1. Title : ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
2. Date : 2010년 06월 18일
3. Purpose : 혈청 단백질인 adiponectin을 ELISA의 방법으로 측정
4. 방법 :
Human Total Adiponectin/Acrp30 Immunoassay
(R&D Systems protocol을 사용)
Quantitative sandwich enzyme immunoassay technique
I. Sample collection & storage
1) Serum
① serum separator tube를 이용
② 30분 동안 놔둔다.
③ 15분 동안 1000☓g에서 원심분리
④ 혈청을 분리하여 즉시 분석실험을 하거나
⑤ 따로 옮겨 담아 -20oC에 저장
2) Plasma
① 항응고방지제로서 heparin 또는 EDTA를 이용하여 혈장 cellect.
② 15분 동안 1000☓g에서 원심분리
③ 바로 분석실험을 하거나 따로 옮겨 담아 -20oC에 저장
Ⅱ. Sample preparation
① 혈청과 혈장 samples를 100배 희석한다.
② 100배 희석하는 방법 : 10ul sample + 990ul Calbrator Diluent RD6-39
③ 100-500 배 희석 샘플 사용
Ⅲ. Reagent preparation & Assay procedure
1) Adiponectin Standard : 2ml Calibrator Diluent RD6-39에 녹인다.
2) Adiponectin Standard 용액 준비
① tube 6개 준비. 각각 6개의 tube에 200ul씩 Calibrator Diluent RD6-39 넣는다.
② 그림과 같이 첫 번째 튜브에 Adiponectin Standard 시약을 넣고 잘 섞어준다.
(Adiponectin Standard: 250ng/ml, Calibrator Diluent RD6-39: 0ng/ml)
③ 200 ul 옮기면서 희석시켜 준다.
3) 각 well에 100ul씩 Assay diluent RD1W를 넣는다.
4) 50ul씩 standard, sample (100배 희석한 sample)를 넣고 adhesive strip을 붙이고 실
온에 2시간 동안 incubation.
5) Wash Buffer 만들기: 48ml DW + 2ml wash buffer => total volume=50ml
* 사용할 만큼만 만들어서 사용
6) 각 well에 200ul씩 wash buffer 넣어서 wash, 4번 반복.
* 마지막 4번째 wash는 aspirating or decanting, paper towel 이용하여 털어냄.
7) 각 well에 200ul씩 Adiponectin Conjugate를 넣는다
8) 새로운 adhesive strip을 붙이고 실온에 2시간 동안 incubation.
9) wash : 6번 과정 반복
10) Substrate Solution 만들기: Color Reagents A와 B를 같은 양으로 섞기
* 사용할 만큼만 만들기,
호일로 싼 tube 사용(protect from light),
사용 직전에 만들기,
만들고 15분 내에 사용하기
11) 각 well에 200ul씩 Substrate Solution을 넣는다.
12) 실온에 30분 동안 incubation. ★★★ protect from light
13) 각 well에 50ul씩 Stop Solution을 넣는다.
* 파랑색에서 노랑색으로 바뀐다.
만약 초록색이라면 부드럽게 plate를 tapping한다. 잘 섞일 것이다.
14) Stop Solution을 넣은 후 30분 이내에 450nm에서 microplate reader set를 이용하여
측정한다.