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Área – Sociedade, Ciência e Tecnologia
Núcleo Gerador 7
Domínio de Referência 2 – Processos e Métodos Científicos
Professor: Graça Mendonça
Trabalho Realizado: Ana Fonseca nº3
Marta Dinis nº13
DNA Fingerprint
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Índice Introdução................................................................................................................................. 3
DNA Fingerprint – O que é ? .................................................................................................... 4
DNA Fingerprint – O que é ? (Continuação) ............................................................................. 5
Técnicas de obtenção do DNA .................................................................................................. 6
Aplicações do DNA Fingerprint .............................................................................................. 11
Conclusão ............................................................................................................................... 13
Webgrafia ............................................................................................................................... 14
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Introdução Para o domínio de referência 2, decidimos dar de certa forma continuidade ao nosso
trabalho para o DR1 “ A célula e o ADN”. Vamos falar do DNA Fingerprint ou
impressões digitais e os seus usos e benefícios para a nossa sociedade. Achamos que
isto é importante e influência a nossa sociedade pois é possível identificar as pessoas
através do seu a DNA, para testes de maternidade, identificar criminosos, até identificar
ossos encontrados em escavações e saber qual era a espécie.
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DNA Fingerprint – O que é ?
Para entender o que é DNA fingerprint é necessário entender o que é herança genética.
Herança genética é processo pelo qual um organismo adquire características
semelhantes à do organismo que o gerou, através de informações codificadas (código
genético) que são transmitidas à descendência. Todos os organismos vivos são
compostos de células, que possuem material genético. Esse material encontra-se reunido
em estruturas celulares chamadas cromossomas. Em organismos unicelulares como as
bactérias, a célula-filha herda o seu genoma da célula-mãe. Em organismos diplóides,
como os seres humanos, os cromossomos ocorrem aos pares. Cada par destes
cromossomas é constituído tanto de informação genética de origem materna quanto de
origem paterna, normalmente em partes iguais.
No processo de fecundação, quando o espermatozóide paterno se une ao óvulo materno,
metade das informações genéticas de cada progenitor unem-se para formar o genoma da
célula embrionária resultante. Assim, esta contém informações genéticas maternas e
paternas. A formação do embrião dá-se por subdivisões celulares sucessivas a partir
dessa primeira célula. Na divisão celular, as informações genéticas são replicadas.
Assim, cada nova célula do indivíduo possui a mesma informação genética presente na
primeira célula zigótica.
O DNA Fingerprint é um método de identificação que compara fragmentos de ácido
desoxirribonucleico (DNA). O DNA é o material genético que se encontra no núcleo
(ou não se o organismo for procarionte) das células de todos os seres vivos. Com
exceção de gémeos idênticos, o DNA completo de cada indivíduo é único.
A estrutura química do DNA de todos é o mesmo. A única diferença entre as pessoas
(ou qualquer animal) é a ordem dos pares de bases. Há tantos milhões de pares de bases
no DNA de cada pessoa que cada pessoa tem uma sequência diferente.
Usando estas sequências, cada pessoa pode ser identificada unicamente pela sua
sequência de pares de base. No entanto, porque há tantos milhões de pares de bases, a
tarefa seria muito demorada. Em vez disso, os cientistas são capazes de usar um método
mais rápido, por causa da repetição de padrões de DNA.
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DNA Fingerprint – O que é ? (Continuação)
Esses padrões DNA são capazes de determinar se duas amostras de DNA são da mesma
pessoa, pessoas relacionadas, ou não-relacionados com as pessoas.
No DNA Fingerprint as sequências de DNA são reconhecidas e cortadas por
determinadas enzimas de restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas
dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para pessoa e refletem as
diferenças entre os alelos dos vários loci.
Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos
a electroforese (técnica em que determinadas moléculas são sujeitas à ação de um
campo elétrico num meio poroso) e o resultado é um padrão de bandas que difere de
indivíduo para indivíduo.
Fig. 1 – Padrão de bandas de DNA.
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Técnicas de obtenção do DNA Existem várias técnicas de obtenção das impressões digitais genéticas, entre as quais a
de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism/Polimorfismo de comprimento
de fragmentos de restrição) , a mais utilizada, e ainda a de PCR (Polymerase Chain
Reaction/ Reação de polimerização em cadeia), que graças à alta sensibilidade e
especificidade é possível analisar um fio de cabelo com bulbo ou caspas eliminadas do
couro cabeludo. A técnica de Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição
baseia-se no princípio que a sequência nucleotidica da molécula de DNA é exclusiva de
cada indivíduo, excepto no caso dos gémeos verdadeiros, esta técnica permite
estabelecer relações de parentesco entre diferentes indivíduos. A RFLP foi desenvolvida
por Alec Jeffreys na Inglaterra, no inicio dos anos 80, apesar de apresentar as suas
desvantagens, os marcadores requerem grandes quantidades de DNA relativamente
puro, sondas específicas de DNA e marcação por radioatividade no sistema de detecção,
actualmente a RFLP tem sido vista como um meio para chegar às identidades de
criminosos, apurar a paternidade de crianças e muitas outras situações.
O Processo da técnica de RFLP
Materiais que podem ser colectados:
Origem Animal Origem Vegetal
Sangue Folhas
Secreções (como esperma) Caule
Saliva Raiz
Urina Semente
Tecidos moles Pólen
Pêlos com folículos Pétalas e outros
Caspa
Dentes
Ossos e outros
O material mais utilizado é o sangue. O DNA é retirado dos glóbulos brancos, umas vez
que os glóbulos vermelhos humanos não possuem núcleo.
1ºPasso – Extracção e purificação do DNA
Torna-se difícil obter o DNA de uma amostra caso esta seja escassa, esteja degradada
ou ainda contaminada. O DNA é purificado através da utilização de métodos químicos
(ex:fenol, chelex, etc.)
Fig. 2- Obtenção de saliva.
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2ºPasso (facultativo) - Processo de PCR
No caso de a amostra de DNA ser inferior ao necessário para realizar a sua análise, a
reação de polimerização em cadeia permite obter cópias de uma parte do material
genético em quantidade suficiente.
3ºPasso – DNA é submetido a enzimas de restrição específicas
Esta passo baseia-se na existência de padrões repetitivos no DNA denominados de
DNA minissatélites ou ainda de VNTR’s (Variable Number of Tandem Repeats/
Número variável de repetições em cadeia). Os VNTRs exibem uma enorme
variabilidade e são constituídos de até centenas de pares de bases repetidos
sequencialmente. Por locus, cada sonda hibridiza com dois segmentos de DNA,
correspondentes aos alelos materno e paterno de cada indivíduo. Os cientistas
seleccionam determinadas enzimas de restrição, que dividem o DNA nestes segmentos
de restrição cujas dimensões, composição em nucleótidos e localização variam muito de
pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.
Fig. 3 – Segmentos de DNA
4ºPasso – Electroforese
Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos
a electroforese. Esta técnica, também denominada separação electroforética, baseia-se
na migração de moléculas carregadas por aplicação de um campo eléctrico. Este
processo é frequentemente usado para separar e algumas vezes purificar
macromoléculas, especialmente proteínas e ácidos nucleicos, com base no seu tamanho,
peso molecular, carga eléctrica ou conformação.
A electroforese de DNA é realizada em gel de agarose. Prepara-se o gel de agarose que
é imerso numa tina de electroforese com uma solução-tampão que estabelece a
condução eléctrica com a fonte de alimentação. Uma vez aplicadas as amostras de DNA
e o padrão de pesos moleculares nos poços, inicia-se a electroforese. A aplicação do
campo eléctrico é efectuada através de 2 eléctrodos situados paralelamente à fileira de
poços.
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Quando sujeitos a este campo eléctrico, os ácidos nucleicos migram em direcção ao
pólo positivo, uma vez que apresentam carga negativa. A agarose funciona como uma
rede cujos poros deixam passar mais facilmente as moléculas de menor tamanho, que
vão, portanto, migrar mais do que as de maiores dimensões. A migração de um
fragmento de DNA na forma circular, como um plasmídeo não digerido, é diferente da
migração do mesmo plasmídeo sob a forma linear (após digestão com uma enzima de
restrição).
Por outro lado, moléculas com uma configuração mais compacta migram mais
rapidamente do que moléculas com uma conformação molecular mais distendida. A
electroforese em gel é frequentemente utilizada para estimar o tamanho de fragmentos
de ácidos nucleicos. Através da comparação da distância percorrida pelos fragmentos
com a percorrida por fragmentos de peso molecular conhecido (padrões de peso
molecular) é possível inferir sobre o peso molecular de cada fragmento da amostra a
analisar.
Fig. 4- Eletroforese em gel.
5º Passo – método de Southern blot
Desnaturação
Terminada a separação electroforética, o gel deve ser tratado com uma solução alcalina
(geralmente contendo hidróxido de sódio) para promover a desnaturação da dupla hélice
de DNA, separando-a em simples hélices.
Fig. 5 – Desnaturação.
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Transferência do DNA para uma membrana
Uma membrana de nitrocelulose ou nylon é posta sobre o gel. Uma pressão é aplicada
uniformemente sobre o gel, ou recorrendo-se à sucção, ou pondo-se sobre a membrana
uma pilha de toalhas de papel com um peso em cima.
Fig. 6 - Transferência do
DNA para uma membrana.
Isto leva a que o DNA passe do gel para a membrana, onde ele adere.
A membrana é então aquecida, no caso de ser nitrocelulose, ou é exposta a radiação
ultravioleta, no caso de a membrana ser de nylon, de modo a ligar o DNA
permanentemente à membrana.
Fig. 7 - Transferência do DNA para uma membrana.
Tratamento com a sonda
A membrana é agora tratada com uma sonda hibridizadora - que é uma molécula de
DNA isolada cuja sequência é conhecida e é idêntica, ou então complementar, aquela
sequência a qual se quer determinar a presença ou não na amostra (como as duas fitas da
dupla hélice do DNA são complementares uma a outra, tanto faz escolher uma sonda
que seja idêntica ou complementar à sequência procurada).A sonda de DNA é marcada
de tal forma que permite ser detectada a sua presença.
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Essa marcação é normalmente feita incorporando-se a ela átomos radioativos ou
ligando-se a ela corantes fluorescentes ou cromogéneos (substâncias incolores que
produzem cor ao interagirem com um determinado meio).Essa sonda irá fazer
emparelhar com qualquer sequência de DNA complementar a ela.
Portanto se a sequência procurada não estiver presente na amostra não haverá o
emparelhamento. Então o excesso de sonda é lavado da membrana, e toda a sonda não
hibridizada será removida.
Depois disso, a presença ou não da sonda na membrana (e as posições onde ela está
presente) é revelada por uma auto-radiografia em um filme de raio-x, ou pelo
aparecimento de uma cor caso a marcação cromogénea tenha sido usada.
Fig. 8- Tratamento com sonda hibridizadora.
Fig. 9 - Tratamento com sonda hibridizadora.
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Aplicações do DNA Fingerprint
Análise forense
A dactiloscopia genética é uma técnica utilizada na ciência forense onde se analisam as
diferenças entre os DNA minissatélites, já referidos, provenientes de material biológico
deixado num local (sangue, cabelo, esperma, etc.). A hipótese de dois indivíduos sem
qualquer relação de parentesco possuírem exactamente os mesmos minissatélites é
muito remota, sendo assim a dactiloscopia do DNA constitui um teste viável. Os
padrões de bandas de DNA obtidos por indivíduos diferentes podem ser comparados e
as diferenças são facilmente detectadas e as pessoas distinguidas. Isto permite a
identificação de cadáveres e a identificação de criminosos, incluindo violadores.
Contudo, na análise dos suspeitos de um crime, por exemplo, é de ter em conta se estes
têm irmãos gémeos verdadeiros, uma vez que, através das impressões digitais genéticas,
não se podem distinguir dois gémeos monozigóticos, pois os padrões de banda são os
mesmos visto possuírem igual material genético.
Fig. 10 – Exemplo do uso do DNA Fingerprint na análise forense.
Determinação de paternidade
Como cada indivíduo herda a disposição dos seus nucleótidos dos seus pais,
comparando os padrões de banda de um indivíduo com os dos alegados progenitores,
podem-se obter probabilidades de parentesco que nos levem a excluir a paternidade ou a
confirmá-la com um elevado grau de certeza. Se os dois padrões forem suficientemente
semelhantes (tendo em conta que só metade do DNA é herdado de cada progenitor),
então a paternidade confirma-se.
Fig. 11 - A ilustração apresenta o resultado de um teste de paternidade obtido pelo método de DNA Fingerprint.
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Diagnóstico de doenças
Esta tecnologia pode ser usada para prever a nossa saúde futura. Pode ser utilizada para
localizar os genes de doenças hereditárias. Se um padrão particular de DNA aparece
repetidamente em diferentes doentes, os cientistas podem verificar qual o gene ou
genes, ou pelo menos qual porção de DNA ou quais porções de DNA, poderão estar
envolvidos. Como o conhecimento dos genes envolvidos na susceptibilidade a uma
doença dá pistas sobre fisiologia subjacente à doença, o auxilia no desenvolvimento de
terapias. Também pode ser usado no período pré-natal para detectar possíveis anomalias
hereditárias, como a distrofia muscular ou a doença de Huntington, de forma a que
possa ser disponibilizado aconselhamento médico e possam ser adoptadas as devidas
precauções.
Diagnóstico molecular
É possível fazer o rastreamento de mutações não caracterizadas e ainda a análise da
eficiência de transplante de medula, para se verificar o quimerismo. Também permite
fazer o ensaio de mutações conhecidas como o caso de acondroplasia, a forma mais
comum de displasia, responsável pelo fenótipo que caracteriza o anão acondroplásico.
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Conclusão Com a realização deste trabalho ficamos a perceber como funcionam as técnicas de
obtenção de DNA e como são importantes para a nossa sociedade. É interessante
perceber como uma coisa tão simples como o DNA (que na verdade não é assim tão
simples) pode identificar cada um de nós.
Isto pode vir a ser uma área de interesse de estudo no futuro para ambas.
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Webgrafia
http://www.ufv.br/dbg/trab2002/GMOL/GMOL006.htm
http://www.portalmedico.org.br/revista/bio2v5/odnacomounica.htm
http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel
http://www.icb.ufmg.br/big/genmed/southblot.html
http://www.biologia-ap.no.comunidades.net/index.php?pagina=1288163696