Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
2.3. Enzim Restriksi
Bioteknologi Tanaman
Copyright Statement:
Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks, gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya)
bahan kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun.
Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana
berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
2.2. Enzim Restriksi
Pengamatan terhadap bakteri yang mampu menghalangi pertumbuhan bakteriophage, disebut nuklease , memotong = restriksi,
internal = endonuklease
Bioteknologi Tanaman
Aktifitas:Memutuskan ikatan rantai phospodiester pada ujung 5‘ rantai DNA
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
3 Macam golongan, restriksi endonuklease type I, II dan III
Type I dan III melakukan proses metilasi dan restriksi pada DNA yang sama
Type II proses metilasi dan restriksi pada DNA yang berbeda
Dalam keperluan rekayasa genetika enzym restriksi type II banyak digunakan
Memotong DNA menurut urutan sisi pengenalan (recognition site), bedakan dengan cutting site (titik pemotongan)
Jenisnya bermacam-macam: dari mulai 4-8 (tetra nukleotide-oktanukleotide)
Contoh:
4: AfaI ; GT AC ; 37°C ; Rhodopseudomonas sphaeroides; 65°C-15 menit
6: Eco RI; G AATTC; 37°C; Escherichia coli H709C; 60°C-15 menit
8; Not I; GC GGCCGC; 37°C; Nocardia otitidis-caviarum; ekstraksi phenol
Bioteknologi Tanaman
Enzim Sisi Pengenalan Suhu inkubasi Organisme asal Suhu inaktifasi
Aat II GACGT C 37°C Acetobacter aceti IFO3281 65°C; 20’Afa I GT AC 37°C Rhodopseudomonas sphaeroides 65°C; 15’Alu I AG CT 37°C Arthrobacter luteus 60°C; 15’Apa I GGGCC C 37°C Acetobacter pasteurianus sub.
pasteurianus60°C; 15’
BamHI G GATCC 30°C Bacillus amyloliquifaciens H. 60°C; 15’Bgl I GCCNNNN NGGC 37°C Bacillus globigi 65°C; 15’Bgl II A GATCT 37°C Bacillus globigi 70°C; 15’Eco RI G AATTC 37°C Escherichia coli H709C 60°C; 15’Eco RV GAT ATC 37°C Escherichia coli 70°C; 15’Hae III GG CC 37°C Haemophilus aegyptus 70°C; 15’Hind III A AGCTT 37°C Haemophilus influenzae Rd 70°C; 15’Hpa I GTT AAC 37°C Haemophilus parainfluenzae 60°C; 15’Mbo I GATC 37°C Moraxella bovis 70°C; 15’Nco I C CATGG 37°C Nocardia corallina 70°C; 15’Not I GC GGCCGC 37°C Nocardia otitidis-caviarum Ekst. phenolPst I CTGCA G 37°C Escherichia coli ED8654 yang
membawa gene Pst I60°C; 15’
Sau3A I GATC 37°C Staphylococcus aureus 3A 70°C; 15’Taq I T CGA 65°C Thermus aquaticus Tidak adaXba I T CTAGA 37°C Xanthomonas badrii 60°C; 15’Xho I C TCGAG 37°C Xanthomonas holcicola Presipitasi
ethanol
Tabel beberapa contoh enzim, sisi pengenalan, suhu inkubasi dan suhu inaktivasi
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
C T G A T G A A T T C C G T
G A C T A C T T A A G G C AEcoRI
C T G A T G
G A C T A C T T A AA A T T C C G T
G G C A
A
MseIG A T G A T G A A T T C C G T
C T A C T A C T T A A G G C A
G A T GA T G A A
C T A C T A C T T
T T C C G T
A A G G C AB
Contoh titik potong enzim restriksi endonuklease
Ujung kohesif
Cohesive end
Ujung tumpul
Blunt end
Bioteknologi Tanaman
Analogi Pemotongan Enzim Restriksi
Enzim A Enzim B
A B AB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
2,5
3,0
11,511,0
7,0
1,0
20,0
2,5
3,0
10,0
7,0
1,0
4,5
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
M V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
1,6 kb
2 kb
3 kb
6 kb
12 kb
Contoh dalam praktek hasil restriksi DNA
DNA BAC dipotong dengan EcoRI dan HindIII, sumber Jamsari
Bioteknologi Tanaman
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Frekuensi pemotongan = 4n
4 = jumlah total macam basa nitrogen (CGAT)
N = jumlah sisi pengenal spesifik
Contoh :
EcoRI, hexanukleotid , maka enzim tersebut memotong DNA setiap: 46
basa = 4096
Maka apabila panjang DNA = 10 kb = 10.000 bp,
akan terpotong menjadi sekitar 2 atau 3 fragmen jika dipotong dengan EcoRI,
Jika dipotong dengan MseI akan menghasilkan 38-40 fragment
Bioteknologi Tanaman
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Transfer Asam Nukleat
Southern Transfer (DNA)
Northern Transfer (RNA)
Western Transfer (Protein)
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Pemberat
Tumpukan kertas penghisap
Bak berisi larutan alkali
Gel tempat DNA
Bahan penghisap larutan alkaliMembran selulosa
Transfer Asam Nukleat
Southern Transfer (DNA) diperkenalkan oleh Edward Southern (1977)
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Hibridisasi Asam Nukleat
Hibridisasi : Penyatuan molekul DNA asing dengan sekuens DNA (probe)
yang sudah diketahui identitasnya
Syarat : ada homologi antara molekul DNA asing dengan probe yang kita
miliki (70-100%)
Sumber Probe:
1. Pustaka DNA genomik anonym yang dipilih.
2. Pustaka cDNA
3. DNA yang dihasilkan dari luar inti sel (sitoplasma)
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Agarose gel Nylon membran Röntgen Film
Hibridisasi
dengan Probe
Langkah-langkah Proses Hibridisasi
Hibridisasi Asam Nukleat
Restriksi
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Bioteknologi Tanaman
Hibridisasi Asam Nukleat
Gambar hasil autoradiogram jumlah kopi ujung Klon BAC yang dihibridisasi dengan DNA genomik tanaman asparagus,
Sumber, Jamsari