DNA synthesis and repair

รั�ชนี�กรั ก�ลลปรัะวิ ทธ์2557

Outline

• DNA replication

• DNA polymerase and other proteins in DNA replication

• Telomere and telomerase

• DNA synthesis using RNA template

• Damage to DNA and mutation

• DNA repair

• DNA repair defect

2

ควิามสำ�าค�ญของการัสำ�งเครัาะห์ DNA

1 .ถ่�ายทอดข�อม ลทางพั�นีธ์"กรัรัมจาก cell เด มไปให์� cell ให์ม� ท�&จะเก ดข'(นี (DNA replication ) เพั)&อให์� cell ให์ม� ม�ล�กษณะ และค"ณสำมบั�ติ ติ�างๆ เห์ม)อนี cell เด ม parental cell daughter cell

(diploid) (diploid)

2. ซ่�อมแซ่ม DNA (DNA repair) เพั)&อรั�กษาข�อม ลทางพั�นีธ์"กรัรัมของ cell ไวิ�ให์�คงเด ม

3

DNA replication

• เก ดในี S-phase (synthesis phase) ของ cell cycle

• เรั &มด�วิยการัคลายเกล�ยวิของ DNA สำายค �

• DNA แติ�ละสำายท�าห์นี�าท�&เป1นี template ในีการัสำรั�าง DNA สำายให์ม� โดยเบัสำท�&จ�าเพัาะก�นีจะจ�บัค �ก�นี ค)อ A จ�บัค �ก�บั T และ G จ�บัค �ก�บั C

• เม)&อเสำรั3จสำมบั รัณ จะได� DNA สำายค � 2 โมเลก"ล ท�&ม�ล�าด�บัเบัสำเห์ม)อนี DNA ติ�(งติ�นี

• เรั�ยกวิ�า semiconservative replication

4

Semiconservative replication

ในีแติ�ละ molecule ของ DNA ท�&เก ดข'(นีให์ม� ปรัะกอบัด�วิย polynucleotide เด ม 1 สำาย และสำายให์ม� 1 สำาย

6

1 A A C T G G G G T T C C A

2 T T G A C C C C A A G G T

1 A A C T G G G G T T C C A

2 T T G A C C C C A A G G T

Semiconservative replication

C G

T A

T T G A C C C C A A G G T

A A C T G G G G T T C C A

7

ป4จจ�ยสำ�าค�ญท�&ใช�ในีการัสำ�งเครัาะห์ DNA

• DNA template

• dNTP : dATP, dGTP, dCTP และ dTTP

• RNA primer :– polyribonucleotide สำายสำ�(นี ๆ– ใช�เป1นีจ"ดเรั &มติ�นีการัสำ�งเครัาะห์ DNA

• Enzyme และ protein ชนี ดติ�าง ๆ เช�นี DNA polymerase, DNA ligase, DNA gyrase, primase, SSB, DnaC เป1นีติ�นี

• พัล�งงานี (ในีรั ป ATP) ท�&ใช�ในีการัคลายเกล�ยวิและติ�อสำาย DNA 8

Origin of replication

• เป1นีจ"ดเรั &มติ�นีของ DNA replication

• Replication process จะเคล)&อนีท�&จาก origin of replication ออกไปท�(ง 2 ท ศทาง (bidirectional)

• Prokaryotic cells จะม� origin of replication ติ�าแห์นี�งเด�ยวิ

• Eukaryotic cells ม�ห์ลาย origin of replication บันี chromosome เด�ยวิก�นี จ'งเก ดการัสำ�งเครัาะห์ DNA สำายสำ�(นี ๆ ห์ลายสำายพัรั�อมก�นี ท�าให์�การัถ่อดแบับัเสำรั3จเรั3วิข'(นี

9

DNA replication

• Unwinding of DNA helix : helicase

• Relaxation of supercoiled DNA : DNA gyrase

• RNA primer synthesis : primase

• DNA synthesis : DNA polymerase III– Leading strand– Lagging strand

• Removal of RNA primer & filling gaps : DNA polymerase I

• Sealing of DNA chain : DNA ligase

10

Replication begins with the unwinding of the Ori C (origin site)

Ori C locus - 245 bp

- tandem array of three 13-mers with nearly identical sequences (AT rich)

Dna A binds to Ori C

initiate sequence of steps of DNA synthesis

Tandem array of 13-mer seq.

Binding site for DnaA protein

E.coli

5' GATCTNTTNTTTT 3'

3' CTAGANAANAAAA 5'

11

HU : histone like protein stimulates initiation

12

Bidirectional replication of a circular chromosome Replication เรั &มเก ดท�& origin of replication โดยเก ดท�(ง 2 ท ศทางในีขณะเด�ยวิก�นี

Origin of replication

Replication forks

New strands

Parental strands

13

OO

O

O

O

O

สำ�วินีของ DNA ท�&ติ� (งติ�นีจากจ"ดเด�ยวิก�นีเรั�ยกวิ�า repliconO

+

Eukaryotic cells ม� origin of replication ห์ลายแห์�ง

O = origin

14

Unwinding of DNA helix

• เอนีไซ่ม helicase (Dna B) ท�าให์�เก ดการัคลายเกล�ยวิ DNA โดยข�(นีติอนีนี�(ติ�องใช�พัล�งงานีจาก ATP

• จ"ดท�& DNA คลายเกล�ยวิออกจะม�ล�กษณะเป1นีง�าม เรั�ยกวิ�า replication fork

• DNA สำายเด�&ยวิท�&เก ดจากการัคลายเกล�ยวิจะม�โปรัติ�นีช)&อ single stranded DNA binding protein มาจ�บัเพั)&อป6องก�นี DNA พั�นีเป1นีเกล�ยวิให์ม�

15

Relaxation of supercoiled DNA

• การัคลายเกล�ยวิ DNA จะท�าให์�เก ด supercoil ในี DNA บัรั เวิณถ่�ดไป (DNA บัรั เวิณใกล�เค�ยงก�บั DNA ท�&คลายเกล�ยวิจะพั�นีก�นีแนี�นีกวิ�าปกติ )

• DNA gyrase ท�าห์นี�าท�&ติ�ดเกล�ยวิออกแล�วิห์ม"นีให์� supercoil คลายติ�วิและติ�อปลายท�&ติ�ดออกให์�เช)&อมก�นีด�งเด ม

16

DNA gyrase (DNA topoisomerase II)

• ท�าห์นี�าท�&คลายเกล�ยวิของ DNA ท�&ขดก�นีแนี�นี (supercoil) ซ่'&งเก ดจากการัท�& DNA ติ�าแห์นี�งข�างเค�ยงม�การัคลายเกล�ยวิโดย DNA helicase ติามข�(นีติอนีด�งติ�อไปนี�(– DNA gyrase ติ�ด DNA duplex สำ�วินีท�&ม� supercoil ออก– เก ดการัห์ม"นีของ DNA duplex เพั)&อให์� supercoil คลายออก– ติ�อปลาย DNA duplex ท�&คลายออกแล�วิเข�าก�บั DNA ข�างเค�ยงด�งเด ม

• Porkaryotic DNA gyrase จะถ่ ก inhibit โดยสำารัติ�าง ๆ ได�แก�– Streptomyces derived novobiocin– Oxolinic acid, Nalidixic acidท�าให์� bacteria ไม�สำามารัถ่แบั�งเซ่ลลเพั &มจ�านีวินีได�

17

RNA primer synthesis

• การัสำ�งเครัาะห์ DNA จะเรั &มติ�นีได�ติ�องม�การัสำ�งเครัาะห์ RNA primer ท�&ม�ควิามยาวิปรัะมาณ 50-100 nucleotide ข'(นีมาก�อนี

• Primase ซ่'&งเป1นี RNA polymerase ชนี ดห์นี'&ง ท�าห์นี�าท�&สำ�งเครัาะห์ RNA primer จาก DNA template โดยม�ท ศทาง การัสำ�งเครัาะห์จาก 5’ 3’

18

DNA synthesis

• การัสำ�งเครัาะห์ DNA จะเก ดติ�อจากปลายของ RNA primer ในีท ศทาง 5’ 3’ (และติรังข�ามก�บัสำาย DNA template ซ่'&งม�ท ศทางจาก 3 ’ 5’ โดยใช� DNA polymerase III holoenzyme และ dNTP เป1นี substrate

• nucleotide ท�&มาติ�อก�นีเป1นีสำายให์ม� จะม�เบัสำท�& complementary ก�บั template ห์รั)อกล�าวิได�วิ�า สำาย nucleotide ท�&สำ�งเครัาะห์ข'(นีมาให์ม�ม�ล�าด�บัเบัสำเห์ม)อนีก�บั DNA สำายเด�&ยวิท�&แยกออกไป

• การัสำ�งเครัาะห์ DNA สำายให์ม�จะเก ดข'(นีสำองสำายในีท ศทางติรังก�นีข�าม โดยสำายห์นี'&งเรั�ยกวิ�า leading strand สำ�วินีอ�กสำายเรั�ยกวิ�า lagging strand

19

DNA synthesis

• Leading strand เป1นี DNA สำายให์ม�ท�&เก ดการัสำ�งเครัาะห์ติ�อก�นีเป1นีสำายยาวิไปในีท ศทางเด�ยวิก�นีก�บัการัเคล)&อนีท�&ของ replication fork

• Lagging strand เป1นี DNA ท�&ปรัะกอบัด�วิย DNA สำายสำ�(นี ๆ (fragment) จ�านีวินีมาก ท ศทางการัสำ�งเครัาะห์จะสำวินีทางก�บั replication fork โดยแติ�ละ fragment เรั�ยกวิ�า Okasaki fragment

• Okasaki fragment เก ดจาก DNA polymerase สำ�งเครัาะห์ nucleotide ได�เฉพัาะในีท ศทาง 5’ 3’ เท�านี�(นี

20

Removal of RNA primer and filling gaps• RNA primer ถ่ กติ�ดออกโดย DNA polymerase I จะติ�ด

nucleotide ทางปลาย 5’ ออกท�ละติ�วิ

• ช�องวิ�างท�&เก ดจากการัติ�ด RNA primer ออก จะถ่ กแทนีท�&ด�วิย deoxyribonucleotide ท�&ม�เบัสำ complementary ก�บั template โดย DNA polymerase I

• ในี leading strand ห์ล�งการัติ�ดสำาย RNA primer ออกแล�วิ จะได� DNA สำายยาวิสำายเด�ยวิ สำ�วินีในี lagging strand จะได� DNA สำายสำ�(นี ๆ ห์ลายสำาย

21

Sealing of DNA chain

• DNA ligase ท�าห์นี�าท�&เช)&อมปลาย 3’-OH ของ Okazaki fragment ก�บัปลาย 5’-phosphate ของ Okazaki fragment ท�&อย �ติ ดก�นี

• นีอกจากนี�( DNA ในี leading strand ท�&เก ดจาก origin of replication คนีละจ"ดก�นี สำามารัถ่ติ�อก�นีเป1นีสำายยาวิด�วิย DNA ligase เช�นีก�นี

• การัท�างานีของ DNA ligase ในี eukaryotic cells ติ�องใช� ATP

22

3'

3'

5'

5'

A

A A

A

T

C

C

G

GT

T T

3'

3'

5'

5'

A

A A

A

T

C

C

G

GT

T T

OH

H2O3 PO

O O

OOP

H

DNA ligaseATPAMP +PPiH2O

23

DNA polymerase

• catalyzes a template-directed synthesis of DNA from dNTP

• requires free 3'-OH group

• synthesis in the 5' 3' direction

• Uses dATP, dGTP, dCTP, and dTTP as substrates 24

DNA polymerase

• DNA polymerase in prokaryotes (E. coli)– DNA polymerase I– DNA polymerase II– DNA polymerase III

• DNA polymerase in eukaryotes

25

DNA polymerase I

• 10 nucleotides / sec / mol-enzyme

• Polymerase activity (5’ 3’)

• 3’ 5’ exonuclease activity ท�าห์นี�าท�& proofreading

• 5’ 3’ exonuclease activity ท�าห์นี�าท�& error-correcting

• ใช�ในี DNA synthesis (ติ�อ Okazaki fragment), remove primer, filling gaps, DNA repair

26

DNA polymerase I ม� activity ของ enzyme 3 ชนี ด อย �ในีติ�วิเอง

3' 5' exonuclease

5' 3' exonuclease polymeraseN C

small fragment large fragment( Klenow fragment )

3. polymerase

1. 3' 5' exonuclease proof-reading

AAAAAAAA

TTTTT

C

HO

5'

5'

3'

3'

H2O site^ C AAAAAA

C

TTTTT

C5'

5'

3'

3'

^H2O site

2. 5' 3' exonuclease error-correcting, remove primer

27

DNA polymerase II

• Multisubunit enzyme (>4 subunits)

• 40 nucleotides/ sec/ mol-enzyme

• 3' 5’ exonuclease activity ท�าห์นี�าท�& proofreading

28

DNA repair

DNA polymerase III holoenzyme

• multisubunit enzyme

• 1000 nucleotides / sec / mol-enzyme

• highly possessive เนี)&องจาก β subunit ช�วิยย'ด core enzyme ให์�ติ ดก�บั DNA template ท�าให์� enzyme ไม�ห์ล"ดจาก DNA template ง�ายๆ ท�าให์�ม�การั form phosphodiester bond จ�านีวินีห์ลายแสำนี bond ก�อนีท�& enzyme จะถ่ กปล�อยออกจาก template เม)&อ replicate เสำรั3จ

• Replicative chain elongation (leading & lagging strand)

29

30

DNA polymerase III3' 5’ exonuclease activity ท�าห์นี�าท�& proofreading activity ช�วิยป6องก�นีไม�ให์�เก ดการั mutation รัะห์วิ�างท�&ม� DNA replication

DNA polymerases in eukaryotes (e.g. humans)

1. DNA polymerase α (replication)* – สำ�งเครัาะห์ short primer (RNA or DNA) for Okazaki fragments on a lagging strand

2. DNA polymerase β (repair)*

3. DNA polymerase γ (replication of mitochondrial DNA)* ทั้��ง 3 ชนิ�ดไม่�ม่ 3 ' 5' exonuclease or proofreading activity

4. DNA polymerase δ (replication) อย �ในี nucleus ม� 3 ' 5' exonuclease or proofreading activity – สำ�งเครัาะห์ leading และ lagging stand (คล�าย DNA pol III ในี prokaryote)

5. DNA polymerase (repair, replication – RNA primer removal คล�าย DNA pol I ในี prokaryote)

ห์ล�งจากสำ�งเครัาะห์จะม� modification ของ DNA โดยการัเติ ม methyl groupให์�ก�บัเบัสำ เช�นี C5 ของ cytosine ด�วิย SAM

31

DNA synthesis using RNA template

• เก ดโดยเอนีไซ่ม reverse transcriptase (RNA dependent DNA polymerase)

• พับัในีไวิรั�สำบัางชนี ด เช�นี ไวิรั�สำท�&ท�าให์�เก ดโรัคมะเรั3ง (Rous sarcoma, Avian myeloblastosis, Raucher murine leukemia), ไวิรั�สำท�&ท�าให์�เก ดโรัคเอดสำ (HIV)

32

RNA dependent DNA polymerase

retrovirus RNAreverse transcriptase (RNA depentdent DNA polymerase)

RNADNA

สำลายสำ�วินีท�&เป1นี RNA ออกไป โดย RNaseH

DNADNA

การัสำ�งเครัาะห์ DNA ท�&ใช� RNA เป1นี template

33

34

DNA REPLICATION

สำรั"ป : ป4จจ�ยสำ�าค�ญท�&ใช�ในีการัสำ�งเครัาะห์ DNA ในี prokaryote

• DNA template

• dNTP : dATP, dGTP, dCTP และ dTTP

• RNA primer :- polyribonucleotide สำายสำ�(นีๆ- ใช�เป1นีจ"ดเรั &มติ�นีการัสำ�งเครัาะห์ DNA

• Enzyme และ protein ชนี ดติ�างๆ เช�นี DNA polymerase, DNA ligase, DNA gyrase, primase, SSB, DnaC เป1นีติ�นี

• พัล�งงานี (ในีรั ป ATP) ท�&ใช�ในีการัคลายเกล�ยวิและติ�อสำาย DNA

Telomere shortening and telomerase• Telomere ค)อ DNA สำ�วินีท�&อย �ปลาย chromosome

• โดยท�&วิไป DNA replication จะเก ดในีท ศทาง 5’ 3’ เท�านี�(นี ด�งนี�(นีเม)&อเก ด DNA replication ติ�อไปเรั)&อยๆ จะท�าให์�ปลาย chromosome ด�านี 5’ สำ�(นีลงเรั)&อย ๆ เรั�ยกวิ�า telomere shortening ซ่'&งอาจท�าให์�สำ ญเสำ�ย gene ท�&อย �ใกล� telomere

35

36

การัถ่อดแบับั DNA ของโครัโมโซ่มท�&เป1นีเสำ�นีติรังได�เป1นีสำาย DNA ให์ม� 2 สำาย ค)อ สำาย leading และ สำาย lagging

3' 3' 3' 3'5'5' 5' 5'

Parental Leading

Parental Lagging

New DNA

Area where gap is generated upon replication

37

• Telomerase เป1นี enzyme ท�&ท�าห์นี�าท�&รั �กษา telomere ไม�ให์�ห์ดสำ�(นีลง

• Telomerase ปรัะกอบัด�วิย RNA oligonucleotide ท�&ท�าห์นี�าท�&เป1นี template และเอนีไซ่ม reverse transcriptase ท�&สำามารัถ่สำ�งเครัาะห์ DNA จาก RNA ได�

• ในีบัรั เวิณ telomere ของมนี"ษย จะม� tandem repeat ของ AGGGTT ซ่'&ง telomerase จะเพั &มสำ�วินี tandem repeat เข�าไป เพั)&อท�&จะให์�เป1นี template ให์� primer เข�ามาจ�บั ผลท�&ได�ก3ค)อ DNA ท�&สำ�งเครัาะห์ข'(นีมาจะม�ควิามยาวิเท�าเด มห์รั)อไม�ห์ดสำ�(นีลงเม)&อม� DNA replication

38

Telomerase

Telomere shortening and telomerase

AGGGTT AGGGTT AGGGTT

TCCCAA

Parental strand Short repeats making up telomere

3'

Newly synthesized lagging strand1 Telomerase

binds

AGGGTT AGGGTT

TCCCAA

AGGGTT AGGGTT

UCCCAA

2 Telomerase extends 3' end

RNA template

Telomerase

reverse transcriptase

New telomere repeat

UCCCAA

AGGGTT AGGGTT AGGGTT

TCCCAA

AGGGTT

3 Telomerase released

Extended telomere permits completion of lagging strand

AGGGTT AGGGTT AGGGTT

TCCCAA TCCCAA UCCCAA

4 Primer is bound.DNA polymerase completes lagging strand

Primer

DNA polymeraseAGGGTTAGGGTT

39

Telomerase

• ในีเซ่ลลบัางชนี ดท�&ติ�องม�การัแบั�งติ�วิอย�างติ�อเนี)&อง เช�นี germ cell จะม�เอนีไซ่ม telomerase ป6องก�นีการัเก ด telomere shortening

• สำ�วินี somatic cell ไม�ม� telomerase ด�งนี�(นี เม)&อเซ่ลลผ�านีวิงจรัการัแบั�งติ�วิมาถ่'งจ"ดห์นี'&งท�& telomere สำ�(นีลงมาก เซ่ลลนี�(นีก3จะแก� และติาย

• ควิามผ ดปกติ ในีการัท�างานีของ telomerase สำ�งผลให์�เก ดโรัคได� เช�นี การัท�างานีไปมาก telomerase ท�าให์� cell ไม�ติายซ่'&งพับัได�ในี cancer cell บัางชนี ด

• ป4จจ"บั�นีม�การัพั�ฒนีาสำารัท�&ย�บัย�(งการัท�างานีของ telomerase มาใช�รั�กษามะเรั3งบัางชนี ด

40

Telomere shortening and telomerase

DNA repair

41

Damage to DNA

• Force distortion, bending, breaking

• X-rays, γ -rays , ionized radicals

• activated oxygen

• ultraviolet light - thymine dimer

• intercalation, cross-link by foreign compound (some chemicals, drugs)

• accident of replication

• spontaneous decay of DNA (loss of base)

42

Mutation• base substitution

– transition : Pu1 Pu2, Py1 Py2

– transversion : Pu Py, Py Pu

• frameshift mutation– deletion– Insertion

ATC GTA TTA ATA …

ATC GTA TTA ATA …

ATC GAT TAA TA …

ATC GTT ATT AAT A..

T

43

AGCTA

TCAAT

AGCTA

TC

AT

AGCTA

TCTAT

AGC

TA

TCG

AT

C

(G) (G)

transition

deletion

transversion

insertion

44

Gene mutation

• missense mutation : base substitution ท�าให์� mRNA เปล�&ยนีไป (รัห์�สำของ amino acid เปล�&ยนีแปลงไป ) ท�าให์�โปรัติ�นีผ ดปกติ

• nonsense mutation : ถ่�า codon ซ่'&งเคย code ให์� amino acid เปล�&ยนีไปเป1นี stop codon ท�าให์�ได� polypeptide สำายสำ�(นีลง อาจจะไม�สำามารัถ่ท�าห์นี�าท�&ได� (truncated polypeptide chain)

• silent mutation : mutation ไม�ม�ผลติ�อ function ของ gene ห์รั)อย�งคง code ให์� amino acid ติ�วิเด ม ท�าให์�โปรัติ�นีชนี ดเด ม เช�นี AAA (Lys) AAG (Lys)

45

Trinucleotide repeat expansion (triplet repeats)

• การัเก ดข'(นีซ่�(า ๆ ก�นีของ nucleotide 3 ติ�วิ ท�&พับับั�อยค)อ CGG, CAG และ CTG

• Triplet repeat อาจอย �ใกล�ก�บั gene ห์รั)ออย �ในี gene

• ม�กท�าให์�เก ดโรัคทางรัะบับัปรัะสำาท

• ติ�วิอย�างโรัคท�&เก ดจาก triplet repeat ได�แก� fragile-X symdrome, spinobulbar muscular dystrophy, myotonic dystrophy และ Huntington’s disease

46

47

Fragile-X syndrome

• เก ดจากควิามผ ดปกติ ท�& FMR-1 gene

• คนีปกติ จะม�จ�านีวินี triplet repeat CGG มากสำ"ดปรัะมาณ 50 copies แติ�ในีผ �ป:วิยจะม�จ�านีวินี copies มากกวิ�า 200 copies

• ท�าให์�เก ด mental retardation

• ผ �ป:วิยท�&ม�จ�านีวินี CGG copy repeat มาก จะม�อาการัท�&รั"นีแรังกวิ�าผ �ป:วิยท�&ม�จ�านีวินี copies นี�อย

48

Fragile X syndrome 49

DNA repair

• เซ่ลลท"กเซ่ลลจะม�รัะบับั DNA repair เนี)&องจากขบัวินีการั DNA replication ม�โอกาสำท�&จะเก ด mispaired base ข'(นีมาได�

• โดยท�&วิไป การัซ่�อมแซ่ม DNA จะเรั &มติ�นีด�วิยการัติ�ด DNA ท�&ผ ดปกติ ออกไป จากนี�(นี DNA polymerase จะเติ ม nucleotide ให์ม�เข�าไปโดยใช� DNA ท�&ปกติ ของอ�กสำายห์นี'&งเป1นี template แล�วิป;ดช�องวิ�างท�&เห์ล)อด�วิย DNA ligase

• DNA repair systems : – Mismatch repair– Base-excision repair– Nucleotide-excision repair– Transcription-coupled repair

50

OH P

OH P

Normal DNA

Damaged DNA

DNA with damaged region

removed

Repaired DNA (normal)

Endo and exonuclease

s

Repaired DNA

polymerase

DNA ligase

Common steps in DNA repair mechanisms.

excinuclease

Nick

51

Mismatch repair

• โดยท�&วิไป DNA ท�&เป1นี parental strand จะม� methyl group เกาะท�&เบัสำ แติ� daughter strand จะย�งไม�ม�การัเติ ม methyl group ท�&เบัสำของม�นี

• Daughter strand บัรั เวิณท�&ม� mismatched base จะถ่ กติ�ดออกไปและม�การัเติ มเบัสำท�&ถ่ กติ�องเข�าไปแทนี

• ติ�วิอย�างโรัคท�&เก ดจาก mutation ของ mismatch repair gene ได�แก� hereditary nonpolyposis colorectal cancer

52

CH3 CH3

CH3 CH3

3'

5'

5'

5'

5'

3'

3'

3'

methylated parental strand

unmethylated newly- synthesized strand

DNA segment replaced

Mismatch repair

53

Base-excision repair

• ซ่�อมแซ่มควิามผ ดปกติ ของเบัสำท�&ผ ดไปเพั�ยงห์นี'&งเบัสำ

• DNA glycosylase จะติ�ด N-glycosidic bond ท�&เช)&อมรัะห์วิ�างเบัสำท�&ผ ดปกติ ก�บั deoxyribose ท�าให์�ขาดเบัสำท�&ติ�าแห์นี�งนี�(นี เก ดเป1นีช�องวิ�างเรั�ยกวิ�า AP (apurinic ห์รั)อ apyrimidic) site

• AP endonuclease จะติ�ดสำายท�&ม� sugar-phosphate ออก ห์ล�งจากนี�(นีจะใช�เอนีไซ่มอ)&นีมาซ่�อมแซ่มบัรั เวิณด�งกล�าวิ

54

Nucleotide-excision repair

• การัซ่�อมแซ่มโดยใช�เอนีไซ่ม endonuclease ติ�ด DNA บัรั เวิณท�&ผ ดปกติ เก ดเป1นีช�องวิ�าง แล�วิอาศ�ยเอนีไซ่มอ)&นีซ่�อมแซ่ม

• เอนีไซ่มท�&สำ�าค�ญในีขบัวินีการันี�(ม� 4 ชนี ด ค)อ Uvr ABC exinuclease (excision nuclease : ติ�ดสำ�วินีท�&ม�ควิามผ ดปกติ ออก), Uvr D (helicase : คลายเกล�ยวิ DNA), DNA polymerase I (เติ ม nucleotide โดยใช� DNA อ�กสำายเป1นี template) และ DNA ligase (เช)&อมปลายเข�าด�วิยก�นี )

• ติ�วิอย�างของควิามผ ดปกติ ท�&ใช�การัซ่�อมแซ่มวิ ธ์�นี�( ค)อ pyrimidine dimer

55

Repaired (normal) DNA

Normal DNA

Damage to

basesglycosylase

incision endonuclease

excision endonuclease

DNA polymerase

DNA ligase

AP site

base excision repair

AP site – Apurinic site – Apyrimidinic site

nucleotIde excision repair56

N

N

O

O

H CH3

H

deoxyribose

P

N

N

O

O

H CH3

H

deoxyribose

P

N

N

O

O

H CH3

H

deoxyribose

N

N

O

O

H CH3

H

deoxyribose

P

P

U.V.

การัเก ด thymine dimer

(cyclobutane ring) เม)&อ DNA ถ่ กแสำง UV

57

thymine dimer

58

Repair of thymine dimerRepair of thymine dimer5'

3'

3'

5'excision of a 12 nt fragment by Uvr ABC excinuclease

DNA synthesis by DNA polymerase 1

joined by DNA ligase

59

Transcription-coupled repair

• การัซ่�อมแซ่มควิามผ ดปกติ ของ gene ในีขณะท�&ม�การัสำ�งเครัาะห์ mRNA

• RNA polymerase จะห์ย"ดการัท�างานีเม)&อม�นีมาถ่'งบัรั เวิณท�&ม�ควิามผ ดปกติ ของ DNA template

• จากนี�(นีโปรัติ�นีท�&ท�าห์นี�าท�& excision repair จะซ่�อมแซ่ม DNA บัรั เวิณนี�(

• เม)&อซ่�อมแซ่มเสำรั3จแล�วิ RNA polymerase จะท�างานีติ�อติามปกติ

60

Direct repair

• การัซ่�อมแซ่ม DNA โดยไม�ติ�องติ�ดเบัสำห์รั)อนี วิคล�โอไทดออก

• พับัในี bacteria ไม�พับัในีมนี"ษย

• ติ�วิอย�างได�แก� การัซ่�อมแซ่ม cyclobutane pyrimidine dimer โดยเอนีไซ่ม photolyase (photoreactivating enzyme) และ visible light ติ�ด dimer โดยไม�สำลาย phosphodiester bond

T TAA

^

T TAA

photoreactivating enzyme (photolyase)and visible light

61

DNA repair defect

• ท�าให์�เก ดโรัคทางพั�นีธ์"กรัรัมได�ห์ลายโรัค

• ติ�วิอย�างโรัคท�&เก ดจากควิามผ ดปกติ ของ DNA repair

– Xeroderma pigmentosum

– Chromosomal breakage syndrome• Bloom’s disease• Fanconi anemia• Progeria

62

Xeroderma pigmentosum

• Defect in excision repair (exinuclease)

• Prevalence 1 : 250,000

• ผ �ป:วิยจะไวิติ�อ UV light (UV light hypersensitivity)

• ผ วิห์นี�งของผ �ป:วิยจะแห์�ง (dry skin) อาจพับั skin atrophy, keratosis, ulceration และ skin carcinoma (cancer) ได�

• ท�&ติาอาจเก ด corneal ulcer (แผลท�& cornea)

• การัป6องก�นี : ห์ล�กเล�&ยงการัถ่ กแสำง UV เช�นี สำวิมเสำ)(อผ�าม ดช ด ใช�ครั�มก�นีแดด ใช�แวิ�นีก�นีแดด

63

RECOMBINATION REPAIR (post-replication RECOMBINATION REPAIR (post-replication repair)repair)

Replication

Recombination repair

Fill in and ligation

DNA containing a pyrimidine dimer

Damaged parental strand

Gapped daughter strand

Normal duplex DNA

Damaged parental strand

Gapped parental strandNormal daughter strandRepaired daughter strand

DNA containing a pyrimidine dimerNormal duplex DNA

5'

5'3'3'

64