TEKNIK ELECTROSPINNING UNTUK MENGENDALIKAN DEPOSISI DAN PENYESUAIAN STRUKTUR WADAH NANOFIBROUS UNTUK
ORIENTASI SELULER DAN REORGANISASI SITOSKELETAL
Joke K. Wise, Michael Cho, Eyal Zussman, Constantine M. Megaridis, dan Alexander L. Yarin
2.1 PENDAHULUAN
Fibril sel dan matriks ekstraseluler (ECM), pada sebagian besar jaringan,
tidak random, tetapi yang jelas menunjukkan pola dan orientasi spasial tertentu.
Temuan terbaru menunjukkan bahwa biopolimer berorientasi berbasis wadah
nanofibrous memiliki potensi untuk pembuluh darah rekayasa [1], jaringan saraf
[2], dan jaringan ligamen [3]. Selain itu, telah terbukti bahwa sel adhesi dan
proliferasi [1] secara signifikan meningkat pada wadah berbasis nanofibrous.
Teori pedoman yang berhubungan menunjukkan bahwa sel memiliki probabilitas
migrasi terbesar dalam orientasi yang lebih disukai yang berhubungan dengan
sifat kimia, struktural, dan mekanis dari substrat [4-6]. Oleh karena itu, dapat
disimpulkan bahwa wadah berbasis nanofibrous akan memandu deretan sel
sepanjang nanofibers. Susunan sel ke nanofibrous wadah berorientasi bisa
disebabkan paduan yang berhubungan dan/atau reorganisasi sitoskeletal. Sel yang
selaras kemudian bisa digunakan untuk mengubah bentuk dan memodulasi
regenerasi dan lingkungan mikro ECM [7].
Tujuan khusus untuk pekerjaan ini adalah untuk merencanakan konsep
seperti jaringan yang akan meniru zona dangkal dari kartilago artikular. Diketahui
bahwa kartilago artikular secara garis besar terdiri dari setidaknya empat zona
berbeda, masing-masing dengan sel tertentu dan organisasi atau orientasi ECM [8-
10]. Zona ini dikenal sebagai zona dangkal atau tangensial, menengah atau
transisi, dalam atau radial, dan zona kalsifikasi. Penyusunan sel khusus dan ECM
dalam setiap zona kartilago dapat dikaitkan dengan riwayat perkembangan dan
masing-masing zona kartilago ini terkena daya mekanik, sehingga mendukung
fungsi keseluruhan jaringan artikular kartilago [12,13]. Beberapa laporan yang
diterbitkan telah difokuskan pada susunan zonal dari kondrosit dalam polimer
17
18
biokompatibel untuk rancangan rekayasa jaringan kartilago artikular [14-18].
Selanjutnya, jurnal yang baru-baru ini diterbitkan telah menggunakan kondrosit
dan sel induk mesenkimal manusia (hMSCs) dan tiga dimensi polimer wadah
secara acak untuk rancangan jaringan nanofibrous kartilago [19-23]. Namun,
upaya khusus untuk rancangan zona superfisial dari kartilago artikular
menggunakan hMSCs dan wadah berbasis nanofibrous belum dilaporkan. Zona
superfisial dari jaringan artikular kartilago alam tampak rata, kondrosit seperti
ellipsoid dan fibril kolagen skala nano, yang berorientasi sejajar terhadap bidang
permukaan artikular, dengan derajat signifikan dengan orientasi pada bidang [8-
1]. Meskipun hanya beberapa lapis tipis, pentingnya zona superfisial ini sering
ditekankan karena memberikan daya tarik tinggi yang dipertahankan oleh
orientasi sel dan fibril kolagen [12,13], dan karena itu sangat penting untuk fungsi
normal di artikular permukaan kartilago. Langkah pertama menuju rancangan
jaringan fungsional dari zona superfisial kartilago memerlukan evaluasi kuantitatif
dari adhesi dan orientasi sel.
Untuk berfungsi dengan baik, pembenihan sel dalam wadah harus mampu
berhubungan dengan lingkungan mereka melalui sinyal biokimia, bioelectrical,
dan topologi yang tepat. Topografi dan komposisi mikro (yaitu, ECM asli)
mempengaruhi fungsi seluler, seperti adhesi, pertumbuhan, motilitas, sekresi,
ekspresi gen, dan apoptosis. Hal ini juga diketahui bahwa struktur fisik dari ECM
asli memiliki dimensi nano. Permukaan luas-volume rasio tinggi dari wadah
nanofibrous dan diameter nano dari serabut cenderung memberikan kondisi yang
baik untuk perlekatan dan pertumbuhan sel. Sebagai contoh, karena kolagen
merupakan komponen ECM paling banyak, wadah berbasis kolagen terdiri dari
fibril dalam kisaran diameter 10-300 nm tidak hanya biokompatibel tetapi juga
bisa memberikan salah satu struktur nanofibrous paling ideal untuk merancang
jaringan [24]. Memang, sel telah diketahui untuk menempel padam dan tersusun
di sekitar serabut dengan diameter lebih kecil daripada sel tersebut [24,25].
Sel induk memiliki sifat unik untuk pembaruan diri tanpa diferensiasi
sampai dan setidaknya selama sinyal biologis dan fisik yang sesuai tersedia.
Dalam konteks rekayasa jaringan, penggunaan sel induk memiliki banyak
19
keuntungan. Tidak seperti konstruksi jaringan rekayasa menggunakan sel
didiferensiasi, sel induk (1) memiliki kapasitas proliferatif yang lebih tinggi, (2)
menyediakan kemampuan regeneratif yang sangat baik yang memungkinkan
integritas dan fungsi dari jaringan rekayasa yang diinginkan, (3) memungkinkan
untuk melihat konstruksi jaringan multifungsi (misalnya, jaringan osteochondral),
dan (4) mengurangi atau menghilangkan penolakan jaringan dan kegagalan.
Sekarang juga ditetapkan bahwa hMSCs dapat dibudidayakan dan dikembangkan
secara in vitro, dan dapat didorong untuk berkembang biak dan berdiferensiasi
menjadi jaringan sel fenotipe spesifik seperti khondrogenik, sel osteogenik,
adipogenik, dan myogenik dengan menggunakan rangsangan biologis dan fisik
[26-29], dan karena itu menyediakan potensi untuk perbaikan dan regenerasi
jaringan otot. Sementara potensi terapi hMSCs yang besar telah diakui untuk
pengobatan jaringan yang rusak atau sakit, kompleksitas peristiwa yang berkaitan
dengan transformasi sel-sel prekursor meninggalkan pertanyaan yang belum
terjawab tentang perubahan morfologi, struktur, proteomika, dan fungsional
dalam sel batang.
Pengetahuan yang lebih rinci mengenai sifat hMSC akan memungkinkan
pendekatan yang lebih baik dan lebih efektif untuk ekspansi sel in vitro, dan
regulasi keterkaitan mereka terhadap fenotip tertentu. Sebagai contoh, kontrol
orientasi, proliferasi, dan diferensiasi hMSC telah terbukti memodulasi aspek
fungsional konstruksi jaringan rekayasa [30,31]. Rekayasa lingkungan yang
kondusif untuk orientasi, adhesi, proliferasi, dan diferensiasi hMSC, oleh karena,
itu sangat penting dalam rekayasa jaringan.
Electrospinning [32-37] adalah teknik menjanjikan untuk menciptakan
arsitektur pola serabut untuk mengatur interaksi seluler dan molekuler dari adhesi,
proliferasi, diferensiasi, dan orientasi sel induk. Berbagai polimer alam atau
sintetis telah digunakan dalam rangka electrospinning untuk membuat dan
merancang wadah nanofibrous yang biokompatibel untuk aplikasi jaringan
rekayasa. Sebagai contoh, polikaprolakton (PCL) adalah bahan biodegradable
yang menunjukkan hampir tidak ada toksisitas, degradasi terkendali, dan tidak
mahal [38]. PCL adalah polimer yang semikristalin milik keluarga dari poliester
20
α-hidroksi (misalnya, PLA, PGA) dan secara signifikan dapat meningkatkan sifat
mekanik dari wadah karena modulus tarik yang tinggi (400 MPa; [39401]). Sifat
mekanik tersebut melebihi modulus elastisitas jaringan kartilago (~ l0 MPa) dan
di kisaran modulus elastis dari serat kolagen (~500 MPa), menunjukkan bahwa
wadah PCL nanofibrous menunjukkan kemungkinan yang sangat baik untuk
rekayasa jaringan kartilago. Selanjutnya, PCL baru-baru ini telah digunakan untuk
menunjukkan kompatibilitas untuk benih dan mengakomodasi hMSCs dan
mendukung diferensiasi multi-lineage [20,21,38].
Pada penelitian ini, pertama kita meninjau teknik berbeda yang digunakan
untuk menyelaraskan nanofibers selama electrospinning. Pada bagian berikutnya,
kami bertujuan untuk mengatur dan mengukur orientasi hMSC paling tidak pada
dua wadah PCL nanofibrous berbeda yang dibuat menggunakan electrospinning.
Dengan menggunakan analisis citra canggih, orientasi hMSC pada wadah
berorientasi nanofibrous acak dan dihitung selama periode kultur 18 hari. Selain
itu, kelangsungan hidup sel jangka panjang, reorganisasi cytoskeletal, dan adhesi
sel-nanofiber dieksplorasi dan berkaitan dengan kontak yang disebabkan orientasi
hMSC pada nanofibers. Terapi aplikasi stem sel dan jaringan rekayasa dapat
ditingkatkan dan difasilitasi oleh pendekatan fisik, seperti yang disajikan di sini,
untuk mengendalikan lingkungan mikro untuk pertumbuhan dan diferensiasi sel.
2.2 PEMBUATAN WADAH NANOFIBER DENGAN ELECTROSPUN
Teknik untuk baris pintalan nanofibers in situ menggunakan daya repulsi
elektrostatik untuk kembali bekerja [41,42] dimana lensa elektrostatik pertama
untuk electrospinning diperkenalkan. Ide dari lensa elektrostatik pada
electrospinning didapatkan dengan cepat dalam penelitian lain [43-46] dimana
beberapa pengaturan tambahan menggunakan prinsip ini digunakan. Sebuah
sketsa dari pengaturan eksperimental digunakan pada referensi [41.42] yang
ditunjukkan pada Gambar 2.1. Pancaran mengalir ke bawah dari permukaan
tetesan tambahan larutan polimer berhenti pada akhir jarum menuju roda kolektor
21
yang berputar dan ditempatkan pada jarak 120 mm di bawah tetesan itu. Roda
aluminium (dengan diameter
200 mm) memiliki tepi runcing dengan sudut setengah dari 26,6° untuk membuat
medan elektrostatik yang sangat konvergen. Sebuah perbedaan potensial listrik
sekitar 8 kV awalnya diterapkan antara permukaan tetesan cairan dan roda
berputar. Ketika beda potensial antara
tetesan dan roda meningkat, tetesan mengakuisisi bentuk kerucut seperti (kerucut
Taylor).
Pada beda potensial cukup tinggi, pancaran stabil muncul dari corong dan pindah
ke bawah
menuju roda. Pancaran mengalir jauh dari tetesan dalam garis hampir lurus dan
kemudian ditekuk ke dalam jalur kompleks yang berada dalam wilayah yang
berbentuk kerucut (sampul kerucut, [32]), dengan puncaknya di bagian atas.
Kemudian, pada suatu titik tertentu di atas roda, sampul kerucut mulai menyusut,
menghasilkan sebuah sampul kerucut terbalik dengan puncaknya di tepi roda.
Selama proses elektrospinning, roda diputar pada kecepatan konstan untuk
mengumpulkan nanofibers yang berkembang ke tepi yang tajam. Ketika pintalan
nanofiber mencapai tepi roda, mereka akan bersinggungan di sekitar roda. Sebuah
meja kecil (5 x 4 mm) yang terbuat dari aluminium juga dapat ditempelkan pada
tepi roda untuk memudahkan pengumpulan berikutnya dari nanofibers. Meja ini
dapat diputar pada sumbu Z (lihat Gambar 2.1) ketika rotasi roda berhenti untuk
sementara, maka, arah nanofibers dikumpulkan dapat dikendalikan. Nanofibers
dikumpulkan biasanya selama 10 detik. Susunan nanofiber dua dimensi yang khas
dibuat dari poli(etilena oksida) (PEO) dengan metode ini ditunjukkan pada
Gambar 2.2. Kecepatan linear di ujung kolektor disk adalah 11 rn/s dalam kasus
ini. Diameter nanofibers pada Gambar 2.2A tidak seragam dan bervariasi 250-400
nm, dan 200-500 nm. Pemisahan antara nanofibers paralel bervariasi dari 1
sampai 2 µm di kedua gambar.
22
Gambar 2.1 Skema proses electrospinning menunjukkan pancaran sampul
kerucut ganda. Roda kolektor dapat dilengkapi dengan meja yang membantu
untuk mengumpulkan nanofibers. Lempengan ini dapat diputar mengelilingi
sumbu Z-ketika rotasi roda untuk sementara berhenti untuk memungkinkan
pengambilan lapisan demi lapis pada sudut yang diinginkan antara susunan
lapisan nanofiber. (dari Zussman, E., Theron, A., dan Yarin, AL, Appl Phys Lea.,
82, 973, 2003. dengan izin.)
Sebuah bagian dari nanofiber yang panjang disimpan di meja tetap
dihitung untuk periode singkat. Karena itu, ketika putaran baru nanofiber
mengendap ke meja, nanofiber itu sebelumnya ditolak oleh bagian yang
mengendap, yang mana masih tetap dihitung. Mekanisme ini memungkinkan
pembentukan susunan dua dimensi di meja yang sama dengan yang ditunjukkan
pada Gambar 2.2. Kecepatan rotasi linier roda memainkan peran penting dalam
peregangan dan penyesuaian bagian nanofiber pada meja setelah pendaratan
mereka (lihat Gambar 2.3). Pada kecepatan rotasi roda linear 5-10 m / s,
keselarasan nanofiber cukup bisa dicapai (Gambar 2.3c dan e). Sudut (terhadap
arah rotasi roda) distribusi yang ditunjukkan pada Gambar 2.3b, d, dan f
mengungkapkan bahwa pada kecepatan rendah tidak ada serabut yang diinginkan
23
yang tercapai (Gambar 2.3b); pada kecepatan yang lebih tinggi, distribusi sudut
menunjukkan serat yang diinginkan menjadi sempit dengan kecepatan rotasi
meningkat linier (Gambar 2.3d dan f). Mekanisme yang sama pada dasarnya
bekerja ketika electrospun nanofibers pada Mandril berputar [46-48]. Namun,
ketika tidak ada pembatasan lateral yang dikenakan oleh tepi tajam roda (lensa
elektrostatik), ekskursi lateral dari serat yang cukup signifikan dan tingkat lebih
rendah dari keselarasan mungkin terjadi. Sebuah varian menengah sesuai dengan
pita logam (yang setara dengan meja sempit memanjang) dipasang di atas tepi
roda yang tajam. Akumulasi strip nanofiber seperti pada pita juga bisa
disesuaikan. Ini merupakan alasan mengapa tikar nanofiber terorientasi yang
digunakan dalam bagian berikutnya dari buku ini adalah nanofiber electrospun
pada pita yang ditempatkan di atas roda tajam yang berputar.
(a)
(b)
24
Gambar 2.2 Pengamatan gambar nanofibers dengan elektron mikroskop (SEM)
dengan PEO yang dikumpulkan pada pita karbon yang menempel pada tepi roda
kolektor. Dalam (a), diameter serat bervariasi 250-400 nm. Pada (b), diameter
serat bervariasi 200-500 nm. Lemparan (pusat ke pusat) bervariasi dari 1 sampai 2
guci di kedua gambar. (Dari Theron, A., Zussman, E., dan Yarin, AL.,
Nanorechnology, 12, 384, 2001 Dengan izin..)
Ditekankan bahwa tarikan pada bagian nanofiber setelah pendaratan
pertama pada kolektor yang berputar, di samping meningkatkan kekuatan tarik,
juga diharapkan untuk sejumlah aplikasi biomedis [46-48].
Susunan tiga dimensi nanofiber yang khas (lintang) digambarkan pada
Gambar 2.4. Kumpulan nanofiber PEO menunjukkan derajat tinggi kesesuaian.
Diameter nanofibers dalam hal ini juga seragam dan bervariasi di kisaran 100-800
nm. Ketika nanofibers yang electrospun ke tepi tajam roda tanpa meja, diperoleh
bundel (tali) nanofiber. Gambaran khas dari tali nanofiber dilepaskan dari tepi
roda ditunjukkan pada Gambar 2.5. Lamanya proses pengumpulan pada kasus ini
adalah 60 detik. Tali itu secara manual terlepas dari tepi roda [41]. Dua detail tali
serat polimer SEM yang dihasilkan dengan cara ini diperlihatkan pada Gambar
2.6. Para nanofibers berada dalam kontak, dan hampir tetap paralel hingga jarak
jauh.
25
Gambar 2.3 Orientasi nanofiber pada berbagai kecepatan rotasi roda linear: (a)
2,9 m / s; (b) orientasi distribusi serabut yang sesuai dinyatakan dalam sudut
sehubungan dengan arah rotasi roda (standar deviasi, SD = 23,44°) ; (c) 5,3 m/s ;
(d) distribusi yang sesuai orientasi sudut serabut (SD = 3,7°); (e) 7,7 m/s (f)
distribusi yang sesuai orientasi sudut serabut (SD = 1,8°). Bagian gelombang
serabut pada (e) tersebut diberikan merupakan bagian terakhir dari filamen yang
dikumpulkan saat medan listrik telah dimatikan. Nanofiber electrospun dari 4 wt
% polietilen oksida, PEO (MW = 1000 kDa) dalam etanol / air.
26
Gambar 2.4 Gambaran khas SEM susunan silang dari PEO berbasis nanofibers
dikumpulkan di meja aluminium. Struktur crossbar diperoleh dalam proses
perakitan berurutan dengan arah penempatan tabel ortogonal. (a) kumpulan dua
lapisan dan (b) kumpulan empat lapisan. (dari Zussman, E., Theron, A., dan
Yarin, AL, Appl Phys Len.., 82, 973, 2003. dengan izin.)
Gambar 2.5 Sebuah bundel (tali) dari nanofibers manual terlepas dari kolektor.
Hampir semua nanofibers dikumpulkan di tepi roda kolektor yang tajam. (dari
Theron, A., Zussman, E., dan Yarin, AL., Nanoteknologi, 12, 384, 2001 dengan
izin.)
27
Gambar 2.6 Gambaran khas SEM dua bundel (tali) nanofibers dengan PEO.
Kepadatannya sekitar 100 nanofibers per mikrometer persegi. (Dari Theron, A.,
Zussman, E., dan Yarin, AL, Nanoteknologi, 12, 384, 2001 dengan izin.)
2.3 METODE DAN MATERIAL
2.3.1 Elektrospinning dari Wadah Nanofiber PCL
Nanofibers dengan diameter beberapa ratus nanometer diproduksi dengan
menggunakan electrospinning seperti yang telah dijelaskan sebelumnya
[32,33,41,42] (lih. Bagian 2.2). Semua wadah polimer nanofiber electrospun
dibuat dari PCL dengan berat molekul 80 kDa (Sigma-Aldrich) electrospun dari
10wt% dari larutan metilen klorida / dimetilformamida dengan perbandingan 75/2
(volume). Dua jenis wadah nanofiber PCL electrospun yang berbeda diperoleh
dan ditandai sebagai random atau terarah. Wadah acak diproduksi oleh
electrospinning polimer nanofibers ke sebuah substrat aluminium datar,
menghasilkan wadah nonwoven tanpa orientasi nanofiber yang terpilih. Wadah
terarah diproduksi dengan mengumpulkan nanofibers pada pita logam sempit di
tepi sebuah roda yang berputar [41,42] (lih. Bagian 2.2), menghasilkan wadah
nanofibrous dengan orientasi yang jelas. Cairan electrospun polimer dari
semprotan 5 ml melekat pada jarum hipodermik (diameter bagian dalam 0,1 mm)
dan menggunakan laju aliran 1 mL / jam. Sebuah elektroda tembaga ditempatkan
dalam larutan polimer dan akhirnya electrospun menuju tepi yang tajam dari
kolektor listrik beralas (Gambar 2.1). Kekuatan medan listrik adalah 1,1 kV / cm.
28
Kecepatan linier dari tepi kolektor roda adalah 10 rn/s. Semua percobaan
dilakukan pada suhu kamar (~25° C) dengan kelembaban relatif udara 40%. SEM
digunakan untuk mendapatkan gambar dari setiap jenis wadah nanofibrous PCL.
Pengamatan SEM dari wadah PCL dibuat dengan mikroskop S-3000N variabel
tekanan elektron hitachi. Instrumen ini memiliki sumber elektron tungsten dan
mampu mencitrakan spesimen dalam tekanan variabel mulai 1-270 Pa. Di bawah
tekanan variabel, spesimen nonconducting dapat dicitrakan tanpa lapisan film
konduktif. Tegangan mempercepat dapat bervariasi selama rentang 0,3-30 kV
dengan resolusi 5 nm pada 25 kV. Diameter nanofiber diperkirakan dengan
menggunakan prosesor gambar (MetaMorph, Device Molekuler Corp.,
Downingtown, Pennsylvania).
2.3.2 Kulturasi Sel Stem Mesenkimal Manusia dan Pembibitan dalam
Wadah Nanofibrous PCL
hMSCs diperoleh dari Sumber Sel Stem Mesenkimal Dewasa (Tulane
University, New Orleans, Louisiana). Sel dikultur dalam medium pertumbuhan
lengkap yang terdiri dari medium Dulbecco eagle yang dimodifikasi (DMEM)
ditambah dengan 15% serum janin sapi (FBS), 2 mM L-glutamin, 1%antibiotik,
antimikotik (konsentrasi akhir: penisilin 100 µg/mL, streptomisin 100 g/mL, dan
amfoterisin B 0,25 µg/mL). Sel pada tahap 6 yang digunakan dalam percobaan
yang ini. Dari material anyaman dan strip nanofibrous electrospun dalam jumlah
besar, piringan wadah kecil dengan luas sekitar 0,3 cm2 cocok untuk kultur sel dan
percobaan penyemaian. Wadah awalnya direndam dalam etanol 70% selama 1
jam, kering, dan disterilkan di bawah sinar UV selama 6 jam di setiap sisi, dan
sebelumnya dibasahi dengan merendam dalam medium kultur sel lengkap dengan
serum selama 48 jam untuk meningkatkan adsorpsi protein. Untuk pembenihan
hMSCs ke wadah nanofiber PCL, sel dipipet langsung ke wadah dengan
kepadatan sel 7,5 x 104 sel/cm2. Medium kultur ditambahkan dan untuk
pembiakan jangka panjang, diganti setiap 2 sampai 3 hari.
29
2.3.3 Pengamatan Microscopy Laser Confocal dan Analisis Orientasi
Sampel diamati pada hari pertama (24 jam setelah pembibitan awal sel
induk ke wadah), dan kemudian pada hari-hari 4, 8, 12, 15, dan 18. Untuk analisis
sel orientasi, satu set sampel diwarnai dengan CellTracker CMFDA (15 µM, 5-
chloromethylfluorescein diasetat, Probe Molekuler Invitrogen, Carlsbad,
California) untuk pengamatan fluoresensi dan difiksasi dalam cairan formalin
fosfat buffered saline 3,7% (PBS) untuk memastikan bahwa arah dan morfologi
sel berada tetap stabil selama pencitraan. Rasio sinyal-suara yang kuat
memungkinkan analisis gambaran kuantitatif terpercaya dari orientasi sel.
Pengamatan confocal mikroskop multiphoton/laser (Radiance 2000, Bio-Rad,
Hercules, California) dan Nikon TE2000-S mikroskop inversi dengan 20x sasaran
Plan Apo (NA = 0,75) digunakan untuk menghasilkan gambar. Sementara
fluoresensi sel yang diwarnai dengan CMFDA terdeteksi, nanofibers PCL sendiri
digambarkan dalam modus refleksi [49]. Bergantian antara mode fluorosensi dan
refleksi, sel dan nanofibers dari area yang sama pada sampel dapat dicitrakan.
Gambar diambil dari setidaknya lima gambaran yang berbeda dan dipilih secara
acak pada setiap sampel pada titik kultur sel yang berbeda dari hari 1 sampai hari
18. Dengan menggunakan analisis pencitraan, orientasi dan serabut sel dengan
mengikuti petunjuk (misalnya, sumbu horisontal) dihitung untuk setiap tampilan
pencitraan. Pengukuran orientasi sel difasilitasi oleh bentuk memanjang dari
hMSCs, yang menampilkan sumbu utama yang jelas.
2.3.4 Viabilitas dan Visualisasi Fluoresensi hMSC
Sampel diwarnai menggunakan uji viabilitas sel (Probe Molekuler). Secara
singkat, calcein AM (2 µM) berdifusi melintasi membran sel hidup dan bereaksi
dengan esterase intraseluler untuk memancarkan fluoresensi hijau, sementara
etidium homodimer-1 (4µM) hanya dapat masuk ke sel mati dengan membran sel
yang rusak dan memancarkan fluoresensi merah ketika berikatan dengan asam
nukleat. Untuk setiap sampel, jumlah sel dan persentase sel hidup dan mati
ditentukan dari setidaknya tiga area yang dipilih secara acak.
30
Mikrofilamen diwarnai menggunakan rhodamine-phalloidin (170 nM, Probe
Molekuler). Sampel dari hari 4 dan 18 dipilih untuk pewarnaan microfilament dan
difiksasi dalam larutan formaldehida PBS 3,7%. Untuk permeabilisasi membran
sel, sampel ditempatkan pada Triton X-100 0,5% dalam larutan PBS selama 5
menit pada suhu 4° C dan dicuci tiga kali dengan PBS. Untuk menahan daerah
ikatan non spesifik, sampel sebelumnya diinkubasi dengan BSA 1% selama 30
menit dan dicuci tiga kali dengan PBS. Filamen aktin diwarnai semalaman dengan
rhodamine-phalloidin dalam BSA 1%. Adhesi struktur khas hMSC-nanofiber
ditemukan dan selanjutnya diperiksa menggunakan mikroskop perbesaran tinggi.
2.3.5 Statistik
Untuk setiap gambaran sel yang disemai pada sampel wadah berorientasi
nanofibrous hari 1, 4, 8, 12, 15, dan 18, arah sudut rata-rata sel dan arah sudut
rata-rata serabut sehubungan dengan arah petunjuk dihitung. Perbedaan antara dua
kuantitas menentukan sudut relatif sel-nanofiber. Selain itu, distribusi sudut relatif
sel yang mengikuti sudut rata-rata arah serabut rata-rata yang diperoleh untuk tiga
gambaran pada setiap sampel wadah. Ketiga distribusi dianalisis secara statistik
dengan uji dua sisi t dan varians Student’s tidak ditentukan signifikan secara
statistik (p> 0,05). Oleh karena itu, dengan menggabungkan data dari tiga
gambaran terpisah, distribusi secara keseluruhan dibentuk setiap hari. Sudut rata-
rata sel-serat relatif diperoleh bersama dengan standar deviasi yang sesuai untuk
setiap hari. Rata-rata sudut relatif sel-serat 10o atau kurang mengisyaratkan
keselarasan paralel sel dengan arah nanofibers di dasarnya. Mengenai wadah
nanofibrous acak, semua nilai dalam distribusi sudut sel-nanofiber memiliki
probabilitas yang sama dan karena itu nilai sudut rata-rata tidak dapat ditentukan.
Meskipun demikian, distribusi sel-nanofiber sudut dalam wadah nanofibrous acak
dapat secara kualitatif dibandingkan dengan wadah nanofibrous yang terorientasi.
31
2.4 HASIL DAN PEMBAHASAN
2.4.1 Karakterisasi Wadah Nanofibrous PCL Electrospun
Pencitraan SEM dilakukan untuk mengamati struktur morfologi nanofibers
masing-masing pada dua jenis wadah (acak atau terarah). Wadah acak (Gambar
2.7a) terbukti terdiri dari nanofibers yang tidak memiliki arah yang ditentukan.
Sebaliknya, wadah terarah (Gambar 2.7b) menunjukkan nanofibers dengan arah
yang ditentukan (pada kasus ini utara-selatan). Mayoritas nanofibers dalam wadah
yang berorientasi selaras satu sama lain. Diameter rata-rata nanofiber diperkirakan
sekitar 820 ± 340 nm. Berdasarkan gambaran SEM, porositas wadah jenis ini
yang cocok untuk adhesi, proliferasi, dan kelangsungan hidup sel.
(a)(b)
Gambar 2.7 SEM gambar nanofibers PCL dalam (a) acak dan (b) wadah PCL
terarah. Gambaran putih terlihat di kedua frame fragmen PCL yang berasal dari
pembentukan kerak polimer di pintu keluar nosel aparat electrospinning.
2.4.2 Arah Sel dan Nanofibers pada Wadah Acak dan Terarah
hMSCs dan nanofibers dicitrakan secara bersamaan oleh pengamatan
microskopi laser confocal (LSCM) untuk mengetahui pengaruh arah electrospun
nanofiber PCL pada barisan sel. Gambar 2.8 menampilkan gambar superimpose,
pseudocolored dari hMSCs (hijau) dan nanofibers (merah) pada (a1) acak dan
(b1) wadah nanofibrous berorientasi PCL setelah kultur sel 1 hari. Ketika gambar
superimpose jelas terlihat bahwa hanya setelah 24 jam inkubasi, ada perbedaan
32
yang signifikan dalam orientasi hMSCs dikultur di atas wadah acak dibandingkan
dengan bahwa pada wadah berorientasi. Sudut orientasi hMSCs terhadap sumbu
horisontal ditentukan untuk sampel wadah acak dan berorientasi. Histogram
mewakili distribusi sudut orientasi hMSC setelah kultur sel 1 hari ditampilkan di
bar hijau grafik Gambar 2.8. Sebagaimana yang dijabarkan oleh distribusi terbatas
sudut sel ditunjukkan pada histogram Gambar 2.8b2 (standar deviasi 16°), hMSCs
diinduksi agar sesuai pada wadah nanofibrous berorientasi. Selanjutnya, deretan
sel pada wadah berorientasi hampir serupa dengan wadah nanofiber terarah
(Gambar 2.8b3), dimana standar deviasi dari distribusi sudut nanofiber adalah
15°. Di sisi lain, penyemaian sel di wadah nanofibrous acak selama 24 jam tidak
menunjukkan arah sel yang diharapkan (Gambar 2.8a1), dipastikan oleh besarnya
sudut distribusi di histogram 2.8a2 Gambar. Demikian juga, di wadah nanofibers
acak juga menunjukkan distribusi sudut yang besar (Gambar 2.8a3).
Arah hMSCs dan nanofibers pada setiap jenis wadah setelah kulturasi yang
lebih lama dari 18 hari sangat mirip dengan yang ditemukan setelah kulturasi sel
hari pertama. Hasil hari ke-18 ditampilkan dalam Gambar 2.9. hMSCs yang
dikultur pada wadah nanofibrous terarah (Gambar 2.9b1) selama 18 hari terus
mempertahankan tingkat yang sangat baik dari deretan sel berbentuk bola. Hal ini
ni dikonfirmasi lagi oleh histogram untuk deretan sel spasial pada wadah terarah
(Gambar 2.9b2) dan nanofiber terarah (Gambar 2.9b3); keduanya menunjukkan
distribusi sudut yang terbatas (standar deviasi 20° dan 32°, masing-masing) dan
korespondensi yang baik satu sama lain. hMSCs yang dikultur pada wadah terarah
menunjukkan morfologi yang lebih tipis dan lebih memanjang secara kualitatif
dibandingkan sel yang dikultur pada wadah acak, menunjukkan bahwa bentuk sel
mungkin telah terpengaruh oleh susunan struktur nanofiber. Mirip dengan hasil
yang diperoleh setelah 1 hari masa inkubasi, hMSCs yang dikultur di wadah acak
setelah 18 hari (Gambar 2.9a1) tidak menunjukkan arah sel yang signifikan dan
mempertahankan distribusi sudut orientasi sel yang lebih luas, lebih dari 180°
(Gambar 2.9a2), yang berkorelasi dengan distribusi dari sudut orientasi nanofiber
acak (Gambar 2.9a3). Harus dicatat, bahwa bagaimanapun,setelah 18 hari kultur
sel, hMSCs muncul untuk menunjukkan beberapa bidang self-alignment "Lokal"
33
di wadah acak. Seperti yang terlihat di bagian kiri bawah Gambar 2.9a, beberapa
sel tampaknya menunjukkan orientasi sesuai arahan, seperti ditegaskan oleh
bagian berbentuk lonceng dari distribusi sudut sel yang sesuai di Gambar 2.9a2.
Temuan ini berkaitan dengan proliferasi dan konfluen kultur sel daripada deretan
sel diarahkan oleh nanofibers di dasarnya. Kumpulan hMSCs lokal ini, yang
terjadi meskipun keacakan dari serabut yang mendasari, tidak memiliki ciri
susunan berbentuk bola yang dilihat pada wadah berorientasi (Gambar 2.9b1).
Tetapi, kurangnya kontrol atas sel orientasi-meskipun dengan skala lokal-
menyebabkan efek lokal ini berarti mempengaruhi keseluruhan hasil dari
percobaan ini, yaitu, untuk menyesuaikan sel secara global dan terkendali.
Gambar 2.8 (Lihat sisipan warna halaman 206.) Gambar superimpose dan
pseudocolored hMSCs (hijau) dan nanofibers (merah) dalam (al) dan acak (b1)
wadah nanofibrous PCL terarah setelah 24 jam kultur sel. Histogram mewakili
34
distribusi sudut arah sel dengan terhadap sumbu horisontal hMSCs pada (a2)
wadah acak dan (b2) terarah. Histogram menggambarkan distribusi sudut orientasi
nanofiber dengan arah horisontal untuk (a3) wadah acak (b3) dan berorientasi.
Histogram pada (a2) dan (a3) dibangun berdasarkan ukuran 127 sel dan 234
nanofibers, sedangkan 124 sel dan 242 nanofibers digunakan untuk membuat
histogram dalam (b2) dan (b3), masing-masing.
Gambar 2.9 Gambar superimpose dan pseudocolored hMSCs (terang) dan
nanofibers (gelap) dalam (al) wadah nanofibrous PCL acak (bi) dan beriorentasi
setelah 18 hari kultur sel. Histogram mewakili distribusi sudut orientasi sel
35
dengan terhadap sumbu horisontal untuk hMSCs pada wadah (a2) acak (b2) dan
berorientasi. Histogram menunjukan distribusi sudut orientasi nanofiber dengan
terhadap sumbu horisontal untuk wadah (a3) acak (b3) dan berorientasi.
Histogram di (a2) dan (a3) dibuat berdasarkan pengukuran dari 132 sel dan 194
nanotibers, sedangkan 138 sel dan 258 nanofibers digunakan untuk membangun
histogram dalam (b2) dan (b3), masing-masing.
2.4.3 Kesejajaran hMSC Konsisten Jangka Panjang dalam Wadah
Nanofibrous Terarah
Efektivitas wadah nanofibrous PCL terarah dalam meningkatkan barisan sel
dari penyemaian hMSCs ini dianalisis secara kuantitatif pada waktu yang berbeda.
Distribusi sudut relatif sel ditentukan untuk wadah berorientasi dengan
mengurangi sudut rata-rata nanofiber dari distribusi sudut, sel dan menentukan
sudut rata-rata relatif sel-serat pada setiap titik waktu. Hasil untuk sampel yang
dibiakkan dari hari ke-1 sampai hari ke-18 yang digunakan sebagai ukuran untuk
menilai efikasi dan pengaruh waktu terhadap perubahan deretan hMSC. Seperti
ditunjukkan dalam Gambar 2.10, untuk semua sampel wadah nanofibrous
berorientasi dari hari 1 sampai hari ke-18, sudut sel relatif sekitar ± 10°. Oleh
karena itu, keakuratan dan konsisten keselarasan sel pada wadah nanofibrous
berorientasi ditetapkan untuk kulturasi awal dan jangka panjang. Dari hari ke-1
hingga hari ke-18, standar deviasi distribusi sudut relatif sel-serat untuk wadah
nanofibrous berorientasi tetap pada kisaran 15° - 30 °, dengan semua nilai rata-
rata harian dalam satu standar deviasi dari sudut referensi umum dari 0 °
(keselarasan sempurna). Hal ini menunjukkan bahwa lampiran hMSC awal untuk
wadah nanofibrous bertahan untuk periode inkubasi 18 hari.
36
Gambar 2.10 Kesesuaian hMSC sementara pada wadah nanofibrous berorientasi.
Analisis uji t (dua-sisi, tidak berpasangan) menunjukkan bahwa setidaknya tiga
gambaran dari setiap wadah nanofibrous setiap hari secara statistik tidak
signifikan (p> 0,05), dan sudut rata-rata orientasi relatif sel dan deviasi standar
yang ditentukan untuk yang sampel wadah nanofibrous berorientasi pada hari ke-
1, 4, 8, 12, 15, dan 18. Rata-rata sudut relatif sel-serat pada wadah nanofibrous
berorientasi setiap hari nya berkisar ± 10 °, menunjukkan keselarasan yang sangat
baik dengan nanofibers didasarnya. Garis kekeliruan menunjukkan dua standar
deviasi (± o).
2.4.4 Viabilitas hMSC dalam Wadah Nanofibrous PCL
Kelangsungan hidup jangka pendek dan jangka panjang dari kultur hMSCs
pada wadah acak dan terarah diuji dengan menggunakan alat tes fluoresensi
hidup/mati. Untuk setiap jenis wadah, jumlah sel-sel hidup dan mati dihitung dari
setidaknya tiga bidang sel biakan yang berbeda setelah 4 dan 18 hari. Persentase
sel hidup dari jumlah total sel dihitung dan hasilnya ditunjukkan pada Tabel 2.1.
Selanjutnya, dari jumlah total sel yang diamati, kepadatan rata-rata sel dihitung
dengan mengukur bidang dan ekstrapolasi data dalam satuan sel per sentimeter
persegi. Sebagian besar sel yang ditanam pada kedua jenis wadah yang hidup (>
70%), tetapi viabilitas mereka lebih rendah daripada yang sel dikultur diamati
dalam percobaan kontrol (misalnya, pada piring petridis). Persentase viabilitas sel
yang lebih rendah dapat dikaitkan dengan fakta bahwa kami menggunakan
37
hMSCs yang tidak berdiferensiasi tetapi tinggi proliferasi. Sebagai contoh,
meskipun kerapatan penyemaian awal hMSC sedang (7,5 x cells/cm2), hMSCs
cepat berkembang biak dan mengumpul. Seperti terlihat pada Tabel 2.1,
kepadatan sel pada kedua wadah nanofibrous, acak dan terarah, meningkat secara
signifikan dari hari ke hari ke-4 hingga ke-18, sedangkan persentase sel hidup
relatif tetap konstan. Karena PCL adalah bahan yang dikenal biokompatibel,
mungkin pengaruh untuk kelangsungan hidup hMSC lebih rendah. Sebaliknya,
dicurigai bahwa kepadatan penyemaian sel yang optimal bisa meningkatkan
viabilitas sel. Sebagai contoh, kepadatan awal penyemaian sel pada wadah
nanofibrous PCL telah terbukti menjadi faktor penting untuk viabilitas,
proliferasi, dan diferensiasi hMSC awal dan jangka panjang [20,21,38,50].
Diharapkan, bagaimanapun, bahwa ketika hMSCs diinduksi untuk berdiferensiasi
keturunan sel tertentu, penurunan proliferasi hMSC akan menghasilkan viabilitas
sel lebih baik. Selain tu, meskipun wadah nanofibrous electrospun yang
digunakan dalam percobaan ini disterilisasi dengan udara kering dan berikutnya
direndam dalam medium kultur sel, tidak ada wadah yang ditempatkan dalam
ruang vakum sebelum sterilisasi. Melakukan langkah ini dalam penelitian
selanjutnya harus menghilangkan pelarut organik sisa dari proses electrospinning
yang dapat merugikan kelangsungan hidup sel.
TABEL 2.1
Viabilitas hMSC yang Dinyatakan sebagai Persentasi Sel
Hidup dan Jumlah Total Sel yang Diperiksa
Hari Sampel % Hidup Sel yang dilihat /cm2
4 Acak
Terarah
76
80
7,0 x 104
11,6 x 104
8 Acak
Terarah
73
76
32,9 x 104
20,2 x 104
38
2.4.5 Reorganisasi Sitoskeletal dan Adhesi hMSC-Nanofiber
Elongasi sel yang disebabkan oleh nanofibers PCL diharapkan untuk
mengubah struktur sitoskeletal yang mengatur morfologi, adhesi, dan pergerakan
sel. Mikrofilamen dari hiMSCs dibiakan selama 4 hari pada wadah nanofibrous
PCL acak dan berorientasi pada kaca diwarnai fluoresens terang dengan
rhodamine-phalloidin dan dicitrakan menggunakan LSCM. hMSCs dikultur pada
substrat kaca menunjukan penyebaran morfologi sel yang khas dan diharapkan
(Gambar 2.lla). Serabut aktin yang besar terlihat dan bertanggung jawab untuk
adhesi hMSC yang lebih kuat pada substrat datar (2D) [51]. Banyak serat yang
tegang muncul untuk berkumpul dan berakhir pada satu titik yang sama pada
membran sel, dapat membentuk daerah titik kontak. Dibandingkan dengan
mikrofilamen yang ditemukan di kultur hMSCs pada substrat datar,susunan aktin
sitoskeletal diamati pada kultur hMSCs di atas wadah nanofibrous PCL acak dan
berorientasi jauh berbeda. Sebagai contoh, hMSCs yang ditanam pada wadah
nanofibrous acak dan berbudaya selama 4 hari (Gambar 2.11 ib) menunjukan
elongasi morfologi sel dan actins berkonsentrasi padat. Menariknya, struktur aktin
tipis berserat antara hMSCs dan nanofibers sekitarnya jelas, dan mudah terlihat
pada daerah yang dilingkari pada Gambar 2.l1b dengan panah menunjuk ke
nanofiber PCL berdekatan. Ketika hMSCs adalah disemai di wadah nanofibrous
PCL berorientasi, sel lebih memanjang dan sejajar di samping bundel nanofiber,
yang digambarkan juga dengan anak panah pada Gambar 2.llc. Actins pada
bderetan sel tersebut juga berkonsentrasi padat, dan bundel filamen aktin ada yang
sebagian besar berderet dalam arah yang sama dengan nanofibers berdekatan.
Bagaimanapun, lapisan tipis fibrous seperti struktur aktin menghubungkan hMSC
dengan bundel nanofiber disebelahnya juga diamati, terutama pada daerah yang
dilingkari dari Gambar 2.llc. Temuan ini mengarah pada gagasan mengenai
karakteristik unik ikatan hMSC ke nanofibers. Hasil kami, konsisten dengan
sebelumnya, menyatakan bahwa kultur sel otot polos pembuluh darah pada wadah
polimer nanofibrous juga mengembangkan hubungan fibrous yang serupa [1].
Perlu diingat, bagaimanapun, bahwa gambar yang dilaporkan memberikan bukti
kemungkinan adhesi Celi-nanofiber diperoleh dengan menggunakan SEM.
39
Sebaliknya, temuan kami menunjukkan bahwa tidak hanya koneksi fibrous yang
serupa yang ditemukan di interaksi hMSC-nanofiber, tetapi juga kemungkinan
keterlibatan filamen aktin dalam perkembangan unik struktur seperti adhesi ini.
Menarik juga untuk dicatat bahwa jaringan aktin padat diamati pada kultur MSCs
terelongasi pada wadah nanofibrous acak dan berorientasi yang muncul mirip
dengan sitoskeleton yang diamati dalam kondrosit artikular yang matang,
terutama pada permukaan artikular [52], menunjukkan bahwa penggunaan wadah
polimer nanofibrous berorientasi bisa menguntungkan untuk meniru jaringan
tulang rawan artikular lebih baik [19-21]. Karena rekayasa jaringan yang sukses
akan memerlukan bahwa konstruksi jaringan rekayasa meniru struktur mikro dan
nano, keselarasan spasial, dan fungsi dari jaringan alami, penggunaan wadah
nanofibrous yang optimal dikombinasikan dengan manipulasi hMSCs dapat
menghasilkan wadah biomimetik yang paling kompatibel.
Gambar 2.11 Gambaran fluorescent dari mikrofilamen hMSCs setelah 4 hari
kultur sel pada (a) permukaan kaca datar, dan (b) dalam wadah PCL acak (c) atau
40
berorientasi. Tidak ada adhesi fibrous seperti batas ditemukan ketika sel-sel
ditempatkan pada substrat khusus, tetapi perbatasan yang mengandung aktin
tampak, dibentuk oleh hMSC untuk melekat pada nanofibers. Struktur unik ini
akan diteliti lebih lanjut untuk menguji keberadaan adhesi protein seperti integrin
dan protein intraseluler lainnya.
2.5 KESIMPULAN
Dalam penelitian ini, teknik untuk penyelarasan nanofiber di electrospinning
telah dibahas dan digunakan dalam kultur sel induk. hMSCs berhasil dikultur pada
dua jenis wadah nanofibrous PCL electrospun. Orientasi sel terhadap jaringan
pendukung nanofiber dihitung. Efektivitas hMSCs untuk menyesuaikan arah
nanofibers terarah diamati. Kultur hMSCs pada wadah nanofibrous PCL
berorientasi menunukan deretan sel yang paling akurat dan konsisten. Viabilitas
sel diuji untuk memastika bahwa hMSCs yang layak dan berproliferasi pada
wadah nanofibrous PCL selama 18 hari kulturasi sel. Selain itu, perubahan aktin
sitoskeletal hMSC pada wadah nanofibrous diamati, dan keberadaan
mikrofilamen itu terungkap dalam adhesi serabut yang menyerupai batas yang
menghubungkan hMSCs dengan nanofibers yang berdekatan. Penelitian lebih
lanjut sedang dilakukan untuk menguji diferensiasi chondrogenic dari hMSCs
pada wadah nanofibrous PCL berorientasi dan efek dari berbagai diameter
nanofiber dan porositas wadah. Secara keseluruhan, temuan kami menunjukkan
bahwa rekayasa lingkungan ECM yang terorientasi untuk mengatur keselarasan
jaringan dapat dioptimalkan oleh nanofibers electrospun oriented, dan bahwa
aplikasi rekayasa jaringan tertentu seperti membuat zona dangkal kartilago
artikular dapat meningkat secara signifikan dengan menggabungkan sel batang
dan nanomaterials.