1
2
DNS: dezoxiribonukleinsav, DNA <ang.>: olyan nukleotidegységekből felépülő nukleinsavak gyűjtőneve,
amelyek dezoxiribóz cukorrészt tartalmaznak. A gének kódolására, és továbbadására szolgálnak.
RNS: ribonukleinsav, RNA <ang.>: olyan nukleotid egységekből felépülő nukleinsav, amely
cukorrészként ribózt tartalmaz, előfordul minden élő sejtben, valamint egyes vírusokban.
Nukleotidok: (= bázis + cukor + foszfát) a nukleozidok foszforsav-észtereinek gyűjtőneve. A bennük szereplő
cukorrész (D-ribóz v. 2-dezoxi-D-ribóz) alapján megkülönböztetik a ribonukleotidok és a
dezoxiribonukleotidok csoportját.
Nukleozidok: (= bázis + cukor) szűkebb értelemben a nukleinsavakban előforduló pirimidin- és purinbázisok
N-ribozid, ill. N-2’-dezoxiribozid típusú glikozidjainak gyűjtőneve (citidin, uridin, timidin,
adenozin, guanozin). A ~okban a cukorrész mindig furanóz szerekezetű, az N-glikozidos
szénatom pedig -konfigurációjú.
Nukleinsavak (DNS, RNS): <lat. nucleus ‘mag’>: (= bázis+cukor+foszfát -> polimer) nukleotidokból felépülő
óriásmolekulák (biopolimerek), amelyek minden sejtben és a virusokban is megtalálhatók, azoknak
esszenciális alkotórészei. ~akat először F. Miescher (1869) különített el a genny fehérvérsejtjeiből.
Watson–Crick-modell: a DNS térszerkezetét leíró térszerkezeti modell. A ~ szerint a DNS-molekula kettős
hélixét két, ellentétes lefutású (antiparalel) polinukleotid-lánc alkotja. A két láncot a
komplementer bázispárok (adenin–timin, guanin–citozin) között létrejött hidrogénkötések
tartják össze. A kettőshélix-szerkezetet J. D. Watson és F. Crick javasolta 1953-ban. A ~ szerint a
polinukleotid-láncokat helikális szerkezetű cukorfoszfátváz építi fel; a hélix tengelyére merőleges
irányban, a hélix belseje felé helyezkednek el a nukleinsavbázisok. A ~ alapján jól magyarázható a
genetikai információ megőrzése és átadása.
DNS kettős hélix/spirál: → Watson–Crick-modell DNS-replikáció: A DNS mindkét szálának megduplázódása, amely során egy DNS kettős spirálból létrejön
kettő, az eredetivel azonos DNS kettős spirál.
Transzkripció: Atírás (DNS->RNS) amely során a DNS-függő RNS polimeráz a rendelkezésére álló nukleozid
5’-trifoszfátokból RNS-t hoz létre. Fontosabb lépései: iniciáció, elongáció és termináció.
Transzláció: Fehérje bioszintézis (RNS->Fehérje), amely során a riboszóma az RNS alapján, a rendelkezésre
álló (és megfelelő aminosavat hordozó) tRNS-ek segítségével megszintetizálja az adott fehérjét.
A nukleinsavkémiai kisszótár:
3
Mutáció: Az eredetihez képesti elváltozás a DNS-ben (más vagy hiányzó nukleotid(ok))
Riboszóma: A fehérjeszintézist = transzlációt végző ribozim, mely 2 rRNS és több fehérjéből áll.
Ribozim: sejtszervecske, ribonukleo-protein komplex: egy bizonyos enzimatikus feladatot ellátó
(egy bizonyos reakciót katalizáló) RNS.
Enzim: Egy bizonyos enzimatikus feladatot ellátó (bizonyos reakciót katalizáló) fehérje.
mRNS: hírvivő vagy messenger RNS: átmeneti adathordozóként szolgál (DNS -> mRNS ->
Fehérje)
rRNS: riboszomális RNS: a riboszóma fő alkotóeleme, a katalitikusan aktív része.
tRNS: átvivő vagy transzfer RNS: Antikodont és az annak megfelelő aminosavat (ill. kötőhelyét)
tartalmazó RNS. Az aminosavakat a riboszómához szállítja, az mRNS-en lévő kodonokat
antikodonja segítségével ismeri fel (bázispárosodás elve)
aminoacil-tRNS szintetáz: adott aminosavat a megfelelő tRNS-hez kapcsoló enzim
genetikai kód: a nukleinsavszekvenciák aminosavszekvenciára „fordítását” meghatározó
szabályrendszer, az mRNS 3 bázisa alkot egy kodont, ami egy aminosavat határoz meg oly módon,
hogy adott antikodonú tRNS ismeri fel a transzláció során
Kodon: Nukleotid-hármas a DNS/RNS-en, mely egy-egy aminosavat kódol
Kromoszóma: (a görög chroma=színes és soma=test) egyetlen hosszú DNS, amely számos gént,
szabályozó és egyéb szekvenciákat tartalmaz.
Kromatin: a kromoszóma anyaga, mely eukarióta sejtekben DNS (rendszerint kettős szálú) és
fehérje komplexe. (Festhető, innen a neve.) Antikodon: Nukleotid-hármas a tRNS-en, mely reverz-komplementje a kodonnak (tehát Watson-
Crick párosítással illeszkedik a kodonhoz transzláció közben)
Gén: Az öröklődő DNS egy fehérjét kódoló része.
Genom: A gének összesége (egy egyedben/fajban), pl. a humán (emberi) genom.
Exon: Egy gén/mRNS azon része(i), mely(ek) tényleges fehérjeszekvenciát kódól(nak)
Intron: Egy gén/mRNS azon része(i), mely(ek) nem kódolnak fehérjeszekvenciát, és az
RNS érés során (transzkripció és transzláció között) kivágódnak, pre-mRNS -> m-RNS.
4
Restrikciós endonukleáz: DNS-hasító enzim, mely csak egy meghatározott szekvencia
egy meghatározott pontján hasítja a DNS-t.
Palindrom szekvencia: DNS szekvencia, mely megegyezik a reverz-komplementjével,
pl. AATT, GGATCC, stb.
Antiszensz oligonukleotid: A kódoló DNS szálhoz kapcsolódó oligonukleotid, amely speciális
szakaszhoz kötődve gátolhatja a DNS átíródását (transzkipciót).
PCR: Polimerase-Chain-Reaction: polimeráz-láncreakció, egy eljárás a sejten-kívüli (in vitro)
DNS sokszorosítására. (templát DNS + primer + polimeráz +
+ nukleotidok(monomerek) + hőmérsékletváltakozás = sokszorozódás)
RNS- polimeráz: egy enzim amely széttekeri a DNS kettős spirált
Promoter: a DNS-nek az a része ahova az RNS-polimeráz kötődik és
ahol megkezdi a transzkripciót
RNS nukleotidok, mint építőelemek
Terminátor: prokarióták azon DNS része ami jezi a transzkripció végét
Transzkripciós egység: Az a DNS darab ami RNS-é átíródik.
Transzkripcós factorok: az eukarióta sejtek azon fehérjéi amelyek az
RNS-polimeráz kötését, illetve a transzkripció megkezdését elősegítik.
Transzkripciós Iniciációs Komplex: A transzkripciós faktorok és a
promoter régióhoz kapcsolódó RNS-polimeráz II együttese.
TATA Box: A DNS promoter része
5
A nukleinsavkémia koronázatlan királyai:
Johannes Friedrich
Miescher
svájci orvos-kémikus
1869-ban felfedezi és
izolálja a DNS-t.
Lord Alexander
R. Todd (angol biokémikus)
1957 Nobel-díj
A nukleotidok és a
nukleotid koenzimek
felfedezéséért
Francis Harry
Compton Crick
James Dewey
Watson
Maurice Hugh
Frederick Wilkins
1962 Nobel-díj a DNS molekuláris
szerkezetének felismeréséért
Oswald T. Avery (DNS a kromószóma anyaga)
Rosalind Franklin
Picture
51
6
A nukleinsavkémia koronázatlan királyai,
kémiai és orvosi Nobel-díjak:
Paul
Berg
Walter
Gilbert
Frederick
Sanger 1980
rekombináns-DNS A nukleinsavak
szekvenálásáért 1972 Nobel-díj
a ribonukleáz aktív centrumának
katalitikus aktivitása és kémiai szerkezete
közötti kapcsolat feltárásáért
Stanford Moore és William H. Stein
amerikai biokémikusok
Aaron Klug (angol kémikus ) 1982 Nobel-díj a krisztallográfiai elektronmikroszkóp kifejlesztéséért
illetve a bilológiai szempontból fontos nukleinsav-
fehérjekomplexek szerkezetfelderítéséért
Luis Federico Leloir (argentín biokkémikus)
1970 Nobel-díj
a cukor nukleotidok
felfedezéséért és a
szénhidrátok
bioszintézise kapcsán
elért eredményeiért
7
Sidney Altman és Thomas R. Cech
Amerikai/kanadai és amerikai kémikus
1989 Nobel-díj az RNS katalitikus
tulajdonságainak felfedezéséért.
Polimeráz
láncreakció (PCR)
Kary B. Mullis Michael Smith
1993 Nobel-díj Irányított
mutagenezis
Sir James
W. Black
Gertrude
B. Elion
George H.
Hitchings
1988 Nobel-díj a purin alapú kemoterápiás
gyógyszerek kifejlesztéséért
Venkatraman
Ramakrishnan
Thomas
Steitz Ada Yonath
2009 Nobel-díj
a riboszóma szerkezetének és
funkciójának tanulmányozásáért
8
9
Nukleinsavak:
1) A kromoszóma és felépítése
2) DNS- RNS építőelemek:
Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak
Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok
A DNS térszerkezete, a bázispárok
3) DNS nanorendszerek
4) DNS (RNS) reaktivitása:
hidrolízise
az építőelemek kémiai szintézise
kémiai (szilárdfázisú) szintézis
enzimatikus szintézis: a replikáció
5) Transzkripció
6) Transzláció
7) DNS analitika: szekvenálás
8) Bioenergetika
10
A prokarióták, körülhatárolt sejtmag
nélküli élőlények, tipikusan
egysejtűek, ilyenek az archeák és a
baktériumok
Az eukarióták olyan élőlények, amelyek valódi
sejtmaggal (a mag anyagát a citoplazmától egy
maghártya választja el) rendelkező sejtekből
épülnek fel (eu = valódi, karyon = sejtmag).
Mind a prokatiota-, mind az eukarióta-
sejtekben az információtárolásra a DNS
hivatott.
Egy eukarióta sejt genetikai anyagának többsége a
sejtmagban, kromoszómák formájában van tárolva. papucsállatka Escherichia coli
baktérium
1) A kromoszóma és felépítése
11
Fajfüggő az eukarióta sejtek
kromoszómáinak a száma:
rozs 14
galamb 16
giliszta 36
mezei nyúl 46
ember 46
csimpánz 48
kutya 78
ponty 104
pillangó 380
páfrány 1200
A szexuális úton szaporodó fajok mind testi
1) diploid (két kromoszómakészlet; 44+2)
vagy poliploid (több készlet; triploid –
magnélküli dinnye, stb.),
mind
2) haploid (egy készlet; 22+1) ivari
sejtekkel rendelkeznek.
Egy férfi diploid sejt kariogramja:
22*2 testi kromoszóma = 44
2 nemi kromoszóma: X és Y = 2
Σ= 46
Egy női diploid sejt kariogramja:
22*2 testi kromoszóma = 44
2 nemi kromoszóma: X + X = 2
Σ= 46
22*2+2 szabály
12
Egy női diploid sejt kariogramja:
22*2 testi kromoszóma = 44
2 nemi kromoszóma (X és X) = 2
kromoszóma gének
száma
bázispárok
száma
1 2 968 245 203 898
2 2 288 243 315 028
13 7 48 114 151 656
21 303 46 976 537
22 288 49 476 972
X (ivari kromoszóma) 1184 152 634 166
Y (ivari kromoszóma) 231 50 961 097
összesen = 46 ~30.000 ~3,2 109
„örökségünk”:
minden diploid sejt
kromoszóma-párja egy
anyai és egy apai
kromoszómát tartalmaz
apai anyai
3,2 gigabyte-nyi betűt
13
Egy eukarióta sejtciklusa: a sejtosztódás lépései: A G0 fázisban a sejtek változatlan
állapotba kerülnek, várva a sejtciklusba
vezető jelre.
- G1 fázis: első növekedési szakasz,
- S fázis: a DNS replikálódik
(46-ból 92 kromószóma lesz)
- G2 fázis: második növekedési szakasz,
és felkészülés az osztódásra,
- M fázis (vagy mitózis + citokinézis):
a sejt két utódsejtre válik szét
14
Egy kromoszómapár
vélelmezett
hierarchikus
szerkezeti
elrendeződése.
A feladat:
az eukarióta sejtek
mintegy 3.2 milliárdnyi
bázispárját feltekerve, azt
néhány mikrométerbe
tömöríteni.
0,2
-2 μ
m
15
A kódolo DNS aránya a
teljes genomhoz
viszonyított (%)
mindig jobb menetes, antiparallel, (kivéve a Z-DNS)
az egészet a H-hidak tartják egyben.
A nukleoszóma
a 8 histon fehérjét
körülölelő 146
bázispárnyi DNS-ből
áll. A komplexet a
H1 linker fehérjék
stabilizálják.
Eukarióta sejtek génjében van nem-
kódoló rész; intronok. (prokarióta
sejtekben tipikusan nincs intron.) Az
intron a pre-mRNS-be átíródik, majd
az RNS érés során az kivágódik.
A „supercoiling” 15000*
kondenzációt tesz lehetővé
kromatin
centromer
telomer régiók
A nukleoszóma
146bp DNS-t
tartalmaz
egy 8 hisztonból álló
fehérjemag köré
csavarva
16
1) Giemsa-festés: a „bázikus” festék a P-O−
gerinchez kötődik, de különösen az A-T
bázispárban gazdag régiókhoz (A-T résznél
sötétebb a szín)
2) Quinacrine-festés
fluoreszcens festés
Kromoszóma: (a görög chroma=színes és soma=test) egyetlen hosszú DNS, amely számos gént,
szabályozó és egyéb szekvenciákat tartalmaz.
Gustav Giemsa
(1867 – 1948),
német mikrobiológus
17
A nukleinsavak két fő fajtája a - dezoxiribonukleinsavak (DNS)
- ribonukleinsavak (RNS)
Kémiai építőelemek: nukleotidok és nukleozidok
N
OH OH
O
OP
O
HO
OH -N-glikozidos kötés
heterociklusos
bázis
egy nukleotid
1'2'3'4'
5'
hidrolízis
•heterociklusos bázis: purin vagy pirimidin
•ötszénatomos monoszacharid: D-ribóz vagy 2-dezoxi-D-ribóz
•foszfátion
- Savanyú jellegű (híg lúgban oldódó), nagy molekulasúlyú polimer vegyület.
- Olyan molekulák, amelyek az átörökítendő információ tárolására, annak átírására
(transzkripció) és átfordítására (transzláció) alkalmasak, aminek köszönhetően a sejt
összes fehérjéje meg tud szintetizálódni . (Alkalmasak továbbá reakciók katalízisére is.)
memo: nucleus = sejtmag 2) DNS- RNS építőelemek
18
Nukleinsav (polinukleotid) Foszforsavészterek hidrolízise:
Nukleozid (glikozid) + H3PO4
cc. NH3, 180 °C
HO
O
HO Q
NN
N
N
NH2
Q=OH adenozinQ=H dezoxiadenozin
nukleotidáz
H+
Nukleotidbázis + pentóz
(nucleobase)
A N-glikozidkötés hidrolízise:
purin
nukleozid
foszforiláz*
* Ez a foszforiláz
valójában egy hidroláz
enyhe degradáció
1N NaOH, 25 °C
Nukleotid (monomer)
PO
O
HO Q
NN
N
N
NH2
Q=OH adenozin-5'-monofoszf átQ=H dezoxiadenozin-5'-monofoszf át
OH
OHO nukleáz
19
D-ribóz D-arabinóz D-xilóz D-lixóz
O Opirán furán
O O
tetrahidro-2H -pirán tetrahidrofurán
memo:
Ciklusos félacetál képződése, avagy hogyan rajzoljuk a furanózokat:
C
C C
C
CH2OH
H
OHOH
H
H
HO
O
nyílt láncú D-ribóz
1
23
4
5
C
C
CH
H
H OH
OH
OH
H
C O
HOCH2
CH
OH
H
OH
HHCC
C
O
-D-ribofuranóz -D-ribofuranóz
HC
C C
C
O
H
OHOH
H
H2COH
H
23
4
5 H
O
1H
1
23
4
5
OH
HOCH2
COH
H
H
OH
HHCC
C
O1
23
4
5
OH
A nyílt láncú D-fruktóz különbözö konformációi
CH2OH nyílt láncú D-ribóz
1
2
3
4
5
Nukleozidokban
mindig 5 tagú
(furanóz) gyűrű
formájában van
a ribóz vagy
dezoxi-ribóz
jelen.
Nukleinsav építőelemek; a D-ribóz
20
két heteroatomos hattagú gyűrűk (Bruckner. III/1 .)
Aromás vegyületek:
Nem aromás származékok
memo: gyenge bázisok: a piperazin 10%-os vizes
oldatának pH-ja 10.8-11.8.
Nukleinsav építőelemek; a heterociklus
21
Az uracil keto-enol tautomer egyensúlyi formái:
memo: csak a laktim-
laktám vagy a dilaktám
forma jöhet szóba, az N-
glikozid kötés miatt.
Pirimidinszármazékok, nukleinsav építőelemek; a barbitursav
fontosabb tautomerjei
22
N
N NH
N
OH
H2N
2-amino-6-hidroxi-purin
guanin
N
N NH
N
NH2
6-amino-purin
adenin
A guanin keto-enol tautomer egyensúlyi formái:
Melyik tautomer forma a stabilabb?
Nukleinsav építőelemek; purinszármazékok
23
HO
O
HO OH
N
NN
N
NH2
adenozin
9-(-D-ribofuranozil)-adenin op= 235oC
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
HO
N
NN
N
NH2
O
OHOH
HH
HH
OP-O
O-
O
N
NN
N
NH2
O
OHO
HH
HH
PO
O-
HO
O-adenozin-5'-foszfát5'-AMP
adenozin-3'-foszfát3'-AMP
adenozin
adenozid
HO
O
HO
N
NN
N
NH2
dezoxiadenozin
9-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-adenin op= 190oC
N
NN
N
NH2
O
HOH
HH
HH
HO
N
NN
N
NH2
O
HOH
HH
HH
OP-O
O-
O
N
NN
N
NH2
O
HO
HH
HH
PO
O-
HO
O-dezoxiadenozin-5'-foszfát5'-dAMP
dezoxiadenozin-3'-foszfát3'-dAMP
dezoxiadenozin
dezoxiadenozid
DNS építőelem
RNS építőelem
24
HO
O
HO OH
N
NN
N
OH
guanozin
9-(-D-ribof uranozil)-guanin op= 240oC
N
NN
N
OH
O
OHOH
HH
HH
HO
N
NN
N
OH
O
OHOH
HH
HH
OP-O
O-
O
N
NN
N
OH
O
OHO
HH
HH
PO
O-
HO
O-guanozin-5'-foszfát5'-GMP
guanozin-3'-foszfát3'-GMP
guanozin
guanozid
NH2NH2
NH2NH2
HO
O
HO
N
NN
N
OH
dezoxiguanozin9-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-guanin
N
NN
N
OH
O
HOH
HH
HH
HO
N
NN
N
OH
O
HOH
HH
HH
OP-O
O-
O
N
NN
N
OH
O
HO
HH
HH
PO
O-
HO
O-dezoxiguanozin-5'-foszfát5'-dGMP
dezoxiguanozin-3'-foszfát3'-dGMP
dezoxiguanozin
dezoxiguanozid
NH2 NH2
NH2 NH2
DNS építőelem
RNS építőelem
25
RNS építőelem H
OO
HO OHcitidin
3-(-D-ribof uranozil)-citozin op= 230oC
O
OHOH
HH
HH
HO
O
OHOH
HH
HH
OP-O
O-
O
O
OHO
HH
HH
PO
O-
HO
O-citidin-5'-foszfát5'-CMP
citidin-3'-foszfát3'-CMP
citidin
citidinf oszfátok
N
N
NH2
ON
N
NH2
O
N
N
NH2
O
N
N
NH2
O
HO
O
HO
dezoxicitidin3-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-citozin
O
HOH
HH
HH
HO
O
HOH
HH
HH
OP-O
O-
O
O
HO
HH
HH
PO
O-
HO
O-dezoxicitidin-5'-foszfát5'-dCMP
dezoxicitidin-3'-foszfát3'-dCMP
dozoxicitidin
dezoxicitidinfoszfátok
N
N
NH2
O
N
N
NH2
O
N
N
NH2
O
N
N
NH2
O
DNS építőelem
26
HO
O
HO OH uridin
3-(-D-ribofuranozil)-uracil op= 165oC
O
OHOH
HH
HH
HO
O
OHOH
HH
HH
OP-O
O-
O
O
OHO
HH
HH
PO
O-
HO
O-uridin-5'-foszfát5'-UMP
uridin-3'-foszfát3'-UMP
uridinn
uridinnfoszfátok
N
N
OH
O
N
N
OH
O
N
N
OH
O
N
N
OH
O
HO
O
HO
timidin
3-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-timin op= 183o
O
HOH
HH
HH
HO
O
HOH
HH
HH
OP-O
O-
O
O
HO
HH
HH
PO
O-
HO
O-timidin-5'-foszfát5'-TMP
timidin-3'-foszfát3'-TMP
timidin
timidinfoszfátok
N
N
OH
O
N
N
OH
O
N
N
OH
O
N
N
OH
O
H3C H3C
H3CH3C
RNS építőelem
DNS építőelem
27
Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok: A purin degradációs út: PNPáz:= Purin nukleozid foszforiláz
PNPáz
Adenozin
dezamináz
AMP →
GMP →
nu
kleo
tidáz
memo: purinvázas alkaloidok: di- és trimetil xantinok:
28
A DNS
kémiai szerkezete
Az RNS
kémiai szerkezete
foszforsavdiészter típusú,
nem-elágazó, lineáris polimer,
amit az 5’→3’ irányba írunk:
..-5’-C-G-T-A-3’-..
5’
3’
29
Erwin Chargaff 1905 - 2002
A Chargaff-szabály megadja a nukleotidok belső
arányait a DNS-ben:
Σ(pur.)/Σ(pir.) ≈ (G+A)/(C+T) ≈ 1
és A/T ≈ 1 és G/C ≈ 1 memo: (G+C)/(A+T) változik: ez adja a DNS
termostabilitását (lásd később)
C
P
G
P
T
P
A
P
C
P
A
P
T
P
G
P
3’
5’
3’
5’
30
A DNS jobbmenetes kettős hélix téralkatú, körülbelül 10 nukleotidpárral hélix menetenként. A
spirálokat H-hidak tartják össze, az egyik a kódoló a másik a templát szál. Az adenint és a
timint 2, míg a guanint és a citozint 3-H híd köti össze. Ezt a téralkatot először James Watson
and Francis Crick becsülték (határozták) meg helyesen 1953-ban Rosalind Franklin
diffrakciós méréseinek köszönhetően.
A DNS térszerkezete, a bázispárok
31
Wats
on
-Cri
ck p
árk
épzé
s H
oog
stee
n p
árk
épzé
s
G C A T
d+
d- parciális
töltés
színkódja: interface: kedvező elektrosztatikus kcs.
interface: kedvező elektrosztatikus kcs. interface: kedvezőtlen elektrosztatikus kcs.
A DNS térszerkezete, a bázispárok
32
Watson-Crick Hoogsteen
33
Watson-Crick Hoogsteen
34
G is C is amino-laktám forma A amino (aromás) míg T dilaktám forma
Francis Harry
Compton Crick
James Dewey
Watson
- a hidrofil és negatív töltésű
„foszfodezoxiribóz” gerinc
„kifelé” mutat
- a bázisok befelé állnak,
intermolekuláris H-hidakkal
stabilizáltak,
- a cukor-foszforsav diészter
gerinc teljesen konzervatív,
míg a heterociklusok
permutálódnak,
- a bázispárok miatt a DNS két
szála komplementer jellegű
- a heterociklusok pontos
szekvenciája hordozza az
információt.
A kettős hélix
(double helix, duplex)
1953
Watson-Crick párképzés: fontos, ez található elsősorban a duplexekben
Rosalind Franklin
krisztallográfia (1952)
DNS elektronsörűség-
eloszlása
35
Normális és „abnormális” bázispár képzés
-G-
-C-
-G- -G-
-C- -C-
-G- -G-
-C- -C-
-G-
-C-
-G*- -A-
-T- -T-
-G- -G-
-C- -C-
szülő gyerek unoka
mutáció
Mutáció I:
memo: ugyanúgy megvan a „3. H-híd” is, ám míg a normál esetben (felső) a purin bázis a 3. H-
hídban az akceptor, addig a mutációra vezető esetben ugyanitt a H-híd donor szerepét tölti be. A két
tautomer eltérő H-híd mintázatú, s ezért eltérő partnerrel (pirimidin bázissal) képez WC párt.
Replikáció #1 Replikáció #2
36
37
magyarázat:
mutáció
-A-
-T-
-A- -A-
-T- -T-
-A- -A-
-T- -T-
szülő gyerek unoka
-A-
-T-
-H*- -G-
-C- -C-
-A- -A-
-T- -T-
indukált mutáció:
memo: ugyanúgy megvan a 2.
H-híd, ám míg a normál
esetben (alsó) a purin bázis a
2. H-hídban donor, addig a
mutációra vezető esetben
(felső) az akceptor szerepét
tölti be. A két tautomer eltérő
H-híd mintázatú, s ezért
eltérő partnerrel (pirimidin
bázissal) képez WC párt.
Mutáció II: a kémiai reagensek kiváltotta mutációk:
Pl. salétromossav (NaNO2 + HCl)
38
A leggyakoribb forma a B-DNS, amely jobbmenetes, a két szál antiparallel elhelyezkedésű
nagyárok
kisárok
memo: Az A olyan mint a B-forma, csak „tömörebb”.
A
P
C
P
C
P
C
P
G
P
G
P
G
P
T
P 3’
5’
3’
5’
A DNS térszerkezete, a bázispárok
memo: Legtöbb DNS téralkata a B-forma amikor vízzel egyensúlyt tart a molekula.
Ha lecsökken a víz tenziója (pl. tömény NaCl oldattal tart egyensúlyt a DNS, s ezért kisebb
a tenzió), akkor megjelenhet az A-forma. Kérdés: mi lehet a helyzet a kromoszómába
becsomagolt DNS esetén?
39
jobbmenetes
hélix
balmenetes
hélix
jobbmenetes
hélix
Az A-DNS hélix
tömzsibb és rövidebb,
mint a B-DNS,
a főtengelyhez képest a
bázispárok síkja
döntött ( ┴ képest 19o).
R
HO H
H
O
O
C-3' a sík felettC-3' endo
R
H
O H
HO
O
C-2' a sík felettC-2' endo
Az Z-DNS hélix
karcsúbb,
főtengelyhez képest a
bázispárok síkja
döntött (┴ képest 9o).
Az B-DNS hélixben
a főtengelyhez
képest a bázispárok
síkja merőleges (┴
képest 1o).
40
A DNS 3 fő formájának szerkezeti jellemzői:
gemetriai jellemzők: A-DNS B-DNS Z-DNS
hélix típús jobbmenetes jobbmenetes balmenetes
ismétlödő egység 1 bp 1 bp 2 bp
bp-onkénti elcsvarodás 32.7° 35.9° 60°/2
1 menetre eső bp száma 11 10.5 12
főtengelytől vett „eltérés” +19° −1.2° −9°
emelkedés/bp 2.3 Å (0.23 nm) 3.32 Å (0.332 nm) 3.8 Å (0.38 nm)
menethossz 28.2 Å (2.82 nm) 33.2 Å (3.32 nm) 45.6 Å (4.56 nm)
átmérő 23 Å (2.3 nm) 20 Å (2.0 nm) 18 Å (1.8 nm)
Milyen hosszú az emberi
genom (kihúzva és
„egyesítve”)?
A teljes genom (44 +2
kromoszóma) összesen
mintegy 3,2 milliárd
bázispárból épül fel:
3,2 109 * 3.32 10-10 m =
1, 06 m
A kettős spirál szétválasztása
szuperspiralizációt indukál
41
N
N
O
OH3C
timinoxo-f orma
N
N
N
NN
adenin
H
H
H
ribóz
ribóz
N
N
O
N
citozinoxo-f orma
N
N
N
NO
N guaninoxo-f ormaH
H
H
H
H
ribóz
ribóz
Atkins de Paula 118
A DNS hőstabilitása / denaturálása
DNS termostabilitás
y = 39,7x + 324R2 = 0,996
y = 39,7x + 344R2 = 0,996
335
340
345
350
355
360
365
370
375
380
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
GC- frakcióT
m (
K)
0 NaCl
150mM NaClLineáris (0 NaCl)
Lineáris (150mM NaCl)
megjegyzés:
- Minnél több a belső H-híd a DNS 2 szála között az
annál stabilabb dimert képez. (Fehérjék esetében ez nem
igaz, ott a belső H-hidakkal nem nő lineárisan a fehérje
termostabilitása!)
- A DNS Tm (60-80oC) pontja lényegesen magasabb mint
a testhőmérsékletünk, és jelentősen magasabb mint a
legtöbb fehérjénkké!
tétel: A DNS Tm pontja nő a GC frakció
növekedésével;
Tm1 < Tm
2 ha GC1/total<GC2/total! memo: mivel a GC-ben 3, míg az AT-párban csak 2
H-híd van bázispáronként.
kérdés: mennyi a Tm pont ha GC= 0,4?
válasz: Tm ≈ 340K (ha c(NaCl= 0))
kérdés: mennyi a Tm pont ha GC = 0,4, de teszünk
mellé NaCl?
válasz:Tm≈ 360 K (ha c(NaCl= 150 mMol))
kérdés: miért nő a Tm pont ugyanolyan GC
frakció mellett akkor, ha magasabb az oldat só
koncentrációja?
válasz: a DNS felszíni negatív töltései P-O–
kompenzálódnak.
memo:
- magas pH
- magas T (K)
A-T gazdag
régió
42
Nem-klasszikus DNS szerkezetek:
triplex DNS: háromszálú DNS
quadruplex DNS: négyszálú DNS
előfordul: pl. telomerek (kromoszómavégek)
4xG: négy guanidin helyezkedik el egy síkban,
egy kation + 4x 2 hidrogénhíd (a purinváz 7-es N-jével is) stabilizálja a szerkezetet.
43
Nukleinsavak:
1) A kromoszóma és felépítése
2) DNS- RNS építőelemek:
Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak
Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok
A DNS térszerkezete, a bázispárok
3) DNS nanorendszerek
4) DNS (RNS) reaktivitása:
hidrolízise
az építőelemek kémiai szintézise
kémiai (szilárdfázisú) szintézis
enzimatikus szintézis: a replikáció
5) Transzkripció
6) Transzláció
7) DNS analitika: szekvenálás
8) Bioenergetika
44
3) DNS nanorendszerek I: Holliday-junction, H-elágazás
(„kocka csúcsa”) hogyan
csináljunk ilyen alakzatot?
5’
5’ 3’
3’ 5’
5’
3’
3’
5’
5’ 3’
3’
180°
5’
5’ 3’
3’
TCTGCACATA AGACGTGTAT
5’
5’
3’ 3
’
azonos
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
„helikáz”
„helikáz”
memo: a kétszálú hélix és a „kereszt
forma” egyensúlyban lehet, (DS!)
1) vegyünk egy tompa végű DNS kettős hélixet:
Holliday, R. (1964). A mechanism for
gene conversion in fungi.
Genetical Research, 5, 282–304.
45
2) A DNS két szála nem feltétlenül egyforma hosszú:
ilyenkor van túlnyúló szakasz
(3’ overhang, 5’ overhang):
Az ilyen DNS is továbbalakítható:
3) Készíthetünk olyan
DNS-t melynek
1) egy részében a két szál
egymásnak nem
komplementere, valamint
2) amelynek mindkét
oldalán van egy-egy
túlnyúló szakasz:
Az ilyen DNS is
továbbalakítható:
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Az összes H-hidak száma:
CG =3
AT=2
4*(CG =3) → 12
6*(AT =2) → 12
10*(CG =3) → 30
10*(AT =2) → 20
46
4) Készítsünk olyan DNS szálakat, ahol a túlnyúló
szakaszok szekvenciáit alkalmasan választjuk meg:
4.1) barna-barna (a 8 H-híd összetartja majd a ligáz összeköti)
barna-hegyesvég
barna-tompavég
4.2) lila-lila (a 12 H-híd összetartja majd a ligáz összeköti)
4.3) fekete-fekete (a 10 H-híd összetartja,
ligáz összeköti)
47
5) Készítsünk ennek fényében olyan DNS
szálakat amelyek spontán módon, s a túlnyúló
szakaszaik révén egyértelműen asszociálódnak:
6) Készíthetünk ilyen módon kockát, vagy
komplexebb idomokat, minden csak tervezés
kérdése ezután? :
a) DNS nano-kocka, b) poliéder, c) csomó, stb.
N.C.Seeman,
MolBiotechnol, 2007,37,246-57
48
DNS nanorendszerek II:
T-elágazás („kocka csúcsa”)
TAGCAGTTCCTATGAG 5’ 3’
ACGACGTCAACTGCTA 5’ 3’
CTCATAGGGACGTCGT 5’ 3’
TAGCAGTT 5’
AACTGCTA 3’
CTCATAGGGACGTCGT 5’ 3’ CTCATAGGGACGTCGT
5’ 3’
TAGCAGTT 5’
AACTGCTA 3’
CTCATAGG 5’
3’
CCTATGAG
Összefoglalva:
49
50
1) Savas hidrolízis
az eredmény: „depurinálás” (A v. G)
DNS és RNS hidrolízise:
memo: az RNS és a DNS kb. egyforma
sebességgel hidrolízál savban
kérdés: a 2-deoxi D-ribóz félacetálja
savban felnyílik-e?
Ez nem
ribóz,
hanem
2-dezoxi-
D-ribóz!
51
memo: ezért az RNS kevésbé, míg a DNS jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek
eredmény: lánchasadás
2) Lúgos hidrolízis (az RNS lúgos hidrolízise):
memo: azért van DNS és nem csak RNS(?), mert az előbbi jobban ellenáll a lúgos
hidrolízisnek, azaz stabilabb!
Rib
52
DNS, RNS építőelemek kémiai szintézise:
1) Nukleozid szintézis I: a Hilbert-Johnson-nukleozid szintézis
T.B. Johnson, G. E. Hilbert, Science 69, 579 (1929)
G. E. Hilbert, T. B. Johnson, J. Am. Chem. soc. 52, 2001, 4489 (1930).
53
2) Nukleozid szintézis II: kapcsolás ribozilaminnal
A reakció javasolt mechanizmusa:
54
R
adenozin
N
N
N
N
NH2
OH OH
O
HON
N
N
N
Cl
R
N
N
N
N
S
R
N
N
N
N
H
H
NH3 H2SH2 / Ni
R: -D-ribofuranozil
3) Szubsztituált nukleozid (purin) származékok továbbalakítása:
55
P
H2C
H2C
O
Cl
dibenzil-foszfokloridát
4) Nukleotid szintézis: nukleozidok foszforilezése (pl. dibenzil-foszfokloridáttal)
N
N
N
N
SH
H
6-merkapto-purin
N
N
N
N
OH
Hallopurinol
N
N
N
N
O
H
H2N
O
OH
aciklovir
Orvosi alkalmazások:
Gyerekeknél akut leukémia
kezelésére
80%-os gyógyulás köszvény kezelésére
Herpes virus kezelésére
2 C-atom hiányzik a ribózból
Oligonukleotid szintézis:foszforamidit kapcsolási módszer
McBridge és Caruthers 1983.
1. Dmtr hasítás
(dimetoxi-tritil) 1.
2. Aktiválás és
kapcsolás
2.
4. Lánczárás
(az elreagálatlan
5’-OH-t acetilezzük)
3. Oxidálás I2
(H2O vagy THF) 4.
3.
57
Védőcsoportok I:
a bázisok védelme
„permanens”
csoportokkal
Cél: a primer aminok
védelme, avagy a
nukleofil csoportok
álcázása, hogy a
majdani kapcsolásnál
már csak a ribóz HO-5’
legyen csupán az
egyetlen Nu.
N
NN
N
HN
N
N
HN
N
N
HN
NH
NN
N
O
NH
C
O
C
O
RibRib
CCH3
O
vagy
A
C
G
T
Rib
Rib
C
O
N6-benzoilezés
N4-benzoilezés N4-acetilezés
N2-izobutiril
nem kell védeni
OO
N
N
O
Rib
O
CH3H
DNS kémiai (szilárdfázisú) szintézise: észter kötés(ek) kialakítása, SN foszfor centrumon
58
B
O
HO
HH
HH
PO
O
O
B
O
HO
HH
HH
CN
cianoetilészter
formában
CNE
Mindkét típusú permanens védőcsoport típus
(N-benzoil vagy N-acetil és a CNE) is eltávolítható: vizes NH3-val
memo: a szintézis végén az összes állandó védőcsoport
vizes ammóniával kvantitatíve eltávolítható
Védőcsoportok II:
a foszfodiészter védelme „permanens” csoporttal
59
B
O
HO
HH
HH
PO
O
O
OCN
OMeMeO
B
O
HO
HH
HH
PO
O
HO
OCN
MeO
OMe
narancs szín
CCl3-COOH
3%
CH2Cl2 +
(enyhén savas rendszer)
Dmtr
Védőcsoportok III: az 5’-OH csoport „ideiglenes” védelme
60
A szilárd hordozó:
CPG (controlled pore glass)
kontrolált pórusú üveg
-kémiailag inert
-nem duzzad
-amino funkcionalizált
SiCPG
OMe
OMe
(CH2)n NH2
A „linker”:
COOHH2C
H2C COOH
Pl. borostyánkősav Si(CH2)n
OMe
OMe
CPGN
H
C
O
CO
O
O
NH3 / H2O hasító hely
61
A DNS szintézis lépésről lépésre : -szilárdfázisú szintézis 3’-től 5’ irányba halad
a „Caruthers”-módszer
Si(CH2)n
OMe
OMe
CPGN
H
C
O
CO
O
HO
HH
HH
O B1Dmtr
Si(CH2)n
OMe
OMe
CPGN
H
C
O
CO
O
HO
HH
HH
O B1H
enyhe savas detritilezés (3% TCA)
1. Dmtr hasítás
(dimetoxi-tritil)
2. Aktiválás és
kapcsolás
memo: a bioszintézis menete
az 5’-től 3’ irányba halad
62
Si(CH2)n
OMe
OMe
CPGN
H
C
O
CO
O
HO
HH
HH
O B1H
SN (5' OH SN reakciója)
NP
O
O
HO
HH
HH
O B2Dmtr
CNE
foszforamidit
MeCN
NN
NN
H
tetrazol(gyenge sav)+
2. Aktiválás és
kapcsolás
63
3. Lánczárás (az elreagálatlan
5’-OH-t acetilezzük)
4. Oxidálás I2
(H2O vagy THF)
Ciklus végén NH4OH-val:
- minden permanens védőcsoport eltávolítása
- gyantáról való lehasítás
Legvégén: kromatográfiás tisztítás
64
Összefoglalás: oligonukleotidok laboratóriumi szintézisére
B2
O
O
HO
B1
O
O
OP
O
RO
CPG
B3
O
O
O
OP
ROB
2
O
O
B1
O
O
OP
O
RO
CPG
DMTr
B3
O
O
O
NiPr2
PRO
DMTr
tetrazol
1. lépés Kapcsolás
B1,B
2,B
3: védett bázisok
R:
-cianoetil
egy savra stabil, de bázisra érzékeny védõcsoport
CPG: "controlled pore glass" (porózus üveg)
N C CH2 CH2
O O
dimetoxitritil
egy savra érzékeny védõcsoport
DMTr :tetrazol:
N
N
N
N
H
H
Foszforamidit kapcsolási módszer
65
B3
O
O
O
OP
O
ROB
2
O
O
B1
O
O
OP
O
RO
CPG
B3
O
O
HO
OP
O
ROB
2
O
O
B1
O
O
OP
O
RO
CPG
DMTr
3. lépés Védõcsoport
eltávolítása
2. lépés Oxidáció
I2 HA
memo: A PCR-től eltérően a kémiai szintézis nem igényel „templátot”
66 Aldous Huxley Szép új világ
J. Craig Ven Science 2 July 2010:
Vol. 329 no. 5987 pp. 52-56
Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome
2003-ban még „csak” egy alig több mint 5000 bázispárt,
2010-ben már 1 millió bázispárt lehet szintetikusan „összerakni”!
„íme az első olyan élő szervezet amely atyja
egy számítógép, s amely megalkotása az
emberi elme és egynéhány robot műve volt”
http://www.youtube.com/watch?v=QHIocNOHd7A
A szintetikus biológia hajnala
67
A DNS enzimatikus szintézis: a replikáció
cél: a genetikai kód megkettőződése:
A kettős hélix az egyik pontján kitekeredik, majd a templátok
mentén a komplementer szálak megszintetizálódnak.
68
DNS polimeráz: 5’ => 3’ irányban szintetizálja az új láncot.
Leading strand = „vezető” szál, folyamatos szálszintézis
Lagging strand = „követő, sántikáló” szál, darabonkénti
szálszintézis, majd utólagos összekötés (DNS ligáz)
A DNS enzimatikus szintézis: a replikáció
69
1. ciklus
PCR vagy Polymerase Chain Reaction (magyar polimeráz láncreakció)
egyszerű és hatékony enzimatikus módszer a DNS-molekulák számának - adott
láncvégek (primerek ) közötti – növelésére. (VIDEO)
T=72°C: nukleotidok bekapcsolódnak,
majd a polimeráz enzim összeligálja
azokat egy-egy lánccá
memo: praktikus termostabil
polimerázt használni, ekkor nem kell
az enzimet ciklusonként pótolni
fütés T=95°C és alkalmas
2 primer hozzáadása
T=55°C: a primerek
helyrekerülnek
(letapadnak, annelláció)
A feladat: [ ]n
Kary B. Mullis
1993 Nobel-díj
70
fütés T=95°C és alkalmas
primerek hozzáadása
2. ciklus
T=55°C (helyre kerülnek
az új primerek)
T=72°C-on a nukleotidok
bekapcsolódnak, s a polimeráz
összeligálja az új szálakat
memo: 4 kópia van de ebből még mind csak közti termék, tehát egyik sem jó még!
71
3. ciklus végén 8 kópia van s ebből már 2 jó!
4. ciklus végén 16 kópia van, ebből 8 rossz, de 8 jó!
5. ciklus végén 32 kópia van, ebből 10 rossz, 22 jó!
6. ciklus végén 64 kópia van, ebből 12 rossz 52 jó!
10. ciklus végén 1024 kópia van, ebből 20 rossz, 1004 jó!
összes kópiák száma: 2n, ebből rossz 2n, jó (2n −2n)
Kary B. Mullis USA biokém.
1983-ban kifejleszti a PCR-t,
1993-ban megkapja a Nobel-d.
72
30. ciklus után
a helyes kópiák száma
(a várt termék) >1 milliárd
tehát: [ ]n>109 *30
Lényegében tiszta terméket kapunk, mert 2n << (2n −2n)
73
Nukleinsavak:
1) A kromoszóma és felépítése
2) DNS- RNS építőelemek:
Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak
Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok
A DNS térszerkezete, a bázispárok
3) DNS nanorendszerek
4) DNS (RNS) reaktivitása:
hidrolízise
az építőelemek kémiai szintézise
kémiai (szilárdfázisú) szintézis
enzimatikus szintézis: a replikáció
5) Transzkripció
6) Transzláció
7) DNS analitika: szekvenálás
8) Bioenergetika
74
DNS
mRNS
fehérje
„átírás”, „másolás”
RNS polimeráz (enzim)
„fordítás”, „dekódolás”
riboszóma (ribozim)
5) Transzkripció A DNS-ről mint információhordozóról a gének leolvasása,
a hírvivő RNS szintézise:
(transzlokáció és
mRNS érés)
transzkripció
transzláció
A DNS-ről RNS-re átírás kezdete:
Folyamata:
a bioszintézis menete
az 5’-től 3’ irányba halad
RNA-Polimerase
Transzkripciós faktor
(fehérje complex)
75
Transzkripció lépései:
elongáció
terminálás
5’CATCCAATTGG 3’ kódoló DNS szál 5’CAUCCAAU3’ születő RNS szál 3’GTAGGTTAACC 5’ templát DNS szál
A transzkripció iránya
RNS polimeráz
iniciáció: promoter régió
76
Ribonukleinsav (RNS) és fehérjeszintézis
gén: olyan DNS szegmens amely tartalmazza mindazon információk összességét amely az adott
polipeptid vagy fehérje szintéziséhez szükséges. (pl. egy egyszerű bacilus DNS-e is legalább 3000
különböző enzimfehérjét kódol.)
A transzkipció folyamatának szereplői:
RNS-polimeráz: egy enzim amely széttekeri a DNS kettős spirált
Promoter: a DNS-nek az a része ahova az RNS-polimeráz kötődik és
ahol megkezdi a transzkripciót
RNS nukleotidok, mint építőelemek
Terminátor: prokarióták azon DNS része ami jelzi a transzkripció végét
Transzkripciós egység: az a DNS darab amely RNS-é átíródik.
Transzkripcós faktorok: az eukarióta sejtek azon fehérjéi amelyek az
RNS-polimeráz kötését, illetve a transzkripció megkezdését elősegítik.
Transzkripciós iniciációs komplex: a transzkripciós faktorok és a
promoter régióhoz kapcsolódó RNS-polimeráz II együttese.
TATA „box”: A DNS promoter része
77
A hírvivő-RNS (messenger-RNS, röviden mRNS) szintézise:
A
C
C
G
etc.
P
P
P
DNS
U
P
C
P
G
P
G
P
komple-
menter RNS
etc. U
G
G
C
P
P
P
komple-
menter RNS.
etc.
P
P
P
DNS
A
C
C
G
etc.
etc.
P
P
P
DNS
P
P
P
A
C
C
G
U
G
G
C
RN
S p
olim
erá
z
láncszétv
álá
s
dezoxiribóz: ribóz:
Transzkripció a sejtmagban történik, a szintetizálódott RNS-
nek van fehérjét kódoló (exon: „expressed sequence”) és nem-
kódoló része (intron: „intervening sequence”).
Az intron a pre-mRNS-be átíródik, majd az RNS érés során
kivágódik. A kész m-RNS elvándorol a citoplazmába ahol a
fehérjeszintézis templátjaként szerepel.
78
DNS:
- nem kódoló részek
- kódoló részek (gének) >>>>>> mRNS:
- nem kódoló részek (intron: „intervening sequence”)
- kódoló részek (exon: „expressed sequence”) >>>>>>> fehérje
fehérje
79
RNS fajták és funkciójuk:
kódoló RNS:
• mRNS: hírvivő (angol: messenger) RNS: DNS-ből másolt RNS, mely a genetikai
információt hordozza, és ezt a riboszómához szállítja, ahol a rajta lévő információ
alapján a fehérjék szintetizálódnak. Három egymás melletti bázis alkot egy-egy
kodon-t, amely egy-egy aminosavat kódol.
• pre-mRNS: éretlen mRNS. Az érés során a nem-kódoló részek (intronok)
kivágódnak, csak a kódoló részek (exonok) maradnak az érett mRNS-ben.
nem-kódoló RNS:
• tRNS: transzfer RNS: segít az mRNS-en található kód (kodon) leolvasásában.
Minden létező kodonhoz külön tRNS tartozik, mely a kodonnak megfelelő
aminosavat hordozza, és a riboszómához szállítja, majd ott részt vesz a
fehérjeszintézisben
• rRNS: riboszomális RNS: a riboszóma alkotóeleme, mely a fehérjeszintézis
katalitikus centrumát alkotja.
léteznek további nem-kódoló RNS-ek is, mint például:
• siRNS: (small interfering RNA): gének kikapcsolásáért felelős rövid RNS részek
(a DNS-hez kötődnek, és így meggátolják annak átíródását)
80
Az RNS térszerkezete: általában egyszálú, de Watson-Crick-féle párképzés a szálon belül,
azaz önmagával itt is kialakulhat:
tRNS térszerkezete
E.coli rRNS kis-
alegységének téralkata
egy „hairpin” RNS téralkat
81
Szállító RNS (transzfer RNS, tRNS)
feladata: hogy a megfelelő helyre eljuttassa az aminosavat
antikodon hurok
A tRNS aminosav
akceptor karja 3’
82
Szállító RNS (transzfer RNS, tRNS)
jellemzői:
- 70-90 nukleotidból áll,
- mindig a CCA- véghez kapcsolódik
észterkötéssel az aminosav (pl. Tyr),
- minden aminosavnak saját tRNS-e van, amelyen az
annak az aminosavnak megfelelő antikodon található
(egy aminosavhoz egy vagy akár több tRNS is tartozhat)
- például:
Met
UAC ….tRNS: antikodon (CAU)
AUG ….mRNS: kodon
83
As. m-RNS As. m-RNS As. m-RNS
5’→3’ 5’→3’ 5’→3’
Ala GCA His CAC Ser AGC
GCC CAU AGU
GCG Ile AUA UCA
GCU AUC UCG
Arg AGA AUU UCC
AGG Leu CUA UCU
CGA CUC Thr ACA
CGC CUG ACC
CGG CUU ACG
CGU UUA ACU
Asn AAC UUG Trp UGG
AAU Lys AAA Tyr UAC
Asp GAC AAG UAU
GAU Met AUG Val GUA
Cys UGC Phe UUU GUG
UGU UUC GUC
Gln CAA Pro CCA GUU
CAG CCC
Glu GAA CCG lánckezdő
GAG CCU fMet AUG
Gly GGA
GGC lánczárás UAA
GGG UAG
GGU UGA
A mRNS tripletjei a genetikai kód: egy aminosavhoz egynél több kodon
(egynél több antikodonnal ellátott t-RNS) tarozik:
antikodon
X
Y Z
kodon
84
Transzláció, az információ lefordítása “fehérje nyelvre”, mely lépés során
a citoszólban a ribószómán megtörténik a fehérjeszintézis.
A szintézis
- résztvevői: mRNS (kodon) + tRNS (antikodon + aminosav)
- helyszíne: a riboszóma
- eredménye: a fehérje
85
Összefoglaló: az információáramlás hierarchiája:
DNS kodon → mRNS kodon → tRNS antikodon→ aminosav 5’ACCTTTCTAAAG → ACCTTTCTAAAG
UGGAAAGAUUUC5’ → UGGAAAGAUUUC
5’ACCUUUCUAAAG ACCUUUCUAAAG
TrpLysAspPhe Kodon „táblázat” az mRNS tripletjeinek kódját rendeli az aminosavakhoz
86
50S 30S
S: (Svedberg egység)
centrifugálás során a
szedimentációs
sebesség
Prokarióta riboszóma térszerkezete a riboszóma egy RNS-fehérje komplex:
két alegység
funkciója: kisalegység: köti az m-RNS-t
nagy alegység: katalitikus aktivitás,
fehérje szintézis
mérete:
- prokarióta esetén 70S (30S és 50S), MW~ 2.6MDa,
- eukarióta esetén 80S (40S és 60S), MW~ 4MDa,
összetétele: RNS és 30-50 fehérje (L1,..L34)
szintézis sebessége: 15-40 amidkötés/sec
szintézis megbízhatósága: ~1 hiba/106 amidkötés
memo: nem a fehérjék hanem az RNS végzi a katalízist:
ezért a riboszóma nem enzim hanem ribozim.
87
Transzláció
1. lépés: (itt kezdődjön a transzláció) mindig az „AUG” mRNS triplet.
2. ide mindig az N-For-Met aminosav kerül
3. szintézis irány N-term.-től a C-term. felé
4. lánczáró kodonok az mRNS-en: UAA, UAG és UGA. („a mondat végi pontot jelölik”)
5. a szintézis legvégén a For-csoportot egy enzim lehidrolizálja .
88
89
90
A ribozim katalizálta peptidszintézis elemi kémiai lépései:
az 50S alegység 2486 adeninje segíti
a nukleofil addiciót :
1) Az adenin nemkötő
elektronpárjának protonvonzása
részlegesen deprotonálja az
aminocsoportot, ezzel fokozva
annak nukleofil jellegét.
2) A tertaéderes köztitermék
elbomlását a proton visszaadása
iniciálja, kialakítva így a
peptidkötést. (Science 289; 920-30, 2000)
91
Transzláció áttekintése:
92
Kérdés: mi a következő DNS templáthoz szekvenciához
tartozó fehérje aminosav-sorrendje?
DNS: 5’ – TGA TTC GTA TTG CTC GTG – 3’
memo1: Ügyeljünk tehát a bázissorrend irányultságára (5’→3’ ≠ 3’→5’)
memo2: minden enzim az 5’ oldal felől olvas!
DNS: 5’ – TGA TTC GTA TAG CTC GTG – 3’
mRNS:3’ – ACU AAG CAU AUC GAG CAC – 5’
Peptid: – Ser -Glu -Tyr - Leu - Glu - His –
– S - E - Y - L - E - H –
5’CATCCAATTGG 3’ kódoló DNS szál 5’CAUCCAAU3’ születő RNS szál 3’GTAGGTTAACC 5’ tempát DNS szál
A transzkripció iránya
DNS → mRNS
5’A…3’T → 5’U
T… A → A
G… C → C 3’C…5’G → 3’G
kérdés: helyes-e ez az átírás?
93 Nature 413, 814-821 (2001)
A Clindamycin az amidkötés
kialakítását gátolja meg a
ribószóma felületén erre a
helyre kötődve
Az Erythromycin A kölcsönhat az
50S (nagy alegység) 2058-as
Adeninjével, s igy beül és blokkolja
azt a csatornát amelyen keresztűl
bújik ki a fehérje. Meggátolja tehát a
bakteriális fehérje szintézisét és a
baktérium elpusztúl. A Eukarióták
riboszómájának 2058 nukleotidja
nem A hanem G, s ehhez nem köt az
antibiotikum, igy lesz szelektív a
hatás
Az antibiotikumok egy jelentős hányada a riboszómához kötve fejti ki szelektív hatását:
A tetraciklinek a 2. tRNS helyére ülnek be, s ezzel gátolják a fehérjeszintézist
94
Nukleinsavak:
1) A kromoszóma és felépítése
2) DNS- RNS építőelemek:
Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak
Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok
A DNS térszerkezete, a bázispárok
3) DNS nanorendszerek
4) DNS (RNS) reaktivitása:
hidrolízise
az építőelemek kémiai szintézise
kémiai (szilárdfázisú) szintézis
enzimatikus szintézis: a replikáció
5) Transzkripció
6) Transzláció
7) DNS analitika: szekvenálás
8) Bioenergetika
95
cél egy DNS fragmens bázissorrendjének meghatározása:
megoldás: A lánczáró festékkel jelölt didezoxynukleotid (ddNTP) vagy
Sanger-féle módszer
7) DNS analitika: a szekvenálás
alapgondolata: a 3'-hidroxi-csoport hiánya megakadályozza a PCR-ezés
során a lánc továbbépülését: lánctörést okoz. Frederick
Sanger
Chain Termination Method
(Sanger, F., et al: PNAS, 1977,
74, 5463.)
3’C-G-A-A-T-A-T-G-C-G-A-G-T-C-T-G-G-C-A-A-C-T5’
A szekvenálandó (templát) DNS
amelyre mint templátra PCR –rel komplementer szálakat fogunk előállítani, de
szintézis során nem csak ATP, GTP, CTP és TTP használunk,
hanem ddATP, ddGTP, ddCTP és ddTTP-t is.
96
3’C-G-A-A-T-A-T-G-C-G-A-G-T-C-T-G-G-C-A-A-C-T5’
G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A
G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C
G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G-T
G-C-T
G-C-T-T-A
G-C-T-T-A-T-A-C
G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G
G-C
G-C-T-T
G-C-T-T-A-T-A-C-G-C
G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A
G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C
G-C-T-T-A-T-A-C-G-C
stb.
minden lehetséges fragmenst előállítunk
templát DNS és alatta a különböző PCR termék típusok:
agaróz gélen
(oszlopon)
megfuttatjuk,
amely méret
szerint szeparál,
s az oszlop alján
az éppen
„kifolyó”
fragmenst színe
alapján
azonosítjuk
G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G-T-T-G-A
bizonytalan szegmens
97
egy valódi szekvenálás végeredménye:
98
Elektromágneses energia forrása lehet hőerőgép és belsőégésű motor,
amelyekben a hőenergia égésből, azaz kémiai átalakulásból származik, ami
az atomok és molekulák elektronszerkezetéhez köthető átalakulás, azaz
elektromágneses folyamat. Az élőlények számára is kémiai folyamatok, azaz
az elektromágneses kölcsönhatás biztosítja az energiatárolást és
energiafelhasználást, tehát a biológiai energiák is elektromágneses
eredetűek.
Memo: Az energiaformákat vissza lehet vezetni a
fizika négy alapvető kölcsönhatásának
valamelyikére. A négy alapvető kölcsönhatás a
gravitációs, az elektromágneses, a gyenge és az
erős kölcsönhatás.
8) Bioenergetika
99
ATP: adenozin -5’- trifoszfát
DG~ –30.5 kJ mol-1
ATP + H2O → ADP + Pi ΔG˚ = −30.5 kJ/mol (−7.3 kcal/mol)
ATP + H2O → AMP + PPi ΔG˚ = −45.6 kJ/mol (−10.9 kcal/mol)
DG~ –45.6 kJ mol-1
foszfátészter foszforsavanhidrid
ATP is an unstable molecule in unbuffered water, which hydrolyses to ADP and phosphate. This is
because the strength of the bonds between the phosphate residues in ATP are less than the
strength of the "hydration" bonds between its products (ADP + phosphate), and water. Thus, if ATP
and ADP are in chemical equilibrium in water, almost all of the ATP will eventually be converted to
ADP. A system that is far from equilibrium contains Gibbs free energy, and is capable of doing work.
Living cells maintain the ratio of ATP to ADP at a point ten orders of magnitude from equilibrium,
with ATP concentrations a thousandfold higher than the concentration of ADP. This displacement
from equilibrium means that the hydrolysis of ATP in the cell releases a great amount of energy
Two phosphoanhydride bonds (those that connect adjacent phosphates) in an ATP molecule are
responsible for the high energy content of this molecule. In the context of biochemical reactions,
these anhydride bonds are frequently—and sometimes controversially—referred to as high-energy
bonds. Energy stored in ATP maybe released upon hydrolysis of the anhydride bonds. The bonds
formed after hydrolysis—or the phosphorylation of a residue by ATP—are lower in energy than the
phosphoanhydride bonds of ATP. During enzyme-catalyzed hydrolysis of ATP or phosphorylation by
ATP, the available free energy can be harnessed by a living system to do work.
Any unstable system of potentially reactive molecules could potentially serve as a way of storing
free energy, if the cell maintained their concentration far from the equilibrium point of the reaction.
However, as is the case with most polymeric biomolecules, the breakdown of RNA, DNA, and ATP
into simpler monomers is driven by both energy-release and entropy-increase considerations, in
both standard concentrations, and also those concentrations encountered within the cell.
8) Bioenergetika
100
ATP és GTP mint energiahordozók:
„elem” / „akkumulátor” (újrafeltölthető!)
(ATP) feltöltés:
direkt módon:
szubsztrát szintű foszforiláció:
a metabolizmus (ételek, raktározott zsírsavak,
egyéb anyagok lebontása) során az exoterm
ill. exergonikus reakciókban történő
ADP/GDP foszforilációja.
indirekt módon: oxidatív foszforiláció
a metabolizmus során redox-reakciókban
redukált koenzimek keletkeznek:
NADH+ és FADH2
Ezek a redukált koenzimek
elektrontranszporttal egybekötött,
szabályozott regenerálása (oxidációja) során
keletkezik ATP.
(ATP) felhasználás:
direkt módon: kapcsolt reakció
A sejtben igényelt anyagok szintézisében
az endoterm ill. endergonikus
reakciókhoz a kapcsolódó ATP/GTP
hidrolízis adja a megfelelő hajtóerőt a
reakció lefutásához.
pl.a felhasználásra:
- transzláció (fehérjeszintézis)
- kreatin (energiaraktár az
izomban)
- …
8) Bioenergetika
101
kérdés: mennyi glükóz elégetése teszi lehetővé egy 30 g össztömegű madár számára,
hogy 10 m magasra repüljön?
válasz: az elvégezendő munka nagysága mgh= (30*10-3 kg)* (9,81*ms-2)* (10 m) = 2,943 kg m2s-2 = 2,943 J
mivel 1 mol glükóz → DG ~ 2,828 106 J munka végzéséhez elegendő,
2,943 J munka elvégzéséhez 2,943 / 2,828 106 mol glükózra van szükség,
ami 1,04 μmol cukrot jelent.
Mivel a glükóz MW-je ~180 g/mol ezért ez hozzávetőlegesen (180 g/mol * 1,04*10-6 mol) = 0,19 mg
Atkins & de Paula 99
kérdés: a koncentráló emberi agy ~25 J energiát igényel másodpercenként. Mennyi cukor
(glükóz) elégetése szükséges ehhez óránként?
tapasztalat: 1 mol glükóz oxidációja 25 °C-on ~ 2828 kJ szabadentalpia (DG) felszabadulását eredményezi.
válasz: az elvégezendő munka nagysága óránként = (25 Js-1)* (3,6*103s) = 90000 J = 90 kJ
mivel 1 mol glükóz → DG ~ 2,828 10-3 kJ munka végzéséhez elegendő,
90 kJ munka elvégzéséhez 90 / 2,828 10-3 mol glükózra van szükség,
ami 32 mmol glükózt jelent.
Mivel a glükóz MW-je ~180g mol-1 ezért ez hozzávetőlegesen (180 * 32*10-3 g ) = 5,7 g/óra
Tehát az emberi agy naponta ~ 24 * 5,7g ~140g glükózt igényel.
tapasztalat: 1 mol szilárd glükóz CO2 gázzá és folyékony vízzé való oxidációja 25 °C-on
~ 2828 kJ (2,8 E6 J) szabadentalpia (DG) felszabadulást eredményez.
8) Bioenergetika
102
A napi 140 – 160 g glükóz többsége ATP-vé alakul és így hasznosul a sejtekben.
Aerob körülmények között 1 mol glükóz mintegy 38 mol ATP eredményez.
mivel Mw(ATP)/ Mw(glükóz) ≈ 507/180 = 2,82 ezért 2,82 * 38 * 160g ≈ 17,1 kg ATP
Ténylegesen egy 70 kg-os ember napi ATP „fogyasztása” ~ 145 kg
(mivel nem csak szénhidrátot, de zsírt és fehérjét is fogyasztunk!)
Ám a szervezetben egyszerre kb. 51 g össz ATP áll rendelkezésre,
ami a teljes szükséglet (51 g /1,45 105 g) kb. 0,035% -a.
Ez az tartalékolt ATP mennyiség tehát kb. (24* 3600s) * (3,5 10-4) ~ 30 s-ra elegendő mindössze!
Tehát az ember ATP szükséglete ~ 100g / perc (aktív mozgás esetén 500g /perc)
ADP/ATP ciklus (a foszforiltranszfer)
A kémiai reakció:
A biokémiai rész ciklus:
ATP4–(aq) + H2O → ADP2– (aq) +HPO42–(aq) DG~ –30 kJ mol-1
½ O2 H2O
– DG
ADP2– + HPO42– ATP4–
103
A teljes biokémiai ciklus:
foszforilátvitel
elektronátvitel
NAD+ (Nikotinamid-adenin-dinukleotid)
FAD (Flavin-adenin-dinukleotid)
½ O2 H2O
– DG
ADP2– + HPO42– ATP4–
– DG
NADH + H+ NAD+
FADH2 FAD
CO2 „C” +2H2O
+ DG
+ DG
– DG
memo: a félkövér résztvevők
(„C”, NADH+H+, FADH2, ATP)
azok a nagyobb energiájú
molekulák a megfelelő párokban.
memo: A negatív DG-s reakciók
hajtják a velük összekapcsolt
(„csatolt”) pozitív DG-s (piros
nyíl) reakciókat.
Tűz, ami melegíti a
levest csatolt
rendszert képeznek
a levegőn keresztül.
”égetés”
104
Néhány fontosabb foszfátvegyület
foszfátcsoport(jai) hidrolízisének DG- értékei
37 oC-on:
foszfoenol-piruvát DG~ –62 kJ mol-1
ATP → ADP DG~ –31 kJ mol-1
ADP → AMP DG~ –28 kJ mol-1
AMP DG~ –14 kJ mol-1
glükóz-1-foszfát DG~ –21 kJ mol-1
glükóz-6-foszfát DG~ –14 kJ mol-1
fruktóz-6-foszfát DG~ –16 kJ mol-1
memo:
kérdés: mit takar az ATP DG~ –31 kJ mol-1?
A hidrolízis exergonikus DG< 0 és éppen 31 kJ mol-1 energiát ad más csatolt ,
esetleg endergonikus reakciók lefolytatásához. Ezért hívjuk a megfelelő
savanhidrid kötést „nagyenergiájú” kötésnek.
memo: vegyük észre hogy az ATP „középen” helyezkedik el, ezért lehet foszfát
donor és akceptor is.
105
Az ATP hidrolízise felhasználható olyan csatolt endergonikus reakciókhoz, amelyek DG-je nem
nagyobb mint +31 kJ mol-1 .
pl. a peptidkötés szintézise erősen endergonikus:
DG~ +17 kJ mol-1
memo: az 1 mol víz a hidrát burok része, mivel a
reakció nem vákuumban megy. Innen a nagy entrópia
csökkenés (2-ből 1-re), a komplexitás növekedés.
DG ezért is ilyen kedvezőtlen.
memo: nem csak az entalpiaváltozás, de a szint entrópia csökkenése (komplexitás növekedése) is jelentős!
kérdés: hogy mehet végbe a reakció 37 oC-on?
válasz: ATP csatolt a reakció.
memo: a csatolt rendszer értelmében a két reakció össze van kapcsolva! (Ha a két reakció elkülönítve (2
edényben) megy végbe, vagy ha csak úgy összeöntjük a reagenseket, akkor a folyamat nem fog
végbemenni.)
memo: az 1 mol víz a hidrát burok része, mivel a reakció nem vákuumban megy. Innen a
formális mólszám növekedés (1-ből 2-re), emiatt van az entrópia növekedés, avagy a
komplexitás csökkenése is, ami egy további kedvező komponens.
A DG értéke (–31 kJ mol-1) ezért is ilyen kedvező.
ATP4–(aq) + H2O → ADP2– (aq) +HPO42–(aq)
tény: az ATP DG~ –31 kJ mol-1 valamint a DH~ –20 kJ mol-1 és DS~ +34 JK-1mol-1
TDS~ 310 K *34 JK-1mol-1~ +11 kJ mol-1 ) memo: mivel DG = DH – TDS
106
megfigyelés: Itt nem részletezett okok miatt 1 peptidkötés kialakításához 3 ATP szükséges.
kérdés: hány gramm glükóz kell 1 mol mioglobin bioszintéziséhez, ha az 153 aminosavból épül fel?
válasz: 153*3 = 459 ATP szükséges. 1 mol glükóz 38 ATP eredményez,
tehát 459/38~ 12 mol glükóz szükséges.
tehát: (12*180 g)~ 2,2 kg cukor kell 1 mol (16,7 kDa) fehérje szintéziséhez (~16,7 kg)
107
How to safely store genetic material:
cable reels in the cell nucleus...
Legend: The nucleosome
Nucleosomes are cable reels for genetic material. In the cell’s nucleus, the genetic
material (DNA) is organized in different chromosomes and protectively packaged. In
this storage packing, the DNA is wound around nucleosomes, just as a cable on a reel.
Each nucleosome consists of four pairs of proteins called histones. Apart from their
role as cable reels, nucleosomes are also involved in gene regulation as they prevent
DNA from being read at wrong positions.
Érdekes nano-rendszerek
108
I am not giving away the original data!
A copy is good enough...
Legend: RNA polymerase
RNA polymerase is essential for each cell. This protein reads the genetic code from the
genetic material in the cell nucleus and copies it onto so-called mRNA molecules. These
copies are then shipped to the ribosomes where they serve as blueprints for proteins.
Thus, the precious original always stays in the vault of the nucleus, and only copies are
shipped. Because RNA polymerase is so important, its function is constantly monitored
and controlled by a multitude of other molecules.
Érdekes nano-rendszerek
109
DNA is long…
where does a gene begin and how to find it?
Legend: The TATA-box binding protein (TBP) in yellow
The repetition of the amino acids threonine (T) and alanine (A) T-A-T-A marks the beginning
of a gene. The TATA-box binding protein (TBP) recognizes this specific genetic start
sequence and allows correct positioning of RNA polymerase. Without TBP, genes could not
be copied to mRNA and would, hence, not be read out. If the tail of TBP is too long, it causes
some of the most severe neurodegenerative diseases
Érdekes nano-rendszerek
110
Replikáció
Szemidiszkontinuus Azaz a DNS megkettőződése mindkét fonal mellett, ugyanabba az irányba történik
Ez azt feltételezi, hogy a replikációs mechanizmus mind 5’->3’ , mind 3’->5’
irányban képes DNS-t szintetizálni
De a DNS-polimeráz csak 5’->3’ irányban képes haladni, vagyis elsőként az 5’
helyen levő nukleotidot építi be, majd 3’ irányba folytatja a láncot
Vezető szál: folyamatosan szintetizálódik
Követő szál: szakaszosan szintetizálódik (Okazaki-fragmentumok)
Itt a szintézis iránya ellentétes a replikációs villa mozgásának irányával
A követő szál a villától távolodva szintetizálódhat
Ismétlés
111
Transzkripció
Iniciáció Az RNS polimeráz felismeri a DNS promoter szakaszát, hozzákötődve szétválaszt
12bp-nyi szakaszt, és megkezdi az RNS szál felépítését: ATP, UTP, GTP, CTP
Elongáció Az RNS-polimeráz 5’->3’ irányban építi be a ribonuleotidokat, működése során a
DNS-lánc mentén mozog
Termináció
A terminátor szakaszok lényegében lazítják a DNS és RNS közötti kapcsolatot
memo: a folyamat aszimmetrikus: csak az egyik szál másolódik,
a DNS két szála csak rövid ideig távolodik el egymástól
Ismétlés
112
Transzláció
Iniciáció Egy riboszóma, amelyik már befejezte egy másik mRNS transzlációját, alegységeire
disszociál (IF-3)
IF-3 kötődik 30S-hez és egy új RNS-hez
IF-2 hozzákapcsolja 30S-hez az első aminoacil-tRNS-t
Ehhez az iniciációs komplexhez kötődik GTP, majd 30S, ezután IF-3 leválik
GTP -> GDP: IF-2 is leválik
Ismétlés
113
Elongáció A transzláció iránya = transzkripció iránya = 5’ -> 3’
Az aa-tRNS minőségét az mRNS második kodonja határozza meg, amely az üres
A-helyen van (Katalizátor: EF-Tu, Energia: GTP
A peptidil transzferáz az fMet-t a P-helyen levő tRNS-ről az A-helyen levő aa-tRNS-re
kapcsolja, így egy dipeptid alakul ki az A hely tRNS-én
A transzlokáció során az mRNS az A-helyre kapcsolódó peptidil-tRNS-sel együtt egy
kodonnal továbblép balra (EF-G)
A P-helyen levő dezacilált tRNS leválik a riboszómáról
Az A-helyen levő dipeptidil-tRNS az A-helyre lép
A következő kodon az A-helyre kerül
Transzláció Ismétlés
114
Transzláció
Termináció RF-1 és RF-2 ismeri fel a STOP kodonokat
RF-3-mal és GTP-vel leállítják a transzlációt
Ismétlés