Download - 6 Cepas Del Gusano Barrenador
UNIVERSIDAD DE PANAMA
VICERRECTORIA DE INVESTIGACIÓN Y POSTGRADO
PROGRAMA CENTROAMERICANO DE MAESTRIA EN ENTOMOLOGÍA
"Caracterización Molecular de 6 cepas del gusano barrenador del ganadoCochliomyia hominivorax (Coquerel) y de la especie
Cochlíomyia macellaria (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae)".
CLAUDIA E. TOLEDO PERDOMO
TESIS SOMETIDA COMO REQUISITO PARA OPTAR AL GRADO DE MAESTRAEN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN ENTOMOLOGÍA AGRÍCOLA
Asesor principal Dr. Steven Skoda, Ph.D.
Panamá, República de Panamá
2007
UNIVERSIDAD DE PANAMÁ
VICERRECTORIA DE INVESTIGACIÓN Y POSTGRADO
PROGRAMA CENTROAMERICANO DE MAESTRIA EN ENTOMOLOGÍA
"Caracterización Molecular de 6 cepas del gusano barrenador del ganado
Cochliomyia hominivorax (Coquerel) y la especie
Cochliomyfa mace//aria (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae)".
CLAUDIA E. TOLEDO PERDOMO
2007
APROBADO
AGRADECIMIENTO
Deseo expresar mi eterno agradecimiento a Dios y la Virgen María, por sus múltiplesbendiciones que he recibido y a mis padres Julio y Bety por el apoyo que me hanbrindado.
Al comité de asesores Doctor Steven Skoda, Doctora Oris Sanjur, Magister Ivan Luna yMagister Percis Garcés.
•.. De una manera muy especial, quiero dar mi profundo agradecimiento a la Doctora OrisSanjur, del Instituto Smithsonian, por todo su apoyo incondicional y tiempo dedicado aesta investigación, además quiero resaltar mi agradecimiento por su calidad humana y suvaliosa amistad.
Agradezco al Doctor Steven Skoda, de ARS — USDA, quien depositó su confianza en miy me brindó la oportunidad de realizar esta investigación, además de su gran apoyo.
A los profesores Doctora Yolanda Águila, Magister Iván Luna y Magister Percis Garcéspor todo su apoyo durante todo el tiempo de mi desempeño en la maestría.
Al Servicio Alemán de Intercambio Académico -DAAD- por la beca otorgada para poderrealizar mis estudios de maestría, especialmente a Magister Neddy Zamora.
Al Doctor Eldrege Bermingham por darme la oportunidad de realizar mi investigación enel laboratorio de Biotecnología del Instituto Smithsonian.
A la Doctora Laura Geyer, Grethel Grajales, Maribel Gonzáles, Carlos Vergara, MabelleChong, Eyda Gómez y Javier Jara del laboratorio de Biotecnología del InstitutoSmithsonian. Así también a Jorge Castillo, Gladys Quinteros y Mario Vásquez dellaboratorio de Investigación del gusano barrenador del ganado ARS-USDA; y finalmente aRicardo Rovira y Rolando Torres del Instituto Conmemorativo Gorgas. A Todos ellos porsu amistad y apoyo.
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^1
Índice General
Índice de Figurasíndice de Cuadros jiResumen 1Summary 2Introducción 3Revisión de literatura 91. Descripción taxonómica y biológica del gusano barrenador del ganado
-GBG — C. hominivorax 102. Aspectos ecológicos en el comportamiento del GBG C. hominivorax 123. Distribución geográfica del GBG C. hominivorax 134. Descripción taxonómica y biológica de Cochliomyia macellaria 145. Principales características utilizadas para diferenciar C. hominivorax de
C. macellaria 166. Miasis 176.1. Signos clínicos 197. Miasis en humanos 20
8. Importancia económica 219. Métodos de control y erradicación 229.1. Sacrificio y tratamientos químicos 229.2. Producción masiva en laboratorio 229.3. Técnica del insecto estéril - TIS - 239.4. Programa de erradicación del gusano barrenador del ganado 2510. Análisis moleculares 2610.I El ADN mitocondrial de los insectos 2610.2 El ADN mitocondrial de Cochliomyia hominivorax 2710.3 Técnicas moleculares utilizadas 2815. Estudios genéticos realizados de C. hominivorax y C. macellaria 3115.1. Estudios para C. hominivorax 3115.2. Estudios para C. macellaria 3316. Características ecológicas de los lugares de origen de
las cepas de C. hominivorax 3416.1 Oaxaca, México 3416.2 Quintana Roo, México 3416.3 Chiapas, México 3516.4 Oeste de San José, Costa Rica 3616.5 Norte de la Ciudad de Panamá, Panamá 3617. Descripción de la crianza de las cepas 3718. Características de área de colecta de C. macellaria 38Materiales y métodos 391. Material biológico 402. Colecta de C. macellaria 423. Extracción del mtADN 434. Amplificación de PCR 445. Evaluaciones para cada Cebador 45
5.1 Cebador 3 455.2 Cebador 4 475.3 Cebador 7 485.4 Cebador 8 495.5 Cebador 9 495.6 Cebador 10 506. PCR para cada Cebador 517. Visualización de PCR 518. Preparación para cortar bandas 529. Secuenciación en ciclo (cycle sequencing) 5210. Columnas de Sephadex 5311. Optimización de protocolos de PCR para Cochliomyia macellaria 5311.1. Cebador 7 5311.2 Cebador 8 5311.3 Cebador 9 5411. Regiones amplificadas 5512. Análisis filogenéticos 55Resultados 571. Optimización de los cebadores para C. hominivorax 582. Optimización de los cebadores para C. macellaria 583. Tamaño de las regiones amplificadas 584. Relaciones filogenéticos de las cepas 584.1. Cebador 7 584.2. Cebador 8 604.3. Cebador 9 604.4. Consenso 60Discusión 661. Regiones amplificadas 672. Caracterización molecular de las cepas de C. hominivorax y C. macellaria 673. Relación molecular entre las 6 cepas de Cochliomyia hominivarax 69Conclusiones 76Recomendaciones 78Literatura citada 80Anexo 88Anexo 1 89Anexo 2 91
Índice de Figuras
Figura 1. Representación circular de mtDNA de C. hominivorax 28Figura 2. Jaulas de reproducción de las moscas y bandejas con pupas,
laboratorio de ARS-USDA, Pacora, Panamá. 38Figura 3. Localización geográfica del origen de las cepas evaluadas 41Figura 4. Árbol filogenético de las cepas C. hominivorax de la región
NADH5, mtADN 62Figura 5. Árbol filogenético de las cepas C. hominivorax de la región
NADH4/NADH5, mtADN 63Figura 6. Árbol filogenético de las cepas C. hominivorax de la región
NADH4 mtADN 64Figura 7. Árbol filogenético de las cepas C. hominivorax del consenso,
región NADH4 -NADH5, mtADN 65
II
Índice de Cuadros
Cuadro 1. Principales características para diferenciar C. hominivoraxy C. macellaria. 16
Cuadro 2. Latitud, longitud y año de colecta de las cepas deC. hominivorax y la especie C. macellaria. 40
Cuadro 3. Principales características de las cepas de C. hominivorax. 40Cuadro. 4. Principales características para diferenciar a los adultos de
C. hominivorax de C. macellaria en el campo 42Cuadro 5. Cebadores utilizados en la investigación. 45
RESUMEN
El gusano barrenador del ganado, Cochliomyia hominivorax (Coquerel) es una
plaga de importancia económica para animales de sangre caliente, principalmente el
ganado vacuno. El programa Agriculture Research Service (ARS) de USDA tiene
identificados a 6 cepas procedentes de México, Panamá y Costa Rica, las cuales fueron
caracterizadas molecularmente. Para ello se optimizaron 3 cebadores de 6 que fueron
evaluados. Por medio del método de secuenciación cíclica se obtuvieron las regiones del
genoma mitocondrial NADH4 —His tRNA — NADH5. Para establecer las relaciones
filogenéticas se realizaron los análisis de Parsimonia, NJ, Máxima Verosimilitud y
Bayesiano, mostrando la misma topología de la formación de 4 clados definidos. El
primero formado por las cepas de Oaxaca y Quintan Roo, el segundo por las cepas
procedentes de Chiapas, el tercero por las cepas de Costa Rica y Panamá y el cuarto por
una población de Brasil, la cual fue obtenida de GenBank. En la investigación también se
incluyó a la especie Cochliomyia macellaria (Fabricius), donde se evaluaron los tres
cebadores que se optimizaron para C. hominivorax, de los cuales se lograron optimizar
dos, amplificando la región de NADH4 y una pequeña región de NADH5. Con esta
región amplificada es posible la diferenciación molecular con C. hominivorax.
2
SUMMARY
The screwworm, Cochliomyia hominivorax (Coquerel) is an important pest which
parasitizes livestock and other warm-blooded animals. The Agriculture Research Service
(ARS) of the USDA identified 6 Zines from Mexico, Panama and Costa Rica, which nave
been characterized molecularly. Six primers were evaluated and three were optimized
and successfully amplified. Using cycle sequencing we obtained sequences from the
regions NADH4 — His tRNA -- NADH5. We used Parsimony, NJ, Maximum Likelihood
and Bayesian methods to analyze the phylogeny of the six lines and another population
from Brazil. These analyses resulted in singular topologies with four clades: the first
consisting of the fines from Oaxaca and Quintana Roo, the second clade consisting of the
lines from Chiapas, the third clade with the lines from Costa Rica and Panama and fourth
clade formed by ene population from Brazil, which we obtained from GeneBank. We
also included Cochliomyia macellaria (Fabricius). We evaluated three primers and
successfully amplified and optimized two. We obtained sequences from NADH4 and
part of NADH5. It is possible to differentiate between C. hominivorax and C. macellaria
using this region.
INTRODUCCIÓN
4
INTRODUCCIÓN
El gusano barrenador del ganado (GBG), Cochliomyia hominivorax (Coquerel),
es una plaga de importancia económica para animales de sangre caliente, principalmente
el ganado vacuno y también afecta a los humanos. Desde 1965 los gobiernos de Estados
Unidos y México iniciaron acercamientos a fin de compartir acciones para contrarrestar
los efectos del gusano barrenador. En 1966 el Departamento de Agricultura de los
Estados Unidos declara a la nación libre del gusano barrenador del ganado, asumiendo la
responsabilidad de mantener una barrera biológica a lo largo de las dos mil millas que
comprenden la frontera de México y Estados Unidos con el objetivo de prevenir una
nueva migración del gusano barrenador que reinfestara el territorio norteamericano. En
1972 se concretó la colaboración conjunta para la erradicación del gusano barrenador del
ganado. Para esto fueron necesarios 19 años para erradicarlo en México, por lo que en
1991 este país fue declarado oficialmente libre de esta plaga, siendo necesario la
dispersión de 250 mil 631 millones de moscas estériles. Los avances en la campaña de
erradicación en México definieron el establecimiento de una nueva barrera biológica
entre México y Estados Unidos en 1999 (Elizalde, 2005).
Posteriormente, el Programa se ha extendido con el propósito de abarcar todo el
Istmo Centroamericano, incluyendo Panamá, hasta llegar al Tapón de Darién. Mediante
esta nueva etapa del Programa de Erradicación del Gusano Barrenador se iniciaron los
programas de Guatemala en 1987, Belice en 1989, El Salvador y Honduras en 1991,
Nicaragua 1992 y Costa Rica en 1995. El avance del Programa hizo posible la
erradicación del gusano en Belice y Guatemala (1994), El Salvador (1995), Honduras
G
(1996) y Nicaragua (1999), Costa Rica (2000) (Embajada de Estados Unidos, Costa
Rica, 2005).
Las operaciones aéreas y de campo en Panamá iniciaron en 1998 y el avance en el
programa de erradicación del gusano barrenador del ganado ha sido significativo. Para
septiembre de este mismo año se registraron más de dos mil casos del gusano barrenador.
Para eI año 2004 ya las tres cuartas partes del territorio panameño se declararon
técnicamente libres de este insecto. En el 2005, un segundo caso de GBG ocurrió en
Metetí-Darién, identificado el 9 de junio del 2005 (COPEG, 2005; Embajada de Estados
Unidos en Panamá, 2005). Finalmente, en julio de 2006 Panamá fue declarado libre del
gusano barrenador del ganado.
El costo del Programa para la Erradicación del Gusano Barrenador en
Centroamérica ha sido de aproximadamente 200 millones de dólares y en Costa Rica de
41 millones. La relación de costo - beneficio de este programa en Costa Rica estuvo
entre 4.8 y 12.8. Si el programa costó 41 millones de dólares, se obtuvieron entre 168 y
448 millones de dólares en beneficios. Después de erradicado el gusano barrenador de
Costa Rica, los beneficios directos a los productores costarricenses se estimaron en más
de 13 millones de dólares por año. Los dos gobiernos compartieron los costos, de igual
manera que se hizo con los otros países centroamericanos 85 % de los costos los cubrió el
gobierno de los Estados Unidos de América y 15 % cada uno de los países
centroamericanos (Embajada de Estados Unidos en Costa Rica, 2006).
n
En la actualidad el gusano barrenador del ganado se encuentra presente en algunos
países del Caribe como Cuba, Republica Dominicana, Haití, Jamaica, Trinidad y Tobago
y en América del sur, exceptuando Chile, afectando la sanidad pecuaria y pública,
además de la economía de esas regiones, donde la población ganadera es de 463,392
millones (bovinos, equinos, sumos, ovinos, caprinos). Con respecto a la población
humana, existen 330,570 millones de personas en riesgo de ser atacados por el gusano
barrenador del ganado (FAO, 2005a). Asimismo, esta situación continúa poniendo en
riesgo de nuevas infestaciones a los países donde la plaga ya ha sido erradicada.
Una de las actividades importantes del programa de erradicación del gusano
barrenador del ganado es su correcta identificación. En estudios realizados se han
encontrados diferencias morfológicas entre individuos de distintas poblaciones del
gusano barrenador del ganado como la variación del color de cuerpo y de los ojos,
anormalidades de la venación de las alas y otras diferencias morfológicas. Estas
variaciones podrían influir en el vuelo, la visión, comportamiento, vigor, longevidad, etc.,
además de poner en duda su correcta identificación. Así, según Baumhover (1966) para
confirmar la identificación y separación de la plaga en estudios ecológicos o separar las
especies de poblaciones nativas es necesario el desarrollo de marcadores genéticos para
adultos. El estudio de los genomas mitocondriales (mtADN) se ha venido incrementando,
debido a que estos aportan información genética que puede ser usada en investigaciones
moleculares y de evolución. Estudios realizados por Litjens et al. (2001) demostraron que
en el gusano barrenador del ganado basando el análisis específico en las regiones mtDNA
a
7
facilitan el potencial de acercamiento para la identificación taxonómica y relaciones entre
poblaciones.
Actualmente el Servicio de Investigación Agrícola —ARS- del Ministerio de
Agricultura de los Estados Unidos —USDA- poseen 6 cepas del gusano barrenador del
ganado, las cuales presentan algunas diferencias morfológicas. Estas cepas son
procedentes de México, Costa Rica y Panamá. Su caracterización molecular, por medio
de las secuencias del mtADN ayudará a demostrar si existe alguna relación filogenética
entre ellas.
Cochliomyia macellaria (Fabricius) es una especie muy común en el neotrópico
de América, con un rango de distribución comprendido desde el sur de Canadá hasta
Argentina. Es considerada como una plaga secundaria de miasis en el ganado,
alimentándose principalmente de tejidos muertos (Litjens et al. 2001). Su distribución
geográfica se traslapa con la de C. hominivorax además que morfológicamente son muy
similares. Además del alto parecido morfológico entre los adultos de ambas especies,
también lo es en el estado inmaduro; es decir, en los distintos estadios larvales, que en
determinado momento resulta muy dificil identificarlas. Esto representa un problema
para el programa de erradicación del Gusano Barrenador del Ganado, debido a que las
liberaciones de moscas estériles, declarar una zona libre, una zona infestada o una zona
re-infestada dependerá de la correcta identificación de C. hominivorax. Una liberación
errónea en zonas donde ya no está la plaga representa un alto costo para el programa.
Debido a lo anterior es importante caracterizar molecularmente a las especies
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Cochliomyia hominivorax y Cochliornyia macellaria porque esto aportará información
que posteriormente facilitar la separación entre ambas especies en las muestras de las
larvas colectadas en el campo y así permitirá tomar decisiones para el manejo del
programa de erradicación del ganado como por ejemplo realizar liberaciones de C.
hominivorax solo cuando realmente sean necesarias.
El presente trabajo tiene como objetivos: determinar la relación molecular entre las 6
cepas evaluadas de Cochliomyia hominivarax. Para cumplir con este objetivo se
realizaron los análisis filogenéticos de Neighbor Joining (NJ), Máxima Parsimonia,
Máxima Verosimilitud (Maximum Likelihood, ML) y el Análisis Bayesiano. Asimismo,
caracterizar molecularmente cada una de las cepas de Cochliomyia hominivorax y
Cochliomyia macellaria por el método de secuenciación cíclica. Finalmente, optimizar
el protocolo para PCR y el programa para el termociclador utilizado por Maliphan et al.
(2006) para cada uno de los 6 cebadores utilizado en la investigación.
Revisión de Literatura
I[^7
El género Cochliomyia posee cuatro especies: C. aldrichi, C. hominivorax, C.
macellaria y C. mínima; de las cuales la que presenta mayor importancia económica por
su impacto sanitario en animales mamíferos y los seres humanos es C. hominivorax,
muy conocida comúnmente como el gusano barrenador del ganado, GBG (Hall, 1973 y
Cunninghain, 1993).
1. DESCRIPCIÓN TAXONOMICA Y BIOLOGICA DEL GUSANOBARRENADOR DEL GANADO —GBG- C. hominivorax
Phylum: Arthropoda
Clase: Insecta
Orden : Diptera
Suborden: Cyclorrhapha
Superfamilia: Muscoidea
Familia: Calliphoridae
Género: Cochliomyia
Especie: Cochliomyia hominivorax (Coquerel).
Cochliomyia hominivorax es un parásito obligado de los mamíferos, siendo
especie endémica en las regiones del trópico y sub-trópico del continente americano
(Norte, centro, sur América e islas del caribe). La temperatura templada es la que
presenta las condiciones óptimas para su desarrollo; sin embargo las sequías prolongadas,
temperaturas altas o muy bajas son condiciones sub-óptimas. La actividad de los adultos
de C. hominivorax decrece cuando la temperatura está por debajo de los 21°C y no
pueden sobrevivir cuando la temperatura es menor de los 9°C por un período de 3 meses
ó 4 días de vida las hembras copulan y comienzan a alimentarse. Dos días después
11
consecutivos o 12°C por 5 meses consecutivos durante el año (Erziclioglu, 1987 y
Jasiorowski, 1993). Los adultos poseen un alto poder de vuelo y dispersión, los cuales se
han reportado en moscas que han alcanzado una dispersión hasta de 290 Km en dos
semanas (Jasiorowski, 1993).
Según Baumhover (1966) y Drugueri (2004), el ciclo de vida de C. hominovorax
dura en total aproximadamente de 3 semanas a 2 meses, dependiendo de la temperatura y
de la humedad. Se ha demostrado que el ciclo es más corto en verano. Las hembras
ovipositan en los bordes de las heridas, ombligos de los neonatos, mordeduras, mucosas
lesionadas, orbita ocular, orejas, etc., las cuales son atraídas por el olor de la sangre del
animal. Estas pueden ovipositar en grupos de 200 a 500 en líneas que se superponen
como tejas en el borde de una herida. Las masas de huevos tardan entre 12 y 21 horas
para que eclosionen las larvas, pasando por tres estadios, dentro del tejido subcutáneo
del hospedero. Las larvas permanecen sobre el hospedero sólo de 5 a 7 días, luego caen
al suelo, donde se transforman en pupa y dependiendo de la temperatura, entre 1 a 8
semanas emergen los adultos (imagos). Los estudios han demostrado que las pupas
pueden sobrevivir un mes a una temperatura de -5°C, mostrando un 70% de eclosión.
Estudios más recientes indican que pueden permanecer de 45 a 50 días vivas a intervalos
continuos a esta temperatura.
En cuanto a los adultos, menos del 1% de los mismos sobrevivieron una noche a
temperatura de -6.7°C (Cunningham, 1993; Krafsur y Lindquist, 1996). A la edad de 3
ó 4 días de vida las hembras copulan y comienzan a alimentarse. Dos días después
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empiezan a depositar los huevos. Con clima cálido el ciclo total dura 21 días
(Baumhover, 1966; Drugueri, 2004).
Crystal (1967) y Adams (1979) reportan que la edad de apareamiento de las
hembras es únicamente del tercero al quinto día. Las hembras incrementan gradualmente
su receptividad para aparearse desde el 3 al 14 día, ovipositan aproximadamente 200
huevos, en donde la condición nutricional de la hembra y los factores ambientales son
influyentes en esta cantidad.
2. ASPECTOS ECOLÓGICOS EN EL COMPORTAMIENTO DEL GBG, C.hominivorox
Según Thomas (1993), está especie es un parásito obligado, causante de una
miasis. Los adultos se localizan entre los arbustos de una zona boscosa en donde
reposan y se alimentan. Los árboles que están floreciendo son los preferidos,
alimentándose del néctar y miel, los cuales son necesarios para que el adulto sobreviva.
En general Thomas y Mangan (1989) demostraron la preferencia de la mayor cantidad de
moscas en zonas boscosas que en los pastizales abiertos. Entre el tercer y cuarto día de
edad las hembras llegan a ser sexualmente activas y el apareamiento ocurre generalmente
cuando los machos se agregan en algún sitio seleccionado de acuerdo al camino utilizado
normalmente por las hembras. Al quinto día de edad las hembras están listas para la
oviposición. La fase de apareamiento es la que reporta la mayor mortalidad debido a que
en este momento están distraídas y son presa fácil de hormigas y otros deperedadores y
oportunistas.
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En cuanto a la dinámica poblacional de los adultos de C. hominivorax, Krafsur
(1987) reporta que existe una relación con veranos calientes y húmedos asociados a la
abundancia de las poblaciones de C. hominivorax, indicando la preferencia de estos
especimenes a dicho clima. Así también, estudios realizados por Gomes et al. (1998), en
Brasil, demostraron que en los meses donde se registraron medias de temperaturas
máximas de 29.7°C en enero y 29.3°C en febrero, combinadas con precipitación de
364.2mm y 185.0 mm, respectivamente, hubo disminución de la población de C.
hominivorax. Sin embargo, para el mes de marzo, donde se registró una temperatura
máxima de 30.1°C y una precipitación de 165.1 mm aumentó la población, por lo que
consideran que el nivel poblacional está asociado a la temperatura y la precipitación, en
donde a medida que aumenta la precipitación disminuye la población. Así también, las
influencias de la vegetación y su relación con el nivel poblacional de las moscas lo
demostraron Gomes et al. (1998), al obtener mayor captura en los lugares que
presentaban mayor cantidad de árboles, sugiriendo que estas moscas tienen preferencia
hacia lugares con mayor cantidad de árboles o arbustos.
3. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DEL GBG C. hominivorax
,' hominivorax, es nativa de las regiones tropicales y subtropicales del continente
americano. Previo a la erradicación, su distribución original estaba comprendida entre la
región de los paralelos 30° norte y 30° sur, abarcando el centro y sureste de los Estados
Unidos, México, Centro América, Panamá, las islas del Caribe y Sur América. En la
actualidad el gusano barrenador del ganado se encuentra presente en forma endémica en
América del Sur, excepto en Chile. También está presente en algunos paises del Caribe
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como Cuba, Republica Dominicana, Haití, Jamaica, Trinidad y Tobago, poniendo en
riesgo una población ganadera susceptible de más de 515 millones de animales (FAO,
2005c).
4. DESCRIPCIÓN TAXONOMICA Y BIOLOGICA DE Cochliomyiamacellaria
Phylum: Arthropoda
Clase: Insecta
Orden : Diptera
Suborden: Cyclorhapha
Superfamilia: Muscoidea
Familia: Calliphoridae
Género: Cochliomyia
Especie: Cochliomyia macellaria (Fabricius).
Cochliomyia macellaria (Fabricius) es una de las principales especies que causan
miasis cutánea secundaria. Su distribución original se limita al continente americano
desde México hasta la Patagonia y en la región ártica hasta el sur de Canadá (Guimaraes,
1983).
Debido al hábito necrófago de las larvas, los adultos generalmente están asociados
con tejidos muertos junto con otras especies de las familias Caliphoridae, Sarcophagidae
y Muscidae. Económicamente, esta especie es menos importante que C. horninivorax; sin
embargo, C. macellaria también es encontrada parasitando tejidos necrótico en
mamíferos vivos, contribuyendo con la gravedad de la lesión ya existente en el mamífero.
15
Sin embargo, no se desarrolla en zonas profundas de los tejidos vivos como lo hace C.
hominivorax (Cunninghaim, 1993).
La longevidad de los adultos es de dos a seis semanas, encontrándolos con
frecuencia visitando carroña, animales muertos, depósitos de basura, frutos caídos, peces
expuestos en mercados, etc. (Guimaraes, et al. 1978; Byrd, 1995). Las hembras
ovipositan hasta 1,000 huevos en lotes de 40 a 250. En condiciones óptimas los huevos
eclosionan dos horas después de ser ovipositados y el período de desarrollo larval es de
aproximadamente de 6 a 20 días. Posteriormente, las larvas caen al suelo, donde pupan y
permanecen en este estado durante un período de 3 a 27 días. Finalmente, el período total
de desarrollo de huevo a adulto es de 39 días (FAO, 1993).
La selectividad de la distribución en el campo, cerca de carroña o animales
muertos responde en mayoría a las hembras con un 90%, debido a que estas buscan un
substrato para la oviposición. Un estudio realizado por Gomes et al. (2000) en Brasil,
reporta la presencia de C. macellaria todos los meses del año, coincidiendo el incremento
de la población con el aumento de la temperatura y el inicio de las lluvias. Los picos
poblacionales se presentaron en los meses de septiembre, octubre y diciembre durante el
periodo lluviosos y disminuyeron durante la época seca, en los meses de junio y julio.
Así también, Butler (1996) realizó estudios de laboratorio con C. macellaria, indicando
que la temperatura óptima para las larvas fue de 39°C. En el desarrollo del huevo a
adulto se evaluaron 3 temperaturas: 21°C, 26°C y 32.2°C mostrando mayor preferencia
por las altas temperaturas.
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5. PRINCIPALES CARACTERISTICAS UTILIZADAS PARADIFERENCIAR C. hominivorax DE C. macellaria
Cuadro 1. Principales características para diferenciar C. hominivorax y C. macellaria(Cunninhaim, 1993).
C. hominivorax C. macellaria
Huevo Depositados en masas en forma de tejados Depositados en masas irregulares
Huevo La sutura dorsal extendiéndose desde el La sutura dorsal se extiende desde el
micrópilo hasta casi el extremo posterior, micrópilo abarcando el 80% del huevo.
Larvas Esclerito dorsofaríngeo pequeño Esclerito dorsofaríngeo grandePrimer InstarLarvas Troncos traqueales dorsales con pigmentación Troncos traqueales dorsales no tan
Segundo oscura. pigmentados.InstarLarvas Troncos traqueales dorsales de los estigmas Troncos traqueales dorsales
Tercer Instar posteriores con una pigmentación oscura pigmentados en la cuarta parte posterior
desde la unión con los estigmas hacia delante del último segmento, donde se unen con
hasta el segmento 9 ó 10. los estigmas posteriores.
Pupa Aproximadamente 10.2 mm de longitud y 4.3 Aproximadamente 7.6 mm de longitud
mm de ancho y 2.8 mm de ancho
Adultos Placas frontoorbitales con setas negras. Placas frontoorbitales con setas de color
Basicosta de la hembra de color pardo oscuro. claro.
Las hembras tienen en la parte posterior de la Basicosta de la hembra de color
cabeza una franja anaranjada rojiza. En los amarillo.
machos esta mancha es pequeña. En la parte posterior de la cabeza, los
En la parte ventral del abdomen, en el tercer y dos sexos tienen una mancha negra.
cuarto segmento, en los bordes laterales no En los bordes de la parte ventral del
tienen manchas blancas, solamente puntos abdomen, en el tercer y cuarto
blancos. segmento, presenta manchas blancas.
La herida Las larvas producen una herida profunda, en En los casos de miasis, las larvas se
forma de bolsa, alimentándose de manera alimentan de tejidos necróticos,
gregaria de los tejidos vivos, situadas con la alrededor de los bordes de la herida. En
cabeza hacia abajo y sin moverse mucho en la los animales de pelo largo por la lana o
superficie de la herida, pelo que la rodea, no producen una
herida en forma de bolsa.
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6. MIASIS
Esta palabra proviene del griego myias (myia= mosca; ase = enfermedad), que
significa enfermedad causada por moscas. Representando la infestación de tejidos de
animales vertebrados por larvas de mosca. La ecología de la miasis es definida como el
conjunto de interacciones biológicas entre el huésped y los parásitos, causando una
infestación sobre animales y humanos por las larvas de algunas moscas (Diptera) de las
familias Calliphoridae, Sarcophagidae, Oestridae, Muscidae, Phoridae y Fannidae
(Poudevigne, 1995; Enciclopedia Microsoft Encarta, 2004; Boros, et al. 2006). Dentro de
las especies causantes de miasis se encuentran C. hominivorax, Chrysomya bezziana y
Wohlfahrtia magnifica (Jasiorowski, 1993).
Dos especies de Cochliomyia se encuentran asociadas a miasis, C. hominivorax y
C. macellaria. Sin embargo, en un principio, erróneamente C. macellaria ha sido
implicada como causante de miasis primaria durante muchos años, confundiéndola con
C. hominivorax. Las larvas de C. macellaria pueden ser muy abundantes en carroña.
Cuando estas se encuentran en miasis, son solamente invasoras en tejidos secundarios,
encontrándose en la superficie de la herida. Es vital para establecer un control una
correcta identificación del insecto causante del daño (Poudevigne, 1995; Boros, et al.
2006).
En función del parasito que provoca la infección se distinguen tres tipos de miasis (FAO
2005b).
a. Miasis Obligatoria: moscas cuyo desarrollo larvario tiene lugar íntegramente sobre
los vertebrados vivos.
18
b. Miasis Facultativa: mosca cuyas larvas se alimentan de carroña, pero, que
ocasionalmente pueden parasitar animales vivos.
c. Miasis Accidental: larvas de ciertas moscas que siendo habitualmente coprófagas o
saprófagas pueden llevar a cabo la oviposición sobre los alimentos, siendo capaces de
resistir la acción de los jugos gástricos y alcanzar el intestino.
Desde el punto de vista clínico, según Jasiorowski (1993) las miasis se pueden
agrupar en:
a. Miasis Cutánea: las larvas perforan la piel para alimentarse de la sangre del
hospedero (hematófagas). En otras especies de moscas las larvas atraviesan la piel sana
provocando un forúnculo o excavan galerías y túneles en la epidermis o tejidos más
profundos, provocando graves daños en el hospedero. En otros casos, los adultos son
atraídos por las heridas abiertas del futuro hospedero, depositando sobre estas los huevos.
Generalmente, la herida se torna circular y muy profunda de aproximadamente 5 a 10 cm
de profundidad o más, resultando en un extenso tejido destruido por las larvas. Estas
heridas tienen un característico olor a putrefacción. Las larvas de C. hominivorax se
encuentras en las partes profundas de la herida, a diferencia de las especies de daño
secundario que se encuentran cercanas a la superficie.
b. Miasis de las cavidades corporales: moscas que ovipositan en las cavidades
nasofaríngeas y oculares y en los conductos auditivos.
19
c. Miasis intestinales y urogenitales: infestaciones accidentales de esas zonas al
ingerir larvas o al penetrar estas por el recto. Ciertos adultos son atraídos por zonas
infestadas o sucias, infestando las larvas el tracto urogenital.
Según Poudevigne (1995), las características necesarias de la herida para que se
desarrollen las larvas de C. hominivorax son: tener una tasa alta de humedad y un pH de
7.2 como una condición mínima para la oviposición y para el desarrollo de las larvas. El
pH óptimo se ubica a 7.6 y se encuentra en miasis de tipo 3 o en herida con fuerte
contaminación por bacterias proteolíticas.
Los efectos patológicos que se producen de la infestación del gusano barrenador
del ganado pueden ser (Poudevigne, 1995):
• Efecto traumático causado por las larvas al alimentarse del tejido del animal;
• Efecto de irritación causado por el movimiento de las larvas dentro de la herida.
• Infección secundaria causada en la herida por otros organismos contaminantes como
bacterias, virus, protozoos u hongos.
• Efectos tóxicos a través de la excreción de las larvas.
6.1. Signos Clínicos
Las infestaciones comienzan en cualquier lesión abierta incluyendo algunas tan
pequeñas como las picaduras de garrapatas. Las hembras grávidas depositan sus huevos
en los bordes de las heridas. Las primeras larvas se mueven inmediatamente hacia la
herida y comienzan a alimentarse. En las primeras etapas es extremadamente dificil
K1]
detectar las larvas en la herida por su pequeño tamaño. Estas se hacen visibles sólo por
ligeros movimientos en la superficie de la herida (FAO, 2005a).
Después del tercer día de la infestación la herida se va haciendo
significativamente más grande por las larvas. Estas se pueden notar fácilmente
alimentándose en posición vertical a la herida con sus espiráculos expuestos en la
superficie y generalmente puede ser diferenciada de otras larvas de moscas por su
comportamiento en la herida. Las larvas se encuentran normalmente profundamente en
los tejidos del huésped y no en la superficie de la herida (FAO, 2005a).
En el quinto día la lesión es obvia, con grandes larvas de tercer estadio. La herida
tiene olor fétido característico del gusano barrenador del ganado y con un exudado
oscuro. En esta etapa la herida está mayormente predispuesta para subsecuentes
oviposiciones de otras hembras, contribuyendo así, a una mayor debilidad y la posible
muerte del animal (FAO, 2005a).
7. MIASIS EN HUMANOS
Desde 1935 se han venido reportando casos de miasis en humanos. A pesar que
existe poca información y divulgación de miasis en humanos es muy importante alertar a
la población humana que viven en áreas donde se encuentra la plaga del gusano
barrenador del ganado. Se ha demostrado que los casos en humanos han sido
prevalentemente en las poblaciones de grupos socioeconómicos bajos. Se han
encontrado casos donde se inicia la miasis por heridas, en mucosas con producción de
secreciones y otros donde los seres humanos han ingerido accidentalmente larvas de
21
dípteros en los alimentos. Otras larvas se desarrollan dentro de ella y pasan al ser
humano que las ingiere. Algunas de estas larvas, con cutícula muy resistente a los jugos
digestivos, son capaces de pasar a través del tracto digestivo y emerger vivas por el ano
(FAO, 2005a).
También se han presentado casos donde la miasis causa deformaciones
anatómicas permanentes (FAO, 2005 b). En la actualidad en Medellín, Colombia, se
han reportado 24 casos entre el año 2001 al 2005 en un hospital de tercer nivel,
presentándose los casos en las mucosas, oídos y el cerebro (Valderrama, 2006).
La miasis en humanos ha sido clasificada clínicamente según las cavidades
infestadas en los humanos: estomatomiasis, nasomiasis, rinomiasis, otomiasis (Boros, et
al. 2006).
8. IMPORTANCIA ECONÓMICA
El gusano barrenador del ganado (GBG), Cochliomyia hominivorax se le
considera una zoonosis; es decir, una enfermedad de los animales que puede ser
transmitida a los humanos. No obstante, los efectos de este problema en la producción
pecuaria resultan verdaderamente dramáticos. Las pérdidas económicas que se originan
con la infestación del gusano barrenador implican anualmente cientos de millones de
dólares. En los Estados Unidos previo a la erradicación, las perdidas anuales eran de
aproximadamente US$ 650 millones. El impacto de esta plaga en los animales es
inmediato: presentan disminución de peso, se deteriora la producción láctea y cárnica,
muestran daños en pieles y presentan infecciones en las heridas por bacterias
22
oportunistas. En algunas ocasiones llevan al animal a la muerte a través de la anorexia,
perdida de peso, anemia y hemorragia, etc. Aunque existen tratamientos para revertir el
problema, en la mayoría de los casos la solución implica el sacrificio e incineración del
animal; además, de los costos constantes de la vigilancia y el tratamiento. En el año
2002 las pérdidas ocasionadas por las gusaneras del gusano barrenador del ganado en
Brasil fueron de 150 millones de dólares (Crozariol, 2005).
9. METODOS DE CONTROL Y ERRADICACIÓN
9.1. Sacrificio y Tratamientos Químicos
Inicialmente se aplicó el control de la plaga mediante el empleo de tratamientos
químicos como lo son los insecticidas para matar la larva de la mosca y como medida
preventiva para evitar la reinfestación. En casos extremos algunos productores optaron
por el sacrificio de los animales (Jasiorowsky, 1993).
9.2. Producción Masiva en Laboratorio
El gusano barrenador del ganado fue reproducido artificialmente por primera vez
utilizando una dieta artificial para las larvas, que básicamente consistía en una mezcla de
leche, sangre, carne sin grasa y formalina. Para la colonia de adultos, se colocan en
jaulas, se alimentan con agua, miel y huevo molido (Baumhover, et al. 1969). Estudios
posteriores para la dieta de los adultos, han utilizando miel, producto del huevo
deshidratado y otra con miel y proteína de carne (Chaudhury, 2000). Actualmente se
producen masivamente en laboratorio con dieta artificial para larvas basada en leche,
23
sangre de ganado bovino, agua, huevo disecado y molido, fibra y formalina. La fábrica
de producción de la mosca estéril del gusano barrenador del ganado estuvo ubicada desde
1976 en Tuxtla Gutiérrez, México, produce aproximadamente 500 millones de moscas
por semana (Anderson y Leppla, 1992) y en el año 2006 fue trasladada a Pacora,
Panamá.
9.3. Técnica del Insecto Estéril - TIS -
La técnica del insecto estéril puede ser descrita de la forma más simple como una
forma de control de la natalidad. En 1937, el doctor E. F. Knipling fue el primero en
proponer la erradicación del gusano barrenador del ganado a través de la esterilización
de los machos, para que luego de su liberación en el campo estos se apareen con las
hembras nativas. En 1951 Bushland y Hopkins esterilizaron moscas del gusano
barrenador del ganado con 5 kv de rayos X o radiación gamma (60 Co) administrado a
pupas de 5 días de edad (Baurnhover, 1966). Las primeras experiencias de liberaciones
de la mosca del gusano barrenador del ganado en campo se realizaron en el sureste de
Estados Unidos de América, y posteriormente en la isla de CuraQao. Los estudios han
demostrado que la dosis de esterilización de rayos X y rayos gamma administradas al
gusano barrenador del ganado puede afectar seriamente la longevidad de los machos o
su competitividad bajo condiciones de laboratorio (Baumhover, 1966).
Según Knipling (1983), biológicamente el gusano barrenador del ganado presenta
las siguientes características a considerar en la aplicación de la técnica del insecto estéril
como herramienta del control autocida:
24
a. Es principalmente un insecto tropical y los estudios han demostrado una merma en
su población en los meses de invierno.
b. Las hembras presentan un comportamiento monógamo para aparearse.
c. Las larvas pueden infestar y madurar en un amplio rango de hospederos.
La técnica del insecto estéril requiere semanalmente una producción de millones
de insectos producidos en laboratorio, para posteriormente ser tratados con radiación X o
gamma para su esterilización, utilizando Cesium 137. Luego del tratamiento, los
insectos son dispersados en las áreas destinadas para la erradicación de la plaga en una
proporción de 10 moscas estériles por cada silvestre o su dispersión preventiva en áreas
erradicadas. Con esto se pretende que en el campo se produzca el apareamiento de los
machos esterilizados en laboratorio con hembras silvestres, nativas de la región. De esta
forma se interrumpe el ciclo de vida y progresivamente se reduce la población
(Jasiorowski, 1993).
La técnica goza de total selectividad; es decir, que los insectos estériles liberados
copulan solo con los de su misma especie, no alterando el equilibrio biológico del
agroecosistema, dirigiéndose sólo hacia la plaga que se desea controlar y no se
desarrollan resistencias (Jasiorowski, 1993).
25
9.4. Programa de Erradicación del Gusano Barrenador del Ganado -GBG —
En 1933 el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos determinó que la
mosca del gusano barrenador del ganado C. hominivorax era distinta a la especie C.
macellaria, la cual en 1858 Coquerel, médico francés, la descubrió en lo senos frontales
de un convicto que finalmente murió. Desde entonces se han registrado muchos casos en
humano (Romero, 2003).
En 1936 se llevó a cabo la producción masiva bajo condiciones artificiales por
Melvin y Bushland. En la erradicación fue decisivo también el uso de la técnica de los
insectos estériles propuesta por Knipling en 1937. La técnica del insecto estéril ha sido
su primera y más ambiciosa aplicación en todo el mundo hasta el momento. En 1972 se
estableció la Comisión México- Americana para la erradicación del gusano barrenador
del ganado y ha continuando a partir de ese momento a extendiéndose por toda Centro
América. La erradicación del gusano barrenador en los Estados Unidos de América y en
México se ha conseguido con un costo superior a los 500 millones de dólares EE.UU
(Bram, 1985; FAO, 1992; Elizalde, 2005; Vargas- Terán, et al, 2005).
En respuesta a la emergencia sanitaria acontecida por esta plaga, la Organización
de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) designó y realizó
con éxito un programa de erradicación basado en la técnica del insecto estéril (TIE). Una
de las primeras acciones de la FAO fue recomendar que la miasis ocasionada por el
gusano barrenador del ganado se incluyera en la lista internacional de enfermedades de
26
los animales de notificación obligatoria (Lista B). La recomendación fue aprobada por la
sesión general en la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) en París, el 12 de
mayo de 1989. Esto significó que la enfermedad se incluiría en los sistemas de reporte
internacional y los datos de ocurrencia se publicarían en el Libro Anual de Salud Animal
de la FAOIWHO/OIE. Asimismo, que las recomendaciones especiales para la
importación y exportación de animales se incluyeran en el Código Zoosanitario
Internacional de la OIE (FAO, 2005a).
10. ANALISIS MOLECULARES
10.1 El ADN Mitocondrial de los Insectos
Los genes de los artrópodos están formados por el DNA localizado en los
cromosomas y consisten en proteínas. RNA y DNA. El DNA es un polímetro de
nucleótidos. Cada nucleótido consiste de un azúcar pentosómico, una de las cuatro bases
nitrogenadas (adenina, timina, guanina, citosina) y un grupo fosfato (Hoy, 2003).
El DNA en los insectos presenta una estructura compleja, por lo que las diferentes
especies de los insectos tienen un número diferente de cromosomas haploides,
constituidos en un rango de 1 a 221. El porcentaje de bases nitrogenadas es menor en
los insectos que en los vertebrados. Por ejemplo, guanina + citosina ((3+C) presentan un
32% - 43% del ADN, comparado con los vertebrados que presentan el 45% (Hoy, 2003).
27
El ADN mitocondrial es el material genético ubicado en las mitocondrias y
generan energía para la célula. Este no se recombina, así que los únicos cambios que
puedan presentarse se deben a mutaciones a lo largo de múltiples generaciones, es decir,
durante el tiempo evolutivo. El rango del tamaño del genoma mitocondrial se encuentra
de 6 kb a más de 2 Mb. En el ADN mitocondrial (mtADN) se da la fosforilación
oxidativa que da como resultado la formación de trifosfato de adenosina (ATP), que es la
molécula primaria de almacenamiento de energía química en la célula. El mtADN es un
componente significativo de el total del ADN en las células de los insectos y es
transmitido por la madre a la progenie (Hoy, 2003).
10.2 El ADN Mitocondrial de Cochliomyia hominivorax
Los aspectos que favorecen el uso del mtADN como un marcador evolutivo son:
el predominio de la línea materna, la falta de una extensiva recombinación y la rápida
proporción de sustitución de nucleótidos.
El genoma mitocondrial de C. hominivorax, según Lessinger et al. (2000) es una
molécula circular de 16022 pb. Al analizar el contenido del gen y la organización en
general corresponde a una típica Brachycera. En el genoma de C. hominivorax se
encontró un gen que usualmente contiene 13 proteínas codificables, 22 genes tRNA y 2
genes rRNA. La principal región no codificable, identificada como la Región Control
del mtADN, está localizada entre el tRNA y rRNA y los genes 12S con un tamaño de
1175 pb. Además, la Región Control posee un alto contenido de A+T (77%) al igual
28
que otras especies del orden Diptera (Ceralitis capitala, Drosophila yacuha, Drosophila
melanogaster, Anopheles gambie, Anopheles quadrimaculatus).
tRNR-Val
tO-Leu
15KND1
tRNH-Ser
12.5K
CYTB
tRFIR -T 6 ./ L@K-Pro
ND4L
rRNR -H
- CDS +trnd- CtS -trard
tRNR-MettP.NR-1 le
tRNA-CystRNA-Tyr
2.SK "
C07S1
- CpxptRNH-Leu •SK ,,
• -tR-LysffPá11 Yk3• tRNR
COM3
ND3N45 NR-G y
trr+n °stRkR-Arg
tHNR-RlatRNR-Rsn
YRNF-C1utRNF-p€
- RNp +strand- RHH -strand
Fig 1. Representación Circular de mtDNA de C. honúnivorax(Fuente: Maliplian eta!. 2006).
10.3 Técnicas Moleculares Utilizadas
a. Extracción de ADN
La aplicación de diversas técnicas para la investigación en el campo de la biología
molecular para el análisis del genoma depende de la extracción del ADN puro, con alto
rendimiento y de muy buena calidad. Existen varios métodos para la extracción del
ADN. Su elección dependerá del tipo de tejido a utilizar. Las membranas celulares
deben destruirse de manera que el ADN sea liberado dentro del buffer de extracción. El
ADN debe ser protegido de la acción enzimática, por lo que se utiliza detergentes como
EDTA (ácido etilene-diamintetracético), agente quelante que une los iones de magnesio.
Luego de la incubación inicial, las proteínas desnaturalizadas y la mayoría de los
29
carbohidratos son removidos al emulsificar la mezcla buffer y tejido con fenoles o
cloroformo (Gallego, 2002).
b. Reacción en Cadena de la Polimerasa —PCR-
El PCR es una metodología in vitro utilizada para sintetizar enzimáticamente
secuencias definidas de ADN. Este método fue inventado por Kary Mullis en 1983. La
reacción en cadena de la polimerasa permite la amplificación masiva de las secuencias de
ADN específicas, siendo una herramienta importante en la biología molecular. Esta tiene
su fundamento en la anexión de dos cebadores cortos. Cada uno de ellos son
complementarios en la secuencia del ADN flanqueante de la región a ser amplificada
(Gaitán y Gallego, 2002). La reacción usa una plantilla de ADN, dos oligonucleótidos
cebadores que hibridizan a la cadena opuesta del ADN y la enzima Taq ADN
polimerasa, que cataliza la elongación de los "cebadores. La mezcla de los cebadores,
ADN, dNTPs (dexonucleótidos trifosfatos), MgCb y Taq es calentada para separar las
cadenas del ADN que tienen la secuencia de interés (Cox y Sinclair, 1998; Gaitán y
Gallego, 2002).
c. Electroforesis
Se conoce como electroforesis al transporte de partículas a través de un disolvente
mediante un campo eléctrico. Esta técnica fue desarrollada inicialmente por Ame Tiselius
en 1930 para la separación de proteínas séricas (Bernal, 2002). La mayoría de los
polímeros biológicos poseen cargas eléctricas, siendo capaces de migrar bajo la
30
influencia de un campo eléctrico. Esta es una técnica muy utilizada en la separación de
ácidos nucleicos. En la electroforesis de ácidos nucleicos, el efecto de tamiz molecular
del gel también es el principal factor de la separación, puesto que la relación carga- masa
es la misma para todos los polinucleótidos. Las moléculas de menor tamaño avanzan más
rápidamente a través del gel que las de mayor tamaño (Freifelder, 1991).
d. Secuenciación
La secuenciación de nucleótidos en el ADN es la portadora de la información
genética que codifica por proteínas y RNA. En los años 70 se generaron dos métodos
para realizar este procedimiento. El primero es el método de Maxam y Gilbert
(Degradación química), que consiste en la utilización de reactivos químicos que
modifican especialmente las purinas y pirimidinas presentes en el ADN, realizando
cuatro reacciones. La cadena se rompe de un modo selectivo en cada una de las
posiciones ocupadas por las cuatro bases modificadas. El segundo método es el de
Sanger en Inglaterra (enzimático), el cual se fundamenta sobre dos propiedades del ADN
polimerasa, es decir, su habilidad para sintetizar una copia complementaria de una
plantilla de ADN y de utilizar 2'3'-dideoxinucleósidos trifosfatos como sustratos. Este
método consiste en la síntesis de una cadena complementaria al ADN que se pretende
secuenciar. En un ADN de cadena sencilla se aparea un oligonucleótido cebadores
complementario que actúa como cebador (Gaitán, 2002). Según Hoelzel (1992), la
secuenciación es un método óptimo para la comparación de poblaciones debido a su alta
resolución y facilidad de interpretación.
31
e. Secuenciación en Ciclo
Este procedimiento consiste en una amplificación lineal de la reacción de
secuencia, usando 25 ciclos de desnaturación y alineamiento de un cebador específico a
una cadena y la extensión en presencia de Taq DNA polimerasa más dideoxinucleotidos
marcados (Fluorescencia). Una de las principales ventajas de esta técnica es reducir la
cantidad de ADN necesaria para la secuenciación, debido a que se produce una cantidad
suficiente después de 25 ciclos de amplificación (Gaitán, 2002).
Según Gaitán (2002) se han determinado las siguientes aplicaciones de la
secuenciación en ciclo:
• Evolución de genes, incluyendo estudios del proceso que produce la variación a nivel
de secuencias, estudios del origen de alelos nuevos o loci nuevos e investigaciones de
convergencia y selección.
• Estudios de poblaciones o intraespecíficos incluyendo estudios de variación
geográfica, flujo de genes, hibridización y conservación genética.
• Estudios interespecíficos tales como la construcción de filogenias de especies para
evaluar la macroevolución de patrones y procesos.
15. ESTUDIOS GENÉTICOS REALIZADOS A C. hominivorax y C macellaria
15.1. Estudios para C. hominivorax
Lessinger et al. (2000) determinaron la secuencia del genoma mitocondrial del
gusano barrenador del ganado, obteniendo una secuencia de 16,022 pb (pares de bases),
indicando que este tamaño es típico de un genoma mitocondrial del suborden Brachycera.
32
También se han realizado varios estudios genéticos poblacionales en el gusano
barrenador del ganado en varias regiones de América. Por ejemplo, Roehrdanz (1989)
realizó estudios de la variabilidad genética intraespecífica del mtDNA de 30 cepas de C.
hominivorax, desde Texas hasta Costa Rica utilizando 15 enzimas de restricción,
demostrando que estas poblaciones presentan variación genética. Azeredo-Spin, (1993)
realizó estudios para 12 poblaciones de Brasil procedentes de 7 localidades encontrando
alta variabilidad en el genoma mtADN. De igual forma, estudios de análisis
citogenéticos y morfológicos han sido desarrollados en algunas poblaciones del gusano
barrenador del ganado en Norte América y Brasil (Vargas y Lima, 1995). Narang y
Degrugillier (1995) realizaron estudios con el gusano barrenador del ganado con
poblaciones de Libia y las comparó con las de Norte y Centro América, Jamaica y Sur
América, utilizando 8 enzimas de restricción. También Jaramillo y Villada (1999),
trabajaron en 6 poblaciones panameñas del gusano barrenador del ganado secuenciando
el gen Citocromo oxidara I, encontrando que las secuencias no presentaron diferencias
significativas concluyendo que en Panamá existe panmixia entre las poblaciones
estudiadas. Lyra et al. (2005) realizaron estudios en siete poblaciones del gusano
barrenador del ganado y de C. macellaria en distintas zonas geográficas ganaderas de
mayor importancia de Uruguay, observándose nueve haplotipos, demostrando una alta
variabilidad en el mtADN de las poblaciones evaluadas. Sin embargo, al aplicar el
índice de similaridad, indicó que no hay evidencia de diferenciación en las sub-
poblaciones, concluyendo que la población de C. hominivorax de Uruguay es una única
población en equilibrio. Posteriormente, Maliphan, et al. (2006) realizó estudios en
33
poblaciones criadas en el laboratorio de Bioseguridad USDA-ARS de Lincoln,
Nebraska, utilizando 30 enzimas de restricción encontrando 16 sitios de restricción.
15.2. Estudios para C. macellaria
Lessinger y Azerdo-Espin (2000) dirigieron sus estudios en varias especies de
moscas causantes de miasis (Cochliomyia hominivorax, Cochliomyia macellaria,
Chrysomya megacephala, Luculia eximia y Dermatobia hominis) en la región de
Control del ADN mitocondrial, encontrando una variación en la longitud entre especies
comprendidas entre 1,000 pb a 1,600 pb. Litjens, et al. (2001) también realizaron
estudios en la caracterización molecular de C. hominivorax e incluyeron a la especie C.
macellaria. Ellos amplificaron dos regiones específicas, Citocromo Oxidasa subunidad I
con 870 pb y la Región Control hasta el gen 12S rRNA con 2,100 pb en siete
poblaciones de Brasil.
Con respecto a C. macellaria con técnicas como RAPD-PCR, RFLP-PCR, etc.
están el de Skoda, et al. (2002) quienes realizaron estudios comparativos con C.
hominivorax y C. macellaria utilizando la técnica ramdon amplified polymorphic DNA —
polymerase chain reaccion (RAPD-PCR) evaluando 120 "primers" elegidos al azar, de
los cuales encontraron 21 "primers" que producen marcadores. Posteriormente fueron
estudiados estos 21 "primers", en dónde encontraron que siete de estos producen claros y
reproducibles marcadores que fueron evaluados en cuatro poblaciones del gusano
barrenador del ganado y C. macellaria.
34
16. CARACTERISTICAS ECOLOGICAS DE LOS LUGARES DE ORIGENDE LAS CEPAS DE C. hominivorax
16.1 OAXACA, MEXICO
Oaxaca esta ubicada al norte 18°39', al sur 15°39' de latitud norte; al este 93°52', al
oeste 98°32' de longitud oeste. En esta región predomina el clima tropical. Su
temperatura media anual es de 18°C. Sin embargo, presenta una geografía provocando
variaciones del clima, en los litorales prevalece una temperatura promedio de 27°C,
mientras que en el valle es de 22° C con clima templado subhúmedo. En cuanto a la
altitud, la mínima está al nivel de mar, presentando un clima cálido, y la máxima se
encuentra en la Sierra Madre del sur con 3,750 msnm en donde el clima es templado con
inviernos fríos. En Oaxaca se encuentran todos los ecosistemas, desde selvas húmedas y
bosques tropicales hasta selvas secas, bosques espinosos y zonas desérticas. La
precipitación promedio anual se presenta desde los 509 mm hasta los 3795 mm,
dependiendo de la región (INEGI, 1998; INEGI, 1999; I EGI, 2000; SEP, 1997)
16.2 QUINTANA ROO, MEXICO
Geográficamente Quintan Roo está ubicada al norte 21°37', al sur 17°53' de
latitud norte; al este 86°42', al oeste 89°20' de longitud oeste. El relieve es escaso,
presentando su altitud máxima a 230 msnm. En este estado predomina el clima tropical
con lluvias en verano, excepto en el suroeste y el sureste, donde predomina una
temperatura tropical con intensas lluvias periódicas e invierno seco en el norte. Al oeste
también es tropical, pero con lluvias intensas en verano. Al norte, el clima es de sabana
con lluvias periódicas e invierno seco. La temperatura media anual es de 26 °C. Su
35
precipitación promedio anual fluctúa entre 1061 mm a 1393mm. La época seca es de
febrero a mayo y la lluviosa de mayo a octubre, aunque con frecuencia se prolonga hasta
enero en forma de chubascos procedentes del norte. La flora varía de acuerdo con el
clima, entre selva baja a alta (Campillo, 1988; INEGI, 1998).
16.3 CHIAPAS, MEXICO
Chiapas está ubicada al norte 17059', al sur 14°32' de latitud norte; al este 90
022', al
oeste 94° 14' de longitud oeste. Su territorio está conformado con zona de montaña y de
planicie. En la sierra de Chiapas existen grandes extensiones de terreno pobladas por
bosques y selvas con plantas y animales de clima templado húmedo. La parte baja de
Chiapas está compuesta de bosques caducifolios y praderas y la zona costera de
manglares. En general, su clima es tropical húmedo y sub-húmedo, debido a que este
cambia dependiendo de la altura del lugar. En Los Altos es templado húmedo y con
muchas lluvias en verano. En las localidades de lugares bajos, como Tapachula, tienen
clima cálido con una temperatura media anual de 27.8 °C. En Chiapas llueve en los
meses más calurosos y las lluvias disminuyen en los meses fríos. Su precipitación
promedio es muy variable, dependiendo de la localidad, siendo entre 3,977.5 mm para la
zona más lluviosa (Pichucalco) a 1,105.5 mm en San Cristobal de las Casas (Gordillo y
Ortíz, 1977; SEP, 1997; INEGI, 2000).
UNIVERSIDAD DB PANAMA
BIBLIOTECA
36
16.4 OESTE DE SAN JOSE, COSTA RICA
Las colectas de la cepa de Costa Rica se llevó a cabo en el oeste de San José,
donde se encuentra el territorio de San Ramón de Tres Ríos y Coronado presentando una
latitud de 9° 53'13.70" Norte y una longitud 83° 59' 4.95" Este. Esta región se
caracteriza por tener una altitud de 1500 msnm. Pertenece a la zona de vida Bosque
Pluvial Montano Bajo. Su precipitación media anual de 1834.5 mm con una temperatura
promedio anual de 19.1 °C. Esta región posee suelos volcánicos con pendientes de 15% a
60%, topografia bastante accidentada. La época lluviosa está comprendida ente mayo a
noviembre y la época seca de diciembre a abril (Herrera y Gómez, 1985; Gómez y
Herrera, 1986; Anónimo 1988; Herrera y Gómez, 1993).
16.5 NORTE DE LA CIUDAD DE PANAMA, PANAMA
La ciudad de Panamá está ubicada a los 9 00' 53" de latitud Norte y 79 31' 02"
de longitud Oeste. Su altitud oscila entre 0 y 125 msnm. Presenta clima tropical con una
temperatura promedio de 27.7°C y humedad relativa promedio anual 70%. El clima
en el entorno del distrito y en el área de la ciudad es lluvioso durante los meses de mayo
a diciembre y cuenta con una temporada seca de enero a abril. El viento norte veraniego
mantiene el clima fresco constantemente. Esta región presenta una precipitación media
diaria de 5.1 mm y una humedad relativa media anual de 75%. La temperatura a lo largo
del año oscila entre 25° C y 35° C, dependiendo del mes. La precipitación anual
promedio es de 1900 mm (Diccionario Geográfico de Panamá, 2001; Hidromet, 2006).
37
17. DESCRIPCION DE LA CRIANZA DE LAS CEPAS
Cada una de las cepas del gusano barrenador del ganado fueron criadas en
laboratorio como poblaciones aisladas. El laboratorio actualmente se encuentra en la
planta productora de moscas estériles ubicada en Pacora, Panamá. Estas instalaciones
cumplen con las características de un laboratorio de bio-seguridad de nivel 2 (BSL2),
siendo apropiado para trabajar fluidos corporales y tejidos que presentan un agente de
infección que podría ser desconocido. Si el laboratorio es usado correctamente funciona
como una barrera primaria. Su uso correcto implica el empleo de mascarillas protectoras,
guantes, batas o uniforme especial para el laboratorio. El personal y visitantes deben
bañarse antes y después de accesar a eI. Las instalaciones del laboratorio cuentan con
las siguientes áreas relacionadas con la cría de las moscas:
• Cuarto de preparación de la dieta para las larvas. Lugar donde se tiene los
ingredientes y equipo para prepara las dietas.
• Cuarto de crecimiento larvario, apareamiento y oviposición. Lugar que posee
bandejas plásticas que contienen las dietas.
• Cuarto de eclosión: en este cuarto las pupas han sido colocadas en pequeños vasos de
plástico dentro de una jaula para esperar que las pupas eclosionen.
Un cuarto caliente para guardar equipo de trabajo (esterilización).
38
a. b.
Figura 2. a. Jaulas de reproducción de las moscas, Laboratorio ARS-USDA, Pacora Panamá. .b. Bandejas con pupas, Laboratorio de ARS-USDA, Pacora, Panamá.
18. CARACTERISTICAS DE ÁREA DE COLECTA DE C. macellaria
La colecta fue realizada en el corregimiento de Pacora, el cual se encuentra
dentro del perímetro de la ciudad de Panamá, a una latitud de 9 04' 59" norte y una
longitud de 79 17' 27" oeste. Presenta una altitud entre 20 a 199 msnm. Su temperatura
promedio en los meses de colecta (15 de marzo — 15 mayo) es de 27.4 °C y
precipitación promedio anual 1300 mm. Se ubica en la zona de vida según Holdridge de
Bosque húmedo tropical, aunque parte de ese bosque ha sido deforestado por el
crecimiento urbano (Diccionario Geográfico de Panamá, 2001; Hidromet, 2006).
K
MATERIALES Y MÉTODOS
40
1. MATERIAL BIOLÓGICO
Se utilizaron especimenes de 6 cepas del gusano barrenador del ganado
Cochliomyia hominivorax y la especie Cochliomyia macellaria. Las cepas, fueron
colectadas en México, Costa Rica y Panamá, en las localidades descritas en el cuadro 2 y
figura 4. Posteriormente se levantó un pie de cría, donde hasta la fecha se mantienen en
laboratorio como poblaciones aisladas en jaulas. El cuadro 3 muestra las principales
características morfológicas que diferencian a cada cepa del gusano barrenador en este
estudio.
Cuadro 2. Latitud, Longitud y año de colecta de las cepas de C. hominivorax y la especieC. macellaria.
Especie Cepa Lugar de Procedencia Latitud Longitud Año
C. hominivorax LH Oaxaca, México 17.05 -96.7167 1983
C. hominivorax P-95 Norte de la ciudad de Panamá, Panamá 9.3333 -82.25 1995
C. hominivorax CECH Quintana Roo, México 19.6667 -88.5 1983
C. hominivorax PA-34 Chiapas, México 16.5 -92.5 1983
C. hominivorax CR-92 Oeste de San José, Costa Rica 10 -84.25 1992
C. hominivorax Limón Chiapas, México 16.5 -92.5 1993
C. macellaria Pacora, Panamá 8.41667 -81.67 2006
Cuadro 3. Principales características de las cepas de C. hominivorax.
Especie Cepa Principales caraterísticasC. hominivorax LH ojos amarillosC. hominivorax CECH ojos rojosC. hominivorax LIMON ojos verde claroC. hominivorax PA-34 ojos anaranjadosC. hominivorax P-95 tipo salvajeC. hominivorax CR-92 tipo salvaje
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42
2. COLECTA DE C. macellaria
Durante dos meses (15 marzo — 15 mayo de 2006) se realizó la colecta en el campo,
iniciando la actividad con la selección del sitio adecuado. Estas actividades se realizaron
en los campos de Pacora, Panamá. Para esto se utilizó como atrayente hígado de pollo,
que fueron colocados en un recipiente plástico con tapadera y dejado en un cuarto a
temperatura ambiente durante 3 días previos al inicio de la colecta para que se iniciara el
proceso de descomposición y sirviera como atrayente de las moscas. Se colocó el
hígado en una bandeja de plástico a un lado del cerco de los potreros, se capturaron las
moscas con la ayuda de una red entomológica. Estas se identificaron y se colocaron en
viales. Para la identificación de la mosca en el campo se usaron los criterios que
aparecen en el cuadro 4.
Cuadro. 4. Principales características para diferenciar a los adultos deC. hominivorax de C. macellaria en el campo (Álvarez, 1996).
Características C. hominivorax C. macellaria
Cabeza Vista dorsal: punto rojo entre los ojos en Vista dorsal: sin punto rojo en
las hembras. hembras y machos.
Vista frontal: con pelos frontales Vista frontal: con pelos frontales
entrecruzados. NO entrecruzados
Tórax Vista dorsal: con 3 líneas oscuras (las dos Vista dorsal: con 3 líneas oscuras
externas de iguales y la interna más corta). (las tres del mismo tamaño).
Ala: Basicosta Pigmento café oscuro Pigmento café claro
ABDOMEN Vista ventral: pubescencia blanca poco Vista ventral: pubescencia blanca
notoria, muy notoria.
Los viales que contenían las moscas vivas se llevaron al laboratorio, donde se
colocaron en un congelador con una temperatura de -26°C para que murieran congeladas.
43
Luego de un periodo de 4 horas de permanecer en el congelador se sacaron del mismo y
se le aplicó a cada vial alcohol al 95%. De esta forma, las moscas estaban listas para ser
llevadas al laboratorio de Biología Molecular del Instituto Smithsonian en Naos, Panamá.
3. EXTRACCIÓN DEL mtADN
El ADN se extrajo utilizando CTAB (bromuro de 6,10,3 metilamonio) como
extracción inicial. El tórax de cada mosca de las cepas en estudio se maceró en la
solución de 2X CTAB (500 µl) y se le agregó 10 µl de proteinasa K (20p.glµi), luego se
incubó a 55 °C por toda la noche. Posteriormente, la mezcla se lavó con 5O0µ1 de fenol:
cloroformo: alcohol isoamilico (PCI) y mezcló por 5 minutos. Luego se centrifugó a
14,000 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante se colocó en un tubo nuevo y limpio.
Posteriormente, la mezcla se lavó nuevamente con 500pl de fenol: cloroformo: alcohol
isomilico (PCI) y mezcló por 5 minutos. Después esta se centrifugó a 14,000 rpm
durante 3 minutos. El sobrenadante de estas muestras se extrajo con 500 pl de
cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) y se mezcló a mano por 5 minutos y se centrifugó a
14,000 rpm durante 3 minutos. Posteriormente, el sobrenadante de esta mezcla se
extrajo con 500 µl de cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) y se mezcló a mano por 5
minutos y se centrifugó a 14,000 rpm durante 3 minutos. Finalmente el sobrenadante de
esta última mezcla se agregó 1000 p.l de etanol al 100% y dejó precipitar el ADN toda la
noche a -20°C. Luego de la precipitación, la mezcla se centrifugó a 12,000 rpm durante
45 minutos a 4 °C para formar un pellet con el ADN en el fondo del tubo, al cual se le
decantó el etanol. Posteriormente se agregó 1000 ji1 de etanol 70% a -20°C para lavar el
44
pellet de ADN y se centrifugó a 14,000 rpm durante 15 minutos, este etanol se decantó y
se con la máquina "Speed Vac" o en la incubadora a 55°C. Finalmente, a esta muestra
se le agregó 100 µl de buffer TE para resuspender el ADN. Al ADN extraído se verificó
la calidad mediante electroforesis en agarosa.
4. AMPLIFICACIÓN DE PCR
Los cebadores rediseñados fueron apareados y utilizados en la amplificación del
mt ADN. La reacción de PCR que se estableció para iniciar la investigación fue la
propuesta por Maliphan et al. (2006). Las reacciones de PCR fueron conducidas en una
mezcla de PCR de 25p.l conteniendo 2 µg del stock de ADN extraído anteriormente; 2.5
µl de la solución buffer lI T OX PCR; 0.25 pi de Qiagen Taq DNA polimerasa; 2 µl de
200 µM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; 0.2 µM de cada cebador; 2.5 µl de 2.5
mM de MgC12 y agua doblemente destilada para completar el volumen. La mezcla de
PCR se colocó en el termociclador PTC-200 Peltier Thermal Cycler.
La reacción que fue desarrollada en el termociclador empleó como base una
desnaturalización inicial del DNA a 94°C por tres minutos. Posteriormente, 94°C por un
minuto. Después se dio el reconocimiento de cada cebador de la cadena de DNA a una
temperatura entre 50°C — 60°C por 30 segundos (más adelante se especifica para cada
cebador). Luego se pasó a la etapa de alargamiento de la nueva hélice de DNA a 72°C
por un minuto. Después de 35 termociclos, se hizo un alargamiento final a 72°C por dos
minutos. Algunos de estos pasos fueron optimizados para lograr la amplificación,
45
procedimiento que se detalla mas adelante. Finalmente, una muestra de los productos
amplificados fue visualizada en electroforesis de gel de agarosa. El residuo de la muestra
fue almacenado a 4°C para futuros análisis. Los cebadores que fueron evaluados y sus
regiones de amplificación son descritas en el cuadro 5.
Cuadro No. 5 Cebadores utilizados en la investigación (Maliphan et al. 2006).
CÓDIGO NOMBRE SECUENCIAS TAMAÑO ( h)3F N2-J-1480 TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC 24503R C2-N-3793 GAGACCATTACTTGCTTTCAGTCATCT
4F C2-J-3662 GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG 2320
4R N3-N-5942 TGATTTCATTCATGATATAAGTCC
7F N5-J-7660 TTCTGATCATCCCTGATC 11947R N5-N-8853 GTAAAATCTTATAATGCTGG8F N5-J-8621 GCTATAGCAGCTGGCAATCAAG 10768R N4-N-9676 CTTATGAACGGATGGGGAGTC
9F N4-J-9580 TAGGAGGAGCAGCCATATTTGGC 11619R NL-N-10740 GAAGGTCTTGGGCTTTCT
IOF NL-J-1075 AAGCCCAAGACCTTC 11481 OR CR-N- 11872 GATGCACCATTGGCATGT
5. EVALUACIONES PARA CADA CEBADOR
5.1 CEBADOR 3
Primero se usó como base el protocolo de Maliphan et al. (2006), al cual se le
hicieron las siguientes modificaciones: 2.5 pl de la solución 1X buffer, 0.75 µl de 25 mM
de MgC12, 2 µl de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 p.l de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 µl de
0.025 U/ tl de Taq, 2µl de la extracción del ADN. A partir de este protocolo fueron
variando las concentraciones hasta optimizar el protocolo como se describe a
continuación. Las concentraciones del cebador evaluadas para este análisis fueron de 0.2
46
mM y 0.5 mM. Para este cebador también se evaluaron dos concentraciones de ADN, el
ADN concentrado de la extracción original y diluido en una relación 1:10. Para el
MgCl2 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.OmM, 1.25mM, 1.5mM, 2mM,
2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM. Con respecto a dNTPs, además de 0.1 mM, se
evaluaron las concentraciones de 0.15mM y 0.2mM. Adicionalmente, se evaluaron
diversas enzimas Taq procedentes de distintas casas comerciales: Amplitaq, Qiagen Taq
y TaqGold. En el buffer también se evaluó una concentración adicional a 0.73X.
Se realizó la prueba de gradientes de temperatura utilizando un rango de 48°C —
60°C. Para este cebador también se evaluaron algunos cambios en el programa para
correr la PCR en el alargamiento de la nueva hélice de ADN a 72°C por dos minutos y
luego de los 35 termociclos un alargamiento final por 10 minutos.
El protocolo siguiente fue el mejor para obtener amplificaciones:
Taq buffer 0.73X
MgCl2 2.0 mM
dNTPs 0.15 mM
Primer 0.5 mM
QiagenTaq 1 U/µl
Sin embargo estas fueron inconsistentes entre las cepas de C. hominivorax, por lo
que se recomienda a partir del mismo iniciar nuevos estudios. El programa de PCR
quedó definido como: paso inicial de 94°C por un minuto, extensión de 94°C por un
minuto, 60°C por 30 segundos, 72°C por dos minutos, 34 termociclos, 72°C por 10
minutos.
47
5.2 CEBADOR 4
En este cebador, además del protocolo inicial descrito en el cebador 3, se
evaluaron las de 0.2 mM y 0.5 Mm de cada cebador. Para este no fue necesario evaluar
las dos concentraciones del ADN, empleándose únicamente el ADN concentrado de la
extracción original. Para el MgC12 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.OmM,
1.25mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM. Para la concentración de
dNTP's además de 0.1 mM se evaluaron las concentraciones de 0.15mM y 0.2mM.
Además, fueron evaluados diversas enzimas Taq procedentes de distintas casas
comerciales: Amplitaq, Qiagen Taq, TaqGold. En el buffer, también se evaluó una
concentración a 0.73X. Se realizó la prueba de gradientes de temperatura utilizando un
rango de 48°C — 50°C. A este cebador, al igual que el cebador 3, también fue necesario
realizar algunas evaluaciones en el programa para correr el PCR. Los cambios evaluados
fueron en el alargamiento de la nueva hélice de ADN a 72°C por dos minutos y luego de
los 35 termociclos un alargamiento final por 10 minutos.
Luego de todas estas evaluaciones se logró amplificar con el siguiente protocolo:
Taq buffer 1 X
MgC12 2.0 mM
dNTPs 0.15 mM
Primer 0.5 mM
QiagenTaq 1 U/µl
Sin embargo, la amplificación no fue consistente para todas las cepas, por lo que al
igual que el cebador 3, se recomienda a partir del anterior protocolo iniciar las futuras
evaluaciones. El programa de PCR que quedó finalmente para este cebador fue:
48
temperatura inicial 94°C por un minuto, temperatura de extensión 94°C por un minuto,
51°C por 30 segundos, 72°C por dos minutos, 34 termociclos, 72°C por 10 minutos.
5.3 CEBADOR 7
Para este cebador se realizó inicialmente el protocolo de Maliphan et al. (2006)
realizando las siguientes modificaciones: 2.5 µl de la solución 1X buffer, 0.75 pl de 25
mM de MgC12. 2 µl de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 µl de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 µl de
0.025 U/µl de Taq, 2µl de la extracción del ADN. La concentración del cebador evaluada
para este fue 0.5 mM. Se empleó el ADN concentrado de la extracción original. Para el
MgC12 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM,
3.5mM, 4mM. Para la concentración de dNTPs, además de 0.1 mM, se evaluó la
concentración de 0.2mM. A este cebador no fue necesario realizar la prueba de
gradientes de temperatura, debido a que se utilizó la recomendada por Maliphan et al.
(2006) a 52°C y funcionó perfectamente.
El protocolo quedó optimizado de la siguiente forma:
Taq buffer 1 X
MgCl2 2.0 mM
DNTPs 0.2 mM
Primer 0.5 mM
QiagenTaq 1 U/µl
El programa de PCR quedo definido con los siguientes pasos: temperatura inicial
de 94 °C por 3 minuto, una temperatura de extensión de 94 °C por un minuto, 52°C por
30 segundos, 72°C por un minutos, 34 termociclos, 72°C por 2 minutos.
49
5.4 CEBADOR 8
Al igual que los cebadores anteriores se utilizó el protocolo de Maliphan et al.
(2006), con las mismas modificaciones: 2.5 pi de la solución 1X buffer, 0.75 pl de 25
mM de MgCl2. 2 pl de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 µl de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 pl de
0.025 U/pl de Taq, 2µl de la extracción del ADN. La concentración de cebador evaluada
para este fue 0.5 mM. Para este cebador tampoco fue necesario evaluar dos
concentraciones del ADN, empleándose únicamente el ADN concentrado de la extracción
original. Para el MgCl2 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.25mM, 1.5 mM
y 2.5mM_ Para la concentración de dNTPs además de 0.1 mM se evaluó la concentración
de 0.2mM. Se realizó la prueba de gradientes de temperatura utilizando un r ango de 54°C
— 60°C. El protocolo final para este cebador quedó optimizado de la siguiente forma:
Taq buffer 1 X
MgCl2 1.25 mM
dNTPs 0.2 mM
Primer 0.5 niM
QiagenTaq 1 U/µl
y el programa de PCR quedó de finido con los siguientes pasos: temperatura inicial 94°C
por 3 minuto, temperatura de extensión 94°C por un minuto, 60°C por 30 segundos, 72°C
por un minutos, 34 termociclos, 72°C por 2 minutos.
5.5 CEBADOR 9
Se utilizó el protocolo de MaIiphan et al. (2006) con las siguientes
modificaciones: 2.5 pl de la solución IX buffer, 0.75 µl de 25 mM de MgCl2. 2 pl de
0.1 mM de dNTPs, 0.5 pl de 0.2 mM de cada echador, 0.25 pl de 0.025 U/pl de Taq, 2p.1
—11I^11L1QUu uc la extraccion original. Con respecto aI MgCl2, se evaluaron las
50
de la extracción del ADN. La concentración de cebador evaluada para este fue 0.5 mM.
Se empleó únicamente el ADN concentrado de la extracción original. Con respecto al
MgCl2 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.5 mM, 2.5mM, 3.OmM, 3.5mM y
4mM. Para la concentración de dNTPs además de 0.1 mM se evaluó la concentración de
0.2mM. No fue necesario realizar la prueba de gradientes de temperatura, debido a que la
temperatura propuesta por Maliphan et al. (2006) funcionó muy bien. El protocolo final
quedó optimizado de la siguiente forma:
Taq buffer 1 X
MgC12 3.0 mM
dNTPs 0.2 mM
Primer 0.5 mM
QuigenTaq 1 U/µ1
y el programa de PCR quedó definido con los siguientes pasos: temperatura inicial de
94°C por 3 minuto, temperatura de extensión de 94°C por un minuto, 57°C por 30
segundos, 72°C por un minutos, 34 termociclos, 72°C por 2 minutos.
5.6 CEBADOR 10
Se utilizó inicialmente el protocolo de Maliphan et al. (2006), con algunas
modificaciones: 2.5 pl de la solución 1X buffer, 0.75 µl de 25 mM de MgC12, 2 µl de 0.1
mM de dNTPs, 0.5 ul de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 µl de 0.025 Ulp.l de Taq, 2µd de
la extracción del ADN. Se utilizó 0.5 mM de cada cebador. Se empleó el ADN
concentrado de la extracción original. Con respecto al MgC12, se evaluaron las
concentraciones de 0.75mM, 1.5 mM, 2 mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM y 4mM, también se
realizó la prueba de gradientes de temperatura utilizando un rango de 50°C — 60°C.
51
El cebador 10 no se logró optimizar, fue inconsistente al amplificar todas las
cepas en estudio, sin embargo el protocolo que amplificó para algunas cepas fue:
Taq buffer I X
MgC12 2.0 mM
dNTPs 0.2 mM
Primer 0.5 mM
QuigenTaq l Ulµl
y el programa de PCR que se utilizó para este protocolo fue: temperatura inicial 94°C por
un minuto, temperatura de extensión 94°C por un minuto, 59°C por 30 segundos, 72°C
por dos minutos, 34 termociclos, 72°C por 10 minutos.
6. PCR PARA CADA CEBADOR
Luego de establecido el protocolo óptimo para cada cebador se realizó el PCR,
utilizando el ADN extraído de dos individuos de cada cepa de C. hominvorax y de C.
macellaria.
7. VISUALIZACIÓN DE PCR
Para la visualización del producto del PCR se corrió la electroforesis con gel de
agarosa a una concentración de 1.5 a 98v. por aproximadamente 45 minutos. Luego se
visualizó con luz ultravioleta y se fotografió el gel.
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52
8. PREPARACIÓN PARA CORTAR BANDAS
El producto de la PCR se coloco en un gel de "Low Melting temperature agarose"
a una concentración de 2.0%. La cámara de electroforesis se cargó con el producto del
PCR. Esta se dejó correr a 98v. aproximadamente por 45 minutos. Luego se visualizó
con luz ultravioleta y se fotografió el gel. Posteriormente, el gel se llevó a una mesa con
luz ultravioleta Foto/Prep I by Fotodyne para cortar las bandas de cada individuo
amplificado. Cada una de estas se colocó en un tubos que se llevaron a la máquina
termocicladora Perkin Elmer Cetus DNA Therma Cycler 480 en donde permanecieron
por 5 minutos a 70°C. Luego, se colocaron a 45°C, dejándolos por 15 minutos. Después
de transcurrido este tiempo, se les agregó a cada tubo 1.2 µl de gelasa y se dejaron en la
máquina a 45°C.
9. SECUENCIACIÓN EN CICLO (CYCLE SEQUENCING)
La secuenciación en ciclo se realizó utilizando el siguiente protocolo: 2µl de agua
doble destilada, 3µl de buffer BD 5X, lp.l del cebador "F"/"R", 1 µl de big dye y 3µl de
la banda cortada y tratada con gelasa. Luego la mezcla se centrifugó por 30 segundos.
Después de centrifugada se llevaron al termociclador PTC-200 utilizando el programa
CS3 100, el cual consistió en una temperatura inicial de 96 °C por un minuto, luego 96 °C
por 10 segundos, seguido de 50 °C por 5 segundos, luego a 60 °C por 4 minutos, y
finalmente 24 ciclos desde el segundo paso. Al terminar este proceso, a los tubos se les
agregó 10 µl de agua doblemente destilada.
53
10. COLUMNAS DE SEPHADEX
Las columnas se prepararon con Sephadex G-50. A cada columna se le agregó 780
pl de Sephadex. Luego se colocaron en una centrifugadora a 400 rpm, por dos minutos.
A cada columna se le agregó la reacción de secuenciación. Luego se colocaron en una
centrifugadora a 3,600 rpm por 3 minutos. La reacción que quedó se llevó a la máquina
Speed vac, se centrifugó por 30 minutos para secarlos. A los tubos secos se les agregó 10
pl de diformamida y se corrieron las secuencias en una secuenciadora Applied Biosystem
3130x1 Genetic Analyzer (Hitachi) con un lectura del fragmento del 98.5% de exactitud.
11. OPTIMIZACION DE PROTOCOLOS DE PCR PARA Cochliomyia macellaria
Para C. macellaria, se evaluaron únicamente los 3 cebadores que se lograron
optimizar para C. hominivorax, los cuales son:
a. cebador (7) F: N5-J-7660; R: N5-N-8853
b. cebador (8) F: N5-J-8621; R: N4-N-9676
c. cebador (9) F: N4-J-9580; R: NL-N-10740
11.1. CEBADOR 7
Varias pruebas se realizaron para optimizar este cebador, sin embargo, no se logró
la amplificación. Todas estas pruebas efectuadas se describen en el anexo 1.
11.2. CEBADOR 8
Inicialmente se realizó el protocolo que había sido optimizado para C.
hominivorax. A partir de este protocolo se varió las concentraciones hasta optimizarlo.
Las siguientes concentraciones de MgC12 fueron evaluadas: 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y
54
3mM. A cada una de ellas se les realizó una prueba de gradiente de temperatura de 50 °C
a 60 °C. Finalmente quedó optimizado con el siguiente protocolo:
Taq buffer 1 X
MgClz 1.25 mM
dNTPs 0.2 mM
Primer 0.5 mM
QiagenTaq 1 Ulµl
El programa de PCR quedó definido con los siguientes pasos: temperatura inicial 94°C
por un minuto, extensión 94°C por un minuto, 52°C por 30 segundos, 72°C por dos
minutos, 34 termociclos, 72°C por 2 minutos.
11.3 CEBADOR 9
Inicialmente se realizó el protocolo para C. hominivorax que había sido
optimizado. A partir de este protocolo se evaluaron las siguientes concentraciones de
MgC12 : 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM. A cada una de ellas se les realizó una prueba
de gradiente de temperatura de de 50 °C a 60 °C. El protocolo que quedó optimizado fue:
Taq buffer 1 X
MgCl2 2.0 mM
dNTPs 0.2 mM
Primer 0.5 mM
QiagenTaq 1 Ulµl
El programa de PCR quedó definido con los siguientes pasos: temperatura inicial
94°C por un minuto, de extensión 94°C por un minuto, 52°C por 30 segundos, 72°C por
dos minutos, 34 termociclos, 72°C por 2 minutos.
55
12. REGIONES AMPLIFICADAS
A partir de los protocolos definidos se hicieron las PCRs para cada una de las
regiones que amplifica cada cebador. Posteriormente, se realizó la secuenciación en
ciclo para obtener las secuencias de cada una de las regiones amplificadas para las dos
especies en estudio: C. hominivorax y C. macellaria, lo que permitió obtener el genoma
de las regiones NADH4 — NADH5 para C. hominivorax y NADH4 para C. macellaria
más una pequeña región de NADH5 que se logró amplificar con el cebador 8.
13. ANALISIS FILOGENETICOS
Las secuencias obtenidas fueron comparadas y corregidas en el programa
Sequencher 6.4. Luego fueron alineadas y se prepararon las matrices NEXUS en
PAUP*4.Ob10(Altivez). Cada una de las tres regiones secuenciadas fueron analizadas
independientemente. Para cada una de las regiones se realizaron análisis utilizando los
criterios de distancias (NJ) y de Parsimonia con el programa PAUP*4.Ob10(Altivez).
Para determinar si se podía realizar una análisis combinado de las tres regiones se realizó
un análisis de Partición en el programa PAUP*4.Ob10(Altivez). Además se realizó el
análisis de Máxima Verosimilitud (Maximum Likelihood, ML). Luego se realizó el
análisis en MrModeltest y posteriormente se realizó el análisis Bayesiano. El análisis de
Parsimonia fue realizado utilizando heuristic searches con TBR Branch Swapping. Para
conocer el grado de soporte de las ramas se utilizó el análisis de Bootstrap (1000
replicas). Para el análisis ML se utilizó Modeltest 3.6 para elegir el mejor modelo de
56
sustitución en los datos. Los modelos que se utilizaron para el análisis fueron HKY+1 y
GTR+G. El análisis filogenético Bayesiano fue conducido utilizando MrBayes 3.1.
Todos los análisis mostraron árboles con similar topologías. Se eligió el árbol
filogenético del análisis Bayesiano para presentarlo en los resultados de la investigación
debido a que este proporciona al mismo tiempo un árbol filogenético con soporte, el cual
según Harrison y Langdale (2006) es conceptualmente equivalente a Maximum
Likelihood (ML) con Bootstrapping. Los árboles filogenéticos obtenidos de estos
análisis fueron editados en el programa Canvas 9TM.
57
RESULTADOS
58
1. OPTIMIZACION DE LOS CEBADORES PARA C. hominivorax
Cuadro 6. Protocolos optimizados de cada cebador evaluado.C.hominivorax C. macellaria
Cebador 7 Cebador 8 Cebador 9 Cebador 8 Cebador 9Buffer 1 X 1 X I X I X 1 X
MgC12 2 mM 1.25 mM 3 mM 1.25mM 2 mM
dNTPs 0.2 mM 0.2 mM 0.2 mM 0.2 mM 0.2 mM
"primer" 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM
QiagenTaq 1 U/µ 1 U/µ 1 J/ji 1 Ulµ 2 U1µ
Inicialmente se hicieron las pruebas para optimizar los protocolos para las
mezclas de la PCR y para el programa del termiciclador. Tres pares de cebadores se
Iograron optimizar para C. hominivorax: 7, 8 y 9. Sin embargo no se logró amplificar los
cebador: 3, 4 y 10.
2. OPTIMIZACION DE LOS CEBADORES PARA C. macellaria
Debido a que los cebadores 7, 8 y 9 fueron los que se lograron optimizar para C.
hominivorax, estos también se eligieron para el caso de C. macellaria. De los cuales se
lograron optimizar el 8 y 9.
3. TAMAÑO DE LAS REGIONES AMPLIFICADAS
El tamaño de las regiones amplificadas del cebador 7 fue de 1,110 pb (abarca la
región NADH4), para el cebador 8 fue de 1,000 pb (abarca parte de las dos regiones
NADH4 y NADH5 y el lis ARN). Finalmente el cebador 9 fue de 1,038 pb (abarca la
región NADH5) (Anexo 2).
59
4. RELACIONES FILOGENETICAS DE LAS CEPAS
Como se explicó en la metodología, debido a que todos los análisis (N3,
Parsimonia, Máxima Verosimilitud, Bayesiano) mostraron la misma tendencia, los
árboles que se presentan en la investigación son los obtenidos con el análisis Bayesiano.
A continuación se describen los resultados obtenidos por cada región evaluada y el
consenso.
4.1. Cebador 7
Los resultados de análisis de las secuencias obtenidas con el cebador 7 muestran
un árbol con una politomía basal para cuatro clados. El primer ciado formado por las
cepas de Quintana Roo (CECH) y Oaxaca (LH) presenta un soporte Bayesiano de 86. El
segundo ciado, formado por las cepas procedentes de Chiapas (PA-34 y Limón) posee un
soporte Bayesiano de 83. El tercer ciado, presentó un soporte Bayesiano débil, de 66,
constituido por las cepas de Panamá (P95) y Costa Rica (CR-92) y finalmente el cuarto
ciado comprendiendo solo la población de Brasil. En general, estos resultados indican
que a nivel de la región mitocondrial que abarca principalmente el gen NADHS las
relaciones filogenéticas muestran una sólida tendencia monofilética entre los clados de
Oaxaca y Quintana Roo con el ciado de las cepas de Chiapas. A pesar que el tercer
elado está bien definido, como se había mencionado, su soporte es un poco débil en esta
región (Figura 4).
60
4.2. Cebador 8
Los análisis de las secuencias obtenidas con el cebador 8 muestra un árbol con
poca variabilidad entre las cepas. Se observó una politomía a nivel basal y de caldos.
Uno formado por las cepas de Quintana Roo (CECH) y Oaxaca (LH) con un soporte
Bayesiano de 99. El segundo está formando por las cepas de Chiapas (Limón y PA-34)
con un soporte Bayesiano de 6I (Figura 5).
4.3. Cebador 9
El árbol filogenético de las secuencias obtenidas del cebador 9, que amplifica
principalmente la región NADH4, presenta un nodo basal de donde nacen dos dados bien
definidos, el primero que agrupa a las cepas de Oaxaca (LH) y Quintana Roo (CECH),
presenta un soporte Bayesiano de 84. El segundo nace de una rama de donde salen dos
grupos, el primero formado únicamente por la población de Brasil, mientras que el
segundo presenta un soporte Bayesiano de 77, de donde nacen nuevamente dos ramas, la
primera formando un grupo con las cepas de Chiapas (Limón y PA-34) con un soporte
Bayesiano de 96, siendo este también un grupo monofilético sólido. El segundo grupo
esta formado por las cepas de Panamá (P-95) y Costa Rica (CR-(92) (Figura 6).
4.4. Consenso
Finalmente se unieron las tres regiones amplificadas, abarcando completamente
NADH4 — His tRNA — NADH5, mostrando consistencia. Este árbol formó los mismos
cuatro dados de los cebadores 7 y 9, pero con un mayor soporte, siendo estos: el primero
formado por las cepas de Quintana Roo (CECH) y Oaxaca (LH) con un 100 de soporte
61
Bayesiano, el segundo con un soporte Bayesiano de 91 y está comprendido por tres
ramas de donde nacen tres grupos. El primero formado únicamente por la población de
Brasil, el segundo un con soporte Bayesiano de 100, formando por las cepas de Chiapas
(Limón y PA-34) y el tercero con un soporte Bayesiano de 94 formado por las cepas de
Panamá (P-95) y Costa Rica (CR-92) (Figura 7).
t.l
f^ F;
i1fuzRts i1!_X
•:"tatas- If\
I1]
I1 5?
62
Figura 4. Arbol filogenético de las cepas C. horinivorax de la región NAD1i5, mtADN
"ya
W►►4
MX
la Roo, MX
6)
la Ro o, MX
63
^R - ^¿ i QUA
5 changos Costa Rica
Figura 5. Árbol hiogenético de las cepas C. hoiyzinivorcrx de la región NADH4/NADI I5, mtADN
lón(55)
tipas, MX
ión (56)apas. MX
-34 (36)apas, MX
-34 (35)apus, MX
64
Chrysarnya
1'-95 (2()Panamá
5(25)iamá
2 (65). Rica
2 (66). Rica
,o, MX
&-^ « I5 changcs Quintana Roo, MX
Figura 6. Árbol filogenético de las cepas C. hominivorax de la región NADI-14 mtADN
Chrtnonya
li vora
Lim— (56)Chiapas, MX
Lirv--fl (55)Chiapas, MX
?A-34 (36)Chiapas, MX
?A-34 (35)hiapas, MX
.95 (26)unan*
)5 (25)
92 (66)
ta Rica
92 (65)
ta Rica
H(5)'aria Roo, MX
(46)aca, MX
45)3ca, MX
(6)Quintara Roo, MX— 10 th uiges
65
Figura 7. Árbol filogenético del consenso de las cepas C. hnniinriorrr.x: región NADH4 - NAD1T5,rntADN
DISCUSIÓN
67
1. Regiones Amplificadas
Los cebadores 7 y 9 muestran la misma topología formando cuatro clados
definidos. Sin embargo, el cebador 8, corno se explicó anteriormente, amplifica una
pequeña región de los genes NADH 4 y NADHS y la región completa del tRNA. Los
resultados obtenidos con el cebador 8 demuestran una politomía para las muestras
procedentes de Panamá, Costa Rica y Brasil. Esto puede darse debido a una baja
variabilidad en la secuencia de esta región.
2. Caracterización molecular de las cepas de C. hominivorax y C. macellaria
Las secuencias obtenidas de las distintas cepas de C. honainnivorax de las regiones
amplificadas pertenecen al ADN mitocondrial, que representa la expresión genética de la
línea maternal y es considerada como una herramienta muy importante para realizar
estudios de poblaciones intraespecificas. En estas secuencias se pueden observar la
existencia de un polimorfismo a través de los cambios que se presentaron en las bases
nitrogenadas entre las cepas; así copio los sitios en donde se dan dichos cambios.
Estos cambios son importantes porque son la principal fuente de información que
se utilizó para realizar los análisis filogenéticos que permitieron demostrar la relación
entre las cepas, tornando en cuenta que estas proceden de zonas actualmente erradicadas,
las cuales fueron colectadas y reproducidas en laboratorio.
68
La variación genética que se observó en los fragmentos amplificados del mtADN
permite aplicar otros métodos, tales como: PCR-RFLP. Este método permite una rápida
identificación de los diversos haplotipos que puedan estar presentes y establecer
relaciones entre poblaciones.
Como se ha mencionado, C. macellaria es considerada una plaga secundaria del
gusano barrenador del ganado y es morfológicamente muy similar a este, principalmente
en los primeros estadíos larvales. Uno de los requisitos indispensables para la eficiencia
del programa de erradicación del gusano barrenador del ganado es la correcta
identificación de las especies en los sitios muestreados, debido a que un error puede
llevar a liberaciones innecesarias, además del alto costo de las mismas para la
erradicación de áreas erróneamente identificadas como infestadas o el diagnóstico
erróneo de una re-infestación. El aporte de las secuencias de la región amplificada para
C. macellaria y C. hominivorax proporciona información genética para diferenciarlas
entre sí, principalmente en los muestreos realizados por el programa de erradicación del
gusano barrenador del ganado.
El desarrollo de estas secuencias en la presente investigación aportan información
importante para estas regiones del genoma (NADH4/NADH5), permitiendo la
comparación entre cepas y poblaciones. Además, estas ayudarán para futuras
comparaciones con otros estudios entre especies del orden Diptera. Por ejemplo, la
región NADH4, has sido estudiada y comparada entre especies del género Drosophila
por Yu, eta!. (1999).
69
Para el caso de C. macellaria, el aporte también es muy importante debido a que
GenBank reporta secuencias de los genes tRNA Ile, 28S rRNA, subunidad I de
Citocromo Oxidasa B, Subunidad I de Citocromo Oxidasa (COI), tRNA-Leu y
Citocormo Oxidasa II (COII). Las regiones secuenciadas en esta investigación es una
contribución que ayuda a incrementar la información de su genoma.
3. Relación molecular entre las 6 cepas de Cochliomyia hominivarax (Coquerel).
El análisis de los resultados muestra que las cepas de Quintana Roo y Oaxaca son
genéticamente muy similares y forman un solo ciado. Mientras que las cepas procedentes
de Chiapas forman un ciado separado y muestran una mayor divergencia genética con
respecto a las cepas de Quintana Roo y Oaxaca (Figura 9). De manera que es muy
importante señalar que a pesar que los estados de Oaxaca, Chiapas y Quintana Roo son
geográficamente cercanos en el territorio del área sur de México, las cepas de estas
regiones se separan filogenéticamente.
Una estrecha relación entre las dos cepas de Chiapas podría esperarse debido a la
cercanía territorial entre ellas, factor que permite su posible apareamiento y retrocruza.
Además, puede considerarse el movimiento interno del ganado en el territorio de
Chiapas. Adicional a esto, el territorio de Chiapas está ubicada en un área montañosa, lo
que podría limitar la dispersión de las moscas a otros territorios, principalmente a la
planicie del norte de territorio de Chiapas. Por otro lado, el estado de Oaxaca está
ubicado más cercano al territorio de Chiapas que al de Quintana Roo. Sin embargo, en el
árbol del consenso, las cepas de Oaxaca (LH) y Quinta Roo (CECH) forman un ciado
70
bien definido. Esto pudo haberse debido a un movimiento migratorio de los animales
domésticos, principalmente el ganado, ya sea por comercialización o por pertenecer a
fincas afines. La facilidad de dispersión de las propias moscas es relativamente limitada,
debido a que el territorio de Oaxaca está localizado en un área ampliamente montañosa,
lo que puede funcionar como una barrera natural para la dispersión de las moscas.
Aunque, este territorio también presenta una planicie que se extiende hacia Quintana
Roo, pudiendo facilitar esta vía para su dispersión entre ambos territorios.
Con respecto al último ciado, conformado por las cepas de Costa Rica (CR-92) y
Panamá (P-95). Esta relación filogenética pudo haberse debido a las mismas razones que
el ciado formado por las dos cepas de Chiapas, ambos países están territorialmente
cercanos. Además, es muy probable que se diera el movimiento del ganado, así como la
migración de las moscas entre zonas fronterizas entre los dos países.
En el árbol filogenético del consenso, se observa una relación entre el ciado
formado por las dos cepas de Chiapas y el constituido por las cepas de Panamá y Costa
Rica. Esto indica una relación monofilética más cercana. Debido a esto, es posible
considerar que el territorio de Chiapas, la ciudad de San José, Costa Rica y la Ciudad de
Panamá tienen en común la cercanía con la carretera Panamericana. Por lo que se puede
suponer que este parentesco se deba al tránsito o migración del ganado. Este
movimiento vehicular pudo haber contribuido de alguna manera a que se diera esta
relación genética. Pese a esto, los clados se dividen conservando claramente su relación
anteriormente mencionada.
71
Sin embargo, en el estado de Oaxaca, también pasa la carretera Panamericana.
Entonces, por qué no existe relación entre estas cepas con Chiapas? Para contestar esto
hay que tomar en cuenta que el territorio de Chiapas está estrechamente cercano con los
países centroamericanos, por lo que la comercialización ganadera es más fácil que se
llevara a cabo entre Chiapas y Guatemala (áreas fronterizas) y los demás países de Centro
América que con los de Quintana Roo (que se encuentra lejos de la carretera
Panamericana) y Oaxaca. Adicional a esto, el departamento de Petén, Guatemala, que
está muy cercano a Quintana Roo, es un departamento de áreas boscosas con una
cobertura de 1,880,000 Ha. perteneciente a la Reserva de la Biosfera Maya, pudiendo
representar una barrera natural entre el territorio de Quintan Roo con Guatemala (López y
Véliz, 1999).
Esta misma cercanía entre Chiapas y Guatemala pudo influir en su relación
filogenética, debido a que se ha reportado que la capacidad de dispersión de las moscas
ha alcanzado hasta los 290 Km en dos semanas (Jasiorowski, 1993). Esta distancia
abarca territorialmente desde Chiapas hasta las fronteras con Guatemala, El Salvador y
Honduras. Adicional a esto el territorio de Chiapas tiene 653.55 Km de frontera con
Guatemala, convirtiéndolo en la puerta de entrada y salida con el mercado
Centroamericano (Secretaria de Desarrollo Económico del Estado de Chiapas, 2006;
Rodríguez, 1996).
En cuanto a la relación filogenética entre las seis cepas evaluadas con la población
de Brasil se observó una relación más cercana con el ciado formado por las cepas de
72
Chiapas, Panamá y Costa Rica. En relación a las áreas fronterizas de Panamá con
América del Sur, la provincia de Darién es limítrofe con Colombia, donde se encuentra
el Tapón del Darién, que se extiende a lo largo de la frontera en un 90%. Esta región,
alberga una rica biodiversidad de flora y fauna, que incluye muchas especies endémicas y
en peligro de extinción. Además de su riqueza biológica, presenta una gran extensión de
áreas protegidas (Conte, 2006). A pesar de la existencia de esta barrera natural, en
1972 fue firmado un acuerdo cooperativo entre Panamá y Estados Unidos, creándose para
ello la Comisión para la Prevención de la Fiebre Aftosa (COPFA), donde se prohibe la
cría, ceba, compra o venta de ganado vacuno y porcino en una franja de 20 millas (32
Km) paralela a la frontera con Colombia que Iimitó las explotaciones a las existentes a la
fecha de la ley en el resto de la provincia (Secretaría General de la Organización de los
Estados Americanos, 1978). Tomando en cuenta que la capacidad de dispersión de
mosca del gusano barrenador del ganado es hasta 290 Km en dos semanas, es posible la
dispersión y migración de la mosca entre Panamá y Colombia. Debido a lo anterior es
importante considerar la implementación de una barrera permanente de liberación de
moscas estériles en toda el área fronteriza de Panamá con Colombia.
Adicional a todos los factores anteriormente mencionados, también puede
considerarse aI istmo de Panamá como un puente biogeográfico. En Panamá,
conjuntamente con Colombia y Ecuador se localiza una de las biotas más abundantes de
tierras bajas, de excepcional riqueza y endemismo, con un amplio rango de especies. Las
características fisiogeográficas del istmo de Panamá, también han generado una riqueza
faunística que lo ubica como una de las regiones de máxima diversidad biológica del
73
planeta y ha facilitado el intercambio de especies entre el continente americano
(Autoridad Nacional del Ambiente, 2003).
Para poder hacer una discusión más precisa de la relación filogenética entre las
cepas de Costa Rica, Panamá y Brasil, es importante conocer la caracterización molecular
de otras poblaciones de América del Sur. Ya se han realizado estudios moleculares entre
poblaciones de Brasil, por ejemplo Azeredo-Espin (1993) realizó una caracterización
molecular de doce poblaciones de C. hominivorax procedentes de siete localidades de
Brasil, demostrando alta variabilidad. Vargas y Azeredo-Espin (1995) encontraron 15
haplotipos entre cuatro poblaciones de C. hominivorax procedentes de So Paulo, los
cuales fueron interpretados como un resultado que reduce el flujo de genes entre estas
poblaciones. El cladograma de la distribución geográfica de los haplotipos observados
sugiere que las muestras del barrenador probablemente pertenecen a un mismo linaje
evolutivo. Estos patrones que indican polimorfismo intraespecífico entre distintas
poblaciones de Brasil lo demostraron Litjens et al, (2001) con el estudio de cinco
poblaciones de Brasil.
Por otro lado Lyra et al. (1995) realizaron estudios en siete poblaciones de C.
hominivorax, procedentes de Uruguay donde también demostraron un alto polimorfismo.
El índice de similaridad, la divergencia promedio de nucleótidos y la varianza del análisis
molecular demostraron que no hay evidencia de diferenciación entre subpoblaciones
indicando que las poblaciones de Uruguay forman una panmixia. A pesar de que todas
estas investigaciones han sido realizadas en algunos países de América del Sur; no se
74
conocen las relaciones filogenéticas de toda la región sur americana y su relación con las
de Norte América, Centro América y el Caribe.
Otro factor muy importante que hay que considerar en las poblaciones sur
americanas, es que durante muchos años han sido controladas por varios métodos,
principalmente con insecticidas, los cuales con el tiempo pueden llegar a obtener
resistencia selectiva, producto de mutaciones. En 1962, LaChance y Hopkins
realizaron estudios en mutaciones de C. hominivorax, considerando que estas podrían
desarrollar efectos como: desigualdad en la proporción del sexo en la progenie, causar la
muerte de los homocigotos, afectando a un solo sexo de la especie o produciendo otras
características genéticas útiles en programas de entomología. Ellos encontraron nueve
mutaciones, que afectan principalmente el color de cuerpo y la venación de las alas. En
Brasil, C. hominivorax ha sido controlada mayormente con insecticidas organofosforados
y su uso inadecuado pudo dar lugar a resistencia por selección de las moscas. Cambios
en la actividad de la carboxilesterasa han sido asociados con el insecticida
organofosforado. Por ejemplo, Carvalho et al. (2006) aislaron y caracterizaron el gen
E3 en C. hominivorax, el cual presentó similares substituciones responsables por estar
sometidos al organofosforado, como lo presentó la especie Lucilia cuprina
(Calliphoridae).
En general, una relación filogenética similar a nuestros resultados ha sido
reportada en estudios con C. hominivorax en otras poblaciones. Por ejemplo, Roehrdanz
(1989) demostró que dentro de los 16 haplotipos encontrados se presentó una relación de
75
parentesco entre las cepas de Oaxaca con las de Quintana Roo, mientras que las cepas de
Chiapas, Costa Rica y Jamaica formaban haplotipos distintos. Skoda et al. (2002),
estudiaron las poblaciones de C. hominivora, procedentes de México (Chiapas, cepa PA-
34), Costa Rica, Brasil y Jamaica. Ellos demostraron la existencia de un polimorfismo
intraespecífico entre las poblaciones, obteniendo a través del análisis de agrupamiento
UPGMA y posteriormente bootstrapping cuatro dados definidos. Asimismo, estos
investigadores obtuvieron un ciado formado por las poblaciones procedentes de México,
otro formado por las poblaciones procedentes de Costa Rica. Un tercero constituido por
las poblaciones procedentes de Brasil y un último con las poblaciones procedentes de
Jamaica. Adicional a estos dados, ellos demostraron una relación entre la cepa de
México (Chiapas, PA-34) con la de Costa Rica, aunque con un soporte de 54%.
Con todos estos análisis se puede conocer parte de la biogeografia histórica de C.
hominivorax, debido a sus consistencia en la formación de los dados. A pesar de su
capacidad de dispersión, las cepas demuestran su procedencia filogenética claramente.
También, con esta investigación se aporta información de las regiones del ADN
mitocondrial estudiadas previamente estudiadas, las que pueden ser comparadas con
poblaciones de sur América, que actualmente son una plaga. Es importante continuar con
estudios en el genoma del C. hominivorax en áreas donde actualmente es una plaga
establecida, debido a que en un futuro puede entrar el programa de erradicación a Sur
América. De esta manera se asegurar el éxito de las liberaciones de moscas estériles
producidas en laboratorio para la erradicación, así como evitar la re-infestación en las
áreas erradicadas.
76
CONCLUSIONES
77
1. Se optimizaron tres cebadores para C. hominivorax: el cebador 7 (F: N5-J-7660; R:
N5-N-8853), el cebador 8 (F: N5-J-8621; R: N4-N-9676) y el cebador 9 (F: N4-J-
9580; R: NL-N-10740). Amplificando las regiones del mtADN NADH4 —tRNA-
NADH5.
2. Para C. macellaria se lograron optimizar únicamente dos "primers": el primer 8 (F:
N5-J-8621; R:N4-N-9676) y el primer 9 (F: N4-J-9580; R: NL-N-10740)
amplificando la región del mtADN NADH4 más una pequeña región de NADH5.
3. Se presentó un evidente polimorfismo que agrupa a las cepas en 3 clados definido y
la población de Brasil obtenida del Genbank queda fuera de estos tres clados. Los
clados son:
1. Las dos cepas de Chiapas (Limón y PA-34)
2. Las cepas de Panamá y Costa Rica (P-95 y CR-92)
3. Las cepas de Quintana Roo y Oaxaca (CECH y LH)
4. Población de Brasil
4. Las diferencias genéticas encontradas entre C. macellaria y C. hominivorax permite
distinguirlas molecularmente.
78
RECOMENDACIONES
79
Optimizar los demás cebadores que quedaron sin amplificar en este estudio, tanto
para C. hominivorax como para C. macellaria debido a que esta información permitirá las
comparaciones de otras regiones del genoma entre ambas especies, lo que facilitará la
separación entre ellas a nivel del genoma mitocondrial.
Continuar con los estudios de las cepas trabajadas, incluyendo las moscas estériles
producidas en laboratorio y su comparación con cepas actualmente establecidas como
especies nativas procedentes de Sur América e islas del Caribe. Información que
permitirá conocer las relaciones tlogenéticos entre ellas lo que aportará conocimientos
que contribuirán al éxito del programa.
Dentro de los estudios genéticos también se recomienda incluir los estudios con
genes nucleares de C. hominivorax.
Compararlas también con poblaciones controladas con insecticidas y áreas
reinfectadas tomando en cuenta la posible resistencia a ciertos insecticidas.
80
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88
Anexo
89
ANEXO 1
EVALUACIONES REALIZADAS PARA EL PRIMER 7 EN LA ESPECIECochliomyia macellaria
Se realizó inicialmente el protocolo optimizado en la investigación para C.
hominivorax. Posteriormente se evaluaron las siguientes concentraciones de MgC12: 1.5
mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM, a cada una de ellas se les realizó una prueba de gradiente de
temperatura de de 50 °C a 60 °C. Luego se evaluaron dos concentraciones de MgCl2:
1.5mM y 2.5 mM, con gradiente de temperatura de 40 °C a 50 °C. Todas estas pruebas
descritas fueron corridas con eI programa de PCR siguiente: Una desnaturalización inicial
del DNA a 94 °C, por tres minuto, luego 94 °C por un minuto, entre 50 °C — 60 °C por 30
segundos (o de 40 a 50, dependiendo del gradiente evaluado). Un alargamiento de 72 °C
por un minuto. Después de 35 termociclos ser hizo un alargamiento final a 72 °C por dos
minutos.
Posteriormente se evaluaron las concentraciones MgCl2 de 1.5 mM, 2 mM,
2.5mM y 3mM, con el mismo programa de PCR pero con eI único cambio del tiempo del
alargamiento de la nueva hélice de DNA a 72 °C por 10 minutos, en dónde tampoco se
tuvo éxito por Io que fue necesario evaluar dos concentraciones de MgC12: 1.5 y 2.5 mM
con los siguientes programas de PCR:
n Una desnaturalización inicial del DNA a 94 °C, por tres minuto, luego 94 °C por un
minuto, 45 °C por 30 segundos, 72 °C por un minuto y luego cuatro termociclos;
luego un paso de 94 °C por un minuto, 50 °C por 30 segundos. Un alargamiento de
72 °C por un minuto. Después de 30 termociclos ser hizo un alargamiento final a 72
°C por dos minutos.
n Una desnaturalización inicial del DNA a 94 °C, por tres minuto, luego 95 °C por dos
minutos, 50 °C por dos minutos, 72 °C por cuatro minutos y luego dos termociclos;
luego un paso de 93 °C por un minuto, luego 50 °C por un minuto. Un alargamiento
de 72 °C por cuatro minutos. Después de 32 termociclos, 93 °C por un minuto, 50 °C
por un minuto y finalmente 72 °C por diez minutos.
Posteriormente se hicieron evaluaciones utilizando el mismo protocolo donde se
evaluaron las siguientes concentraciones de MgCl2: 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM, a
las que se Ie hizo prueba de gradiente de temperatura de de 50 °C a 60 °C. También se
evaluaron las enzimas TagGold, Amplitaq y Qiagen.
Se evaluaron con el protocolo inicial 3 diluciones diferentes de ADN: 1:10, 1:50 y
1:100. Posteriormente se hicieron evaluaciones utilizando el mismo protocolo,
adicionándole DMSO al 5% y además donde se evaluaron las siguientes
concentraciones de MgC12: 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM, a cada una de ellas se les
realizó una prueba de gradiente de temperatura de de 50 °C a 60 °C.
A pesar de todas estas evaluaciones realizadas el primer no trabajo.
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