Download - Новые возможности платформ для полногеномного секвенирования и анализа биочипов высокой плотности
Нов е воз о ос а фор я о о е о о оНовые возможности платформ для полногеномного секвенирования и анализа биочипов высокой плотности
Иллюмина
Егоров Николай
Менеджер проектаМенеджер проекта
по секвенированию и биочипам
Казань, 13.09.2011
Секвенирование сегодня: Новые горизонты
ВОЗМОЖНОСТЬ ГЛУБОКОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ МНОЖЕСТВА КРУПНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ ГЕНОМОВ И ТРАНСКРИПТОМОВКРУПНЫХ, КОМПЛЕКСНЫХ ГЕНОМОВ И ТРАНСКРИПТОМОВ
СОСТАВЛЯЕТ ОСНОВУ КРУПНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ КАНЦЕРОГЕНЕЗА И ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ЛЕЖИТ В ОСНОВЕ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ МЕДИЦИНЫ
ПОЗВОЛЯЕТ ОСУЩЕСТВЛЯТЬ DE NOVO СЕКВЕНИРОВАНИЕ:
ЧеловекаРастенийЖЖивотныхОбъектов потребительской геномики
Рак смертелен
ДиабетВсе остальные
Причины смерти(USA, 2003)
Инсульт (stroke)Респ.заболевания
Сердце97.4%
Рак
Аварии, происшествия
Source: TIME, December 4, 2006, citing CDC and National Transportation Safety Board
Уровень смертности * из-за Онкологии и Болезней Сердца в период с 1975 по 2004 годыВ войне против рака мы проигрываем
Уровень смертности из за Онкологии и Болезней Сердца в период с 1975 по 2004 годы
Copyright ©2008 American Cancer Society
Jemal, A. et al. CA Cancer J Clin 2008;58:71-96.
…но помощь близкаЧем более разнообразны терапии и подходы тем больше выбора
96
97
145
Lung
Unspecified Cancers
Solid Tumors
50
210
Infectious Disease
Cancer
Чем более разнообразны терапии и подходы, тем больше выбора
66
79
79
89
96
ColoRectal
Breast
Prostate
Leukemia
Lung
22
22
44
HIV
CVD
AutoImmune
42
46
51
54
66
P ti
Skin
Other Cancers
Lymphoma
ColoRectal
15
17
18
Diabetes
Neurological Disease
Other
36
37
37
39
42
O i
Brain
Kidney
Cancer-Related Conditions
Pancreatic
10
13
14
Blood Disorders
Respiratory Disease
Digestive Disorders
23
25
31
36
Stomach
Liver
Head/Neck
Myeloma
Ovarian
6
7
9
10
E C diti
Skin Disorders
Genetic Disorders
Blood Disorders
10
11
16
17
Sarcoma
Bladder
Cervical
Stomach
4
4
6
Transplantation
Growth Disorders
Eye Conditions
Source: PhRMA: 2006 Medicines in Development Biotechnology
Рак – это война на множестве фронтовAnnual Age-adjusted Cancer Death Rates* Among Males for Selected Cancers, United States, 1930 to 2004
Copyright ©2008 American Cancer Society
From Jemal, A. et al. CA Cancer J Clin 2008;58:71-96.
Инициатива Illumina б б бпо борьбе с онкологическими заболеваниями
Три Основные Подхода
• Идентификация маркеров ранней детекции для популяций и отдельных групп рискапопуляций и отдельных групп риска
• Идентификация маркеров эффективности терапии
• Идентификация маркёров прогнозирования заболевания
Основные три приоритетные области компании Illuminaкомпании Illumina
100
ость
100
80
90Testis
Thyroid
Breast
значим
олечени
я)
60
70 Melanoma
Bladder
Thyroid
Prostate
Colon/ rectum
ическая з
(% успеха л
40
50Kidney
Cervix/ UteriOral
NHLOvary
CNS
Nasopharynx
Stomach
Клин
и
20
30
Esophagus
Myeloma LeukemiaBrain
CNS
Lung
0 6 8 10 12 140
10
2 4
Pancreas Liver
Source: WHO
Превалирование(% от общего количесва онкологич.заболеваний)
Проект Apollo – Изучение новых биомаркёровpSamples Discovery Validation Translation Clin Studies Dx Service
Targeted Seq300 FFPE Tumor RNA/
DNA/ normal
Frozen 25Tumor/Normals
WGS, RNA, Methylation 25Tumor/Normals
10 Cases/20 ControlsBlood, Tumor, Pap,
Proximal Fluids
Expanded clinical studies on preferred
body fluid
CLIA lab service offering
25/25 268candidate genes
490 samples received 123 sequenced
Яичники
7 tumor2 controlsFound CTC’s in 2/5
23/23 266
Желудок
15023/23 266Candidate genes
Кишечник
150samples received SAB 6/2/11 at ASCO
25/25 Sequencing complete analysis in progress
Растения и животные представляют огромныйРастения и животные представляют огромный генетический потенциал
Fig, 3I. Different types of corn. A. King Philipp, variety of flint corn. B. Giant yellow dent corn, C. Rice popcorn. D. Dwarf popcorn.
From: Plant Breeding, Hugo DeVries, 1907
И отличаются огромной вариабельностью.И отличаются огромной вариабельностью.
11
Генетический подход д д‐ это революция в растениеводстверастениеводстве
Потребности
► Улучшение потребительских качеств
► Засухо‐, стрессоустойчивость► У й б► Устойчивость к заболеваниям и пестицидам► Повышение требований к качеству► Значительное увеличение населения 8млрд+ к
2025
Sources: Syngenta Agflation Point (Bear Stearns); United Nations Population Fund
ЖЖивотноводство –неограниченные перспективыр р
Потребности
► Потребность в высококачественной, питательной пище
► Пониженное /локализованное жиросодержаниеПониженное /локализованное жиросодержание► Устойчивость к болезням и инфекциям► Селекция► Значительное увеличение населения 8млрд+ к► Значительное увеличение населения 8млрд+ к
2025Sources: http://animalid.aphis.usda.gov/nais
Малые геномыМалые геномы$60‐100/бактериальный геном
При работе на HiSeq 20002000 бактерий/запуск125 бактерий/на лунку
Genome sequence of the polymyxin‐producing plant‐probioticrhizobacterium Paenibacillus polymyxa E681.
История секвенирования ДНКр р ДВ 1953, James D. Watson и Francis Crick – двойная спираль ДНК ( Nature)
70е‐90е гг ‐ бурное развитие технологии
спираль ДНК ( Nature).
1968 – первый сиквенс ДНК
70е‐90е гг бурное развитие технологии секвенирования по Сэнгеру (Sanger)
1991 г. – начало Human Genome Project.Государственный проект Human Genome ProjectГосударственный проект Human Genome Project против частного проекта Celera Genomics. 2001 Первые грубые данные о секвенировании генома человека
2006 – новое поколение секвенаторов NGS, закат эры капиллярных секвенаторов
Ближайшая перспектива 1000 USD за геном
2007 ‐ технология Solexa. Cиквенс методом синтеза
Ближайшая перспектива 1000 USD за геном
Полногеномное секвенирование
Craig Venter$20M+ Capillary
Watson$2M
3+ genomes$200K/геном
Personal genome~ $50K/геном
Human genome~ $5K/геномp y
electrophoresis
2006
$454
2007
$ /GA
2008
$ /GAIIx
2009
$ /HiSeq 2000
2011
Бесперецендентный рост производительности секвенаторов Illuminaр
Gb/ run
G
Year4104 увеличение производительности за 5 лет
КомпанияКомпания IlluminaIllumina
Illumina в миреIllumina в миреIllumina BV(Нидерланды)
Illumina Китай(Пекин)
Illumina Кембридж
( д р д )
Россия
Illumina Хейвард(Хейвард, Калифорния)
Главное управлениеIllumina
Illumina Восток(Валингфорд, Коннектикут)
Кембридж
Illumina KK (Токио)ДжинанЧенгду
Корея
ШанхайИндия Т й
Турция
Персидский залив
Израиль
Illumina(Сан Диего,
Калифорния)
Illumina Сингапур
Индия
Малайзия
ВьетнамТайландТайваньПерсидский залив
Австралия Новая Зеландия
Южная Африка
Компания основана в 1998 году штаб-кватрира –КоммерческийПроизводство/исследования и разработкиПартнеры
Компания основана в 1998 году, штаб-кватрира –San-Diego, СШАДважды становилась №1 в рейтинге Forbes как наиболее быстро развивающаяся технологическая компания - 2007 и 2009; в 2008 попала в рейтинг NASDAQ 100
19
NASDAQ-100 Сейчас – более 2000 сотрудников
Миссия компанииИнновационные разработки будущего в области генетического анализаИнновационные разработки будущего в области генетического анализа
От исследования генома человека…
до валидации новых мишеней…
Задача компании Illumina состоит в достижении лидирующих позиций при разработке комплексных решений в области генетики и здравоохранения
Сегодня компания Illumina предлагает:
Генотипирование Анализ геннойэкспрессииСеквенирование Молекулярную
диагностикур д у
• Комплексное изучение генома
• Применение НИР
П
• Профиль экспрессии
• Ресеквенирование• Выявление редких у
человека• Исследование биомаркеров и их валидация
• Продукты домашнего приготовления (Homebrew)
• Диагностика сопутствующих
экспрессии• Поиск биомаркеров и их валидация
• Выявление ассоциированных
• Выявление редких вариантов
• Цифровое изображение картин экспрессии генов
• Определение • Эпигенетические исследования
• Проведение клинических экспериментов
сопутствующих заболеваний
• Стандартный скрининг
• Выявление
заболеваний• Проведение клинических экспериментов
р дтранскриптов
• Секвенирование продуктов CHiP
• Mетиллированиеэкспериментов
• Продукты AgBio• Потребительские услуги
инфекционных заболеваний
• Метиллирование de novo• Продукты AgBio
Персонализированная медицина
Подход компании – интеграция различных решений геномного анализа
От открытий в масштабах полного генома к валидации мишеней и скринингуОт открытий в масштабах полного генома к валидации мишеней и скринингуОт открытий в масштабах полного генома к валидации мишеней и скринингу От открытий в масштабах полного генома к валидации мишеней и скринингу
SequencingSequencing ArraysArrays qPCRqPCRSequencingSequencing ArraysArrays qPCRqPCR
HiScanSQUnique combination
HiSeq 2000Redefining the
HiSeq 2000Redefining the
HiScanSpeed, quality and
tilit f
HiScanSpeed, quality and
tilit f
BeadXpressAccuracy, versatility and flexibility for
BeadXpressAccuracy, versatility and flexibility for
EcoGold‐standard qPCR
EcoGold‐standard qPCR
Genome Analyzer IIxGenome
Analyzer IIxMiSeq
My samples!of sequencing and
arraystrajectory of sequencingtrajectory of sequencing
versatility for arraysversatility for arrays and flexibility for molecular testingand flexibility for molecular testing
made accessiblemade accessibleMost widely adopted NGS platform
Most widely adopted NGS platform
My studiesMiseq
Единая платформа HiSeq2000 позволяет:
Секвенирование геномов р6!!! Человек
В 30x покрытии
Одновременно:
Проводить различные исследования с разной длиной чтения
АнализАнализ
Полногеномное секвенирование20 полногеномных
транскриптов
За четыре дня
Анализдо 10 метилом
За одну неделю
За один запуск прибора
Целевое ресеквенированиеЭкспрессия геновМетиллированиеЗа четыре дня
Профиль генной экспресии на 200
д у д
МетагеномикаСеквенирование de novo
Метиллирование
экспресии на 200образцах
Менее чем за 2 дняПолногеномные транскриптомы
ChIP-секвенирование
Секвенаторы IlluminaСеквенаторы Illumina 2000+ приборов
1 прибор1 прибор
Now…1 lab bench
1 HiSeq
Then…1.2 M bases/day/instrument
$1 2M for 1Gb raw data
1 Technician
25 G bases/day/instrument
$400 for 1Gb raw data$1-2M for 1Gb raw data $
Динамика числа публикаций ‐ NGS( ф )
1000
(только по данным, полученным на платформе Illumina)
800
900
600
700
400
500
200
300
0
100
Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3
2007 2008 2009 2010
Сколько стоит NGS?Изменение цены сиквенса полного генома человека как ц
универсального ценового индикатора $10 000 000$10,000,000
500-кратное уменьшение$1,000,000 уменьшение стоимости за 3
года! $100,000
$10,000
$1,000
2007 1G 2007 GA 2008 GAII 2009 GAIIx 2010 HiSeq 2011 HiSeq 2011 MiSeq00 G 2007 GA 008 G 009 G 0 0 Seq 2011 HiSeq 2011 MiSeq
Секвенатор под любые нуждыДве технологии в одной
платформеСамая
распространённая платформа
Персональный секвенатор
MiSeq
Самая мощная платформа
HiScanSQ MiSeqHiSeq1000HiSeq2000 GAМаксимальныйвыход
600 Gb(к концу года – 1ТБ)
300 Gb(к концу года – 1ТБ)
150 Gb 95 Gb > 1 Gb
К В сумме: 3 млрд 1 5 млрд 750 320 3 4
HiScanSQ MiSeqHiSeq1000HiSeq2000 GAIIx
Количество фрагментов Single Read
В сумме: 3 млрд.На лунку: 187 млн.
1.5 млрд.187
750 94
320 40
3.4 3.4
Количество фрагментов
6 млрд.374 млн.
3 млрд.374 млн.
1.5 млрд.188 млн.
640 млн.80 млн.
6.8 млн.6.8 млн.
Paired‐end
Необходимое кол‐во материала
Nextera 50 ng TruSeq100 ng –1 µg
50 ng100 ng – 1 µg
50 ng100 ng – 1 µg
50 ng100 ng – 1 µg
50 ng100 ng – 1 µg
Длина чтения 2 × 100 bp 2 × 100 bp 2 × 100 bp 2 × 150 bp 2 × 150 bp
Четыре основные стадии Секвенирование методом синтеза IlluminaСеквенирование методом синтеза Illumina
Упрощённая пробоподготовка
cBot Генерация кластеров HiSeq 2000 Секвенирование Обработка и анализ пробоподготовка данных
2‐ 6 часов 4 часа 1‐10 дней 7‐14 дней
Анализ данныхд
ПО, контролирующее работу HiSeq2000
CASAVA ВИЗУАЛИЗАЦИЯработу HiSeq2000
Генерирование РидовВыравнивание, вариации, сборка
GenomeStudio
Стадии секвенирования Illuminaд р5’3’
DNA(0.05‐1.0 μg)
C
CC
AA
TT GG
TGT
CCAA
AA
TT
TT
GG
G
GG
ACGATCAC
CC
TTGG
Single molecule array
CCGATCGA
Подготовка библиотеки СеквенированиеГенерация кластеров(1000х)5’
AA
1 2 3 7 8 94 5 6T G T A C G A T …
Обработка изображений Посл‐ть нукл‐ов
Разнообразие наборов для пробоподготовки
Sample Prep KitsSample Prep Kits
• Спецификация по типу исследованиятипу исследования
• Возможность мультиплексного
Геномная ДНК
Полногеномнаяэкспрессия
анализаДНК р
Экзомноеобогащение
РНК и микроРНК
ChiP‐SeqMate Pair
секвенирование(фрагменты 2‐5 kb)
Epicentre Nextera Технология подготовки библиотек для NGSТехнология подготовки библиотек для NGS
2 часа, одна пробирка, 50 нг ДНК
Flow CellFlow Cell
Поверхностьflow cellflow cell покрыта газонов парных олигов
Генерация кластеров:Гибридизация и комплиментарный синтезГибридизация и комплиментарный синтез
Сиквенсовый адаптер
3’ удлинение
Генерация кластеров:Денатурация 2‐цепочечной ДНК
Новая цепь
• Двуцепочечная молекула денатурирует Новая цепь
Первичная цепь
денатурирует
• Первичная цепь вымывается
• Новая цепь
сброс
• Новая цепь закреплена на поверхности проточной ячейкипроточной ячейки
Генерация кластеров:Ковалентно‐связанные одиночные молекулы разделены пространственно
Единичные молекулы рандомнорандомно расположены на внутренней поверхности
йпроточной ячейки
Генерация кластеров:ф
• Одноцепочечные молекулы становятся
Амплификация по типу мостов
у«мостиком» и гибридизуются на смежных олигах
• Затем происходит синтез новой цепи
Генерация кластеров:ф
Об й
Амплификация по типу мостов
• Образуется двуцепочечный мостик
Генерация кластеров:ф
• Цикл повторяется, пока не образуются структуры из
Амплификация по типу мостов
образуются структуры из множества мостов
Генерация кластеров:
• Структура моста денатурирует
• Результат: 2 копии ковалентно‐связанных одноцепочечных молекул
Генерация кластеров:
О• «Отстающая цепь» вымывается, остаётся толькоостаётся только «лидирующая»
Генерация кластеров:
Генерация кластеров:
• Свободные 3’ концы блокируются
• Сиквенсовый праймерпраймер гибридизуется на сиквенсовый
Сиквенсовый праймер
сиквенсовый адаптер
Амплификация кластеровф ц р
~1000 молекул на ~ 1 um кластерЗ ё б ДНК
100umу р
~7 миллиардов кластеров «Звёздное небо» из молекулярных кластеров ДНК
5’3’
Секвенирование путем синтеза (SBS)5’3’
Первое основание включеноЦикл 1: Добавить реагенты для секвенирования
Первое основание включено
Удалить невключившиеся основания
Детектировать сигнал
G
A
T
CG
TC
Детектировать сигналРазблокировать и снять флуоресцентную меткуT
PPP Основание Флюоресценция
T
C
G
ACG
A
TA
Ц 2 Д бG
G
T
AAT
CC
C
Цикл 2: Добавить реагенты для секвенированияи повторить
• Все 4 нуклеотида добавляются в одной реакцииG
C TAG
CG
Все 4 нуклеотида добавляются в одной реакции • Высокая точность• Секвенирование от основания к основанию
5’
G
TA • Не возникает проблем с гомополимерными
повторами
Технология Clonal Single Molecule Array (КлональнаяТехнология Clonal Single Molecule Array (Клональная амплификация на чипе )
>3,5 миллионов кластеров на проточную кювету MiSeqИ >1 5 млрд кластеров наИ >1,5 млрд кластеров на проточную кювету HiSeq
20 микрон20 микрон
47100 микрон
Типы чтений платформы Иллюмина
Библиотеки парноконцевых
Иллюмина
Библиотеки парноконцевых чтений (200 – 500 bp)
Хорошо работают для сиквенса больших и малых инсерций и делеций, инверсий и тп а также для некоторыхинверсий и тп, а также для некоторых видов повторов.
После завершения первого прочтенияПосле завершения первого прочтения матрица восстанавливается прямо в ячейке, и начинается чтение с другого конца фрагментаконца фрагмента. Так мы прочитываем один фрагмент 2 раза, и мы знаем, что эти 2 чтения получены с разных концов одного и того же участка.
Типы чтений платформы ИллюминаИллюмина
«Mate pair» библиотеки (2-5 kb) p ( )Для сборки генома de novo, идентификации больших
й бструктурных вариаций, сборке повторов
Эволюция приборов NGS на ф llпримере платформы Illumina
Все технологические этапы работы с пробами объединены в одном прибореВсе технологические этапы работы с пробами объединены в одном прибореВсе технологические этапы работы с пробами объединены в одном прибореГенерация кластеров
Флюидика для парно—концевых чтенийПервичный и вторичный компьютерный анализ
р руПервичный и вторичный компьютерный анализПо цене обычного секвенатора по Сенгеру
Illumina EpigenomicsГлубокое и быстрое изучение всех областей в полном геноме, транскриптоме и генной регуляциитранскриптоме и генной регуляции
ChIP-Seq
DNA SequencingTargeted ResequencingGenotyping arrays
ChIChIP Seq
Bisulfite SeqInfinium methylationGG meth on Veracode
yp g y
ChIP- mRNA-Seq
smRNA-seq
SesmRNA-seqExpression arrays
q
Transcriptome Epigenome Genome
HiScanSQ BeadXpress iScanHiScanSQGenome Analyser HiSeq 1000/2000 BeadXpress iScan
ДНК-секвенатор
Анализатор биочипов
Анализатор биочипов
Анализатор биочипов
+ДНК-секвенатор
MiSeq
НастольныйДНК-
секвенатор секвенатор биочиповбиочиповСиквенсовый
модуль
секвенаторсеквенатор
СеквенированиеАнализ
микроматрицр
Объединение технологий NGS и микрочипов высокой плотности
Технология BeadChipТехнология BeadChip
Приготовление микролунок с BeadChip
Кремниевое покрытие
Фото-устойчивый
Кремниевое покрытие
слой
Микролунки
2
2um
2um
2um
3.7um
Подготовка «бидов» и сборка чиповПодготовка «бидов» и сборка чипов.
Для каждого типа бидов – уникальный
олигонуклеотидолигонуклеотид
Пулы бидов = от 1536 до 100,000 типов
Случайное расположение на чипеСлучайное расположение на чипе
От 15 до 30 бидов каждого типа
Функциональная валидация чипаФункциональная валидация чипа
Sentrix® Bead DesignsSentrix Bead Designs
Universal Capture
Address (IllumiCode)23 b
ProbeAddressLocus-Specific
Bead Decoding Example: 16 Bead Types
Decoder Oligo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Example: 16 Bead Types
gDecode hyb 1Decode hyb 2
Decoder hybridization 2Decoder hybridization 1
От 6K до 5M SNP – Одна методика ‐ Infinium
Полногеномная амплификация
Геномная ДНК
TT TC CC
Фрагментирование ДНК
Гибридизация ДНК
Определение аллелей при помощи Технологии «Single Base Extension»
ddNTP
G G C T A A
Однонуклеотидное удлинениеdintrophenol-labeled ddNTPs
C
A
G
T
biotin-labeled ddNTPs
G G C T A AC C G A TT
Окрашиваниеstreptavidin-
green
anti-DNP-
C C G A TTred
anti-streptavidin-biotin
anti-Ab-DNPDNP
Усиление сигнала и визуализация
C C G A TT
INTE
NS
ITY
INTE
NS
ITY
INTE
NS
ITY
I
Анализ данных. Genome Studio
Анализ данных. Genome Studio: Наглядное и простое представление цитогенетических данныхд р р д ц д
KaryoStudio Cytogenetics Reportsy y g pIndication of
genome build and versions of
software
Information on found region Gene Information
Chromosome i f ti
Aberration informationdisplay
Cross-matches
Платформа iScan –биочипы высокой плотности
• Технология биочипов высокой плотностиплотности
• 2 вида чипов:
– Infinum – плотность 6К‐240К‐5М маркеров /чип
– GoldenGate – плотность 96‐6К маркеров/чипмаркеров/чип
• Производительность – 2‐12 образцов на чип
Технологическая платформа используется для высокопроизводительного анализа SNP; экспрессии генов; CNV (вариацию числа копий); генетическихполиморфизмов MHC, ассоциированных с заболеваниями; метилирования;
Есть панели на человека, мышь, овцу, лошадь, Custom‐панели
iScan with Autoloader2iScan with Autoloader2
Семейство биочипов Illumina. Цель: изучение человека
Семейство биочипов Illumina. Цель: изучение генома животных
The Omni Family of MicroarraysPowerful, flexible and additive arrays out to 5M markers per sample
Omni Express*
Omni1‐Quad Omni1S‐8 Omni2.5‐8 Omni2.5S‐8*Omni5‐Quad*
f , f y p p
Express* Quad*
The most optimalHighest‐throughput array with industry‐proven quality at an exceptional price.
Optimal combination of common SNPs, CNVs, and content
from 1kGP.
Takes researchers from Omni1/Express to 2.5M
The most optimal and comprehensive set of both common
and rare SNP content from the
~2M additional markers providing rare 1kGP
content
The ultimate GWAS tool providing near complete coverage of common and rare variation
1kGP rare variation
MAF > 5% MAF >2.5% MAF > 1%
* Available as semi-custom products
Биочиповые технологии iScan
HiScan or iScan
Infinium
GoldenGate
Gene Expression
74 COMPANY CONFIDENTIAL – INTERNAL USE ONLY74 COMPANY CONFIDENTIAL – INTERNAL USE ONLY
Технология GoldenGate: Biochemistry/Assay
• Allele specific extension and ligation
Diagram
• Allele‐specific extension and ligation
AG
illumiCode’ AddressAllele Specific
Universal PCR Sequence 1
Genomic DNA [T/C] Ligase [T/A]Polymerase
GpExtension &Ligation
PCR Sequence 1Universal
PCR Sequence 2Universal
PCR Sequence 3’
Технология GoldenGate: Biochemistry/Assay
• AmplificationDiagram
A illumiCode #561Amplification TemplateTemplate
PCR with Cy3 Universal UniversalPCR with
Common Primers
yPrimer 1
Cy5 Universal Primer 2
Universal Primer P3
Технология GoldenGate: Biochemistry/Assay
• Hybridization to Universal ArrayDiagram
illumiCode #561
illumiCode #217
illumiCode #1024
/\/\/\
/
/\/\/\
/
/\/\/\
/
#561 #217 #1024
/\/\/\
/
/\/\/\
/
A/A G/G C/TA/A G/G C/T
SNP #561 SNP #217 SNP #1024
G ld G t M th l tiGoldenGate MethylationAssay Chemistryy y
DNA Methylationy• Methyl group added to 5’ position of cytosine
• Catalyzed by DNA methyltransferases
• In mammals, occurs in CG dinucleotides
DNA Methylation changes in cancerDNA Methylation changes in cancer
Normal cell:
Cancer cell:
Cancer-associated CpG Island
Hypermethylation
Methylated CpGUnmethylated CpG
Совмещая технологии… HiScanSQ
Единственная в своём роде система совмещающаяS & S Единственная в своём роде система, совмещающая высокопроизводительный анализ биочипов и секвенирование нового поколения
Scan & Seq = HiScanSQ
HiScanSQВозможности сканера HiScanSQ– Загрузка и сканирование 4‐х биочипов в реальном времени
р
– Высокоточная оптическая система– 2 CCD камеры
Разрешение сканера 0,5 микронРазрешение сканера 0,5 микрон
Возможности секвенирования
Производительность данных– До 150 Gb за 1 запускБ 17 5 Gb– Более 17,5 Gb в день
Время 1 запуска– 1.5 дня при 1*36 bp SR – 8 дней при 2*100 bp PE
Плотность кластеров
– Более 1,5 миллиардов кластеров, прошедших фильтр и пригодных для анализа
CytogeneticsTumor Profiling S l t d y gg
Algorithms Cytogenetics
SelectedPublications
Algorithms y g
WGASWGAS/Algo WGASWGAS/Algo
www.illumina.com/publications
HiScanSQ BeadXpress iScanHiScanSQGenome Analyser HiSeq 1000/2000 BeadXpress iScan
ДНК-секвенатор
Анализатор биочипов
Анализатор биочипов
Анализатор биочипов
+ДНК-секвенатор
MiSeq
НастольныйДНК-
секвенатор секвенатор биочиповбиочиповСиквенсовый
модуль
секвенаторсеквенатор
Платформа BeadXpress –Суспензионные биочипы
• Биочиповая технология для больших потоков образцов – 96‐луночные плашки, 8‐луночные стрипы
• Мультиплексность – до ~386 образцов одновременно (технология штрих‐кодирования микрочастиц)
• Возможность работы с ДНК РНК и белкамиВозможность работы с ДНК, РНК и белками
• Готовые наборы VeraCode, и возможность создавать собственные наборы на основе этой технологии
• 2 флюорисцентные краски для 2 типов зондов• 2 флюорисцентные краски для 2 типов зондов
BeadXpress ReaderBeadXpress Reader
ASSAY BEAD KIT
SAMPLE PLATE
ASSAY
DATA & LOG FILES
CODE LIBRARY
INSTRUMENT SPECIFICATIONS
SAMPLE DELIVERY FORMAT Standard 96-well plate & Stripwell Plates
MULTIPLEXING PER SINGLE WELL 1 to 384MULTIPLEXING PER SINGLE WELL 1 to 384
THROUGHPUT 120 samples/hr at 10-plex80 samples/hr at 96-plex
DETECTION Optional 1 or 2 color detection
AUTOMATION Designed to be compatible with standard laboratory automationLIMS compatible
87
VeraCode Technology
CAPILLARY FORCE ATTRACTS BEADS INTO GROOVES
GROOVE PLATECROSS-SECTION
BEADS INTO GROOVES
BEADS FALLINTO GROOVE
PLATE
BEADS ALIGN TIGHTLY FOR OPTIMAL SCANNING EFFICIENCY
88
SCANNING EFFICIENCY
Code Detection
BEAD CCD LINE ARRAY
“READING”
220340440200290200290290200240180180160290390180340180
READINGBEAM
140
160
180200
utpu
t 240
290
utpu
t
290
340
390
utpu
t
140
160
180
utpu
t
190
240
utpu
t
140
160
180
utpu
t
190
240
utpu
t
190
240
utpu
t
140
160
180
utpu
t
160180200220
utpu
t
120
140
160
utpu
t
120
140
160
utpu
t 120
140
utpu
t
190
240
utpu
t
240
290
340
utpu
t
120
140
160
utpu
t 240
290
utpu
t
120
140
160
utpu
t6080
100
120
ADC
O90
140
190
ADC
O90
140
190
240
ADC
O60
80
100
120
ADC
O90
140
ADC
O60
80
100
120
ADC
O90
140
ADC
O90
140
ADC
O60
80
100
120
ADC
O6080
100120140
ADC
O60
80
100
ADC
O60
80
100
ADC
O60
80
100
ADC
O90
140
ADC
O90
140
190
ADC
O60
80
100
ADC
O90
140
190
ADC
O60
80
100
ADC
O
40
60
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
90
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
60
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
60
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
60
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
4060
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
40
0 20 40 60 80 100
120
140
160
180
200
220
240
Pixel
89
GoldenGate Methylation Assay
Polymerase extends the perfectly matched ASOLigase joins the extended ASO and LSO to form anLSO and ASO for unmethylated template (3’ A)
GoldenGate Methylation AssayAllele-Specific Extension & Ligation
Polymerase extends the perfectly matched ASO.Ligase joins the extended ASO and LSO to form an amplifiable template.LSO and ASO for unmethylated template (3 A) hybridize to template.
Unmethylated CpG Site
Ligase
PolymeraseU
Bi-sulfite-converted gDNA
y p
g
AA
Universal PCR Seq 1 IllumiCode
AddressUniversal
PCR Seq 3G
Query oligo -unmethylated template G
Universal PCR Seq 2 IllumiCode
AddressUniversal
PCR Seq 3
pQuery oligo -methylated template
90
p
GoldenGate Methylation AssayAllele Specific Extension & Ligation
LSO and ASO for methylated template (3’ G)Polymerase extends the perfectly matched ASO.
Allele-Specific Extension & Ligation
Ligase joins the extended ASO and LSO to form anLSO and ASO for methylated template (3 G) hybridize to template.
Methylated CpG Site
o y e ase e e ds e pe ec y a c ed SOLigase joins the extended ASO and LSO to form an amplifiable template.
Ligase
PolymeraseC
Bi-sulfite-converted gDNA
y p
g
GQuery oligo -
th l t d G
Universal PCR Seq 2 IllumiCode
AddressUniversal
PCR Seq 3A
methylated template
Query oligo - A
Universal PCR Seq 1 IllumiCode
AddressUniversal
PCR Seq 3
Query oligo unmethylated template
91
GoldenGate Methylation Assay PCR AmplificationPCR Amplification
PolymeraseLigated ASE T l t
IllumiCode Address
Template
Cy3 IllumiCode Address
PCR with Universal P i
Universal Primer 3
Universal Primer 1
Cy5
Address
PrimersUniversal Primer 2
92
GoldenGate Methylation AssayGoldenGate Methylation AssayHybridization & Detection
IllumiCodeIllumiCode u CodeIllumiCode
CpG locus 1 CpG locus 2
U h l d
U/U C/C
Unmethylated Methylated
IllumiCodeu Code
CpG locus 3Semi-methylated
C/U
93
Semi methylated
HiScanSQ BeadXpress iScanHiScanSQGenome Analyser HiSeq 1000/2000 BeadXpress iScan
ДНК-секвенатор
Анализатор биочипов
Анализатор биочипов
Анализатор биочипов
+ДНК-секвенатор
MiSeq
НастольныйДНК-
секвенатор секвенатор биочиповбиочиповСиквенсовый
модуль
секвенаторсеквенатор
Стадии процесса секвенированияд р ц рФрагментация DNA
Достраивание и аденилирование Приготовление библиотек ДНК (~ 2-5 часа)15 минут – 2,5 часов ручной работы
1Д р д р
концовЛигирование адапторов
Отбор нужных фрагментов DNAр у фр
Автоматическая генерация кластеров (~4 часа)2
Гибридизация на flow cell
Удлинение гибридизованныхАвтоматическая генерация кластеров (~4 часа)15 минут ручной работы
2 Удлинение гибридизованныхфрагментов
Амплификация на поверхности flow cell по типу bridge аmplificationпо типу bridge аmplification
Непосредственно секвенирование3 Непосредственно секвенирование(~1,5-11 дней)
3 Анализ последовательности DNA
Первичная обработка данных
Стадии процесса секвенированияПодготовка библиотек DNA (~ 6 часов)1 Фрагментация DNA
д р ц р
Достраивание и аденилирование концов
Лигирование адапторов
О б ф DNA
Automated Cluster Generation (~ 5 часов)2 Hybridize to flow cell
Отбор нужных фрагментов DNA
Extend hybridized oligos
Perform bridge amplification
Sequencing (~ 1,5 - 11 дней)3 Perform sequencing on forward strand
Re generate reverse strandRe-generate reverse strand
Perform sequencing on reverse strand
Фрагменты ДНК
Затупление концов
Фосфорилирование
Аденилирование
Лигирование адаптеров
Sequencing ProcessSequencing ProcessFragment DNALibrary prep (~ 6 hrs)1
Repair ends / Add A overhang
Ligate adapters
Select ligated DNA
Автоматическая генерация кластеров (~ 5 часов)2 Гибридизация на flow cellАвтоматическая генерация кластеров ( 5 часов)15 минут ручной работы
2 Гибридизация на flow cell
Удлинение гибридизованных фрагментов
Sequencing (~ 48 to 72 hrs)3 Perform sequencing
Амплификация на поверхности flow cell по типу bridge аmplification
Sequencing ( 48 to 72 hrs)3 Perform sequencing
Generate base calls
Sequencing Process
Fragment DNALibrary prep (~ 6 hrs)1
Repair ends / Add A overhang
Ligate adapters
Select ligated DNA
Automated Cluster Generation (~ 5 hrs)2 Automated Cluster Generation ( 5 hrs)2 Hybridize to flow cell
Extend hybridized oligos1-8 samples
Perform bridge amplification
Непосредственно секвенирование(~1,5-11 дней)
3 Анализ последовательности DNA
Первичная обработка данных
5’3’
Секвенирование путем синтеза (SBS)5’3’
Первое основание включеноЦикл 1: Добавить реагенты для секвенирования
Первое основание включено
Удалить невключившиеся основания
Детектировать сигнал
G
A
T
CG
TC
Детектировать сигналРазблокировать и снять флуоресцентную меткуT
PPP Основание Флюоресценция
T
C
G
ACG
A
TA
Ц 2 Д бG
G
T
AAT
CC
C
Цикл 2: Добавить реагенты для секвенированияи повторить
• Все 4 нуклеотида добавляются в одной реакцииG
C TAG
CG
Все 4 нуклеотида добавляются в одной реакции • Высокая точность• Секвенирование от основания к основанию
5’
G
TA • Не возникает проблем с гомополимерными
повторами
Технология Clonal Single Molecule Array (КлональнаяТехнология Clonal Single Molecule Array (Клональная амплификация на чипе )
>3,5 миллионов кластеров на проточную кювету MiSeqИ >1 5 млрд кластеров наИ >1,5 млрд кластеров на проточную кювету HiSeq
20 микрон20 микрон
101100 микрон