Download - 指導教授:吳文海 教授 研 究 生:黃柏智 報告日期: 2009/11/25
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指導教授:吳文海 教授研 究 生:黃柏智報告日期:2009/11/25
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大綱 前言
實驗藥品
實驗步驟
結果與討論
結論
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前言 Liposome 是脂質空心微球,懸浮於水相中。 磷脂分子之磷酸端為親水性,脂質端為疏水性,由此所形成
的脂質層雙面為親水,內層為疏水膜。 水溶性物質 ( 藥物 ) 可包在球心之溶液,油溶性物質可夾在
球皮膜層中,由此 Liposome 可當作水性物質及油性物質之載體。
Liposome 立體示意圖
親水區域
疏水區域
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藥物載體的特性
這些特性可由 Liposome 下列組成來達到 :1.HSPC :Liposome 的主要組成成份,其所形成之單層 Liposome 其粒徑約為 123.8nm( 腫瘤血管壁間隙約 500nm) 。2. 膽固醇 : 膽固醇能幫助膜結構的黏合,同時減緩膜滲透的速 率,降低藥物洩漏率。3.DSPE-PEG :PEG 的長鏈可以增加 Liposome 周圍的立體障礙,防 止血液中的抗體辨識 Liposome ,增加Liposome 在體 內的循環時間 。4.RGD :RGD 胜肽對癌症血管內皮細胞上的 αvβ3 細胞受體 有高度專一結合性,增加 Liposome 對癌細胞的選擇性。
做為一個良好之藥物載體必須具備以下特性 :1. 較小之粒徑以通過血管壁間隙進入細胞2. 低藥物洩漏率3. 可長時間在體內循環4. 高度的細胞選擇性 ( 對癌細胞的選擇性 )
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LCL 結合 RGD 胜肽RGD-LCL
RGD-LCL : RGD- 長效性微脂體 (LCL : Long circulating liposomes)
DSPE-PEG-Mal 與 RGD 結合
RGD 上的硫醇基在室溫以及 pH6.5-7.5 下與 Maleimide 結合
膽固醇在脂質層的排列方式
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藥物的作用機制=RGD-LCL
RGD - LCL 通過血管間隙,與腫瘤內皮細胞上的 αvβ3 受體結合,釋放出Combretastatin A4藥物破壞腫瘤血管細胞之吸收,使腫瘤無法得到養分。
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實驗藥品
Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC)
氫化大豆卵磷脂
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho- ethanolamine-N-[Polyethylene glycol] (DSPE-PEG)
二硬脂酸磷酸脂乙醇胺氮聚乙二醇
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實驗藥品 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-
ethanolamine-N-[ Maleimide Polyethylene glycol] ( DSPE-PEG-Maleimide)
Cholesterol
膽固醇
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實驗藥品 Combretastatin A4
cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys](RGD 胜肽 )
cholesteryl [4-14C] oleate
油酸膽固醇酯 [ 碳 -14]
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實驗步驟 (LCL)HSPC :325μmolCholesterol :150μmolDSPE-PEG :25 μmolDrug :100μmol
混合溶解於 chloroform : methanol(9:1 vol:vol) 溶液中
旋轉蒸發法去除溶劑形成脂質薄膜
溶於 50mM HEPES +150mM Nacl buffer(pH6.5) 中
與 50mM HEPES +150mM Nacl buffer(pH6.5) 在 62℃進行水合 2 小時
擠壓 Liposome 通過小孔徑PC 膜,使多層 Liposome 破裂重組成單層 Liposome
形成多層 Liposome
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實驗步驟 (RGD-LCL)HSPC :325 μmolCholesterol :150 μmolDSPE-PEG :24.5μmolDSPE-PEG-Mal:0.5 μmolDrug :100 μmol
由上述方法製備出單層 Liposome
加入 0.1ml 之 0.27 mol RGD( 溶於 PH 6.5 之 50mM HEPES buffer)
在室溫靜置 12 小時,反應生成RGD-LCL
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結果與討論RGD
RGD-LCL
過量 RGD+RGD-LCL
游離之 RGD peak 落在 14 min 的位置
只有 Liposome 的 peak 代表RGD 全部與 Liposome 上之 Maleimide 結合
有 Liposome 和 RGD 的peak 代表 RGD 與Maleimide 之鍵結已飽和
RGD-LCL
由此可證實 RGD 與 LCL 結合
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觀測 Liposome 形狀及粒徑
由光學顯微鏡及 TEM 來觀察多層 Liposome 及單層Liposome
粒徑約為3~7μm
粒徑約為123.8nm
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動態光散射法測定粒徑可使用動態光散射法測定 Liposome的平均粒徑及分佈
可由粒徑判斷經過擠壓後之 Liposome 為多層 Liposome 或單層 Liposome ,以及粒徑之分布情形。
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Liposome配方改變的影響
改變 Liposome 成分之比率、濃度以及藥物和脂質的比率,探討Combretastatin A4 的濃度及包覆率。
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Liposome配方改變的影響配方 配方比率 濃度
(mM)藥物 :脂
質包覆藥物濃度(mg/ml)
包覆率
C 65:30:5 100 20:100 1.55 84.26
D 95:0:5 100 20:100 5.68 95.74
E 50:45:5 100 20:100 0.77 68.30
F 62.5:30:7.5 100 20:100 1.81 89.36
配方 配方比率 濃度(mM)
藥物 :脂質
包覆藥物濃度(mg/ml)
包覆率
A 65:30:5 60 20:100 0.78 71.11
C 65:30:5 100 20:100 1.55 84.26
G 65:30:5 200 20:100 2.11 92.85
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Liposome配方改變的影響配方 配方比率 濃度
(mM)藥物 :脂
質包覆藥物濃度(mg/ml)
包覆率
B 65:30:5 100 10:100 1.05 88.02
C 65:30:5 100 20:100 1.55 84.26
G 65:30:5 200 20:100 2.11 92.85
H 65:30:5 200 40:100 2.99 80.95
上述表格顯示最好的配方為D,其次為G、F、C。
G的配方由於所需 Liposome 濃度較高 ( 2倍),成本較高 , 且包覆藥物濃度並未顯著增加 ( 約為 C 的 1.36 倍 ) ,故不予考 慮。
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體外藥物洩漏率測試左圖顯示:在48小時 後F以及D的包覆率低 於80% ,同時有下降 的趨勢。而C之 LCL 及 RGD –LCL 均在 80% 以上 並且下降趨勢不明顯, 符合 Liposome 需在體內 長時間循環之要求。
由上表及左圖的結果判斷 : C 為 Liposome最佳化配方。 (C = HSPC:Chol:DPSE- PEG = 65:30:5 ,濃度 100mM ,藥物 : 脂質之莫 耳比率為 20:100)
藥物包覆率
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Liposome 與細胞結合率
以油酸膽固醇酯 [ 碳 -14] 進行放射標誌放射性越高代表細胞結合之 Liposme越多
IL-1β 為一種信號分子,可促進發炎反應使細胞表現 αvβ3 -integrin receptor( 一種細胞受體(cell adhesion receptor ,對RGD 有高度專一結合性 ) 。
RGD-LCL 結合量約為LCL 的四倍 !
580
800
310
1120
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Liposome V.S. 細胞 : 擴散 or 內吞
3:1
2:1
3:1
1.6:1
擴散
內吞
若 Liposome 黏附於細胞表面,擴散傳播較易發生。若 Liposome連接於細胞受體上,內吞及擴散傳播發生比率接近。
加入 Trypsin 破壞LCL 與細胞之間的結合
LCL+細胞
LCL
細胞
離心
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加入過量 RGD 對細胞結合的影響加入過量 RGD 證實 Liposome 主要是由
RGD 與 αvβ3 受體之作用結合
IL-1β細胞
= αvβ3 細胞受體= RGD - LCL
= RGD
RGD-LCL
IL-1β細胞
RGD-LCL+Free RGD
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結論RGD-LCL 對腫瘤血管細胞之結合,主要是由 RGD 對 αvβ3 細胞受體作用而結合。
RGD-LCL 相對 LCL 來說,對腫瘤血管細胞有高度 選擇性,可以減少對正常細胞的傷害並提高治療 效率。
RGD-LCL 包覆藥物濃度最高可以達到 2.99 mg / ml ,而成本效益比最佳的 RGD-LCL 藥物濃度為 1.55 mg/ml ,可因應不同情況來選擇藥物濃度。
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謝謝各位的聆聽
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旋轉蒸發儀
接真空幫浦
收集溶劑
持續旋轉使脂質形成均勻薄膜
恆溫水槽
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微孔擠壓機
通入氮氣給予壓力
加入 Liposome 懸浮溶液
通過小孔徑的 PC (poly carbonate) 膜過濾膜的孔徑分別為0.8 、 0.4、 0.2、 0.1μm
擠壓後的 Liposome溶液流出
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Liposome 的合成溶於非極性溶劑 溶於含有藥物的極性溶
液並給予能量 (震盪、超音波等等… )
用旋轉蒸發儀將溶劑蒸發,使其在圓底燒瓶上形成均勻的脂質膜。
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Liposome 的藥物傳播
內吞作用(Uptake)
擴散作用(diffusion)
Liposome 的藥物傳播藉內吞作用以及擴散作用來傳送到細胞內部。