DNA 重排的检测方法

马欣荣 高方远 康海歧

一、形态学观察二、细胞遗传学 如：染色体核型分析、染色体显带等三、分子细胞遗传学 如：荧光原位杂交四、分子生物学 如： Southern 杂交， PCR 及相关技术等

一、形态学观察

例子：• 上个世纪 40 年代科学家 B ． McClintock 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜

色变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基本改变引起的，从而导致转座子的发现。

• 肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，

遗 传结构的改变引起表型的改变。因此

从 形态学上可以鉴定肿瘤。

二、细胞遗传学

染色体核型分析、染色体显带一个物种的染色体核型及带型是稳定的1.染色体核型分析：观察中期染色体，初步

分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、易位、及附加

• 常规核型分析• 荧光核型分析• 光谱核型分析 (Spectral karyotyping, SK

Y)

光谱核型分析原理 (Spectral karyotyping, SKY)

　　 1996 年 Schroch 等首次描述了 SKY 技术。应用 5 种荧光素同时标记 24 条人染色体，制成染色体涂染探针，应用 Fourier 光谱仪，CC 成像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处理， 46 条染色体形成具有不同颜色的核型影像 ,可用以分析各种染色体异常。

优势：• 特异性和分辨率比传统的显带技术高，它 可以检测到 1.5mb 碱基的转位 • 一次杂交即可分辨人的 24条染色体

人染色体光谱核型分析

乳腺癌细胞染色体复杂的畸变

2. 染色体显带技术：• C-banding 主要染异染色质 • R-banding 与 C-banding 相反，主要染常 染色质区域• G-banding 是 Giemsa 染色结果，产生深 浅不同的条带• Q-banding 是用喹丫因（ quinacrine ）染 色得到的荧光条带，带型与 G带相似

G- 带 c. 正常染色体a.末端缺失 d. 末

端倒位b.末端单向易位 e. 着丝粒

周倒位

G －带显示人急性骨髓白血病异常染色体 9 、 10 、 11 染色体间易位，右为异常染色体

三、分子细胞遗传学

1.原位杂交（ In situ hybridisation ） 标记的核酸探针变性后与已变性的靶

核酸在退火温度下复性，在不改变被分析对象，即维持其原位的前提下对靶核酸进行分析。

2. 荧光原位杂交 Fluorescent in situ hybridisation (FISH) 核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通过显微镜观察。

3. 染色体涂染 (Chromosome painting)

又称为多重荧光原位杂交 (multiplex- fluorescence in situ hybridisation, M-FISH)• 可同时检测多个染色体，一次杂交即可检 测人的 24 条染色体• 可检测简单及复杂的染色体重排

荧光原位杂交，据标记物不同可分为：• 间接法：用生物素或地高辛标记探针， 通过与荧光染料结合的抗生物素或抗 地高辛抗体将信号放大而进行检测。• 直接法：直接用荧光素标记，如 Vysis 公司的 FISH探针。

荧光原位杂交原理示意

荧光原位杂交过程

急性骨髓白血病10 、 11号染色体间易位

10 、 11号染色体易发生断裂的基因 (MLL) 位点

小麦－簇毛麦 F1 代染色体间易位

染色体涂染显示人染色体组

荧光标记探针

• 不对环境构成污染• 灵敏度能得到保障• 可进行多色观察分析，可同时使用多个 探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。

4. 比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridization (CGH)

原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析

是由 Kallioniemi 等在 1992 年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组 DNA增加或减少的强有力的工具

比较基因组杂交原理示意

• 肿瘤 DNA 和对照DNA 在染色体上的相对结合量取决于两种 DNA 标本中相应杂交序列的多少

• 因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中 DNA 的增加或丟失

等比混合

比较基因组杂交过程

DAPI4’,6- 二联脒 -2-吲哚苯

FITC异硫氰酸酯

TRITC硫氰酸四甲基罗丹明

人染色体不同荧光素染色结果

数字化图

像

FITC/TRITC 荧光强度比率分析图Ratio image FITC/TRITC

应用：• 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化• 物种间染色体同源性比较优势：• 可快捷检测中期、间期基因组• 不需预先知道 DNA 发生改变的部位• 一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减

1. Southern-blotting•   应用于基因重排检测是 1981 年 Korsmeyer等 首先进行的。• 淋巴瘤 DNA 重排 : 将细胞 DNA抽提出来 ,用限制 性内切酶进行酶切，胚系 DNA就会产生特征 性片段。但发生过基因重排的细胞 DNA 的酶 切位点有所改变，会产生有别于胚系的 DNA 酶切片段。转膜后，与标记的 DNA 探针杂交， 如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存 在 (>1~5%），克隆性的基因重排条带就 可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴 细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥 散带。

四、分子生物学技术

Figure 5._Southern blot analysis of the T-cell receptor -chain gene. Three specimens are shown, each digested with EcoRI, BamHI, and HindIII restriction enzymes, run in agarose gels, transferred to a nylon membrane, and hybridized with a radioactively labeled J probe. Two specimens, one (negative control) in lanes 2, 5, and 8, and the second in lanes 3, 6, and 9, reveal only germline bands and are polyclonal. The third specimen, in lanes 4, 7, and 10, has evidence of gene rearrangement in all 3 lanes and is monoclonal. Lane 1 shows the markers. Lane 11 is a 5% sensitivity control

• 优势： Southern 分析已被应用于 IgH、 Igk、 Igl及各种 TCR(T- 细胞受体 )克隆性重排的检测， 并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因 重排检测的“金标准”。• 局限：需要较大量（ 10mg ）新鲜或冰冻组织， 操作复杂，若用放射性同位素标记，时间过长（约两周），易污染等缺点，仅适用于科研而不 适用于临床诊断。• 改进：荧光素标记 IgH、 Igk、 Igl及各种 TCR 探 针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素 取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间 (5~10 分钟 ) ，并且敏感性不降低，非常有利于在临床 诊断中推广、应用。

DNA 发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异，由此可以检测 DNA 重排• 淋巴瘤诊断： 淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果，其特殊的基因重排形式占一定的数量优势，从而成为细胞克隆性的检测指标。选取 IgH与 TCR （ T细胞受体）的 V、 D、 J、 C区基因编码中 20 个左右的保守核苷酸序列，人工合成一对或多对（家族基因）引物，以待测样品 DNA 为模板，扩增目的 DNA序列片段。如果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。而良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状，

2. 常规 PCR 技术

不形成单带。

转基因材料外源基因的检测

1, 标准分子量； 2 ，质粒； 3，对照； 4-8，转基因植株

1 2 3 4 5 6 7 8

转基因黑麦草 PCR 检测外源 Ubi启动子

(1) PCR-RFLP: 多聚酶链反应 (PCR)--限制性片段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism ， RFLP)• 原理： PCR 产物－限制性内切酶切－多态性分 析， DNA 发生重排后，酶切位点发生改变。• 优点：具有分辩率高，无需标记 ,重复性好， 简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析 与比较 , 微生物的分群分型分亚型，癌基因 分析，遗传病的诊断等。• 局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变 的情况下，一次只能完成一个特定位点突变 筛选，检测效率低。

3. PCR 相关技术 

PCR-RFLP 原理示意

原理：是将经扩增的 DNA 片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。刚建立时是将同位素掺入 PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示 DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。 1993年起用 EB染色法显示 DNA 带型，使得 SSCP操作更简单，更经济，更迅速。

（ 2） PCR-SSCP ：聚合酶链反应一单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism)

聚合酶链反应一单链构象多态性（ PCR-SSCP ）示意

优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。

（ 3） PCR-southern blot 及 Dot blot 技术：

PCR-southern blot原理：是将 PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼 龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，来检测有无特定的扩增片段及相对含量。优点：可以直接检测基因的点突变，缺失及重排，比 PCR 产物 EB染色电泳分离法的灵敏度至少要高 103以上，由于非放射性同位素标记的探针的应用，使得 PCR-southern blot 应用更简便，现己广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病 原体特异基因等方面的研究及检测。

PCR-Dot blot 即是将 PCR扩增产物变性后直接点在膜上，与标记的特异性探针进行杂交。• 优点：时间短，可半定量分析，一张膜上可 同时检测多个样品。• 局限：只能看到一个斑点，必须小心控制反 应条件，设立阳性及阴性对照，以便对检测 标本做出正确鉴定 .

• 原理：在扩增反应中加入不等量的两段寡核 苷酸引物，引物量相差 100倍，通过 PCR扩增 获得单链 DNA ，然后利用双脱氧法直接测序。• 应用：扩增产物的测序，可以很容易确定群 体中某一特定基因的序列变异情况，这种方 法是了解目的基因突变的较理想的方法。

（ 4）不对称 PCR （ asymmetric － PCR ） 直接测序法

• 原理：即聚合酶原位扩增技术。将 PCR 技术 与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织 的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原 位研究基因变化的技术。

(5) 原位 PCR 技术

固定组织 蛋白酶 K 消化 PCR 扩增

显微镜观察

dNTP-- 荧光素

或 dNTP- 地高辛 - 生物素

或荧光染料－抗地高辛抗体 －抗生物素抗体

• 优点：提高了杂交的灵敏度，又能直接显微 观察病变部位，且标本不需特殊处理或制备， 比较省时和经济，尤其对形态学研究具有其 它方法难以比拟的独到长处。

• 应用：原位 PCR自创立以来，已经在神经性 疾病、肿瘤、微生物病原体等多种检测中得 到广泛应用。

（ 6 ） RT-PCR( reverse transcriptase-PCR)

• 原理： mRNA 反转录后进行 PCR扩增。实际上 是检测基因表达产物的方法。• 优点：灵敏度高，可在 106个正常细胞中检 测出 1 个白血病细胞。

4. 基因芯片技术检测基因突变基因芯片（ gene chips)DNA芯片 (DNA chips)DNA 微阵列（ DNA microarray)

• 将数以万计的 DNA 探针按照一定的顺序排列固化 于支持物表面上，产生二维 DNA 高密度的分子探 针阵列，然后与标记的样品进行杂交，再利用计 算机控制的信号产生、识别及图象处理系统进行 结果分析来实现对生物样品快速、并行、高效地 检测。• 基因芯片技术是分子生物学、信息科学、材料 科学、微加工技术、光学检测技术、计算机技术 等多学科相互结合的产物。

DNA 方阵的构建 芯片制作

硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物 带标记样品

DNA 或 mRNA 的准备

分子杂交 

杂交图谱的检测和分析  计算机控制的信号产生、识别及图象处理系统

二维 DNA 高密度的分子探针阵列

生物样品快速、并行、高效地检测

通常是荧光标记

PCR扩增

基因芯片突变检测原理示意

DNA 芯片

应用：突变检测，基因测序， DNA 重排，多态分析，基因表达，克隆选择，文库筛选，病源诊断，药物筛选等

其他：1.与 PCR 相关的技术：多重 PCR (multi-PCR) 、巢式 PCR （ nested-PCR) ，长 PCR(long-PCR),定量 PCR (quantification PCR) ，等位基因特异性 PCR(allele specific PCR, ASPCR) ， 酶联免疫 PCR(ELISA-PCR) 等

2. 限制酶切片段长度多态性组织配型技术 3. 连接酶链反应技术 (ligase chain reaction LCR)4. 变性梯度凝胶电泳 (denaturing gradient gel electrophoresis)5. 抑制消减杂交 (SSH) 等