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Professores: Bruno Portela Brasileiro

Renata Faier Calegario

DNA recombinante, PCR e

Eletroforese

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO

AF 060- Biotecnologia Vegetal

BIOLOGIA MOLECULAR

❖ Possibilita a manipulação de moléculas

=> introdução de genes em um genoma receptor

✓ Enzimas cortar, copiar e colar o DNA

✓ Bases nitrogenadas

Tecnologia do DNA recombinante

Depende:

Enzimas

Arthur Kornberg

DNA polimerase DNA ligase

Martin Gellert Werner Arber

Enzimas de restrição

Plasmídeos

Stanley Cohen

✓ Clivar DNA com enzimas de restrição

✓ Inserir DNA eucariótico em bactérias

✓ Determinar a sequência de nt de um fragmento de DNA

✓ Amplificar e sintetizar DNA

✓ Recombinar fragmentos de DNA, etc.

DNA RECOMBINANTE

Ferramenta permite:

MANIPULAÇÃO DO DNA

Enzimas de Restrição

Reconhecem e cortam sequências específicas do DNA

• Encontradas em ampla variedade de procariotos (clivar

moléculas de DNA exógeno)

• Isolamento de genes e criação de moléculas novas de DNA

• Reconhecem sequências de 4 a 8 nucleotídeos

• Sítios de Clivagem: hidrolisa ligações fosfodiéster

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

5’...

...5’

...3’

3’...

5’...

3’... ...5’

...3’

Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência

das duas cadeias é igual quando for lida de 5’ para 3’

Extremidade Coesiva Extremidade Cega (Abrupta)


Clonagem: Mais utilizados fragmentos gerados com

extremidades coesivas > eficiência de ligação


Enzimas com diferentes especificidades já foram purificadas:

✓ Abreviação de 3 letras do nome da espécie

✓ Seguida da designação da linhagem

✓ Número Romano: se mais de uma enzima é produzida

Denominação Origem Sequência de Reconhecimento

ENZIMAS DE LIGAÇÃO

✓ Restabelecem as ligações fosfodiéster entre os

nucleotídeos (hidroxila 3’+ fosfato 5´)

✓ Capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma

enzima de restrição

Ex: T4 DNA ligase

DNA DNA3’ OH -O O 5’P

O

-O

DNA DNA3’ O O 5’

O

P

-O

+

DNA-Ligase

ATP ou NAD

DNA RECOMBINANTE

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Kary Mullis

“A revelação me ocorreu numa noite enluarada de sexta-feira de

abril de 1983, enquanto dirigia por uma estradinha tortuosa nas

montanhas do norte da Califórnia que atravessa uma floresta de

sequóias”.

TESTES MOLECULARES

PCR: Polymerase Chain Reaction

✓ Método in vitro para produzir DNA

✓ Baseado nas propriedades do DNA:

Reação de Polimerização em cadeia

Elementos necessários:

DNA molde: Proveniente de extração

Componentes da Replicação: DNA polimerase, primers e

nucleotídeos

Kary Mullis: 1983

Prêmio Nobel: 1993

Desnaturação e Renaturação

REPLICAÇÃO X PCR

Quais os elementos necessário para a Replicação do DNA?

DNA molde

Abertura das fitas = helicase

Adição de nt = síntese

Primers = Primase

Nucleotídeos

Temperatura

Primer: desenhar

DNA: extrair

Nt Sintéticos

DNA polimerase

CÉLULA IN VITRO

Todos elementos são adicionados ao tubo (eppendorf)

• DNA extraído: 20 a 200ng

• dNTPs: Nucleótidos livres A, T, C, G

• Par de Primers (iniciadores)

=> anelando nas bordas da

região a ser amplificada

• Taq DNA polimerase: Thermus

aquaticus (estável em T°)

• Tampão 10X: estabiliza pH

• MgCl2: ajuda ligação dos primers

e cofatores (Mg+2) Taq

REAÇÃO DE PCR

H2O

dATP

dCTP

dTTP

dGTP

Primer5’ - 3’

Primer3’ – 5’

Taq DNA Polimerase

Mg+2

Tampão 10X

dNTPs

Figura: http://slideplayer.com.br/slide/366864/

DNA

25µL

=> Amplificação da sequência específica do DNA = amplicon

=> Tamanho e sequência definidos

=> Grande quantidade

Ao final da Reação:

PCR

Equipamento necessário:

Termociclador

Propicia ciclos de temperaturas

Desnaturação = 94°C

Anelamento = 54°C

Extensão = 72°C

1 Ciclo

✓ Limpe a bancada de trabalho ao começar e ao terminar

✓ Adicione o DNA por último na reação: evita transferência de

amostras de DNA de um tubo para outro

✓Faça sempre um controle negativo, sem DNA. Prepare-o por

último - representativo da manipulação

✓Controle positivo: material conhecidamente positivo

PCR

Recomendações:

PRIMERS

O QUE É UM PRIMER?

✓ Sequência de nucleotídeos complementar às extremidades

da sequência alvo do DNA

✓ Tamanho: 17-24 nucleótidos

✓ Deve corresponder a uma sequência única dentro do DNA a

ser amplificado

COMO FAZER UM PRIMER ?

✓ Conhecer a sequência do gene

✓ Lembrar: Polimerização sempre 5’-3’

PRIMERS

…GTTCTAGGATCGACTCTAAGTTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTGTC

AACACTGAGTCGAGACCCCTGGCTAGGACTTTCCGTAGTCCTCCAGATGT

TATGCCTACCGTATGCAGCAAATTTACGGTAAGTCACTTAAAGGCCTGACC

ATACAGTGTTTGAGCAAGAATCAGGACACTTCTCCAAGCGTCTCTAAGCTT

GTTATCACAAAGAATTATAGGTTTGGACAGAATTTTATACGCGAAGTCTTTG

ATAAAATTGGACATGCTTAGCTTTTATGGTAATGGTGGTATGATCTTTACAG

ATTGCTGTAGTACTATACACCAGTTTCAGGGTAGTGACGCTGAATATGTTG

TTGTCATGCGCCTGACATATGCTGAGTAAGTCTATTTTTATGGATGAAAGG

CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...

5’-

- 3’

Sequência do Gene

5’…GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’

3’…CAAGATCCTAGCTGAGATTCATTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTC.…5’

5’…CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...3’

3’- GTGATACGCTTACCAGATGC…5’

Fita 1 - Molde

Fita 2 - Complementar

Fita 1 - Molde

Fita 2 - Complementar

PRIMERS

5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’Sequência do Primer

Forward (Left)

Amplifica

Fita 5’- 3”

molde

Sequência do Primer

Reverse (Right) 5’- CGTAGACCATTCGCA TAGTG- 3’

Amplifica

Fita 5’ - 3’

Complem.

✓ Tamanho: 17-25 bases

✓ Composição: 50% C+G

✓ Extremidade 3’com G ou C

✓ Evitar três ou mais Gs ou Cs (3´): Anelamento inespecífico emregiões ricas em G ou C

✓ Evitar primers F e R com complementaridade de bases(dímeros de primers)

✓ Evitar complementaridade de bases no próprio primer (hairpin,estruturas secundárias)

PRIMERS

Características desejáveis dos Primers

✓ Determina o anelamento específico

✓ Temperatura alta: maior especificidade

✓ Temperatura baixa: menor especificidade

✓ Depende da %GC

✓Temp. Anelamento: ~ 5º C abaixo do menor Tm do par de primers

✓Tm varia de 55-72oC : Tm dos dois primers próximas

PRIMERS

Condições de Anelamento TEMPERATURA

Tm = 2 (A+T) + 4 (G + C)

Melting Temperature (TM) = Temperatura Desnaturação

Fórmula de Wallace

PRIMERS

5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’Sequência do Primer

Forward (Left)

Tm = 2 (5 + 6) + 4 (5 + 4)

Tm = 58°C TA = 53°C

PCR

Equipamento necessário:

Termociclador

Propicia temperaturas distintas

Desnaturação = 94°C

Anelamento = 54°C

Extensão = 72°C

1 Ciclo

REAÇÃO DE PCR

Anelamentoou

Primer ForwardPrimer Reverse

Forward

Reverse

REAÇÃO DE PCR

1° CICLO

APÓS REAÇÃO

Quantidade de cópias aumenta em progressão geométrica

Quantidade de cópias = 2 n

Onde, n = n° de ciclos

2 31 = 2 bilhões de cópias do fragmento

Cada uma das novas fitas de DNA sintetizadas a partir dos “primers”

serve como molde para síntese de uma nova fita.

ANÁLISE DA PCR

Verificar se houve amplificação do fragmento de interesse

➢ Eletroforese: Análise em gel de agarose

• Concentração: 0,8% e 1% (acordo com tamanho fragmento)

• Marcador conhecido: para estimar o peso molecular

• Gel é corado com brometo de etídio, visualizado luz UV

Presença de Banda = Positivo

Ausência de Banda = Negativo

• Amostras comparadas ao marcador determinando-se o tamanho

do fragmento de DNA amplificado

ANÁLISE DA PCR

Milho Bt - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

(A) Esquema da localização relativa no

gene dos primers utilizados para os

experimentos de PCR e o isolamento do

Vip3A

B) Resultados de amplificação para a cepa

HD125, confirmando a presença do gene, que

demonstrou ser 99,8% idêntico à sequência de

nucleotídeos publicada para o gene Vip3A(a)

Detecção do gene Vip3A em cepas transformadas Bacillus turingiensis

ANÁLISE DA PCR

Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p.1335-1343, set. 2007

Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco

Fragmento com aproximadamente 1.200 nucleotídeos para o DNA A,

compreendendo as extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum

Rep

CP

- Apresenta alguns falsos positivos

- Importante controles +/-

- Sensível (fentograma: 10-18)

- Rápido

- Grande n° amostras

Vantagens:

Desvantagens:

PCR

Controle positivo = amostra conhecidamente positiva

Controle negativo = sem DNA

Controle negativo = com DNA, sem primer

PCR

- Detecção de genes em DNA genômico

- Clonagem de DNA

- Sequenciamento

- Evolução molecular

- Análise de estrutura genômica

- Identificação de mutações

- Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas

- Teste de paternidade

APLICAÇÕES

.....

DNA com diferentes tamanhos => migram em velocidades

diferentes => formam diferentes bandas

✓ Base: mobilidade de partículas em um suporte sólido sob

ação de um campo elétrico

✓ Separação de acordo com: o tamanho, forma e carga elétrica

COMO ANALISAR O DNA

❖ Método para separar ácidos nucleicos e proteínas

Eletroforese

DNA contém carga negativa => migra para o polo positivo

• Gel Agarose = agarose (polissacarídeo)

=> separação de fragmentos pequenos e grandes

• Gel Acrilamida = acrilamida e bisacrilamida (polímeros)

=> separação de proteínas ou partículas muito pequenas

ELETROFORESE

✓ Meios de suporte sólido

✓ Visualização das bandas: corantes de DNA

• Brometo de etídio (carcinogênico e teratogênico)

• SYBRGreen

• GelRedMoléculas se ligam ao DNA

ELETROFORESE

ELETROFORESE

-

+

Gel

Cuba de eletroforese

Gel

Fonte

Luz UV

ELETROFORESE

http://www.jove.com/video/3923/electroforese-em-gel-de-agarose-para-separao-dos-fragmentos-de-dna?language=Portuguese

LABORATÓRIO DE BIOMOL

Recomendações:

✓ Uso de luvas e Material estéril

✓ Soluções autoclavadas

✓ Exceção: enzimas, detergentes, DNA e RNA, etc

✓ Água: deionizada (autoclavada)

✓Cuidado com soluções tóxicas, carcinogênicas e

teratogênicas: Brometo de etídeo, Fenol, Clorofórmio,

βME, Luz UV.

INTRODUÇÃO

Isolamento do DNA da planta = Extração de DNA

✓ Fundamental para análise de DNA exógeno no

genoma vegetal

1º Passo para Técnicas Moleculares de detecção

• PCR = Presente ou ausente

• Southern Blot = Nº de cópias

Confirmar a integração do DNA exógeno

EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Diferentes protocolos => variam em função da espécie e

do tecido a ser utilizado

✓ Reflete a variabilidade da composição bioquímica de

diferentes plantas e tecidos

Maioria dos protocolos => variação de 2 protocolos básicos

• Dellaporta et al (1983)

• Doyle & Doyle, (1987)

Baseado na utilização do detergente CTAB

Baseado na precipitação de proteínas e polissacarídeos por acetato de

potássio na presença de SDS

Romper as membranas celulares para liberação do DNA

Romano, 1998


Você deve ter em mente:

✓ Isolar o DNA de outros constituintes celulares: lipídeos,

proteínas e polissacarídeos

✓ Manter Integridade: informação/sequência

✓Polifenois e polissacarídeos = interferem na atividade de

enzimas usadas para manipulação de DNA

=> ligases, polimerases e enzimas de restrição

✓ Use tubos plástico novos e esterilizados

=> O DNA apresenta grande afinidade pelo vidro (evite-o)


Etapas básicas de protocolos de extração

✓ Lise celular = liberar o DNA

• N2 líquido

• Diretamente no Tampão de extração

Tampão de extração

• Tris pH 8.0 e 9.0 = mantém pH (desfavorável às DNAses, pH 7.0)

• EDTA = agente quelante Mg+2 e Ca+2 (co-fator de DNAses)

• β-mercaptoetanol = antioxidante e desnatura enzimas

=> DNA oxidado é inacessível às enzimas de restrição


✓ Tampão de extração (continuação)

• NaCl = auxilia na dissociação de proteínas ligadas aos ácidos

nucleicos (íons rompem ligações de cadeias polipeptídicas)

• CTAB e SDS = detergentes = auxiliam na lise das membranas

celulares (libera os componentes)

Junto com NaCl = forma um complexo com o DNA

Usado para precipitar o DNA seletivamente

• RNAse = elimina RNA

✓ Desnaturação das proteínas com solventes orgânicos

• Fenol

• Clorofórmio:álcool isoamílico

Fase aquosa (superior): DNA + Contaminantes (Polissacarídeos e RNAs)

Interface: proteínas desnaturadas

Fase orgânica (inferior): Lipídeos, polissacarídeos

✓ Recuperação do DNA: Precipitação

• Isopropanol ou álcool absoluto = DNA desidrata e precipita

• Acetato de amônio = remove fenóis ou polissacarídeos

• Acetato de potássio (+SDS) = precipita proteínas e polissacarídeos

Centrifugação


✓ Lavagem do DNA: remoção de sal

• Etanol 70%

EXTRAÇÃO DE DNA: MÉTODO CTAB

Romano, 1998

CTAB, NaCl, Tris, EDTA, β me, H2O

✓ Contaminação por polifenóis: cor marrom do DNA

(oxidação)

✓ Co-isolamento de polissacarídeos: aspecto gelatinoso e

muito viscoso

✓ Presença de DNAses endógenas: visualização do DNA

genômico em gel de agarose – degradado (arraste

vertical)


Problemas comumente encontrados:

Baixa qualidade do DNA

PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES

Ro

man

o &

Bra

slei

ro, 1

99

8

Continuação

Romano & Brasileiro, 1998

PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES

ANÁLISE DA EXTRAÇÃO

➢ Análise da OD em espectrofotômetro

• DNA absorve luz no 260 nm / Proteínas a 280 nm

• 1 OD 260 = 50 mg de DNA

DNA = leitura DO260 x 50 x fator de diluição

• Parâmetro da qualidade do DNA => Relação DO260/DO280

Valores < 1,8 => contaminação com proteínas

Valores >1,8 => contaminação com fenol

Avaliação DNA purificado: Concentração e Pureza

➢ Eletroforese: Análise em gel de agarose

• Concentração: 0,8% e 1%

• Marcador: DNA de concentração conhecida (Padrão)

• Gel é corado com brometo de etídio, visualizado luz UV

• Amostras comparadas aos padrões, determinando-se as

concentrações aproximadas de DNA em cada amostra



1Kb = 1000pb


Análise em gel de agarose: DNA genômico de Plantas

1-4 = DNA Folha Tabaco 5-8 = DNA Arroz

http://www.uniscience.com/homogeneizador/bullet-blender-next-advance

Sorgo Folha Arroz Folha Trigo

Kit de extração DNA

HiPurA™ - Hemedia

Moléculas de DNA de mesmo tamanho = migram com diferentes

velocidades na forma circular relaxada, linear ou supertorcida

5 Min 30 Min

Tratamento com Topoisomerase


A dupla-hélice

enrola-se sob si

mesma

Promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou

removendo superenrolamentos

HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização

Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex

Teste de complementaridade

DNA

Southern Blot Northern Blot

RNA

Sonda: sequência complementar de DNA alvo

SOUTHERN BLOT

Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico

COMO?

Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA

✓ Sondas Radioativas = nt 32P

✓ Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica

ou quimioluminescente)

Nick Translation

Marcação por Random primers

• DNAse: digestão controlada

• DNA polimerase I

• Atividade exonucleásica = retira nt

do lado 5’-P do corte

• Atividade polimerásica = adiciona nt

do lado 3’-OH do corte

Marcação de Sonda

• Primers aleatórios anelam vários

pontos do DNA

• dNTPs marcados e não marcados

• Fragmento Klenow da DNA

polimerase I

KIT DE MARCAÇÃO

Kit Dig DNA Labeling: Randon Primers

Produto PCR purificado

Fervido: 100° C/10 min => Gelo

PCR desnaturado

Nt (primers aleatórios - hexameros)

dNTP- Digoxigenina

Enzima Klenow DNA Polimerase I

Δ 37°C 12hs

Gel: Fragmentos DNA

TRANSFERÊNCIA

HIBRIDIZAÇÃO

SOUTHERN BLOT

REVELAÇÃO

Tratamentos:DepurinaçãoDesnaturaçãoNeutralização

-- --

-

-

-

-

--

-

-

--

-Lavagens

Retira excesso de sonda

DNA imobilizado

Sonda fria

Nucleotídeos marcados com digoxigenina

E E E

IgG anti-digoxigeninaconjugado com Fosfatase

alcalina

Membrana (+)

Adição substrato NBT/BCIP: clivagem e precipitação sobre a membrana

O QUE ACONTECE NA MEMBRANA

Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos

SOUTERN BLOT

VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja

Separou

fragmentos

Gel - 3hs

Hibridização

18hs

α32P: d-CTP3 3

4

1 11

4 4 6 66 6

4

Cópias do transgene

DNA total

Hind III

PCR

Souther

Blot

✓ Possibilita rearranjos complexos das inserções que podem

levar a perda das mesmas ou ao silenciamento

✓ Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo da

planta, pelo efeito posicional das inserções (podem

comprometer genes do metabolismo primário)

Alto número de inserções do transgene:

SOUTERN BLOT

✓ Importante para a expressão estável

✓ Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação da

real interação entre as moléculas

Poucas cópias:

SOUTERN BLOT

Plantas Transgênicas de Batata

DNA total digerido Eco RI

1 e 5: Marcador Peso Molecular2 e 4: DNA total batata transgênicadigerido com Eco RI3: DNA total batata Não-transgênicadigerido com Eco RI

Southern Blot do gel

✓ Sensibilidade (fentograma)

✓ Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma

✓ Envio de membranas para outro laboratório

✓ Demorado

✓ Caro

✓ Perigoso (sondas radioativas)

✓ É limitada quando o local exato do gene de interesse é

desconhecido

SOUTHERN BLOT

Vantagens:

Desvantagens:

- Importante experimentos de Transformação => Prova

molecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal

- Bandas com PM diferente do controle + => indicativo de

alterações no material genético

- Detecta fragmento específico em meio a milhões de

fragmentos

- Usado para distinguir estirpes de um organismo

SOUTHERN BLOT

APLICAÇÕES

dna recombinante, pcr e eletroforese 2- pcr... · professores: bruno portela brasileiro renata...

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