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3^ SESSIONE
Aspetti di tossicologia forense
Le analisi chimiche e tossicologiche
Prof. Letizia Antonilli
Laboratorio Sezione di Farmaco-Tossicologia
UOC Patologia Clinica
Umberto I Policlinico di Roma - «Sapienza» Università di Roma
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Summary
• Analisi chimico-tossicologiche e loro ruolo nel
percorso diagnostico clinico e medico legale
• Procedure di accertamento implicazioni ed
applicazioni
• Parametri di laboratorio
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L’analisi chimico-tossicologica
• L’analisi tossicologica è una parte essenziale nel processo diagnostico clinico e medico
legale essendo mirata a ricercare l’evidenza della presenza di sostanze psicoattive nei
fluidi biologici
• Metodi analitici con elevato potere identificativo sono necessari al fine di poter
ottenere più informazioni possibili da una singola analisi
• Le conseguenze penali che possono derivare dai risultati provenienti dal laboratorio si
traducono nella necessità di ottenere un dato analitico altamente attendibile
• Il laboratorio analitico deve seguire linee guida nazionali e/o internazionali nonché
avere misure di verifica e accreditamento esterno
• Le linee guida internazionali specificano che nel caso di analisi finalizzate a scopi
medico-legali, le fasi analitiche previste siano fondamentalmente due, basate ciascuna
su principi chimico-fisici differenti cioè “ortogonali” tra loro
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Obiettivo dell’indagine analitica
Ottenere da un dato scientifico tutte le informazioni utili per
supportare correttamente il processo diagnostico clinico e medico
legale.
Particolare attenzione deve essere posta:
alla validità e al controllo delle procedure operative
ai criteri di scelta dei metodi di analisi
alla valenza diagnostica e agli eventuali aspetti di natura
medico-legale correlati alla gestione del risultato
analitico
4
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5
• Quali sostanze / gruppo di sostanze si
vogliono ricercare
• In quali concentrazioni sono presenti
nella matrice biologica
A quale periodo di tempo si può
riferire l’esposizione
Tipo di matrice
Tipo di procedura
analitica
Quali informazioni dovrebbe fornire l’analisi
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6
Scelta della matrice biologica
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SOSTANZA TEMPO
MDMA (ecstasy) 30 -48 ore
Metamfetamina 48 ore
Cocaina 6-8 ore
Benzoilecgonina 48-72 ore
Cocaetilene > 20 ore
Morfina 24 ore
Codeina 24 ore
6 monoacetil morfina (6-MAM) 2-4 ore
Morfina glucuronidi 48 ore
Buprenorfina 48-46 ore
∆ -9-tetraidrocannabinolo
Uso saltuario - moderato 3 – 4 giorni
Uso giornaliero 10 giorni
Uso cronico fino a 36 giorni
Fenciclidina 8 giorni
Ketamina 72 ore
Intervallo di rilevabilità nelle urine
7
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Fasi dell’indagine analitica analitica
Richiesta di analisi
Campione biologico
Sangue
Urina
Capelli
Saliva
Metodi analitici
Interpretazione del risultato
9
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La richiesta di analisi
Dati del richiedente
Dati dell’utente
Data, ora e firma di chi effettua il prelievo
Elementi circostanziali (terapia in atto, esposizione attuale
o pregressa a farmaci o a sostanze d’abuso, segni
sintomatologici ….)
Finalità dell’analisi
Documentazione allegata : consenso informato
catena di custodia
10
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Metodi Immunochimici
Metodi sensibili
Individuano le classi di sostanze : specificità non assoluta
L’anticorpo può cross-reagire con molecole strutturalmente
correlate con l’analita di interesse
Altre sostanze esogene o componenti della matrice possono
interferire con il segnale analitico
Non richiedono un pretrattamento del campione: semplicità
operativa e rapidità di esecuzione
11
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Principio della reazione antigene-anticorpo
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13
Y
EROINA
MORFINA
CODEINA
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14
SOSTANZA AGENTE
INTERFERENTE
RISULTATO CAUSA
Oppiacei Fluorochinolonici Falso positivo Interferenza
Rifampicina Falso positivo Interferenza
Metadone Verapamil Falso positivo Non identificata
FANS Falso positivo Interferenza
Cannabinoidi Ibuprofene,Naproxene Falso positivo Interferenza
Cocaina Salicilati Falso negativo Interferenza
Amfetamine Efedrina Falso positivo Cross-reattività
Norpseudoefedrina Falso positivo Cross-reattività
Clorpromazina Falso positivo Interferenza
Statine Falso positivo Interferenza
Interferenze e Reattività crociata
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• nessuna tecnica di screening è in grado di rilevare tutte le
sostanze xenobiotiche di interesse medico-legale, quindi a
seconda delle singole esigenze è necessario utilizzare più
metodi analitici.
• «NON PUO’ AVERE VALIDITA’ FORENSE UN
RISULTATO POSITIVO OTTENUTO ATTRAVERSO
UN’ANALISI DI SCREENING. E’ PERTANTO
INDISPENSABILE CHE TALE RISULTATO SIA
VERIFICATO MEDIANTE UN’ANALISI DI
CONFERMA» *
*
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Analisi di conferma: Metodi cromatografici
• Sensibilità: elevata
• Specificità: elevata – molto elevata
• Richiedono l’isolamento degli analiti dalla matrice
• Determinazione quantitativa : precisa ed accurata
• Tempi di esecuzione maggiori rispetto ai metodi
immunochimici
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Cromatografia Liquida ad Elevata Prestazione (HPLC)
17
COLONNA
SOLVENTE
POMPA
INIETTORE
DETECTOR
RECORDER
CR
OM
ATO
GR
AM
MA
Tempo di ritenzione (min)
Are
a
A,B,C
A
BC
A
BC
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nm
C
B
AU
campioni standards
solvente
CBA
Fronte del
solvente
standard
sample
AU
Rf
Cromatografia su strato sottile ad alta prestazione (HPTLC)
A
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Spettrometria di massa tandem
19
Cocaina
304 (m/z)
82 (m/z)
182 (m/z)
+
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Cosa ci dice la spettrometria di massa?
le sostanze sono identificate in base al loro pesomolecolare e ai frammenti chimici che si originanoper impatto con elettroni prodotti ad alta velocità
Si può misurare accuratamente il peso molecolare, fino alla quarta cifra decimale
Si possono ottenere per ciascun composto dei profili di frammentazione specifici e che costituiscono la loro inequivocabile impronta digitale
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LA SPETTROMETRIA DI MASSA,
ACCOPPIATA AD UNA METODICA
CROMATOGRAFICA, E’ UNIVERSALMENTE
RICONOSCIUTA DALLE ASSOCIAZIONI
SCIENTIFICHE FORENSI COME TECNICA
IDENTIFICATIVA DI ELEZIONE PER LE
ANALISI DI CONFERMA
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Parametri di laboratorio
Tutti i metodi analitici sono principalmente
definiti da due variabili :
Sensibilità : capacità del metodo rilevare la minima
concentrazione di analita significativamente diversa dal bianco
Specificità : capacità del metodo di rilevare la presenza
dell’analita, in una miscela complessa, senza subire interferenze
da parte di altri componenti presenti
22
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Concetto di cut-off
23
Limite di concentrazione definito in maniera
convenzionale per:
stabilire la negatività o la positività in un
campione
garantire la confermabilità dei risultati
positivi con tecniche alternative dotate di
maggiore sensibilità e specificità
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Quali sostanze
Classe Sostanza
Oppiacei Morfina
Morfina glucuronide
6-Monoacetilmorfina
Codeina
Diidrocodeina
Cocaina metaboliti Cocaina
Benzoilecgonina
Ecgonina metilestere
Cocaetilene
Cannabinoidi Delta-9-THC
Cannabidiolo
Amfetamine ed analoghi Amfetamina
Metamfetamina
MDMA (ecstasy)
MDA
Alcool e metaboliti Etanolo
Etilglucuronide
Ketamina
New drugs : Cannabinoidi sintetici,
Catinoni, preparati erboristici
ecc..
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Determinazione dell’alcolemia
28
CH3-COHCH3COOH
+
NADH
Alcol deidrogenasi
NAD NAD
CH3-CH2-OH
O
H
H O
H
H O
H
H
O HHO
COOH
C H2
C H3
Aldeide deidrogenasi
Etil-glucuronide
(0.06%)
Metabolismo dell’etanolo
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Gas cromatografia dello spazio di testa: determinazione dell’alcolemia
30
Analisi di composti volatili anchein tracce
Si inietta in colonna il vapore chesi trova in equilibriotermodinamico con il campioneda analizzare
lavora su una frazione arricchitadelle specie chimiche
Si realizzano così analisi moltoprecise e riproducibili
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CONCLUSIONI
Le indagini analitiche per identificare e determinare sostanze stupefacenti in matrici biologiche riguardano diversi settori in
ambito clinico e con implicazioni medico legali
Integrazione tra metodologie analitiche diverse
IMMUNOCHIMICHE CROMATOGRAFICHE
AFFIDABILTA’ DEL DATO DI LABORATORIO
SUPPORTO DEL PERCORSO DIAGNOSTICO CLINICO E MEDICO LEGALE