dna dizileme (sekanslama) · dna dizileme metotları 5 -metodun prensibi - enzimatik bir metod -...
TRANSCRIPT
T.C GIDA TARIM VE HAYVANCILIK BAKANLIĞI PENDİK VETERİNER KONTROL ENSTİTÜSÜ
DNA Dizileme
(Sekanslama)
Dr. Eray ATIL
Vet. Hekim, Mikrobiyolog
Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü
Eğitim süresi
◦ 3 ay
Başlangıç Tarihi
◦ 08 Aralık 2013
Bitiş Tarihi
◦ 7 Mart 2014
Ülke
◦ İngiltere
Yer
◦ Leicester University
Bölüm
◦ Infection, Immunity and
Inflammation
Danışman
◦ Dr. Ahmet Yeşilkaya
Eğitim Bilgileri
2
Moleküler Genetik
Laboratuvarı
Kuruluş yılı : 2011
ABI Sistem
◦ ABI 3130 XL Genetik
Analizör
DNA Sekanslama
PENDİK VETERİNER KONTROL ENSTİTÜSÜ
3
Restriksiyon Enzimleri
PCR-RFLP
◦ (Restriction Fragment Lenght
Polymorphism)
RAPD
◦ (Randomly Amplified Polymorphic DNAs)
AFLP
◦ (Amplified Fragment Lenght
Polymorphism)
VNTR
◦ (Variable Number Tandem Repeats)
DNA Dizileme
SNP
◦ (Single Nucletide Polymorphism)
DNA Çeşitliliğinin Analiz Edilmesinde Kullanılan Metotlar
4
…ACGTGACTGAGGACCGTG
CGACTGAGACTGACTGGGT
CTAGCTAGACTACGTTTTA
TATATATATACGTCGTCGT
ACTGATGACTAGATTACAG
ACTGATTTAGATACCTGAC
TGATTTTAAAAAAATATT…
Sanger Metodu
Maxam&Gilbert metodu
True single molecule sequencing, Strand
sequencing ve diğer metotlar
DNA Dizileme Metotları
5
- Metodun Prensibi
- Enzimatik bir metod
- ddNTP lerin rastgele
DNA zincirine
bağlanmasına dayalıdır.
- DNA polimeraz ve primer
gerektirir.
- Jel elktroforez ya da
kapillar elektroforez
gerektirir
1980 Nobel Ödülü
1)DNA tek zincir olarak hazırlanır
2)Karışım 4 normal deoksinükleotid içerir
(dGTP, dATP, dTTP, dCTP)
3)Aynı karışım 4 dideoksinükleotid herbiri
farklı floresan ile etiketlenmiş)
(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP)
4) DNA polimeraz
5)Buffer
Standart Dizileme Prosedürü (Sanger)
6
DNA Dizileme Tipleri
7
Tek yönlü okuma
Çift yönlü okuma
Ters tek yönlü zincir okuma
Yeni Nesil DNA Dizileme Sistemleri
8
Genom haritalarının çıkarılması
Bireysel genotipin tanımlanması
DNA Polimorfizminin tespit edilmesi
Genetik çeşitlilik çalışmaları
Filogenetik çalışmalar
Ebeveyn ve akrabaların tespiti
Kantitatif özellikteki gen lokuslarının
saptanması
Hastalık ve genetik bozuklukların teşhisi
Adli tıp çalışmaları
Moleküler arkeoloji
DNA Dizileme Kullanım Alanları
9
• Viruslar
• 3222 (Bacteriophage phi X 174, 5386
nt – 1977)
• Bakteriler
• 2289 (Haemophilus influenza, 1.8 x 106
nt – 1995)
• Ökaryotlar
• 68 (S. cerevisiae 1.2 x 107 nt – 1995; H.
sapiens, 3 x 109 nt -2001)
• Archaea
• 152 (Methanococcus jannaschi , 1.7 x
106 nt – 1996)
DNA Dizileme (Şimdiye kadar yapıalanlar)
10
11
Moleküler Biyolojinin Temel Prensibi
RNA Protein DNA
Elimizde genomik DNA varsa, dizinin ait olduğu tür hakkında bütün
bilgiye sahip olmalı mıyız ?
James Watson’a göre
Evrimsel geçmiş
Mutasyonlar
Moleküler saat
Kullanıldığı alanlar
◦ Genler arası etkileşim çalışmaları
◦ İlaçların dizaynı
◦ Aşı çalışmalarında suş değişilikliğinde
◦ Genetik ve bulaşıcı hastalıkların epidemiyolojisi
◦ Yeni genlerin tespiti
Filogenetik: Evrimsel geçmiş
12
Root
◦ Bütün soy için ortak ata
Branch
◦ Soy ve atasal ilişkiyi gösterir.
Branch lenght
◦ Mevcut dalda meydana gelen
değişiklikleri gösterir.
Node
◦ Mevcut ya da kaybolmuş türü işaret
eden birimdir.
Clade
◦ Ortak ataları olan her iki soydan birisi.
Distance scale
◦ Organizma ya da diziler arası farkları
temsil eden birimdir.
Topology
◦ Ağacın dallanma biçimi
Filogenetik İlişki Ağaçları
13
AM911076 /Slovakia/06
EU443551/Czech Republic/06
A/chicken/Turkey/Enez ist929/2006
A/chicken/Turkey/Taflan ist15/2006
A/chicken/Turkey/Esetce ist986/2006
A/chicken/Turkey/Ipsala/563/2008
AM911090-Slovenia-06
AM911100/Slovenia/06
DQ407519/Turkey/05
EF619980/Turkey/05
A/chicken/Turkey/Sirapinar ist706/2006
EF446771/Hungary/07
EF446779/Hungary/07
DQ323672/Russia/05
DQ449632/Russia/05
EF619990/Turkey/06
A/chicken/Turkey/Misinli ist582/2006
A/chicken/Turkey/Hilvan ist271/2005
DQ434889/Russia/05
DQ449640/Russia/05
A/chicken/Turkey/Goncaaydin ist982/2006
A/chicken/Turkey/B.Cekmece ist980/2006
A/chicken/Turkey/Silivri ist962/2006
DQ358746/Russia/05
AM492165/Germany/06
DQ095617/Qinghai/05
A/bird/Turkey/Unye ist06/2006
A/seagull/Turkey/Cayeli ist04/2006
EF362418/India/06
EF362426/India/06
DQ864715/Russia/06
A/chicken/Turkey/Baklali ist955/2006
DQ864720/Russia/06
99
64
47
56
92
92
76
82
62
38
50
96
65
95
96
43
83
78
79
44
50
50
62
49
52
59
94
51
58
36
0.001
Filogenetik Network Analizi
14
Filogenetik ağaçlar
evrimsel model için
uygun olmadığında,
Kompleks evrimsel
biçimlerin görsel hale
getirilmesinde
Verilerin derinlemesine
incelenmesinde
kullanılır.
A phylogenetic network. The network was generated by Neighbor-Net for a
sequence-based data set comprising of Salmonella isolates.
Bryant et al. Algorithms for Molecular Biology 2007 2:8 doi:10.1186/1748-7188-2-8
Filogenetik Analiz Yaparken Kabul Edilen Varsayımlar
15
Nükleotid dizisi hata içermemektedir.
Analizde kullanılan diziler homologdur.
Ortak evrimsel ilişkiye sahiptir.
Nükleotid dizileri arasındaki farklılıklar daha
büyük bir grubun temsilcisidir.
Her bir nükleotid için 4 olasılık vardır, Bir
nükleotidin diğer 3 nükleotide değişme olasılığı
eşittir(Jukes Cantor)
Bioedit
◦ Dizilerin hizalanması, BLAST araştırması, plasmid çizimi, RE site haritalandırması,
ABI ve Beckman chromatogram dosyalarının görselleştirilmesi için kullanılır.
◦ http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html
ChromasPro
◦ ABI ve Beckman kromatogram dosyalarının görselleştirilmesi, çoklu
kromatogram dosyalarının açılması hizalanması, enzim kesimi haritalandırılması,
ABI Genescan dosyalarının gösterilmesi için kullanılabilir.
◦ http://technelysium.com.au/?page_id=27
ClustalW2
◦ Çoklu dizilerin hizalanması için kullanılır.
◦ http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/
Dizi Analizi Gerekli Araçlar
16
◦ DnaSP
Populasyon içi ve dışı dizi farklılaşması ve diğer populasyon
istatistiklerinin hesaplanmasında kullanılır.
http://www.ub.edu/dnasp/
◦ MEGA
Otomatik veya manuel dizi hizalaması, filogenetik ağaçlardan sonuç çıkarılması, web
tabanlı veritabanlarında araştırma yapmak, moleküler evrim ve evrimsel hipotezleri test
etmek için kullanılır.
http://www.megasoftware.net/
◦ NETWORK
DNA dizisi, STR, RFLP ve aminoasit verileri ile filogenetik ilişki örgüsü (median-joining
network) yapabilmek için kullanılır
http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm
◦ SplitsTree4
Dizi verilerinden evrimsel ilişki örgüsü yapar. (Alignment, distance ve ağaç setleri giriş
değeri olarak kullanılarak, split decomposition, neighbor-net, consensus network …
metotları ile çalışılabilir.
http://www.splitstree.org/
Moleküler evrim ve filogenetik
analiz için gerekli araçlar
17
BLAST
◦ Dizileri arasındaki benzer bölgeleri tespit etmek,
benzerlikleri istatistiksel olarak hesaplamak, elde
edilen DNA veya protein dizilerini başka kaynaklarla
araştırmak için kullanılır.
◦ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
TreeView
◦ Yeniden Yapılandırılan filogenetik ağaçları
görselleştirmek için kullanılır.
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html
Yardımcı Programlar
18
Teşekkür Ederim
19
İletişim:
Batı Mahallesi Erol Kaya Cad. No:1 34890, Pendik/İSTANBUL
Telefon: 0 216 390 12 80, Fax: 0 216 354 76 92
E-posta : [email protected]