DNA Polimorfisma di Lokus D1S80 dalam Sampel Populasi Melayu Modern Sarawak

HAIRUL AZMAN ROSLAN, NUR HAFIZAH AZIZAN & ROSMAWATI SAAT

ABSTRAK : Penanda genetik molekul, lokus minisatelit D1S80 (1p35-p36), adalah lokus VNTR yang tinggi keperbagaian rupa bentuknya. Sifat keperbagaian bentuk ini membolehkan kajian filogenetik, analisis forensik, peta genetik dan kajian penentuan ibu bapa dijalankan. Satu kajian dalam lokus D1S80 telah dijalankan untuk menentukan frekuensi dan penyebaran lokus ini pada populasi Melayu moden di Sarawak. Kajian telah menggunakan teknik amplifikasi rantai polimeras (PCR) dan elektroporesis gel menggunakan media poliakrilamid. Sejumlah 76 sampel DNA dari individu Melayu dalam populasi UNIMAS yang tiada hubungan saudara telah di ambil dan dikaji. Keputusan menunjukkan 17 alel diperoleh dari populasi ini. Alel bersaiz 577 bp (27 ulangan) ialah alel yang biasa dijumpai dengan frekuensi 0.1641 dan diikuti dengan alel bersaiz 561 bp (26 ulangan) dan 529 bp (24 ulangan) dengan frekuensi masing-masing 0.1172 dan 0.1094. Alel terkecil yang dijumpai ialah alel bersaiz 465 bp (20 ulangan) manakala alel yang terbesar ialah alel bersaiz 753 bp (38 ulangan). Populasi ini menunjukkan 56.9% individu heterozigositi. Kata kunci: Lokus D1S80; VNTR; keperbagaian rupa bentuk; genetik populasi; populasi Melayu moden Variabel jumlah ulangan tandem (VNTR) terdiri salinan berulang dari urutan DNA yang terletak berdekatan satu sama lain pada kromosom (Bloom et al. 1996). Jumlah pasti mengulangi sangat bervariasi dalam populasi (Jeffreys et al. 1985). VNTR polimorfisme dapat terjadi dalam kasus unit berulang yang sangat singkat (mikrosatelit), menengah (minisatelit) atau besar. D1S80 adalah lokus yang terletak di kromosom 1 di wilayah telomeric lengan p, kromosom manusia terbesar, pada posisi 1p36-P35. Wilayah telomeric di akhir kromosom mengandung tandem (side-by-side) mengulangi urutan noncoding sederhana (winter et al. 2003). Pada wilayah ini, urutan inti berulang adalah 16 basis pair (bp) dari GAAGACCACCGGAAAG (Hatzaki dkk. 1994) dengan 29 alel yang berbeda yang berkisar dalam ukuran dari 200 bp 700 bp (Roy 1997). Lokus ini memiliki alel yang mengandung antara 14-42 berulang (Tamaki & Jeffreys 2005). Adanya beberapa alel menunjukkan polimorfik yang jenisnya dari lokus D1S80. Sejak itu ditandai, lokus D1S80 telah banyak digunakan dalam studi filogenetik, analisis forensik (Anderson et al. 1996) dan pengujian sumber (Helminen et al. 1992). lokus D1S80 memungkinkan diskriminasi geografis (Katsuyama et al. 1997) dan kelompok etnis (Das & Seshadri 2003; Vallinoto dkk. 2003); perbedaan ras account untuk ~ 50% dari VNTR alel keanekaragaman (Turowska & Sanak 1995). Populasi Malaysia terdiri dari berbagai etnis dan ras. Lokus hypervariable banyak terdapat di 144 populasi yang belum mapan di Malaysia dan khususnya di Sarawak. Di Semenanjung Malaysia, beberapa laporan penelitian serupa dengan menggunakan berbagai penanda seperti DNA mitokondria (mtDNA),sitokrom P450 dan polimorfisme enzim CYP2C9 (Hoong & Lek 2005; Yang et al. 2004; Zainuddin et al. 2006), telah menunjukkan perbedaan yang signifikan antara tiga etnis utama kelompok di Malaysia (. Seng et al 2003; Yang et al 2004.). Selain itu daerah hypervariable yang memiliki mtDNA juga telah digunakan untuk menentukan pergerakan populasi di Asia selama zaman kuno (Ricaut et al. 2006) dan identifikasi DNA purba (Ariffin et al. 2006/2007). Di sini, hasil untuk lokus D1S80 dalam sampel masyarakat Melayu modern di Sarawak. Pekerjaan ini dimaksudkan untuk membangun database distribusi alel di Sarawak. Lebih lanjut, jumlah dan frekuensi Alel D1S80 hadir di komunitas sampel juga bertekad.Bahan dan Metode Pengumpulan SampelSampel DNA dikumpulkan dengan teknik swab bukal (Richards et al. 1993). Tujuh puluh enam sampel dikumpulkan dari individu yang tidak berhubungan dalam sarjana Unimas populasi antara Juli-Agustus 2006. Informed consent diperoleh dari semua donor sebelum mengumpulkan bukal sampel. DNA itu baik diekstraksi segera setelah diperoleh atau disimpan di -20 oC freezer sebelum ekstraksi.Ekstraksi DNA dan Kuantifikasi DNA diekstraksi dengan metode mendidih (Richardset al. 1993). Sel pipi diambil dari subjek dengan swab bukal. Seratus mikroliter air steril diambil dipipet dimasukan ke dalam tabung eppendorf steril. Sel bukal dikumpulkan dengan tusuk gigi yang diputar dan tegas terhadap bagian dalam pipi dan kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf. Proses swab diulang dua kali dengan menggunakan tusuk gigi baru sampai larutan menjadi berawan. Lima mikroliter dari 1M NaOH ditambahkan ke sel penangguhan. Tabung eppendorf tutup itu diusuk menggunakan pin dan diinkubasi di blok panas selama 15 menit pada 90 derajat celcius. Tabung tersebut kemudian dikeluarkan dari blok panas dan dibiarkan dingin dengan suhu kamar. Selanjutnya, 5,5 ml 1M Tris-HCl pH 7,5 ditambahkan dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke 1,5 ml tabung centrifuge baru. Kuantifikasi DNA kemudian dilakukan menggunakan Ultrospec 1100 prospectrophotometer (Amersham Pharmacia Biotech).Polymerase Chain Reaction (PCR) Primer D1S80 digunakan dalam penelitian ini didasarkan pada Kasai et al. (1990). Amplifikasi PCR dari hypervariable locus dilakukan dengan menggunakan komponen berikut: 1X buffer yang mengandung (NH4) 2 SO4, 2mm dNTP mix (Fermentas), 25 pmol D1S80 maju primer (5' GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG -3 ') (Base Pertama, Selangor), 25 pmol primer D1S80 terbalik (5' GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC -3 ') (Pertama Dasar, Selangor), 1 unit Taq DNA polimerase (Fermentas), 100 ng minyak DNA, 20 ml mineral (opsional) dan dibuat sampai total volume akuades steril 25 l. PCR dilakukan dengan menggunakan Biometra Pribadi (Biometra) dan Kondisi thermocycler adalah sebagai berikut: denaturasi pada 94oC selama 30 detik, annealing pada 65o C selama 1 menit, elongasi di 72oC selama 1 menit, ekstensi akhir pada 72oC selama 10 menit dan PCR diulang 30 siklus.Agarosa Gel Elektroforesis dan penentuan amplikon Produk DNA dan PCR dianalisis pada 8% poliakrilamida gel (Owl Ilmiah) di penyangga 1X Tris-borat (TBE). Etidium bromide (10 mg / ml) ditambahkan pada gel dan divisualisasikan menggunakan transilluminator UV. Gel didokumentasikan menggunakan Kodak Gel Dokumentasi System (BioRad). Ukuran amplikon ditentukan melalui analisis regresi. Ukuran semua band ditentukan melalui regresi linear menggunakan migrasi standar penanda. Jarak band terbalik sebanding dengan jumlah unit berulang di D1S80.Analisis Statistik Data genotipe dianalisis menggunakan software Popgene (Yeh & Boyle, 1997). Perangkat lunak ini digunakan untuk menghitung frekuensi alel, mengamati jumlah alel, jumlah efektif alel, frekuensi genotipe dan yang heterosigositas dari alel. HASIL DAN DISKUSI Sebanyak 76 sampel diperkuat melalui PCR, dan kemudian dipisahkan pada 8,0% halaman. Gambar 1 dan 2 mewakili Produk PCR yang mengandung homozigot dan heterozigot dari lokus D1S80. Tunggal amplikon PCR (Gambar 1 piring (a), sampel nomor 49, 8 dan 45) mewakili individu yang homozigot, sementara dua amplikon PCR (Gambar 1 piring (b), sampel nomor 51, 10, 22, 29, 6 dan 74) mewakili individu heterozigot pada lokus D1S80. Band tambahan dapat dilihat pada ukuran berat molekul sekitar 120 bp adalah produk dari primer mengikat non-khusus untuk lokus kromosom lainnya (Bloom et al. 1996). Dari 76 sampel, 64 sampel dipilih untuk analisis statistik lebih lanjut. Ukuran alel dan nomor pengulangan untuk lokus diberikan dalam Tabel 1. Sebanyak 17 alel terdeteksi untuk hadir dalam sampel populasi bahasa Melayu Modern. Temuan ini sebanding dengan alel ditemukan dalam penelitian lain menggunakan D1S80 lokus seperti sebagai karya oleh Katsuyama dkk. (1998) dimana 10-28 alel yang ditemukan di delapan populasi sampel yang hidup sepanjang Silk Road rute (daerah dari Eropa Timur, Asia Tengah ke Cina). Studi oleh Das & Seshadri (2003) di

Gambar 1. D1S80 etidium bromida-bernoda gel. Lane L adalah tangga Generuler 100 basis poin (Fermentas). Lanes 1-9 mewakili PCR produk dengan jumlah sampel ditunjukkan dengan jumlah pada gel. Piring (a) Sampel sejumlah 73, 37, 16, 11, 17 dan 54, heterozigot sedangkan sampel nomor 49, 8 dan 45 adalah individu homozigot. Piring (b) Contoh nomor 51, 10, 22, 29, 6 dan 74 yang heterozigot sedangkan sampel nomor 71, 41 dan 20 adalah individu homozigot.

Gambar 2. Pelat (a) dan (b) adalah representasi skematis dari amplikon yang terdeteksi pada Gambar 1 piring (a) dan (b)dua populasi suku di India menunjukkan 12 sampai 14 alel yang hadir dengan nilai heterosigositas diamati dari 0,79. Vallinoto dkk. (2003) juga melaporkan distribusi alel komunitas D1S80 dalam dua Afrika-Brasil memiliki hanya 12 alel. Karya ini digunakan sebagai dasar untuk analisis genetik lainnya. Lokus ini adalah salah satu lokus yang paling sering digunakan dalam studi populasi di seluruh dunia mulai dari studi suku terpisah untuk migrasi populasi (Katsuyama et al. 1998; Vallinoto dkk. 2003). Dalam rangka untuk melakukan studi seperti hubungan penyakit genetik, genetika populasi dan studi forensik, perbandingan frekuensi alel dan variasi lokus dalam suatu populasi diperlukan. Oleh karena itu, berbagai VNTR diperlukan dan prasyarat ini untuk dianalisis, untuk setiap VNTR frekuensi alel standar dan distribusi dalam suatu populasi harus ditentukan.KESIMPULAN D1S80 lokus adalah salah satu yang terbaik ditandai oleh penanda VNTR. Tujuh belas alel dari lokus D1S80 yang terdeteksi pada populasi Melayu untuk penelitian ini. Alel dengan Tabel 1. Daftar ukuran alel, jumlah mengulangi alel, jumlah alel yang diamati dan alel frekuensi yang modern populasi sampel Melayu di Sarawak

ukuran 577 bp (27 berulang) adalah yang paling umum (alel frekuensi 0,1641), diikuti oleh alel dengan ukuran dari 561 bp (26 berulang) dan 529 bp (24 berulang). Alel-alel yang jarang dengan frekuensi 0,0078 ditentukan untuk menjadi alel-alel dengan ukuran 497 bp (22 berulang) dan 721 bp (36 berulang). Alel terkecil yang ditemukan adalah alel dengan 20 berulang (465 bp) sedangkan yang terbesar terdiri dari 38 mengulangi (753 bp). Jumlah efektif alel adalah 11,176 dan populasi ditunjukan 57,8% heterozigositas. Pekerjaan ini menentukan sebagai platform dasar untuk penyelidikan lebih lanjut ke dalam migrasi penduduk dan campuran antara adat dan studi modern Melayu dan juga dari hubungan genetik di sarawak.PENGAKUANKami berterima kasih kepada Azis Ajim, Tan Hong Sia, Patricia Chong dan Yasotha Sundaraj atas bantuan dan saran teknis. Penelitian ini didukung dengan UNIMAS mendasar hibah.

REFERENCES Anderson, J.F., Greenhalgh, M.J., Butler, H.R., Kilpatrick, S.R., Piercy, R.C., Way, K.A., Myhill, H.S., Wright, J.C., Hallett, R. & Parkin, B.H. 1996. Further Validation of Multiplex STR System for Use in Routine Forensic Identity Testing. Forensic Science International 78:4764.Ariffin, S. H. Z., Wahab, R. M. A., Zamrod, Z., Sahar, S., Razak, M. F. A., Ariffin, E. J. & Senafi, S. 2007. Molecular Archeology of Ancient Bone from 400 Year Old Shipwreck. Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 15:1 27-31.Bloom, M. V., Freyer, G. A. & Micklos, D. A. 1996. Cold Spring Harbor Laboratory. New York: The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.Das, B. & Seshadri, M. 2003. DNA Polymorphism Study at D1S80, DYS19, DYS287 and DYF155S2 in Two Tribal Populations from Central India [Electronic version]. Journal of Forensic Sciences 48:5.Hatzaki, A., Loukopoulos, D., Spiliopoulou, H. & Koutselinis, A. 1995. A Study of Five Variable Number Tandem Repeat (VNTR) Loci in the Greek population. Molecular and Cellular Probes 9:129-133. Helminen, P., Sajantila, A., Johnsson, V., Lukka, M., Ehnholm, C. & Peltonen, L. 1992. Amplification of Three Hypervariable DNA Regions by Polymerase Chain Reaction for Paternity Determinations Comparison with Conventional Methods and DNA Fingerprinting. Molecular Cell Probes 6:2126.Hoong, L. L. & Lek, K. C. 2005. Genetic Polymorphisms in Mitochondrial DNA Hypervariable Regions I, II and III of the Malaysian Population. Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 13:2 79-85.Jeffreys, A., Wilson, V. & Thein, S.L. 1985. Hypervariable Minisatellite Regions in Human DNA. Nature 314:67-73. Kasai, K., Nakamura, Y. and White, R. 1990. Amplification of a Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) Locus (pMCT 118) by the Polymerase Chain Reaction (PCR) and its Application to Forensic Science. Journal of Forensic Science International 35:1196-1200. Katsuyama, Y., Inokob, H., Imanishic, T., Mizukib, N., Gojoboric, T. & Otaa, M. 1998. Genetic Relationships among Japanese, Northern Han, Hui, Uygur, Kazakh, Greek, Saudi Arabian and Italian Populations Based on Allelic Frequencies at Four VNTR (D1S80, D4S43, COL2A1, D17S5) and One STR (ACTBP2) Loci. Human Heredity 48:126137.Ricaut, F.X., Bellatti, M. & Lahr, M. M. 2006. Ancient Mitochondrial DNA from Malaysian Hair Samples: Some Indications of Southeast Asian Population Movements. American Journal of Human Biology 18(5): 654-667. Richards, B., Skoletsky, J., Shuber, P. A., Balfour, R., Stern, R. C., Dorkin, H. L., Parad, R. B., Witt, D. & Klinger, K. W. 1993. Multiplex PCR Amplification for the CRFT Gene Using DNA Prepared for Buccal Brushes/Swab. Journal of Human Molecular Genetics 2:159-163. Roy, R. 1997. Infrared Fluorescent Detection of D1S80 Alleles. Journal of Forensic Science International 87:63-71. Seng, K.C., Gin, G.G., Sangkar, J.V. & Phipps, M.E. 2003. Frequency of Cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) Alleles in Three Ethnic Groups in Malaysia. Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology. 11(2):83-91. Tamaki, K. & Jeffreys, A. J. 2005. Human Tandem Repeat Sequences in Forensic DNA Typing. Journal of Legal Medicine 7:244-250. Turowska, B. & Sanak, M. 1995. D1S80 VNTR Locus Genotypes in Population of South Poland; Meta-analysis Pointer to Genetic Disequilibrium of Human Populations. Journal of Forensic Science International 75:207-216. Vallinoto, I. M. V. C., Vallinoto, A. C. R., Cristina Maria Duarte Valente C. M. D. & Guerreiro J. F. 2003. Allele Frequency Distributions of 6 Hypervariable Loci (D1S80, APOB, D4S43, vW1, F13A & DYS19) in Two African-Brazilian Communities from the Amazon Region. Journal of Genetics and Molecular Biology 26:235-240. Winter, P. C., Hickey, G. I. & Fletcher, H. L. 2003. Instant Notes in Genetics (2nd edit). Oxford: Bios Scientific Publishers Ltd. Yang, Y. S. Wong, L. P., Lee, T. C., Mustafa, A. M., Mohamed, Z. & Lang C. 2004. Genetic Polymorphism of Cytochrome P450 2C19 in Healthy Malaysian Subjects. British Journal of Clinical Pharmacology 58:3 332-335. Yeh, F. C. & Boyle, T. J. B. 1997. Population Genetic Analysis of Co-Dominant and Dominant Markers and Quantitative Traits. Belgian Journal of Botany 129:157. Zainuddin, Z., Teh, L. K., Suhaimi, A. W. M. & Ismail, R. 2006. Malaysian Indians are Genetically Similar to Caucasians: CYP2C9 Polymorphism. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics 31:2 187-191.

Department of Molecular Biology, Faculty of Resource Science and Technology, Universiti Malaysia Sarawak, 94300 Kota Samarahan, Sarawak Malaysia Received: 11 July 2007 Accepted: 25 June 2008