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现代生物医学进展 www.shengwuyixue.com Progress inModern Biomedicine Vol.10 NO.19 OCT.2010

乳腺癌微转移检测的研究进展 *苏洁之梁庆模△

（1南华大学湖南衡阳 421001；南华大学附属南华医院普外科湖南衡阳 421001）

摘要：乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤,近年在我国的发病率逐年上升。研究证实乳腺癌是全身性疾病,早期可能就存在血液、淋巴及骨髓的微转移。随着分子生物学技术的发展，乳腺癌微转移的检测已被越来越多的应用到临床，这对乳腺癌患者的预后判断和生存率的提高具有重要的意义。关键词：乳腺癌；微转移；检测；预后中图分类号：R737.9 文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2010）19-3778-04

Research progress in detection of micrometastasis of breast cancer*SU Jie-zhi1, LIANG Qing-mo△

(1 Postgraduate 2008 of Nanhua University, Hunan Hengyang 421001, China;Department of Surgery,Nanhua Hospital Attached to Nanhua University, Hunan Hengyang 421001, China)

ABSTRACT: Breast cancer is a common malignancy of women, the incidence in our country increased yearby year. Research hasshown that breast cancer is a systemic disease, early, there may be blood, lymph node and bone marrow micrometastasis.With the devel-opments of molecularbiology, the detection of micrometastatic breast cancer is more and more applied to clinic, which plays an importantrole in breast cancer patient's prognosis and improved survival.

Key words: Breast neoplasms;Neoplasm merastasis; Detection; PrognosisChinese Library Classification: R737.9 Document code: AArticle ID: 1673-6273(2010)19-3778-04

*基金项目：湖南省卫生厅（科研项目：B2009061）作者简介：苏洁之(1983年),女,硕士研究生, 电话：15173442082, E-mail:[email protected]△通讯作者：梁庆模，E-mail:[email protected](收稿日期:2010-06-10 接受日期:2010-07-05)

乳腺癌(breast cancer)是妇女常见的恶性肿瘤之一，在我国的发病率逐年上升,引起乳腺癌患者死亡的原因几乎均为远处的播散和转移。然而近十几年来，乳腺癌微转移越来越引起肿瘤学者的重视，人们对微转移存在的意义以及其对预后的影响等做了许多探索性的研究，并取得了一些颇具价值的成果。

1 微转移的概念

1971年,Huvos等以直径 2 mm转移灶为界,首次引入微转移的概念。2002年 AJCC制定的第六版乳腺癌分期定义了微转移 (>0.2mm，≤2.0mm)。目前一般认为，所谓微转移(mi-crometastasis) 是指非血液系统的恶性肿瘤在发生发展过程中，具有转移潜能的肿瘤细胞在术前或术时已脱离原发灶，以非常少的数量 "转移 "并 "粘附 "于外周血液、淋巴结、骨髓或远处器官（肺、肝等）中，但尚未形成转移结节。微转移的肿瘤细胞常以单个或微小细胞团的形式存在，故常无任何临床表现，常规CT、MRI、病理学方法不能检出。

2 乳腺癌微转移的检测途径

2.1 血循环检测微转移的提出最初就源于外周血中发现癌细胞,然而乳腺

癌患者血液中是否存在微转移一直是临床所关注的问题。Mikhitarian等[1]对 215例Ⅰ~Ⅲ期未发生临床明确转移的乳腺

癌患者用 RT-PCR分析外周血中多肿瘤标志物的表达，结果显示循环血中阳性标志物的表达与患者的分期有关,同时也预示着不良的预后。 Zheng等[2]收集了 108例不同分期的乳腺癌患者外周血,运用实时定量 PCR检测 CK19和 CEA的表达情况,结果发现 26例(24.1%)患者的 CK19表达阳性, 23(21.3%)例患者 CEA表达阳性, 15例(13.9%)患者 CK19和 CEA均表达阳性,且发现肿瘤的大小、临床分期,血管内皮生长因子等因素与患者外周血微转移有关。因此，外周血中的肿瘤细胞的检出对预测肿瘤复发、转移有重要的参考价值,并且有助于指导临床治疗。2.2 腋窝淋巴结检测

腋窝淋巴结是否发生转移一直作为进行肿瘤分期、判断预后和指导治疗的重要临床指标。近年来，采用连续切片、逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reac-tion,RT-PCR）和免疫组织化学(immunohistrochemistry,IHC)的方法对腋窝淋巴结进行检测，可以发现其中存在的微小转移。Tille JC[3]等对 149例乳腺癌患者的前哨淋巴结进行冰冻切片，并通过 IHC检测，发现 63例前哨淋巴结是阳性，其中 22例是微转移，这表明前哨淋巴结的冰冻切片是微转移检测较为准确的方法，同时显示其良好的敏感性。Daehoon等[4]分析了乳腺癌腋窝淋巴结微转移与乳腺癌患者预后的关系，选取常规病理检测阴性的患者(N0),发现其中 84例患者存在微转移，且证实了

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存在微转移患者的疾病缓解率及远期无病生存率较差,乳腺癌特异性生存率明显降低。近几年,前哨淋巴结微转移的检测逐渐被人们所重视,但是对于前哨淋巴结微转移阳性的患者是否行腋窝清扫术还没统一的定论,还有待于进一步的研究[5,6]。2.3 骨髓检测

研究发现，在女性乳腺癌转移患者中有超过 70%的患者会发生骨转移[7]。因此，骨髓微转移的检测对于乳腺癌患者判断预后及疾病的复发是一个可靠的独立的因素。Daskalaki A[8]等利用 RT-PCR 技术检测 165 例乳腺癌患者的骨髓和外周血中CK-19 mRNA 的表达量，发现其表达率分别是 57.6% 和55.2%。说明骨髓微转移的检测对于乳腺癌患者微转移的发生是一个独立可靠的因素，且表明乳腺癌骨髓微转移发生率高于血液。但是骨髓检测也存在一定的缺点[9]: (1)骨髓抽取是一项有创检查; (2)骨髓很难实现反复抽取样本来定期检测病情的变化; (3)骨髓抽取对于它的数量和体积很难有标准化的认识。以上种种都限制了骨髓检测乳腺癌微转移在临床上广泛的开展应用。

3 乳腺癌微转移的检测技术

乳腺癌微转移的检测方法有很多种，如连续石蜡切片、印迹细胞学检测、常规细胞学检测、集落形成实验等。随着近年来分子生物学和免疫技术的发展，微转移检测的灵敏度大大提高，其包括免疫组织化学、流式细胞术和逆转录聚合酶链反应，它们是目前微转移检测的主要方法，其余的检测方法由于灵敏度低等原因较少应用。3.1 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）

免疫组织化学是应用抗原抗体特异性结合的原理，使用已知的抗体在病理切片上使之与相应的抗原结合，然后把结合产物应用组织化学的方法显现出来，使之可以在显微镜下观察得以确认。Treseler[10]应用 IHC检测角蛋白可在大约 18%经常规检测为阴性的腋窝淋巴结中发现乳腺癌微转移。Mullenix等[11]

指出如果乳腺癌患者的前哨淋巴结经检测角蛋白为阳性，那么他们发生远处和区域转移的风险增加，这都说明了 IHC在乳腺癌微转移检测中具有一定的敏感性及有助于判断预后，然而利用 IHC检测乳腺癌微转移也有一定的局限性，如某些正常骨髓细胞可能会出现交叉反应，肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，不能准确定量等均限制了该方法的推广。3.2 流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）

流式细胞术是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：（1）测量速度快；（2）可进行多参数测量；（3）是一门综合性的高科技方法；（4）既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。Gao JD[12]等利用流式细胞术对 65例乳腺癌患者和 8例健康者的外周血进行检测，发现 65例乳腺癌患者中有 57例患者外周血中检测到癌细胞，阳性率达 87.7%，而 8例健康者均为阴性，这说明流式细胞术在乳腺癌微转移的检测中具有很高的敏感性。然而由于检测需要新鲜标本，不便于储存以及检查设备昂贵等原因流式细胞术的应用受到限制。3.3 逆转录聚合酶链反应 (Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction,RT-PCR)

逆转录 -聚合酶链反应是目前最敏感的微转移检测方法。

逆转录聚合酶链反应的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA，再以 cDNA为模板进行 PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。Benoy等[13]收集了 170例Ⅰ~Ⅳ期的初治乳腺癌患者的液和骨髓样本, 以 CK19和MAM作为检测微转移的标志物运用 RT-PCR方法检测 CK19和MAM表达情况, 结果 CK19和MAM阳性患者的死亡相对风险度分别为 3.5和 3.39倍，证明了微转移对于乳腺癌患者的预后有重要的意义。随着分子生物学的发展,一些更敏感更特异的方法用于微转移检测,如巢式 PCR(Nested-PCR)，荧光定量 PCR(Flu-orescene quantitative polymerase, FQ-PCR)、免疫磁珠 PCR(Im-munobeads-PCR)等。尽管 RT-PCR方法被广泛应用，但它也有着自身的的缺点，RT-PCR的高度敏感性必然产生非特异表达而出现假阳性，然而近几年出现的实时荧光定量 PCR技术能真正做到实时定量, Xenidis等[14]以 CK19作为微转移检测标志物,运用实时定量 RT-PCR对 167例未经辅助化疗、腋窝淋巴结阴性的乳腺癌患者外周血进行检测, 结果发现 21.6%患者出现阳性结果，这说明实时定量可以很好地区分肿瘤组织中的特异性表达和正常组织的低水平表达,因其克服了传统 PCR假阳性率过高的缺点。

4 乳腺癌微转移检测的标志物

肿瘤标记物(tumor marker)是肿瘤细胞产生的特异性物质或在数量上大大高于相应正常细胞的物质。理想的标志物应具敏感性、特异性且能反映癌细胞的存在。目前用于乳腺癌微转移的标记物有很多，例如细胞角蛋白、人乳腺球蛋白、癌胚抗原、多形上皮黏蛋白、乳腺上皮粘蛋白、mammary-serpin、转移 -粘附基因，现就以上几种标志物做如下介绍:4.1 细胞角蛋白(cytokeratin,CK)

细胞角蛋白是至少包括 20 种多肽（CK1-20）的多基因家族编码产物。其中 CK-19是目前研究最多的微转移检测指标之一。CK-19是一分子量为 40×103U的酸性蛋白质,为上皮细胞骨架的一部分,在恶性上皮细胞中,激活的蛋白酶加速了细胞角蛋白降解,使得大量片断入血。Saloustros E[15]等利用 RT-PCR发现约 20-40%早期乳腺癌患者的循环肿瘤细胞中 CK19为阳性，证明了 CK19可作为早期乳腺癌微转移检测指标之一。尽管 CK19经常被用作检测乳腺癌微转移的标志物, 但以 CK19作肿瘤标志物,用 RT-PCR方法检测微转移有时候会出现假阳性的结果。这有很多原因,如血液疾病的干扰、假基因的存在、样本的污染等[16]。4.2 人乳腺球蛋白(human mammaglobin,hMAM)

hMAM表达于乳腺上皮细胞, 在乳腺癌患者中常上调表达。1996年,Watson MA等[17]应用差异筛选技术分离得到了新的乳腺组织特异性基因，即 hMAM。在正常情况下,乳腺细胞是不能进入血液循环的，因此, 在乳腺癌患者的外周血中检出hMAM-mRNA的表达, 则提示有乳腺癌微转移的可能。Ron-cella等[18]采用巢式 RT-PCR技术检测 165例乳腺癌、66名健康者和 151例良性乳腺疾病患者外周血中 hMAM的表达情况，发现乳腺癌患者外周血中 hMAM的表达率为 95%(156/l65)，而健康者和良性乳腺疾病患者的外周血中全部为阴性。Shen C[19]等针对 94例乳腺癌患者、35例良性乳腺肿瘤、40例健康人、

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25例其他实体肿瘤患者的外周血，通过 RT-PCR检测发现 Sur-vivin和 hTERT基因在其他实体肿瘤患者外周血中是高表达，而 hMAM mRNA只在乳腺癌患者外周血中高表达，这说明hMAM mRNA能够成为早期乳腺癌患者微转移检测的辅助指标之一。鉴于 hMAM高特异性,它被广泛的作为淋巴结、骨髓及外周血中检测微转移的肿瘤标志物,是一个很有临床应用前景的乳腺肿瘤标志物。4.3 癌胚抗原（CEA）

CEA是主要存在于直肠，结肠癌组织和胚胎肠粘膜上的一种糖蛋白抗原，它可以促进肿瘤细胞与正常细胞结合，对肿瘤转移起着重要作用。许多研究认为，它可以作为观察乳腺癌远期复发的一个指标。Mariani L[20]等利用纵向数据统计模型，对 900多例乳腺癌患者的 CEA和 CA 15.3进行检测，对其区域和远处复发进行统计学分析，得出 CEA和 CA 15.3同为阳性时，乳腺癌诊断率最高，并表明 CEA和 CA 15.3在判断乳腺癌远期复发中扮演重要的角色。Zheng HY[21]等利用实时定量PCR对 28例健康女性志愿者、20例良性乳腺肿瘤和 108例乳腺癌患者的外周血检测 CEA mRNA 和 CK19 mRNA 的表达量，发现健康女性志愿者和良性乳腺肿瘤患者中 CEA mRNA和 CK19 mRNA是不表达或低表达，而在乳腺癌患者中则是高表达，这就证明联合检测 CK19和 CEA mRNA可以提高乳腺癌患者外周血微转移的检出率，并且与肿瘤大小，临床分期密切相关。因此可认为以 CEA、CK-19为标记物采用 RT-PCR技术检测乳腺癌微转移可能是预测局部复发的一个独立因素。4.4 多形上皮黏蛋白（mucin，MUCI）

MUCI基因定位于染色体 1q21，表达一种高分子量的跨膜糖蛋白，组织特异性不高，正常情况下主要表达于多种组织器官的腺管或腺腔面的上皮细胞，在多种上皮来源的恶性肿瘤中有异常表达。MUCI编码的蛋白在外周血中称为糖类抗原 15-3(carbohy-drate antigen15-3,CK15-3)，许多研究证实 CK15-3是判断乳腺癌预后的一个有价值的指标。Basuyau J[22]等通过对浸润性乳腺癌患者进行 10年的随访，发现 CA 15-3水平的增加与乳腺癌远期转移密切相关，并提示与乳腺癌预后不良有关。4.5 乳腺上皮粘蛋白（small breast epithelial mucin,SBEM）

乳腺上皮粘蛋白(SBEM)是 2002年 Miksicek RJ等[23]报道的一种新的用于检测乳腺癌微转移的标志物,该蛋白表达具有特异性,仅在乳腺和唾液腺中表达，可作为临床早期诊断乳腺癌生物学标志物。Valladares-Ayerbes M[24]等做了一个试验性研究，分别利用 PCR和 ICC检测乳腺癌患者的骨髓样本，结果SBEM mRNA的表达量分别是 26%和 24%，从而得出 SBEMmRNA可作为乳腺癌骨髓微转移的标志物之一，对于乳腺癌的早期诊断意义重大。仲雷等[25]用巢式逆转录 -聚合酶反应检测 60例乳腺癌患者术前外周血 SBEMmRNA的表达, 对其术后切除的组织标本用免疫组化 S-P法检测 c-erbB2 的表达情况。结果显示 SBEM-mRNA的阳性表达与 c-erbB2的高表达呈显著相关，且伴随 c-erbB2表达程度的增强而增高，并认为SBEM可作为乳腺癌微转移检测的标志物。4.6 mammary-serpin(maspin)

maspin基因是 1994 年 Zon 等从人正常乳腺肌上皮细胞中分离出一种基因，为新的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因,是一种肿瘤抑制基因。maspin在乳腺、小肠、前列腺等人体器官组织中有高水平表达,而在相应的恶性肿瘤中表达下调或不表达,提示

maspin可以作为肿瘤转移及预后评估的一个重要指标。StarkAM[26]等采用免疫组织化学对乳腺癌和乳腺癌脑转移瘤患者的标本中 maspin蛋白进行检测，发现 maspin基因表达量在两者中都是低表达，故其认为转移抑制基因 maspin可能参与了乳腺癌脑转移瘤的形成。Bitisik O[27]等采用巢式 RT - PCR检测了85例乳腺癌患者 maspin和 hMAM的表达量，治疗前 maspin阳性是 20例，hMAM阳性是 10例。观察 4例病人，经过治疗后，hMAM 阳性仅有 1 例，而 maspin 阳性有 3 例，这表明hMAMmRNA的检测有助于判断治疗效果，且 maspin基因转录则表示疾病预后差。4.7 转移 -粘附基因(metadherin，metastasis adhesion ,MTDH)

转移 -粘附基因 MTDH（metadherin，metastasis adhesion）为近年来发现的乳腺癌 "远处转移和器官粘附 "相关性靶基因。其位于人染色体基因组 8q22，翻译产物为一跨膜蛋白。MTDH最早在人类胎儿星形胶质细胞中，作为 HIV-1-和肿瘤坏死因子α-可诱导转录产物被克隆出来，后来发现它与恶性肿瘤的复发和转移有关[28]。Hu G[29]等通过荧光原位杂交技术和染色体组 DNA定量 PCR技术检测肺部高转移率乳腺癌样本8q22区域相关基因，发现其中MTDH不但为最高表达量基因，而且该基因与致乳腺癌患者高转移、复发、生存期下降密切相关；COX 模型多因素分析显示转移危害比与 MTDH 明显相关，提示MTDH为乳腺癌患者的独立预后因素。Li J[30]等应用RT-PCR 和 Western blot 技术检测，得出乳腺癌细胞 MTDHmRNA和蛋白质表达量显著高于正常乳腺上皮细胞，四组配对的原发乳腺癌组织 MTDH mRNA 表达量是正常乳腺组织的35倍；在 225例临床病理确诊乳腺癌石蜡标本中，免疫组化显示呈MTDH的高表达。统计学数据显示MTDH表达与乳腺癌临床分期、肿瘤分型、阳性淋巴结个数以及患者生存期呈显著相关性，多元分析提示MTDH为乳腺癌患者的独立预后因素。

5 微转移的临床意义

目前对微转移的临床意义尚有争议，但多数研究认为微转移可作为判断乳腺癌预后的独立指标。乳腺癌是全身性疾病，往往在早期即出现血行转移，然而大部分临床上可发现的乳腺癌患者肿瘤仅限于乳腺以及邻近的腋窝淋巴结,初治时没有常规方法可测量的病灶,治疗失败的原因主要是乳腺癌细胞的全身播散，因此如能早期检测到血液中的微转移病灶无疑有助于指导临床治疗方案及判断预后。但也有部分学者认为，外周血肿瘤细胞存在对乳腺癌患者尤其是早期患者的预后价值目前尚无可靠证据证实，且这样就增加了外周血中的肿瘤细胞向远处转移的危险，应及时给予预防监测和预防性治疗。另外一项重要预后因素是腋窝淋巴结转移情况，它与远处转移、生存期和 TNM分期密切相关。近年来,腋窝淋巴结活检冰冻病理切片技术判断乳腺癌病理分期,并决定是否行腋淋巴结清扫术广泛应用于临床。此外，乳腺癌患者骨髓肿瘤细胞是最有力的且误差很小的预后因素，而且多数学者支持乳腺癌骨髓微转移发生率高于血液，但相对骨髓而言，检测血液微转移患者更容易接受，并可以反复采集血液标本，因此，血液微转移的检测更易于推广。

6 展望

随着人们物质生活水平的提高，乳腺癌已作为威胁女性健

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康的 "头号杀手 "，乳腺癌在我国的发病率和死亡率都呈迅速上升趋势，发病年龄也日趋年轻化。虽然乳腺癌是目前治疗效果最好的肿瘤之一，但其复发率高。以我们目前对乳腺癌认识来安排治疗方案，仍有相当一部分病人出现了转移，这就需要我们寻找更好的指标来指导我们的治疗，微转移的检测就试图在预测肿瘤转移方面给我们做一个参考。随着免疫学和分子生物学技术的发展和应用,使得微转移的检测成为可能，并对诊断乳腺癌早期转移,指导临床治疗和判断预后产生深刻影响。

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