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Produzione di agenti terapeutici
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AGENTI TERAPEUTICI RICOMBINANTI
Vantaggi
Produzione in grande quantit a costi ridotti
Sicurezza (es: GH e fattori della coagulazione)
Possibilit di ingegnerizzazione
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Geni di proteine (potenziali agenti terapeutici) clonati:
>500
Agenti terapeutici di origine biotecnologicaautorizzati da FDA:
50
NB: Dati del 2001
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Recombinant Biopharmaceutical Products in the U.S. MarketRecent FDA Approvals
2006: Insulin, rDNA, inhaled/Pfizer [Exubera Insulin, recombinant powder for inhalation]; Treatment of adults with type 1 and type 2 diabetes.
2005: CTLA4-Ig, rDNA [Orencia; Abatacept; cytotoxic T-lymphocyte- associated antigen 4--Immunoglobulin G1 fragment fusion protein, recombinant] Bristol-Myers Squibb Co. Treatment of rheumatoidarthritis in moderate to severe adult patients.
Insulin-like Growth Factor-1, rDNA/Tercica [Insulin-like Growth Factor-1, recombinant IGF-1] Treatment of growth failure in children with severe primary IGF-1 deficiency (Primary IGFD) or with growth hormone (GH) gene deletion who have developed neutralizing antibodies to GH.
Hyaluronidase, rDNA [Hylenex; Chemophase; rHuPH20; PH-20 hyaluronidase, recombinant human]. To enhance the delivery of local anesthesia, contrast agents, and for subcutaneous fluidreplacement (hypodermoclysis).
PDGF, rDNA/Bone matrix [Platelet-derived growth factor (PDGF)-BB, recombinant with inorganicbone matrix] Treatment of periodontal bone defects and associated gingival recession.
Calcitonin, rDNA [Calcitonin (salmon) - Fortical; calcitonin, recombinant] Treatment of postmenopausal osteoporosis
Insulin detemir, rDNA - [Insulin detemir, recombinant - Levemir] Treatment of diabetes mellitus(type 1 and type 2; [a long-acting recombinant insulin analog]
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MANIPOLAZIONE DEGLI INTERFERONI
Isolamento dei cDNA negli anni 80
IFN, IFN: sintetizzati da vari tipi di cellule in risposta a uninfezione virale
IFN: secreto principalmente da cellule T CD8+. Induce lespressione delle proteine MHC di classe I e II, e favorisce la presentazione dellantigene.
sintetizzato in risposta ad agenti che stimolano la crescita cellulare (inibitore della proliferazione)
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IFN 23 varianti
19-26 kDa
Estremit N-terminale variabile
Parte centrale o C-terminale pi conservata
I vari sottotipi hanno tutti attivit antivirale e antiproliferativa sebbene con specificit diverse
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60 92 150
MANIPOLAZIONE DEGLI INTERFERONI
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Induzione della sintesi di (2-5) oligonucleotide sintetasi
Oligonucleotidi 2-5
Attivazione di una ribonucleasi cellulare latente che taglia mRNA virale
Attivit di alcuni IFN ibridi:
Attivit antiproliferativa maggiore in vari tumori
1
2
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MANIPOLAZIONE DELLORMONE DELLA CRESCITA
hGH nativo pu legarsi al proprio recettore o al recettore della prolattina
=> Modificazione del sito di legame con il recettore della prolattina tramite MUTAGENESI SITO-SPECIFICAallo scopo di evitare effetti collaterali nel corso della terapia
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(His18, His21, Glu174)
Ulteriori studi necessari per approvazione FDA
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Ottimizzazione dellespressione
Selezione del sistema di espressione ottimale allo scopo di ottenere:
- Un prodotto autentico
- Una quantit sufficiente per clinical trials e
commercializzazione
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Livelli di sintesi di interleuchina 3 in diversi ospiti
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Trattamento delle infezioni polmonari batteriche nella fibrosi cistica
Malattia ereditaria ad esito fatale tra le picomuni
Individui affetti suscettibili di contrarre infezioni polmonari batteriche
I batteri causano accumulo di muco nei polmoni
Il muco formato da DNA e polisaccaridi
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Trattamento delle infezioni polmonari batteriche nella fibrosi cistica
- DNasi I
- ALGINATO LIASI
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Dnasi I
Pulmozyme (Genentech)
- Dnasi I umana ricombinante
- Clonaggio, espressione, purificazione
- Somministrazione tramite aerosol
- Riduce la viscosit del muco
Approvazione FDA
- 123 milioni di $ di vendite nel 2001
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Alginato
-polisaccaride costituito da -D-mannuronato e -L-guluronato, che da luogo a legami trasversali fissando ioni Ca++
-secreto dai ceppi mucoidi di Pseudomonasaeruginosa
Alginato liasi
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Isolamento del gene alginato liasi
- da una specie di Flavobacterium
- screening di una genoteca in E. coli
in che modo?
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1. Piastratura dei cloni su terreno solido contenente alginato
2. Aggiunta di Ca++: il terreno diventa opaco.
3. Rimane un alone trasparente attorno alle colonie esprimenti alginato liasi che hanno idrolizzato lalginato
4. Analisi del DNA clonato, espressione e caratterizzazione della proteina
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63 kDa
23 kDa40 kDa
Alginato liasi di Flavobacterium
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Amplificazione tramite PCR del tratto codificante per lenzima di 40 kDa
Clonaggio in Bacillus subtilis:
=> Alginato liasi secreta nel mezzo di coltura e funzionante su alginato prodotto da P.aeruginosa
Ulteriori studi necessari per approvazione FDA
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AGENTI TERAPEUTICI BASATI SU ANTICORPI MONOCLONALI
IgG umanizzateIgG murine IgG chimeriche uomo-topo
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Trattamento con papainaAttiva la cascata del complementoSi lega ai recettori per lFc di cellule:-ADCC-fagocitiche
Struttura degli anticorpiCDR=regioni determinanti la complementariet
Bindingantigene
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Anticorpi monoclonali come immunosoppressori: OKT3
T cell
CD3
OKT3
T cell
CD3
Farmaco potente ma con effetti collaterali importanti
Blocco della funzione delle cellule T
in via di sviluppo: HuM291 (mAb umanizzato)
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Anticorpi monoclonali coniugati
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PA
Esempio di utilizzo di MAb coniugati
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Esempio di utilizzo di MAb coniugati
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Radioimmunoterapia pre-targeted
Esempio di utilizzo di MAb coniugati
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Problemi riscontrati nellutilizzo di anticorpimonoclonali:
1.Accoppiamento chimico difficoltoso e poco riproducibile
2.Limpiego di MAb di origine NON umana presenta problemi di reazioni crociate e sensibilizzazione
Bisogno di MAb UMANI
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Estrema difficolt nel produrre MAbs UMANI con la tecnica dellibridoma
a) Cromosomi instabili in ibridomi linfociti
umani/mieloma murino
b) Non sono disponibili idonee linee cellulari di
mielomi umani
c) Ragioni etiche
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Possibili soluzioni:
1.Introduzione (trapianto) di PBLs (peripheralblood lymphocytes) umani in un topo scid
2.Creazione di topi transgenici capaci di produrre unimmunoglobulina umana e selezione dei cloni con la normale tecnica dellibridoma
3.Utilizzare la tecnologia del DNA ricombinante
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Produzione di anticorpi chimerici uomo-topo
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Produzione di anticorpi umanizzati
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Produzione di anticorpi umanizzati (I)
1) Ibridoma di topo isolamento del cDNA delle catene L e H
2) Amplificazione tramite PCR delle regioni variabili (VH e VL), clonaggio e sequenziamento
3) Analisi della sequenza e identificazione delle CDR
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Coda di 12 nucleotidicomplementari alle regioni FR del DNA umano
4) Sintesi di 6 coppie di primers (3 CDRL + 3 CDRH)
5)
Produzione di anticorpi umanizzati (II)
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6) 6 cicli di mutagenesi per sostituire atrettantiframmenti CDR
7) Clonaggio dei geni ricombinanti codificanti catene H e L in vettori di espressione
8) Introduzione in cellule ospiti idonee (E. coli o di mammifero) e produzione degli anticorpi
Produzione di anticorpi umanizzati (III)
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>100 anticorpi monoclonali umanizzaticon questa tecnica
20 in sperimentazione clinica
SVANTAGGI:Tecnica laboriosa e costosa
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PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI
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PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI
Espressione di un frammento Fv anticorpale assemblato
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PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI
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M13 COME ALTERNATIVA AL BATTERIOFAGO 3
PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI
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Single chain Fv antibody
Per consentire un giusto orientamento dei peptidi
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Disulfide-stabilized Fv antibody
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Anticorpi monoclonali umanizzati contro il diabete di tipo 1
- malattia multifattoriale: cause genetiche e ambientali- Linfociti T si attivano e distruggono le cellule beta del pancreas che
producono insulina
Keymeulen et al. New England J. of medicine 2005 Jun 23;352(25):2598-608[Trial Clinico fase II]
-Anticorpi monoclonali anti CD3 umanizzati -80 malati (40 anticorpo -40 placebo)
Miglioramento per 12 pazienti il cui livello di produzione di insulina era gia alto.
Per gli altri pazienti (28) il bisogno di insulina rimasto stabile. Effetti collaterali non gravi e passeggeri
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Nome generico Origine Isotipo Target Indicazioni Anno approvaz.
mAbs non coniugatiTrastuzumab(Herceptin)
Umanizzato IgG1 umane HER2/neu Cancro al seno 1998
Rituximab(Rituxan)
chimerico IgG1 umane CD20 Linfoma 1997
Cetuximab(Erbitux)
chimerico IgG1 umane Recettori EGF
Cancro al colon-retto
2004
Bevacizumab(Avastin)
chimerico IgG1 umane VEGF Cancro al colon-retto, polmone
2004
Alemtuzumab (Campath- 1H)
Umanizzato IgG1 umane CD52 Leucemia linfocitica cronica
2001
ImmunoconiugatiIbritumomab tiuxetan(Zevalin) insieme a rituximab
Murino IgG1 murine radiomarcato 90Y
CD20 Linfoma 2002
Tositumomab e 131I tositumomab (Bexxar)
Murino IgG2a murine radiomarcato 131I
CD20 Linfoma 2003
Gemtuzumab (Myelotarg)
Umano (farmaco derivato da streptomyces)
IgG4 umana coniugato con calicheamicina
CD33 Leucemia mieloide acuta
2000
mAb utilizzati come agenti terapeutici nella terapia contro il cancro
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FARMACI CONTRO HIV
Anticorpi anti-CD4
Proteina CD4 libera
Proteina di fusione CD4-Fc1. Legame alla gp120
2. Legame alle cellule recettrici
di anticorpi (risposta ADCC)
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Uccisione selettiva delle cellule infettate da HIV
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When a HIV particle binds to a cell, the interaction of gp120 withCD4 changes gp120's shape. This in turn changes the shape of gp41, in such a way that the gp41 helps to initiate the process of membrane fusion betweenvirus and cell.
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T-20 is a peptide (a 36 amino acid chain) with amino acid sequences that are identical to a segment of the heptadrepeat (HR-1 and HR-2) regions of the gp41 molecule on the HIV envelope.
The drug binds to the HR-1 region and disrupts interactionsbetween HR-1 and HR-2 that normally draw HIV into contact with the target cell. By blocking this step, T-20 blocks cellfusion, and consequently, HIV's entry into the cell.
FUZEON (T20)http://www.fuzeon.com
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To identify natural HIV-1 inhibitors we screened a comprehensive peptide librarygenerated from human hemofiltrate. The most potent fraction contained a 20-residue peptide, designated VIRUS-INHIBITORY PEPTIDE (VIRIP), corresponding to the C-proximal region of 1-antitrypsin, the most abundantcirculating serine protease inhibitor.
We found that VIRIP inhibits a wide variety of HIV-1 strains including thoseresistant to current antiretroviral drugs. Further analysis demonstrated that VIRIP blocks HIV-1 entry by interacting withthe gp41 fusion peptide and showed that a few amino acid changes increase itsantiretroviral potency by two orders of magnitude.
Thus, as a highly specific natural inhibitor of the HIV-1 gp41 fusion peptide, VIRIP may lead to the development of another class of antiretroviral drugs.
Mnch et al.Discovery and Optimization of a Natural HIV-1 Entry InhibitorTargeting the gp41 Fusion PeptideCell 129, 263-275, 20 April 2007
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Animali transgenici come bioreattori
Produzione di agenti terapeutici