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Riarrangiamento dei geniper le Immunoglobuline e
sviluppo dei linfociti B
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• I geni che codificano i recettori per gli antigeni (BCR e TCR) sono presenti in uno “stato” non funzionale nella linea germinale
• Diversi eventi di ricombinazione devono avvenire durante lo sviluppo di ciascun linfocita per rendere funzionali questi geni
• Ciascun evento richiede l’introduzione di doppie rotture nel DNA cromosomico
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Chromosome localization of Ig loci
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• Sia le catene leggere che le catene pesanti sono codificate da famiglie multi-geniche separate• Nel DNA della linea germinale ciascuna famiglia multi-genica contiene diverse sequenze codificanti, dette segmenti genici, separate da regioni non codificanti
• Durante la maturazione dei linfociti B questi segmenti genici vengono riarrangiati• Il riarrangiamento crea un esone funzionale corrispondente alla regione variabile
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La regione VL è codificatada più di un segmento genico
• La regione variabile della catena leggera (VL) è codificata da 2 segmenti genici– segmento genico V
• codifica per i primi 95-101 a.a.– segmento genico J
• codifica per pochi a.a. (fino a 13)Il riarrangiamento dei segmenti V e J crea un esone (VJ)
che codifica per l’intera regione VL
VL
CL
Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig
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La regione VH è codificatada più di un segmento genico
• La regione variabile della catena pesante (VH) è codificata da 3 segmenti genici– segmento genico V– segmento genico D– segmento genico J
Il riarrangiamento dei segmenti V, D e J crea un esone (VDJ) che codifica per l’intera regione VH
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VH
Cm1
Cm3
Cm2
Cm4
Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig
Cm1 Cm2 Cm3 Cm4 TM Cyt
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Germline organization of Ig light- and heavy-chain loci in human genome
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Riarrangiamento catena kDNA catena k germ-line
DNA catena k riarrangiato
Trascritto primario catena k
V-J joining
Trascrizione
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Trascritto primario catena k
RNA splicing + poliadenilazioneCoda poli-A
TraduzionemRNA catena k
Polipeptide nascente catena k
Catena k
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DNA catena H riarrangiato
Trascritto primario
DNA catena H germ lineRiarrangiamento catena pesante
D-J joining
V-DJ joining
Trascrizione
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Catena Hm Catena Hd
splicing alternativoTrascritto primario catena H
mRNA catena H
Polipeptide nascente catena H
Catena H
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Co-espressione di IgM e IgD• Nelle cellule B naive il trascritto primario della catena pesante contiene sia gli esoni per i domini costanti della catena m che della d
– il trascritto primario non contiene esoni per altre catene pesanti (g, e, a)• Attraverso lo splicing alternativo vengono prodotti sia mRNA per m che per d• La cellula B naive co-esprime IgM e IgD con la stessa specificità antigenica
– stesso esone VDJ per dominio variabile delle catene pesanti m e d– catena leggera associata identica
• Le altre classi di Ig non sono mai co-espresseUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Recombination Signal Sequence, RSS• Accanto a ciascun segmento genico sono presenti delle sequenze dette recombination signal sequences (RSS)
– 1 RSS è collocata al 3’ di ciascun segmento V– 1 RSS è collocata al 5’ di ciascun segmento J– 1 RSS è presente al 5’ e un’altra al 3’ di ciascun segmento D
• Queste sequenze funzionano da segnali per i processi di ricombinazione
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Recombination Signal Sequence, RSS• Ciascuna RSS contiene
– NONAMERO: sequenza conservata non codificante di 9 nucleotidi• sito di legame per RAG1; ancora le proteine RAG al DNA
– EPTAMERO: sequenza conservata non codificante di 7 nucleotidi• aumenta legame di RAG, specifica sito di taglio
– eptamero e nonamero sono separati da uno “spacer” di 12 o 23 paia di basi• lo spacer varia di sequenza ma la sua lunghezza è conservata e corrisponde a uno (12 bp) o due (23 bp) giri di DNA doppia elica• la lunghezza dello “spacer” è cruciale per la ricombinazione
– permette corretta giustapposizione di nonamero ed eptamero
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Sequenze RSS
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“Regola 12/23”
Un segmento genico fiancheggiato da una RSS con uno spacer di 12 bp può ricombinare con un segmento fiancheggiato da uno spacer con 23 bp
Il complesso della ricombinasi V(D)J• Il complesso di enzimi che opera la ricombinazione somatica V(D)J è detto ricombinasi V(D)J• Recombinant-Activating Genes: RAG-1 e RAG-2
– i prodotti di questi geni costituiscono la componente della ricombinasi specifica dei linfociti (B e T)• necessari per la generazione dei recettori per l’antigene
– topi KO per uno dei due geni Rag non sviluppano linfociti B né T• sono espressi durante lo sviluppo dei linfociti solo quando avviene il riarrangiamento dei geni per il recettore dell’antigene
• La ricombinasi V(D)J include anche enzimi espressi ubiquitariamente e coinvolti nella riparazione del DNA– DNA ligasi IV, DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), Ku70/80, Artemis
• La ricombinazione avviene alle giunzioni tra le sequenze RSS e le sequenze codificantiUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
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Recombinant-Activating Genes:RAG-1 e RAG-2
• Proteine nucleari, altamente conservate in vertebrati• Costituiscono la componente della ricombinasi specifica
dei linfociti (B e T)• Necessari per la generazione dei recettori per l’antigene
• Il core di RAG-1 contiene– regione per legame a nonamero– regione centrale che interagisce con eptamero e RAG2– sito catalitico per taglio DNA
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• Il core di RAG-2– è necessario per il taglio del DNA– interagisce con RAG1– aumenta l’affinità di legame con il DNA
• RAG2 contiene una regione che lega la lisina 4 trimetilata dell’istone H3 (H3K4me3)– guidando il complesso RAG nelle regioni di cromatina attiva
Recombinant-Activating Genes:RAG-1 e RAG-2
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Fasi della ricombinazione 1• RAG1 e RAG2
riconoscono RSS– (alla formazione del complesso
partecipano anche altre proteine)
• le RSS di un segmento V e di uno J sono portate in prossimità
Segmento genico V
Segmento genico J
RSS - 1 giro
RSS - 2 giri
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Fasi della ricombinazione 2• taglio di un filamento di
DNA da parte di RAG-1 e RAG-2 alla giunzione delle RSS con le sequenze codificanti– tra eptamero e segmento
genico codificante
Segmento genico V
Segmento genico J
RSS - 1 giro
RSS - 2 giri
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Fasi della ricombinazione 3• l’estremità tagliata del
segmento genico codificante, viene unita al filamento opposto producendo una “forcina”
• all’estremità della RSS, viene prodotta una doppia rottura del DNA
Segmento genico V
Segmento genico J
RSS - 1 giro
RSS - 2 giri
• Vengono reclutate altre proteine– Ku70/Ku80
• La forcina viene tagliata in posizione casuale– RAG/Artemis– l’estremità viene poi modificata da
• esonucleasi• TdT (terminal deoxynucleotidyltransferase)
• Riparo e legame delle sequenze codificanti e di quelle segnale– DNA ligasi IV
Ricombinazione 4
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Generazione della diversità anticorpale(GoD, Generation of Diversity)
• Molteplici segmenti genici– diverse combinazioni V-(D)-J
• Flessibilità nel processo di giunzione– aggiunta e rimozione di nucleotidi
• Combinazione di catene pesanti e leggere• Ipermutazione somatica
– in linfociti B attivatiUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
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200 1.2x1066x103
6x103 0.72x106
1.92x106
120
Possibili combinazioni teoriche
xx
==
+=
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Figure 3-6Variabilità degli aminoacidi nelle Ig
Regione V catena pesante Regione V catena leggera
Variab
ilità
Variab
ilità
FR, frame region HV, hyper-variable region
HV3 ha una varibilità maggiore
di HV1 e HV2HV3 ha una
variabilità maggiore di HV1 e HV2
La regione del DNA dove avviene la giunzione V(D)J codifica per la regione ipervariabile 3 (HV3) che
corrisponde al CDR3
HV regions
HV1 HV2 HV3
HV1 HV2 HV3
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Flessibilità nel processo di giunzione:aggiunta e rimozione di nucleotidi
• l’estremità tagliata del segmento genico codificante, viene unita al filamento opposto producendo una “forcina”• (v. diapo precedenti)
Eptamero della RSSEptamero della RSS
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Flessibilità nel processo di giunzione:aggiunta e rimozione di nucleotidi
(P-addition)• Il taglio della forcina genera un filamento singolo
• Gli enzimi di riparazione aggiungono nucleotidi complementari a questa sequenza generando una sequenza palindromica– P-nucleotidi
• Variazioni nella posizione del taglio della forcina generano variazioni in questa sequenzaUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
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• Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) aggiunge fino a 15 nucleotidi alle giunzioni D-J e V-DJ.• I nucleotidi aggiunti generano sequenze randomiche• La N-addition contribuisce largamente alla variabilità del CDR3 della catena pesante
Flessibilità nel processo di giunzione:aggiunta e rimozione di nucleotidi
(N-addition)
• La N addition si verifica quasi esclusivamente nella catena pesante
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Ig TCRabDiversità totale(combinazioni V(D)J e catene L/H + diversità giunzioni N/P addition)
1011 1016
Tuttavia, in un determinato momento ciascun individuo haun repertorio di circa 107 cloni B e T
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Esclusione allelica• Ciascuna cellula B esprime i geni riarrangiati
della catena pesante di un solo cromosoma e i geni riarrangiati della catena leggera di un solo tipo (k o l) e di un solo cromosoma– esclusione allelica
• Assicura che una cellula B funzionale esprima una sola catena pesante e una sola leggera una sola specificità antigenica
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Esclusione allelica in singole cellule B
I due aplotipi diversi sono espressiin cellule diverse
Ceppo di aplotipo“a/a” per la catena pesante delle Ig
Ceppo di aplotipo“b/b” per la catena pesante delle Ig
Ibrido F1 di aplotipo“a/b” per la catena pesante delle Ig