![Page 1: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/1.jpg)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
(continuare)
Metode turbidimetrice
http://namrataheda.blogspot.ro/2013/07/Măsurarea activității enzimatice a
lipazei din S.aureus
Rollof, J. et al., Acta path. Microbiol.
Immunol. Scand., Sect.B, 92,
155-158, 1984
![Page 2: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/2.jpg)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare
a activității enzimatice
Metode nefelometrice
https://www.pinterest.co.uk/
Măsurarea activității celulazei din
Trichoderma reesei
Mummi, M., J. et al., Anal. Biochem.,
116, 133-136, 1981
![Page 3: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/3.jpg)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare
a activității enzimatice
Metode nefelometrice
trends.directindustry.com/ Măsurarea activității enzimelor
pancreatice II. Lipase
Zinterhofer., L. et al., Clin. Chim.
Acta, 44, 173-178, 19873
![Page 4: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/4.jpg)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare
a activității enzimatice
Luminometria
Firefly (Photinus pyralis)
Etichetarea cu FITC a compușilor cu –NH2
![Page 5: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/5.jpg)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Luminometria
https://www.etsy.com/
![Page 6: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/6.jpg)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Polarimetria
Hidroliza zaharozei folosind
soluții de diluții 1:250, 1:500,
1:1000 de invertază din drojdie
McIntosh,. K.A. et al. (1998),
J. Pharm. Biomed. Anal.,
17, 1037-1045
![Page 7: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/7.jpg)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Metode electrochimice
Bisswanger, H. (2012) Practical Enzymology
Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany Ramsay, R. R. and Tipton, K. F. (2017)
Molecules, 2017, 22, 1192
![Page 8: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/8.jpg)
Disfuncții ale gutei pentru
pacienți cu EED
https://www.pinterest.co.uk/pin/
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a
activității enzimatice
Etichetarea radioactivă
Metodă discontinuă de măsurare a activității
enzimatice (P pe filtru)
Rossomando, E.(Ed) HPLC in Enzymatic Analysis,
Capitol 1, Willey & Sons (1998)
![Page 9: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/9.jpg)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Etichetarea radioactivă
![Page 10: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/10.jpg)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Alte metode
Separarea substratului și produșilor unei reacții
catalizate de adenozin kinaza
pe HPLC (fază inversă)
Rossomando, E.(Ed) HPLC in Enzymatic Analysis,
Capitol 1, Willey & Sons (1998)
![Page 11: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/11.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor
imobilizarea prin adsorbție și includere a enzimelor
m = k1 Ck2
izoterma Freundlich
m =k1 k2 C
1 + k2 C
izoterma Langmuir
![Page 12: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/12.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor
imobilizarea prin adsorbție și includere a enzimelor
Cantitatea de enzimă adsorbită - parametri:
• Concentrația soluției enzimei care este supusă imobilizării
• Timpul de contact
• Tincubare
• Influența pH-ului
www.easybiologyclass.com
![Page 13: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/13.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor
imobilizarea prin adsorbție a enzimelor
Suporturi utilizate
• Suport mineral (Al2O3, argilă)
• Suport organic (amidon)
• Sefaroză mofificată
• Rășini schimbătoare de ioni
Interacțiunilor slabe
interacțiuni electrostatice
hidrofobe
punți de hidrogen
Mărimea particulelor
D = 500 nm – 1 mm
https://www.intechopen.com
![Page 14: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/14.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor
imobilizarea prin includere a enzimelor
• Sechestrarea enzimelor într-o matrice
• Matricea – polimeri solubili în apă
• Exemple de matrici
Geluri de poliacrilamidă
Triacetat de celuloză
Agar-agar
Gelatină
Caragenan
alginate
![Page 15: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/15.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor
imobilizarea prin includere a enzimelor
Avantaje - dezavantaje
Variază forma și natura matricilor
Dimensiunea porilor matricii poate fi ajustată
Posibile “scăpări” ale enzimelor cu M mică
Agarul și caragenanul – dimensiuni mari - pori
Dimensiunea porilor poate fi ajustată variind
conc polimerului
Metoda nu poate fi utilizată în procesele industriale
Preferată pentru experimente la scară mică
![Page 16: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/16.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
Legarea covalentă a enzimelor
Formarea de legături covalente între
enzimă și suport
Metodă preferată de imobilizare
Grupări chimice care pot forma legături
covalente cu suportul
Grupări amino, imino
Grupări -OH
Grupări -COOH
Grupări –SH și –SCH3
Grupări guanidil și imidazol
Nuclee fenolice
![Page 17: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/17.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
Legarea covalentă a enzimelor
Matrici / suporturi utilizate în legarea covalentă a enzimelor:
Carbohidrați: celuloză, DEAE celuloză, agaroză
Agenți sintetici: poliacrilamidă
Proteine (colagen, gelatină, albumină)
Matrici cu grupări amino: amino-benzil-celuloză
Suporturi anorganice: sticlă poroasă, silicagel
CNBr-agaroză și CNBr-Sepharose
Grupările –OH și –NH2 formează mai ușor legături covalente
![Page 18: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/18.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
Legarea covalentă a enzimelor
Metode de legare covalentă
Diazotare
Gr –NH2 suport ↔ Y sau H din enzimă
Formarea legături peptidice
–NH2 suport
HOOC- din enzimă
Illanes, Enzyme Bocatalysis. Principles and
applications, Springer (2008)
![Page 19: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/19.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
Legarea covalentă a enzimelor
Metode de legare covalentă
![Page 20: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/20.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
Legarea covalentă a enzimelor
Metode de legare covalentă
Utilizarea agenților polifuncționali
Portman, R.(2008), Biology of Metals,
22(2):363-375
![Page 21: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/21.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
reticularea enzimelor
Metode de legare covalentă
![Page 22: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/22.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
Aplicații ale enzimelor imobilizate
Producerea industrială a
antibioticelor
băuturilor
aminoacizilor
Aplicații biomedicale
tratament
diagnoză
eliberare medicamente
Industrie alimentară
gemuri
jeleuri
siropuri
Cercetare
HPR – experimente blotting
proteaze – lizare celulară
![Page 23: 2. Purificarea enzimei 2.5. Monitorizarea activității ... file• Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate. 2.6](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022040422/5e1451317de7344e8e6e3288/html5/thumbnails/23.jpg)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
Aplicații ale enzimelor imobilizate
Producerea biodieselului
din uleiuri vegetale
Managementul apelor reziduale
tratarea apelor de canal
tratarea efluenți industriali
Industrie textilă
degresare
bio-netezire
dezmembrare țesături
Industria detergenților
imobilizare lipaze
îndepărtarea murdăriei