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Modul BA05:
Reinhard Fischer
Enzymreinigung
Radioaktivität
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Wildtype
10 µmM P C
brlA abaA
!apsA
!hymA
brlA
abaA
wetA
yAwA
fluffy
Bisher: Entwicklungsmutanten A. nidulansForward Genetics
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Entwicklungsmutanten von A. nidulansForward Genetics
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asexual
sexual
Entwicklung in Aspergillus nidulansAktuell: Lichtregulation
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Heute: Fruchtkörperentwicklung in A. nidulans
100 µm
Stadienspezifisches Enzym: Laccase
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Stadienspezifisches Enzym
Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren
Laccasegen
Regulator
Regulator
Regulierte Gene
Signale
Fruchtkörperent-wicklung
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Hiwis
Hiwis für Modul BA04 gesucht
Homepage design Dekanat
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Proteinreinigung (mit Tagg)
Affinitätschromatographie: Ni-Agarose etc.
Voraussetzungen: - Gen bekannt- Reinigung aus E. coli oder Organismus ist selbst transformierbar
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Proteinreinigung (ohne Tagg)
Reinigung von Proteinen aus einem Organismus, um- Stoffwechselwege aufzuklären- ein Protein oder Enzym zu charakterisieren,
(Enzymkinetik, Substratspektrum, pH OptimumTemperaturoptimum, kinetische Parameter,Cofaktoranalyse)
- das Enzym biotechnologisch zu nutzen (Waschmittelindustrie, Getänkeindustrie, Medizin)- Antikörper herzustellen- Kristallstruktur zu bestimmen (Modelling)- das Gen zu isolieren
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Zellaufschlussmethoden
Dounce Homogenisator
Kugelmühle, Zellmühle
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French press
Cavitation
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Säulenchromatographie
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Säulenchromatographie
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FPLC – SäulenchromatographieFast performance liquid chromatography
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Säulenchromatographie
Gelfiltration (Molekularsieb) Adsorption
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SäulenchromatographieIonenaustausch
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Säulenchromatographie
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Stadienspezifisches Enzym
Enzym als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren
Laccasegen
Regulator
Regulator
Regulierte Gene
Signale
Fruchtkörperent-wicklung
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BC DCB
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Nachweis von Laccase IIEnzymtest
Abs
orpt
ion
bei 5
50 n
m
Zeit
∆E (c)
∆t
Enzymaktivität: µmol / minSpez. Enzymaktivität: µmol / min . mg protein
Zugabe Enzym
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Peptide Fingerprinting
Suche nach dem GenModul 3
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Peptide Fingerprinting
Suche nach dem GenModul 3
![Page 30: 2018 Modul 4 Proteinreinigung und Radioaktivität Modul 4 Proteinreinigung und... · Stadienspezifisches Enzym Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren Laccasegen Regulator](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062912/5cfe480a88c99367218c6ddf/html5/thumbnails/30.jpg)
Laccase Fusion mit GFP
PstI PstIATG Stop
ClaI
0.3 kb0.4 kb 2.3 kb
CpeA::GFP
GFP
![Page 31: 2018 Modul 4 Proteinreinigung und Radioaktivität Modul 4 Proteinreinigung und... · Stadienspezifisches Enzym Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren Laccasegen Regulator](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062912/5cfe480a88c99367218c6ddf/html5/thumbnails/31.jpg)
!
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![Page 32: 2018 Modul 4 Proteinreinigung und Radioaktivität Modul 4 Proteinreinigung und... · Stadienspezifisches Enzym Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren Laccasegen Regulator](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062912/5cfe480a88c99367218c6ddf/html5/thumbnails/32.jpg)
Stadienspezifisches Enzym
Enzym als Werkzeug, um Regulatorenzu isolieren
Laccasegen
Regulator
Regulator
Regulierte Gene
Signale
Fruchtkörperent-wicklung
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4 Hiwis für Modul BA04 gesucht!
![Page 34: 2018 Modul 4 Proteinreinigung und Radioaktivität Modul 4 Proteinreinigung und... · Stadienspezifisches Enzym Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren Laccasegen Regulator](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062912/5cfe480a88c99367218c6ddf/html5/thumbnails/34.jpg)
2. Radioaktivität
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Isotope
![Page 36: 2018 Modul 4 Proteinreinigung und Radioaktivität Modul 4 Proteinreinigung und... · Stadienspezifisches Enzym Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren Laccasegen Regulator](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062912/5cfe480a88c99367218c6ddf/html5/thumbnails/36.jpg)
Stabilität der Kerne
![Page 37: 2018 Modul 4 Proteinreinigung und Radioaktivität Modul 4 Proteinreinigung und... · Stadienspezifisches Enzym Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren Laccasegen Regulator](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062912/5cfe480a88c99367218c6ddf/html5/thumbnails/37.jpg)
Zerfallsarten
![Page 38: 2018 Modul 4 Proteinreinigung und Radioaktivität Modul 4 Proteinreinigung und... · Stadienspezifisches Enzym Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren Laccasegen Regulator](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062912/5cfe480a88c99367218c6ddf/html5/thumbnails/38.jpg)
Radioaktivität in der Biologie
![Page 39: 2018 Modul 4 Proteinreinigung und Radioaktivität Modul 4 Proteinreinigung und... · Stadienspezifisches Enzym Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren Laccasegen Regulator](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062912/5cfe480a88c99367218c6ddf/html5/thumbnails/39.jpg)
Zerfallsschema für Tritium
Cl1735 + e- + Neutrino HWZ: 82 Tage
P1532 S
1632 + e- + Neutrino HWZ: 14 Tage
C6
14 N7
14 + e- + Neutrino HWZ: 5730 Jahre
S1635
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Nachweis von RadioaktivitätFilm Szintillationszähler