluenzen, R. Zarivach, A. Bashan, S. Gat, I . Agmon, H. Bartels, F. Franceschi, and A. Yonath. 2001. High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107:679-88.

53. Harms, J. M., F. Schlunzen, P. Fucini, H. Bartels, and A. Yonat h. 2004. Alterations at the peptidyl transferase centre of the ribosome induced by the synergistic action of the streptogramins dalfopristin and quinupristin. BMC Biol 2:4.

54. Haroche, J., J. Allignet, S. Aubert, A. E. Van Den Bogaard, a nd N. El Solh. 2000. satG, conferring resistance to streptogramin A, is widely distributed in Enterococcus faecium strains but not in staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 44:190-1.

55. Haroche, J., J. Allignet, C. Buchrieser, and N. El Solh. 2000. Characterization of a variant of vga(A) conferring resistance to streptogramin A and related compounds. Antimicrob Agents Chemother 44:2271-5.

56. Haroche, J., A. Morvan, M. Davi, J. Allignet, F. Bimet, a nd N. El Solh. 2003. Clonal diversity among streptogramin A-resistant Staphylococcus aureus isolates collected in French hospitals. J Clin Microbiol 41:586-91.

57. Hauschild, T., P. Luthje, and S. Schwarz. 2006. Characterization of a novel type of MLSB resistance plasmid from Staphylococcus saprophyticus carrying a constitutively expressed erm(C) gene. Vet Microbiol 115:258-63.

58. Heir, E., B. A. Lindstedt, T. M. Leegaard, E. Gjernes, and G. Kapperud. 2004. Prevalence and characterization of integrons in blood culture Enterobacteriaceae and gastrointestinal Escherichia coli in Norway and reporting of a novel class 1 integron-located lincosamide resistance gene. Ann Clin Microbiol Antimicrob 3:12.

59. Hiramatsu, K. 2001. Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: a new model of antibiotic resistance. Lancet Infect Dis 1:147-55.

60. Hiramatsu, K. 1998. Vancomycin resistance in staphylococci. Drug Resist Updat 1:135-50. 61. Hiramatsu, K., H. Hanaki, T. Ino, K. Yabuta, T. Oguri, and F. C. Tenover. 1997. Methicillin-

resistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother 40:135-6.

62. Horinouchi, S., W. H. Byeon, and B. Weisblum. 1983. A complex attenuator regulates inducible resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramin type B antibiotics in Streptococcus sanguis. J Bacteriol 154:1252-62.

REFERENCE

55

63. Horinouchi, S., and B. Weisblum. 1982. Nucleotide sequence and functional map of pE194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin type B antibodies. J Bacteriol 150:804-14.

64. Horinouchi, S., and B. Weisblum. 1980. Posttranscriptional modification of mRNA conformation: mechanism that regulates erythromycin-induced resistance. Proc Natl Acad Sci U S A 77:7079-83.

65. Huang, J., P. W. O'Toole, W. Shen, H. Amrine-Madsen, X. Jiang, N. Lobo, L. M. Palmer, L. Voelker, F. Fan, M. N. Gwynn, and D. McDevitt. 2004. Novel chromosomally encoded multidrug efflux transporter MdeA in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 48:909-17.

66. Chabbert, Y. 1956. Antagonisme in vitro entre l'erythromycine et la spiramycine. Ann Inst Pasteur (Paris) 90:787-90.

67. Chabbert, Y. A., and P. Courvalin. 1971. [Synergism of antibiotic components of the streptogramin group]. Pathol Biol (Paris) 19:613-9.

68. Chakraburtty, K. 2001. Translational regulation by ABC systems. Res Microbiol 152:391-9. 69. Chesneau, O., H. Ligeret, N. Hosan-Aghaie, A. Morvan, and E. D assa. 2005. Molecular

analysis of resistance to streptogramin A compounds conferred by the Vga proteins of staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 49:973-80.

70. Chesneau, O., K. Tsvetkova, and P. Courvalin. 2007. Resistance phenotypes conferred by macrolide phosphotransferases. FEMS Microbiol Lett 269:317-22.

71. Ito, T., Y. Katayama, K. Asada, N. Mori, K. Tsutsumimoto, C . Tiensasitorn, and K. Hiramatsu. 2001. Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 45:1323-36.

72. Janosi, L., and E. Ban. 1982. Presented at the 12th International Congress of Chemotherapy, Florence, Italy, 1981.

73. Jenkins, G., M. Zalacain, and E. Cundliffe. 1989. Inducible ribosomal RNA methylation in Streptomyces lividans, conferring resistance to lincomycin. J Gen Microbiol 135:3281-8.

74. Jenssen, W. D., S. Thakker-Varia, D. T. Dubin, and M. P. Weins tein. 1987. Prevalence of macrolides-lincosamides-streptogramin B resistance and erm gene classes among clinical strains of staphylococci and streptococci. Antimicrob Agents Chemother 31:883-8.

75. John, M. A., C. Pletch, and Z. Hussain. 2002. In vitro activity of quinupristin/dalfopristin, linezolid, telithromycin and comparator antimicrobial agents against 13 species of coagulase-negative staphylococci. J Antimicrob Chemother 50:933-8.

76. Kawachi, R., T. Akashi, Y. Kamitani, A. Sy, U. Wangchaisoont horn, T. Nihira, and Y. Yamada. 2000. Identification of an AfsA homologue (BarX) from Streptomyces virginiae as a pleiotropic regulator controlling autoregulator biosynthesis, virginiamycin biosynthesis and virginiamycin M1 resistance. Mol Microbiol 36:302-13.

77. Kehrenberg, C., K. K. Ojo, and S. Schwarz. 2004. Nucleotide sequence and organization of the multiresistance plasmid pSCFS1 from Staphylococcus sciuri. J Antimicrob Chemother 54:936-9.

78. Kehrenberg, C., and S. Schwarz. 2006. Distribution of florfenicol resistance genes fexA and cfr among chloramphenicol-resistant Staphylococcus isolates. Antimicrob Agents Chemother 50:1156-63.

79. Kehrenberg, C., S. Schwarz, L. Jacobsen, L. H. Hansen, and B. V ester. 2005. A new mechanism for chloramphenicol, florfenicol and clindamycin resistance: methylation of 23S ribosomal RNA at A2503. Mol Microbiol 57:1064-73.

80. Kerr, I. D., E. D. Reynolds, and J. H. Cove. 2005. ABC proteins and antibiotic drug resistance: is it all about transport? Biochem Soc Trans 33:1000-2.

81. Kim, S. D., L. C. McDonald, W. R. Jarvis, S. K. McAll ister, R. Jerris, L. A. Carson, and J. M. Miller. 2000. Determining the significance of coagulase-negative staphylococci isolated from blood cultures at a community hospital: a role for species and strain identification. Infect Control Hosp Epidemiol 21:213-7.

82. Kloos, W. E., and T. L. Bannerman. 1994. Update on clinical significance of coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Rev 7:117-40.

83. Kono, M., K. O'Hara, and T. Ebisu. 1992. Purification and characterization of macrolide 2'-phosphotransferase type II from a strain of Escherichia coli highly resistant to macrolide antibiotics. FEMS Microbiol Lett 76:89-94.

84. Krolewski, J. J., E. Murphy, R. P. Novick, and M. G. Rush. 1981. Site-specificity of the chromosomal insertion of Staphylococcus aureus transposon Tn554. J Mol Biol 152:19-33.

REFERENCE

56

85. Kwak, J. H., E. C. Choi, and B. Weisblum. 1991. Transcriptional attenuation control of ermK, a macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinant from Bacillus licheniformis. J Bacteriol 173:4725-35.

86. Lai, C. J., and B. Weisblum. 1971. Altered methylation of ribosomal RNA in an erythromycin-resistant strain of Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci U S A 68:856-60.

87. Lampson, B. C., and J. T. Parisi. 1986. Nucleotide sequence of the constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance plasmid pNE131 from Staphylococcus epidermidis and homologies with Staphylococcus aureus plasmids pE194 and pSN2. J Bacteriol 167:888-92.

88. Leclercq, R., C. Carlier, J. Duval, and P. Courvalin. 1985. Plasmid-mediated resistance to lincomycin by inactivation in Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents Chemother 28:421-4.

89. Leclercq, R., and P. Courvalin. 1991. Bacterial resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin antibiotics by target modification. Antimicrob Agents Chemother 35:1267-72.

90. Leeb, M. 2004. Antibiotics: a shot in the arm. Nature 431:892-3. 91. Leelaporn, A., N. Firth, I. T. Paulsen, and R. A. Skurray. 1996. IS257-mediated

cointegration in the evolution of a family of staphylococcal trimethoprim resistance plasmids. J Bacteriol 178:6070-3.

92. Lim, J. A., A. R. Kwon, S. K. Kim, Y. Chong, K. Lee, and E. C. Choi. 2002. Prevalence of resistance to macrolide, lincosamide and streptogramin antibiotics in Gram-positive cocci isolated in a Korean hospital. J Antimicrob Chemother 49:489-95.

93. Lina, G., A. Quaglia, M. E. Reverdy, R. Leclercq, F. Vandenes ch, and J. Etienne. 1999. Distribution of genes encoding resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramins among staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 43:1062-6.

94. Livermore, D. 2004. Can better prescribing turn the tide of resistance? Nat Rev Microbiol 2:73-8.

95. Lodder, G., S. Schwarz, P. Gregory, and K. Dyke. 1996. Tandem duplication in ermC translational attenuator of the macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance plasmid pSES6 from Staphylococcus equorum. Antimicrob Agents Chemother 40:215-7.

96. Lodder, G., C. Werckenthin, S. Schwarz, and K. Dyke. 1997. Molecular analysis of naturally occuring ermC-encoding plasmids in staphylococci isolated from animals with and without previous contact with macrolide/lincosamide antibiotics. FEMS Immunol Med Microbiol 18:7-15.

97. Long, K. S., J. Poehlsgaard, C. Kehrenberg, S. Schwarz, and B. Ve ster. 2006. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 50:2500-5.

98. Luthje, P., and S. Schwarz. 2006. Antimicrobial resistance of coagulase-negative staphylococci from bovine subclinical mastitis with particular reference to macrolide-lincosamide resistance phenotypes and genotypes. J Antimicrob Chemother 57:966-9.

99. Luthje, P., M. von Kockritz-Blickwede, and S. Schwarz. 2007. Identification and characterization of nine novel types of small staphylococcal plasmids carrying the lincosamide nucleotidyltransferase gene lnu(A). J Antimicrob Chemother 59:600-6.

100. Malbruny, B., A. Canu, B. Bozdogan, B. Fantin, V. Zarrouk, S. Dut ka-Malen, C. Feger, and R. Leclercq. 2002. Resistance to quinupristin-dalfopristin due to mutation of L22 ribosomal protein in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 46:2200-7.

101. Mangili, A., I. Bica, D. R. Snydman, and D. H. Hamer. 2005. Daptomycin-resistant, methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia. Clin Infect Dis 40:1058-60.

102. Marshall, V. P., W. F. Liggett, and J. I. Cialdella. 1989. Enzymic inactivation of lincosaminide and macrolide antibiotics: divalent metal cation and coenzyme specificities. J Antibiot (Tokyo) 42:826-30.

103. Martineau, F., F. J. Picard, N. Lansac, M. i. q. m. C, P. H . Roy, M. Ouellette, and M. G. Bergeron. 2000. Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents Chemother 44:231-8.

104. Marton, M. J., C. R. Vazquez de Aldana, H. Qiu, K. Chakrab urtty, and A. G. Hinnebusch. 1997. Evidence that GCN1 and GCN20, translational regulators of GCN4, function on elongating ribosomes in activation of eIF2alpha kinase GCN2. Mol Cell Biol 17:4474-89.

105. Marty, F. M., W. W. Yeh, C. B. Wennersten, L. Venkataraman, E. Albano, E. P. Alyea, H. S. Gold, L. R. Baden, and S. K. Pillai. 2006. Emergence of a clinical daptomycin-resistant

REFERENCE

57

Staphylococcus aureus isolate during treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia and osteomyelitis. J Clin Microbiol 44:595-7.

106. Mason, D. J., and C. Lewis. 1964. Biological Activity of the Lincomycin-Related Antibiotics. Antimicrobial Agents Chemother (Bethesda) 10:7-12.

107. Matsuoka, M., K. Endou, H. Kobayashi, M. Inoue, and Y. Nakajima. 1997. A dyadic plasmid that shows MLS and PMS resistance in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 148:91-6.

108. Matsuoka, M., K. Endou, H. Kobayashi, M. Inoue, and Y. Nakajima. 1998. A plasmid that encodes three genes for resistance to macrolide antibiotics in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 167:221-7.

109. Matsuoka, M., M. Inoue, Y. Endo, and Y. Nakajima. 2003. Characteristic expression of three genes, msr(A), mph(C) and erm(Y), that confer resistance to macrolide antibiotics on Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 220:287-93.

110. Matsuoka, M., L. Janosi, K. Endou, and Y. Nakajima. 1999. Cloning and sequences of inducible and constitutive macrolide resistance genes in Staphylococcus aureus that correspond to an ABC transporter. FEMS Microbiol Lett 181:91-100.

111. Matsuoka, M., L. Janosi, K. Endou, S. Saitoh, H. Hashimoto, and Y. Nakajima. 1993. An increase of 63 kDa-protein present in the cell membranes of Staphylococcus aureus that bears a plasmid mediating inducible resistance to partial macrolide and streptogramin B antibiotics. Biol Pharm Bull 16:1288-90.

112. Mayford, M., and B. Weisblum. 1990. The ermC leader peptide: amino acid alterations leading to differential efficiency of induction by macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. J Bacteriol 172:3772-9.

113. Melter, O. 2003. Průkaz molekulární charakterizace kmenů meticilin rezistentních Staphylococcus aureus a Bartonella henselae v České republice. Univerzita Karlova, 3.LF, Praha.

114. Melter, O., M. Aires de Sousa, P. Urbaskova, V. Jakubu, H. Zemlickova, and H. de Lencastre. 2003. Update on the major clonal types of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the Czech Republic. J Clin Microbiol 41:4998-5005.

115. Melter, O., I. Santos Sanches, J. Schindler, M. Aires de S ousa, R. Mato, V. Kovarova, H. Zemlickova, and H. de Lencastre. 1999. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clonal types in the Czech Republic. J Clin Microbiol 37:2798-803.

116. Mendez, C., and J. A. Salas. 2001. The role of ABC transporters in antibiotic-producing organisms: drug secretion and resistance mechanisms. Res Microbiol 152:341-50.

117. Minakhina, S., G. Kholodii, S. Mindlin, O. Yurieva, and V. Nikif orov. 1999. Tn5053 family transposons are res site hunters sensing plasmidal res sites occupied by cognate resolvases. Mol Microbiol 33:1059-68.

118. Mukhtar, T. A., K. P. Koteva, D. W. Hughes, and G. D. Wright. 2001. Vgb from Staphylococcus aureus inactivates streptogramin B antibiotics by an elimination mechanism not hydrolysis. Biochemistry 40:8877-86.

119. Mukhtar, T. A., and G. D. Wright. 2005. Streptogramins, oxazolidinones, and other inhibitors of bacterial protein synthesis. Chem Rev 105:529-42.

120. Murphy, E. 1985. Nucleotide sequence of ermA, a macrolide-lincosamide-streptogramin B determinant in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 162:633-40.

121. NCCLS. 2004. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 14th informational supplement. M100-S14. NCCLS, Wayne, PA.

122. Noguchi, N., Y. Tamura, J. Katayama, and K. Narui. 1998. Expression of the mphB gene for macrolide 2'-phosphotransferase II from Escherichia coli in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 159:337-42.

123. Novotna, G., V. Adamkova, J. Janata, O. Melter, and J. Spiz ek. 2005. Prevalence of resistance mechanisms against macrolides and lincosamides in methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci in the Czech Republic and occurrence of an undefined mechanism of resistance to lincosamides. Antimicrob Agents Chemother 49:3586-9.

124. Novotna, G., and J. Janata. 2006. A new evolutionary variant of the streptogramin A resistance protein, Vga(A)LC, from Staphylococcus haemolyticus with shifted substrate specificity towards lincosamides. Antimicrob Agents Chemother 50:4070-6.

125. Novotna, G., J. Spizek, and J. Janata. 2007. In Vitro Activity of Telithromycin and Quinupristin/dalfopristin against Methicillin-Resistant Coagulase-Negative Staphylococci with Defined Resistance Genotypes. Folia Microbiol (Praha) Accepted .

REFERENCE

58

126. Ohki, R., K. Tateno, T. Takizawa, T. Aiso, and M. Murata. 2005. Transcriptional termination control of a novel ABC transporter gene involved in antibiotic resistance in Bacillus subtilis. J Bacteriol 187:5946-54.

127. Ojo, K. K., M. J. Striplin, C. C. Ulep, N. S. Close, J. Zittle, H. Luis, M. Bernardo, J. Leitao, and M. C. Roberts. 2006. Staphylococcus efflux msr(A) gene characterized in Streptococcus, Enterococcus, Corynebacterium, and Pseudomonas isolates. Antimicrob Agents Chemother 50:1089-91.

128. Olano, C., A. M. Rodriguez, C. Mendez, and J. A. Salas. 1995. A second ABC transporter is involved in oleandomycin resistance and its secretion by Streptomyces antibioticus. Mol Microbiol 16:333-43.

129. Oliveira, S. S., E. Murphy, M. R. Gamon, and M. C. Bastos. 1993. pRJ5: a naturally occurring Staphylococcus aureus plasmid expressing constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance contains a tandem duplication in the leader region of the ermC gene. J Gen Microbiol 139:1461-7.

130. Ounissi, H., and P. Courvalin. 1985. Nucleotide sequence of the gene ereA encoding the erythromycin esterase in Escherichia coli. Gene 35:271-8.

131. Paulsen, I. T., M. H. Brown, and R. A. Skurray. 1998. Characterization of the earliest known Staphylococcus aureus plasmid encoding a multidrug efflux system. J Bacteriol 180:3477-9.

132. Paulsen, I. T., M. T. Gillespie, T. G. Littlejohn, O. Hanvivat vong, S. J. Rowland, K. G. Dyke, and R. A. Skurray. 1994. Characterisation of sin, a potential recombinase-encoding gene from Staphylococcus aureus. Gene 141:109-14.

133. Peeters, M. J., and J. C. Sarria. 2005. Clinical characteristics of linezolid-resistant Staphylococcus aureus infections. Am J Med Sci 330:102-4.

134. Pechere, J. C. 1996. Streptogramins. A unique class of antibiotics. Drugs 51 Suppl 1: 13-9. 135. Peschke, U., H. Schmidt, H. Z. Zhang, and W. Piepersberg. 1995. Molecular

characterization of the lincomycin-production gene cluster of Streptomyces lincolnensis 78-11. Mol Microbiol 16:1137-56.

136. Petinaki, E., I. Spiliopoulou, M. Maniati, and A. N. Maniatis. 2005. Emergence of Staphylococcus hominis strains expressing low-level resistance to quinupristin/dalfopristin in Greece. J Antimicrob Chemother 55:811-2.

137. Pfaller, M. A., and L. A. Herwaldt. 1988. Laboratory, clinical, and epidemiological aspects of coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Rev 1:281-99.

138. Potoski, B. A., J. Adams, L. Clarke, K. Shutt, P. K. Linden, C. Baxter, A. W. Pasculle, B. Capitano, A. Y. Peleg, D. Szabo, and D. L. Paterson. 2006. Epidemiological profile of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci. Clin Infect Dis 43:165-71.

139. Projan, S. J. 2003. Why is big Pharma getting out of antibacterial drug discovery? Curr Opin Microbiol 6:427-30.

140. Prunier, A. L., B. Malbruny, D. Tande, B. Picard, and R. Leclerc q. 2002. Clinical isolates of Staphylococcus aureus with ribosomal mutations conferring resistance to macrolides. Antimicrob Agents Chemother 46:3054-6.

141. Putman, M., H. W. van Veen, J. E. Degener, and W. N. Konings. 2001. The lactococcal secondary multidrug transporter LmrP confers resistance to lincosamides, macrolides, streptogramins and tetracyclines. Microbiology 147:2873-80.

142. Putman, M., H. W. van Veen, and W. N. Konings. 2000. Molecular properties of bacterial multidrug transporters. Microbiol Mol Biol Rev 64:672-93.

143. Rende-Fournier, R., R. Leclercq, M. Galimand, J. Duval, and P. Courvalin. 1993. Identification of the satA gene encoding a streptogramin A acetyltransferase in Enterococcus faecium BM4145. Antimicrob Agents Chemother 37:2119-25.

144. Reynolds, E., J. I. Ross, and J. H. Cove. 2003. Msr(A) and related macrolide/streptogramin resistance determinants: incomplete transporters? Int J Antimicrob Agents 22:228-36.

145. Reynolds, E. D., and J. H. Cove. 2005. Resistance to telithromycin is conferred by msr(A), msrC and msr(D) in Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 56:1179-80.

146. Rice, L. B., L. L. Carias, S. H. Marshall, and M. E. Bonafe de. 1996. Sequences found on staphylococcal beta-lactamase plasmids integrated into the chromosome of Enterococcus faecalis CH116. Plasmid 35:81-90.

147. Roberts, M. C., J. Sutcliffe, P. Courvalin, L. B. Jensen, J. Rood, and H. Seppala. 1999. Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother 43:2823-30.

REFERENCE

59

148. Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, and S. Baumberg. 1995. Identification of a chromosomally encoded ABC-transport system with which the staphylococcal erythromycin exporter MsrA may interact. Gene 153:93-8.

149. Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, and S. Baumberg. 1996. Minimal functional system required for expression of erythromycin resistance by msrA in Staphylococcus aureus RN4220. Gene 183:143-8.

150. Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, W. J. Cunliffe, S. Baumberg, and J. C. Wootton. 1990. Inducible erythromycin resistance in staphylococci is encoded by a member of the ATP-binding transport super-gene family. Mol Microbiol 4:1207-14.

151. Ross, J. I., A. M. Farrell, E. A. Eady, J. H. Cove, and W. J. Cunliffe. 1989. Characterisation and molecular cloning of the novel macrolide-streptogramin B resistance determinant from Staphylococcus epidermidis. J Antimicrob Chemother 24:851-62.

152. Rosteck, P. R., Jr., P. A. Reynolds, and C. L. Hershberger. 1991. Homology between proteins controlling Streptomyces fradiae tylosin resistance and ATP-binding transport. Gene 102:27-32.

153. Rowland, S. J., M. R. Boocock, and W. M. Stark. 2005. Regulation of Sin recombinase by accessory proteins. Mol Microbiol 56:371-82.

154. Rowland, S. J., and K. G. Dyke. 1989. Characterization of the staphylococcal beta-lactamase transposon Tn552. Embo J 8:2761-73.

155. Rowland, S. J., W. M. Stark, and M. R. Boocock. 2002. Sin recombinase from Staphylococcus aureus: synaptic complex architecture and transposon targeting. Mol Microbiol 44:607-19.

156. Sader, H. S., J. M. Streit, T. R. Fritsche, and R. N. Jone s. 2006. Antimicrobial susceptibility of gram-positive bacteria isolated from European medical centres: results of the Daptomycin Surveillance Programme (2002-2004). Clin Microbiol Infect 12:844-52.

157. Sader, H. S., A. A. Watters, T. R. Fritsche, and R. N. Jone s. 2007. Daptomycin antimicrobial activity tested against methicillin-resistant staphylococci and vancomycin-resistant enterococci isolated in European medical centers (2005). BMC Infect Dis 7:29.

158. Sandler, P., and B. Weisblum. 1989. Erythromycin-induced ribosome stall in the ermA leader: a barricade to 5'-to-3' nucleolytic cleavage of the ermA transcript. J Bacteriol 171:6680-8.

159. Sarkis, G. J., L. L. Murley, A. E. Leschziner, M. R. Boocock , W. M. Stark, and N. D. Grindley. 2001. A model for the gamma delta resolvase synaptic complex. Mol Cell 8:623-31.

160. Shaw, J. H., and D. B. Clewell. 1985. Complete nucleotide sequence of macrolide-lincosamide-streptogramin B-resistance transposon Tn917 in Streptococcus faecalis. J Bacteriol 164:782-96.

161. Shortridge, V. D., R. K. Flamm, N. Ramer, J. Beyer, and S . K. Tanaka. 1996. Novel mechanism of macrolide resistance in Streptococcus pneumoniae. Diagn Microbiol Infect Dis 26:73-8.

162. Schlunzen, F., R. Zarivach, J. Harms, A. Bashan, A. Tocilj, R. Albrecht, A. Yonath, and F. Franceschi. 2001. Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase centre in eubacteria. Nature 413:814-21.

163. Schmitz, F. J., J. Petridou, N. Astfalk, K. Kohrer, S. Sche uring, and S. Schwarz. 2002. Molecular analysis of constitutively expressed erm(C) genes selected in vitro by incubation in the presence of the noninducers quinupristin, telithromycin, or ABT-773. Microb Drug Resist 8:171-7.

164. Schmitz, F. J., J. Petridou, N. Astfalk, S. Scheuring, K. Kohr er, J. Verhoef, A. C. Fluit, and S. Schwarz. 2001. Structural alterations in the translational attenuator of constitutively expressed erm(A) genes in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 45:1603-4.

165. Schnellmann, C., V. Gerber, A. Rossano, V. Jaquier, Y. Panchaud, M. G. Doherr, A. Thomann, R. Straub, and V. Perreten. 2006. Presence of new mecA and mph(C) variants conferring antibiotic resistance in Staphylococcus spp. isolated from the skin of horses before and after clinic admission. J Clin Microbiol 44:4444-54.

166. Schoner, B., M. Geistlich, P. Rosteck, Jr., R. N. Rao, E. Seno, P. Reynolds, K. Cox, S. Burgett, and C. Hershberger. 1992. Sequence similarity between macrolide-resistance determinants and ATP-binding transport proteins. Gene 115:93-6.

167. Schreckenberger, P. C., E. Ilendo, and K. L. Ristow. 2004. Incidence of constitutive and inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci in a community and a tertiary care hospital. J Clin Microbiol 42:2777-9.

REFERENCE

60

168. Schulin, T., and A. Voss. 2001. Coagulase-negative staphylococci as a cause of infections related to intravascular prosthetic devices: limitations of present therapy. Clin Microbiol Infect 7 Suppl 4: 1-7.

169. Schwarz, S., C. Kehrenberg, and K. K. Ojo. 2002. Staphylococcus sciuri gene erm(33), encoding inducible resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramin B antibiotics, is a product of recombination between erm(C) and erm(A). Antimicrob Agents Chemother 46:3621-3.

170. Schwarz, S., C. Werckenthin, and C. Kehrenberg. 2000. Identification of a plasmid-borne chloramphenicol-florfenicol resistance gene in Staphylococcus sciuri. Antimicrob Agents Chemother 44:2530-3.

171. Sidhu, M. S., E. Heir, T. Leegaard, K. Wiger, and A. Holck. 2002. Frequency of disinfectant resistance genes and genetic linkage with beta-lactamase transposon Tn552 among clinical staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 46:2797-803.

172. Singh, K. V., K. Malathum, and B. E. Murray. 2001. Disruption of an Enterococcus faecium species-specific gene, a homologue of acquired macrolide resistance genes of staphylococci, is associated with an increase in macrolide susceptibility. Antimicrob Agents Chemother 45:263-6.

173. Singh, K. V., G. M. Weinstock, and B. E. Murray. 2002. An Enterococcus faecalis ABC homologue (Lsa) is required for the resistance of this species to clindamycin and quinupristin-dalfopristin. Antimicrob Agents Chemother 46:1845-50.

174. Skinner, R., E. Cundliffe, and F. J. Schmidt. 1983. Site of action of a ribosomal RNA methylase responsible for resistance to erythromycin and other antibiotics. J Biol Chem 258:12702-6.

175. Srinivasan, A., J. D. Dick, and T. M. Perl. 2002. Vancomycin resistance in staphylococci. Clin Microbiol Rev 15:430-8.

176. Swaney, S. M., H. Aoki, M. C. Ganoza, and D. L. Shinabarger. 1998. The oxazolidinone linezolid inhibits initiation of protein synthesis in bacteria. Antimicrob Agents Chemother 42:3251-5.

177. Štika, L. 2001. Spotřeba antimikrobiálních léčiv a její vliv na rezistenci mikroorganismů. Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 3:66-71.

178. Tait-Kamradt, A., T. Davies, M. Cronan, M. R. Jacobs, P. C . Appelbaum, and J. Sutcliffe. 2000. Mutations in 23S rRNA and ribosomal protein L4 account for resistance in pneumococcal strains selected in vitro by macrolide passage. Antimicrob Agents Chemother 44:2118-25.

179. Takeuchi, F., S. Watanabe, T. Baba, H. Yuzawa, T. Ito, Y. Mor imoto, M. Kuroda, L. Cui, M. Takahashi, A. Ankai, S. Baba, S. Fukui, J. C. Lee, and K. Hir amatsu. 2005. Whole-genome sequencing of staphylococcus haemolyticus uncovers the extreme plasticity of its genome and the evolution of human-colonizing staphylococcal species. J Bacteriol 187:7292-308.

180. Tan, T. Y., S. Y. Ng, and W. X. Ng. 2006. Clinical significance of coagulase-negative staphylococci recovered from nonsterile sites. J Clin Microbiol 44:3413-4.

181. Tenover, F. C., R. D. Arbeit, R. V. Goering, P. A. Mickels en, B. E. Murray, D. H. Persing, and B. Swaminathan. 1995. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 33:2233-9.

182. Tenson, T., M. Lovmar, and M. Ehrenberg. 2003. The mechanism of action of macrolides, lincosamides and streptogramin B reveals the nascent peptide exit path in the ribosome. J Mol Biol 330:1005-14.

183. Tenson, T., and A. S. Mankin. 2001. Short peptides conferring resistance to macrolide antibiotics. Peptides 22:1661-8.

184. Tenson, T., L. Xiong, P. Kloss, and A. S. Mankin. 1997. Erythromycin resistance peptides selected from random peptide libraries. J Biol Chem 272:17425-30.

185. Thakker-Varia, S., W. D. Jenssen, L. Moon-McDermott, M. P. Weinstein, and D. T. Dubin. 1987. Molecular epidemiology of macrolides-lincosamides-streptogramin B resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 31:735-43.

186. Tillotson, L. E., W. D. Jenssen, L. Moon-McDermott, and D. T. Dubin. 1989. Characterization of a novel insertion of the macrolides-lincosamides-streptogramin B resistance transposon Tn554 in methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents Chemother 33:541-50.

187. Townsend, D. E., S. Bolton, N. Ashdown, D. I. Annear, and W. B. Grubb. 1986. Conjugative, staphylococcal plasmids carrying hitch-hiking transposons similar to Tn554: intra-

REFERENCE

61

and interspecies dissemination of erythromycin resistance. Aust J Exp Biol Med Sci 64 ( Pt 4):367-79.

188. Vannuffel, P., and C. Cocito. 1996. Mechanism of action of streptogramins and macrolides. Drugs 51 Suppl 1: 20-30.

189. von Eiff, C., G. Peters, and C. Heilmann. 2002. Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci. Lancet Infect Dis 2:677-85.

190. Walker, J. E., M. Saraste, M. J. Runswick, and N. J. Ga y. 1982. Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. Embo J 1:945-51.

191. Walsh, C. 2003. Where will new antibiotics come from? Nat Rev Microbiol 1:65-70. 192. Wang, J., N. B. Shoemaker, G. R. Wang, and A. A. Salyers. 2000. Characterization of a

Bacteroides mobilizable transposon, NBU2, which carries a functional lincomycin resistance gene. J Bacteriol 182:3559-71.

193. Watanabe, S., T. Ito, Y. Morimoto, F. Takeuchi, and K. Hiramatsu. 2007. Precise excision and self-integration of a composite transposon as a model for spontaneous large-scale chromosome inversion/deletion of the Staphylococcus haemolyticus clinical strain JCSC1435. J Bacteriol 189:2921-5.

194. Weigel, L. M., D. B. Clewell, S. R. Gill, N. C. Clark , L. K. McDougal, S. E. Flannagan, J. F. Kolonay, J. Shetty, G. E. Killgore, and F. C. Tenover. 2003. Genetic analysis of a high-level vancomycin-resistant isolate of Staphylococcus aureus. Science 302:1569-71.

195. Weinstein, M. P., M. L. Towns, S. M. Quartey, S. Mirrett, L. G. Reimer, G. Parmigiani, and L. B. Reller. 1997. The clinical significance of positive blood cultures in the 1990s: a prospective comprehensive evaluation of the microbiology, epidemiology, and outcome of bacteremia and fungemia in adults. Clin Infect Dis 24:584-602.

196. Weisblum, B. 1995. Erythromycin resistance by ribosome modification. Antimicrob Agents Chemother 39:577-85.

197. Weisblum, B. 1995. Insights into erythromycin action from studies of its activity as inducer of resistance. Antimicrob Agents Chemother 39:797-805.

198. Weisblum, B. 1998. Macrolide resistance. Drug Resist Updat 1:29-41. 199. Werckenthin, C., M. Cardoso, J. L. Martel, and S. Schwarz. 2001. Antimicrobial resistance

in staphylococci from animals with particular reference to bovine Staphylococcus aureus, porcine Staphylococcus hyicus, and canine Staphylococcus intermedius. Vet Res 32:341-62.

200. Werckenthin, C., S. Schwarz, and H. Westh. 1999. Structural alterations in the translational attenuator of constitutively expressed ermC genes. Antimicrob Agents Chemother 43:1681-5.

201. Westh, H., D. M. Hougaard, J. Vuust, and V. T. Rosdahl. 1995. Prevalence of erm gene classes in erythromycin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated between 1959 and 1988. Antimicrob Agents Chemother 39:369-73.

202. Wondrack, L., M. Massa, B. V. Yang, and J. Sutcliffe. 1996. Clinical strain of Staphylococcus aureus inactivates and causes efflux of macrolides. Antimicrob Agents Chemother 40:992-8.

203. Wootton, J. C., and M. H. Drummond. 1989. The Q-linker: a class of interdomain sequences found in bacterial multidomain regulatory proteins. Protein Eng 2:535-43.

204. Zarrouk, V., B. Bozdogan, R. Leclercq, L. Garry, C. Carbon, a nd B. Fantin. 2000. Influence of resistance to streptogramin A type antibiotics on the activity of quinupristin-dalfopristin in vitro and in experimental endocarditis due to Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 44:1168-73.

205. Zhang, H. Z., H. Schmidt, and W. Piepersberg. 1992. Molecular cloning and characterization of two lincomycin-resistance genes, lmrA and lmrB, from Streptomyces lincolnensis 78-11. Mol Microbiol 6:2147-57.

dizerta ČnÍ prÁcemedia1.mistecko.cz/files/media1:50f81cb892f37.pdf.upl/disermed.pdf ·...

Documents