Doktori (Ph.D.) értekezés
A búza (Triticum aestivum L.) táplálkozástani értékének javítása géntechnológiai módszerrel
Készítette Tamásné Nyitrai Erzsébet Cecília
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola
Dr.Erdei Anna
Kísérletes növénybiológia PhD program Dr. Szigeti Zoltán
Témavezetı Dr. Bedı Zoltán, akadémikus
igazgató MTA Mezıgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár
MTA Mezıgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár 2009
TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS........................................................................................................................1 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ...............................................................................................2 2.1 A búza jellemzése ................................................................................................................2
2.1.1 A búza eredete és fontossága ......................................................................................2 2.1.2 Mag- és szemtermések fehérjéi, különös tekintettel a búza tartalékfehérjéire ...........2 2.1.3 A búza tartalékfehérje összetétel és a minıség kapcsolata.........................................9 2.1.4. Tészta- és lisztminısítésre alkalmas módszerek......................................................14
2.2 Az amarantusz jellemzése..................................................................................................15 2.2.1 Az amarantusz tartalékfehérjék csoportosítása és frakcionálásuk ............................15 2.2.2 Az amarantusz tartalékfehérjék aminosav összetétele..............................................20 2.2.3 Az AmA1 jelő fehérje jellemzése.............................................................................21
2.3 A táplálkozástani minıség javításának lehetıségei ...........................................................22 2.3.1 Táplálkozástani minıség javítása hagyományos nemesítéssel .................................23 2.3.2 Táplálkozástani minıség javítása géntechnológiai módszerrel ................................26
2.4 A búza genetikai módosítása .............................................................................................31 2.4.1 A növényregeneráció és az azt befolyásoló tényezık hatása a transzformációra.....32 2.4.2 A búza transzformációja ...........................................................................................35
3. CÉLKIT ŐZÉSEK ..............................................................................................................42 4 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .........................................................................................43 4.1 Növényregenerációs kísérletek ..........................................................................................43
4.1.1 Növényi anyagok ......................................................................................................43 4.1.2 Éretlen embriók szövettenyésztése ...........................................................................43 4.1.3 Statisztikai elemzés...................................................................................................44
4.2 Búza-transzformációs kísérletek........................................................................................44 4.2.1 Növényi anyagok ......................................................................................................44 4.2.2 Növényi szövet elıkészítése bombázáshoz ..............................................................44 4.2.3 Transzgénikus növények elıállítása .........................................................................45
4.3 A transzgénikus jelölt növények nukleinsav szintő vizsgálatai.........................................47 4.3.1 Genomi DNS izolálása..............................................................................................47 4.3.2 PCR-reakció..............................................................................................................47 4.3.3 Southern-blot analízis ...............................................................................................48 4.3.4 RT-PCR reakció........................................................................................................49
4.4 A transzgénikus növények fehérje szintő vizsgálatai ........................................................50 4.4.1 A marker/riporter gének aktivitásának tesztelése .....................................................50 4.4.2 A transzgén (ama1) expresszió igazolása Western-blot analízissel .........................51 4.4.3 A szemtermés fizikai vizsgálatai ..............................................................................52 4.4.4 Liszt vizsgálatok .......................................................................................................52 4.4.5 A búzalisztbıl készült tészták dagasztási tulajdonságainak vizsgálata ....................54
5 EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ............................................................................56 5.1 Növényregenerációs rendszer kidolgozása ıszi búza genotípusokhoz..............................56
5.1.1 A hajtásregeneráló táptalaj összetétel hatása a növényregenerációra.......................57 5.1.2 Az inkubációs hımérséklet csökkentésének hatása a növényregenerációra ............59 5.1.3 A fényintenzitás változtatásának hatása a növényregenerációra ..............................62 5.1.4 A hajtásregenerációban alkalmazott hımérséklet, fényintenzitás és táptalaj
összetétel együttes hatása a növényregenerációra ....................................................64 5.2 A növényregeneráció körülményeinek optimalizálása transzformációhoz .......................66 5.3 Búza-transzformációs kísérletek........................................................................................69
5.3.1 Transzgénikus búzanövények elıállítása és tesztelése .............................................69
5.3.2 Az AmA1 fehérje expresszió bizonyítása.................................................................75 5.3.3 Transzgénikus búza lisztminták elıállítása, fehérje- és aminosav összetétele .........77 5.3.4 A transzgénikus búza lisztminták HPLC analzíse ....................................................85 5.3.5 A transzgénikus búzavonalak lisztjének funkcionális vizsgálatai ............................88
6. ÖSSZEFOGLALÁS...........................................................................................................96 7. IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................................102 8. FÜGGELÉK .....................................................................................................................122
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BAP - benzil-amino-purin
BD - tésztaellágyulás (Resistance Break Down)
CTAB – cetil-trimetil-ammónium-bromid
Cys - cisztein aminosav
DDT – maximális tésztaellenállásig eltelt idı, dagasztási idıszükséglet (Dough Development
Time)
DTT – ditiotreitol
GUS - glükuronidáz enzim
HMW -GS - nagy molekulatömegő glutenin (High Molecular Weight Glutenin Subunit)
HPLC - nagy nyomású folyadék kromatográfia (High Pressure Liquid Chromatography)
IAA - indolecetsav
LMW -GS - kis molekulatömegő glutenin (Low Molecular Weight Glutenin Subunit)
Lys – lizin aminosav
NAA – naftilecetsav
PAT - foszfinotricin-acetiltranszferáz enzim
PCR - polimeráz láncreakció
RT-PCR - reverz transzkriptáz PCR
PPT - foszfinotricin
PR - maximális tésztaellenállás (Peak Resistance)
PVDF - polivinilidén-difluorid
RP-HPLC - fordított fázisú HPLC (Reverse Phase - HPLC)
SDS - Nátrium-dodecil-szulfát
SDS-PAGE - Nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis
SE-HPLC - méretkizárásos HPLC (Size Exclusion- HPLC)
ST – a tészta stabilitása a mikro-Valorigráfon kapott görbén (Stability)
TCA - triklórecetsav
UPP% - oldhatatlan polimer fehérje frakció (Unextractable Polymer Protein)
VU – valorigráfos unit
1
1. BEVEZETÉS
A Föld népességének folyamatos növekedése olyan fenntartható, új mezıgazdasági
technológiai fejlesztéseket igényel, melyek lehetıvé teszik az évenkénti élelmiszer-elıállítás
közel 50%-os növekedését a következı 30-40 évben (OECD, 2000).
Az emberi és az állati táplálkozásban ısidıktıl fogva a gabonafélék nagy szerepet játszanak.
Ma is az emberiség mintegy 50%-ának biztosítja a kalória igényét, míg 45%-ának a fı fehérje
forrását. A gabonafélék szemtermésének úgynevezett tartalékfehérjéi, melyek az
endospermiumban raktározódnak, az összes fehérjének több mint felét teszik ki.
Táplálkozástani értéküket a bennük lévı esszenciális aminosavak nem megfelelı mennyisége
és aránya korlátozza. Az esszenciális aminosavak az emberi és állati szervezetben de novo
nem szintetizálódnak, így a táplálékkal kell bevinni azokat. Ha egy ilyen aminosav limitáló
mennyiségben van jelen, a többi is csak ennek arányában szívódik fel, s a maradék kiürül a
szervezetbıl. Emiatt az állati takarmányok táplálkozástani értékét olyan fehérjék, ill. adalékok
bekeverésével javítják, mely a limitáló esszenciális aminosavakat (fıként lizin) a szokásosnál
nagyobb arányban tartalmazzák. Ez a fehérje azonban vagy nagyon drága, vagy nem áll
megfelelı mennyiségben rendelkezésre. A gabonafélék táplálkozástani értékének javítását
több módon érhetı el: hagyományos nemesítéssel (szelekció), molekuláris nemesítéssel
(mutagenézis vagy molekuláris markerezés segítette nemesítés) és géntechnológiai úton. A
kívánatos tulajdonság illetve tulajdonság csoport megjelenítésére a gabonafélék
szemtermésében az egyik lehetséges megközelítés a transzgénikus módszert is alkalmazó
nemesítés.
A búzanövény (Triticum aestivum L.) minıségét meghatározó tulajdonságok célzott módon
történı megváltoztatásáról elıször Vasil és mtsai. (1992) számoltak be. A genetikai
transzformáció elınye, hogy a kiválasztott gén/gének bejuttatása az egyedek sejtmagjába a
gének által hordozott információ hozzáadódását jelenti a genetikai információ halmazhoz, ami
lehetıvé teszi a „szülı” kiváló tulajdonságainak megtartása mellett egy specifikus gén által
kódolt új, egy adott felhasználási szempontból jobb tulajdonság beépítését. Munkánkban a
búza táplálkozástani értékének javításához az amarantusz (Amaranthus hypochondriacus)
egyik tartalékfehérje génjét (megfelelı szabályozó genetikai elemekkel kiegészítve)
biolisztikus módszerrel jutattuk be a búza genetikai állományába, melyrıl fehérje csak az
endospermium szövetben expresszálódott.
2
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1 A búza jellemzése
2.1.1 A búza eredete és fontossága
A búza az emberiség legfontosabb kultúrnövénye. Egyszikő kalászos gabonanövény, mely a
számos termesztett fajt tartalmazó pázsitfőfélék (Poaceae (Gramineae)) családjának Triticeae
nemzetségébe tartozik. A búzafajok lehetnek di-, tetra- és hexaploidok (Feldman és mtsai.,
1995). A termesztett búza kialakulásának elsı lépése a diploid Triticum urartu (Au genom) és
a diploid Aegilops speltoides (B genom) spontán keresztezıdése volt valószínőleg több tízezer
évvel ezelıtt a Közép Keleten (Vasil, 2007). A létrejött vad emmer búza, a T turgidum ssp.
dicoccoides már tetraploid (2n = 4x = 28, AABB). A további hibridizációk és domesztikáció
során jöttek létre a termesztett emmer (T. turgidum ssp. dicoccon) és a durum búzák (T.
turgidum ssp. durum) korai formáia. Az allohexaploid kenyérbúza (Triticum aestivum L.) (2n
= 6x = 42, AABBDD) az emmer búza és az Aegilops tauschii (2n = 2x = 14, DD)
keresztezıdése során alakult ki a Kaszpi síkságon i.e. 8000 körül (Vasil, 2007). A három
homeológ genom mindegyike hét pár kromoszómát tartalmaz.
Legnagyobb mennyiségben ma is a kenyérbúzát („közönséges” búza) (Triticum aestivum L.)
termesztik, mert valamennyi gabonaféle között egyedülálló abban a tulajdonságában, hogy
lisztjének fehérjéi sikérképzésre alkalmasak. Ennek következtében ırleményébıl laza
állományú, könnyen emészthetı sütıipari termékek készíthetık (Gianibelli és mtsai., 2001).
Lisztjének tészta-kialakítási képessége miatt a búza az emberi táplálkozás egyik legfontosabb
fehérjeforrása.
2.1.2 Mag- és szemtermések fehérjéi, különös tekintettel a búza tartalékfehérjéire
2.1.2.1 A mag- és szemtermések fehérjéi csoportosítása
A mag- és szemtermések jelentıs gazdasági és táplálkozásbeli szerepét a bennük felhalmozott
nagy mennyiségő tartalék tápanyagok (fehérjék, keményítı és lipidek) adják. A terméseket és
annak egyes részeit az ipar is sokféleképpen hasznosítja, mert a bennük lévı sajátos
tulajdonságú fehérjék a különbözı magvak és szemek tömegének akár 40%-át is kiteszik. A
magfehérjék tudományos vizsgálata a XVIII. század végén kezdıdött, és fıleg a fehérjék
oldhatóság szerinti osztályozását jelentette. Az elsı, mai tudományos igényeknek is
megfelelı, szisztematikus jellemzést T.B. Osborne végezte, s eredményeit 1924-ben
3
publikálta elıször. Nevezéktana a növényi fehérjéket négy csoportba sorolja: albuminok,
globulinok, prolaminok és glutelinek.
Az albumin fehérjék vízben oldódnak és hı hatására koagulálódnak. A fıleg kétszikő
növényekre jellemzı tartalékfehérjék szedimentációs állandója 2S, és többnyire a 11-12S
globulinokkal együtt fordulnak elı. Albumin fehérjék egyszikő növényekben, így
gabonafélékben is találhatók. A 2S albumin fehérjék fontos képviselıi az árpa és búza
hidrolitikus enzimeinek inhibitorai (α–amiláz vagy tripszin inhibitorok, szerin proteázok). Az
α–amiláz inhibitor fehérjék a teljes albuminfrakció kétharmadát teszik ki a búzában (Wrigley
és Bietz, 1988). Fıként, ha nem kizárólag, a keményítıben gazdag endospermiumban
találhatók (Altpeter és mtsai., 1999). A durum búza α–amiláz inhibitorai a glutén fehérjéihez
hidrofób kötéssel kapcsolódnak, s befolyásolják a belıle készült tészta kialakulását és annak
tulajdonságait. A búza és kukorica nem specifikus lipid transzfer fehérjéi tipikus 2S albumin
szerkezetőek (Pons és mtsai., 2003; Boutrot és mtsai., 2005). A búza „HMW és LMW
albumin”-jai polimerizációra képes β–amiláz fehérjék, melyek oldhatatlan, enzimatikusan
aktív komplexek (Rothfus és Kennel, 1970). Az enzimet három méretben azonosították (60,
63 és 65 kDa). A fehérjék monomer, vagy diszulfid híddal összekötött polimer formában
vannak jelen az endospermiumban (Gupta és mtsai., 1991a). Kimutattak diszulfid hidat β–
amiláz és LMW glutenin alegységek között is (Perutto és mtsai., 1996). Az „HMW- és LMW
albuminok” mennyiségét a termesztés körülményei (pl. kén hozzáférhetıség) erısen
befolyásolják (McRitchie és Gupta, 1993).
A híg vizes sóoldatban oldható globulin fehérjék fıleg a kétszikő növények magvaiban
találhatók, de mennyiségük számottevı a rizs és a zab szemtermésében is. A többi
gabonafélében nem jelentıs komponensek. Az endospermium fehérjetartalmának kb. 5%-át
adják (Singh és mtsai., 1991). Az érett búzaszemben 7S és a 11S globulinok találhatók,
melyek központi régiója β–hordó formájú, s hozzá két kevésbé konzervált szekvencia
motívum kapcsolódik (Dunwell és mtsai., 2004). A búza, az árpa és a zab 7S globulinjai
fıként az embrió és az aleuronréteg fı tartalékfehérjéi, a búza endospermiumban nincs 7S
globulin fehérje (Burgess és Shewry, 1986). A búza egyik 60 kDa endospermium fehérjéje
keresztreakciót adott a zab 11S globulin antitestjével. A fehérje redukáló szer jelenlétében 40
és 20 kDa polipeptidekre disszociált. A késıbb jellemzett triticin alegységek (legumin-típusú
búzafehérjék) diszulfid hidakkal dimereket, tetramereket és egyéb oligomereket alkotnak, s a
búza endospermium fehérje mátrixában elkülönült fázisban találhatók (Bechtel és mtsai.,
1991). A fehérjék repetitív régiója lizinben viszonylag gazdag (3 mol%).
4
A vizes alkoholban (50-70%) oldható prolamin fehérjék a gabonafélék legfontosabb és
legnagyobb mennyiségben lévı raktározott fehérjéi, bár a rizsben és a zabban csak kis
mennyiségben fordulnak elı. A búza prolamin fehérjéi a gliadinok, mely fehérjék legfeljebb
intramolekuláris diszulfid hidakkal rendelkeznek.
Az extrahálás után visszamaradó, semleges oldatban nem, de gyenge sav- és lúgban oldódó
fehérjék frakciója a glutelinek csoportja. E fehérjék neve búzában gluteninek. A frakció
fehérjéi összetételüket és szerkezetüket tekintve a prolaminok közé sorolhatók (Shewry és
mtsai., 1999). A glutenin fehérjék polimerizálódásra képesek, oldhatóságukat az
intermolekuláris diszulfid hidak (S-S típusú kötések) révén kialakuló polimer mérete
korlátozza. Redukció után (alegységekre bontás) oldatba vihetık vizes alkohollal (etanol és
propanol). A felszabaduló alegységek mobilitásuk alapján (SDS-poliakrilamid
gélelektroforézis) két csoportba sorolhatók: nagy molekulatömegő (HMW-GS) és kis
molekulatömegő (LMW-GS) glutenin alegységfehérjék. A búza prolamin típusú (gliadin és
glutenin) tartalékfehérjéit részletesen külön fejezetben tárgyaljuk (2.1.2.2 fejezet).
A különbözı polipeptidek alkotta Osborne frakciók átfedést mutatnak az oldhatóságban,
emiatt a magfehérjék modern besorolásának kritériuma ma már a fehérjék növényben
betöltött funkciója és szerkezete, valamint aminosav összetétele.
A tartalékfehérjék a legtöbb növénynél a szaporítószervekben halmozódnak fel, de kisebb
mennyiségben a vegetatív részekben is raktározódnak. Funkciójuk a nitrogén és kén atomok,
valamint szénvázak biztosítása a csíranövény számára. A gabonafélék legfontosabb és
legnagyobb mennyiségben reprezentált tartalékfehérjéi a prolaminok, míg a kétszikőek
tartalékfehérjéi az albuminok és globulinok. A gabonafélék szemtermésében a raktározott-
vagy tartalékfehérjék a szem összes fehérjéinek közel háromnegyedét teszik ki, s az
endospermiumban találhatók. A Triticeae nemzetségbe tartozó árpa, búza és rozs rokonságát
kiválóan demonstrálják tartalékfehérjéik, melyek különbözı típusai nagyfokú hasonlóságot
mutatnak egymás között (Shewry és mtsai., 1995). Specifikus biológiai aktivitásuk eddig nem
ismert. A búza tartalékfehérjéit külön fejezetben ismertetjük (2.1.2.2).
A nagyon eltérı tulajdonságú szerkezeti és metabolikus fehérjék minden Osborne
frakcióban megtalálhatók kis mennyiségben (teljes fehérjére vonatkoztatva). Minıségükben
nagyon fontos, az egyedfejlıdésben elengedhetetlen funkciójú molekulák. A gabonák
albumin és globulin frakciói a lizin fı forrásai. Az árpa lizinben gazdag β-amiláz enzime nem
csupán csírázáskor fontos, de nagy szerepet játszik, mint tartalékfehérje is.
A védı fehérjék a mag- és szemtermések fontos, nagy mennyiségben lévı fehérjéi, hiszen a
termések nem csupán az ember és az állatok számára jelentenek fontos táplálékot, hanem a
5
kórokozóknak és a rágcsálóknak is. Némelyiküket rezisztens fehérjének (PR, Pathogenesis
Related) hívják, noha legtöbbjük biológiai aktivitását még in vivo nem igazolták. Van köztük
olyan is, mely tartalékfehérje szerepet is betölt, mint pl. az árpa szerpin-típusú proteináz
inhibitora (protein Z).
2.1.2.2 A búza tartalékfehérjéi és másodlagos szerkezetük
A búzaliszt felhasználása szempontjából az endospermium fehérjéi a legfontosabbak, amit az
is alátámaszt, hogy a búza tartalékfehérjéit már 1745-ben tanulmányozták (Beccari). A
modern búzafajták többsége prolamin fehérje összetételükre nézve egységes és fajtára
jellemzı, de a tájfajták, mint például a régi magyar búzafajták (pl. a Bánkúti 1201), erıs
variabilitást mutatnak (Bedı és mtsai., 1995). A fehérje összetétel mind kvalitatív, mind
kvantitatív aspektusai a genetikai determináltságon felül a környezeti, élettani és agronómiai
hatásoknak is függvénye. A kenyérbúzában kétdimenziós gélelektroforézis módszerrel több
száz tartalékfehérje különböztethetı meg, de az egyes búzafajták prolamin fehérjéinek száma
eltérı. Hagyományosan (oldhatóság alkohol-víz elegyben) két azonos mennyiségben
megtalálható csoportba sorolhatók: oldható gliadin (monomer), és nem oldható glutenin
(polimer) fehérjék. Ma a nevük prolaminok (Shewry és mtsai., 1999), melyet nagy prolin és
glutamin aminosav tartalmuk miatt kaptak. A búza tartalékfehérjék többféleképpen
csoportosíthatók és csoportosították is az idık folyamán, de a legújabb, a molekulák
szerkezeti tulajdonságai alapján történı csoportosítás (monomer és polimerizációra képes
fehérjék) azt jelzi, hogy e fehérjék a búzalisztbıl készült tészta egyes funkcionális
tulajdonságainak kialakításában speciális szerepet töltenek be. A tartalékfehérjék kovalens és
nem kovalens kötéseken keresztül, a kenyértészta tulajdonságait elsısorban meghatározó,
nagyon bonyolult fehérje mátrixot hoznak létre (Hamer és van Vliet, 2000). A
viszkoelasztikus tulajdonságú kenyértészta két fontos reológiai jellemzıje a nyújthatóság és a
rugalmasság. A gliadin típusú fehérjéket a sikér nyújthatóságáért (Bushuk és Tkachuk, 1991),
míg a glutenin alegységfehérjéket elsısorban a sikér rugalmasságáért tartják felelısnek.
A kromatográfiás technika megjelenése, a genetikai vizsgálatok és a polipeptideket kódoló
gének megismerése új nomenklatúrához vezetett (Shewry és mtsai., 1999). Az aminosav
szekvencia és összetétel alapján a búza prolamin fehérjéit három osztályba sorolják: i) a
kéntartalmú aminosavakban szegény prolaminok, ii) a kéntartalmú aminosavakban gazdag és
iii) a nagy molekulatömegő (HMW) prolaminok csoportjába (2.3 táblázat). A csoportokon
belül további kisebb csoportok különböztethetık meg. Az „új” és a hagyományos (Osborne
féle) osztályozás között az oldhatóság és a polimerizációs hajlam szintjén van kapcsolat.
6
2.3 táblázat A búza tartalékfehérjék csoportosítása és nevezéktana Shewry és mtsai. (1999) szerint
A búza tartalékfehérjéi Osborne féle osztályozás
gliadinok gluteninek
funkcionális osztályozás
monomer prolaminok polimer prolaminok
ω-gliadin α/β-gliadin γ-gliadin LMW
glutenin HMW
glutenin
molekuláris osztályozás
kén-szegény prolamin
kén-gazdag prolamin HMW
prolamin A kén-szegény prolamin fehérjék a teljes prolamin frakció kb. 10%-át teszik ki. Régi nevük
ω-gliadin, molekulatömegük 30-80 kDa. A molekulák metionin aminosav tartalma kisebb,
mint 0,1%, cisztein aminosavakat kis számban, vagy egyáltalán nem tartalmaznak, így
általában monomerek. Lehetnek azonban fehérje polimerláncok terminátor molekulái is
(Masci és mtsai., 1993; Tamás és mtsai., 1998). Az egy cisztein aminosav tartalmú fehérjék
diszulfid híddal kapcsolódnak a glutenin polimerhez, emiatt az LMW glutenin
alegységfehérjék D csoportjába (is) sorolják (Masci és mtsai., 1993). Az ω-gliadin fehérjék
szerkezetét rövid N- és C-terminális szakasz által közrefogott nagy kiterjedéső, erısen
repetitív régió jellemez. Szokatlan másodlagos szerkezetét (laza spirál) béta-fordított-
fordulások (beta-reverse turns) és poli-L-prolin II (poly-L-proline II) hélixek keveréke adja
(Tatham és Shewry, 1995). A 70 nm hosszú molekula merev csavarmenetes spirál (worm-like
coil) (I’Anson és mtsai., 1992).
A kén-gazdag prolamin fehérjék a frakció fı komponensei (a teljes prolamin frakció 70-
80%-a). Molekuláikban 6-8 cisztein aminosav van molekulánként (2-3 mol%),
molekulatömegük 30-50 kDa. A csoportot a búza α/β- és γ-gliadinjai (monomerek), és a
polimerizálódásra képes LMW glutenin alegységfehérjék alkotják. Mindhárom csoport
fehérjéi hasonló aminosav szekvenciájúak, hosszú, nem repetitív C-terminális doménnel, és
rövid N-terminális repetitív doménnel rendelkezik. A C-terminális domén három hasonló
szekvenciájú régióra osztható (A, B és C régiók). A γ-típusú kén-gazdag prolaminok C-
terminális doménjében nyolc, konzervatív elhelyezkedéső SH csoport van, s csak
intramolekuláris diszulfid hidakat alakítanak ki (monomerek). A páratlan számú ciszteint
tartalmazó néhány kén-gazdag fehérje molekula szintén beépülhet a glutenin polimerbe
(Shewry és Tatham, 1997). Ezek a kötött γ-gliadinok képezik az LMW glutenin
alegységfehérjék C csoportját. Az α-típusú kén-gazdag prolamin fehérjék csak búzában
található meg. Legtöbbjük monomer, a C-terminális domén hat cisztein aminosava csak
7
molekulán belüli diszulfid hidakat hoz létre. A glutenin frakcióból izolált, egy ciszteinnel
rendelkezı fehérjék az LMW glutenin alegységfehérjék C csoportjába is sorolhatók.
A polimerizációra képes kén-gazdag prolamin fehérjék (LMW glutenin alegységfehérjék)
diszulfid hidakkal stabilizált polimereikbıl izolálhatók. Hat konzervált helyzető cisztein
aminosavuk intramolekuláris diszulfid hidakat képez, s a két (nagyon ritkán egy) extra
cisztein aminosav kovalens kötést alakít ki a molekulák között. A csoport fehérjéit további két
alcsoportba sorolják. Az egyikbe az LMWi, LMWm és LMWs fehérjék tartoznak, nevük a
fehérje elsı aminosavát jelzi (i, izoleucin, m, metionin, s, szerin). A másik csoport három
fehérjéje az α- és γ-gliadin fehérjékhez hasonló szekvenciájú (Gianibelli és mtsai., 2001).
A HMW prolamin fehérjék a teljes prolamin frakció 6-10%-át adják. Fıleg hatalmas
mérető, diszulfid hidak stabilizálta polimer molekulák. Molekulatömegük meghaladja a 20
millió Da-t (a természetben elıforduló legnagyobb fehérjemolekulák) (Wrigley, 1996). Régi
nevük HMW glutenin alegységfehérjék. Molekulatömegük és génjeik alapján az
alegységfehérjéket két típusba sorolják: nagyobb molekulatömegő (83-88 kDa) x-típusú, és
kisebb mérető (67-74 kDa) y-típusú alegységfehérjék (Payne és mtsai., 1984). A hexaploid
kenyérbúza fajták endospermiumában 3, 4, vagy 5 HMW glutenin alegységfehérje található.
A Dx, Dy és Bx alegységfehérjék minden búzafajtában jelen vannak, de az Ay
alegységfehérje nem két svéd búzafajta kivételével (Margiotta és mtsai., 1996). A tetraploid
búzában 1, 2, vagy 3 HMW glutenin alegységfehérje, míg a diploid búzákban egy, vagy két
alegységfehérje expresszálódik. Másodlagos szerkezetüket a molekula középsı részén egy
nagymérető, ismétlıdı aminosav szekvenciákat tartalmazó domén jellemzi, amit két rövid,
nem ismétlıdı szekvenciákból álló terminális régió fog közre. A fehérje molekulák méretbeli
változatosságát a központi repetitív domén eltérı hossza eredményezi. Minden alegység
repetitív doménje hat és kilenc aminosavból álló szekvencia egységeket tartalmaz, de az x-
típusú fehérjékben megfigyelték egy tripeptidbıl álló szakasz ismétlıdését is. A cisztein
aminosavak száma a búza HMW prolamin fehérjékben 4 és 7 között változik, egy részük
molekulán belüli, a többi molekulák közötti diszulfid kötés kialakításában vesz részt. A C-
terminálison egy cisztein aminosav van, de az N-terminális részben három (x-típusú HMW
fehérje) vagy öt (y-típusú HMW fehérje) cisztein aminosav található. Minden y-típusú
alegység repetitív régiója a C-terminális felıli végen tartalmaz egy cisztein aminosavat
(Anderson és mtsai., 1989), míg az 1Dx5 alegység repetitív régiójában az extra cisztein az N-
terminális felıli végen van. Az ismétlıdı szekvenciákat tartalmazó domén szabályos spirált
képez, aminek alapját béta-fordított-fordulások adják. A pálcika formájú szerkezet sokkal
szorosabb, mint a kén-szegény prolamin fehérjék repetitív régiójáé, mert poli-L-prolin
8
szerkezeti elemek nem szakítják meg. Az N- és C-terminális régiók konformációja α-hélixben
gazdag. A HMW prolamin fehérjék a legrészletesebben tanulmányozott és funkcionális
hatásukban értett fehérjék (Shewry és mtsai., 1995; Gras és mtsai., 2001; Wieser, 2007).
Viszonylag kis részarányuk ellenére szerepük rendkívül fontos, mivel a kenyértészta
rugalmasságát és ezen keresztül sütıipari minıségét befolyásolják. A polimer elmélet alapján
(Singh és McRitchie, 2001) az erısen polimerizált glutenin egy bonyolult polimer térháló,
melyben polimer-kémiai és reológiai viselkedés szempontjából is fontos szerep jut a lineáris
láncok „összegabalyodásának”.
2.1.2.3 A búzaszem anatómiai részei, fehérjetartalma és aminosav összetétele
Legfontosabb kenyérgabonánk szemtermése, a búzaszem anatómiailag három fı részbıl áll: a
liszttest (endospermium), a csíra (embrió) és a három rétegő héj, melynek legbelsı rétege az
aleuronréteg (Pomeranz, 1988). A búzaszem tömege legnagyobb részét az endospermium adja
(80-85%), míg az embrió a szem 2-3%-át teszi ki. A külsı héj alatt (2,5%) a maghéj található
(5-6%), s a keményítıben gazdag endospermiumot az aleuronréteg (7-9%) fedi be. A
búzaszem teljes fehérjetartalma 75%-a az endospermiumban, kb. 14%-a az aleuronrétegben,
kb. 7%-a az embrióban és kb. 4%-a a héjakban található (Shewry, 2007). Az endospermium,
melynek összetevıi a szemtermés ırlése és az ırlemény szitálása után a lisztben találhatók,
túlnyomórészt keményítıbıl áll (80-85%). Fehérjetartalma 8-15% között változik, amit a
búza genotípusa és a termesztés körülményei befolyásolnak.
A búzaszembıl ırölt különbözı malmi lisztfrakciók egymástól eltérı fehérjetartalmúak és
fehérje összetételőek a búzaszem egyes anatómiai részei eltérı fehérjetartalma és –összetétele
miatt. A keményítıben gazdag endospermium a búzaszem teljes fehérje mennyiségének
körülbelül háromnegyedét adja annak ellenére, hogy fehérje koncentrációja viszonylag
alacsony (Shewry, 2007). Az endospermium prolamin fehérjéi aminosav összetételét magas
glutamin (35,2%) és prolin (12,9%), valamint alacsony bázikus aminosav tartalom jellemzi
(arginin 3,6% és lizin 2,1%) (Jensen és Martens, 1983). Ezzel szemben mind az embrió, mind
az aleuronréteg fehérjéi kevés prolin és glutamin aminosavat tartalmaznak. Az
aleuronrétegben az arginin aminosav (11,1%), az embrióban az aszparagin aminosav (10,4%)
mennyisége viszonylag nagy (Jensen and Martens, 1983).
A búzaliszt egyes Osborne frakcióit alkotó fehérjék aminosav összetétele is eltér egymástól,
az eltérés fajtánként változik (Shewry és mtsai., 1999). Az albuminok és globulinok fehérjéi
jóval több lizin, aszparaginsav, treonin, alanin és valin aminosavat tartalmaznak, mint a
prolaminok gliadin és glutenin fehérje frakciói, de a glutaminsav és glutamin tartalmuk
9
kisebb. A globulin fehérjék prolin tartalma a legkisebb, míg a lizin tartalma a legmagasabb. A
búza endospermiumban raktározott prolamin fehérjéi nagy százalékban tartalmaznak prolin
és glutamin aminosavakat, innen kapták nevüket is. Mennyiségük 30-70 mol% között változik
az egyes molekulákban. E fehérjékben nagy koncentrációban találhatók glicin, fenilalanin,
tirozin és szerin aminosavak is. Töltéssel rendelkezı aminosavakban nagyon szegények, így a
molekulák töltése alacsony bármilyen pH érték mellett is. Általában az alacsony lizin,
triptofán, metionin, hisztidin és aszparagin aminosav tartalom is jellemzı.
2.1.2.4 A búza tartalékfehérjék szintézise
Klasszikus és molekuláris genetikai vizsgálatok alapján a búza prolamin típusú
tartalékfehérjéi az 1-es és 6-os homeológ kromoszóma csoport komplex lókuszain,
géncsaládokban kódoltak (Payne és mtsai., 1984). A tartalékfehérjék expressziója kontrollált
módon történik, koordinációja transzkripciós szinten valósul meg. Az mRNS-ek a növény
fejlıdésének adott szakaszában és specifikus szöveteiben jelennek meg. A fehérjék szintézise
térben és idıben jól meghatározott, amit szövetspecifikus promóter irányít. A szintézis
kizárólag csak a keményítıben gazdag endospermiumban játszódik le a megporzást követı
hatodik és harmincadik nap között (Grimwade és mtsai., 1996; Gupta és mtsai., 1996). A
tartalékfehérjék szekréciós fehérjék, melyek szignál peptiddel együtt szintetizálódnak, ami
segíti a fehérjék transzlokációját az endoplazmatikus retikulum (ER) lumenébe. A lumenben a
fehérje elveszíti a többnyire 20 aminosavból álló N-terminális végét, majd felveszi megfelelı
konformációját, s ezen a helyen történik a diszulfid hidak elsıdleges kialakulása is. A
megfelelı szerkezet kialakulása után minden prolamin fehérje molekula úgynevezett fehérje
testecskében raktározódik az endospermiumban (lásd Kermode és Bewley összefoglalója,
1999). A szem érése során a fehérje testek dezintegrálódnak. A közöttük lévı teret kitölti az
egyre nagyobb mennyiségő keményítı, a határmembránok szétszakadnak és az érett, száraz
szövetben egy folytonos fehérje mátrix alakul ki, melyben keményítı szemcsék „ülnek”.
2.1.3 A búza tartalékfehérje összetétel és a minıség kapcsolata
A búzalisztbıl dagasztott tészta különbözı végtermékek elıállítására való alkalmasságát
jellemzı minıség komplex fogalom, melyet a búzaszem fizikai- és kémiai tulajdonságai
együttesen határoznak meg. A táplálkozástani minıséget fıként az endospermiumban
található szénhidrátok, rostok, vitaminok, ásványi anyagok, valamint fehérjék mennyisége és
kémiai összetétele befolyásolja, míg a fehérjék táplálkozástani értékét az esszenciális
aminosav összetételük határozza meg (Shewry, 2007). (Lásd 2.3 fejezet).
10
A sütıipari termékek gyártása szempontjából a tészta minıségét a tartalékfehérje gének
expressziója során keletkezett fehérjék, azok szerkezete, valamint a fehérjék egymás közötti
és az egyéb komponensekkel (lipidekkel, szénhidrátokkal) kialakított kölcsönhatásai
befolyásolják (Bushuk, 1998; Shewry és mtsai., 1999). A búza tartalékfehérjéire jellemzı
egyedi tulajdonság, hogy víz és dagasztás hatására a hidratálódott fehérjékbıl egy stabil
térhálós szerkezet, a sikér alakul ki. A tészta kb. 10%-át kitevı sikér közel 80%-a (száraz
anyagra nézve) fehérje, a többi része fıként keményítıbıl és lipidekbıl áll. E molekulák is a
hidratált komplex szerves részét képezik. A lipidek és a lipid-fehérje komplexek meghatározó
szerepet játszanak a dagasztás, a kelesztés és a sütés során kialakuló gáz-víz és gáz-olaj
határfelületek stabilizálásában (Marion és Dubreil, 1998). A sikérmátrix szabályozza a
lipoprotein filmek által stabilizált gázbuborékok tágulását is. A viszkoelasztikus sikérmátrix
rugalmassága és nyújthatósága a fehérje összetételtıl függ, ami meghatározza a tészta
funkcionális tulajdonságait és a belıle készíthetı termékek minıségét. Lehetıvé teszi, hogy a
búza lisztjébıl kenyeret és különbözı lisztesipari terméket készíthessünk (Gianibelli és mtsai.,
2001). A sikér tartalékfehérjéi a szerkezet kialakításában két módon vesznek részt: a
polimerizálódásra képes molekulák (glutenin fehérjealegységek) diszulfid hidakon keresztül
óriás mérető polimereket hoznak létre; a monomer fehérje molekulák (gliadin) másodlagos
kötéseket (hidrogén hidak, hidrofób kölcsönhatások) alakítanak ki egymással és a fehérje
hálózat glutenin polimer molekuláival. Így funkcionális tulajdonságaik is eltérıek. A glutenin
fehérjék a tészta rugalmasságát, a gliadin fehérjék a tészta formálhatóságát és nyújthatóságát
biztosítják (Bushuk és Tkachuk, 1991).
A tészta minıségével, különbözı végtermékek elıállítására való felhasználhatóságával
kapcsolatos elırejelzéshez a búzaliszt funkcionális tulajdonságaival szoros összefüggést
mutató paramétereket határoznak meg: a liszt fehérjetartalma, polimer/monomer fehérje
arány, a HMW/LMW glutenin alegységfehérjék aránya, az x- és az y- típusú HMW glutenin
alegységfehérjék aránya és a polimer fehérjék méreteloszlása. Ezen paramétereket (a
fehérjetartalom kivételével) modern kromatográfiás technikákkal [méretkizárásos (SE) és
fordított fázisú (RP) nagy nyomású folyadék kromatográfia (HPLC)] határozzák meg. Az
egyes paraméterek változásának hatásait a tészta funkcionális tulajdonságaira tésztaminısítési
módszerekkel tanulmányozták (2.1.4 fejezet). A tartalékfehérjék szerkezete és funkciója
közötti összefüggések keresésében számos kutatócsoport vett részt. (McRitchie és mtsai.,
1987, 1991, 1993; Gupta és mtsai., 1989, 1992, 1994, 1995; Békés és mtsai., 1993, 1994a,b,
1995, 2000, 2003; Békés és Gras, 1994; Gupta és McRitchie, 1994; Uthayakumaran és mtsai.,
1997, 1998, 1999, 2000, 2001; Butow és mtsai., 2003a,b). Munkájukban in vivo (transzgé-
11
nikus búzafajták vizsgálata) és in vitro (rekonstrukció, addíció és inkorporáció) módszereket
használtak. Kezdetben a búza tartalékfehérje összetételét jellemzı paraméterek hatását a
tészta funkcionális tulajdonságaira búza populációk eltérı fehérjetartalmú és -összetételő
fajtáin vizsgálták (Gupta és mtsai., 1991b; Cornish, és mtsai., 1998). Statisztikai módszereket
is használva erıs pozitív korrelációt állapítottak meg a teljes fehérjetartalom, a glutenin
alegységfehérjék mennyisége és a belıle készített tészták tulajdonságai között. A HMW
glutenin alegységfehérjék kulcsszerepét a tésztaerısségre gyakorolt hatásukban Barro és
mtsai. (1997) in vivo kísérletekben (transzgénikus búzák tesztelése) is bizonyították.
Dagasztási kísérleteikkel egyértelmően igazolták a Glu1-Ax1 és a Glu1-Dx5 gének pozitív
hatását. A tészta erısség javulását a dagasztási idıszükséglet (DDT) és az úgynevezett
maximális dagasztási ellenállás (PR) növekedése jelezte. A legelsı in vitro módszert, az
úgynevezett rekonstrukciós vizsgálatot, amikor a liszt különbözı mérető tartalékfehérje
frakcióit izolálják, majd visszaadagolják a lisztbe a dagasztási kísérletek során, elıször
McRitchie (1987) alkalmazta. A módszert továbbfejlesztve szisztematikus adagolással (csak a
vizsgált paraméter változik, a többi állandó) a fehérjetartalom, valamint a tartalékfehérje
molekulák méretének és méreteloszlásának egymástól független hatását Uthayakumaran és
mtsai. (1999) tanulmányozták. Megállapították, hogy a fehérjetartalom emelése állandó
glutenin/gliadin fehérje arány (polimer/monomer arány, ami a molekulatömeg méreteloszlás
ill. fehérje méret jellemzıje is) fenntartása mellett bizonyos dagasztási paraméterek
növekedését eredményezi: dagasztási idıszükséglet, maximális dagasztási ellenállás,
nyújthatóság és cipótérfogat. Állandó fehérjetartalom mellett a glutenin/gliadin arány
növelése a dagasztási idıszükségletet, a maximális ellenállást és a cipótérfogatot növelte, de a
tészta nyújthatósága és az ellágyulás mértéke csökkent (Uthayakumaran és mtsai., 1999).
Azonos glutenin/gliadin arány esetében (változatlan fehérjetartalom mellett) a polimer frakció
HMW/LMW-GS aránya határozhatja meg szignifikánsan a tészta erısséget és nyújthatóságot
(Gupta és mtsai., 1989, 1995). Az alacsonyabb HMW/LMW alegységfehérje aránnyal
rendelkezı fajtákat vizsgálva már Lawrence és Shepherd (1980) is kisebb tésztaerısséget és
nagyobb nyújthatóságot figyelt meg. A fehérjealegység arány módosítása a tésztában az x- és
y-típusú HMW glutenin alegységek arányának szisztematikus változtatásával is lehetséges
(Butow és mtsai., 2003a), miközben fenntartható az azonos értékő fehérjetartalom,
glutenin/gliadin illetve HMW/LMW alegység arány. Az egyedi polipeptidek relatív aránya
szintén meghatározhatja a minıségi jellemzıket.
Az addíciós és inkorporációs elvő in vitro kísérletek, valamint az elmúlt néhány évben a
funkcionális tulajdonságok vizsgálatára kialakított új technikák lehetıvé tették kis
12
mennyiségő (5-10 mg) búza tartalékfehérje hatásának a vizsgálatát. Az egyes
fehérjék/polipeptidek izolálása búzalisztbıl idıigényes, nehézkes és sokszor nem valósítható
meg. Erre lehet megoldás a fehérjék búzafehérje-mentes rendszerben történı termeltetése (pl.
heterogén expresszió az E. coli-ban), mely megkönnyíti a fehérje tisztítást és izolálást (Tamás
és mtsai., 1998; Tamás és Shewry, 2006).
Az addíciós kísérletekkel bizonyították, többek között, a gliadin fehérjék abszolút
mennyisége és a glutenin/gliadin arány változtatásának pozitív hatását a tészta
nyújthatóságára (Wieser és mtsai., 1994; Schropp és Wieser, 1996, Uthayakumaran és mtsai.,
2001). Az egy gliadin fehérjének tulajdonított hatásban valószínőleg a többi gliadin vagy
LMW glutenin fehérjének is szerepe van. Ez magyarázhatja, hogy a gliadin fehérjék
arányának növelésével megemelkedett cipótérfogatot is tapasztaltak (Weegels és mtsai.,
1994), holott a liszthez adagolt gliadin fehérjék általában gyengébb és kevésbé stabil tésztát
eredményeznek (Fido és mtsai., 1997; Uthayakumaran és mtsai., 1999). Ezek a dagasztási idı
és a maximális rezisztencia csökkenésében illetve az ellágyulás mértéke és a nyújthatóság
növekedésében nyilvánultak meg. Uthayakumaran és mtsai. (2001) az egyes gliadin fehérje
molekulák nyújthatóságra gyakorolt hatását nem a molekulamérettel, hanem növekvı
hidrofóbicitásukkal (ω-, α/β- és γ-gliadin fehérjék) találták összefüggınek. Számos kutatás
bizonyítja, hogy az LMW glutenin alegységek is szignifikánsan összefüggésbe hozhatók a
kenyér és a durum búzalisztbıl készült tészta minıségével, elsısorban a stabilitásával és
nyújthatóságával (Gupta és mtsai., 1989, 1994; Ruiz és Carrillo, 1993; Sissons és mtsai.,
1998; Lee és mtsai., 1999a).
A tartalékfehérjék polimer hálózatba történı beépítése, a tésztára alkalmazott megfelelıen
beállított redukciós-oxidációs módszer (kémiai inkorporációs technika, Békés és mtsai.,
1994b) lehetıvé teszi, hogy a különbözı allél-variációk hatását kísérletekben is
tanulmányozzuk anélkül, hogy egyéb genetikai különbségek befolyásolnák azt. Az egyéni
HMW glutenin fehérjealegységek (pl. az 1Bx7 HMW-GS) inkorporációja jobb dagasztási
tulajdonságokkal rendelkezı erısebb tésztát eredményezett (nagyobb dagasztási idı és nagy
dagasztási ellenállás). Békés és mtsai. (1995) igazolták, hogy a Dx5, és/vagy Dy10
alegységfehérjék inkorporációja egy null–Glu-D1 típusú mutáns növény lisztjébe nagyobb
mértékben növelte a tészta erısségét, mint az azonos mennyiségő Dx2, és/vagy Dy12
fehérjék. A 2, 12, 5 és 10 HMW glutenin alegységfehérjék külön-külön történı
inkorporációjának hatása kisebb volt, mint az alegység párok esetében (2+12 vagy 5+10)
(Békés és mtsai., 1995). Inkorporációs vizsgálatokkal bizonyították az egyes HMW glutenin
alegységfehérjék nem csak minıségének, de mennyiségének funkcionális tulajdonságokra
13
gyakorolt fontosságát is (Schropp és mtsai., 1995; Schropp és Weiser, 1996; Sapirstein és Fu,
1996). Az inkorporációval beépített polipeptidek mérete is fontos paraméter. A nagyobb
mérető glutenin alegységfehérje nagyobb tészta kialakulási idıt eredményez (Veraverbeke és
mtsai., 1998; Tamás és mtsai., 2002). Nı a dagasztási idı értéke LMW-GS beépítésének
hatására is, bár a hatás kevésbe jelentıs, mint a HMW glutenin alegységfehérjék esetében
(Lee és mtsai., 1999a). Ha az LMW glutenin alegységfehérjéket egy, kettı vagy mindhárom
Glu-3-ban hiányos búzafajtákba inkorporálják, nı a tészta erısség, bár kisebb mértékben,
mint HMW alegységfehérjék hatására (Gupta és mtsai., 1995).
A búza sütıipari tulajdonságait in vivo olyan fajták létrehozásával javíthatjuk, melyek a
HMW-GS fehérjéket új kombinációban tartalmazzák, vagy az egyes gének nagyobb
kópiaszámban történı beépítésével növelhetjük a jó minıséghez kapcsolódó fehérjék
mennyiségét. A genetikai transzformáció lehetıvé teszi az élelmiszerek termelésében vagy
az ipari folyamatokban nem kedvezı fehérjék géncsendesítés általi kiütését (Maruta és mtsai.,
2001), de más fajtákból származó vagy mesterségesen szintetizált új gének is bejuttathatók a
búzába. Több munkacsoport sikeresen transzformált búzát HMW-GS alegységekkel (Altpeter
és mtsai., 1996a; Blechl és Anderson, 1996; Barro és mtsai., 1997; Alvarez és mtsai., 2000).
Barro és mtsai. (2003) az 1Dx5 és 1Ax1 HMW-GS fehérjék funkcionális tulajdonságokra
gyakorolt hatását vizsgálták transzgénikus búzában. Az 1Ax1 alegység transzgénikus
expresszáltatása szignifikánsan javította a sikér és a tészta sütıipari minıségét. Az 1Dx5
alegységfehérjét kódoló gén kópiaszámának és az expresszálódott fehérje mennyiségének
növelése a transzgénikus búzában olyan erıs tésztát adott, hogy annak dagasztása
hagyományos módon nem volt lehetséges (Barro és mtsai., 1997). A HMW 1Ax1 és az 1Dx5
alegység génekkel transzformált durum búza 2 g Mixográfos dagasztási vizsgálatai szerint az
alegységek expressziója erısebb és stabilabb tésztát eredményezett, bizonyítva, hogy a
transzformálás alkalmas a durum búza lisztjébıl készült tészta tulajdonságainak módosítására
(He és mtsai., 1999). León és mtsai. (2009) kereskedelmi forgalomban lévı búzafajtába
épített 1Ax1, 1Dx5 és 1Dy10 HMW-GS fehérje gének hatását vizsgálták a transzgénikus
búzalisztbıl készült tészta dagasztási- és funkcionális tulajdonságaira.
Számos kutatás bizonyítja, hogy LMW glutenin alegységfehérjék termeltetése transzgénikus
kenyér és a durum búzában is összefüggésbe hozhatók a kenyér és a durum búzalisztbıl
készült tészta minıségének változásával, elsısorban a stabilitásában és nyújthatóságában
(Masci és mtsai., 2003; Tosi és mtsai., 2004, 2005). Megállapították, hogy a jelölt LMW-GS
fehérjék beépülnek a sikérmátrixba, de kevésbé drasztikusan növelik a fehérje térháló méretét,
mint a HMW-GS alegység fehérjék beépítése (He és mtsai., 1999; Popineau és mtsai., 2001;
14
Vasil és mtsai., 2001). Emiatt hatásuk kevésbé erıteljes a tészta egyes dagasztási
paramétereire, s így lehetıvé teszi azok finomszabályozását.
2.1.4. Tészta- és lisztminısítésre alkalmas módszerek
A kenyérsütésre alkalmas lisztet a sikérmennyiség és –minıség, valamint a végtermék
minıségének vizsgálatával jellemezhetjük. A sikér minıségét közvetlen (reológiai
tulajdonságok mérése) és közvetett módszerekkel jellemezzük. A közvetett módszerek közül a
tészta-labdapróba (AACC Method 56-50) és a Zeleny szedimentációs teszt (AACC Method
56-61A) a legelterjedtebbek. A szedimentációs teszt a liszt poliszacharidjainak és fehérjéinek
duzzadási tulajdonságaival kapcsolatba hozható információt ad, amely többek között hatással
lehet a vizsgált genotípus lisztjébıl készült tészta erısségére és a várható kenyértérfogatra
(Halverson és Zeleny, 1988).
A reológiai sajátságok mérése a lisztbıl víz hozzáadásával készült tészta dagasztási
paramétereinek meghatározásával történik. A laboratóriumi dagasztók (mixerek) a dagasztás
során fellépı, a tészta kialakulása közben folyamatosan változó ellenállást regisztrálják.
Világviszonylatban kétféle mérési módszer van használatban, melyek alapvetıen a dagasztás
által közvetített energia mennyiségében, vagyis a dagasztás intenzitásában, illetve a dagasztó-
lapát kialításában különböznek egymástól. Az eredetileg magyar szabadalomként kidolgozott
z-karú laboratóriumi dagasztók (Farinográf és Valorigráf) mellett az álló és mozgó tőkkel
operáló Mixográf a két általánosan használt típus. A Farinográf és a Valorigráf két ellentétes
irányban és eltérı sebességgel forgó z-karból és a hozzátartozó csészébıl álló dagasztó
berendezések. A kirajzolt görbe (valorigram) tájékoztat a reológiai tulajdonságokban
bekövetkezett változásokról (F1 ábra).
2.1.4.1 A mikro-módszerek
A fajták nemesítési folyamatainak kezdeti szakasza, a genetikai módosítás lehetıségeinek
tanulmányozása, illetve a változások molekuláris szinten történı magyarázatához szükséges
vizsgálatok olyan kutatási területek, ahol a minta korlátozott mennyiségben áll rendelkezésre.
A hagyományos mőszerek analógiájára készült, ún. mikro-készülékek, valamint mikro-
módszerek alkalmazása lehetıvé teszik, hogy néhány grammnyi liszt minıségi paramétereit,
illetve a paramétereknek néhány mg tisztított fehérjekomponens adagolása hatására
bekövetkezett változásait követni tudjuk (Békés és mtsai., 2003).
A mőszerek méretcsökkentés fejlesztésének eredménye volt a 10g-Farinográf, a 2g-Mixográf,
a mikro-Extenzográf, a mikro-Valorigráf, a mikro malom és a mikro-sütési eljárások, melyek
15
segítségével korábban nehézségekbe ütközı kísérletek is elvégezhetık (Békés és mtsai., 2000;
Gras és mtsai., 2000; Haraszi és mtsai., 2004). A mikro-Valorigráffal (mikro z-arm mixer)
elért eredmények hasonlóak a hagyományos készülék eredményeihez (Tömösközi és mtsai.,
2000). A készülékkel felvett görbe (alapgörbe, 4.2 ábra) karakterisztikája megegyezik a
hagyományos valorigraméval.
2.2 Az amarantusz jellemzése
2.2.1 Az amarantusz tartalékfehérjék csoportosítása és frakcionálásuk
Az amarantusz (Amaranthus), amit amarant és amaránt néven is ismernek Magyarországon, a
disznóparéjfélék, Amaranthaceae családjába tartozik, s nincs közeli rokonságban a főfélékkel
(Gramineae). Ennek ellenére apró-szemcsés, pelyvás toktermése miatt gyakran pszeudo
cereáliának nevezik, és az egyéb gabonafélék közé sorolják. Tavaszi vetéső, gyors
növekedéső, nagy terméshozamú kétszikő növény ıshazája Peru és Mexikó. Már az inkák is
fogyasztották a mai növények ısét, erıt adó és az egészségre jótékony hatása miatt. Ma
három nemesített amarantusz fajt termelnek Északnyugat-, Közép- és Dél-Amerikában. Ezek
az Amaranthus (A.) caudatus, A. curentus és az A. hypochondriacus. Az A. hypochondriacus
(Piros disznóparéj vagy Hercegtoll) (2.1 ábra), fıleg Peru északnyugati és középsı régiójában
terjedt el, de az utóbbi évtizedekben komoly érdeklıdést mutatnak iránta Európában és
Ázsiában is.
2.1 ábra Az Amaranthus hypochondriacus növény (Piros disznóparéj vagy Hercegtoll) és pelyvás toktermése
Az amarantusz fajok fehérjetartalma (13-19% száraz magra vonatkoztatva) a gabonákéhoz
viszonyítva magas. Legalacsonyabb fehérjetartalmú az A. curentus (13,2-18,2%), míg az A.
caudatus 17,6-18,4% és az A. hypochondriacus 17,9% fehérjét tartalmaz. Kiegyensúlyozott
aminosav tartamú tartalékfehérjéik miatt potenciális fehérjeforrások lehetnek a fejlıdı
16
országok számára (Barba de la Rosa és mtsai., 1992; Marcone, 1999; Romero-Zepeda és
Paredes-López, 1996; Segura-Nieto és mtsai., 1994, 1999). Több szerzı a XXI. század
élelmiszer gabonájaként emlegeti (Lehman, 1996; Chaturvedi és mtsai., 1997; Guzmán-
Maldonadó és Paredes-López, 1998).
Tartalékfehérjéik ellentétben a búza tartalékfehérjéivel nem prolamin, hanem fıleg albumin
és globulin, valamint glutelin típusúak. Mindössze 0,9-2% prolamin fehérjét tartalmaznak
(Barba de la Rosa és mtsai., 1992). Fehérje összetételük vizsgálatakor többnyire hexánnal
zsírtalanított, zúzott magokból, alapvetıen kétféleképpen nyerik ki az albumin és globulin
fehérjéket. Az egyik eljárás elıbb vízzel az albumin, majd sóoldattal a globulin fehérjéket
oldja ki (Bressani és Garcia-Vela, 1990; Segura-Nieto és mtsai., 1992). A másik megoldás
szerint a két frakciót együtt extrahálják sóoldattal. Az oldatot ezután alacsony ionerısségő
oldattal vagy vízzel szemben dializálva a globulinok kicsapódnak, míg az albuminok oldatban
maradnak (Barba de la Rosa és mtsai., 1992; Soriano-Santos és mtsai., 1992). E két
frakcionálási módnak köszönhetıen egyes szerzık az Osborne féle albumin frakciót is
globulinnak hívják (pl. Segura-Nieto és mtsai., 1992 és 1994; Marcone, 1999; Shewry és
mtsai., 1999). A 2S globulin (régi nevén albumin) fehérje frakció a kétszikőekre jellemzı,
melyek fehérjéi legtöbbször heterodimer formában vannak jelen. A két polipeptidet diszulfid
híd(ak) köti(k) össze (Shewry és mtsai., 1999). A különbözı extrahálási eljárások majdnem
mindegyike szerint az albuminok és globulinok együttesen az amarantusz magok
fehérjetartalmának legnagyobb részét adják (39,5-82,0%) mindhárom amarantusz fajban. A
magfehérjék kevesebb, mint 20%-át a globulinok, a legnagyobb mennyiségét (20-65%) az
albuminok teszik ki (Segura-Nieto és mtsai., összefoglalója, 1999).
A magfehérjék többsége tartalékfehérje szerepet tölt be, azaz C-, N- és S- forrás a csírázó
növény számára (Fukiyama, 1991). Éppen ezért meglepı, hogy az amarantusz fajok
legnagyobb mennyiségben jelenlévı fehérjéi albumin típusúak, hiszen e fehérjék általában
biológiailag aktív fehérjék más növényekben (Higgins, 1984). Ennek egyik magyarázata
lehet, hogy néhány biológiailag aktív amarant albumin fehérje tartalékfehérje szerepet is
betölt hasonlóan a búza 2S albuminjaihoz (McRitchie és Gupta, 1993). Az amarant albumin
frakció polipeptidjei méretükben nagyon heterogének, legnagyobb mennyiségben a kismérető
komponensek vannak jelen. A fı tömeget az 1,4S-2S szedimentációs állandójú fehérjék adják
(4-9 kDa), de találtak 4,6S értékő fehérjéket is (Shewry és mtsai., 1999).
17
2.2.1.1 Az Amaranthus hypochondriacus tartalékfehérjéinek jellemzése
Segura-Nieto és mtsai. (1992, 1994) az A. hypochondriacus teljes kiırléső lisztjébıl az
albumin és globulin fehérjéket híg só oldattal extrahálták és kétdimenziós elektroforézis
módszerrel (SDS-PAGE) vizsgálták. A polipeptidek mind méretben, mind izoelektromos
pontjuk értékében nagyon eltérıek voltak, hasonlóan a pillangósok 7S és 11S globulinjaihoz.
Az elektroforetikus képet nem befolyásolta, hogy a mintákat zsírtalanították-e vagy sem. Az
elvégzett szedimentációs vizsgálatok alapján az A. hypochondriacus globulinjait három
frakcióra bontották: az 1,2-2S, a 8-10S és a 12,7-13S szedimentációs állandójú
globulinokra. A fı tömeget adó, alacsony szedimentációs értékő (1,2-2S) frakció az Osborne-
féle albumin frakció, mely megfelelhet a búza, a rozs és a borsó hasonló szedimentációs
értékő 2-3S albuminjainak (McRitchie és Gupta, 1993). Ezek a fehérjék glikozilációjukban és
antigén hatásukban hasonlóak a vicilinekhez (7-8S frakció) (Segura-Nieto és mtsai., 1999).
Még ma is tudományos bizonyításra vár, hogy ezek vajon valódi, kész fehérjék vagy csak
degradációs termékek. A három különbözı szedimentációs állandójú frakció (1,2-2S, 8-10S
és 12,7-13S) SDS-PAGE elemzésének eredményei alapján Segura-Nieto és mtsai. (1992 és
1994) a polipeptideket 5 csoportba sorolták. Az elsı csoporthoz az 50-75kDa tömegő, 7S-
típusú globulinok tartoznak, melyek létezését Marcone (1999) megerısítette. A másodikba és
a harmadikba a 11S-típusú globulinok savas (30-37,5 kDa) és bázikus (18-27,5 kDa)
alegységeit sorolták. A negyedik és az ötödik csoport az alacsony molekulatömegő
polipeptidek csoportjai (14-17 és 18-30 kDa). Ezek az ún. 1,4-1,9S és a 4,6S szedimentációs
állandójú frakciók, melyek megfelelnek a korábban néhány gabonafélében, ill. a borsóban és a
szójában 2-3S értékkel jellemzett frakcióknak (Shewry és mtsai., 1999). További vizsgálatok
szükségesek annak megállapítására, hogy a különbözı polipeptidek vajon mely gén termékei,
és melyik polipeptid ment keresztül poszt-transzlációs módosításon (proteolitikus érési
folyamat, glikoziláció) és melyik degradálódott.
Vasco-Méndez és Paredes-López (1995) az A. hypochondriacus (Mercado fajta) ırölt magjait
zsírtalanítás után az Osborne féle négy frakcióra választották szét a Barba de la Rosa és
mtsai. (1992) által módosított eljárás szerint. Az egyes frakciók fehérjetartalmát mikro-
Kjeldahl módszerrel mérték (5,85 fehérjefaktor). Legkisebb a mennyisége (7,2%) a prolamin
fehérjéknek, míg az albumin, globulin és glutelin fehérjék mennyisége nagyon közel esik
egymáshoz (28,2%, 21,9% és 29,2%). Az egyes frakciókat β-merkaptoetanollal (2-ME)
redukálva gélelektroforézis módszerrel vizsgálták. Eredményeik megerısítették korábbi
megfigyelésüket, mely szerint az amarantusz néhány glutelin alegység fehérjéje hasonlít sok
kétszikő és egyszikő növény (rizs és zab) globulin fehérjéihez. A globulin és glutelin fehérjék
18
további savas frakcionálása után immunológiai vizsgálatokkal is igazolták, hogy határozott
szerkezeti hasonlóság mutatkozik a két frakció fehérjéi között, valamint mindkét frakció
legumin-típusú fehérjéket tartalmaz. Utóbbit azzal magyarázták, hogy határozott
immunológiai affinitást mutattak a rizs (savas glutelin alegység) és a zab (globulin)
poliklonális antitestjeivel szemben. Kétdimenziós gélelektroforézissel azt is kimutatták, hogy
a 32 kDa glutelin sáv hat savas, különbözı izoelektromos ponttal jellemezhetı (pI 5,7-6,3)
fehérje alegység keveréke. Közülük négy keresztreakciót adott az amarantusz savas globulin
al-frakcióit kimutató antitestjével.
Romero-Zepeda és Paredes-López (1996) az A. hypochondriacus (Mercado fajta) zúzott
magjaiból nem csak a teljes globulinfrakciót nyerték ki, hanem annak egy részébıl szelektív
kicsapással izolálták az amarantint is. Az amarantin az A. hypochondriacus 11S
szedimentációs állandójú tartalékfehérjéje. Vizsgálataikban gélelektroforézis, gél filtrációs
kromatográfia és ultracentrifugás módszerek segítségével megállapították, hogy a kinyert
amarantin nagy tisztaságú. A globulin frakció a teljes fehérje 20,5%-át, míg az izolált
amarantin a 18,6%-át adta, így a globulinokat fıként az amarantin alkotja. Munkáikban
egyértelmő bizonyítást nyert az is, hogy az amarantin 389 kDa molekulatömegő és az erısen
konzervatív 11S-típusú globulin fehérjék szupercsaládjába tartozik, mely fehérjék
asszociációra és disszociációra hajlamos, cisztein aminosavakat tartalmazó alegységek
aggregátumai. Az aggregátumok létezését Segura-Nieto és mtsai. (1999) is megerısítették.
Chen és Paredes-López (1997) az A. hypochondriacus másik fajtájából (waxy fajta) két
különbözı ionerısségő extraháló szerrel az amarantin két heterogén formáját izolálták
(330 kDa és 400 kDa). SDS-PAGE analízissel kimutatták, hogy redukció elıtt a legfıbb sáv
az 50-52 kDa volt, míg redukció után két új sáv jelent meg (32-34 kDa és 22-24 kDa). Ez
tipikus jellemzıje a 11S globulinoknak, melyek egyetlen prekurzor molekulaként
szintetizálódnak, majd késıbb proteázok hasítják a 27-37 kDa savas alegységgé és a 20-24
kDa bázikus polipeptiddé, melyeket diszulfid híd (hidak) köt(nek) össze. A redukált
frakcióban is megjelenı 50-52 kDa molekulatömegő amarantin egy poszttranszlációs érési
folyamat alól ’megmenekült’ fehérje lehet (Barba de la Rosa és mtsai., 1996).
Egy 59,4 kDa rekombináns amarantin fehérjét Osuna-Castro és mtsai. (2000) E. coli
heterológ fehérjeszintetizáló rendszerben expresszáltattak. A munkájukhoz használt cDNS-t
Barba de la Rosa és mtsai. (1996) klónozták és jellemezték. A nagy mennyiségben
termeltetett fehérjét kromatográfiás módszerekkel tisztították, majd megállapították, hogy
elektromos-, felületi-, immunológiai-, biológiai- és funkcionális tulajdonságai hasonlóak a
natív fehérje tulajdonságaihoz. In vitro refolding vizsgálatokban igazolták a molekula helyes
19
konformációját is. További kísérletek szükségesek azonban ahhoz, hogy szisztematikusan
megváltoztatott szerkezető fehérjéket helyes másodlagos és harmadlagos szerkezettel képesek
legyenek heterológ rendszerben nagy mennyiségben elıállítani. Az így szerzett tudás
közelebb vihet a jó táplálkozástani értékő fehérjék transzgénikus növényekben való korrekt
termeltetéséhez. Az amarantin fehérje génjét rizs glutelin-1 promótere segítségével sikeresen
expresszáltatták transzgénikus kukoricában, ami fehérjetartalom növekedést (6-32%),
valamint esszenciális aminosav tartalom (lizin 18% és triptofán 22%) növekedést
eredményezett (Rascón-Cruz és mtsai., 2004) (lásd még 2.3.2.1/lizin fejezet).
Martínez és mtsai. (1997) az A. hypochondriacus kereskedelmi forgalomban lévı fajtájából
vízzel az albumin 1 frakciót, a maradékból foszfát-pufferrel pedig a globulin frakciót
extrahálták Konishi és mtsai. (1991) szerint. Az ırlemény maradékát tovább extrahálva
vízzel, majd abból a savas kicsapással nyert csapadékot vízben feloldva kapták az albumin 2
frakciót, míg híg vizes β-merkapto-etanolban oldva az albumin 2M frakciót. A frakciókat
elemezve megállapították, hogy az albumin 2 frakció egy erısen polimerizálódott polipeptid
komplex. Molekulatömege 300±10 kDa és diszulfid hidak stabilizálják. Fıként 52, 54 és 56
kDa alegységekbıl áll. Az 52 és 56 kDa alegységek két részre bonthatók (31-38 és 19-23
kDa), melyeket diszulfid hidak kötnek össze. Az 54 kDa alegység diszulfid hidakkal
összekapcsolt aggregátumot alkot a két kisebb résszel (31-38 és 19-23 kDa). A jellemzés
szerint úgy tőnik, hogy az albumin 2 szerkezetét tekintve olyan, mint a 11S globulinok vagy
más néven amarantin fehérje, csak tartalmaz egy extra 54 kDa polipeptidet, s hajlamosabb a
polimerizációra. Mivel ezt a polipeptidet csak a nagy molekulatömegő aggregátumban találták
meg, valószínősíthetı, hogy polimerizáció indukáló szerepe van az aggregátum képzésben. Ez
megerısíti Vasco-Méndez és Paredes-López (1995) eredményeit, miszerint nagyfokú
homológia van az amarantusz globulin és glutelin fehérjéi között és az amarantusz
tartalékfehérjék fıként globulin típusúak. A fehérjék a magon belül különbözı
aggregátumokban, különbözı konformációban vannak jelen, mely magyarázatot ad eltérı
oldhatóságukra és eltérı extrahálhatóságukra. Ezek alapján a szerzık a globulin fehérjéket
három csoportra osztották. Az elsı csoportba a 7S és a 11S globulinokat sorolják, míg további
két globulin csoportot alkotnak az erısen polimerizálódott globulin fehérjék (albumin 2) és az
amarant glutelin fehérjék. Mindez jó korrelációban van Fukuyima (1991) tartalékfehérje
csoportosítási módszerével, mely a fehérjéket kódoló gének szerkezetének hasonlóságán
alapul. További szekvencia elemzések és genetikai eredetvizsgálatok szükségesek azonban,
hogy egyértelmően jóváhagyható legyen az amarantusz tartalékfehérjék ilyen besorolása.
20
Az amarant tartalékfehérjéi asszociációra és disszociációra hajlamos, cisztein aminosavakat
tartalmazó alegységek aggregátumai, amiket nem csupán kémiai kötés (diszulfid hidak),
hanem gyenge, másodlagos kötıerık tartanak össze. Ezt az asszociációs/disszociációs
képességet különbözı savas és bázikus pH értékeken turbiditást mérı módszerekkel
vizsgálták (Segura-Nieto és mtsai., 1999). A pH változásának hatására megváltozott az egyes
fehérje alegységek felületi töltéseloszlása, izoelektromos pontja és hidrofóbicitása. Ez sokszor
az oligomerek disszociációját eredményezte monomerekre, azaz változás következett be a
harmadlagos szerkezetben is. Ennek következtében elképzelhetı, hogy a molekulák illetve
molekula aggregátumok/asszociátumok alakja nem mindig gömb, s ez meghamisítja a
gélfiltrációs molekulatömeg meghatározás eredményét. Valószínőleg ennek tulajdonítható,
hogy egymással nem korreláló molekulatömeg- és szedimentációs állandó értékeket kaptak az
egyes fehérjefrakciókra különbözı extraháló szerek használatakor például Martínez és mtsai.
(1997) is. A felületi töltésbeli különbségek miatti elektroforetikus mintázat megváltozását a
szója 7S globulinjainál is megfigyelték (Gorinstein és mtsai., 1999).
Az A. hypochondriacus 35 kDa molekulatömegő, albumin típusú fehérjével (AmA1)
kapcsolatos eddigi ismereteket a 2.2.3. fejezetben ismertetjük.
2.2.2 Az amarantusz tartalékfehérjék aminosav összetétele
Az amarantusz növények magvai nem csupán jóval magasabb fehérjetartalmúak de
gazdagabbak esszenciális aminosavakban is. Az albumin és globulin fehérjék könnyen
emészthetı, nagy táplálkozástani értéket képviselnek, ugyanúgy, mint a maximum 20%-ot
kitevı híg lúgos oldatban oldódó glutelin fehérjék (Paredes-López és mtsai 1988). A
mindössze néhány százaléknyi prolamin frakció fehérjei esszenciális aminosavakban
szegények. Noha a magfehérje frakciók aminosav összetétele nagymértékben függ a globulin
frakció extrahálási körülményeitıl, minden vizsgálati módszer eredménye jelentıs mértékő
eltérést mutat a búza tartalékfehérjéinek aminosav összetételétıl. Az A. hypochondriacus
magfehérjéi pl. több szerzı által bizonyítottan esszenciális aminosavakban gazdagok (Segura-
Nieto és mtsai., összefoglalója 1999). A zúzott magok lizin tartalma 3,7-7,6%, mely jóval
magasabb, mint ami gabonafélék szemtermésében található (pl. zab 2,8%, búza 2,8%) (Shoup
és mtsai., 1966). A kéntartalmú aminosavak mennyisége is nagyobb (3,1-7,1%), mint a
pillangósok magfehérjéié (1,3-2,8%) és a búzaszemé (1,2-2,3%). Arginin tartalmuk 9,2-
12,3%, mely általában a pillangósokra jellemzı (borsó 12,3%), míg a búzaliszté csak 2,9-
4,7% (Shoup és mtsai., 1966). A gabonákéhoz hasonló magas aszparaginsav/aszparagin és
glutaminsav/glutamin tartalom az amarant magfehérjék tartalékfehérje jellegét bizonyítja.
21
Argininben, lizinben és kén tartalmú aminosavakban gazdag fehérjéi miatt az amarantusz
növények magvai ígéretes forrásai nagy táplálkozástani értékő fehérje géneknek, melyek
felhasználhatók a géntechnológia úton történı nemesítésben.
2.2.3 Az AmA1 jelő fehérje jellemzése
Az A. hypochondriacus egyik albumin típusú tartalékfehérjéjének cDNS-ét Raina és Datta
(1992) klónozták. Az ama1 gén az AmA1 jelő, 35 kDa molekulatömegő fehérjét kódolja. A
polipeptid aminosav szekvenciáját (Függelék II. ábra) és az egyes aminosavak
molekulatömegét figyelembe véve, az AmA1 fehérje a WHO által is fontosnak tartott
esszenciális aminosavak közül 7,7% lizint, 7,0% tirozint és 5,4% treonint tartalmaz (2.2.1
táblázat), s ezért nagy táplálkozástani értéket képvisel. Mindemellett nagyon fontos
hangsúlyozni, hogy ez az albumin típusú fehérje, ellentétben a Brazil dió 2S albuminjával,
allergenitásra utaló aminosav szekvenciákat nem tartalmaz. A fehérje nem allergén voltát
egyértelmően bizonyítják a Chakraborty és mtsai. (2000) által végzett nagyérzékenységő
allergia teszt negatív eredményei, valamint az a tény, hogy az amarantuszok lisztjébıl
Mexikóban, Közép- és Dél-Amerikában évszázadok óta készítenek kovásztalan kenyeret, de
használják ıket élelmiszerek adalékaiként is minden negatív tünet nélkül.
2.2.1 táblázat Esszenciális aminosavak mennyisége az A. hypochondriacus mag teljes fehérje frakciójában, az AmA1 fehérjében és a WHO ajánlás (Raina és Datta, 1992).
1Az AmA1 fehérje aminosav összetételét a szerzık a szekvencia adatokból kalkulálták az adott aminosav molekulatömegének figyelembe vételével.
aminosav mennyiség, % aminosav
teljes fehérje 1AmA1 fehérje WHO ajánlás Trp
Met/Cys Thr Ile Val Lys
Phe/Tyr Leu
1,4 4,4 2,9 3,0 3,6 5,0 6,4 4,7
3,6 3,9 5,4 6,1 5,2 7,7
6,7/7,0 9,2
1,0 3,5 4,0 4,0 5,0 5,5 6,0 7,0
Az AmA1 fehérje négy izomer formában van jelen a magban. Az egyik izomerhez készített
antitest a másik hárommal is keresztreakciót adott. A legnagyobb (1,2kb) klón cDNS-e
egyetlen fı ORF-et tartalmaz, mely egy 304 aminosavból álló polipeptidet kódol. A klónt
hibridszelekciós transzlációval és immun-precipitációval azonosították. Az immun-precipitált
termék mérete megegyezett az érett fehérje méretével. A fejlıdı mag RNS és fehérje
22
vizsgálata azt mutatta, hogy az Ama1 fehérje szintézise a korai embriógenezisben kezdıdik és
mennyisége a félig érett magban éri el a maximumot. A gén expressziója mag specifikus, a
fehérje vagy annak RNS-e más növényi szövetben nem mutatható ki. Az érett mag még egy
év után is tartalmaz AmA1 mRNS-t, ugyan kissé csökkent mennyiségben. Csírázáskor az
AmA1 fehérje mennyisége nem azonnal csökken le nullára, de harmadik napra, amikor a mag
teljesen szétesik, a fehérje is eltőnik. A késleltetett lebomlás azt sugallja, hogy a fehérje a
citoszolban van és proteolitikus enzim szerepét is betöltheti. Higgins és mtsai. (1987)
borsóban találtak egy albumin típusú tartalékfehérjét, mely raktározási szerepe mellett
proteolitikus enzim funkciót is ellát, és mint ilyen a sejt szétesésének utolsó fázisáig nem
juthat ki a citoszolba. Ez a lokalizáció azonban nem zárja ki a magspecifitást, hiszen az csak a
gén mőködését szabályozó promóter és enhanszer elemek szekvenciájától függ.
Az A. hypochondriacus nagy táplálkozástani értékő AmA1 fehérjéjének génjét már elınyösen
használták géntechnológia úton történı nemesítésben (Chakraborty és mtsai., 2000).
(Részletes ismertetését lásd a 2.3.2.1 fejezetben.)
2.3 A táplálkozástani minıség javításának lehetıségei
A fejlett országok lakosságának tápláléka a gabonák mellett hüvelyesek magjaiból, húsból,
zöldségekbıl és gyümölcsökbıl is áll, s ez a változatos táplálkozás biztosítja a megfelelı
ásványi anyag- és fehérjeszükségletet. A fejlıdı országok lakossága számára azonban sokszor
egyetlen gabonaféle, a rizs vagy a kukorica, jelenti a fı fehérje- és energia bevitelt. Különösen
az ırölt gabona magvak nem csupán egyes aminosavakban (pl. lizinben), de A-vitaminban,
folsavban, vasban, cinkben és szelénben is szegények (Christou és Twyman, 2004). Így a
világ népességének kb. egyharmada szenved a fejlıdésüket meghatározó vitaminok,
nyomelemek és fehérjék hiányától. Ezért a gabona magvak fehérjetartalma és annak aminosav
összetétele különösen fontos számukra. Hasonlóan odafigyelést igényel a fehérjetartalom
(mennyiség és minıség) beállítása az állatok takarmányának elkészítésekor is, különösen a
gyors növekedéső szárnyasoknál és sertéseknél. (Shewry, 2007).
A táplálkozástani érték javításának nagyon sok módja ismert és alkalmazott a világban (Zhu
és mtsai., 2007).
A hagyományos nemesítés és különösen ennek együttes alkalmazása a molekuláris nemesítési
módszerekkel (pl. mutagenézis vagy molekuláris markerezés) fontos lehetıség a
táplálkozástani minıség javítására. A jó tulajdonságért felelıs fajták megkeresése és elınyös
23
tulajdonságaik beépítése elit fajtákba azonban hosszadalmas és csak a szülık
tulajdonságainak kombinálásával valósítható meg. A kívánatos tulajdonság illetve tulajdonság
csoport megjelenítésére a gabonafélék szemtermésében ma az egyik lehetséges megközelítés
a transzgénikus módszert is alkalmazó nemesítés (Shewry és Jones, 2005).
2.3.1 Táplálkozástani minıség javítása hagyományos nemesítéssel
2.3.1.1 Szelekció magas fehérjetartalomra
A gabona magvak fehérjetartalma a termesztés körülményeitıl és a használt tápanyagoktól
függıen igen tág határok között változik. Száraz tömegre vonatkoztatva a rizs fehérjetartalma
5,8-7,7% (Champagne és mtsai., 2004), az árpáé 8-15% (Shewry, 1993), a kukoricáé 9-11%
(Zuber és Darrach, 1987).
Az elsı minıségjavítási lépéseket fajon belüli magas fehérjetartalmú fajták megkeresése
jelentette. A legelsı, évekig tartó szelekciós kísérletben Dudley és mtsai. (1974) több
kukoricafajta 70 generációját vizsgálva 4,4-26,6% fehérjetartalmú törzseket találtak. A
késıbbiekben a legtöbb kísérletet árpára és búzára végezték. Az árpa magfehérjéinek
genetikai hátterérıl Ullrich adott kiváló összefoglalót (2002).
Az USDA világra kiterjedı búzakollekciójában lévı 12600 búzatörzs fehérjetartalmát Vogel
és mtsai. (1978) 7-22% közöttinek találták. Vizsgálataik szerint a magas fehérjetartalomért
kb. egyharmad részben a genetikai háttér a felelıs. A két legmagasabb fehérjetartalmú, Atlas
66 és Nap Hal fajtát (17 és 18% teljes ırleményben) késıbb keresztezték egymással, de külön
is használták hagyományos nemesítésben jobb táplálkozástani minıség és agronómiai
tulajdonságok elérésére (Shewry, 2007). A késıbbiekben több búzafajtából izoláltak magas
fehérjetartalomért felelıs géneket, és alkalmazták a hagyományos nemesítésben (Olmos és
mtsai., 2003; Distelfeld és mtsai., 2004, 2006). A kísérletekben QTL és RFLP markerezési
módszereket használtak azonosítási célra. Uauy és mtsai. (2006) kimutatták, hogy a Gpc-B1
gén, ami egy transzkripciós faktort kódol, felgyorsítja az öregedést, és ezáltal nitrogént és
ásványokat (cink, vas) szállít a levélbıl a fejlıdı búzaszembe. Ez a gén kb. a genetikai
variációk 70%-ért felelıs. Fenti sikerek ellenére nagyon nehéz magas fehérjetartalomra
szelektálni, mert a valószínőleg többgénes befolyásoltság mellett erıs a környezeti hatás is. A
fı probléma azonban az, hogy növekvı fehérjetartalom mellett általában csökken a búza
terméshozama (Simmonds összefoglalója, 1995). Emiatt ez a módszer nem valószínő, hogy
sikeres lesz kereskedelmi forgalomban lévı búzák esetén.
24
2.3.1.2 Szelekció emelt esszenciális aminosav tartalomra
A gabonafélék esszenciális aminosav tartalma
A fehérjék táplálkozástani értékét az esszenciális aminosav összetételük határozza meg. Az
esszenciális aminosavak az emberi és állati szervezetben de novo nem szintetizálódnak, így a
táplálékkal kell bevinni azokat. Ha egy ilyen aminosav limitáló mennyiségben van jelen, a
többi sem szívódik fel és kiürül a szervezetbıl. Tíz szigorúan esszenciális aminosavat
ismerünk: lizin, izoleucin, leucin, fenilalanin, tirozin, treonin, triptofán, valin, hisztidin és
metionin. Sokszor a ciszteint is idesorolják, mert kizárólag csak metioninból szintetizálódik,
és azzal együtt biztosítja a szervezet kénigényét. A fenilalanin és a tirozin aromás karakterük
miatt fontosak. A növekedésben lévı gyermekek esszenciális aminosav igénye magasabb,
mint a felnıtteké. A gyorsabb növekedéső állatok tenyésztéséhez is több aminosav szükséges.
A különbözı gabonafélék esszenciális aminosav összetétele g aminosav/100g fehérje (%)
mértékegységgel kifejezve a 2.3.1 táblázatban látható.
2.3.1. táblázat A gabonafélék esszenciális aminosav összetétele (%) és a FAO ajánlás Búza árpa zab rozs rizs kukorica FAO ajánlás aminosav
szem Liszt szem dara szem dara liszt gyermek felnıtt His 2,3 2,2 2,3 2,2 2,2 2,4 2,7 2,6 1,6 Ile 3,7 3,6 3,7 3,9 3,5 3,8 3,6 4,6 1,3 Leu 6,8 6,7 7,0 7,4 6,2 8,2 12,5 9,3 1,9 Lys 2,8 2,2 3,5 4,2 3,4 3,7 2,7 6,6 1,6 Cys 2,3 2,5 2,3 1,6 1,9 1,6 1,6 Met 1,2 1,3 1,7 2,5 1,4 2,1 1,9
4,2 1,7
Phe 4,7 4,8 5,2 5,3 4,5 4,8 5,0 Tyr 1,7 1,5 2,9 3,1 1,9 2,5 3,8
7,2 1,9
Thr 2,9 2,6 3,6 3,3 3,3 3,4 3,7 4,3 0,9 Trp 1,1 1,1 1,9 - 1,1 1,3 0,6 1,7 0,5 Val 4,4 4,1 4,9 5,3 4,8 5,8 4,8 5,5 1,3
Forrás 1 1 2 3 4 4 4 5 5 1Az értékek Shoup és mtsai., által publikált adatok (1966) átlagai. A triptofán értékek Paul és Southgate (1978) méréseibıl származnak. 2Az értékek Newman és McGuire (1985) által publikált adatok átlagai. 3Az értékek Robbins és mtsai. (1971) által publikált adatok átlagai. 4Az értékek Paul és Southgate (1978) méréseibıl származnak. 5FAO/WHO/UNU (1985)
A limitáló aminosav minden gabonafélénél a lizin, mennyisége fajonként változik. Legtöbb a
zab- és a rizs darában található (4,2 és 3,7%), a legkevesebb a kukorica- és a búzalisztben (2,7
és 2,2%). A gabonafélék a többi aminosav tartalmukban is különböznek, de a kukorica
alacsony triptofán tartalma (0,6%) a legszembetőnıbb. A búza aminosav összetételét a teljes
szemre és az endospermiumból ırölt lisztre is megadják, hiszen ırléskor a magasabb
25
esszenciális aminosav tartalmú aleuron réteget és az embriót elveszítjük. A búzalisztben
különösen a lizin aminosav kevés (2,2%), míg a teljes szemre vonatkoztatva kis
mennyiségben jelenlévı aleuron réteg és az embrió lizin tartalma magas (4,8 és 8,3%) (Jensen
és Martens, 1983). A zab- és a rizsszemek endospermiumának legumin-típusú tartalékfehérje
frakciói több lizint tartalmaznak és így a teljes szemek is, mint a többi gabonaféle fıként
prolamin-típusú tartalékfehérjéi (Jensen és Martens, 1983). Mivel a gabonafélék prolamin
fehérjéire az alacsony esszenciális aminosav tartalom a jellemzı, a gabona magvak
táplálkozástani minısége a prolamin frakció arányának változtatásával módosítható (Shewry,
2007). Általánosan igaz, hogy a kisebb mérető gabonaszem (kisebb endospermium) magasabb
esszenciális aminosav tartalmú, de ez a liszt összetételét nem befolyásolja. Ha
nitrogéntartalmú mőtrágyázással növeljük a gabonaszem teljes N-tartalmát, az az
endospermium megnövekedett fehérjetartalmában, a prolamin típusú fehérjék mennyiségének
növekedésében fog megnyilvánulni. Emiatt a lizinben gazdag anatómiai részek aránya
csökken, s vele együtt a szem lizin tartalma és így táplálkozástani értéke is. Kirkman és mtsai.
(1982) árpánál, míg Mossé és Huet (1990) a legumin-típusú tartalékfehérjékkel rendelkezı
zabnál is igazolták ezt a feltevést. Így a gabonatermesztésben alkalmazott mőtrágyázás
mértéke egy kompromisszum eredménye a nagy terméshozam és a magas táplálkozástani
érték között (Shewry, 2007).
Szelekció emelt lizin tartalomra
A legelsı lizinben gazdag (69%-kal több lizin, mint átlagos szemben) természetes mutáns
gabonát, („opaque-2” kukorica) magas lisztkihozatalú törzsek elemzésekor találták meg
(Mertz és mtsai., 1964). Munck és mtsai. (1970) az árpaszemek festékmegkötı képességét
vizsgálták szelekciós munkájukban. Az emelt lizin tartalmú természetes mutáns kukoricát,
kölest és árpát, melyeket több ezer fajta közül válogattak ki, kémiai (etilin-imin, nátrium-azid,
etilmetán-szulfonát) és fizikai (gamma-sugárzás, gyors neutronok, forró neutronok)
mutagenézisnek vetették alá. Vizsgálataik szerint (Gibbon és Larkins, 2005) a mutációért
felelıs gének azonos módon fejtették ki hatásukat, azaz a magas lizin tartalom a lizinben
szegény prolamin frakció szintézisének visszaszorulásából, a lizinben gazdag fehérje frakciók
túltermelésébıl és a szabad lizin mennyiségének növekedésébıl adódott. Ez azonban negatív
hatással is járt. Mindhárom gabona mutáns utódai csökkent terméshozamúak voltak, sıt a
kukorica és kölesszemek puhábbak is lettek. A magas lizin tartalomért felelıs géneket
(opaque-2, hl, lys3a) még nem sikerült kereskedelmi forgalomban lévı kölesbe és árpába
hagyományos nemesítéssel bejuttatni (Oria és mtsai., 2000). Prasanna és mtsai. (2001) a
magas lizin tartalmú kukorica törzsek közül a normális endospermiummal rendelkezıket
26
választották ki. Megállapították, hogy ezek a törzsek a magas lizin tartalomért felelıs gén
(opaque-2) mellett a keményítı szintézisét szupresszáló, módosító (mo) gént is tartalmaznak,
s a normális endospermium textúrát ennek tulajdonították. Biokémiai vizsgálataik szerint
ebben a kukorica fajtában (Quality Protein Maize, Kiváló Fehérjeminıségő Kukorica) a 22
kDa molekulatömegő α-zein mennyisége lecsökkent, de megemelkedett a 27 kDa-os γ-zein
mennyisége. Ez a fehérje valószínőleg térhálót képez a keményítı granulátumok körül, s így
módosítja a keményítıben gazdag endospermium struktúráját (Dannenhoffer és mtsai., 1995).
A Kiváló Fehérjeminıségő Kukoricafajtát ma Latin Amerika, Afrika és Ázsia több
országában, valamint Ausztráliában emberi táplálékként és állati takarmányként is termesztik
(Prasanna és mtsai., 2001). Crow és Kermicle (2002) az USA-ban hasonló jó táplálkozástani
értékő opaque-2 kukorica fajtákat állítottak elı magas terméshozammal, de ezek kicsi
szemkeménységük miatt csak állati takarmánynak alkalmasak.
Szelekció emelt metionin tartalomra
A metionin bioszintézise aszparaginsavból indul ki, mint a lizin és treonin aminosavaké.
Utóbbiak a szintézis enzimeit negatív visszacsatolással szabályozzák (Galili, 1995), így a
kukoricaszemek lizin és treonin tartalmú táptalajon nem képesek csírázni. Phillips és mtsai.
(1981) a kor ismereteit meghaladva, 200 kukoricaszemet lizin és treonin tartalmú táptalajon
gyökereztettek. Az egyetlen túlélı növény magvai magas metionin tartalmúak, 30-70% δ-
zeint tartalmaztak. A fehérjében több mint, 20 mol% lizin volt, s felületéhez nagy mennyiségő
metionin aminosav kapcsolódott (Phillips és McClure, 1985). Hagyományos nemesítéssel
azonban e jó tulajdonságot nem tudták átvinni újabb fajtákba.
2.3.2 Táplálkozástani minıség javítása géntechnológiai módszerrel
Attól függıen, hogy szerves vagy szervetlen anyagban szeretnénk feldúsítani a növény
termését, más-más transzgénikus megközelítést szükséges választani. A szerves molekulákat
(aminosavak, zsírsavak és vitaminok) a növény képes szintetizálni, így azok anyagcsere
folyamatait kell befolyásolni. A szintézisút átalakításának három célja van: a növény által
termelt anyag szintézisének fokozása, a versengı molekula szintézisének visszaszorítása és új
anyag termeltetése (Capell és Christou, 2004).
Az ásványi anyagokat a növény a talajból veszi fel. A növénybe beépített tápanyag
mennyisége ezért a sók felvételére, szállítására és akkumulálására a növényben meglévı
biokémiai folyamatok szabályozásával (Zhu és mtsai., 2007), illetve a növényi tápanyag
hozzáférhetıségének javításával növelhetı (Shewry és Jones, 2005).
27
2.3.2.1 Esszenciális aminosavak mennyiségének növelése
Lizinben gazdag fehérjék mennyiségének növelése
A magas lizin tartalmú természetes mutáns árpa, a Hiproly, négy lizinben gazdag enzim
fehérjét tartalmaz. Ezek a β-amiláz, a szerpin proteináz inhibitor és két kimotripszin inhibitor
fehérje (CI-1 és CI-2). A CI-2 fehérjét molekuláris módszerekkel úgy alakították át, hogy a 83
aminosavból 14 lizint tartalmazzon négy helyett (Roesler és Rao, 1999, 2000), de a fehérjét
még nem expresszáltatták transzgénikus növényben. A kevésbé helyettesített formát (7 lizin),
O’Kennedy és mtsai. (2006) kölesbe transzformálták, de az eredményekrıl eddig még nem
számoltak be. Zhao és mtsai. (2003) az árpa 12 lizint tartalmazó hordotionin fehérjéjét
(HT12), kölesben expresszáltatták, s a magok teljes lizin tartalma 50%-kal nıtt meg. A
burgonya pollen lizinben gazdag fehérjéje génjét (40 lizin/240 aminosav, 16,7 mol%) Yu és
mtsai. (2004) kukoricába juttatták be, s ennek következtében a magfehérjék lizin mennyisége
50%-kal nıtt meg. Gondot okoz azonban, hogy e fehérje biológiai szerepérıl szinte semmit
nem tudunk. Wu és mtsai. (2003) transzgénikus rizsben a lizint szállító tRNS-t nagy
mennyiségben termeltették, aminek következtében a fehérjékben egyes aminosavak
(glutaminsav, glutamin és aszparagin) részben lizinre cserélıdtek. Ezzel a fehérjére nem
specifikus módszerrel a transzgénikus rizsszem lizin tartalma 0,9%-kal nıtt. A lizinben
gazdag kukoricamutánsok jellemzıje a kisebb terméshozam mellett a zein fehérje
mennyiségének csökkenése is. Ezt kihasználva két kutatócsoport is állított elı transzgénikus
kukoricát az α-zeinek (22 és 19 kDa) szintézisének szabályozásával, az ún. RNS interferencia
technika alkalmazásával (Segal és mtsai., 2003; Huang és mtsai., 2004). A kukoricaszemek
lizin tartalma 15-20%-kal emelkedett, de még így sem érték el a természetes mutánsokét (pl.
opaque-2). Az α-zein fehérjék (különösen a 22 kDa α-zein) expressziójának csökkentése
lehetıvé tette emelt lizin tartalmú kukorica elıállítását. Huang és mtsai. (2006) e módszerrel
transzgénikus kukoricában mindkét α-zein tartalékfehérje termelését csökkentették. Hatására
2,83%-ról 5,62%-ra emelkedett a kukorica szemtermésben a lizin, és 0,69%-ról 1,22%-ra a
triptofán aminosav tartalma.
Rascón-Cruz és mtsai. (2004) transzgénikus kukoricában magas fehérjetartalom növekedést
értek el (6-32%), amikor az A. hypochondriacus 11S globulin fehérjéjét (amarantin)
expresszáltatták rizs glutelin-1 promótere segítségével. A lizin aminosav mennyisége 18%-
kal, a triptofáné 22%-kal nıtt a vadtipusú kukoricáéhoz képest (0,34% és 0,09% teljes
ırleményben). A nagymértékő fehérje expressziót valószínőleg a transzgén magas kópia
száma (10 vagy több) és az alkalmazott szövetspecifikus promóter nagy hatékonysága
indokolja az adott célszövetben. Chakraborty és mtsai. (2000) egy másik amarantusz fehérje
28
(AmA1, albumin típusú tartalékfehérje) génjét expresszáltatták burgonyában. A keményítı
bioszintézisben résztvevı enzim (GBSS, granule-bound starch synthase) szövetspecifikus
promóterének használatával a transzgénikus növény gumójában a fehérjetartalom 35-45%-kal
nıtt. Ez a nagy változás talán azzal is magyarázható, hogy a kontroll növény gumóinak
fehérjetartalma rendkívül alacsony (1,15%). A módosítás több esszenciális aminosav
mennyiségének jelentıs növekedését eredményezte, a lizin mennyisége ötszörösére, a
cisztein, metionin és tirozin mennyisége hétszeresére nıtt a nem transzformált növényben
mért adatokhoz képest.
Metioninban gazdag fehérjék mennyiségének növelése
A legelsı metioninban gazdag kukoricát a 10kDa δ-zein tartalékfehérje túltermeltetésével
érték el (Kleese és mtsai, 1991). Noha a transzgénikus kukorica néhány szemtermése 30%-kal
több metionint tartalmazott, mint a vadtípus, a szerzık nem tudtak egyértelmő összefüggést
kimutatni a transzgén jelenléte, valamint a δ-zein akkumuláció és a metionin tartalom
növekedése között. Késıbb megállapították, hogy a túltermeltetendı fehérje szintézise poszt-
transzkripcionálisan szabályozott egy másik kromoszómán található fehérje faktor által. E
szabályozás eliminálásával sikerült a természetes mutánshoz hasonló kukoricát elıállítani,
mely állatkísérletekben ugyanolyan tömegnövekedést adott, mint amikor metionin aminosavat
adagoltak a takarmányhoz (Lai és Messing, 2002).
Metioninban gazdag napraforgó 2S albumin tartalékfehérje gén rizsbe transzformálásáról
Hagan és mtsai. (2003) számoltak be, míg szezámmag 2S albumin génnel Lee és mtsai.
(2005) állítottak elı transzgénikus rizst. Az elsı kísérletben a szemek metionin tartalma nıtt
ugyan, de a cisztein mennyisége 15%-kal csökkent. Így a kén mennyisége változatlan maradt
a magban, csak a kéneloszlás változott. Eszerint a metionin tartalom javítását célzó kísérletek
eredményét a magvak kénellátása korlátozza. A szezámmag albumin génjét oleosin és glutelin
promóterekkel irányítva sikerült transzformálással mind a rizsszemek korpájában, mind az
endospermiumban a kéntartalmú aminosavak mennyiségét 25-75%-kal növelni. A
kéntartalom részletes elemzésérıl, a kén eloszlásáról a rizsszemen belül és a táplálkozástani
érték változásáról nem áll rendelkezésre információ.
A 2S fehérjét expresszáló transzgénikus gabonafélék ugyan magasabb metionin aminosav
tartalmúak, de ezek a fehérjék többnyire allergén tulajdonsággal rendelkeznek. A Brazil dió
transzgénikus szójában expresszáltatott metioninban gazdag 2S albumin fehérjéje
bizonyítottan allergiás reakciókat váltott ki (Melo és mtsai., 1994; Nordlee és mtsai., 1996).
Emiatt nem valószínő, hogy a közeljövıben metioninban gazdag 2S albumin fehérje
használatát engedélyezni fogják gabonafélék transzformációjában, mely kísérletek emberi
29
táplálkozást céloznak meg. Ez azonban nem a transzformáció módszerének káros voltát
jelenti, hanem sokkal inkább azt bizonyítja, hogy az engedélyezı szervek az emberi
biztonságra és egészségre nézve nagyon körültekintıen járnak el (Shewry, 2007).
Szabad aminosavak mennyiségének növelése
A lizinben gazdag mutáns kukoricák vizsgálatakor kiderült, hogy a magasabb aminosav
tartalomért a szabad, fehérjébe be nem épült, aminosavak is felelısek. A gabona magvak
általában kis mennyiségben tartalmaznak szabad aminosavakat, s mennyiségük csak akkor nı,
ha a fehérjék szintézise korlátozott, pl. árpában a kénhiány miatt (Shewry és mtsai., 1983). Az
alacsony szabad aminosav szintet a növény az aminosav szintézisben résztvevı enzimek
szabad aminosav általi gátlása révén (negatív visszacsatolás) tartja fenn, mely egy komplex
szabályozási rendszer (Galili összefoglalói, 1995 és 2002). Falco és mtsai. (1995) E. coli
eredető, feedback érzéketlen, enzimeket (AK, DHDPS) kódoló génekkel transzformáltak
repcét és szóját. Hatására a szabad lizin tartalom repcében duplájára, míg szójában
ötszörösére nıtt. Az elsı kereskedelmi forgalomba került (2006) magas lizin tartalmú
transzgénikus kukoricát a Monsanto cég ezzel a technikával állította elı Corynebacterium-ból
származó, visszacsatolásra nem érzékeny DHDPS gén és a kukorica globulin-1 promótere
használatával. Ezzel a módszerrel rizs szabad triptofán tartalmát a vadtípuséhoz képest 55-
431-szeresére növelték meg (Wakasa és mtsai., 2006).
Noha sikerült már elıállítani megváltoztatott fehérje összetételő búzát, ami jobb funkcionális
tulajdonsággal bír, mint a vadtípusú búza, még senki sem számolt be javított táplálkozástani
értékő búzáról.
2.3.2.2 Telítetlen zsírsavak, vitaminok, ásványi anyagok, szénhidrátok és rostok
mennyiségének növelése
A telítetlen zsírsavak szerepe fontos és változatos a növények anyagcsere folyamataiban, jó
hatásúak a szív és érrendszeri megbetegedésekkel szemben, gyulladás gátlók, valamint
vérnyomás szabályozó szerepük is ismert. Mennyiségüket transzformációval Arabidopsis-
ban, szójában és olajos magvakban növelték (Qi és mtsai., 2004; Kinney és mtsai., 2004; Wu
és mtsai., 2005) a 18 szénatomos telítetlen zsírsavak és nagyon hosszú láncú többszörösen
telítetlen zsírsavak (ω-3 és ω-6) bioszintézise kulcsenzimeinek túltermeltetésével.
Vitamin és folsav tartalom növelése
Az A-vitamin hiányban szenvedık száma, különösen a fejlıdı országokban magas. A WHO
1995-ös jelentése szerint az A-vitamin hiánya felelıs évente 2 millió gyermek haláláért és a
túlélı gyermekek vakságáért. Az A-vitamin prekurzor molekulája, a β-karotin, a legtöbb
30
növényben megtalálható, belıle az emberi szervezet A-vitamint szintetizál, így hiánya
könnyen kiküszöbölhetı. A gabonafélék nem tartalmaznak β-karotint, s a szintéziséhez
szükséges 3 enzimet sem. Ye és mtsai. (2000) elsı kísérletükben csak egy-egy enzimet
expresszáltattak, majd késıbb a rizsszemek endospermiumába két sárganárcisz fitoin szintáz
enzimet és egy Erwinia uredovora fitoin szintázt kódoló gént juttattak be transzformálással.
Ezzel a teljes A-vitamin szintézis folyamatot rekonstruálták. A transzgénikus rizsszemek a
nagymennyiségő β-karotin miatt (15 µg/1 g szem) sárga, narancssárga színőek, ezért az új
rizsfajta az „Aranyszemő rizs” nevet kapta (Golden Rice). Késıbb kukoricát, krumplit,
karfiolt és paradicsomot is transzformáltak hasonló módszerrel (Paine és mtsai., 2005;
Ducreux és mtsai., 2005; Lu és mtsai., 2006). A transzgénikus sárga burgonya β-karotin
tartalma olyan magas (47 µg/1 g gumó), hogy egyetlen adag elfogyasztása (25 dkg) a napi A-
vitaminszükséglet felét biztosítja.
Az E-vitamin nem egyetlen molekula, hanem 8 hidrofób molekula egysége, közülük az α-
tokoferol a leghatásosabb a növények telítetlen zsírsavai védelmében. Hiánya emberben
leromláshoz, vesebajhoz és terméketlenséghez vezet. Transzgénikus megközelítésekben a
teljes vitamin mennyiségét vagy az α/β-tokoferol arányát növelik γ/δ-tokoferolhoz képest
(Shintani és Della-Penna, 1998; Van Eenennaam és mtsai., 2003).
A C-vitamin fontos elektron donor, enzim kofaktor és antioxidáns, hiánya skorbuthoz vezet.
Növényekben legalább három szintézis út ismeretes, így nagyon sok megközelítés kínálkozik
mennyiségének növelésére (Zhu és mtsai. összefoglalója, 2007). A legtöbb transzgénikus
kísérlet a C-vitamin bioszintézis enzimek túltermeltetését célozta meg.
A folsav hiánya sok betegséggel összefügg. Legnagyobb problémát a korai terhességben
okozza (spina bifida, azaz nyitott gerinc csatorna) ha a kismamák nem jutnak elegendı friss
zöldséghez (Geisel, 2003). A folsav három precurzor molekula asszociátuma. A szintézis út
módosításával Diaz de la Garza és mtsai. (2007) transzgénikus paradicsomot állítottak elı,
melynek termésében a folsav mennyisége a vad típusúéhoz képest 20 szorosára nıtt. Napi
100g paradicsom elfogyasztása biztosítja egy felnıtt vitamin szükségletét (400 µg).
Ásványi anyag tartalom növelése
Az ásványi anyagokat a növények nem szintetizálják, hanem a talajból veszik fel. A
transzgénikus stratégiák fıként a vas és a cink mennyiségének növelését célozták meg két
módon: az ásványi anyag felvétel fokozása és szállítása a fogyasztásra használt növényi
részekbe, a biológiai hozzáférhetıség javítása (White és Broadley, 2005). A mioinozitol-
hexakis-foszfátok (IP6) a gabona magvak foszfáttartalmának 70%-át adják és ásványi ionokat
(Ca2+, Cu2+, Fe3+, K+, Mg2+ és Zn2+) biztosítanak nagy mennyiségben a növény számára. Az
31
állatok és az emberek nem rendelkeznek fitáz enzimmel, a fitátot lebontani nem tudják. A
fitátok lebontása érdekében gomba eredető (Aspergillus niger) fitáz enzimet kódoló génnel
transzformáltak gabonaféléket, köztük búzát is (Brinch-Pedersen és mtsai., 2000, 2003; Lucca
és mtsai., 2001). Késıbb hıstabil fitázok génjét alkalmazták a transzformációs kazettákban,
hogy az enzimek a gabona feldolgozása, fızése során a magas hımérsékletén ne bomoljanak
le (Lucca és mtsai., 2001; Brinch-Pedersen és mtsai., 2002, 2006). A szója vaskötı fehérjéjét
(ferritin) Lucca és mtsai. (2001) rizsbe jutatták be, s a vastartalom két-háromszorosára nıtt
meg. Hasonló módon a búzaszem vastartalma is növelhetı lesz (Shewry és Jones, 2005).
Szénhidrátok és rostanyagok mennyiségének növelése
A búzaliszt kb. 70% keményítıt és 2-3% sejtfal poliszacharidot tartalmaz, melyek nagy
hatással vannak az emberi táplálkozásra. A keményítıt két polimer alkotja. Az amilóz
kevésbé emészthetı, mint az amilopektin, így az amilózban gazdag búza táplálkozástani
rostok forrása, ami jó hatással van az emésztı rendszer mőködésére, s feltehetıen csökkenti a
szívbetegség, gyomor- és vastagbél rák, valamint a cukorbetegség kialakulásának esélyét is
(Regina és mtsai., 2008). A keményítı bioszintéziséért felelıs enzimek közül két enzim
(SBEIIa, SBEIIb) expressziójának szabályozása RNS interferenciával a búzaszem amilóz és
amilopektin arányát megnövelte (több mint 70% amilóz) (Regina és mtsai., 2006). A gabona
magvak aleuron rétege és endospermiuma sejtjei vastag sejtfalát alkotó poliszacharidok
(arabinoxilánok, β–glükánok), mennyisége és azok aránya fajonként eltérı. A bioszintézis
enzimek megismerése és modell kísérletek elvezethetnek a sejtfal összetételének elıre
meghatározott módon történı változtathatóságához (Burton és mtsai., 2006; Vasil, 2007).
2.4 A búza genetikai módosítása
A hagyományos növénynemesítési módszereken túl a növények genetikai állományának
megváltoztatása lehetséges géntechnológia úton is, melyet növényi transzformációnak, az
így elıállított szervezeteket pedig Genetikailag Módosított (GM) növényeknek nevezzük.
Az elsı transzgénikus növényeket az 1980-as évek elején állították elı, amit megalapozott a
szövettenyésztés, a növényregeneráció és a molekuláris biológia módszertani fejlıdése.
Legfontosabb hatása a rekombináns DNS technikának volt. A kezdeti, pusztán a módszer
fejlesztésére és a transzgénikus növények tulajdonságainak jellemzésére szolgáló
alapkutatásokat követıen a figyelem a GM növények mezıgazdasági termelésbe való
bevonása felé fordult. Az elsı generációs GM növények agronómiai célokat szolgáltak, azaz
32
növényi kártevıknek (gomba-, vírus-, baktérium- és rovar rezisztens), illetve növényvédı
szereknek ellenálló növényeket hoztak létre. Különbözı rezisztencia génekkel növelték a
növény ellenállóságát gombák (Pellegrineschi és mtsai., 2000), rovarok (Altpeter és mtsai.,
1999; Stoger és mtsai., 1999), vírusok (Karunarate és mtsai., 1996) ellen, vagy gyomirtó
szerekkel (DeBlock és mtsai., 1997) szemben. Az abiotikus stresszel (vízhiány, Abebe és
mtsai., 2003; magas sókoncentráció, Huang és mtsai., 2006) szembeni ellenállóság
géntechnológiai úton történı növelésére is számos sikeres példa ismert az irodalomban búza
és más gabonafélék esetében (lásd Vasil összefoglalója, 2007).
A második generációs fejlesztések már az élelmiszer feldolgozóipar igényeit is szolgáló, ill.
az élelmiszerrel szemben támasztott új táplálkozás élettani szempontok kielégítésére is
irányultak. Kedvezıbb fehérje-összetétellel (Blechl és Anderson, 1996; Barro és mtsai., 1997;
Rakszegi és mtsai., 2005; Tosi és mtsai., 2004) és beltartalmi értékekkel (Regina és mtsai.,
2006) rendelkezı, elınyösebb zsírsavtartalmú (Edlin és mtsai., 2000) transzgénikus növények
elıállítására összpontosítanak a kutatások.
A harmadik generációs GM növények fejlesztése nem mezıgazdasági, vagy táplálkozástani
célokat szolgál, hanem azt vizsgálja milyen módon lehet a növényt, mint biofermentort,
alkalmazni enzimek, szerves molekulák elıállítására és gyógyszeripari intermedierek és
hatóanyagok, vakcinák termeltetésére. Ilyen alkalmazásokról búza esetében jelenleg még
nincsenek publikált adatok, de ehetı vakcinát a szemtermés endospermiumában termelı GM
rizsrıl már beszámoltak (Oszvald és mtsai., 2007).
2.4.1 A növényregenerációt befolyásoló tényezık és hatásuk a transzformációra
Minden növényi transzformáció elsıdleges követelménye, hogy jól regenerálódó
szövettenyészetbıl induljon ki, álljon rendelkezésre jól mőködı in vitro növény-sejt-növény
rendszer (Shewry és Jones, 2005). A sejt- és szövettenyészetek a növényi biotechnológia
alappillérei, melyek a vegetatív és generatív sejtek, szövetek, szervek és embriók in vitro
tenyésztését jelentik kontrollált körülmények között. Szövettenyésztési módszerekkel a
növények minden része, szerve, szövete, sejtje megfelelı feltételek és sterilitás esetén
mesterségesen életben tarthatók és tenyészthetık (Tulecke, 1953). Elméletileg minden
növényi sejtbıl teljes növény regenerálható, mert a növény minden sejtje totipotens,
rendelkezik a teljes genetikai állománnyal.
A magasabb rendő növények szervei már differenciálódott sejteket tartalmaznak ezért elıször
sejtosztódáson keresztül történı dedifferenciálódásukat kell indukálni és fenntartani. Erre
általánosan használt vegyületek a növényi hormonok. A módosítást követı
33
növényregeneráció lehetséges útjai a szomatikus embriógenezis és az organogenézis (in vitro
merisztéma- és szervdifferenciálódás). A merisztémák differenciálódása a morfogenézis
leggyakoribb útja, melynek során a jelen lévı hormonoktól függıen alakul ki a szerv típusa,
azaz a morfogenézis iránya. (Dudits és Heszky, 2003).
A géntechnológiai beavatkozás célpontja legtöbbször a különbözı növényi részek
hormonkezelésével dedifferenciálódásra késztetett szövetekbıl keletkezett kallusz. Újabb in
vitro hormonkezelésre a transzformált totipotens sejtbıl osztódáson és differenciálódáson
keresztül (redifferenciálódás) növény fejlıdik. Organogenézisnél a kallusz több sejtjének
közremőködésével gyökér és/vagy hajtás fejlıdik a hormonkeverék citokinin/auxin arányától
függıen. Ekkor, függetlenül attól, hogy elıbb gyökér vagy hajtás fejlıdik, mozaikos növényt
kaphatunk. Szomatikus embriógenezisnél az új növény a kallusz egyetlen totipotens sejtjébıl
embriószerő képzıdményen keresztül fejlıdik ki. Ha a transzformált sejt szomatikus
embriógenézissel fejlıdik tovább, akkor a géntechnológiával módosított növény minden sejtje
hordozza az idegen DNS-molekulát. Így alapvetıen embriógenézis indukálása a cél a
szövettenyésztés optimális körülményeinek kidolgozásakor (Shewry és Jones, 2005).
A búza kallusz regenerálódó képessége mennyiségi jelleg, az ezért felelıs gének különbözı
kromoszómákon helyezkednek el a genomban (Ben Amer és mtsai., 1997). A regenerációs
kísérletekben gyakran felmerülı probléma a regenerálódó képesség, vagy a termıképesség
elvesztése és a rendellenes fenotípusok (albinizmus, mozaikosság) gyakori megjelenése
(Gordon-Kamm és mtsai., 1999). A regenerálódó képesség, és így a transzformáció
hatékonysága is, nagymértékben függ a kallusz képzésére felhasznált növényi résztıl, a
növényregenerációban alkalmazott táptalajok összetételétıl és a szövettenyésztés
körülményeitıl, de a növény genotípusa is befolyásolja (Potrykus, 1990).
A genotípus elsıdleges faktor a gabonafélék sikeres transzformációjában. Intenzíven
fejlesztik az agronómiailag fontos nemesítési vonalakra és a kereskedelmi forgalomban levı
fajtákra is hatékony regenerációs módszereket (Iser és mtsai., 1999; Zhang és mtsai., 1999).
Tesztelték számos kereskedelmi forgalomban levı búzafajta kalluszindukciós képességét, és
sikerült növelni néhány fajtánál a növényregeneráció hatékonyságát (Fennell és mtsai., 1996;
Machii és mtsai., 1998; Barro és mtsai., 1999).
Regenerálható búza szövetkultúra többféle növényi rész felhasználásával is létrehozható.
Ilyen növényi rész az érett és az éretlen embrió, az izolált szkutellum, az éretlen virágzat
(Rasco-Gaunt és Barceló, 1999), az éretlen levél, a mezocotyl, a hajtáscsúcs merisztéma
(Zhang és mtsai., 1999), a koleoptilcsúcs és a gyökér. Jelenleg éretlen embrióból kiindulva
34
érik el a legjobb eredményeket. Sikeresen regeneráltak növényeket búza sejtszuszpenziós
kultúráiból elıállított protoplasztokból is (Ahmed és Sági 1993, Pauk és Szarka 1991).
A növényi transzformációhoz felnevelt kiindulási növény, a donor növény kora is jelentısen
befolyásolja a géntranszformáció nélküli és transzformáció utáni in vitro növényregeneráció
hatékonyságát. Pastori és munkatársai (2001) 12-14 nappal virágzás utáni kalászok éretlen
embrióiból kimetszett szkutellumok transzformációja esetén 7-14% hatékonysággal
transzformáltak tavaszi búzát. A körülbelül 60 napos búzanövények belsı hormonösszetétele
ekkor a legalkalmasabb a már differenciálódott szövetek dedifferenciálódására, majd
redifferenciálódására. A paraméter fontosságát a búzafajta több törzsére kapott
eredményeikkel Pellegrineschi és munkatársai (2002) is megerısítették.
Számos tanulmány foglalkozik az in vitro szövettenyésztés körülményei közül a kallusz- és
embrióindukcióra, valamint a növényregenerációra használt táptalajok összetételével (Rasco-
Gaunt és mtsai., 1999a; Zhang és mtsai., 1999). Az MS (Murashige és Skoog, 1962) és ennek
változatai a leggyakrabban használt táptalajok a gabonafélék szövettenyésztésében. A
dedifferenciálódás, azaz a kalluszképzıdés indukálására rendszerint az auxin hatású 2,4-
diklórfenoxi-ecetsavat (2,4D) használják, esetenként kiegészítve kis mennyiségő citokininnel.
A képzıdött kalluszokból a hajtásokat általában nagyobb citokinin koncentrációt alkalmazva,
auxinnal vagy a nélkül regenerálják (Barro és mtsai., 1998). A táptalajban 5-10 mg/l zeatin
pozitív hatással van a regenerációra (Barro és mtsai., 1999; Sparks és Jones, 2004). A gyökér
regenerálása hormonmentes táptalajon történik. Cukrok és cukoralkoholok nagy
koncentrációban vagy a különbözı fémion kiegészítık (pl. ezüst) jelenléte a táptalajban
növelik a kenyérbúza növényregenerációs hatékonyságát (Zhang és mtsai., 1999; Sparks és
Jones, 2004), ami azt bizonyítja, hogy ezek a komponensek csökkentik a növényi szövetek
érzékenységét a transzformációnál bekövetkezı sérülésekkel szemben (Rasco-Gaunt és
mtsai., 1999a). Más tanulmányok a különbözı szénforrások (Zhang és mtsai., 1999) és a
szövettenyésztés idıtartamának hatásáról számoltak be (Takumi és Shimada, 1996). Fontos
szerepe van még a regeneráció hatékonyságára a hımérsékletnek és a fényintenzitásnak is. A
szövettenyésztés hımérsékleti tartománya általában 20 és 30°C között van. A búzanövény
hımérséklet- és fényigénye is változik fejlıdése közben mind in vivo, mind in vitro
körülmények között. Míg a kalluszok sötétben fejlıdnek jobban, addig a kis fényintenzitás
(1000 lx, 90 nmol m-2 s-1) a redifferenciálódásnak kedvez (Tamás és mtsai., 2000).
A növényi transzformáció tárgyalásakor megkerülhetetlen a szomaklonális variabilitás,
mely az in vitro tenyésztett sejtekben lejátszódó folyamatok eredménye. A szomaklonális
variabilitás kialakulására több hipotézis létezik. A fenotípusosan is megjelenı genetikai
35
változásokat a DNS replikációja közben bekövetkezı hibák, a gének inaktiválódása,
transzpozíciója, valamint az alkalmazott szövettenyésztés aránytalan hosszúsága
eredményezheti (Maheshwari és mtsai., 1995). Ezért a szövettenyésztés különbözı fázisait a
lehetı legrövidebbre kell csökkenteni.
2.4.2 A búza transzformációja
2.4.2.1 Transzformációs rendszerek
A génbeviteli rendszerek között két klasszikus transzformációs technikát különböztetünk
meg, a közvetlen és a közvetett eljárásokat (Kohli és mtsai., 2003).
A közvetett transzformációs technikák az idegen gén beviteléhez vírus, illetve bakteriális
eredető vektorokat használnak. Az elmúlt évtizedben a gabonafélék esetében is rutinszerővé
vált közvetett génbeviteli módszer a kétszikőek transzformációjához gyakran használt
agrobaktérium közvetítette T-DNS átvitel (Komari és Kubo, 1999). A talajlakó
Agrobacterium tumefaciens és az A. rhizogenes prokarióta mikroorganizmusok (Gram-
negatív baktériumok) képesek genetikailag módosítani a növényi sejteket. Fertızéskor a
sebzés helyén az A. tumefaciens a gyökér golyvásodását elıidézı, tumor-indukáló
plazmidjának (Ti plazmid), illetve az A. rhizogenes hajszálgyökér-indukáló plazmidjának (Ri
plazmid) egy darabja (transzfer DNS, vagy T-DNS) be tud épülni a növény genetikai
állományába. A T-DNS-t körülvevı határszekvenciák által közrefogott bármely DNS darab
hatékonyan bejut és integrálódik a növény genetikai állományába. A technika, mellyel nagy
mérető DNS fragmentumokat is lehet integrálni kis kópiaszámban a növény kromoszómájába,
kezdetben csak kétszikőeknél volt sikeres. A 90-es években már rizs (Hiei és mtsai., 1994),
kukorica (Ishida és mtsai., 1996), árpa (Tingay és mtsai., 1997) és búza (Cheng és mtsai.,
1997) stabil transzformánsairól is beszámoltak. Az agrobaktérium közvetítette búza
transzformációt befolyásoló paramétereket több kutatócsoport vizsgálta (Xia és mtsai., 1999;
Amoah és mtsai., 2001; Weir és mtsai., 2001; Jones és mtsai., 2005). A módszer
hatékonysága búza esetében megközelíti a 10%-ot több virulencia gént tartalmazó „helper”
plazmidot hordozó AGL1 baktérium törzs használatával (Wu és mtsai., 2007), de a búza
transzformáció hatékony alkalmazása (>1%) csak néhány kivételesen jól regenerálódó
genotípusra korlátozódik (Bobwhite, Cadenza, Fielder, Veery-5, Florida). A viszonylag
nagyszámú publikáció, valamint Jones és munkatársainak több tucat búzafajta sikeres
transzformálása (személyes közlemény) ellenére egyelıre vitatott, hogy e transzformációs
módszer búzánál helyettesítheti-e a biolisztikus módszert (Vasil, 2007).
36
A közvetlen transzformáció elsı eljárása a polietilén-glikolos (PEG) módszer volt, mellyel
számos hátránya ellenére sikerrel transzformáltak búzát is (Lörz és mtsai., 1985). A módszer
gyenge pontja, hogy a protoplaszt regenerálódó képessége nagyon alacsony, így csak néhány
genotípus használható a transzformációhoz. A sejtszuszpenziós kultúrák könnyen elveszítik
csírázó képességüket, és idıvel akkumulálják a genetikai rendellenességeket (szomaklonális
variáció). Jelentısebb eredményeket a gabonafélék közül csak kukoricával és rizzsel értek el
(Golovkin és mtsai., 1993; Barceló és Lazzeri, 1998). Sejt és szövet elektroporációjánál a
DNS nagyfeszültségő elektromos impulzusok hatására jut be a sejtekbe. A módszer
valamennyi gabonafélére mőködik, azonban a transzformáció hatékonysága csak kukoricánál
és rizsnél elfogadható mértékő (Laursen és mtsai., 1994; Xu és Li 1994). Az
elektroporációban a célobjektum rendszerint a megtermékenyített petesejt, a kallusz, az
éretlen embrió vagy az éretlen virágzat. He és mtsai. (2001) transzformált növényeket
állítottak elı tritordeum (búza-árpa hibrid) éretlen virágzatából nyert szövet
elektroporációjával. Egy kevésbé jelentıs közvetlen génbeviteli eljárásban szilicium-karbid
(SiC) tőket használtak a transzformáláshoz. A módszert elıször szuszpenziós kultúrákon
tanulmányozták (Frame et al. 1994), majd késıbb búzaembriót és embrióból származó
kalluszt is transzformáltak ezzel a technikával (Serik et al. 1996; Petolino et al. 2000). A
módszer egyszerő, mégsem terjedt el, mert az embriogén szuszpenzió elıállítása nehéz és
idıigényes feladat, a mikroszkopikus SiC tők pedig veszélyt jelentenek a kísérletet végzı
egészségére. A gyors és hatékony mikroinjektálásos technikát exogén DNS búzasejtmagba
és zigótába juttatására fejlesztették ki (Pónya és mtsai., 1999). A módszer egy mechanikus
feltárást és egy nagy frekvenciájú váltakozó árammal végzett protoplaszt rögzítést foglal
magába. A módszer óránként 15 injektálást tesz lehetıvé, és a bejuttatott gének szignifikánsan
magasabb tranziens expressziót mutattak (46-52% petesejtre és zigótára külön-külön), mint
amit eddig növényi protoplasztoknál megfigyeltek.
A génágyús, vagy más néven biolisztikus módszer a búza transzformálására napjainkban
vitathatatlanul a legelterjedtebb közvetlen génbeviteli rendszer. Az elsı sikeres kísérlet óta
(Vasil és mtsai., 1992) számos laboratóriumban alkalmazzák a búza genetikai állományának
módosítására különbözı eredető búza kalluszból és szövetbıl kiindulva. A módszert Sanford
1988-ban fejlesztette ki. Alapja, hogy nagynyomású gáz juttatja a mikromérető hordozókra
felvitt DNS-t az intakt sejtekbe, szövetekbe. A Jenes és munkatársai által (1996) kifejlesztett
és szabadalmaztatott olcsó, hatékony génágyú, a Genebooster, nagynyomású nitrogén gázzal
mőanyag lövedéket gyorsít fel, majd a megfékezett lövedék üregében elhelyezett DNS-sel
bevont aranyszemcse repül be a célszövetbe. Ma búzára leginkább a hélium gázzal mőködı
37
génpuskát (PDS1000/He, BioRad) használják. A kézi részecskeágyú (Chaure és mtsai., 2000)
lehetıvé teszi transzgén átvitelét az intakt növény szöveteibe, akár az üvegházban, vagy a
szántóföldön is. A biolisztikus technika jelenleg a legmegbízhatóbb és a leghatékonyabb
módszer termékeny, transzgénikus egyszikő növények elıállítására (Barro és mtsai., 1997;
Rasco-Gaunt és mtsai., 2001; Jones és mtsai., 2005; Vasil, 2007; Dwivedi és mtsai., 2008).
Gabonaféléknél a DNS-t a növényi részekbe néhány órával (Barro és mtsai., 1997;
Pellegrineschi és mtsai., 2002) vagy 2-8 nappal izolálás után juttatják be (Vasil és mtsai.,
1992; Pastori és mtsai., 2001; Sparks és Jones 2004). Utóbbi esetben kalluszokat
transzformálnak. A transzgén expresszióját befolyásolják a biolisztikus eljárás fizikai és
kémiai paraméterei. Lényeges az aranyszemcse mérete (0,4-1,2 µm) és mennyisége (29-235
µg/lövés), a mikro-hordozóra felvitt DNS oldat összetétele. Az oldat általában 2,5-20 µg
plazmidot vagy lineáris DNS-t, 8-16 mM spermidint és 0,2-1,9 M Ca2+ iont tartalmaz. A
génpuska mőködési paraméterei közül fontos a He-gáz nyomása [4,5-7,6 MPa (650-1100
psi)], a vákuum a kamrában [711 Hgmm (27-28 inchesHg)] és a lövési távolság (2,5-5,5 cm).
Az említett paraméterek optimalizálásáról több tanulmány is beszámolt (Rasco-Gaunt és
mtsai., 1999a; Harwood és mtsai., 2000).
A búza biolisztikus transzformáció hatékonysága általában 1% körül van (Altpeter és
mtsai., 1996b), bár néhány genotípusnál 4-17%-ot is elértek (Xia és mtsai., 1999; Pastori és
mtsai., 2001; Rasco-Gaunt és mtsai., 2001). A sikeres, bizonyított transzformációknál sokszor
komoly probléma a transzgén instabilitása (Barro mtsai., 1998; Cannell mtsai., 1998,) és a
géncsendesítésnek nevezett részleges génexpresszió (Blechl et al. 1998, Alvarez et al. 2000).
Az idegen gén integrációs mechanizmusa az agrobaktérium közvetítette transzformáció és a
közvetlen DNS beviteli technikáknál sem teljesen ismert. Az integráció helye és a transzgén
lókusz szerkezete jelentıs változatosságot mutathat a független transzgénikus vonalakban,
ami hatással lehet a génexpresszió szintjére és stabilitására. A géncsendesítés oka legtöbbször
a promóter metilációja, de okozhatja a beépülési hely módosulása is (Howarth és mtsai.,
2005). Biolisztikus transzformációval elıállított búzáknál stabil öröklıdésrıl többkópiás és
több helyre történı génbeépülés esetén is beszámoltak (Rooke és mtsai., 2003). Az eredmény
azért jelentıs, mert kotranszformációban a több helyre való beépülés biztosíthatja a transzgén
szegregációját, ami a marker gén kiesését, s csak a hasznos gén megmaradását
eredményezheti. Az utóbbi idık eredményei alapján úgy tőnik, hogy a biolisztikus
transzformációs módszer elınyösebb búza esetében (Vasil, 2007). Egy kópiás génbeépülésrıl
és magas szintő génexpresszióról számoltak be Altpeter és mtsai. (2005a). Az új
agrobaktériumos transzformációs technikák esetében is megfigyeltek több kópiás és a T-
38
DNS-nél nagyobb mérető DNS fragmentum beépülését (Wu és mtsai., 2006). Hely specifikus
beépülést célzó munkák segíthetnek a megoldásban, mint amiket pl. rizs (Hoa és mtsai., 2002)
és kukorica (Zhang és mtsai., 2003a) esetén tanulmányoztak.
2.4.2.2 A transzgén expresszió szabályozása, promóterek
Az eukarióta sejtekbıl származó promóterek teszik lehetıvé a többnyire bakteriális eredető
markergének és a különbözı élılényekbıl származó transzgének átíródását és expresszióját a
transzgénikus növény megfelelı szövetében, vagy szöveteiben. Megfelelı promóterek
kiválasztásával térben és idıben is szabályozható a transzgének megnyilvánulása.
A konstitutív promóterek a transzgénikus sejtek in vitro azonosítására használt szelekciós és
vizuális markergének folyamatos átíródását segítik a növény minden sejtjében. A növény
genetikai állományába beépíteni kívánt hasznos gén szabályozására is használnak konstitutív
promótereket, ha a növény minden szövetében és valamennyi fejlıdési állapotában magas
szintő génexpresszió elérése a cél. Gabonafélék transzformációjánál a leggyakrabban használt
konstitutív promóterek: a karfiol-mozaikvírus 35S rRNS (CaMV 35S), a rizs aktin fehérje
(Act) (Barro és mtsai., 1998) és a kukorica ubiquitin fehérje (Ubi) (Barro és mtsai., 1998;
Stoger és mtsai., 1999) génjeinek promóterei. A kukorica alkohol dehidrogenáz enzim (Adh)
és az agrobaktérium oktopin szintáz génjének (ocs) promóterébıl készült kiméra promóter, az
Emu (Chamberlain és mtsai., 1994). A génexpresszió szintje fokozható különbözı intronokkal
is, mint pl. a rizs aktin (McElroy és mtsai., 1991; Oszvald és mtsai., 2008) vagy a kukorica
adh gén (Barro és mtsai., 1998) elsı intronja. A cukornádból izolált bacilliform vírus (ScBV)
promóter szintén ígéretes konstitutív promóter (Tzafrir és mtsai., 1998).
A szövetspecifikus promóterek a transzgén kifejezıdését csak specifikus szövetekben és
azok meghatározott fejlettségi állapotában engedélyezik. A fény által szabályozott
promóterek, mint pl. a klorofill-a/b kötı fehérje (LHCP) gének promóterei a klorofillt
tartalmazó szövetekben aktívak (Baga és mtsai., 1999a). A rizs szacharóz-szintetáz génje (rss)
és a rizs tungro bacilliform vírus (RTBV) promótere a háncsszövetben történı expressziót
irányítják (Bhattacharyya-Pakrasi és mtsai., 1993). A kukoricából és a rizsbıl származó
GBSS promóterekkel a transzgénikus kukorica endospermiumában és a pollenben is
transzgén expresszió figyelhetı meg (Russell és mtsai., 1997). A búza Em (Early methionine)
fehérjék, melyek tagjai a LEA (late embryogenesys abundant) fehérje csoportnak promóterei,
embrió és aleuron specifikus fehérje expressziót mutattak árpában (Furtado és Henry, 2005).
A búza HMW glutenin tartalékfehérje alegység (1Ax1, 1Dx5) gének promóterei
endospermium specifikus expressziót eredményeznek a transzgénikus kenyérbúzában
39
(Altpeter és mtsai., 1996a; Barro és mtsai., 1997) és durum búzában is (He és mtsai., 1999). A
HMW-GS fehérjék között a Bx típusúak expresszálódnak legerısebben (Juhász és mtsai.,
2003). Oszvald és mtsai. (2008) az 1Bx17 fehérje promóterét négy különbözı, kiméra
formában készítették el. Vizsgálataikkal az endospermium specifikus kiméra promóterek
egyes elemeinek funkcióját és hatékonyságát éretlen búza endospermium tranziens
expressziójában és stabilan transzformált rizsben is igazolták.
Az indukciós promóterek a növény külsı környezetében bekövetkezı változások hatására
indítják el a transzgén expresszióját. Ilyen promóterek szabályozzák azon növényi fehérjék
génjeit, melyek a stressz káros hatását csökkentı élettani folyamatokban vesznek részt. (lásd
Potenza és mtsai. 2004 összefoglalóját). Különösen jelentıs a gabonafélék, s így a búza
esetében a hideg- és hı stressz indukálta gének promótereinek alkalmazása transzgénikus
kutatásokban (Frederico és mtsai., 2005; Meyer és mtsai., 2004).
2.4.2.3 Transzgénikus növények szelekciója
A génbevitel után a transzformált sejteket nem transzformált sejtek veszik körül. A
transzformáció döntı lépése azon sejtek szelektálása és felszaporítása, melyekben a transzgén
nem csak integrálódott a nukleáris genomba, de expresszálódik is. Az ilyen sejtek azonosítása
marker génekkel lehetséges. Ezek legtöbbször olyan gének, melyekrıl az átíródó fehérjék
ellenállóvá teszik a növényt antibiotikumokkal vagy herbicidekkel szemben. A szelekcióra
használt vegyületek a vadtípusú sejtek növekedését gátolják, vagy elpusztítják azokat, míg a
transzgénikus sejtek életképessége megmarad. A rezisztenciagének mellett léteznek egyéb
szelekciós gének is, melyeket riporter géneknek is nevezünk.
A rezisztenciagének egyik csoportja az aminoglikozid alapú antibiotikumokkal szemben
biztosít rezisztenciát. Ide tartozik többek között a kanamicin, a gentamicinB, a geneticin
(G418), a neomicin, a paromomicin és a sztreptomicin (Jelenska és mtsai., 2000). Az
aminoglikozidok baktériumölı hatása elsısorban úgy valósul meg, hogy irreverzibilisen
kötıdnek a riboszómákhoz. Különbözı enzimek, pl. az aminoglikozid-adeniltranszferáz
(AadA) és a neomicin-foszfotranszferáz (NptII) képesek inaktiválni az aminoglikozidokat.
A növényvédıszer komponensekkel szemben kialakított rezisztencia jó alternatívája az
antibiotikum rezisztencián alapuló szelekciónak. A legtöbbször használt herbicid rezisztencia
gén a bar (Basta/bialaphos resistance) ami a foszfinotricin-acetiltranszferáz (PAT) enzimet
kódolja (DeBlock és mtsai., 1995). Az enzim a foszfinotricin (PPT) alapú gyomirtó szerekkel
(Basta, Finale, Ignite, Herbiace) szemben ad toleranciát azáltal, hogy hatástalanítja azok
toxikus komponenseit (bialaphos, glufozinát). A PPT alapú szelekciót transzgénikus
40
növények azonosítására már az összes gabonaféle transzformációjánál felhasználták (Barro és
mtsai., 1998; Pauk és mtsai., 1998; Iser és mtsai., 1999; Kohli és mtsai., 1999; Rasco-Gaunt
és mtsai., 1999b). Széles körben elterjedtek, bár negatív mellékhatásaik lehetnek, mivel
gátolhatják a sejtosztódást és a differenciálódást, valamint a környezetre gyakorolt hatásuk
nem kellıen ismert (Bregitzer és mtsai., 1998). A gabonafélék transzformációjánál ritkábban
használt, herbicid rezisztencián alapuló szelekciós rendszer a glifozáttal és a szulfonilureával
szemben kialakított toleranciát mutáns enzimeket kódoló génekkel éri el (Zhang és mtsai.,
2000). Weeks (1998) ciánamid alapú herbicidet használt szelekcióra.
A rezisztenciagének mellett az úgynevezett funkcionális szelekciós géneket is sikeresen
használták gabonafélék transzformációjánál. A pozitív funkcionális szelekció (Haldrup és
mtsai., 1998) olyan stratégia, mely a transzgénikus sejteknek metabolikus elınyt ad a nem
transzformált sejtekkel szemben. Ez az új marker ártalmatlan mind a fogyasztókra, mind a
környezetre. A búza transzformációnál is használt egyik pozitív szelekciós rendszerben az E.
coli baktériumból származó foszfomannóz-izomeráz (pmi) gén a markergén (Wright és mtsai.,
2001). Az enzim a növények számára nem hasznosítható mannóz-6-foszfátot átalakítja
metabolizálható fruktóz-6-foszfáttá, így a markergént tartalmazó sejtek mannóz-6-foszfát
tartalmú táptalajon is képesek osztódni, míg a nem transzgénikus sejtek nem. A pmi gén
használatával a transzformáció hatékonysága nagyobb, mint a bar herbicid rezisztencia gén
használatakor, valamint a nem transzgénikus sejtek túlélési aránya a szelekciós táptalajon
csökken. Pozitív funkcionális marker továbbá az izopentenil-transzferáz (ipt) és a rol gén is
(Kunkel és mtsai., 1999). Az ipt gén az A. tumefaciens sejtburjánzást indukáló génjei közé
tartozik, a citokinin bioszintézis egyik enzimét kódolja. A bevitt gén hatására a transzgénikus
növényi szövet citokinin szintje növekszik, s a növény elveszíti apikális dominanciáját.
Gátlódik a gyökér képzıdése is. Az A. rhizogenes eredető rol gén az úgynevezett „hairy
roots” kialakulásáért felelıs, de a gén hatására a növény levele is megváltozik. Ráncossá
válik, megrövidülnek az internódiumok és csökken az apikális dominancia is. Az ipt, vagy a
rol génekkel a transzgénikus növények fenotípusa változik meg, így vizuálisan
megkülönböztethetık a nem transzgénikus növényektıl. Normális fenotípust csak úgy lehet
elıállítani, ha az ipt vagy a rol gént kikapcsolják, vagy rekombinációval a növény elveszíti
azt. A pozitív funkcionális szelekció mellett léteznek negatív szelekciós markerek is. Ilyen
gén a bakteriális citozin dezamináz (codA) gén, mely a nem toxikus 5-fluorcitozint az
eukarióta sejtek számára mérgezı 5-fluoruracillá alakítja át. A gén hatását és további
alkalmazhatóságát transzgénikus rizsben tanulmányozták (Dai és mtsai., 2001).
41
A szelekciós markergének jelenléte gyakran nem kívánatos a transzgénikus növényekben. Így
a figyelem azon módszerek fejlesztésére irányul, melyekkel a szelekciós markergének
eltávolíthatók a transzgénikus növényekbıl. Ez elérhetı normál szegregációval (Komari és
mtsai., 1996), de sokkal ígéretesebb a homológ rekombináció közvetítette gén kiütés (gene
knockout) módszere. Ez utóbbi megvalósítására dolgozták ki a MAT (multi-auto-
transformation) vektor rendszert. A MAT rendszer egyik változatában a kukorica
transzpozábilis elemét (AC) használják (Ebinuma és mtsai., 1997), míg a másik módszerben
az élesztı (Zygosaccharomyces rouxii) hely specifikus rekombinációs rendszerével (R/RS)
távolítják el a genomból az ipt gént (Sugita és mtsai., 1999). Az utóbbi MAT vektorral
sikeresen állítottak elı transzgénikus rizst szkutellumból (Ebinuma és Komamine, 2001). A
MAT rendszer használatával lehetıség van szelekciós markergén mentes transzgénikus
növények elıállítására egy lépésben (Ebimuma és Komamine, 2001). Növényi
transzformációnál gyakran elıfordul, hogy az idegen gén több példányban épül be a genomba.
Többek között a stabil expresszió miatt, a transzgént egy kópiában hordozó növények
elıállítása a célszerő. Az extra szekvenciákat pl. a Cre-lox helyspecifikus rekombináción
alapuló rendszerrel lehet kiiktatni a genomból. A módszerrel sikeresen alakítottak át négy
transzgén kópiát hordozó búzanövényeket egy kópiát tartalmazó transzformánsokká
(Srivastava és mtsai., 1999).
A látható markergének, vagy más néven riportergének alkalmasak az átmeneti
génexpresszió tanulmányozására, szelekciós markerként többnyire nem használják ıket. A
riportergének vizuálisan detektálható enzimaktivitással rendelkezı fehérjéket vagy színes
pigmentet, illetve fluoreszcens fehérjét kódoló gének. Ha a detektálás alsó határa elég
alacsony, a mennyiségi értékelés rendszerint már 48 órával a transzformáció után elvégezhetı.
A növényi transzformáció elsı éveiben a glükuronidáz (uidA/GUS) és a klóramfenikol-
acetiltranszferáz (CAT) enzimeket kódoló gének voltak az idegen DNS növényi sejtbe
jutásának indikátorai. Sikerrel használták gabona transzformációnál luciferáz enzim génjét is.
(Baruah-Wolff és mtsai., 1999). A medúzaeredető GFP (green fluorescent protein) egyre
gyakrabban használt riporter a növényi transzformációban. Ez a fehérje roncsolásmentesen
teszi lehetıvé a transzgénikus sejtek vizuális azonosítását fluoreszcens mikroszkóppal. A
rendszer kis toxicitású, szövettıl és genotípustól független, és széles körően használt a gabona
transzformációban (Tamás és mtsai., 1999; Stewart, 2001). A korallból származó, vörösen
fluoreszkáló fehérje génjét (pDsRed, Clontech) elıször baktériumokban használták
riporterként, de sikeresen azonosítottak vele transzgénikus dohány növényeket is (Jach és
mtsai., 2001).
42
3. CÉLKIT ŐZÉSEK
Munkánk célja a búza táplálkozástani minıségének javítása, melynek meghatározó
paramétere az endospermiumból ırölt lisztben található tartalékfehérjék aminosav összetétele.
Irodalmi adatok alapján ismert, hogy a búza tartalékfehérjéinek aminosav összetétele
jelentısen eltér az állati fehérjék aminosav összetételétıl (Dubetz és mtsai., 1979).
Esszenciális aminosav tartalmuk nagyon alacsony, ezért ezeknek a fehérjéknek
táplálkozástani értéke nem kielégítı, nem teljes. A búzalisztben jellemzıen alacsony az
arginin, hisztidin és treonin aminosavak aránya, míg a lizin tartalom nagyon alacsony (Shoup
és mtsai., 1966; Jensen és Martens, 1983). Ez annak tulajdonítható, hogy az ırlés során a
magasabb esszenciális aminosav összetételő embrió részt (8,3% lizin) és aleuronréteget (4,8%
lizin) eltávolítják. Így a liszt fehérje összetételének, azon belül aminosav összetételének
megváltoztatása jelentıs táplálkozástani érték változást eredményezhet.
Munkánkban in vitro funkcionális vizsgálatok segítségével, illetve in vivo molekuláris
biológiai módszereket felhasználva egyrészt arra szeretnénk választ kapni, hogy a búza
endospermium fehérje mátrixában expresszálódott amarantusz tartalékfehérje (AmA1)
hogyan befolyásolja a búza endospermiumból ırölt liszt fehérje- és aminosav összetételét.
Másrészt azt kívánjuk vizsgálni, hogy a búzalisztbıl készült tészta dagasztási tulajdonságai
változnak-e, és hogyan, az öt cisztein aminosavat tartalmazó heterológ fehérje génjének a
búza örökítı anyagába való beépítése és a fehérje termelıdése után.
A célkitőzés megvalósításához az alábbi konkrét célokat fogalmaztuk meg:
1A. Hatékony növényregenerációs rendszer kidolgozása különbözı búza genotípusokhoz.
1B. A kidolgozott szövettenyésztési módszer körülményeinek optimalizálása búza
transzformációhoz.
2. Amarantusz tartalékfehérje gén in vivo expresszáltatása transzgénikus búzavonalakban.
3. A transzgénikus búzanövények nukleinsav és fehérje szintő vizsgálatai.
4. Utódgenerációk felnevelése és a transzgén öröklıdés kapcsoltsági szintjének megállapítása.
5. Összefüggések keresése a megváltozott fehérje-összetétel és a funkcionális tulajdonságok
között.
43
4 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
4.1 Növényregenerációs kísérletek
4.1.1 Növényi anyagok
Növényregenerációs kísérleteinkhez a termesztett Martonvásári ıszi búzafajták közül az Mv
Emese, Mv Magvas, Mv Martina, Mv Pálma és két Mv Emma genotípust (eltérı HMW
glutenin alegység összetétel) használtuk donor növényként. Kísérleteinkben vizsgáltuk egy
régi magyar búzafajta, a Bánkúti 1201 három törzsének (B2, B8, B70) in vitro regenerációs
képességét is. A kicsíráztatott magokat tápkockában, 6 hétig, 4 oC-on vernalizáltuk, majd a
donornövényeket növénynevelı kamrában (Conviron), kontrollált körülmények között
kalászolásig neveltük. A kamrák hımérséklete 16/14 oC (nappal/éjjel) volt, a fényszükségletet
hideg, fehér fényt adó fénycsövekkel (200 µmol m-2 s-1), 16/8 óra (nappal/éjjel)
fotóperiódussal biztosítottuk. A biológiai stressz elkerülése érdekében a donornövényeket
kéthetente rutinszerően permeteztük. A kísérletek folyamatos növényigénye miatt minden
búzafajtát kéthetente vetettünk.
4.1.2 Éretlen embriók szövettenyésztése
Virágzás után 8-10 nappal a donornövények éretlen magjait 1,3% NaOCl vizes oldatával és
egy csepp felületaktív anyaggal sterilizáltuk, majd steril desztillált vízzel ötször öblítettük
(Larkin, 1982). A kissé áttetszı, 0,5-1 mm hosszú embriókat embriócsúccsal lefelé BEG 2
kalluszindukáló táptalajt (Függelék I. táblázat) tartalmazó Petri csészére helyeztük (30
embrió/csésze). Egy hetes sötét inkubálás után a nem csírázó, kalluszosodó embriókat friss
BEG 2 táptalajon (12-15 kallusz/csésze) további négy hétig inkubáltuk sötétben. Három
különbözı kísérleti beállításban 26±1 oC, 23±1 oC és 20±1 oC hımérsékletet alkalmaztunk.
A kalluszindukció után minden kalluszt módosított MS (Murashige and Skoog, 1962)
hajtásregeneráló táptalajon (MS9, MS9N, MS92, MS92N; Függelék I. táblázat) 4-8 hétig
fényben inkubáltunk (6-7 kallusz/csésze). A kalluszokat és a fejlıdı hajtásokat alacsony
intenzitású (20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus) vagy állandó magas intenzitású (50 µmol
m-2 s-1) fénnyel világítottuk meg. Kísérleteinkben a hajtásokat 26±1 oC vagy 23±1 oC
hımérsékleten regeneráltuk.
44
A regenerált hajtásokat minden kísérleti beállításban hormonmentes MS táptalajon, a
hajtásregenerációban alkalmazott körülmények között gyökereztettük. Genotípusonként
három növényt tápkockában, majd cserépben felneveltünk.
4.1.3 Statisztikai elemzés
Minden kísérleti beállításban, genotípusonként öt Petri csésze (30 embrió/csésze) embriót
preparáltunk, és a kísérletet háromszor megismételtük. A növényregeneráció hatékonyságát
százalékban adtuk meg. A regenerált növények számát nem a preparált, hanem az egy hét
után szelektált, kalluszosodó, de nem csírázó embriók számához (25-27 embrió/csésze)
viszonyítottuk. Az egyes kísérleteken belül a növényregeneráció eredményeinek értékelésére
kéttényezıs varianciaanalízist végeztünk (SPSS for Windows 10.0 statisztikai
programcsomag és Microsoft Excel).
4.2 Búza-transzformációs kísérletek
4.2.1 Növényi anyagok
Transzformációs kísérleteinkhez a termesztett Martonvásári ıszi búzafajták közül a
növényregenerációs kísérleteinkben (Tamás és mtsai., 2004) legjobbnak bizonyult Mv Emese
búzafajtát, valamint két tavaszi búzafajtát (Cadenza, Bobwhite 26 törzs) választottunk donor
növényként. A kicsíráztatott magokat tápkockába tettük (az ıszi Mv Emese búzafajtát ebben
az állapotban 6 hétig, 4 oC-on vernalizáltuk), majd a donornövényeket cserépbe ültetve
növénynevelı kamrában (Conviron) a 4.1.1 fejezetben leírtak szerint kontrollált körülmények
között neveltük. A kísérletek folyamatos növényigénye miatt minden búzafajtát kéthetente
vetettünk.
4.2.2 Növényi szövet elıkészítése a biolisztikus transzformációhoz
Virágzás után 12-14 nappal a donor növények éretlen szemtermését a 4.1.2 fejezetben leírtak
szerint sterilizáltuk. Az éretlen embriók embriócsúcsát mikroszkóp alatt eltávolítottuk, majd a
szkutellumokat méretük szerint három csoportba válogatva (kicsi: 0,5-1,0 mm, közepes: 0,8-
1,2 mm és nagy: 1,0-1,6 mm) külön Petri csészék közepére helyeztük (30 szkutellum/csésze).
Minden méretbıl legalább négy csészével készítettünk. A szkutellumokat módosított MS
kalluszindukciós táptalajokon (MD0,5; MD1, MD2; Függelék II. táblázat) génbelövés elıtt
36-48 óráig, 23±1 oC hımérsékleten, sötétben inkubáltuk. Kísérletenként a belövéshez 360-
45
480 szkutellumot preparáltunk, valamint a növényi anyag regenerációs képességének
ellenırzéséhez 1-1 Petri csésze bombázott és nem bombázott kontrollt készítettünk.
4.2.3 Transzgénikus növények elıállítása
Alkalmazott plazmidok
A növényregenerációs rendszer transzformációhoz történı optimalizálásakor az antibiotikum
(kanamicin) rezisztenciát biztosító pEmu-KON nevő plazmidot használtuk (Chamberlain és
mtsai., 1994).
Kotranszformációs munkánkban szelekciós marker/riporter génként a pAHC25 jelő plazmidot
használtuk, mely az uidA és a bar gént tartalmazza, s expressziójukat a kukorica ubiquitin
promótere vezérli (Christensen és Quail, 1996). A hasznos tulajdonságot kódoló transzgén az
ama1 gén (Raina és Datta, 1992) pTLZ transzformációs kazettába klónoztuk (AmA1-pTLZ).
A transzgén expresszióját nagy hatékonyságú búza endospermium specifikus promóter, az
1Bx17 HMW-GS promóter, vezérli (4.1 ábra). A plazmid DNS-eket baktérium tenyészetbıl
QIAGEN kittel preparáltuk, koncentrációjukat 1 µg/µl-re állítottuk be a további munkákhoz.
1Bx17 HMW-GS ama1 gén NOS
4.1 ábra A transzgén konstrukciója a transzformációs kazettában.
Aranyszemcsék bevonása DNS-sel
A 0,6 µm átmérıjő aranyszemcséket (Bio-Rad, Submicron Gold) Barcelo és Lazzeri (1995)
módszerét követve 96%-os koncentrációjú etanollal mostuk, szonikáltuk, majd steril
desztillált vízben szuszpendáltuk (40 mg/ml). Az 50 µl-es részletekben tárolt, 2 mg
aranytartalmú szuszpenzióhoz 5 µg plazmidot (2,5+2,5 µg) kevertünk (vortex). Az Eppendorf
csı oldalán 44 µl 3 mol/l CaCl2 oldatot és 20 µl 0,1 mol/l spermidint összekevertünk és a
szuszpenzióhoz adtuk erıs keverés közben (vortex). Három másodperc, maximális
sebességgel történı centrifugálás után a felülúszót eltávolítottuk a csapadékról. A DNS-sel
bevont aranyrészecskéket 150 µl etanollal mostuk, majd 3 másodpercig újra centrifugáltunk
és a felülúszót eldobtuk. Az aranyszemcséket 85 µl etanolban szuszpendáltuk, s a
felhasználásig jégen tartottuk az etanol párolgás csökkentése érdekében (maximum 1-2 óra).
Az alkohollal sterilezett makro hordozó lemezekre minden belövéshez 5 µl szuszpenziót
pipettáztunk (12 belövés/egy adag arany szuszpenzió). A bombázott kontrollokhoz az
aranytartalmú szuszpenzió megfelelı térfogatú részletét fentiek szerint kezeltük, de DNS
nélkül.
46
A belövés paraméterei
A transzformációs kazettát PDS-1000/He génágyúval (Bio-Rad) a gyártó felhasználói
utasításait követve jutattuk a növényi sejtekbe. A munkatérben 28 inch-es Hg (711,2 Hgmm)
vákuumot alkalmaztunk. A héliumot 650 psi (4,484 MPa) nyomás mellett engedtük be az
aranyrészecskéket hordozó korong fölötti térbe. A vákuum és a nyomás hatására szétrepedı
korong (hasadó lemez) és a belövendı kalluszok közötti távolságot 6 cm-re állítottuk be,
melyet a legkedvezıbb tranziens expressziós vizsgálat alapján választottunk meg (Rasco-
Gaunt és mtsai., 1999a).
Transzgénikus jelölt növények regenerációja és szelekciója
Közvetlenül belövés után a kalluszosodó szkutellumokat az eredeti és még két Petri csészén
szétterítettük és három hétig 23±1 oC hımérsékleten, kalluszindukciós táptalajon sötétben
tenyésztettük. Ezt követıen a kalluszokat hajtásregeneráló táptalajra (RZ+1/2Cu) (Függelék
II. táblázat) helyeztük és 23±1 oC hımérsékleten, alacsony intenzitású fénnyel világítottuk
meg (20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra nappal/éjjel). A zöldülı kalluszokat és növénykéket a
kallusszal együtt ezután 4 mg/l foszfinotricin (PPT) tartalmú szelekciós táptalajra (RZPPT4)
(Függelék II. táblázat) helyeztük 5-6 képzıdmény/csésze sőrőséggel és még három hétig
neveltük. A bombázott és nem bombázott negatív kontroll kalluszokat illetve növénykéket
fele-fele arányban szelekció nélküli és szelekciós táptalajon tenyésztettük az alkalmazott
szelekciós nyomás erısségének vizsgálatára. Minden további szelekciós fázisban így jártunk
el. A szelekciót túlélt transzgénikus jelölt zöld növényeket további szelekció és gyökereztetés
céljából hormonmentes táptalajt (RPPT4, Függelék II. táblázat) tartalmazó Petri csészékbe,
majd steril üvegekbe helyeztük kétszer három hétre. Az Mv Emese ıszi búzafajta szelektált,
kb. 10 cm nagyságú transzgénikus jelölt növényeit szelekciós nyomás nélkül, R0 táptalajt
(Függelék II. táblázat) tartalmazó üvegekben 6 hétig vernalizáltuk. A tavaszi búzafajták
(Bobwhite és Cadenza) transzgénikus jelölt növényeit a szelekciós táptalajról közvetlenül
tápkockába, majd két hét után cserépbe ültettük és üvegházban, ill növénynevelı kamrában
kontrollált körülmények között felneveltük.
47
4.3 A transzgénikus jelölt növények nukleinsav szintő vizsgálatai
4.3.1 Genomi DNS izolálása
PCR-reakcióhoz a genomi DNS-t fitotroni kamrában nevelt háromleveles állapotú
transzgénikus jelölt növények (és utódaik) zászlósleveleibıl AquaGenomic (AG) oldattal
(MultiTarget Pharmaceuticals) izoláltuk. A levéldarabot (20 mg) 200 µl AG oldatban,
kvarchomokkal (Sigma), szobahımérsékleten dörzsöltük el. A habzást 25 µl propan-2-ol
adagolásával csökkentettük, a szuszpenziót Eppendorf csövekbe vittük át, és rövid keverés
után 65 oC-on 30 percig inkubáltuk. Négy perces centrifugálás után (13000 fordulat/perc) 100
µl felülúszót tiszta csıbe pipettáztunk, és a DNS-t 100 µl propan-2-ol hozzáadásával csaptuk
le. A centrifugálással ülepített DNS csapadékot kétszer 600 µl 70% etanollal mostuk,
szárítottuk és 80-100 µl steril TE (pH 8) oldatban 37 oC-os vízfürdıben oldottuk. A DNS
oldatok koncentrációját 260 nm-en UV spektrofotométerrel (NanoDrop) határoztuk meg.
Southern-blot analízishez a genomi DNS-t üvegházban nevelt hatleveles állapotú növények
zászlóslevelébıl (200 mg) Stacey és Isaac (1994) módszerével izoláltuk. A folyékony
nitrogénben eldörzsölt levélmintát 1 ml 2%-os CTAB (hexadecyl-trimetil-ammóniumbromid)
pufferrel (2% CTAB, 0,02 mol/l EDTA, 0,1 mol/l Tris, 1,4 mol/l nátrium-klorid, 50 mmol/l
DTT) és 100 µl kloroform:oktanol (24:1) eleggyel extraháltuk. A csöveket elıször 65 oC-on
30 percig, majd szobahımérsékleten 15 percig inkubáltuk. Fehérjementesítés céljából további
1 ml kloroform:oktanol elegy hozzáadása után óvatosan, zöldesszürke szuszpenzió
megjelenéséig rázogattuk, majd centrifugáltuk (13000 rpm, 7 perc). A felülúszót tiszta csıbe
pipettáztuk és 1 ml jégbehőtött 90%-os etanollal 4 oC-on inkubálva a DNS-t kicsaptuk. A
fázishatáron láthatóvá vált DNS szálakat Pasteur pipettával összegyőjtöttük,
etanol/nátriumacetát elegyben (76% etanol és 0,2 mol/l nátriumacetát) mostuk és szárítottuk.
A DNS-t 100-200 µl steril desztillált vízben 37 oC-on, RN-áz jelenlétében oldottuk fel. A
DNS töredezés mentességét 0,8%-os agaróz/TBE gélen megfuttatva ellenıriztük. A DNS
oldatok koncentrációját 260 nm-en UV spektrofotométerrel (NanoDrop) határoztuk meg.
4.3.2 PCR-reakció
A PPT szelektált transzgénikus jelölt T0 növényekben és utódaikban (T1, T2, T3 generáció) a
marker és riporter gének (bar és uidA) jelenlétét gén specifikus primerekkel (Sparks és Jones,
2004) PCR módszerrel vizsgáltuk. A transzgén (ama1) kimutatásához különbözı hosszúságú
terméket amplifikáló promóter-, gén- és terminátor specifikus primereket használtunk (4.1
48
táblázat). A reakciót 10 µl végtérfogatban végeztük 1x térfogatú Taq PCR puffer, 2 mM
MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,1 µM primerek, 1,25 U Go Taq polimeráz (Promega) és 80 ng
templát DNS használatával. A reakciókban 35 cikluson keresztül alkalmazott körülményeket
a 4.2 táblázat tartalmazza. A PCR-reakció után a termékeket 1,2%-os agaróz gélen
választottuk el, majd a DNS termékeket etidium-bromiddal tettük láthatóvá, s UV fényben
ellenıríztük.
4.1 táblázat PCR reakcióban használt primerek szekvenciája szelekciós bar primerek
barF barR
5’ GTCTGCACCATCGTCAACC 3’ 5’ GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC 3’
riporter gus primerek gusF gusR
5’ AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC 3’ 5’ ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA 3’
transzformációs kazetta specifikus primerek
AmaF1 AmaR3
Bx17HMW3'F NosR3
5' GGAGACTCTCTACGGATAATTG 3' 5' TGGATCCCAATTCTATTATCTC 3' 5' TCCCTATAAAAGCCCATCC 3' 5’ CCGCGCGCGATAATTTATCC 3'
4.2 táblázat. PCR reakció körülményei
gén
primerpár neve kapcsolási
hımérséklet (oC)
kapcsolási idı
(sec)
elongációs lépés ideje
idı (sec)
termék mérete
(bp)
bar barF-barR 60 60 40 444
uidA gusF-gusR 60 60 40 1050
ama1 kazetta
AmaF1-R3 AmaF1-NosR3
Bx17HMW3'F-NosR3
55 55 55
20 20 30
30 242 480 1260
4.3.3 Southern-blot analízis
A CTAB módszerrel kinyert genomi DNS (20 µg) emésztését egy éjszakán át EcoRI
restrikciós enzimmel végeztük. A DNS fragmentek agaróz gélen történı elválasztását
követıen a DNS-t kapilláris módszerrel pozitív töltéső Nylon membránra transzferáltuk
(SIGMA-ALDRICH-Techware). A membrán elıhibridizálása, digoxigenin (DIG) jelölt
próbával történı hibridizálása, a mosások, a háttér blokkolása, az anti-DIG alkalikusfoszfatáz
szubsztrát reakció (1:10 000) és a kemilumineszcens detektálás a gyártó (Roche) utasításai
szerint, a cég termékeit felhasználva történt. A DIG-jelölt próbát PCR reakcióval állítottuk
49
elı, melyben dNTP használata helyett saját készítéső jelölı keveréket (2 mM dATP, 2 mM
dCTP, 2 mM dGTP, 1,3 mM dTTP, 0,7 mM DIG-11-dUTP) alkalmaztunk. A jelölt 250 bp
hosszú DNS fragment felszaporítását AmaF1-AmaR3 gén specifikus primerekkel a 4.3.2
fejezet szerinti körülmények között végeztük. Az antitest- és szubsztrát reakciót követıen a
membránhoz specifikusan hibridizált DIG-jelölt próbát hyper érzékeny röntgenfilm
(Amersham Biosciences) segítségével tettük láthatóvá.
4.3.4 RT-PCR reakció
A transzgén transzkripcióját az mRNS-en végzett RT-PCR reakcióval igazoltuk. A
transzgénikus jelölt T0 növények szemtermését (T1 mag) 20 nappal virágzás után elemeztük.
A hosszában félbevágott egyik félszem endospermiumából teljes RNS-t, majd mRNS-t
izoláltunk polyA Spin mRNA Isolation Kit (NEB) használatával a gyártó utasításait követve.
A DNS szennyezıdéstıl megtisztított mintákon iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)
segítségével cDNS-t szintetizáltunk. A kapott cDNS molekulával a transzgénre specifikus
primerekkel (AmaF1-AmaR3) PCR reakciót végeztünk a 4.3.2 fejezetben ismertetett
protokoll szerint, de a templát cDNS mennyisége itt csak 1 pg volt. A reakciótermékeket
agaróz gélen analizáltuk. T1 növények esetén az mRNS-t 17, 24 és 31 nappal virágzás után
izoláltuk a kettévágott éretlen T2 búzaszem egyik felének endospermiumából. A másik
félszemben Western-blot analízissel a fehérje expresszióját vizsgáltuk. Fenti leírás szerint
mRNS izolálást, cDNS szintézist és elemzést levél- és gyökérszövet mintákból is elvégeztük.
Kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR)
Az ama1 gén transzkripciója idıbeli változásának nyomonkövetéséhez a T2 növények éretlen
T3 szemtermésének endospermiumából (10, 17, 24 és 31 nappal a virágzás után) teljes RNS-t,
majd mRNS-t izoláltunk és a mintákban a Terzi és mtsai. (2005) által publikált módszerrel
qRT-PCR reakció segítségével határoztuk meg az átírt mRNS mennyiségét. Referenciaként a
búza tubulin fehérje génjét használtuk, melyre olyan oligonukleotidokat terveztünk, amik a
gén 3’ végének szekvenciáját ismerik fel és az amplifikált termék hossza 100 bázispárnál nem
hosszabb (Tub1F: 5’ CSTCCATCCAGGAGATGTTC 3’ és Tub1R: 5’ AGRTCGTTCA
TGTTGCTCTC 3’ úgynevezett degenerált primerek). A cDNS-t tartalmazó oldatban az ama1
gén egy rövid (97 bp) fragmentjének amplifikálásához az
AmaF2 (5’ AAGCTGCTGC GTTGTTTAG 3’) és
AmaR1 (5’ ACTCGTAAATCTCTTAATAAACC 3’) oligonukleotidokat használtuk. Az
AmaF2 primer a gén 3’ közeli végéhez kapcsolódik. A reakció során keletkezett DNS
50
mennyiségét a reakcióelegyben lévı SybrGreen floureszcenciája alapján mértük. Minden
mintát és a kontrollt is öt ismétlésben elemeztük. Kalibrációra a 17 napos mintát használtuk
50, 100, 500, 1000, 2000 és 5000-szeres hígításban. A reakcióelegy (25 µl) 12,5 µl
SYBRGreen PCR Master Mixet (Applied Biosystems), 900 nM primereket és 100 ng templát
cDNS-t tartalmazott. A mintákat a kezdeti lépésben 5 percig 50 ˚C-on inkubáltuk, majd 10
percig 95 ˚C-on denaturáltuk. Az amplifikálást 40 cikluson keresztül végeztük (95 ˚C 20 sec
és 60 ˚C 1 perc) az amplifikációs görbe felvételéhez. A PCR reakció után a mintákat 60 ˚C-ról
95 ˚C-ra lassan (0,03 ˚C/s sebességgel) felmelegítettük, miközben folyamatosan mértük a
reakcióelegy fluoreszcenciáját. Ez adja az olvadási/disszociációs görbét, amit PE Biosystems
5700 software segítségével analizáltunk.
Az amplifikációs ciklusok alatt mért fluoreszcencia adatokat az Applied Biosystems 5700
rendszer detektálta és a ∆Rn számított értékeket kirajzolta a ciklus szám függvényében.
∆Rn=(R+n)─(R─n), ahol az R+n az amplifikált termék fluoreszcencia értéke az adott idıben, az
(R─n) pedig az alapvonal (háttér) emissziója (fluoreszcencia értéke) a 6-15 ciklusok között.
Meghatároztuk a Ct értéket minden egyes vizsgált mintára és ebbıl, az általunk készített
kalibrációs egyenes segítségével, kiszámoltuk a minták kiindulási templát koncentrációját.
4.4 A transzgénikus növények fehérje szintő vizsgálatai
4.4.1 A marker/riporter gének aktivitásának tesztelése
A bar gén expressziójának igazolása PAT teszt segítségével
A PCR pozitív T0 növények T1 magjaiból genotípusonként 16 db-ot tápkockában
csíráztattunk, majd a cserépbe ültetett növényeket hat leveles állapotban PPT tartalmú,
kereskedelmi forgalomban lévı permetezıszer (FINALE, glufozinát-ammónium totális
gyomirtó szer) hígított oldatával (1 g/l) kétszer permeteztük.
Az uidA gén expressziójának igazolása GUS festéssel
A T1 magokból permetezés nélkül és permetezés után felnevelt T1 növények T2 magjait
(genotípusonként minimum 12 szem) steril desztillált vízben duzzasztottuk két órán át, majd a
csíraoldallal szemben, keresztben vékony (1-1,5 mm) szeletet vágtunk le belıle. A vékony
metszetet Eppendorf csıbe tettük, 100 µl GUS festıoldatot mértünk rá és néhány órán át,
idınként rázogatva 37 oC-on inkubáltuk. A festıoldat végsı koncentrációja: 100 mM nátrium-
foszfát puffer (pH 7,0), 10 mM EDTA, 0,8 mM kálium-ferricianid, 0,8 mM kálium-
ferrocianid, 0,1 V/V% Triton X-100 és 2 mM X-Glca (5-bróm-4-klór-3-indolil-β-D-
51
galakturonid, melynek 50x tömény, 1 mg/ml koncentrációjú, dimetil-formamidos oldatát
használtuk). A 24 óra után megkékült szegmensekhez tartozó növények expresszálták a GUS
enzimet. A nagyobb, csírát tartalmazó részt kicsíráztattuk és tápkockában, majd cserépben
felneveltük.
4.4.2 A transzgén (ama1) expresszió igazolása Western-blot analízissel
A fehérje expresszió bizonyítása Western-blot analízissel történt. A regenerált búzanövények
éretlen illetve érett szemterméseit a csírarész eltávolítása után dörzsmozsárban eldörzsöltük.
A teljes fehérjét 2 m/V% SDS és 100 mM DTT tartalmú 62,5 mM Tris-HCl pufferrel (pH 6,8)
extraháltuk (25 µl puffer/mg minta). Centrifugálás után (10000g, 10 oC, 15 perc) a felülúszót
összegyőjtöttük. A fehérje minták molekulaméret szerinti szétválasztását SDS poliakrilamid
gélelektroforézissel végeztük Laemmli (1970) módszerével. A fehérjeminták koncentrációját
megmértük, majd azonos (10 mg/ml) koncentrációjú oldatokat készítettünk. A mintákat 30 µl
SDS minta pufferben 4-5 percig 95 oC -os vízfürdın denaturáltuk, majd centrifugáltuk (4400
rpm, 3 perc). Az elıkészített mintákat (7-10 µl/fehérjeizolátum) és a molekulatömeg
standardot (5 µl Fermentas 20-100 kDa) 1 mm vastagságú 12% akrilamid tartalmú szeparáló
gélre vittük. Az elektroforézist két géles rendszerben, a győjtı gélben 40 mA, a szeparáló
gélben 60 mA állandó áramerısséggel végeztük.
Az elválasztott fehérjéket polivinilidén-difluorid (PVDF) membránra BioRAD Trans-Blot SD
Semi-Dry Transfer Cell készülékben 130 mA állandó áramerısségen 15 percig „Towbin”
puffer segítségével transzferáltuk. Ezt követıen, a membránon lévı fehérjéket Towbin és
mtsai. (1979) leírása szerint detektáltuk. A membránt a transzfer után egy éjszakán keresztül
10% zsírmentes tejport tartalmazó TBST (Tris buffered saline with Tween 20) oldatban
áztattuk. Ezután a membránt 3x15 percig TBST oldatban mostuk, majd az elsı, AmA1
fehérjére specifikus poliklonális antitestet 1:200 hígításban tartalmazó TBST oldatban 1 órán
keresztül, szobahımérsékleten inkubáltuk. A membránt 3x15 perces mosás után (TBST oldat)
1:7000 arányban hígított alkalikus foszfatáz enzimmel konjugált másodlagos antitesttel
(Sigma) egy órán át tovább inkubáltuk. Három mosás után a membránra transzferált antigén
specifikus fehérjéket BCIP (5-bróm-4-klór-3-indolilfoszfát) és NBT (p-nitrotetrazólium-kék)
szubsztrátok segítségével tettük láthatóvá. A szubsztrátokat tartalmazó 200 µl törzsoldatot
(9,4 mg/ml BCIP és 18,75 mg/ml NBT dimetil-szulfoxidban oldva) 10 ml TMN oldatban (0,1
M Tris-HCl, pH 9,5, 0,05 M MgCl2 és 0,1 M NaCl) kevertük el.
52
4.4.3 A szemtermés fizikai vizsgálatai
A transzgénikus búzanövények T2, T3 és T4 szemtermésének keménységét a széles körben
használt standard búza vizsgálati módszer szerint (AACC 55-31) Perten SKCS 4100
készülékkel határoztuk meg. A vizsgálathoz 160-300 búzaszemet használtunk és azok alábbi
paramétereit mértük: szemátmérı (mm), ezerszemtömeg (g) és szemkeménység (keménységi
index, mértékegység nélküli szám).
4.4.4 Liszt vizsgálatok
A transzgénikus búzanövények fehérje- és aminosav összetételének, valamint funkcionális
tulajdonságainak jellemzéséhez a növények szemtermését laboratóriumi Mini-malmon
ıröltük, majd a lisztet mikro-szitán szitáltuk (METEFÉM Kft., Magyarország).
Teljes fehérjetartalom
A lisztminták fehérjetartalmát 14% nedvességtartalom mellett Kjeldahl módszerrel határoztuk
meg (N faktor 5,7).
AmA1 fehérje mennyiségi meghatározása
A transzgénikus búzában expresszálódó AmA1 fehérje relatív mennyiségét (a teljes fehérje
százalékában) indirekt ELISA módszerrel határoztuk meg. A lisztmintákból a 4.4.2 fejezet
szerint extrahált teljes fehérje inkubálását, mosását, blokkolását és az antigén reakciót
(kecskében termelt anti-nyúl IgG-HRP konjugátummal, 1:7000 hígítás, PBST-ben) Kang és
mtsai. (2003) szerint végeztük. Elıhívás/színreakció után a minták abszorbanciáját Bio-Rad
készülékkel 492 nm hullámhosszon határoztuk meg, melyekbıl az alábbi egyenlettel relatív
fehérje mennyiséget számoltunk: % = (ODsample – ODneg) / (ODpos - ODneg) x 100. Pozitív
kontrollként bakteriális expresszióval termelt AmA1 fehérjét (100 ng) használtunk.
Esszenciális aminosav tartalom
A lisztminták esszenciális aminosav összetételének meghatározásához Adebowale és mtsai.
(2007) módszerét alkalmaztuk. A mintákat 110 oC -on 1% fenol tartalmú 6M HCl oldattal
hidrolizáltuk, vákuumban szárítottuk, majd dietil-etoximetilénmalonáttal kezeltük. Az amino
savakat fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) módszerrel választottuk el. Az összetételt tömeg
%-ban 100g fehérjére vonatkoztatva adtuk meg.
Méretkizárásos – HPLC (SE-HPLC)
A lisztminták polimer/monomer (glutenin/gliadin, Glu/Gli) arányát SE-HPLC kromatográfiás
módszerrel határoztuk meg Batey és mtsai. (1991) által leírt módon. A teljes fehérjefrakció
53
kinyerésekor 10 mg liszthez 1ml 0,5 m/V% SDS-foszfát puffert (pH 6,9) adtunk, majd 15
másodpercig szonikáltuk. Centrifugálás után a felülúszót 0,45 µm PVDF szőrın szőrtük. Az
analízishez Phenomenex BIOSEP-SEC 4000 oszlopot alkalmaztunk. A futtatás ideje 10 perc
(áramlási sebesség 2 ml/perc). Az alkalmazott eluens vizes acetonitril puffer volt (0,05 V/V%
trifluórecetsav vízben és 0,05 V/V% acetonitrilben). Az oszlopról eluálódott fehérjéket 214
nm hullámhosszon detektáltuk.
Az oldhatatlan polimer frakció (UPP) mennyiségének meghatározásához Gupta és
MacRitchie (1994) módszerét alkalmaztuk. A mintafeltáráshoz az elıbbi SDS/foszfát puffert
használtuk. Az extrahálás két lépésben, elıször szonikálás nélkül (oldható fehérje frakció),
majd a centrifugálás után visszamaradt csapadék szonikálásával történt (oldhatatlan fehérje
polimer frakció). A kromatográfiás elválasztás és detektálás körülményei a fentiekkel
megegyeztek. Az UPP % értéket az oldhatatlan fehérje frakció polimer mennyiségének és az
összes fehérje polimer frakció mennyiségének arányából határoztuk meg. A kromatogrammok
polimer és monomer fehérjéire jellemzı csúcsok számszerősített görbe alatti területeibıl a
polimer- és monomer fehérjék arányát, azaz a Glu/Gli arányt a Glusol+insol/Glisol+insol képlettel
számoltuk ki (Larroque és Békés, 2000).
Fordított fázisú – HPLC (RP-HPLC)
A HMW- és LMW gluteninek egymáshoz viszonyított mennyiségét Marchylo és mtsai.
(1989) módosított módszerével határoztuk meg. A gliadinokat 50 mg lisztbıl 1 ml 70 V/V%
etanollal, majd kétszer 1 ml propán-1-ol vizes oldatával (50 V/V%) extraháltuk. A
csapadékban maradt glutenin polimereket redukáltuk és a monomereket szolubilizáltuk (50
V/V% propan-1-ol, 2 M karbamid és 0,2 M Tris-HCl, pH 6,6) 100 mM DTT jelenlétében,
majd a fehérjéket 10 µl 4-vinilpiridinnel alkileztük. Centrifugálást és szőrést követıen (0,45
µm PVDF szőrın) a fıleg HMW- és LMW glutenin alegységekbıl álló szőrletet Supercosil
LC-308 (300 A, 3.5% carbon, 5 µm, 5×4.6) oszlopon választottuk el.
Statisztikai elemzések
A fenti lisztvizsgálatokat három ismétlésben végeztük el. A mérési eredmények értékelése
különbözı statisztikai módszerekkel (korrelációs számítások, variancia analízis), a
STATISTICA version 7.0 software (Statsoft Inc., USA) segítségével történt.
Mikro Zeleny szedimentációs teszt
A lisztminták szedimentációs vizsgálatát, ami a lisztek poliszacharidjainak és fehérjéinek
duzzadási tulajdonságaival kapcsolatba hozható információt ad, a Sedicom System automata
készülékkel (Lab-Intern Kft., Magyarország), mikro módszerrel végeztük Tömösközi és
mtsai. (2005) által leírt módon. Az Európában Zeleny teszt néven elterjedt módszer a hazai
54
(MSZ ISO 5529:1993) és a nemzetközi szabványok között is szerepel (ICC-Standard No.116,
AACC Method 56-61A).
A vizsgálathoz 0,4±0,001g lisztmintát mértünk a zárható mérıhengerekbe. A liszthez 6,25 ml
brómfenolkék oldatot (5 mg/l vizes oldat) adtunk, majd az automata rázókészülékkel 5 percig
rázattuk. Ezután a mintához 3,15 ml szedimentációs reagenst adagoltunk (tejsav) és 10 percig
tovább rázattuk. (Tejsav reagens készítése: 250 ml 85 V/V% tejsavat 1 literre egészítettünk ki
és 6 órán keresztül visszafolyós hőtıvel forraltuk a tejsav molekula asszociátumok
disszociáltatása céljából. A hígított tejsav 180 ml-éhez 200 ml propan-2-olt adtunk, majd 1
literre egészítettük ki, s állni hagytuk 48 óráig). A szedimentációs tejsav reagenssel történı 10
perc rázatás után a mérıhengereket függıleges helyzetben a moduláris készülék
fotométerének tartójába helyeztük. Öt perc állás után az üledék térfogatát a digitális
képfeldolgozó rendszer automatikusan leolvasta, s az eredményeket a csatlakoztatott
számítógépen tárolta. A szedimentációs index az üledék ml-ben kifejezett térfogatának
számértéke. A párhuzamos mérések átlagát szabványos eredménynek akkor fogadjuk el, ha
különbségük nem haladja meg a 0,2 ml-t.
4.4.5 A búzalisztbıl készült tészták dagasztási tulajdonságainak vizsgálata
A funkcionális kísérletekhez a transzgénikus búzanövények T3 szemtermésének 90%-át Mini-
malmon ıröltük és mikro-szitán szitáltuk meg (METEFÉM Kft., Magyarország). A kontroll
vizsgálatokhoz a donor (nem transzformált) növények és a transzformációs procedúrán
átesett, de transzgénre PCR negatív búzanövények szemtermésébıl ıröltünk lisztet (null
minták). A még így is limitált mennyiségben rendelkezésünkre álló lisztmintákból készült
tészták dagasztási tulajdonságainak vizsgálatát mikro-Valorigráf (mikro z-arm mixer)
prototípusán végeztük (Tömösközi és mtsai., 2000; Haraszi és mtsai., 2004). A mérésekhez
használt liszt mennyisége 4 g volt. A vízfelvétel meghatározása egy bevezetı mérés
formájában történt (a helyes vízabszorpció a felvett görbe maximális ellenállásából (PR)
számítható, 4.2 ábra). A maximális keverési ellenállás és a vízfelvevı képesség közötti
negatív, lineáris összefüggés van (Gras és mtsai. 2000).
A mikro z-arm mixer által szolgáltatott jelek regisztrálása a Scom, a dagasztási jellemzık
meghatározása az IZARM program (CSIRO, Ausztrália) segítségével történt. A mérést
valamennyi minta esetében állandó fordulatszámon (88-89 rpm), két-három ismétlésben
végeztük. A regisztrált görbék alapján a dagasztási paramétereket az említett szoftverek
segítségével határoztuk meg. A mikro-Valorigráf és egy, a készülékkel regisztrált tipikus
alapgörbe a leolvasható reológiai paraméterek értelmezésével a 4.2 ábrán látható.
55
4.2 ábra A mikro z-arm mixerrel felvett alapgörbe DDT: a maximális tésztaellenállásig eltelt idı (Dough Development Time, sec). PR: maximális
tésztaellenállás (Peak Resistance, VU). ST: stabilitás, az a hossz, mely a PR elıtti és utáni görbeelhajlásig tart (Stability, sec). BD: tésztaellágyulás, a PR utáni 10 perces görbeszakasz és a
maximumhoz húzott egyenes közötti területérték (Break Down in Resistance) (VU x sec).
A mikro-Valorigráf (mikro z-arm mixer) állandó fordulatszámon, a tengelyen ébredı erıvel
arányos és a motor teljesítményében bekövetkezı áramerısség-változást méri. A vízadagolás
pillanatától kezdıdıen, egy kaotikus szakasz után, a görbe növekvı tendenciája jelzi a
tésztaképzıdés megindulását. A vízadagolástól a maximális konzisztencia eléréséig eltelt idı
a minta dagasztási szükséglete (DDT, dough development time) míg a regisztrált maximális
ellenállásérték (PR, peak resistance) az úgynevezett maximális konzisztencia. Ha a dagasztást
folytatjuk a maximális ellenállás értéke csökken. Ez a hosszabb-rövidebb ideig tartó plató a
tészta stabilitását (ST) jellemzi (D’Appolonia és Kunerth, 1984). Az ellágyulás (BD, break
down) mértéke, vagyis a konzisztencia-csökkenés meredeksége az úgynevezett tolerancia
indexet adja meg.
DDT
56
5 EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK
5.1 Növényregenerációs rendszer kidolgozása ıszi búza genotípusokhoz
Minden sikeres növényi transzformációs módszer elsıdleges követelménye, hogy jól
regenerálódó szövettenyészetbıl induljon ki, hogy rendelkezésre álljon jól mőködı in vitro
növény-sejt-növény rendszer. A kontrollált körülmények között tartott sejt- és
szövettenyészetek a növényi biotechnológia és a géntechnológia alappillérei. A búza genetikai
állományának módosítása, azaz transzformálása leggyakrabban az éretlen embriókból nyert
kalluszok belövésével vagy fertızésével kezdıdik. Ezekbıl a kalluszokból kell aztán növényt
regenerálni és felnevelni úgy, hogy azok tartalmazzák a transzgént. Függetlenül attól, hogy a
transzgént tartalmazó sejteket a nem transzformált sejtek közül milyen módszerrel válogatjuk
ki (szelekció), a legfontosabb az, hogy képesek legyünk belövés nélkül is nagyszámú növényt
regenerálni. Ezért kísérleteinkben elıször azt teszteltük, hogy a kiválasztott magyar ıszi
búzafajták (Mv Emese, Mv Magvas, Mv Martina, Mv Pálma, két Mv Emma genotípus és a
Bánkúti 1201 búzafajta három törzse: B2, B8, B70) éretlen embriói hogyan kalluszosíthatók,
valamint a képzıdött kalluszokból milyen körülmények között lehet a legtöbb növényt
regenerálni. A búzafajták regenerációs képességét a korábban Hartog tavaszi búzára
kidolgozott és búza transzformációban sikeresen mőködı (Tamás és mtsai., 1999)
regenerációs rendszerünket használva teszteltük. Ez a növényregenerációs rendszer a Larkin
(1982) által publikált módszeren alapul. A teszt kísérletben a szövettenyésztés egymást
követı három fázisában (kalluszindukció, hajtásregeneráció és gyökérregeneráció) egyaránt
26±1 oC hımérsékletet alkalmaztunk, mert a szövettenyésztés hımérsékleti tartománya az
irodalom szerint általában 20-30 oC közötti, s mindhárom szakaszban azonos érték. A
hımérsékleti optimum fajonként változik (Chalupa, 1987). A donor növények kalászait 8-10
nappal virágzás után győjtöttük be, és a steril körülmények között preparált éretlen embriókat
BEG 2 táptalajon (Függelék I. táblázat), sötétben kalluszosítottuk. Az egy hét sötétben történı
inkubálás során hajtást adó embriókat eldobtuk, melyek aránya az eredeti embriók számához
képest mind a kilenc vizsgált búza genotípus esetén 8-10% volt. A sötétben, 5 hét alatt
képzıdött kalluszokat MS9 táptalajt tartalmazó Petri csészékben, alacsony intenzitású fénnyel
(20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus) világítottuk meg 4 héten keresztül hajtásregeneráció
céljából. A képzıdött hajtásokat hormonmentes MS táptalajon, a hajtásregenerációval azonos
körülmények között 4 hétig gyökereztettük. Kísérleteinkben ilyen körülmények között a
legnagyobb regenerációs hatékonyságot (61%) a Bánkúti 1201/B8 törzs mutatta, míg a többi
57
búzafajta regenerálhatósága nagymértékben eltért egymástól (0-15%). A teszt kísérlet
eredményeit az 5.1 összefoglaló táblázat elsı oszlopában mutatjuk be.
5.1 táblázat A hajtásregenerációban alkalmazott táptalaj összetétel és az inkubációs hımérséklet hatása a növényregenerációra.
hajtás regeneráció hatékonysága (%) 26±±±±1 °C���� 23±±±±1 °C�������� fajta/törzs
MS9 MS9N MS92 MS92N MS9 MS9N MS92 MS92N Mv Emese 12,3 6,2 34,5 29,4 37,2 35,2 96,0 90,1 Mv Emma (5+10)
0,0 0,0 18,1 13,2 20,3 27,2 81,2 78,2
Mv Emma (2+12)
0,0 0,0 18,2 11,0 26,3 32,2 88,2 81,1
Mv Magvas 5,0 2,1 21,5 17,3 47,1 34,3 78,2 73,2 Mv Martina 6,1 1,3 26,4 21,2 45,2 37,1 88,1 85,2 Mv Pálma 0,0 0,0 19,4 14,1 28,4 27,2 62,3 56,1 B1201/B2 5,4 0,0 20,2 23,4 36,0 41,4 80,2 88,1 B1201/B70 0,0 0,0 10,2 21,1 33,2 39,3 48,2 54,3 B1201/B8 61,0 18,3 30,4 28,4 39,2 58,2 86,0 93,2
átlag 10,0 3,1 22,1 19,9 34,8 36,9 78,7 77,7 ����Az embriókat, kalluszokat és hajtásokat 26±±±±1 °C-on tenyésztettük. LSD5%=7.2 ��������Az embriókat, kalluszokat és hajtásokat 23±±±±1 °C-on tenyésztettük. LSD5%=7.8 A fényszakaszban minden esetben azonos megvilágítást (20 µmol m-2 s-1) alkalmaztunk 16/8 óra fotóperiódussal.
Találtunk olyan fajtákat, mint például az Mv Emma, az Mv Pálma és a Bánkúti 1201/B70
törzs, melyek éretlen embrióiból egyetlen növény sem regenerálódott a fentebb ismertetett
körülmények között. Az Mv Emese, az Mv Magvas búzafajták és a Bánkúti 1201/B2 törzs
éretlen embriói 5-12%-os regenerációs hatékonyságot mutattak. A regeneráció átlagos
hatékonysága ebben a kísérleti beállításban mindössze 10% volt, mely nem szolgáltatott
megfelelı alapot a búza transzformációs munkák elkezdéséhez. Irodalmi adatok alapján a
sikeres búza transzformációs kísérletekben alkalmazott fajták növényregenerációs
hatékonysága 60% fölött kell legyen (Pellegrineschi és mtsai., 2002).
5.1.1 A hajtásregeneráló táptalaj összetétel hatása a növényregenerációra
A búza in vitro regenerálódó képessége elsısorban a búza genotípusától és a kallusz
képzésére felhasznált növényi rész típusától függ, de nagymértékben befolyásolják azt a
növényregenerációban alkalmazott táptalajok összetétele, valamint a szövettenyésztés
körülményei is (Potrykus, 1990). Így egy hatékony növényregenerációs rendszer kidolgozása
sokkal inkább módosításokat, mint sem teljesen új módszerek alkalmazását igényli. Adott
genotípusok és kimetszett növényi rész felhasználása mellett például módosíthatjuk az egyes
58
szövettenyésztési fázisokban használt táptalajok összetételét (hormonok, szénhidrátok,
vitaminok, mikro- és makroelemek minısége és mennyisége) (Rasco-Gaunt és mtsai., 1999a;
Zhang és mtsai., 1999), valamint a szövettenyésztés környezeti körülményeit (hımérsékleti-
és fényviszonyok) (Tamás és mtsai., 2000).
Az irodalmi adatok figyelembevételével ezért a fentiekben ismertetett kevésbé sikeres teszt
kísérlet után elıször a hajtásregeneráló táptalaj összetételét változtattuk, míg a többi
paraméteren nem módosítottunk. A három egymást követı szövettenyésztési fázisban ismét
26±1 oC hımérsékletet alkalmaztunk. A kalluszok indukcióját és tenyésztését ugyanúgy a
BEG2 táptalajon, sötétben végeztük, és nem változtattunk a fényszakaszban alkalmazott
inkubáció fény- és hımérsékleti viszonyain sem. A képzıdött kalluszokat, hasonló
körülmények között neveltük, mint a teszt kísérletben a hajtások regenerációjához. Az
alkalmazott táptalajban azonban kétféle auxin valamelyikét (indolecetsav, IAA; naftilecetsav,
NAA), valamint más-más makroelem koncentrációt alkalmaztunk. A változtatás hatását a
regeneráció hatékonyságára módosított MS9-típusú táptalajon (MS9N, MS92, MS92N)
tanulmányoztuk. Ezek a táptalajok a használt auxin típusában (IAA, NAA) és az MS
makroelemek koncentrációjában tértek el egymástól. Az MS9 és MS92 táptalaj IAA-t, míg az
MS9N és MS92N ugyanolyan moláris koncentrációban NAA-t tartalmazott. A makroelemek
koncentrációja az MS9 és MS9N táptalajokban az eredeti MS táptalajoknak megfelelı volt,
de az MS92 és MS92N táptalajok az elızıkhöz képest csak a fele mennyiségben tartalmazták.
Az újabb háromféle táptalajon minden genotípus regenerációs képességét három ismétlésben
vizsgáltuk, az eredményeket az 5.1 összefoglaló táblázat 2-4 oszlopában mutatjuk be.
Vizsgálataink szerint az IAA lecserélése NAA-ra az eredeti makroelem tartalmú táptalajban
(MS9 helyett MS9N) nem javította, hanem rontotta a növényregeneráció hatékonyságát. A
kiválasztott kilenc genotípus közül öt genotípus éretlen embrióiból egyáltalán nem lehetett
növényeket regenerálni (Mv Emma búzafajta mindkét genotípusa, Mv Pálma, Bánkúti
1201/B2 és B70 törzs), s az átlagos regenerációs hatékonyság értéke 10%-ról 3%-ra csökkent.
Ugyanakkor az MS makroelemeket fele koncentrációban tartalmazó táptalajok (MS92,
MS92N) alkalmazása a hajtásregeneráló fázisban nagymértékő pozitív változást
eredményezett. Fenti paraméterek mellett minden genotípus éretlen embriói kalluszosodtak és
a kalluszok 10-35%-ából lehetett növényeket regenerálni. Ez minden genotípusnál
szignifikáns pozitív változást jelent (5% szignifikancia szinten) a makroelemeket eredeti
koncentrációban tartalmazó táptalajokkal elért eredményekhez képest. A legalacsonyabb
regenerációs hatékonyságot a Bánkúti 1201/B70 törzse mutatta (10%, MS92 táptalajon), a
legjobban pedig, az Mv Emese búzafajta éretlen embrióiból nyert kalluszok regenerálódtak
59
(35%, MS92 táptalajon). Az átlagos regenerációs hatékonyság a makroelemeket fele
koncentrációban tartalmazó táptalaj alkalmazása mellett 22% és 20% volt, melyek
szignifikánsan magasabbak, mint az eredeti MS táptalajok használatakor kapott értékek (10%
és 3%). Eredményeink jól egyeznek Constabel és Shyluk, (1994) adataival, miszerint az
ásványi sók mennyiségének csökkentése a táptalajban segíti a hajtás és a gyökér
regenerációját. He és mtsai. (1989) a búza éretlen embriók és protoplasztok embriogén
kapacitását találták magasabbnak a makroelem koncentráció alacsonyabb értéke mellett.
Az auxin típusának változtatása általában nem eredményezett szignifikáns javulást a vizsgált
ıszi magyar búzafajták növényregenerációs képességében. Két esetben azonban szignifikáns
változást kaptunk, 5.1 táblázat, 2-4 oszlop adatai. Csökkentett makroelem koncentráció
mellett az Mv Emma búzafajta egyik genotípusának (2+12 HMW-GS összetételő)
regenerációs képessége szignifikánsan magasabbnak bizonyult IAA használata mellett (MS92
táptalaj, 18%), mint NAA használatakor (MS92N táptalaj, 11%). Ugyanakkor a Bánkúti
1201/B70 törzs a NAA használata mellett (MS92N táptalaj) mutatott szignifikánsan
magasabb regenerációs képességet (10 helyett 21%). A többi genotípusra általában csak az
mondható el, hogy minden Martonvásári búzafajta az MS92 hajtásregeneráló táptalaj
használatakor, ha nem is javult szignifikánsan, de magasabb regenerációs hatékonyságot (18-
35% szemben a 11-29%-kal) mutatott. Ugyanakkor a Bánkúti 1201 régi magyar búzafajta
mindhárom törzsének regenerációs hatékonysága az MS92N táptalajon volt a legjobb (21-
28% szemben a 10-30%-kal).
Annak ellenére, hogy az átlagos regenerációs hatékonyság a makroelem koncentráció
csökkentésével 3-10%-ról 20-22%-ra javult, az in vitro szövettenyésztés során több minıségi
problémát is tapasztaltunk. A sötétben indukált kalluszok mindössze egy-két százaléka volt
embriogén, azaz a kompakt kalluszok felszínén csak néhány esetben figyeltünk meg apró
fehér kinövéseket (embrioidok). A legtöbb kallusz (a kalluszok több mint fele), vagy már a
kalluszindukció alatt, vagy pedig a fényszakaszban szinte teljesen elvizesedett és/vagy
megbarnult.
5.1.2 Az inkubációs hımérséklet csökkentésének hatása a növényregenerációra
A fentiekben ismertetett minıségi problémák kiküszöbölése érdekében a következı
kísérletben a szövettenyésztés mindhárom egymást követı fázisában alacsonyabb inkubációs
hımérsékletet alkalmaztunk. Az embriókat, a kalluszokat és a zöld képzıdményeket 26±1 oC
helyett ennek a kísérletnek minden szövettenyésztési fázisában 23±1 oC hımérsékleten
60
tartottuk. Kalluszindukció céljából az embriókat BEG2 táptalajon inkubáltuk, és a
hajtásregenerációban ugyanazt a négyféle táptalajt használtuk (MS9, MS9N, MS92, MS92N),
mint az elızı, magasabb hımérsékleten végrehajtott kísérletekben. A megvilágítás intenzitása
és fotóperiódusa is ugyanaz volt (20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus). Kísérleteink során
megfigyeltük, hogy az alacsonyabb hımérséklet alkalmazása egyértelmően jó hatással volt a
kalluszok indukciójára. A sötét szakaszban a kalluszok lassabban fejlıdtek ugyan, de külsı
megjelenésük ígéretesebb volt (keményebb szövet, ’grízes’ felszín). Az embriogén kalluszok
száma minden genotípus esetében meghaladta a 15%-ot, és átlagosan 18-22% volt. A
szövettenyésztés mind sötét, mind fényszakaszában a kalluszok sokkal kisebb hányada
(maximum 5-6%) vizesedett el, és csökkent a barna, nekrotikus elhalást mutató kalluszok
száma is. Mindezen minıségi változások mellett, és valószínőleg hatására, az átlagos
növényregenerációs hatékonyság is javult. Míg a 26±1 oC hımérsékleten elvégzett összes
(mindenegyes genotípus és minden táptalaj alkalmazása melletti) kísérlet eredményeit
átlagolva az átlagos regenerációs képesség 13% volt, addig a 23±1 oC hımérsékleten
elvégzett összes kísérlet eredményeit átlagolva jóval magasabb értékeket kaptunk (57%) (5.1
táblázat). Mindemellett nagyon fontos hangsúlyozni, hogy a növényregeneráció hatékonysága
(20-96%) ebben a kísérleti beállításban is nagymértékben függött a genotípustól. A
legalacsonyabb regenerációs képességet (20%, MS9N táptalajon) az Mv Emma búzafajta
(5+10 genotípusa) mutatta, míg a legjobban az Mv Emese búzafajta regenerálódott (96%,
MS92 táptalajon). A genotípus mellett ezen az alacsonyabb hımérsékleten is erıteljesen
befolyásolta a kísérletbe vont búzafajták regenerációs hatékonyságát az alkalmazott táptalajok
összetétele. Az auxin típusának megváltoztatása (IAA helyett NAA) az eredeti koncentrációjú
MS táptalajok esetén (MS9 helyett MS9N) a búzafajták átlagos regenerációs képességét nem
javította (35% ill. 37%). Az egyes genotípusokra kapott regenerációs értékek közötti
különbségek azonban az mutatják, hogy míg a Martonvásári búzafajták növényregenerációja
kis mértékben romlott (28-45%-ról 27-37%-ra), kivétel ezalól az Mv Emma két genotípusa,
addig a Bánkúti 1201 búzafajta három törzsének regenerációs képessége valamelyest javult az
MS9N táptalajon (33-39%-ról 39-58%-ra). A pozitív változás csak egy búzafajta esetében
(Bánkúti 1201/B8 törzs) volt szignifikáns, a növényregeneráció mértéke 39%-ról 58%-ra
emelkedett. Szignifikáns pozitív változást ezen az alacsonyabb inkubációs hımérsékleten
(23±1 oC) a makroelemek koncentrációjának felére csökkentése hozott, mely érvényes
minden genotípusra. A koncentráció csökkentése az átlagos regenerálhatóságot 35-37%-ról
78%-ra növelte. Ilyen körülmények között a legalacsonyabb regenerációs hatékonyságot
(48% MS92 táptalajon, 54% MS92N táptalajon) most is a Bánkúti 1201/B70 törzs mutatta.
61
Legeredményesebben ismét az Mv Emese búzafajta éretlen embrióiból nyert kalluszok
regenerálódtak (96%, MS92 táptalajon). Az IAA helyettesítése NAA-val, a makroelemeket
fele mennyiségben tartalmazó táptalajokban (MS92 helyett MS92N), hasonló változást
eredményezett a vizsgált búzafajták regenerációs hatékonyságában, mint az eredeti MS
koncentrációjú táptalajokban. Azt tapasztaltuk, hogy a Martonvásári búzafajták éretlen
embriói az IAA tartalmú hajtásregeneráló táptalaj (MS92) alkalmazása mellett regenerálódtak
jobban. Regenerációs hatékonyságukat 62-96% közötti értéknek találtuk, szemben az NAA-t
tartalmazó táptalajok (MS92N) használata során kapott 56-90% növényregenerációval. A
Bánkúti 1201 búzafajta három törzsének éretlen embriói az NAA tartalmú táptalajon
(MS92N) regenerálódtak jobban (54-93% szemben a 48-86%-kal). Szignifikáns javulást
azonban csak a B2 törzs esetén tapasztaltunk (80% helyett 88%). A többi genotípus éretlen
embrióiból nyert kalluszok növényregenerációs képességét az alkalmazott auxin típusa nem
befolyásolta szignifikánsan, 5% szignifikancia szinten. Annak ellenére, hogy a Martonvásári
búzafajták és a Bánkúti 1201 búzafajta három törzse eltérı regenerációs képességet mutatott a
két különbözı auxint tartalmazó hajtásregeneráló táptalajon, ha minden egyes vizsgált
genotípus kísérleti eredményeit figyelembe vesszük a növényregeneráció átlagos
hatékonysága közel azonos volt a két különbözı auxint tartalmazó hajtásregeneráló táptalajon
(79% MS92 táptalajon és 78% MS92N táptalajon).
Ebben az alacsonyabb inkubációs hımérsékletet alkalmazó kísérleti beállításban nagyon
fontos eredményre jutottunk. Összességében azt mondhatjuk, hogy a szövettenyésztés
mindhárom fázisában 23±1 oC-ra csökkentett hımérséklet hatása szignifikáns pozitív
változást eredményezett a növényregeneráció mértékében: az átlagérték 13%-ról (26±1 oC)
57%-ra nıtt. (Az átlagértékek számításánál mindenegyes genotípusra és a
hajtásregenerációban alkalmazott minden táptalajra kapott regenerációs eredményeket
figyelembe vettük.) Ez az átlagérték azonban még mindig 60% alatt van. Ezért egy további
kísérleti beállításban az embriogén kalluszok számának növelése céljából a kalluszindukció
során még alacsonyabb (20±1 oC) hımérsékletet alkalmaztunk, míg a szövettenyésztés
késıbbi fázisaiban ugyanúgy, mint elızıekben, 23±1 oC hımérsékletet biztosítottunk. A
kalluszindukcióban BEG2 táptalajt, a hajtásregenerációban MS92 táptalajt használtunk és a
fényviszonyokon nem változtattunk. A sötétfázisban alkalmazott még alacsonyabb
hımérséklet hatására az embriogén kalluszok száma tovább nıtt (25-30%), de a regeneráció
hatékonysága nem javult, hanem 10-14%-kal volt alacsonyabb, mint azokban a kísérletekben,
amikor a kalluszindukciót 23±1 oC hımérsékleten végeztük (az eredményeket nem közöljük).
A negatív mennyiségi változások mellett megfigyeltük azt is, hogy a regenerált növények
62
nagy része nem a sötét szakaszban indukált kalluszok felületén képzıdött embrioidokból
fejlıdött tovább. Az embriószerő képzıdmények elhaltak, s a hajtáskezdemények a kalluszok
más területein jelentek meg elıször zöld foltok, majd zöld kinövések formájában. Ezeket a
megfigyeléseket figyelembe véve arra következtethetünk, hogy az alkalmazott
szövettenyésztési viszonyok között az általunk tesztelt búzafajták növényregenerációja
valószínőleg túlnyomórészt organogenézisen és nem embriógenézisen keresztül játszódik le.
A növényregeneráció hatékonyságára kapott alacsonyabb értékek és fenti megfigyeléseink
miatt a hımérséklet 23±1 oC alá csökkentését a késıbbiekben nem alkalmaztuk, mert ha a
növényeket organogenézisen keresztül regeneráljuk a kalluszokból, az mozaikossághoz
vezethet. A mozaikosságot a növényi transzformációban kerülni kell, hogy az idegen DNS-
molekulát a géntechnológiával módosított növény minden sejtje hordozhassa. Ez csak akkor
valósulhat meg, ha a szövettenyésztés optimális körülményeinek kidolgozásakor alapvetıen
embriógenézist indukálunk, hogy szomatikus embriógenézissel fejlıdhessen tovább a
transzformált sejt (Shewry és Jones, 2005).
5.1.3 A fényintenzitás változtatásának hatása a növényregenerációra
A szövettenyésztés hajtásregeneráló fázisában alkalmazott megvilágítás spektrális összetétele,
intenzitása és fotóperiódusa egyaránt befolyásolja a kallusz sejtek differenciálódását. Noha a
kutatók nagy része ma már nem vizsgálja az optimális fejlıdéshez és differenciálódáshoz
szükséges fény minıségét és mennyiségét, ennek fontosságáról számos korai riport számolt
be (Thorpe, 1980; Hughes, 1981). Munkánk külön kísérleti beállításaiban mind a kilenc búza
genotípus kalluszainak regenerációs képességét alacsony (20 µmol m-2 s-1) 16/8 óra
fotóperiódussal, vagy magas (50 µmol m-2 s-1) intenzitású fényt állandó megvilágítással
használva vizsgáltuk. A fenti kísérletek hajtásregeneráló fázisában mindig alacsony
intenzitású megvilágítást alkalmaztunk 16/8 óra fotóperiódussal. Ekkor az inkubációs
hımérséklet csökkentése (26±1 °C-ról 23±1 °C-ra) és a felére csökkentett mennyiségő
makroelemet tartalmazó táptalajok alkalmazása (MS92, MS92N) hatására minden vizsgált
ıszi búza genotípus éretlen embrió eredető kalluszaiból nagy számú növényt regeneráltunk.
Az átlagos regenerációs képesség 20%-ról 78%-ra nıtt, a legalacsonyabb érték 48% (Bánkúti
1201/B70 törzs, MS92 táptalajon), míg a legmagasabb 96% volt (Mv Emese, MS92
táptalajon) (5.1 táblázat). A pozitív mennyiségi változások mellett azonban kísérleteinkben a
kalluszokból lassan (6-8 hét) fejlıdtek ki hajtások, az embriók preparálásának idıpontjától
számítva 11-13 hét alatt (5 hét kalluszindukció), amit 4 hét gyökérregeneráció követett. A
63
hosszú szövettenyésztési idı az irodalmi adatok szerint genetikai instabilitáshoz és nagyfokú
szomaklonális variabilitáshoz vezethet (Harvey és mtsai., 1999). Ezért a következı kísérlet
hajtásregeneráló fázisában a megvilágítás intenzitását és idıtartamát megnöveltük (50 µmol
m-2 s-1, állandó fény). Ez gyorsíthatja a kalluszok redifferenciálódását, de az alkalmazott
fényviszonyokat empirikus úton szükséges meghatározni (Thorpe, 1994). A szövettenyésztés
hımérsékletét (23±1 oC) és a hajtásregeneráló táptalajok összetételét (MS9, MS9N, MS92,
MS92N) nem változtattuk. A fényviszonyok módosítása nem vezetett egyértelmő
eredményekre. Jó hatással volt ugyan a kalluszok redifferenciálódására (már egy hét után
nagy számú zöld folt és hajtáskezdemény jelent meg), de a többnyire fodros hajtások nem
fejlıdtek növénnyé, és a kalluszok nagymértékben gyökeresedtek. A regeneráció mértéke
ezért nem volt számszerősíthetı. A negatív változásokat az NAA tartalmú táptalajon
tenyésztett kalluszokon figyeltük meg (MS9N, MS92N). Ezek aktív citokinin/auxin hormon
aránya kisebb, mint az IAA tartalmúaké (MS9, MS92), mivel az NAA azonos mól arány
esetén nagyobb bioaktivitású auxin típusú hormon, mint az IAA (Thorpe, 1994). A szerzı
szerint a főfélék in vitro hajtás regenerációja általában alacsony citokinin koncentrációt
igényel, de a citokinin/auxin hormon arány erısen függ a genotípustól is. A következı
kísérletben a citokinin/auxin hormon arányt a két NAA tartalmú táptalajban a citokinin (BAP)
abszolút mennyiségének duplájára emelésével (4,4 µM helyett 8,8 µM BAP) növeltük meg.
Hatására a kalluszok gyökeresedése csökkent, de a hajtások fodrosak maradtak, melyekbıl
növények továbbra sem fejlıdtek. Így a gyökérképzıdés visszaszorulása nem javította a
növényregeneráció mértékét. Elképzeléseink szerint ennek két oka lehetséges. Az egyik, hogy
a kísérleteink sötét fázisa után alkalmazott állandó, magasabb (50 µmol m-2 s-1) intenzitású
megvilágítás a kalluszok számára fény stresszt jelentett. A másik az lehet, hogy búzánál, mint
a legtöbb növénynél a hajtásregeneráció mértékét a külsı (táptalajban használt)
citokinin/auxin hormonarány mellett a genotípus és az alkalmazott szövettenyésztési
körülmények (táptalaj összetétel, hımérséklet- és fényviszonyok) együttes hatása befolyásolja
(Thorpe, 1994; Fischer-Iglesias és mtsai., 2001). Az okok keresése, az optimális körülmények
kidolgozása céljából az egyes paraméterek változtatásának hatását elıbb külön-külön (mint
fent), majd együttesen is vizsgáltuk (következı, 5.1.4 fejezet).
64
5.1.4 A hajtásregenerációban alkalmazott hımérséklet, fényintenzitás és táptalaj
összetétel együttes hatása a növényregenerációra
Az elızıekben ismertetett minıségi problémák (túl hosszú szövettenyésztés, a kalluszok
erıteljes gyökeresedése és fodros hajtások képzıdése), kiküszöbölése érdekében a következı
kísérleti beállításban a szövettenyésztés egymást követı három fázisában a megvilágító fény
intenzitását valamint a hımérsékleti értékeket fokozatosan és együttesen változtattuk. A
kísérletbe vont mind a kilenc búza genotípus éretlen embrióit most is sötétben, a korábban is
alkalmazott körülmények között (BEG2 táptalaj, 23±1 oC) kalluszosítottuk. A hajtások
regenerálását csak két különbözı, az eredetihez képest fele makroelemet tartalmazó táptalajon
(MS92, MS92N) végeztük. A fény stressz elkerülése érdekében azonban a kalluszokat elıször
2 hétig alacsony intenzitású fénnyel világítottuk meg (20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus)
23±1 oC hımérsékleten, majd a zöldülı kalluszokat azonos összetételő táptalajon, de állandó,
magas fényintenzitás mellett (50 µmol m-2 s-1) és magasabb hımérsékleten (26±1 oC)
tenyésztettük, míg növények nem fejlıdtek rajtuk. Ez általában még 2 hetet vett igénybe. A
hımérséklet és fényintenzitás fokozatos, együttes növelésének hatására a két különbözı
összetételő táptalajon megfigyeltük, hogy a kalluszok sokkal kevésbé gyökeresedtek, rajtuk
fodros levelek nem képzıdtek, így minden hajtáskezdemény növénnyé fejlıdhetett. Ezek a
minıségi változások a növényregeneráció hatékonyságára is pozitív hatással voltak. Az
átlagos növényregenerációs képesség az elızı kísérletben elért 78%-ról MS92N táptalajon
82%-ra, míg MS92 táptalajon 83%-ra emelkedett (5.2 táblázat). Eredményeink jól egyeznek a
Thorpe (1994) által megállapítottakkal, miszerint szinte minden in vitro tenyésztés
hatékonyságát több faktor együttes hatása befolyásolja, s ezeket empirikus úton szükséges
meghatározni.
5.2 táblázat A hajtásregeneráló táptalaj összetétel, valamint a hajtásregenerációban alkalmazott hımérséklet és fényintenzitás fokozatos, együttes változtatásának hatása a növényregenerációra.
(LSD5%=6,7) hajtás regeneráció hatékonysága (%)
táptalaj Mv Emese
Mv Emma (5+10)
Mv Emma (2+12)
Mv Magvas
Mv Martina
Mv Pálma
B1201 (B2)
B1201 (B70)
B1201 (B8) átlag
MS92 99,9 88,3 88,5 79,2 90,3 71,1 89,4 57,2 85,5 83,3 MS92N 91,1 80,0 78,2 73,3 87,1 66,2 93,1 68,0 96,2 81,5
A fenti kísérleti körülmények között ismét az Mv Emese búzafajta éretlen embrióinak
regenerációs hatékonysága volt a legmagasabb (99,9%, MS2 táptalajon). Az alkalmazott
szövettenyésztési módszer a többi búzafajta esetében is (Mv Emma, Mv Martina, Bánkúti
65
1201/B2 és B8 törzs) 80%-nál magasabb regenerációs hatékonyságot eredményezett (88,5%,
90%, 93%, 96%) és egyetlen búzafajta sem mutatott alacsonyabb regenerációs képességet,
mint 57% (Bánkúti 1201/B70 törzs). A Bánkúti 1201 régi magyar búzafajta három törzsének
(B2, B70, B8) in vitro regenerációs képessége, ha nem is minden esetben szignifikánsan, de
eltért egymástól (89,4%, 57,2%, 85,5% MS92 táptalajon; 93,1%, 68,0%, 96,2% MS92N
táptalajon). A három közül két búza törzs (B70, B8) növényregenerációs képessége
szignifikánsan magasabb volt MS92N hajtásregeneráló táptalajon, mint az MS92 táptalaj
alkalmazása mellett. Ez az eredmény nagyon hasonló Pellegrineschi és mtsai. (2002) által
publikált, a Bobwhite búzafajta egyes törzseinek növényregenerációs képességét
tanulmányozó kísérletekben tapasztaltakkal. Eredményeink az irodalmi adatokkal
megegyezıen azt jelzik, hogy lehetséges még egy tájfajtán belül is a jó regenerációs
képességre szelektálni. A Martonvásári búzafajták mindegyike, ebben a kísérleti beállításban
is, az MS92 táptalajon mutatott jobb regenerációs képességet. Közülük három búzafajta (Mv
Emese, Mv Emma két genotípusa) regenerációs hatékonysága szignifikánsan magasabb volt,
mint az MS92N táptalajon elért értékek. Ebben a kísérleti beállításban is, mint az elızı
kilencben is, a regenerációs képesség nagymértékben függött a búza genotípusától, de a
különbözı kísérletekben az egyes genotípusok hasonló módon viselkedtek. Mind a tíz
különbözı kísérleti beállításban kapott eredményeinket elemezve, a genotípus és a különbözı
szövettenyésztési körülmények között szoros, pozitív korrelációt állapítottunk meg (0,83** -
0,99***).
Összefoglalva elmondható, hogy az általunk kidolgozott szövettenyésztési módszer mind a
kilenc vizsgált, köztük hat kereskedelmileg is fontos magyar búzafajtára alkalmas, nagy
hatékonyságú módszer. A genotípusok közötti regenerációs képességbeli különbségek nem
tőntek el, ami azt jelezheti, hogy az általunk vizsgált paraméterek nagy valószínőséggel olyan
változásokat eredményeztek a kísérleteinkbe bevont ıszi búza genotípusok regenerációs
képességében, melyek általános érvényőek. Ennek eredményeként a módszer különösen
hasznos lehet, mivel jó kiindulási alapot szolgáltat további búzafajták regenerációs
képességének teszteléséhez, optimalizálásához.
66
5.2 A növényregeneráció körülményeinek optimalizálása transzformációhoz
A fentiekben tárgyalt, belövés nélküli regenerációs kísérleteinkben a növényregeneráció
hatékonyságát a hajtásregeneráló táptalajok összetételének és a hajtásregeneráció
körülményeinek (fény, hımérséklet viszonyok) változtatása mellett vizsgáltuk. A két
eredmény kombinációjaként a regenerálódás mértéke belövetlen kalluszokkal több ıszi búza
genotípusnál (Mv Emese, Mv Martina, Bánkúti 1201/B2 és B8 törzs) meghaladta a 90%-ot,
mely jó kiindulási alapot nyújtott a búza genetikai módosítására biolisztikus módszerrel. Ezt a
kidolgozott szövettenyésztési módszert búza transzformációs kísérleteinkben a fenti négy
legjobb regenerációs képességő ıszi búza genotípusra alkalmaztuk. A szelekciós markergént
és a transzgént ugyanúgy, mint korábbi munkánkban (Tamás és mtsai., 1999) az éretlen
embriókból nyert egyhetes kalluszokba juttattuk be biolisztikus módszerrel. A célszövet
túlzott sérülésének elkerülése és a megfelelı hatékonyságú növényregeneráció fenntartása
érdekében a belövés fizikai paramétereit az irodalmi adatok szerinti optimális (Rasco-Gaunt
és mtsai., 1999a; Harwood és mtsai., 2000) értéknek választottuk. A transzformált sejtek
kiválogatásához, valamint belılük növények regenerálásához azt az nptII/kanamycin
szelekciós rendszert használtuk, mely a korábbi munkánkban (Tamás és mtsai., 1999) sikeres
transzformációra vezetett. Az antibiotikum szelekciót a lövés utáni szövettenyésztés korai
szakaszában elkezdtük. A kalluszokat két hétig sötétben BEG2 táptalajon szelekciós ágens
nélkül tenyésztettük, majd a friss kalluszindukáló táptalajba 50 mg/l kanamycint adagoltunk
és további két hétig inkubáltuk sötétben. A hajtások és a gyökér regenerációja is szelekciós
nyomás alatt történt, mint azt más kutató laboratóriumokban is végezték (pl. Rooke és mtsai.,
1999). A belövés utáni növényregenerációs hatékonyság a kanamycin tartalmú táptalajokon a
kísérletbe vont ıszi búza genotípusoknál 8-15% volt, mely eredmény jól egyezik más kutató
csoportok eredményeivel (Lee Rooke személyes közleménye). Az irodalmi adatok szerint a
kanamycint ennél nagyobb koncentrációban (100 mg/l) csak transzgénikus rizs növények
szelekciójához használják (Chamberlain mtsai., 1994). Kísérleteinkben minden genotípus
esetén nagy számban (30-40) kaptunk regenerált búzanövényt, melyeknek csak egy részében
tudtuk kimutatni a transzgén jelenlétét (4-5 növény/genotípus). A DNS szintő vizsgálatokat a
fiatal növények leveleibıl kinyert genomi DNS-en PCR módszerrel végeztük. A PCR pozitív
T0 növények T1 szemtermésébıl többet elvetettünk, de a T1 növényekbıl izolált DNS-ben
nem tudtuk kimutatni a szelekciós markergén jelenlétét. Ha figyelembe vesszük az
alkalmazott szelekció hatékonyságára vonatkozó irodalmi és személyes közleményeket (mint
fent), a gén „elvesztése” nagy valószínőséggel nem a szelekció hiányossága, hanem inkább
67
annak lehetett az eredménye, hogy a transzgén mozaikosan épült be a búza genetikai
állományába. A mozaikosságot a növényi transzformációban úgy tudjuk elkerülni, ha
megtaláljuk a szövettenyésztés körülményeinek kidolgozása során az alapvetıen
embriógenézist indukáló táptalajokat és körülményeket (Shewry és Jones, 2005).
A továbbiakban a növényregeneráció hatékonyságát javítani szándékozó szövettenyésztési
kísérleteinket olyan módosításokkal egészítettük ki, melyek a szomatikus embriógenézist
segíthetik elı. Míg korábbi növényregenerációs kísérleteinkben (Tamás és mtsai., 2004) csak
a hajtásregenerációban alkalmazott körülményeket (táptalajok összetétele, hımérséklet- és
fényviszonyok) változtattuk, addig a továbbiakban a kalluszindukció körülményeit és a
hajtásregeneráció korai szakaszának (elsı három hét) táptalaját módosítottuk. Korábbi
növényregenerációs kísérleteinkben valószínőleg a preparált éretlen embriók
dedifferenciálódása sem volt megfelelı. Mindezek miatt az embriópreparálás módját és a
kalluszindukcióban alkalmazott táptalajok összetételét módosítottuk.
Kísérleteinkben a legjobb regenerációs hatékonyságot mutató magyar ıszi búzafajta (Mv
Emese) mellett két tavaszi, úgynevezett modell búzafajtát is vizsgáltunk (Bobwhite és
Cadenza). A modell búzafajták alkalmazása lehetıvé tette a használt szövettenyésztési
körülmények és táptalajok, valamint a kiindulási növényi anyag tesztelését.
A csírázás megakadályozása, valamint az embriók eredeti genetikai programjának leállítása
érdekében az éretlen embriók embriócsúcsát mikroszkóp alatt eltávolítottuk. Az így preparált
szkutellum ma az egyik leggyakrabban használt kiindulási szövet a búza biolisztikus
módszerrel történı transzformációjában (Jones és mtsai, 2005). A preparált szkutellumokat
olyan kalluszindukáló táptalajra helyeztük, melyek nem tartalmaztak glicint, de tartalmaztak
10 mg/l AgNO3-ot, nagyobb mennyiségő szacharózt (30 g/l helyett 90 g/l) és változó
mennyiségben 2,4-D auxin típusú hormont (2,0 mg/l, 1,0 mg/l és 0,5 mg/l). Kísérleti
eredményeink azt mutatták, hogy a növényregeneráció hatékonysága leginkább a preparált
embriók méretétıl (azaz hormon tartalmától) függött, mint azt Pastori és mtsai. (2001) is
publikálták. A regenerációs képességet nagymértékben befolyásolta a kísérletbe vont
búzafajta genotípusa is. A legtöbb növényt a Bobwhite és Cadenza búzafajtáknál a kicsi (0,5-
1,0 mm) és közepes mérető (0,8-1,2 mm) embriókból kiindulva neveltünk (75-80%), míg az
Mv Emese búzafajta regenerációs képessége a nagymérető (1,0-1,6 mm) embriókból
kiindulva (5.1 ábra) volt a legmagasabb (80%). Az Mv Emese búzafajta kicsi embrióiból
preparált szkutellumok kalluszaiból egyáltalán nem lehetett növényt regenerálni. Az
embriócsúcs eltávolítása mindenegyes búzafajta esetén és bármely mérető embrióból
kiindulva megakadályozta a csírázást.
68
6 5 4 3 2 1
5.1 ábra Éretlen embriók csoportosítása méret szerint: 1 és 2 kicsi (0,5-1,0 mm), 3 közepes (0,8-1,2 mm), 4 és 5 nagy (1,0-1,6 mm), 6 túl nagy. A Bobwhite búzafajta transzformálásához a hármas számú, áttetszı szkutellumot és kissé opálos embriócsúcsot tartalmazó közepes mérető embriók a megfelelıek (Pellegrineschi személyes közleménye).
A növényregeneráció mértékét a genotípus és az embrió mérete mellett a kalluszindukáló
táptalaj 2,4-D tartalma (2,0 mg/l, 1,0 mg/l és 0,5 mg/l) is nagymértékben befolyásolta.
Mindhárom genotípus esetén a 0,5 mg/l 2,4-D tartalmú kalluszindukciós táptalaj (MD0,5;
Függelék II. táblázat) használatakor kaptuk a legtöbb növényt, mely jó korrelációt mutatott a
sötétben indukált embriogén kalluszok számával (az adatokat nem közöljük). Ez a
megfigyelés nagyon fontos, hiszen az embriogén kalluszokból az új növény a kallusz egyetlen
totipotens sejtjébıl fejlıdik ki embriószerő képzıdményen keresztül, s ezáltal a
géntechnológiai úton módosított növény feltételezhetıen minden sejtje hordozni fogja az
idegen DNS-molekulát. Az embrioidok hajtássá fejlıdését az elsı hajtásregeneráló fázisban
használt táptalajban (RZ+1/2Cu; Függelék II. táblázat) oldott 0,05 mM CuSO4-tal segítettük
az irodalomban publikáltak szerint (Sparks és Jones, 2004). Ugyanezen célból, valamint a
szomaklonális variabilitás elıfordulási esélyének csökkentése érdekében minden
szövettenyésztési fázist három hétre rövidítettünk le. A változtatások, azaz a szkutellumok
megfelelı mérető embriókból történı preparálása, embriógenézist indukáló táptalajok
használata a kalluszindukcióban és a hajtásregeneráció korai szakaszában, valamint a
szövettenyésztési fázisok lerövidítése elvezettek a megfelelı minıségő és hatékonyságú
növényregenerációhoz, s így a sikeres búza transzformációhoz.
69
5.3 Búza transzformációs kísérletek
5.3.1 Transzgénikus búzanövények elıállítása és tesztelése
Búza transzformációs kísérleteinkhez két tavaszi búzafajtát (Bobwhite 26 törzse, Cadenza),
valamint az ıszi búzafajták közül a növényregenerációs kísérleteinkben (Tamás és mtsai.,
2004) legjobbnak bizonyult Mv Emese Martonvásári búzafajtát használtuk. Több kísérletben
összesen 600 db Bobwhite, 3000 db Cadenza és 1260 db Mv Emese búzafajta éretlen
szkutellumát kotranszformáltuk ekvimoláris mennyiségő pAHC25 és AmA1-pTLZ jelő
transzformációs kazettákkal. A széles körben alkalmazott pAHC25 jelő plazmid, mely a
herbicid rezisztenciát biztosító bar gént hordozza, lehetıvé tette a transzgénikus növények
szelekcióját (5.3 táblázat). Az AmA1-pTLZ jelő transzformációs kazetta az Amaranthus
hypochondriacus ama1 génjét tartalmazza, ami egy esszenciális aminosavakban gazdag
albumin típusú trartalékfehérjét kódol (Raina és Datta, 1992). Ez a 35 kDa molekulatömegő
AmA1 fehérje amellett, hogy nagy táplákozástani értéket képvisel és allergenitásra utaló
aminosav szekvenciákat nem tartalmaz. A megfelelı szövetspecifikus génexpresszió
biztosítása érdekében az ama1 gént búza endospermium specifikus promóter (1Bx17 HMW-
GS) mögé építettük. Ennek eredményeként az extra tartalékfehérje termelıdését csak a búza
endospermiumában várjuk, mely fehérje megjelenik a belıle készült búzalisztben is.
Munkánkban összesen 89 herbicid rezisztens T0 növényt regeneráltunk foszfinotricin (PPT)
szelekcióval. A szelekciós nyomást a szövettenyésztés késıi fázisában, csak a második
háromhetes hajtásregenerációs fázissal kezdıdıen alkalmaztuk. A táptalajok PPT
koncentrációja 4 mg/l volt. A különbözı genotípusokból regenerált herbicid rezisztens
növények számát, a PCR vizsgálatok eredményét és a transzformáció hatékonyságát az 5.3
táblázatban foglaljuk össze és a következı alfejezetben tárgyaljuk. A táptalajban alkalmazott
foszfinotricin szelekciót túlélt putatív transzgénikus növények mindegyike egészséges volt és
fenotípusosan sem különbözött a donor növényektıl.
5.3 táblázat A transzformáció hatékonyságának változása a genotípussal. Zárójelben (negyedik oszlop) a kotranszformáció hatékonysága látható.
PCR pozitív növény (db) genotípus
belıtt szkutellum
(db)
szelekciót túlélt
növény (db) bar bar és ama1
transzformáció hatékonysága bar
génre (%) Bobwhite26 600 16 6 5 (83%) 1,00 Cadenza 3000 60 20 12 (60%) 0,67 Mv Emese 1260 13 3 1 (33%) 0,24
összesen 4860 89 29 18 (62%) 0,60
70
5.3.1.1 Transzgénikus búzanövények tesztelése
A szelekciós markergén (bar) és a transzgén (ama1) jelenlétét a szelekciót túlélt három-négy
leveles állapotú búzanövények levelébıl kinyert genomi DNS-en PCR módszerrel
bizonyítottuk (5.2 ábra). Vizsgálatainkhoz génspecifikus primereket használtunk.
42 44 49 52 58 59 65 66 67 68 71 75 76 78 80 81 82 83 86 H2OCa Em Pl+ Pl+
5.2 ábra Transzgénikus növények genomi DNS-én végzett PCR vizsgálat AmaF1-NosR3 primer párral. Az amplifikált termék mérete 480 bp. 52, 58, 59, 65, 71, 76, 80, 83: PCR pozitív T0 növények számjelzése, Ca és Em: negatív növényi kontrollok (Cadenza és Mv Emese donor növények), Pl+: plazmid pozitív kontroll.
A bar gén jelenlétét hat Bobwhite, húsz Cadenza és három Mv Emese búzafajta szelekciót
túlélt, regenerált növényében mutattuk ki, mely 0,24-1,00 % transzformációs hatékonyságot
jelent (5.3 táblázat). A szelekciós markergént tartalmazó 29 búzanövény közül 18, a növények
62 %-a tartalmazta az ama1 transzgént is. Ezek a transzformációs- és kotranszformációs
gyakoriságra vonatkozó eredményeink jó egyezést mutatnak a korábban modell genotípusok
éretlen embrióival végzett legtöbb kísérlet eredményeivel (lásd. Rasco-Gaunt és mtsai., 2001
összefoglalója,). Kísérleteinkben a kotranszformáció hatékonysága genotípusonként változott
(5.3 táblázat, negyedik oszlop). A legmagasabb kotranszformációs hatékonyságot (83%) a
Bobwhite fajta, a legalacsonyabbat pedig (33%) az Mv Emese ıszi búzafajta esetén
tapasztaltuk. A Cadenza búzafajta kotranszformációja (60%) az átlaggal megegyezı volt. A
transzformációban elıállított, PCR pozitív T0 növényeket üvegházi kontrollált körülmények
között, elkülönítve neveltük fel. A búzanövények mindegyike fertilis, normális magkötésőnek
bizonyult.
A transzgénikus búzanövények további vizsgálataihoz (T1 és T2 generáció) a T0 növények
közül hét független transzgénikus vonalat választottunk. Ezek a Bobwhite búzafajta #15, a
Cadenza búzafajta #28, #58, #59, #80, #83, és az Mv Emese búzafajta #71 számú
transzgénikus vonalai voltak. Minden kiválasztott T0 növény 16 db T1 magjából T1
növényeket neveltünk, és a három-négy leveles növények leveleibıl kinyert genomi DNS-en
71
a bar és az ama1 gén jelenlétét PCR módszerrel vizsgáltuk. Ezt követıen az öt-hat leveles
állapotú növényekben a bar gén aktivitását herbicid resziztencia teszttel is ellenıriztük úgy,
hogy egy hét eltéréssel a növényeket 1 g/l PPT tartalmú kereskedelmi forgalomban lévı
totális gyomirtó szerrel (FINALE, glufozinát-ammónium) kétszer lepermeteztük. A herbicid
resziztencia tesztet túlélt növények száma a különbözı transzgénikus vonalaknál 9-13 közötti
volt, ami a lepermetezett növények 56,3-78,6%-a (5.4 táblázat). A herbicid rezisztancia
tesztnek ellenálló legtöbb búzanövényt (13) a Cadenza búzafajta #59 vonala adta, a
legkevésbé ellenálló pedig az Mv Emese (#71) és a Cadenza búzafajta #58 és #83 számú
vonalai voltak (9 túlélı/16 tesztelt növény). A teszt eredménye nem csak a búza fajtájától
függıen változott, de a Cadenza búzafajtánál az egyes transzgénikus búzavonalakra is eltérı
eredményeket adott.
5.4 táblázat Génaktivitás ellenırzése herbicid resziztencia- és GUS hisztokémiai teszttel. PPT-permetezés (T1 generáció)
GUS festés (T2 generáció)
T0 növény számjelzése genotípus kezelt
növények (db)
túlélı növények
(db)
túlélı növények
(%)
tesztelt növények
(db)
GUS pozitív
növények (db)
GUS pozitív
növények (%)
#15 Bobwhite 16 10 62,5 48 23 47,9 #28 Cadenza 16 12 75,0 48 40 83,3 #58 Cadenza 16 9 56,3 27 21 77,8 #59 Cadenza 16 13 78,6 24 20 83,3 #80 Cadenza 16 11 68,8 36 27 75,0 #83 Cadenza 16 9 56,3 24 15 62,5
#71 Mv
Emese 16 9 56,3
nem teszteltük
Függetlenül azonban a búza fajtájától és azon belül a transzgénikus vonaltól, minden vizsgált
transzgénikus búzanövény esetében azt tapasztaltuk, hogy a bar gént hordozó PCR pozitív
növények mindegyike a bar gén által kódolt foszfinotricin-acetiltranszferáz (PAT) enzimet
expresszálta, mely inaktiválta a totális gyomírtószert, s ezzel biztosította a lepermetezett
növény számára a túlélést. A genomi DNS-en transzgénre (ama1) elvégzett PCR vizsgálatok
eredményei azt mutatták, hogy minden vizsgált transzgénikus vonal T1 utódja, mely
tartalmazta a markergént és expresszálta a PAT enzimet, hordozta az ama1 transzgént is.
Ebbıl azt a következtetést vonhatjuk le, hogy nagy valószínőséggel a bar gént tartalmazó
pAHC25 nevő plazmid és az ama1 gént hordozó AmA1-pTLZ jelő transzformációs kazetta
egymáshoz közeli helyre (lokuszra) épült be a búza genetikai állományába. Eredményeink
összhangban vannak számos kutatócsoport eredményeivel, miszerint a búza biolisztikus
72
transzformációja során a kotranszformált gének többnyire ugyanazon lokuszra épülnek be
(Pawlowski és Somers, 1998; Stoger és mtsai.,1998; Rooke és mtsai., 2003). A szerzık arról
is beszámoltak, hogy a szelekciós markergén és a transzgén az esetek többségében együtt
öröklıdtek át a következı nemzedékre. Kísérleteinkben a mindkét génre PCR pozitív
növények száma az elemzett T1 generációban a növények 56-78%-át tette ki, ami a Mendeli
öröklıdés szabályainak majdnem teljes mértékben megfelel. Ez jó egyezést mutat az elmúlt
néhány évben elvégzett búza transzformációs kísérletekben tapasztaltakkal, hogy a
géntechnológiai módszerrel bejuttatott gének a transzgénikus növények korai generációiban
Mendeli öröklıdés szerint jutnak tovább a következı nemzedékre (Vasil összefoglalója,
2007).
A T2 generáció nagy számú növényében (24 db növény/transzgénikus vonal) a marker-,
riporter- és transzgén jelenlétét a genomi DNS-en végzett PCR reakcióval, míg az uidA
génrıl expresszálódó glükuronidáz enzim (GUS) jelenlétét a szemtermésekben hisztokémiai
GUS teszttel igazoltuk. Ehhez a T1 növények érett T2 magjaiból (kivéve az Mv Emese #71
vonalát, mely apró szemeket termett) vékony szeletet vágtunk le a csíra oldallal szemben és
GUS festıoldatban inkubáltuk. Az GUS fehérjét expresszáló növények szemtermésének
vékony metszete kékre szinezıdött (5.3 ábra).
negatív kontroll 1 2 3 4 5
5.3 ábra A transzgénikus növények T2 szemtermésének hisztokémiai tesztje.
(GUS enzim aktivitás kimutatás) 1-5: a vizsgált búza növény utódvonalainak száma.
A csírát tartalmazó részbıl növényt neveltünk. A levélszövetbıl kinyert genomi DNS-en
végzett PCR reakciók valamint a GUS teszt eredményei azt mutatták, hogy a kotranszformált
marker/riporter- és a transzgén (bar/uidA és ama1 gének) a T2 generációban is megfeleltek a
Mendeli öröklıdés szabályainak (5.4 táblázat). A vizsgált növények 48-83%-a hordozta mind
a három gént. Találtunk a transzgénikus Cadenza #28, #59 és #80 vonalak utódjai között
olyan vonalakat is, melyeknek mind a 12 vizsgált T2 növénye hordozta mind a három gént
(úgynevezett ‘tiszta’ vonalak). A kotranszformált gének ebben a generációban is szinte
minden vizsgált transzgénikus vonal utódjaiban együtt, nem szegregálódva jutottak át a T2
73
generációba. Ez alól egyetlen kivétel volt, a transzgénikus Bobwhite #15 vonala, melynek két
T2 növénye csak az ama1 transzgént tartalmazta. Ehhez hasonló adatokat találunk az
irodalomban is, miszerint a kotranszformált gének általában együtt öröklıdnek, de az esetek
kis százalékában (<10%) a markergén és a transzgén szegregálódik a magasabb
generációkban (Rooke és mtsai., 2003). A Bobwhite búzafajta #15 vonala két transzgénikus
utódvonalainak további vizsgálata lehetıséget nyújt arra, hogy csak ama1 gént tartalmazó
transzgénikus búzavonalakat állítsunk elı. A szelekciós markergén hiánya elméleti
lehetıséget adhat arra, hogy a transzgénikus növény további szigorú feltételek teljesülése
mellett, alapos és körültekintı vizsgálatok után, akár kereskedelmi forgalomba is kerülhessen.
Ehhez természetesen szükséges a szabályozó szervezetek engedélye és a fogyasztók elfogadó
magatartása is, mely hosszú távon nem elképzelhetetlen.
5.3.1.2 Southern-blot analízis
Az ama1 gén jelenlétét a búza genomjában nem csak PCR reakcióval, hanem Southern-
hibridizációval is ellenıriztük. A sikeres beépülést, valamint az integrálódás mintázatát két
független transzgénikus Cadenza vonal (#28 és #58) több PCR pozitív T1 utódjában
vizsgáltuk. Negatív kontrollként a transzgénikus #28 vonal egyik PCR negatív utódvonalát
(transzgénikus null minta) használtuk. A növények levélszövetébıl CTAB módszerrel kinyert
genomi DNS EcoRI restrikciós enzimmel emésztett elegyét agaróz gélen elválasztottuk,
Nylon membránra transzferáltuk, majd a membránon lévı DNS-t DIG jelölt próbával
hibridizáltuk. Kemiluminszcens detektálás után megállapítottuk, hogy a #28 vonal utódjaiban
egy, míg az #58 vonal utódjaiban három (plusz egy hosszabb és egy rövidebb) hibridizálódó
DNS szakasz mutatható ki. A belsı kontrollként használt PCR negatív utódvonalban
(transzgénikus null #28 vonal) az elvárásoknak megfelelıen hibridizálódó sávot nem
detektáltunk (5.4 ábra).
74
5.4 ábra Transzgénikus Cadenza T1 növények Southern-blot analízise az ama1 génre. 1: a molekulatömeg standard (Promega, 1kb ladder) 1000bp mérető sávja, 2: negatív kontroll (a transzgénikus #28 vonal PCR negatív utódvonala), 3-6: a transzgénikus #28 vonal négy PCR pozitív utódvonala, 7: plazmid kontroll (a linearizált plazmid mérete ~6,4 kb), 8 és 9: a transzgénikus #58 vonal két PCR pozitív utódvonala. A nyilak a búza genomjába integrálódott, a próbával hibridizálódó DNS fragmenteket jelzik.
A vizsgálattal nem csak azt bizonyítottuk, hogy az ama1 gén stabilan integrálódott a búza
genetikai állományába, hanem a Southern-blot eltérı mintázata azt is jelzi, hogy a két
transzgénikus búzavonal biztosan két egymástól független transzformációs eseménybıl
származik. A hibridizálódott sávok száma jelzésértékő az integrálódó fragmentek számát
illetıen. A Cadenza búzafajta transzgénikus #28 vonalának Southern-blot elemzésekor
detektált egy sáv mérete megfelel a transzformációs kazetta restrikciós enzimmel történı
emésztése után kapott DNS molekula relatív mobilitásának. Ez azt jelzi, hogy az integrálódás
során a plazmid nem rövidült meg. Ezzel szemben az #58 vonalban a transzformáció során a
DNS kazetta nem csak teljes mérető integrálódása történt meg, hanem vagy beépülés közben
megrövidült a kazetta, vagy a beépülés után átrendezıdés történt, melyet a Southern-blot két
extra hibridizációt mutató sávja valószínősít. A legrövidebb (~1000bp) fragment mérete (5.4
ábra) megfelel az ama1 gén hosszának, azaz a transzformációs kazetta valószínőleg
elveszítette a promóter és a vektor részét. Ilyen jelenségrıl már korábban is beszámoltak búza
és rizs biolisztikus, valamint agrobaktérium közvetítette transzformációja során egyaránt (Fu
és mtsai., 2000; Wu és mtsai., 2006; Zhao és mtsai., 2007).
A transzgénikus növényeket és a biolisztikus transzformáción átesett, de nem transzgénikus
növényeket a donor növényektıl elkülönítve, kontrollált körülmények között neveltük fel.
75
5.3.2 Az AmA1 fehérje expresszió bizonyítása
A transzgén transzkripció ját a transzgénikus búzanövények éretlen T1 szemtermései
endospermiumából tisztított mRNS-en végzett RT-PCR reakcióval vizsgáltuk. A hosszában
félbevágott 20 napos éretlen szemek elemzésével minden, ama1 génre PCR pozitív növény
fejlıdı endospermiumában kimutatható volt az mRNS jelenléte is. Transzgénikus
vonalanként változó szintő transzkripciót detektáltunk (5.5 ábra), bár ez a szemi-kvantitatív
módszer nem a legmegfelelıbb a transzkripció mennyiségi viszonyainak jellemzésére,
összehasonlítására.
5.5 ábra Az ama1 transzgén transzkripciójának igazolása RT-PCR reakcióval. dw: desztilláltvíz, M: molekulatömeg standard, pl: plazmid pozitív, #28, #31, #58, #59, #80, #83: a T0 transzgénikus vonalak számjelzései, #49: a biolisztikus transzformáción átesett, de nem transzgénikus (PCR negatív) növény számjelzése.
A munkánkban használt búza endosperm specifikus promóter (1Bx17 HMW-GS)
szövetspecifitását transzkripciós szinten is igazoltuk. A levélbıl és gyökérbıl tisztított
mRNS-rıl átírt cDNS mintákon a PCR reakció negatív volt, míg a tubulin fehérje génjének
(pozitív kontroll) transzkripcióját mindkettıben ki tudtuk mutatni. Az endospermium
specifikus promóter az ama1 gén transzkripcióját csak az endospermiumban teszi lehetıvé.
Eredményeink összhangban vannak a korábban mások által (Jones és mtsai., 2005) és saját
munkánk során is tapasztaltakkal (Oszvald és mtsai., 2007), miszerint búza endosperm
specifikus promóterrel szabályozott idegen eredető gének is csak a búza endospermiumban
expresszálódnak.
Az ama1 gén transzkripciója idıbeli változását a Cadenza #28 transzgénikus vonal három T2
növényének éretlen szemtermésében követtük nyomon. Az éretlen endospermiumokból
virágzás után 10, 17, 24 és 31 nappal teljes RNS-t izoláltunk és a mintákban qRT-PCR
módszerrel tanulmányoztuk az mRNS mennyiségét. A reakcióelegyben lévı SybrGreen
76
floureszcenciájának mérésével kimutattuk, hogy az ama1 génrıl átíródott mRNS már a 10
napos mintákban is jelentıs mennyiségben jelen van. A telítési jellegő görbe elemzésével
megállapítottuk, hogy mennyisége kb. a huszadik napig tovább nıtt, majd nagyon lassú
csökkenés indult el (5.6 ábra).
0,0000
0,0001
0,0010
0,0100
0,1000
1,0000
10,0000
0 5 10 15 20 25 30 35
Virágzást követ ı napok száma
ama1
mR
NS
rel
atív
men
nyis
ége
T3 mag 28-3-13
T3 mag 28-3-22
T3 mag 28-3-2
5.6 ábra Az ama1 transzgén transzkripciójának mennyiségi elemzése qRT-PCR reakcióval. Az ama1 mRNS mennyiségét a tubulin fehérje mRNS-ének mennyiségéhez viszonyítottuk. A vizsgálatot három T2 növény (T228-3-2, T228-3-13, T228-3-22) éretlen szemtermésével végeztük.
Minden mintát és a kontrollt is öt ismétlésben elemeztünk. A PCR reakció után felvett
olvadási görbék minden esetben egy csúcsot tartalmaztak, ami a reakciókörülmények (reakció
elegy összetétel, kapcsolási hımérséklet) helyességét igazolta. Eredményeink összhangban
vannak a korábban publikált adatokkal (Grimwade és mtsai. (1996), ami szerint a búza
endospermiumban a tartalékfehérje gének transzkripciója már 10 nappal a virágzás után
megindul, és az mRNS termelıdése, ami a 21-ik nap körül éri el a maximumát, majd lassú
csökkenést mutat a szemtermés fejlıdésének késıi szakaszáig.
Az AmA1 fehérje búza szemtermésben történı expresszióját a félbevágott éretlen (20
DPA) T1 szemek másik felébıl kinyert fehérje Western-blot analízisével bizonyítottuk. A
Western-blot analízist arra is felhasználtuk, hogy ellenırizzük az ama1 gén transzlációjának
idıbeli korrekt lejátszódását. Ehhez a legjobban expresszáló Bobwhite #15 és Cadenza #28
vonalak egy-egy T1 növényének éretlen T2 szemtermésébıl nyertünk ki fehérjét a virágzás
után 17, 24 és 31 nappal. Az elválasztást követıen már az SDS-PAGE gélen egy új fehérje
sávot figyeltünk meg a kontrollként használt búzafehérje extraktum mintázatához képest. Az
új sáv mérete alapján a detektált fehérje molekulatömege 35 kDa (5.7.a. ábra), és a sáv
intenzitása a virágzás után eltelt idıvel egyre erısödött. A Western-blot analízis (5.7.b. ábra)
bizonyította, hogy ez az extra sáv az AmA1 fehérjének felel meg.
77
5.7 ábra Transzgénikus Cadenza növény (#28-4 vonal) SDS-PAGE és Western-blot elemzése. (a) A virágzás után 17, 24 és 31 nappal begyőjtött éretlen szemtermésbıl kinyert albumin fehérjefrakció SDS-PAGE vizsgálata. (b) Ugyanabból az éretlen szemtermésbıl extrahált fehérje Western-blot elemzése. A nem specifikus kötıdéső sáv a búza albumin fehérjének felel meg, mely az érés során változatlan mennyiségben expresszálódik. AmA1: az amarantusz magból extrahált vízoldható albumin fehérje, C: a donor (nem transzformált) növénybıl nyert búza endospermium fehérje. A nyilak mindkét ábrán a 35 kDa mérető AmA1 fehérjét (rekombináns fehérje) mutatják.
Az 5.7 ábrán jól látható, hogy a transzgénikus növények szemtermésében termelıdött extra
fehérje (rekombináns fehérje) az endospermium szövetekben növekvı mennyiségben
akkumulálódott a szemtermés fejlıdésének elırehaladtával. Eredményeink jól egyeznek
korábban publikált megfigyelésekkel, miszerint a búza tartalékfehérjék expressziója már 14
nappal virágzás után kimutatható az endospermiumban és szintézisük fokozódó intenzitással
folyik a szemtermés fejlıdésének késıi szakaszáig (Gupta és mtsai., 1996).
5.3.3 Transzgénikus lisztminták elıállítása, fehérje- és aminosav összetétele
5.3.3.1 A szemtermések fizikai vizsgálata
A T2 szemtermés fizikai vizsgálataihoz a herbicid rezisztencia tesztet (PPT permetezés) túlélt
T1 növények szemtermését használtuk (lásd 5.4 táblázat). Az Mv Emese fajta #71 vonalának
utódjait nem vizsgáltuk, mert a búzaszemek nagyon aprók voltak (ezerszem tömeg 20 g, míg
a donor- és T0 növényé 42-45 g), s véleményünk szerint ez irreális eredményeket adott volna
a továbbiakban. A többi transzgénikus vonal (Bobwhite #15, Cadenza #28, #58, #59, #80 és
#83) esetében, mivel a markergén és az ama1 transzgén a T1 generációban együtt öröklıdtek,
az egyes vonalak T1 növényeinek szemtermését (90%-át) egyesítettük, hogy egy-egy vonalból
a vizsgálatokhoz elegendı mennyiség álljon rendelkezésre. Annak ellenére, hogy nem
78
jellemeztük teljesen a szemeket, a szemtermést egységes mintaként kezeltük, ahogyan ezt
korábban mások is tették transzgénikus búzavonalak T2 szemtermésének vizsgálatakor (Rooke
és mtsai., 1999). A transzgénikus vonalanként termett 260-300 búzaszembıl Perten SKCS
4100 készülékkel mért szemátmérı, ezerszem tömeg és szemkeménység értékeket az 5.5
táblázat tartalmazza. A szemtermés korlátozott mennyisége miatt a lisztmintákat a
szemkeménység mérés után kapott töret ırlésével mikro-szitán megszitálva állítottuk elı. A
vonalankénti 2,5-3,5 g lisztet (lisztkihozatal értékek az 5.5 táblázatban) a késıbbiekben
fehérje és funkcionális oldalról is vizsgáltuk.
A T3 szemtermést minden transzgénikus búzavonal (Bobwhite #15, Cadenza #28, #58, #59,
#80, #83) 3-4 független utódvonala 12 magjából kicsírázott T2 növények felnevelésével
nyertük (28-50 g szem) (lásd 5.4 táblázat). Találtunk négy Cadenza T1 vonalat (T128-6, T128-
12, T159-16, T180-16), melyek 12 magját elvetve a felnevelt növények mindegyike hordozta a
transzgént (tiszta T2 vonalak). A T4 szemtermést a T2-28-1-1 növény 12 magjából felnevelt
növények (tiszta T3 vonalak) termése adta. A fizikai paramétereket a Perten SKCS 4100
készülékkel 400-800 búzaszemen vizsgáltuk. A lisztet a töretbıl és teljes szemekbıl ıröltük,
majd szitáltuk. A mérési eredményeket két kontrollhoz viszonyítottuk, a nem transzformált,
úgynevezett donor növény, és a PCR negatív T2 növények, úgynevezett null transzgénikus
(null segregant) növények, szemtermésének adataihoz. A mért értékeket az 5.6 táblázatban
foglaljuk össze.
5.5 táblázat Transzgénikus búzák T2 szemtermésének fizikai jellemzıi és lisztkihozatala.
búzavonal szemátmérı (mm)
ezerszem tömeg (g) szemkeménység lisztkihozatal
(%) Bobwhite (donor) 2,50 34,2 78 35,01 T2-15 2,12 24,2 81 29,87 Cadenza (donor) 2,84 43,9 68 43,15 Cadenza (null transzgénikus)
2,68 38,7 69 41,15
T2-28 1,97 26,4 68 36,21 T2-58 2,06 28,9 62 41,75 T2-59 2,10 28,2 71 32,02 T2-80 2,29 33,2 76 32,04 T2-83 2,25 32,7 77 29,42
szórás 0,5 12 13 -
Méréseink szerint a T2 szemek átmérıje (1,97-2,29 mm) és ezerszem tömege (24,2-33,2 g)
szignifikánsan alacsonyabb volt a kontroll növények termésén mért értékeknél (2,50-2,84
mm; 34,2-43,9 g), ami általában jellemzı az elsı két transzgénikus generáció termésére (Peter
79
R. Shewry személyes közleménye). A búzaszemek kisebb mérete több esetben alacsonyabb
lisztkihozatalt eredményezett (29-42%), mint a kontroll búzaszemeké (35-43%).
A T3 és T4 búzaszemek átmérıje (2,51-3,23 mm) és ezerszem tömege (38,7-56,8 g)
hibahatáron belül egyezı értékeket mutatott a kontrollok értékeihez képest (2,73-2,84 mm;
41,1-45,8 g). A keménységi indexeket elemezve megállapítottuk, hogy az AmA1 fehérje
expressziója az endospermiumban nincs hatással a búzaszem keménységére, így mind a
három generáció transzgénikus pozitív és negatív növényei ugyanúgy, mint a donor
növények, a kemény endospermium szerkezető búzák közé sorolhatók (50-70 keménységi
index).
5.6 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésének fizikai jellemzıi és lisztkihozatala.
búzavonal szemátmérı (mm)
ezerszem tömeg (g) szemkeménység lisztkihozatal
(%) Bobwhite (null transzgénikus)
2,73 45,8 57 43,43
T3-15 3,03 50,5 67 43,55 Cadenza (donor) 2,84 43,9 68 44,12 Cadenza (null transzgénikus)
2,81 41,1 69 43,73
T3-28-6-tiszta 2,90 45,7 76 43,85 T3-28-12-tiszta 3,23 55,5 64 42,82 T4-28-1-1-tiszta 2,91 47,1 69 43,54 T3-58 3,13 56,8 54 39,67 T3-59-tiszta 2,70 43,1 66 42,43 T3-80-tiszta 2,56 41,7 58 44,45 T3-83 2,51 38,7 75 41,09
szórás 0,5 12 13 -
5.3.3.3 Lisztminták teljes- és rekombináns AmA1 fehérjetartalma
Teljes fehérjetartalom
A transzgénikus búzavonalak T2, T3 és T4 szemtermésébıl ırölt lisztminták fehérjetartalmát
Kjeldahl módszerrel három ismétlésben határoztuk meg.
A Cadenza búzafajták T2 lisztmintáiban a legalacsonyabb (12,59%) fehérjetartalmat a #80
vonal lisztjében, míg a legmagasabbat (13,10%) az #58 vonal lisztjében mértük (5.7 táblázat).
A mért értékek csak kis eltérést mutattak a nem transzformált (donor) és a nem transzgénikus
(null) növénybıl nyert kontroll lisztminták fehérjetartalmához képest (12,65 és 12,58%). A
Bobwhite #15 vonal T2 lisztjének teljes fehérjetartalma (12,18%) sem mutatott szignifikáns
eltérést a kontroll lisztminta fehérjetartalmától (11,60%).
80
5.7 táblázat Transzgénikus búza T2 szemtermésébıl nyert lisztminták teljes- és AmA1 fehérjetartalma.
lisztminta teljes fehérje (%) AmA1 fehérje (%) Cadenza (donor) 12,65 0 Cadenza (null transzgénikus)
12,58 0
T2-28 12,81 2,41±0,05 T2-58 13,10 2,28±0,05 T2-59 12,92 2,17±0,05 T2-80 12,59 2,25±0,05 T2-83 12,66 1,78±0,05 Bobwhite (donor) 11,60 0 T2-15 12,18 2,22±0,05
A transzgénikus búzavonalak T3 és T4 szemtermésébıl ırölt lisztminták teljes
fehérjetartalma 12,16% (Bobwhite #15) és 14,03% (Cadenza #58) között változott (5.8
táblázat). A mért értékek ezekben a generációkban sem különböztek jelentısen a kontroll
lisztminták értékeitıl, a rekombináns fehérje expressziója nem növelte az endospermium
fehérjetartalmát számottevıen (Bobwhite 11,55%, Cadenza 12,85).
5.8 táblázat Transzgénikus búza T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták teljes- és AmA1 fehérjetartalma.
lisztminta teljes fehérje (%) Ama1 fehérje (%)
Bobwhite (null transzgénikus)
11,55 0
T3-15 12,16 2,09±0,05 Cadenza (donor) 12,85 0 Cadenza (null transzgénikus)
12,97 0
T3-28-6-tiszta 12,29 2,16±0,05 T3-28-12-tiszta 13,51 2,41±0,05 T4-28-1-1-tiszta 13,68 2,57±0,05 T3-58 14,03 2,07±0,05 T3-59-tiszta 13,87 2,45±0,05 T3-80-tiszta 13,04 2,27±0,05 T3-83 12,97 1,94±0,05
Chakraborty és mtsai. (2000) ugyanezt az AmA1, albumin típusú, amarantusz tartalékfehérjét
expresszáltatták burgonya gumóban a keményítı bioszintézisben résztvevı enzim (GBSS)
szövetspecifikus promóterének irányítása alatt. Az általuk publikált eredmények, a hatás,
változás mértékét tekintve, jelentıs mértékben eltérnek az általunk mért adatoktól. A
transzgénikus növény gumójában a fehérjetartalom 35-45%-kal nıtt. Az eltérés egyik
lehetséges magyarázata, hogy a kontroll növény gumóinak fehérjetartalma rendkívül alacsony
81
(1,15%) volt. További indok lehet, hogy a két promóter hatékonysága eltér egymástól,
valamint hogy a transzgén nem egy, hanem több mint három kópiában épült be a
burgonyanövény genomjába.
Hasonlóan magas fehérjetartalom növekedést detektáltak (6-32%) transzgénikus kukorica
endospermium szövetében az amarantusz amarantin nevő fehérjéjét (11S globulin)
expresszáltatva, a rizs glutelin-1 promótere segítségével Rascón-Cruz és mtsai. (2004). A
nagymértékő fehérje expresszió növekedést itt is valószínőleg a transzgén magas kópia száma
(10 vagy több) indokolja, de befolyásolhatta az alkalmazott szövetspecifikus promóter eltérı
hatékonysága is az adott célszövetben.
Lisztminták AmA1 rekombináns fehérjetartalma
A transzgénikus búzában expresszálódó AmA1 fehérje relatív mennyiségét (a teljes fehérje
százalékában) indirekt ELISA módszerrel, Kang és mtsai. (2003) leírása alapján határoztuk
meg.
A T2 szemtermésbıl ırölt lisztminták teljes fehérjetartalma, mint azt fent bemutattuk, nem
különbözött szignifikánsan a kontroll búzanövények lisztjének teljes fehérjetartalmától.
Ugyanakkor az AmA1 fehérje mennyiségét a különbözı transzgénikus búzanövények
lisztjében 1,78-2,41% közötti értékeknek találtuk (5.7 táblázat). A legalacsonyabb AmA1
fehérjetartalmat (1,78%) a Cadenza #83 vonal lisztjében, míg a legmagasabb fehérjetartalmat
(2,41%) a Cadenza #28 vonal lisztjében mértük. A Bobwhite #15 vonalak AmA1
fehérjetartalma a szemtermés lisztjében 2,22%, míg a T3 szemek endospermiumában 2,09%
volt. A Cadenza búzavonalak T3 szemtermésbıl ırölt lisztmintáinak AmA1 fehérjetartalma
1,94-2,45% között változott (5.8 táblázat). A legalacsonyabb AmA1 fehérjetartalmat (1,94%)
szintén a Cadenza #83 vonal lisztjében, míg a legmagasabbat (2,45%) a Cadenza #59 ’tiszta’
vonalának lisztjében mértük. A T2-28-1-1 növény 12 utódjának (tiszta T3 vonalak) T4
szemtermése ırlésével nyert liszt AmA1 rekombináns fehérjetartalma volt a legmagasabb
(2,57%) az összes vizsgált transzgénikus búza lisztmintáé között (5.8 táblázat).
Hasonló eredményeket publikáltak Altpeter és mtsai. (1996a) endospermium specifikus
promóterrel szabályozott transzgén expressziójának szintjére transzgénikus búzában.
Munkájukban a Bobwhite búzafajtába az abból egyébként hiányzó 1Ax1 HMW-GS
tartalékfehérje gént biolisztikus transzformációval juttatták be, aminek hatására az
endospermiumban mért alegységfehérje koncentráció elérte a 2,3%-ot a legjobban
expresszáló transzgénikus vonalakban az összfehérjére vonatkoztatva. Amikor ugyanezt a
genotípust a hibrid 1Dy10:1Dx5 HMW-GS konstrukcióval transzformálták (Blechl és
Anderson, 1996), az endospermiumban expresszálódott fehérje mennyisége hasonló volt a
82
vadtípusú gének expressziós szintjéhez (2% körüli érték). Ennél jelentısen magasabb fehérje
expressziót detektáltak Barro és mtsai. (1997) egyes HMW-GS fehérje génnel transzformált
transzgénikus búzavonalaikban. Ennek magyarázata lehet, hogy az 1Dx5 HMW
tartalékfehérje gént hordozó DNS szakasz igen magas kópiaszámban (10-15) van jelen a
transzgénikus búzavonalak genetikai állományában. Szántóföldi kísérletekben is igazolták,
hogy ez a magas expressziós szint (4-6-szorosa a vadtípusnak) stabilan öröklıdött több
generáción át (Rakszegi és mtsai., 2005; Shewry és mtsai., 2005). Az általunk kapott
adatokhoz hasonló értékeket mértek transzgénikus rizs endospermiumában az idegen fehérje
expresszióját vizsgálva Oszvald és mtsai. (2007). Kísérleteikben ugyanazt az endospermium
specifikus promótert (búza 1Bx17 HMW-GS) alkalmazták, s az ehetı vakcinaként is
használható fehérje koncentrációja elérte a 2,7%-ot (a teljes fehérjére vonatkoztatva) az egyes
vonalakban.
5.3.3.4 Lisztminták esszenciális aminosav tartalma
A különbözı transzgénikus búzavonalak lisztmintáinak esszenciális aminosav összetételét
Adebowale és mtsai. (2007) módszerével határoztuk meg. A T2 szemtermésbıl ırölt összes
lisztmintára vonatkozó eredményeket a Függelék III. számú táblázatában adjuk meg. A
táblázatban látható, hogy az egyes aminosavak tartalmában 0-6,4% növekedés mutatható ki a
kontroll lisztminta értékeihez képest. A legmagasabb AmA1 fehérjetartalmú (2,41%)
transzgénikus búza (Cadenza #28 vonal) lisztjének mért értékeit az 5.9 táblázatban is
bemutatjuk. Ebben a lisztmintában a legnagyobb változást (6,4% növekedés) a lizin aminosav
mennyiségében találtuk a donor növény (negatív kontroll) lisztminták lizin tartalmához
képest. A tirozin aminosav mennyisége 3,8%-kal, a treonin aminosavé 3,1%-kal nıtt, a
kontroll minták megfelelı aminosavainak értékeihez képest. A metionin aminosav
mennyiségében nem mérhetı változás ezzel a módszerrel.
83
5.9 táblázat A legmagasabb AmA1 fehérjetartalmú (2,41 %) transzgénikus Cadenza #28 vonal T2 szemtermésébıl nyert lisztminta esszenciális aminosav összetétele.
aminosav tartalom (%) aminosav
Cadenza (donor) Cadenza (null) transzgénikus #28 vonal His 2,26 2,20 2,28 (0,9) Ile 3,38 3,33 3,46 (2,4) Leu 6,53 6,45 6,58 (0,8) Lys 2,19 2,18 2,33 (6,4) Met 1,32 1,32 1,32 (0,0) Phe 5,03 4,98 5,08 (1,0) Thr 2,53 2,51 2,61 (3,1) Tyr 2,61 2,57 2,71 (3,8) Val 4,28 4,26 4,34 (1,4)
Az értékek három párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,01. Zárójelben a nem transzformált búzanövény lisztjében mért aminosav tartalomhoz viszonyított növekedést adtuk meg %-ban.
A legmagasabb AmA1 fehérjetartalommal rendelkezı ’tiszta’ búzavonalak (Cadenza #28,
#59, #80 utódai) T3 és T4 termésébıl ırölt lisztminták esszenciális aminosav tartalma az 5.10
táblázatban látható.
5.10 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták esszenciális aminosav összetétele.
aminosav tartalom (%) aminosav
Cadenza (donor) Cadenza (null) T4-28-tiszta T3-59-tiszta T3-80-tiszta His 2,26 2,20 2,29 (1,2) 2,28 (0,9) 2,28 (0,9) Ile 3,38 3,33 3,48 (3,0) 3,46 (2,4) 3,45 (2,1) Leu 6,53 6,45 6,62 (1,4) 6,58 (0,8) 6,57 (0,6) Lys 2,19 2,18 2,35 (7,3) 2,33 (6,4) 2,32 (6,0) Met 1,32 1,32 1,32 (0,0) 1,32 (0,0) 1,33 (0,8) Phe 5,03 4,98 5,10 (1,4) 5,08 (1,0) 5,07 (0,8) Thr 2,53 2,53 2,63 (4,0) 2,61 (3,1) 2,60 (2,8) Tyr 2,61 2,57 2,71 (3,8) 2,72 (4,2) 2,71 (3,8) Val 4,28 4,26 4,36 (1,9) 4,34 (1,4) 4,33 (1,2)
Az értékek három párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,01. Zárójelben a nem transzformált búzanövény lisztjében mért aminosav tartalomhoz viszonyított növekedést adtuk meg %-ban.
Az egyes aminosavak tartalmában figyelemreméltó növekedést mutattunk ki a kontrollhoz
lisztmintákhoz képest. A legnagyobb változást (7,3% növekedés) a lizin aminosav
mennyiségében mértük a transzgénikus búza (Cadenza #28 vonal) ‘tiszta’ T3 növényei
szemtermésébıl ırölt T4 lisztben, mindkét negatív kontroll lisztminta lizin aminosav
tartalmához képest. A másik két transzgénikus búzavonal (#59 és #80) T3 lisztjében is a lizin
84
aminosav mennyisége változott a legnagyobb mértékben (6,4% és 6,0%), míg a tirozin
mennyiségében 3,8-4,2%, a treonin mennyiségében 2,8-3,1% növekedést mértünk.
Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy az AmA1 fehérjét legnagyobb mennyiségben
(2,57%, 2,45% és 2,27%) termelı transzgénikus Cadenza búza #28, #59 és #80 ’tiszta’
vonalainak lisztjében a rekombináns fehérjetartalom növekedése szoros összefüggést mutat a
lisztminta esszenciális aminosav tartalom növekedésével. Az adatok alapján feltételezzük,
hogy ez az aminosav tartalom változás a transzgénikus búza szemtermésének
endospermiumában expresszálódó AmA1 fehérjének köszönhetı. Irodalmi adatok szerint
(Chakraborty és mtsai., 2000) ennek a fehérjének burgonya gumóban történı expresszáltatása
magas fehérjetartalom növekedés (35-45%) mellett azzal arányos, jelentıs mértékő esszen-
ciális aminosav tartalom növekedést is eredményezett (a lizin mennyisége ötszörösére, a
cisztein, metionin és tirozin aminosavak mennyisége hétszeresére nıtt a nem transzformált
növényben mért adatokhoz képest).
Rascón-Cruz és mtsai. (2004) transzgénikus kukoricában az Amaranthus hypochondriacus
11S globulin fehérjéjét (amarantin) expresszáltatták rizs glutelin-1 promótere segítségével. A
magas fehérjetartalom növekedéssel (6-32%) az esszenciális aminosav tartalom arányosan
nıtt (lizin 18%-kal, triptofán 22%-kal) a vadtipusú kukoricáéhoz képest (0,34% és 0,09%
teljes ırleményben).
Eredményeink azért biztatóak, mert a búza különösen e három (Lys, Thr, Tyr) esszenciális
aminosavban szegény. Az általunk mért, az irodalomban publikált adatokhoz képest
(Chakraborty és mtsai., 2000; Rascón-Cruz és mtsai., 2004) kisebb mértékő aminosav
tartalom növekedés, ahogyan a kisebb mértékő idegen fehérje koncentráció is, a transzgén
alacsonyabb kópia számával, valamint a búza endospermium jóval magasabb fehérje- és
esszenciális aminosav tartalmával magyarázható. Ha azonban figyelembe vesszük, hogy
Barro és mtsai. (1997) képesek voltak olyan transzgénikus búzát elıállítani, mely a
géntechnológiai úton bejuttatott 1Dx5 HMW-GS tartalékfehérje gént több kópiában (10-15),
több generáción át stabilan öröklıdve hordozza és magas szinten (4-6-szoros a vadtípushoz
képest) termeli, úgy tőnik technikailag lehetséges olyan magas Ama1 fehérjetartalmú búzát is
elıállítani, mely jelentısen megemelkedett szintő táplálkozástani értéket képvisel (akár 30-
35%-os esszenciális aminosav tartalom növekedés).
85
5.3.4 A transzgénikus búza lisztminták HPLC analízise
A transzgénikus búzanövények T2, T3 és T4 szemtermésébıl nyert búzalisztben nem csak a
fehérjetartalmat (teljes- és AmA1 fehérje), valamint aminosav tartalmat határoztuk meg,
hanem HPLC kromatográfiás módszerekkel vizsgáltuk és jellemeztük a transzgénikus búzák
tartalékfehérje összetételét is. Az SE- és RP-HPLC módszerek alkalmasak arra, hogy
tanulmányozzuk a lisztben megjelenı AmA1 rekombináns fehérje hatását a liszt funkcionális
tulajdonságaira, valamint hogy elıre jelezzük a tészta minıségében esetleg bekövetkezı
változásokat.
5.3.4.1 SE-HPLC vizsgálatok
A lisztmintákban a polimer (glutenin) és monomer (gliadin) fehérjék arányát (számított
Glu/Gli arány) az SE-HPLC kromatogramm adataiból, Batey és mtsai. (1991) módosított
módszerét követve határoztuk meg. A vizsgálatokhoz a transzgénikus vonalakból, valamint a
kontroll búzák lisztjébıl teljes-, oldható- és oldhatatlan fehérje frakciókat extraháltunk, majd
elemeztük azokat három ismétlésben. A herbicid rezisztencia tesztet túlélt transzgénikus
növények T2 szemtermésébıl nyert lisztmintákban a glutenin és gliadin fehérjék egymáshoz
viszonyított mennyisége 0,958 és 1,224 között változott (számított Glu/Gli arány, 5.11
táblázat).
5.11 táblázat Transzgénikus búzák T2 szemtermésébıl nyert lisztminták HPLC analízise.
lisztminta polimer/monomer (Glu/Gli) arány UPP% HMW/LMW arány
Cadenza (donor) 1,110 100,0 0,482 Cadenza (null) 1,112 97,64 0,462 T2-28 1,213* 108,4* 0,436 T2-58 0,958* 79,0* 0,477 T2-59 1,171* 104,4 0,509 T2-80 1,224* 106,5* 0,512 T2-83 1,184* 105,1* 0,518 Bobwhite (donor) 1,073 100,0 0,625 T2-15 1,074 109,9* 0,643
UPP%: oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyisége, HMW/LMW arány: nagy molekulatömegő- és kis molekulatömegő glutenin alegységfehérjék egymáshoz viszonyított mennyisége a polimer frakcióban. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 5% szignifikancia szinten.
Négy transzgénikus Cadenza vonal (#28, #59, #80 és #83) Glu/Gli aránya szignifikánsan nıtt
mindkét kontroll értékéhez képest (1,110 és 1,112). A donor növény lisztjének elemzési
adataiból számolt Glu/Gli arányt száz egységnek véve, az eltérések 5,5-10,1% között voltak.
86
A glutenin és gliadin fehérjék egymáshoz viszonyított mennyisége a Bobwhite #15 vonal
lisztjében szignifikánsan nem különbözött a kontrollhoz képest.
Az oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyiségének (UPP%) meghatározásához egy
széles körben elterjedt módszert alkalmaztunk (Gupta és MacRitchie, 1994). A polimer
fehérjék méreteloszlásának jellemzésére használt UPP% értéket a Cadenza donor növény
értékéhez viszonyítva adjuk meg. Azt 100 egységnek véve, a transzgénikus vonalak
lisztmintáinak UPP% értéke 4,4-9,9%-kal nıtt, ami a transzgénikus vonalak lisztmintáiban
(egy kivétellel) szignifikáns eltérést mutatott a kontroll minták értékeihez képest (5.11
táblázat). Szignifikáns pozitív változást három Cadenza vonal esetében kaptunk (#28, #80,
#83). A transzgénikus Bobwhite vonal (T2-15 minta) UPP% értéke jelentısen magasabb volt
(+9,9%), mint a kontrollé.
A T3 és T4 transzgénikus szemtermésbıl ırölt lisztminták Glu/Gli aránya 0,582 és 0,756
között változott (5.12 táblázat). Három transzgénikus búzavonal (Cadenza T4-28-1-1-tiszta,
T3-59-tiszta, T3-80-tiszta) Glu/Gli értéke szignifikáns pozitív változást mutatott mindkét
kontroll búzaliszthez képest, míg a #58 vonal lisztmintájában (Cadenza T3-58) szignifikánsan
alacsonyabb értéket kaptunk. A transzgénikus pozitív és negatív Bobwhite búzafajta
lisztjének Glu/Gli értékei nem tértek el egymástól.
5.12 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták HPLC analízise.
lisztminta polimer/monomer Glu/Gli arány
UPP%
Bobwhite (null transzgénikus) 0,577 100,0 T3-15 0,582 101,8 Cadenza (donor) 0,716 100,0 Cadenza (null transzgénikus) 0,703 100,2 T3-28-6-tiszta 0,702 101,3 T3-28-12-tiszta 0,726 101,9 T4-28-1-1-tiszta 0,751* 113,6* T3-58 0,668* 93,7* T3-59-tiszta 0,756* 114,8* T3-80-tiszta 0,741* 101,8 T3-83 0,738 104,8
UPP%: oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyisége. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 5% szignifikancia szinten.
A transzgénikus búzavonalak T3 szemtermésébıl nyert lisztminták UPP% értéke 1,3-14,8 %-
kal nıtt a kontrollhoz képest (5.12 táblázat), míg a T3-58 mintában csökkenést tapasztaltunk
(mínusz 6,3%), ami szignifikáns eltérést jelent. Szignifikáns pozitív változást a T3
87
szemtermések lisztjében csak egy esetben (T3-59-tiszta, 14,8%) mértünk, de a T4-28-1-1-tiszta
lisztmintában is nıtt (13,6%) az oldhatatlan polimer fehérjék aránya. A transzgénikus
Bobwhite búzafajta ezen paramétere sem mutatott változást az AmA1 fehérje expressziójának
hatására.
Vizsgálatainkban a Cadenza búzafajta egyik transzgénikus vonala (#58) rendre eltérı módon
viselkedett a többi transzgénikus vonal lisztmintáitól a funkcionális tulajdonságokat vizsgáló
SE-HPLC analízisek során. A T2-58 és T3-58 transzgénikus lisztmintákban lévı
tartalékfehérjék Glu/Gli arányát és UPP% értékét egyaránt szignifikánsan alacsonyabbnak
találtuk a kontrollhoz képest. A szignifikánsan negatív eltérések a kontrolltól valószínőleg a
transzformáció során bekövetkezı nem kívánatos változások következményei, mely eredhet
magából a transzformáció eljárásából, de okozhatja a transzgén hibás integrációja vagy
kromoszóma átrendezıdés is (Rooke és mtsai., 2003; Shewry és Jones, 2005). Mindezek
kiszámíthatatlan agronómiai tulajdonságbeli (Svitashev és mtsai., 2002; Barro és mtsai.,
2003) vagy funkcionális tulajdonságbeli változásokhoz vezethetnek (Blechl és mtsai., 1998;
és Békés Ferenc személyes közleménye).
Ugyanakkor a transzgénikus Cadenza búza #28-as vonal utódainak szemtermésébıl készült
lisztminták Glu/Gli arányát és UPP% értékeit mind a három generációban szignifikánsan
magasabbnak találtuk a kontrollok értékeihez képest. Ezek a megemelkedett értékek, irodalmi
adatok szerint, hozzájárulnak a búzalisztbıl készült tészták dagasztási reológiai és
tulajdonságainak javulásához (Uthayakumaran és mtsai., 1999; 2001). Munkájuk során
összehasonlítottak különbözı Glu/Gli értékekkel rendelkezı búzaliszteket és kimutatták, hogy
a lisztben mérhetı polimer/monomer fehérje arány pozitívan korrelált a tészta reológiai,
dagasztási és kenyérsütési paramétereivel. A búzaliszt másik fontos, a végtermék minıségét
(end-use quality) befolyásoló paramétere a lisztben lévı polimer fehérjék méreteloszlása,
melyet az UPP% értékkel jellemezhetünk. Irodalmi adatok szerint szoros összefüggés van a
polimerek méreteloszlása és a különbözı búzafajták kenyérsütési (pl. cipó magasság és cipó
térfogat) tulajdonságai között (Gupta és mtsai., 1995).
Nem csak különbözı vad típusú búzafajták lisztjeiben vizsgálták a Glu/Gli, továbbá az UPP%
értékek és a liszt funkcionális tulajdonságainak kapcsolatát, hanem búza HMW glutenin
alegységfehérje génekkel transzformált transzgénikus búzavonalakban is. A transzgénikus
liszt funkcionális tulajdonságainak változása erıs korrelációt mutat a két érték
megnövekedésével (Rooke és mtsai., 1999; Uthayakumaran és mtsai., 2003; Rakszegi és
mtsai., 2005; León, és mtsai., 2009). Az 1Dx5 HMW alegységfehérje expressziója a
transzgénikus búzában olyan mértékben megváltoztatta a Glu/Gli és az UPP% értékét a
88
lisztben, hogy a kenyértészta túlzottan erıssé vált, a bevált módon mikro-készülékben nem
volt dagasztható (Barro és mtsai., 1997). Az LMW glutenin alegységfehérjék expressziója
transzgénikus búzában szintén megváltoztatta a polimer monomer fehérjék arányát és az
UPP% értékét, mivel képesek beépülni a sikér fehérje mátrixába, de kevésbé drasztikusan
növelték a polimer fehérjék méreteloszlását. Emiatt hatásuk kevésbé erıteljes a liszt
funkcionális tulajdonságaira, a tészta egyes dagasztási paramétereire (Masci és mtsai., 2003;
Tosi és mtsai., 2005).
Az általunk vizsgált transzgénikus búzavonalak lisztjében a szignifikánsan magasabb Glu/Gli
és UPP% értékek az amarantusz albumin fehérje pozitív hatását jelzik a búzaliszt funkcionális
tulajdonságaira.
5.3.4.2 RP-HPLC vizsgálatok
A liszt minıségét még a HMW/LMW arány változása is befolyásolhatja (Gupta és mtsai.,
1989, 1995), ezért ezt az arányt is megmértük a transzgénikus lisztmintákban. A polimer
frakción belül a HMW- és LMW glutenin alegységfehérjék egymáshoz viszonyított
mennyiségét RP-HPLC módszerrel határoztuk meg. A vizsgálatokhoz Marchylo és mtsai.
(1989) módosított eljárását használtuk. A transzgénikus és kontroll búzanövények T2
szemtermésébıl nyert lisztminták kromatogrammjainak görbe alatti területeibıl HMW/LMW
arányt számoltunk. Az adatok az 5.11 táblázatban láthatók (5.3.4.1 fejezet). A transzgénikus
Cadenza búzafajták lisztjének HMW/LMW aránya 0,436 és 0,518 között változott. A számolt
értékek egyike sem mutatott szignifikáns eltérést a kontroll növények adataihoz képest. A
transzgénikus Bobwhite búzafajta HMW/LMW aránya sem mutatott szignifikáns eltérést a
kontroll növényben mért értékhez képest. Eredményeink azt jelzik, hogy a pszeudo cereália
albumin fehérjéjének expressziója a búza endospermiumában nem befolyásolja a búzaliszt
ezen paraméterét, azaz nem változtatja meg sem a nagy-, sem a kismolekulatömegő glutenin
fehérjealegységek expressziós szintjét. Mivel a T2 szemtermésbıl nyert lisztminták
HMW/LMW arányában nem tapasztaltunk változást a transzgénikus lisztmintákban, ezt a
paramétert a T3 és T4 transzgénikus szemtermésbıl ırölt lisztmintákban nem vizsgáltuk.
5.3.5 A transzgénikus búzavonalak lisztjének funkcionális vizsgálatai
A búzafajták kenyérminıségét meghatározó módszerek alapvetıen két típusba sorolhatók. Az
úgynevezett közvetett módszerek valamilyen, a tészta minıségével szoros összefüggésben
álló fizikai tulajdonságot határoznak meg, mint pl. az ülepedési képesség – szedimentációs
érték. Az úgynevezett közvetlen módszerek a tészta reológiai tulajdonságairól (erısség,
89
stabilitás, nyújthatóság) adnak információt. A fajta nemesítés kezdeti szakaszában, a genetikai
módosítás lehetıségeinek tanulmányozásakor és a változások molekuláris szinten történı
magyarázatához szükséges vizsgálatokban a rendelkezésre álló minta mennyisége korlátozott.
A hagyományos mőszerek analógiájára készült, ún. mikro-készülékekkel és mikro-
módszerekkel már néhány grammnyi liszt minıségi paramétereit, illetve a paraméterek
néhány mg tisztított fehérje adagolása hatására bekövetkezı változásait vizsgálhatjuk (Békés
és mtsai., 2003).
5.3.5.1 Lisztminták Zeleny szedimentációs tesztje
Munkánkban a Zeleny szedimentációs teszt (AACC Method 56-61A) kis mintamennyiségek
vizsgálatára alkalmas változatát használtuk (mikro Zeleny teszt) és a Tömösközi és mtsai.
(2005) által leírt módszert követtük. A transzgénikus búzavonalak szemtermésébıl ırölt
lisztminták vizsgálati eredményeit az 5.13 táblázatban mutatjuk be.
5.13 táblázat Transzgénikus búzák T2 , T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták szedimentációs vizsgálata.
T2 szemtermés mikro Zeleny érték (ml)
T3 és T4 szemtermés
mikro Zeleny érték (ml)
Bobwhite (donor) 3,86 Bobwhite (null transzgénikus)
3,49
T2-15 3,75 T3-15 3,52 Cadenza (donor) 3,33 Cadenza (donor) 3,63
Cadenza (null transzgénikus)
3,38 Cadenza (null transzgénikus)
3,77
T2-28 3,85* T3-28-6 -tiszta 3,85
T3-28-12 -tiszta 4,19*
T4-28-1-1 -tiszta 4,21*
T2-58 2,84 T3-58 3,58
T2-59 4,55* T3-59 -tiszta 4,09*
T2-80 4,47* T3-80 -tiszta 4,16*
T2-83 4,00* T3-83 4,07* Az értékek 3 párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,1.
A transzgénikus Bobwhite #15 búzavonal lisztmintáinak szedimentációs értéke (3,75 ml T2-
15; 3,52 ml T3-15) egyik generációban sem különbözött a kontrollétól. A transzgénikus
Cadenza búzavonalak lisztmintáinak szedimentációs értékei 2,84-4,55 ml (T2 szemtermés) és
3,52-4,19 ml (T3 szemtermés) között változtak, és három kivétellel (2,84 ml T2-58 lisztminta;
3,58 ml T3-58; 3,85 ml T3-28-6 -tiszta) szignifikánsan magasabb értéket mutattak a kontroll
90
búzanövények lisztmintáira kapott értékeknél. A legmagasabb szedimentációs értéket (4,21
ml) az összes vizsgált minta között a Cadenza T4-28-1-1-tiszta szemtermésébıl nyert
lisztmintán mértük. A transzgénikus Cadenza vonalak két generációjának lisztmintáira kapott
eredményeink nagyon hasonlóak, a lisztminták többségének szedimentációs értéke magasabb
volt a kontrollokénál. Ez azt jelezheti, hogy az AmA1 fehérje megjelenése a búza
endospermiumban pozitív hatással van, de biztosan nem rontja, a liszt funkcionális
tulajdonságait, melyeket a Zeleny szedimentációs teszt segítségével is mérhetünk. Ez a
módszer, az irodalmi adatok szerint, a liszt poliszacharidjainak és fehérjéinek duzzadási
tulajdonságaival kapcsolatba hozható információt ad, amely többek között hatással lehet a
vizsgált genotípus lisztjébıl készült tészta erısségére és a várható kenyértérfogatra
(Halverson és Zeleny, 1988). Shewry és Tatham (2000) kimutatták, hogy a Zeleny
szedimentációs érték pozitív korrelációt mutat a fehérjetartalommal és a szemkeménységgel,
de befolyásolja azt a búza endospermium tartalékfehérje összetétele és a liszt készítésekor
alkalmazott ırlési technológia is. Utóbbi a keményítıszemcsék töredezettségét, és ezen
keresztül vízfelvevı képességét módosíthatja. Az általunk vizsgált szemtermések keménységi
indexe és a belılük nyert lisztminták fehérjetartalma nem változott meg szignifikánsan a
rekombináns fehérje búza endospermiumban történı expressziója hatására. Így nagy
valószínőséggel, mint azt az SE-HPLC vizsgálatok eredményei is jelzik, a búzaszemek
tartalékfehérje összetétele módosulásából adódó változást tudtuk kimutatni a Zeleny szám
változásával. A vizsgált lisztminták egy része nem mutatott szignifikáns pozitív eltérést, vagy
éppen alacsonyabb szedimentációs értékő volt, mint a kontroll lisztminták értékei. Hasonlót
tapasztaltak Masci és mtsai. (2003) is, akik az LMW-GS tartalékfehérje génekkel
transzformált búzavonalak lisztjének SE-HPLC és reológiai vizsgálataival ugyanakkor
egyértelmően igazolták a transzgén expressziójának pozitív hatását a liszt funkcionális
tulajdonságaira.
5.3.5.2 Lisztminták reológiai tulajdonságainak vizsgálata mikro-Valorigráffal
A reológiai sajátságok mérése a lisztbıl víz hozzáadásával készült tészta dagasztási
paramétereinek meghatározásával történik. Annak tanulmányozására, hogy a transzgénikus
búzában expresszáltatott albumin típusú fehérje milyen hatással van a lisztbıl készített tészta
dagasztási paramétereire, nagyobb mennyiségő búzaliszttel kell rendelkezni. Így a dagasztási
kísérletekhez azokat a T3 és T4 szemtermésbıl ırölt lisztmintákat használtuk, melyek legalább
15-18 g mennyiségben álltak rendelkezésünkre (Bobwhite T3-15 és 7 db transzgénikus
Cadenza búzavonal lisztmintái). A mérést mikro-Valorigráf (mikro z-arm mixer) prototípusán
91
végeztük úgy, ahogyan azt a szerzık leírták (Tömösközi és mtsai., 2000; Haraszi és mtsai.,
2004). Egy a készülékkel felvett tipikus alapgörbét és a belıle leolvasható paramétereket az
5.8 ábrán mutatjuk be.
5.8 ábra A mikro z-arm mixerrel felvett alapgörbe. DDT: a maximális tésztaellenállásig eltelt idı (Dough Development Time, s). PR: maximális tésztaellenállás (Peak Resistance, VU). ST: stabilitás, az a hossz, mely a PR elıtti és utáni görbeelhajlásig tart (Stability, s). BD: tésztaellágyulás, a PR utáni 10 perces görbeszakasz és a maximumhoz húzott egyenes közötti területérték (Break Down in Resistance, VU x s).
A transzgénikus búzavonalak lisztmintáival elvégzett dagasztási kísérletek eredményeit az
5.14 táblázatban foglaltuk össze.
A Bobwhite transzgénikus búzavonal T3-15 szemtermése lisztmintájából készített tészta
dagasztási idıszükséglete (DDT), dagasztással szembeni maximális ellenállása (PR) és tészta
ellágyulási értéke (BD) nem különbözött szignifikánsan a Bobwhite null transzgénikus
kontroll értékétıl. Ugyanakkor a tészta stabilitása szignifikánsan magasabb volt (1,4 perc),
mint a kontrollé (1,1 perc).
DDT
92
5.14 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták dagasztási paraméterei.
lisztminta maximális
tésztaellenállás (VU)
dagasztási idıszükséglet
(perc)
tésztaellágyulás (VU x s)
stabilitás (perc)
Bobwhite (null transzgénikus)
450 3,23 118 1,1
T3-15 477 3,35 118 1,4* Cadenza (donor) 483 3,52 97 0,8 Cadenza (null transzgénikus)
497 3,58 98 0,9
T3-28-6-tiszta 433* 3,59 62* 1,6* T3-28-12-tiszta 530* 4,11* 98 1,4* T4-28-1-1-tiszta 583* 4,22* 89 1,4* T3-58 493 3,47 98 1,0 T3-59-tiszta 531* 3,24* 100 1,1* T3-80-tiszta 486 3,46 81 1,2* T3-83 505 3,59 89 1,2*
Az értékek 2 párhuzamos mérés átlagai. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 10% szignifikancia szinten.
A Cadenza transzgénikus búzák lisztmintáin mért dagasztási idık 3,24 és 4,22 perc között
változtak. A vizsgált hét Cadenza lisztminta közül két minta (T3-28-12-tiszta, T4-28-1-1-
tiszta) dagasztási idı szükséglete szignifikánsan magasabb (10% szignifikancia szinten), a T3-
59-tiszta mintáé szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontrollok értékei (3,52 és 3,58
perc). Ez utóbbi azért érdekes, mert tésztájának maximális ellenállása a második legmagasabb
érték volt (531 VU) és stabilitása is szignifikánsan nagyobb volt (1,1 perc), mint a
kontrolloké. A dagasztással szembeni maximális ellenállás értékei (PR) 433 és 583 VU között
változtak. A tésztaminták dagasztással szembeni ellenállása szignifikánsan nıtt, azaz a tészta
erısebb volt, a Cadenza #28 transzgénikus vonal, három úgynevezett ’tiszta’ utódvonalainak
szemtermésébıl nyert lisztmintákból készült tészták esetén. Közülük is a legmagasabb PR
értéket a T4 szemtermés lisztjébıl készült tészta mutatta (583 VU). A vizsgált lisztminták
mindegyike egy kivétellel (T3-58) jelentısen stabilabb tésztát adott (ST 1,1-1,4 perc), mint a
kontrollok.
A transzgénikus Cadenza T3-58 szemtermés lisztjébıl készült tészta egyetlen egy dagasztási
paramétere sem különbözött a kontrollétól. A dagasztási kísérletekben ugyanúgy eltérı
viselkedést mutatott, mint azt az SE-HPLC és a Zeleny szedimentációs vizsgálatokban
tapasztaltuk. Feltételezzük, hogy a többi transzgénikus vonaltól eltérı viselkedés oka a
transzformáció során lejátszódott folyamatokban keresendı. Fontos megjegyezni, hogy az 58-
as vonal Southern blot analízisének képe eltért a 28-as vonal képétıl.
93
A legjobb paraméterekkel jellemezhetı tésztát a T4-28-1-1-tiszta lisztmintából dagasztottuk,
melynek három mért paramétere szignifikánsan eltért a kontrollokéitól. A T4-28-1-1-tiszta
lisztmintából és a kontrollból mikro-Valorigráffal dagasztott tészta dagasztási görbéit az 5.9
ábrán mutatjuk be. Az ábrán látható görbék lefutása hasonló, de a transzgénikus mintán mért
jelentısen nagyobb maximális ellenállás és a stabilitás értékek erısebb (rugalmasabb és
stabilabb) tészta kialakulását igazolják. A T4-28-1-1 mintából kapott lisztnek a dagasztás
során mért, az erısségre vonatkozó paraméterei, az összes vizsgált minta közül a
legmagasabbak (PR, 583 VU; DDT, 4,22 perc). Ugyanakkor jelentısen javult a tészta
stabilitása, melyet az ST érték növekedése (1,4 perc) és a tészta ellágyulási értéke (BD)
csökkenése (89 VU x s) jelez. Irodalmi adatok szerint a tészta erısség javulását a dagasztási
idıszükséglet (DDT) és az úgynevezett maximális dagasztási ellenállás (PR) növekedése jelzi
(Békés és mtsai., 1994b). Hasonlóan jó dagasztási paramétereket mértünk a T3-28-6-tiszta
lisztmintából készült tésztán is, melynek stabilitás értéke a legmagasabb (1,6 perc),
ellágyulási értéke a legkisebb (62 VU x s) és PR értéke is szignifikánsan magasabb (433 VU)
volt a kontrollénál. A dagasztási idıszükséglet (3,59 perc) nem különbözött a kontrollétól.
5.9 ábra A transzgénikus T4-28-1-1-tiszta lisztmintából és a Cadenza kontrollból mikro-Valorigráffal dagasztott tészta alapgörbéi.
Irodalmi adatokból jól ismert, hogy az amarantuszok tartalékfehérjéi pozitív hatással vannak a
búzalisztbıl készült tészta funkcionális tulajdonságaira mind egyszerő addíció után (Ayo,
2001; Silva-Sanchez és mtsai., 2004) mind inkorporálva azokat a búzaliszt fehérje mátrixába
(Oszvald és mtsai., 2009). A búzalisztben lévı fehérjék szabad SH csoportjaikon keresztül
képesek diszulfid hidakat (S-S kötés) létrehozni, melynek eredményeképpen javul a
búzatészta erıssége, rugalmassága (Tamas és mtsai., 2002). Az S-S kötések létrejöttének
hatását a búzaliszt tulajdonságaira egyrészt a polimer/monomer (Glu/Gli) fehérjék arányának
mérésével (SE-HPLC technika, 5.3.4 fejezet), dagasztási kísérletekkel (mint fent), valamint a
94
lisztminták dagasztása során kapott tészták fehérje összetételének elemzésével (SE-HPLC,
mint alább) követhetjük nyomon.
A tésztamintákat, melyek dagasztását a maximális ellenállás elérésekor abbahagytuk,
fagyasztva szárítottuk, majd a korábban leírt módon kinyert három fehérje frakció összetételét
SE-HPLC módszerrel elemeztük. A görbe alatti területekbıl számolt Glu/Gli arány értékeket
és a normalizált (a Cadenza donor növény lisztjének tésztájára vonatkoztatott) UPP%
értékeket az 5.15 táblázatban mutatjuk be. Eredményeink szerint a transzgénikus Bobwhite
búzafajta T3-15 lisztjébıl készült tészta fehérje összetétele valószínőleg megváltozott
(szignifikánsan nagyobb Glu/Gli arány és UPP% a Bobwhite null transzgénikus kontroll
értékeihez képest), ami az AmA1 fehérjének a sikér fehérje mátrixába való beépülését jelzi.
Hasonlóan pozitív változás figyelhetı meg a Cadenza lisztminták dagasztása során is három
kivétellel (T3-28-12-tiszta, T3-59-tiszta, T3-83), mely mintáknak csak az egyik mért
paramétere mutatott jelentıs eltérést a kontrollétól. A másik három minta (T3-28-6-tiszta, T4-
28-1-1-tiszta és T3-80-tiszta) mindkét szignifikánsan magasabb mért értéke azt jelzi, hogy a
rekombináns AmA1 fehérje expressziója a búza endospermiumban pozitív hatással van a
búzaliszt funkcionális tulajdonságaira, a tészta minıségére.
5.15 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 lisztjébıl dagasztott tésztaminták HPLC analízise.
lisztminta UPP% polimer/monomer (Glu/Gli) arány
Bobwhite (null transzgénikus) 104,1 0,718 T3-15 112,1* 0,767* Cadenza (donor) 100,0 0,931 Cadenza (null transzgénikus) 97,0 0,920 T3-28-6-tiszta 116,7* 1,016* T3-28-12-tiszta 110,7 0,994* T4-28-1-1-tiszta 122,3* 1,136* T3-58 - - T3-59-tiszta 113,7* 0,955 T3-80-tiszta 111,7* 0,972* T3-83 114,4* 0,951
UPP%: oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyisége. Az értékek 3 párhuzamos mérés átlagai. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 5% szignifikancia szinten.
A kapott eredményeket úgy értelmezhetjük, hogy az AmA1 fehérje cisztein aminosavainak
szabad -SH csoportjain keresztül S-S kötéseket alakított ki a búza tartalékfehérjék szabad -SH
csoportjaival, ami hosszabb polimer fehérjék létrejöttét eredményezte. Ennek következtében
az SE-HPLC mérések során magasabb Glu/Gli arány és UPP% értékeket kaptunk ezen
95
transzgénikus mintákban. Fontos megjegyezni, hogy ezeket a lisztmintákat ’tiszta’
transzgénikus búzavonalak szemtermésébıl nyertük, melyben a transzgén jelenléte homogén,
minden búzaszemben jelen van és expresszálódik róla a fehérje. Eredményeink jól egyeznek
Uthayakumaran és mtsai. (1999) által publikáltakkal, akik rekonstrukciós tészta kísérletek
sorozatán keresztül bizonyították, hogy a polimer/monomer arány növekedése (állandó
fehérjetartalom mellett) erısen befolyásolja a kenyértészta tulajdonságait, így például
szignifikánsan növeli a tészta kialakulási idıt, a tészta erısségét, stabilitását, valamint a
kenyércipó magasságát és térfogatát.
A munkánk során elıállított egyes transzgénikus búzavonalak endospermiumában 1,94-2,57%
rekombináns AmA1 fehérjetartalmat mutattunk ki, miközben a lisztminták teljes
fehérjetartama nem különbözött szignifikánsan a kontroll növények lisztmintáinak
fehérjetartalmától. A legmagasabb AmA1 fehérjetartalom a T4-28-1-1-tiszta lisztmintát
jellemzi, melynek minden kísérletünkben vizsgált paramétere szoros összefüggést mutat ezzel
az értékkel. Az AmA1 fehérjét tartalmazó transzgénikus búzaliszttel kapott eredményeink
teljes összhangban vannak a korábban, amarant albumin típusú fehérjékkel elvégzett és
publikált, búzalisztbıl készült tészta, rekonstrukciós vizsgálatainak eredményeivel (Oszvald
és mtsai., 2009). Kémiai inkorporációs, mikro-dagasztási és SE-HPLC módszerekkel kapott
eredmények értékelése alapján megállapították, hogy 3% (a liszt teljes fehérjetartamára
vonatkoztatva) amarantusz albumin fehérje beépítése a tészta fehérje mátrixába pozitívan
befolyásolja a búzatészta minıségét.
Eredményeink azt mutatják, hogy a géntechnológiai úton történı nemesítés nem csak a búza
táplálkozástani minıség javításának alkalmas módszere lehet a búzaliszt esszenciális
aminosav tartalmának növelése által, de megfelelı tulajdonságú fehérje génjének beépítésével
a búza genetikai állományába, javíthatók a búzaliszt funkcionális tulajdonsága is.
96
6. ÖSSZEFOGLALÁS
A búza (Triticum aestivum L.) táplálkozástani minıségét és a búzalisztbıl készült tészta
felhasználhatóságát fıként az endospermiumban található tartalékfehérjék kémiai összetétele
és szerkezete határozza meg. A búza táplálkozástani értéke jelentısen eltér az állati fehérjék
táplálkozástani értékétıl, mert az endospermiumból ırölt liszt esszenciális aminosavakban
szegény (arginin, hisztidin, tirozin, treonin), de különösen a lizin aminosav mennyisége
limitáló. A liszt fehérje-, valamint annak aminosav összetételét, továbbá a liszt funkcionális
tulajdonságait ma már géntechnológiai úton történı nemesítéssel is meg lehet változtatni.
A sikeres genetikai transzformáció elsıdleges követelménye a hatékony növényregenerációs
rendszer, ezért munkánk elsı lépéseként magyar ıszi búza genotípusok (Mv Emese, Mv
Magvas, Mv Martina, Mv Pálma, Mv Emma, Bánkúti 1201/B2, /B8, /B70) éretlen embrióinak
szövettenyésztéséhez dolgoztunk ki megfelelı módszert. A hımérséklet- és a hajtásregeneráló
táptalajokban alkalmazott MS makroelemek mennyiségének csökkentése, valamint a
fényintenzitás fokozatos növelése minden vizsgált genotípus esetén magas (átlag 78%)
regenerációs hatékonyságot eredményezett. A legjobban regenerálódó (99%) Mv Emese és
két tavaszi búzafajtával (Bobwhite, Cadenza) a módszert búza transzformációhoz
optimalizáltuk. A szkutellumok megfelelı mérető éretlen embriókból történı preparálása és a
szövettenyésztési körülmények módosítása (rövid, 3 hetes fázisok, embriógenézist indukáló
táptalajok használata a kalluszindukcióban és a hajtásregeneráció korai szakaszában) olyan
növényregenerációs rendszerhez vezetett, melynek alkalmazása lehetıvé tette a sikeres,
megfelelı hatékonyságú búza transzformációs rendszer kialakítását.
Munkánk célkitőzésének megvalósításához (búza táplálkozástani minıségének javítása) az
Amaranthus hypochondriacus egyik tartalékfehérje génjét választottuk. A gén által kódolt
nem allergén fehérje nagy táplálkozástani értéket képvisel, esszenciális aminosav tartalma
magas (lizin 7,7%, tirozin 7,0%, treonin 5,4%), emiatt a WHO is ajánlja fogyasztásra. A 35
kDa mérető fehérjét kódoló ama1 gént búza endospermium specifikus promóterhez
kapcsoltuk és biolisztikus módszerrel juttattuk a búza genetikai állományába. Az elıállított
nagy számú transzgénikus búzavonalból hét független vonalat (Bobwhite #15, Cadenza #28,
#58, #59 #80, #83, Mv Emese #71) több generáción át vizsgáltunk. A levélbıl kinyert genomi
DNS-en elvégzett PCR analízissel megállapítottuk, hogy a transzgén öröklıdése megfelelt a
Mendeli öröklıdés szabályainak. A T2 generáció növényei között találtunk olyan
utódvonalakat is, melynek minden vizsgált növénye hordozta a transzgént. Ezeket ’tiszta’
97
vonalaknak neveztük. A transzgén jelenlétét a genomi DNS-ben Southern-blot, a fehérje
expressziót Western-blot analízissel bizonyítottuk. A promóter szövetspecifikus mőködését
RT-PCR-rel, igazoltuk. A növények éretlen szemtermésében a mRNS már 10 nappal a
virágzás után jelentıs mennyiségben jelen volt, termelıdése a 20-ik napig nıtt, majd lassan
csökkent. Az éretlen endospermiumokban expresszálódó AmA1 fehérje növekvı
mennyiségben akkumulálódott a búzaszem fejlıdésének elırehaladtával.
A T2, T3 és T4 szemtermésbıl ırölt lisztben indirekt ELISA módszerrel 1,78-2,57%
rekombináns fehérjetartalmat mértünk, miközben a teljes fehérjetartalom érdemben nem
változott. A legjobban expresszáló búzavonalban a rekombináns fehérjetartalom növekedése
szoros összefüggést mutatott a lisztminta esszenciális aminosav tartalom növekedésével
(7,3% lizin, 4,0% treonin és 3,8% tirozin aminosav), ami alapján feltételezzük, hogy ez a
transzgénikus búza endospermiumában expresszálódó AmA1 fehérjének tulajdonítható.
A transzgénikus búza lisztmintákban megjelenı AmA1 fehérje hatását SE- és RP-HPLC
módszerekkel vizsgáltuk. A vizsgált lisztminták nagy részében szignifikánsan magasabb
polimer/monomer fehérje arányt (Glu/Gli) és a polimer fehérjék méreteloszlását jellemzı
UPP% értéket mutattunk ki. A Cadenza #28 búzafajta utódvonalainak szemtermésébıl készült
lisztminták Glu/Gli aránya és UPP%-a mind a három generációban szignifikáns javulást
mutatott a kontroll lisztmintákhoz képest. A megemelkedett értékek a tészta dagasztási,
reológiai tulajdonságainak javulását jelezték. A dagasztási paramétereket mikro z-arm
mixerrel mértük. A T4-28-1-1-tiszta lisztmintából dagasztott tészta három dagasztási
paramétere szignifikánsan eltért a kontrollok értékeitıl. Nıtt a tészta erıssége és stabilitása,
valamint csökkent a tészta ellágyulási értéke. A dagasztott tésztából kinyert fehérjeminta SE-
HPLC vizsgálata valószínősíti, hogy a több cisztein aminosavat tartalmazó AmA1 fehérje
beépült a tészta fehérje mátrixába. Eredményeink in vivo igazolják a korábban amarantusz
albumin fehérjével, búza lisztmintán végzett inkorporációs vizsgálataink publikált adatait.
Már kb. 3% albumin fehérje képes javítani a búzaliszt funkcionális tulajdonságait, a tészta
dagasztási paramétereit, ha az beépül a tészta fehérje mátrixába.
Eredményeink igazolják, hogy a géntechnológiai úton történı nemesítés során lehetıség van a
búza táplálkozástani értékének és a liszt funkcionális tulajdonságának együttes javítására, ha
megfelelı tulajdonságú fehérjét választunk ki a transzformáláshoz.
98
SUMMARY
Wheat (Triticum aestivum L.) is one of the most important food crops for about half of the
human population forming a staple diet in over 60 countries. The nutritional quality of the
wheat is mainly determined by the low essential amino acid content of the storage proteins.
Especially the lysine and threonine are present in limiting amounts in the prolamin protein
fraction of the flour. The white flour contains even less lysine and threonine as a result of the
milling process. With the removal of the aleurone and embryo tissues of the grain, high
amounts of essential amino acids are lost. Our attempt to improve the amino acid contents of
the flour produced from wheat is the gene technology approach to express recombinant
storage protein with the appropriate amino acid profiles in the wheat endosperm tissue.
In the present work Hungarian winter wheat varieties with high callus induction and plant
regeneration ability, suitable for breeding purposes, were screened. An efficient tissue culture
method for plant regeneration from immature embryos of wheat varieties (Mv Emese, Mv
Magvas, Mv Martina, Mv Pálma, Mv Emma, Bánkúti 1201/B2, /B8, /B70) was established.
The effects of the concentration of macroelements in the regeneration medium, the incubation
temperature and the light intensity were investigated on the plant regeneration frequency. The
most remarkable effect was achieved by reducing both the incubation temperature to 23 °C
and the concentration of macroelements in the regeneration medium to half strength. This
modification increased the average plant regeneration frequency from about 10% to 78%.
Changes in the light intensity and the temperature raised the average frequency to 83%. The
method was optimised for biolistic transformation of the best performing Mv Emese and two
spring wheat varieties (Bobwhite, Cadenza) with the use of embriogenesis inducing tissue
culture parameters.
For biolistic transformation of these bread wheat varieties, an amaranth (A. hypochondriacus)
albumin gene, encoding the 35-kDa AmA1 protein of the seed, with high content of essential
amino acids (Lys 7.7%, Tyr 7.0%, Thr 5.4%), was chosen. Transformation cassette carried the
ama1 gene under the control of a powerful wheat endosperm-specific promoter (1Bx17
HMW-GS). Southern blot analysis of T1 lines (#28 and #58) confirmed the stable integration
of the foreign gene into the genetic material. Seven independent transgenic lines (Bobwhite
#15, Cadenza #28, #58, #59, #80, #83, Mv Emese #71) were investigated in T1, T2 and T3
generations by PCR analysis of the genomic DNA. The segregation ratio (around 3:1) was
consistent for the normal transmission of a single transgene locus. Transcription and
99
translation of the ama1 gene showed tissue specificity in both RT-PCR and Western blot
analysis of the endosperm prepared from either immature or mature seeds. Transcripts were
detected neither in leaf nor in root tissues. Study of the protein expression pattern on
developing endosperm tissues (at 17, 24 and 31 DPA) in the best performing transgenic line
#28 also confirmed the proper function of the promoter. The amaranth albumin protein
appeared in increasing amount within the wheat endosperm.
The effects of the extra albumin protein on the properties of flour, produced from T2, T3 and
T4 seeds, total protein, essential amino acid content analysis, furthermore polymeric-to-
monomeric protein and HMW-to-LMW glutenin subunit ratio measurements were performed.
We found no significant changes in total protein content of the flour from transgenic lines,
while the AmA1 protein was present in reasonable quantity (1.78-2.57%). The amount of the
accumulated AmA1 protein showed a close correlation with the increase in the essential
amino acids content (7.3% Lys, 4.0% Thr, 3.8% Tyr). From these data we conclude that the
improvement of the amino acid composition was due to the expression of the AmA1 protein.
These findings are very important, as these amino acids are highly deficient in common wheat
flour. To detect any changes in the flour functional quality, like the S-S bond formation
between the storage proteins, the polymeric-to-monomeric (Glu/Gli) protein ratio and the
unextractable polymeric protein ratio (UPP%) were calculated from the SE-HPLC data. The
Glu/Gli ratio and the size distribution of the polymeric proteins in the flour (UPP%) were
found to be significantly higher in most of the transgenic lines compared to the control
samples. According to correlative studies, these parameters are related to better end-use
quality and breadmaking properties of the wheat cultivars. Data gained during the
investigation of transgenic line #28 in T2, T3 and T4 generations, indicated the positive
effects of the amaranth albumin protein on the flour end-use quality. The reological properties
of the dough, using the best performing flour sample (T4-28-1-1), was measured by micro z-
arm mixer. Three significantly higher parameters (dough development time, peak resistance
and stability) proved that stronger and more stable dough can be produced from this
transgenic wheat flour. SE-HPLC analysis of the protein sample, extracted from this dough,
confirmed that the recombinant protein had integrated into the protein matrix of the gluten,
formed during the dough development.
Our results indicated that transgenic approach can be a method of choice to improve not only
the essential amino acid content of the wheat flour, but certain functional quality attributes in
parallel.
100
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönetemet fejezem ki családomnak és mindenkinek, akik hozzájárultak munkám
sikeréhez és dolgozatom elkészültéhez:
Köszönet illeti témavezetıimet, Dr. Bedı Zoltán akadémikust az MTA Mezıgazdasági
Kutatóintézetének igazgatóját és Dr. Tamás László egyetemi docenst (ELTE, Növényélettani
és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék) szakmai tanácsaikért és támogatásukért.
Köszönetet mondok Dr. Láng Lászlónak, Dr. Rakszegi Mariannak a kísérleti munkák
feltételeinek biztosításáért. Dr. Sági Lászlónak tanácsaiért. Köszönöm Némethné Kisgyörgy
Boglárka fiatalos lendületét és kitartó munkáját a búza transzformációban és a transzgénikus
növények tesztelésében.
Köszönöm Dr. Peter Shewry és Dr. Huw Jones hozzájárulását a laboratóriumukban töltött 4
hetes tanulmányúthoz (Rothamstead Research, 2007). Hálás köszönettel tartozom Dr.
Caroline Sparks és Dr. Mark Wilkinson tanácsaiért és türelmes közremőködéséért a Southern
blot analízis elvégzésében.
Köszönöm koreai partnereinknek, hogy együttmőködési pályázat keretén belül Dr. Moon-Sik
Young rendelkezésünkre bocsátotta az ama1 gént, valamint Dr. Tae Kang-nak az AmA1
fehérje elleni antitestért és az indirekt ELISA módszer elvégzéséhez nyújtott tanácsaiért.
Köszönöm Dr. Békés Ferenc (CSIRO Plant Industry, Ausztrália) szakmai tanácsait és a
funkcionális vizsgálati eredmények statisztikai értékelésében nyújtott segítségét. Dr.
Tömösközi Sándornak (BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék)
a funkcionális vizsgálati eszközök használatának lehetıségét. Dr. Oszvald Máriának a
lisztvizsgálatok elvégzésében nyújtott segítsége mellett hasznos tanácsait is.
Köszönöm az MTA Mezıgazdasági Kutatóintézet Kalászos Gabona Nemesítési Osztály
Molekuláris laboratóriumában dolgozó minden munkatársnak, de különösen Holtainé Patona
Magdolnának a szövettenyésztésben, növénynevelésben és tesztelésben nyújtott nagyszerő
segítségét. Pásztohi Irénnek és Illés Klárának a DNS kinyerésben, Bodnárné Jávori Tímeának
(Lisztlabor) a HPLC vizsgálatokban nyújtott segítségét.
Köszönöm az ELTE Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék dolgozóinak,
Kremmerné Palczer Katalinnak és Pardi Sándornénak odaadó munkáját a DNS, RNS és
fehérje vizsgálatokban.
Köszönöm minden kedves, a fentiekben nem említett kollegámnak segítségét és soha nem
szőnı szakmai támogatását, emberi biztatását.
101
Köszönettel tartozom a kutatási munkát támogató pályázatok pénzügyi segítségéért:
AKP 98-36 3.1,
OTKA T034791,
OTKA 68659, OMFB 39/2000,
ICGEB Fund (CRP/HUN00-02),
TéT KOR 13/99.
102
7. IRODALOMJEGYZÉK AACC Method 55-31. Physical Tests. Singel-kernel characterization system for wheat kernel
texture. 1999. AACC Method 56-50: Pelshenke-test. Approved Methods of the AACC, 8th edition, St.
Pauls, Minnesota, 1983. AACC Method 56-61A: Sedimentation test based on Zeleny. Approved Methods of the
AACC, 8th edition, St. Pauls, Minnesota, 1983. Abebe, T., Guenzi, A.C., Bjorn, M., Cushman, J.C., 2003. Tolerance of mannitol-
accumulating transgenic wheat to water stress and salinity. Plant Physiol 131, 1748–1755.
Adebowale, YA., Adeyemi, IA., Oshodi, AA., Niranjan, K., 2007. Isolation, fractionation and characterization of proteins from Mucuna bean. Food Chem 104, 287–299.
Ahmed, K.Z., Sági, F., 1993. Culture of and fertile plant regeneration from regenerable embryogenic cell-derived protoplasts of wheat (Triticum aestivum L.). Plant Cell Reports 12, 175-179.
Altpeter, F., Vasil, V., Srirastava, V., Vasil, I.K., 1996a. Integration and expression of the high-molecular-weight glutenin subunit 1Ax1 gene into wheat. Nature Biotechnology 14, 1155-1159.
Altpeter, F., Vasil, V., Srivastava, V., Stöger, E., Vasil, I.K., 1996b. Accelerated production of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) plants. Plant Cell Reports 16, 12-17.
Altpeter, F., Diaz, I., McAuslane, H., Gaddour, K., Carbonero, P. and Vasil, I.K., 1999. Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor CME. Mol Breed 5, 53-63.
Altpeter, F., Baisakh, N., Beachy, R., Bock, R., Capell, T., Christou, P., Daniell, H., Datta, K., Datta, S., Dix, P.J., Fauquet, C., Huang, N., Kohli, A., Mooibroek, H., Nicholson, L., Nguyen, T.T., Nugent, G., Raemakers, K., Romano, A., Somers, D.A., Stoger, E., Nigel, T., Visser, R., 2005a. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breed 15, 305–327.
Alvarez, M.L., Guelman, S., Halford, N.G., Lustig, S., Reggiardo, M.I., Ryabushkina, N., Shewry, P., Stein, J., Vallejos, R.H., 2000. Silencing of HMW glutenins in transgenic wheat expressing extra HMW subunits. Theoretical Applied Genetics 100, 319-327.
Amoah, B.K., Wu, H., Sparks, C., Jones, H.D., 2001. Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue. Journal of Experimental Botany 52, 1135–1142.
Anderson, O.D., Greene, F.C., Yip, R.E., Halford, N.G., Shewry, P.R., Malpica-Romero, J.M., 1989. Nucleotid sequences of the two high-molecular-weight glutenin genes from the D-genome of a hexaploid bread wheat, Triticum aestivum L., cv Cheyenne. Nucleic Acids Research 17(1), 461-462.
Ayo, J.A., 2001. The effect of amaranth grain flour on the quality of bread. International Journal of Food Properties 4, 341-351.
Baga, M., Chibbar, R.N., Kartha, K.K., 1999a. Expression and regulation of transgenes for selection of transformants and modification of traits in cereals. Molecular Improvement of Cereal Crops. In Vasil IK (eds), Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants 5, pp 83-131. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.
Barba de la Rosa, A.P., Gueguen, J., Paredes-López, O., Viroben,G., 1992. Fractionation procedures, electrophoretic characterization, and aminoacid composition of amaranth seed protein. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40, 931-936.
103
Barba de la Rosa, A.P., Herrera, A., Utsumi, S., Parades-López, O., 1996. Molecular characterization, cloning and structural analysis of a cDNA encoding an amaranth globulin. J. Plant Physiol. 149, 527-532.
Barcelo, P. and Lazzeri, P. A., 1995. Transformation of cereals by microprojectile bombardment of immature inflorescence and scutellum tissues. In: Methods in Molecular Biology: Plant Gene Transfer and Expression Protocols, (Ed. H. Jones), Humana Press, Totowa. Vol. 49, pp 113-123.
Barcelo, P. and Lazzeri, P.A., 1998. Direct gene transfer: Chemical, electrical and physical methods. In Lindsey, K. (eds), Transgenic Plant Research pp. 35-55. Harwood Academic Publishers, The Netherlands.
Barro, F., Rooke, L., Békés, F., Gras, P., Tatham, A.S., Fido, R., Lazzeri, P.A., Shewry, P.R., Barcelo, P., 1997. Transformation of wheat HMW subunit genes results in improved functional properties. Nature Biotechnology 15, 1295-1299.
Barro, F., Cannell, M.E., Lazzeri, P., Barcelo, P., 1998. Influence of auxins on transformation of wheat and tritordeum and analysis of transgene integration patterns in transformants. Theoretical Applied Genetics 97, 684-695.
Barro, F., Martin, A., Lazzeri, P.A., Barcelo, P., 1999. Medium optimisation for efficient somatic embryogenesis and plant regeneration from immature inflorescences and immature scutella of elite cultivars of wheat, barley and tritordeum. Euphytica, 108, 161-167.
Barro, F., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., Shewry, P.R., Ballesteros, J., Martin, A., 2003. Functional properties of flours from filed grown transgenic wheat lines expressing the HMW glutenin subunit 1Ax1 and 1Dx5. Molecular Breeding 12, 223-229.
Baruah-Wolff, J., Harwood, W.A., Lonsdale, D.A., Harvey, A., Hull, R., Snape, J.W., 1999 Luciferase as a reporter gene for transformation studies in rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Reports 18, 715-720.
Batey, IL., Gupta, RB., MacRitchie, F., 1991. Use of SE-HPLC in the study of wheat flour proteins: An improved chromatographic procedure. Cereal Chem 68, 207-209.
Beccari, J.B., 1745. De Frumento. De Bononiensi Scientarium et Artium. Instituto atque Academia Commentarii: Bologna 2, 122-127.
Bechtel, D.B., Wilson, J.D., Shewry, P.R., 1991. Immunocytochemical localization of the wheat storage protein triticin in developing endoperm tissue. Cereal Chem. 68, 573-577.
Bedı, Z., Kárpáti, M., Vida, Gy., Kramarik-Kissimon, J., Láng, L., 1995. Good breadmaking quality wheat (Triticum aestivum L.) genotypes with 2+12 subunit composition at the Glu-D1 locus. Cer. Res. Comm. 23, 283-289.
Békés, F., Gras, P.W., Gupta, R.B., Hickman, D.R., Tatham, A.S. 1993. Effects of a high Mr glutenin subunit (1Bx20) ont he dough mixing properties of wheat flour. Journal of Cereal Science. 19, 3-7.
Békés, F. and Gras, P.W., 1994. Effects of individual HMW glutenin subunits on mixing properties. In ’Gluten Proteins 1993’. Association of Cereal Research, Detmold, Germany, 170-179.
Békés, F., Anderson, O., Gras, P.W., Gupta, R.B., Tam, A., Wrigley, C.W., Apples, R., 1994a. The contribution to mixing properties of 1D glutenin subunits expressed in a bacterial system. Proc.'Improvement of Cereal Quality by Genetic Engineering', (Eds. Henry, R., and Ronalds, J.) pp 97-104.
Békés, F., Gras, P.W., Gupta, R.B., 1994b. Mixing properties as a measure of reversible reduction and oxidation of doughs. Cereal Chemistry. 71, 44-50.
104
Békés, F., Gras, P.W., Gupta, R.B., 1995. The effects of purified cereal polypeptides on mixing properties of dough, 92-98. in: Proc. 45th Australian Cereal Chemistry Conf. Y.A. Williams and C.W. Wrigley, eds. RACI: Noth Melbourne, Australia.
Békés, F., Southan, M.S., Tömösközi, S., Nanasi, J., Gras, P.W., Varga, J., McCorquodale, J., Osborne, B.G. 2000. Comparative studies on a new micro scale laboratory mill. Proc. 49. RACI Conference, Eds.: Panozzo, J.F., Ratcliffe, M., Wootton, M., Wrigley, C.W., 483-487., RACI, Melbourne.
Békés, F., Lukow, O., Uthayakumaran, S., Mann, G., 2003. Small-scale dough testing methods. In: Shewry, P.R., Lookhart, G. (Eds.), Wheat Gluten Protein Analysis. AACC, St. Paul, USA, pp 173–198.
Ben Amer, I.M., Korzun, V., Worland, A.J., Börner, A., 1997. Genetic mapping of QTL controlling tissue-culture response on chromosome 2B of wheat (Triticum aestivum L.) in relation to major genes and RFLP markers. Theoretical Applied Genetics 94, 1047-1052.
Bhattacharyya-Pakrasi, H., Peng, J., Elmer, J.S., Laco, G., Shen, P., Kaniewska, M.B., Kononowicz, H., Wen, F., Hodges, T.K., Beachy, R.N., 1993. Specificity of a promoter from the rice tungro bacilliform virus for expression in phloem tissues. Plant Journal 4, 71-79.
Blechl, A.E., Anderson, O.D., 1996. Expression of a novel high molecular weight glutenin subunit gene in transgenic wheat. Nat Biotechnol 14, 875–879.
Blechl, A.E., Le, H.Q., Anderson, O.D., 1998. Engineering changes in wheat flour by genetic transformation. Journal of Plant Physiology 152, 703-707.
Blechl, A.E., Lin, J., Nguyen, S., Chan, R., Anderson, O.D., Dupont, F.M., 2007. Transgenic wheats with elevated levels of Dx5 and/or Dy10 high-molecular-weight glutenin subunits yield doughs with increased mixing strength and tolerance. Journal Of Cereal Science. 45, 172-183.
Boutrot, F., Guirao, A., Alary, R., Joudrier, P., Gautier, M.F., 2005. Wheat non-specific lipid transfer protein genes display a complex pattern of expression in developing seeds. Biochim. Biophys. Acta 1730, 114-125.
Bregitzer, P., Halbert, S.E., Lemaux, P.G., 1998. Somaclonal variation in the progeny of transgenic barley. Theoretical Applied Genetics 96, 421-425.
Bressani, R. and Garcia-Vela, L.A., 1990. Protein fractions in amaranth grain and their chemical characterization. Journal of Agricultural and Food Chemistry 38, 1205-1209.
Brinch-Pedersen, H., Olesen, A., Rasmussen, S.K., Holm, P.B., 2000. Generation of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) for constitutive accumulation of an Aspergillus phytase. Molecular Breeding 6, 196.
Brinch-Pedersen, H., Sorensen, L.D., Holm, P.B., 2002. Engineering crop plants: getting a handle on phosphate. Trends in Plant Science 7, 118–125.
Brinch-Pedersen, H., Hatzack, F., Sorensen, L.D., Holm, P.B., 2003. Concerted action of endogenous and heterologous phytase on phytic acid degradation in seeds of transgenic wheat (Triticum aestivum L.). Transgenic Research 12, 649–659.
Brinch-Pedersen, H., Hatzack, F., Stoger, E., Arcalis, E., Pontopidan, K., Holm, P.B., 2006. Heat-stable phytases in transgenic wheat (Triticum aestivum L.): deposition pattern, thermostability, and phytate hydrolysis. J Agric Food Chem 54, 4624–4632.
Burgess, S.R., and Shewry, P.R., 1986. Identification of homologous globulins from embryos of wheat, barley, rye and oats. J. Exp. Bot. 37, 1863-1871.
Burton, R.A., Wilson, S.M., Hrmova, M., Harvey, A.J., Shirley, N.J., Medhurst, A., Stone, BA., Newbigin, N.J., Bacic, A., Fincher, GB., 2006. Cellulose synthase-like CslF genes mediate the synthesis of cell wall (1,3;1,4)-b-D-glucans. Science 311, 1940–1942.
105
Bushuk, W., 1998. Wheat breeding for end-product use. Euphytica. 100, 137-145. Bushuk, W. Interactions: The Keys To Cereal Quality, 1st ed. Hamer, R.J. and Honesey, R.C. Eds. American Association of Cereal Chemistry: St. Paul. Mn. 1998. Chapter 2.
Bushuk, W. and Tkachuk, R. Eds. 1991. Gluten proteins 1990. Am. Assoc. Cereal Chemistry: St. Paul, Mn.
Butow, B.J., Tatham, A.S., Savage, A.W.J., Gilbert, S.M., Shewry, P.R., Solomon, R.G., Békés, F., 2003a. Creating a balance – the incorporation of a HMW glutenin subunit into transgenic wheat lines. Journal of Cereal Science. 38, 181-187.
Butow, B.J., Ma, W., Gale, K.R., Rampling, L., Larroque, O., Morell, M.K., Békés, F., 2003b. Molecular discrimination of Bx7 alleles demonstrates that highly expressed high-molecular weight glutenin allele has major impact on wheat flour dough strength. Theoretical and Applied Genetics 107, 1524-1532.
Cannell, M.E., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., 1998. Stability and heritability of marker genes in transgenic wheat and Tritordeum. In Slinkard AE (eds), Proceedings of the 9th International Wheat Genetic Symposium 3, 92-94. University Extension Press, University of Saskatoon, Canada.
Capell, T. and Christou, P., 2004. Progress in plant metabolic engineering. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 148-154.
Chakraborty, S., Chakraborty, N., Datta, A., 2000. Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 3724–3729.
Chalupa, V., 1987. Temperature. In: Bonga JM, Durzan DJ (eds) Cell and Tissue Culture in Forestry, Vol. 1. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, pp 142-151.
Chamberlain, D.A., Brettel, R.I.S., Last, D.I., Witrzens, B., McElroy, D., Dolferus, R., Dennis, E.S., 1994. The use of the Emu promoter with antibiotic and herbicide resistance genes for the selection of transgenic wheat callus and rice plants. Australian Journal of Plant Physiology 21, 95-112.
Champagne, E.T., Wood, D.F., Juliano, B.O., Bechtel, D.B., 2004. The rice grain and its gross composition. In: Champagne, E.T. (Ed.), Rice: Chemistry and Technology, third ed. AACC, St. Paul, MN, pp 77–107.
Chaturvedi, A., Sarojini, G., Nirmala, G., Nirmalamma, N., Satyanarayana, D., 1997. Glycemic index of grain amaranth, wheat and rice in NIDDM subjects. Plant Foods for Human Nutrition 50, 171-178.
Chaure, P., Gurr, S.J., Spanu, P., 2000. Stable transformation of Erysiphe graminis, an obligate biotrophic pathogen of barley. Nature Biotechnology 18, 205-207.
Chawla, H.S., Cass, L.A., Simmonds, J.A., 1999. Developmental and environmental regulation of anthocyanin pigmentation in wheat tissues transformed with anthocyanin regulatory genes. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 35, 403-408.
Chen, S.F., Paredes-Lopez, O., 1997. Isolation and characterization of the 11S globulin from amaranth seedsSource. Journal of Food Biochemistry 21, 53-65.
Chen, Z., Young, T.E., Ling, J., Chang, S.C., Gallie, D.R., 2003. Increasing vitamin C content of Plant through enhanced ascorbate recycling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3525–3530.
Cheng, M., Fry, J.E., Pang, S., Zhou, H., Hironaka, C.M., Duncan, D.R., Conner, T.W., Wan, Y., 1997. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiology 115, 971-980.
Christensen, A.H. and Quail, P.H., 1996. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res 5, 213-218.
106
Christou, P. and Twyman, R.M., 2004. The potential of genetically enhanced Plant to address food insecurity. Nutr. Res. Rev. 17, 23–42.
Constabel, F., Shyluk, J.P., 1994. Initiation, nutrition, and maintenance of plant cell and tissue culture. In: Vasil IK, Thorpe TA (eds) Plant Cell and Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 3-15.
Cornish, G., Békés, F., Larroque, O., Appels, R., 1998. The relationships between allelic composition of glutenin subunits and functional properties. In ‘Cereals 98—Proceedings of the 48th RACI Cereal Chemistry Conference’. (Eds AW Tarr, AS Ross, CW Wrigley) pp 536–539. (RACI: North Melbourne)
Crow, J.F., Kermicle, J., 2002. Oliver Nelson and quality protein maize. Genetics 160, 819–821.
D’Appollonia, B.L. and Kunerth, W.H. Eds. 1984. The Farinograph handbook, AACC, St. Paul, MN, ISBN-0-913250-37-6.
Dai, S., Carcamo, R., Zhang, Z., Chen, S., Beachy, R.N., 2001. The bacterial cytosine deaminase gene used as a conditional negative selection marker in transgenic rice plants. Plant Cell Reports 20, 738–743.
Dannenhoffer, J.M., Bostwick, D.E., Or, E., Larkins, B.A., 1995. Opaque-15, a maize mutation with properties of a defective opaque-2 modifier. Proceedings of the National Academy of the Sciences USA 92, 1931–1935.
De Block, M., Debrouwer, D., Moens, T., 1997. The development of a nuclear male sterility system in wheat. Expression of the barnase gene under the control of tapetum specific promoters. Theoretical Applied Genetics 95, 125-131.
Diaz de la Garza, R.I., Quinlivan, E.P., Klaus, S.M.J., Basset, G.J.C., Gregory III, J.F., Hanson, A.D., 2004. Folate biofortification in tomato by engineering the pteridine branch of folate synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13720-13725.
Diaz de la Garza, R.I., Gregory, J.F., Hanson, A.D., 2007. Folate biofortification of tomato fruit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4218–4222.
Distelfeld, A., Uauy, C., Olmos, S., Schlatter, A.R., Dubcovsky, J.,Fahima, T., 2004. Microlinearity between a 2-cM region encompassing the grain protein content locus Gpc-6B1 on wheat chromosome 6B and a 350-kb region on rice chromosome 2. Functional and Integrative Genomics 4, 59–66.
Distelfeld, A., Uauy, C., Fahima, T., Dubcovsky, J., 2006. Physical map of the wheat high-grain protein content gene Gpc-B1 and development of a high-throughput molecular marker. New Phytologist 169, 753–763.
Dubetz, S., Gardiner, E.E., Flynn, D., de la Roche, A.I., 1979. Effect of nitrogen fertilizer on nitrogen fractions and amino acid composition of spring wheat. Canadian J Plant Sci 59, 299-305.
Ducreux, L.J.M., Morris, W.L., Hedley, P.E., Shepherd, T., Davies, H.V., Millam, S., Taylor, M.A., 2005. Metabolic engineering of high carotenoid potato tubers containing enhanced levels of beta-carotene and lutein. J. Exp. Bot. 56, 81–89.
Dudits, D. és Heszky, L., 2003. Növényi biotechnológia és géntechnológia. Agroinform Kiadó, Budapest (második, bıvített kiadás).
Dudley, J.W., Lambert, R.J., Alexander, D.E., 1974. Seventy generations of selection for oil and protein concentration in the maize kernel. In: Dudley, J.W. (Ed.), Seventy Generations of Selection for Oil and Protein in Maize. Crop Science Society of America, Madison, WI, pp 181–212.
Dunwell, J.M., Purvis, A. and Khuri, S., 2004. Cupins: the most functionally diverse protein superfamily. Phytochem. 65, 7-17.
Dwivedi, S., Perotti, E., Ortiz, R., 2008. Toward molecular breeding of reproductive traits in cereal crops. Plant Biotechnology Journal 6(6), 529-559.
107
Ebinuma, H., Sugita, K., Matsunaga, E., Yamakado, M., 1997. Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene as a selectable marker. Proceedings of the National Academy of Science 94, 2117–2121.
Ebinuma, H., Komamine, A., 2001. MAT (Multi-Auto-Transformation) vector system. The oncogenes of Agrobacterium as positive markers for regeneration and selection of marker-free transgenic plants. Cell. Dev. Biol.–Plant 37, 103-113.
Edlin, D.A.N., Kille, P., Wilkinson, M.W., Jones, H.D., Harwood, J.L., 2000. Morphological and metabolic changes in transgenic wheat with altered glycerol-3-phosphate acyltransferase or acyl-acyl carrier protein (ACP) thioesterase activities. In: 14th International Symposium on Plant Lipids, Biochemical Society Transactions 28(6), 682-683.
Falco, S.C., Guida, T., Locke, M., Mauvais, J., Sandres, C., Ward, R.T., Webber, P., 1995. Transgenic canola and soybean seeds with increased lysine. Bio/Technology 13, 577.
FAO/WHO/UNU, 1985. Necessidades de Energia y Proteinas. World Health Organisation, Geneva.
Feldman, M., Lupton, F.G.H., Miller, T.E., 1995. Wheats Triticum spp. In Evolution of Crop Plants 2nd edition (eds. Smartt,J. and Simmonds,N.W.) Longmann Scientific and Technical, pp184-192.
Fennell, S., Bohorova, N., van Ginkel, M., Crossa, J., Hoisington, D., 1996. Plant regeneration from immature embryos of 48 elite CIMMYT bread wheats. Theoretical Applied Genetics 92, 163-169.
Fido, R.J., Békés, F., Gras, P.W., Tatham, A., 1997. The effects of added gliadin classes on the mixing properties and extension of dough. Journal of Cereal Science 26, 271-277.
Fischer-Iglesias, C., Sundberg, B., Neuhaus, G., Jones, A.M., 2001. Auxin distribution and transport during embryonic pattern formation in wheat. Plant J 26, 115-129.
Frame, B.R., Drayton, P.R., Bagnall, S.V., Lewnau, C.J., Bullock, W.P., Wilson, H.M., Dunwell, J.M., Thompson, J.A., Wang, K., 1994. Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide fiber-mediated transformation. The Plant Journal 6, 941-948.
Frederico, M.L., Kaeppler, H.F., Skadsen, R.W., 2005. The complex developmental expression of a novel stress-responsive barley Ltp gene is determined by a shortened promoter sequence. Planr Molecular Biology 57(1), 35-51.
Fu, X.D., Duc, L.T., Fontana, S., Bong, B.B., Tinjuangjun, P., Sudhakar, D., Twyman, R.M., Christou, P., Kohli, A., 2000. Linear transgene constructs lacking vector backbone sequences generate low-copy-number transgenic plants with simple integration patterns. Transgenic Res 9, 11-19.
Fukuyima, D., 1991. Structures of plant storage proteins and their functions. Food Rev. Int. 7, 353-381.
Furtado, A. and Henry, R.J., 2005. The wheat Em promoter drives reporter gene expression in embryo and aleurone tissue of transgenic barley and rice. Plant Biotechnology Journal 3(4), 421-434.
Galili, G., 1995. Regulation of lysine and threonine synthesis. Plant Cell 7, 899–906. Galili, G., 2002. New insights into the regulation and functional significance of lysine
metabolism in Plant. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 53, 27–43.
Gianibelli, M.C., Larroque, O.R., MacRitchie, F., Wrigley, C.W., 2001. Biochemical, genetic and molecular characterization of wheat endosperm proteins. Online review. AACC.
Gibbon, B.C., Larkins, B.A., 2005. Molecular genetic approaches to developing quality protein maize. Trends in Genetics 21, 227-233.
108
Geisel, J., 2003. Folic acid and neural tube defects in pregnancy – a review J. Perinat. Neonat. Nurs. 17, 268-279.
Golovkin, M.V., Ábrahám, M., Mórocz, S., Bottka, S., Fehér, A., Dudits, D., 1993. Production of transgenic maize plants by direct DNA uptake into embryogenic protoplasts. Plant Science Limerick 90, 41-52.
Gordon-Kamm, W.J., Baszczynski, C.L., Bruce, W.B., Tomes, D.T., 1999. Transgenic cereals: Zea mays (maize). Molecular Improvement of Cereal Crops. In Vasil IK (eds), Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants V, 189-253. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.
Gorinstein, S., Jaramillo, N.O., Medina, O.J., Rogriques, W.A., Tosello, G.A. and Paredes-Lopez, O., 1999. Evaluation of Some Cereals, Plants and TubersThrough Protein Composition Journal of Protein Chemistry 18(6), 687-693.
Gras, P.W., Békés, F., Gupta, R.B., MacRitchie, F., 1992. in ’Proceedings of the 24nd RACI Cereal Chemistry Conference’ (V.J. Humphrey-Taylor, ed.) RACI, Parkville, Australia. pp 171-180.
Gras, P.W., Varga, J., Rath, C., Tömösközi, S., Fogod, D., Salgo, A. and Békés, F., 2000. Screening for improved water absorption and mixing properties using four grams of flour: A new small-scale Farinograph –type mixer. In Proceeding of 11th International Cereal and Bread Congress, Broadbeach, QLd, Australia.
Gras, P.W., Anderssen, R.S., Keentok, M., Békés, F., Apples, R., 2001. Gluten protein functionality in wheat flour processing: a review. Aust. J. Agric. Res. 52, 1311-1323.
Grimwade, B., Tatham, A.S., Freedman, R.B., Shewry, P.R., Napier, J.A., 1996. Comparison of the expression patterns of genes coding for wheat gluten proteins and proteins involved in the secretory pathway in developing caryopses of wheat. Plant Mol Biol 30, 1067-1073.
Gupta, R.B., Singh, N.K., Shepherd, K.W., 1989. The cumulative effect of allelic variation in LMW and HMW glutenin subunits on physical dough properties in progeny of two bread wheats. Theor. Appl. Genet. 77, 57-64.
Gupta, R.B., Shepherd, K.W., McRitchie, F., 1991a. Genetic control and biochemical properties of some high molecular weight albumins in bread wheat. J. Cereal Sci. 13, 221-235.
Gupta, R.B., Békés, F., Wrigley, C.W., 1991b. Prediction of physical dough properties from glutenin subunit composition in bread wheats: correlation studies. Cereal Chemistry 68, 328–333.
Gupta, R.B., Batey, I.L., MacRitchie, F., 1992. Relationship between protein composition and functional properties of wheat flours. Cereal Chemistry. 69, 125-131.
Gupta, R.B. and McRitchie, F., 1994. Allelic variation at glutenin subunit and gliadin loci, Glu-1, Glu-3 and Gli-1 of common wheats. II. Biochemical basis of the allelic effects on dough properties. J. Cereal Sci. 19, 19-29.
Gupta, R.B., Popineau, Y., Lefebvre, J., Cornec, M., Lawrence, G.J., McRitchie, F., 1995. Biochemical basis of flour properties in bread wheats. II. Changes in polymeric protein –formation and dough/gluten properties associated with the loss of low M(R) or hight M(R) glutenin subunits. Journal of Cereal Science 21, 103-116.
Gupta, R.B., Masci, S., Lafiandra, D., Bariana, H.S., McRitchie, F., 1996. Accumulation of protein subunits and their polymers in developing grains of hexaploid wheats. J Exp Bot 47, 1377-1385.
Guzmán-Maldonado, S. H., Paredes-López, O., 1998. Functional products of indigenous Plant to Latin America: Amaranth, quinoa, common beans and botanicals. In Functional Foods: Biochemical and Processing Aspects. Mazza, G., Ed., Technomic Publishing: Lancaster, PA, Chapter 9, pp 293-328.
109
Hamer, R.J. and van Vliet, T., 2000. Understanding the structure and properties of gluten: An overview. pp 125-131. in Wheat Gluten. P.R. Shewry and A.S. Thatam. Eds. Royal Society of Chemistry: Cambrige, UK.
Hagan, N.D., Upadhyaya, N., Tabe, L.M., Higgins, T.J.V., 2003. The redistribution of protein sulfur in transgenic rice expressing a gene for a foreign, sulfur-rich protein. The Plant Journal 34, 1–11.
Haldrup, A., Petersen, SG., Okkels, FT., 1998. Positive selection: a plant selection principle based on xylose isomerase, an enzyme used in the food industry. Plant Cell Reports 18, 76-81.
Halverson, J. and Zeleny, L., 1988. Criteria of wheat quality. In: Wheat: Chemistry and Technology (Y. Pomeranz ed.), Vol. II., AACC, St.Paul, Minnesota, USA, pp. 15-46.
Haraszi, R., Gras, P.W., Tömösközi, S., Salgo, A., Békés, F., 2004. The application of a micro Z-arm mixer to characterize mixing properties and water absorption of wheat flour. Cereal Chem. 81, 550-560.
Harvey, A., Moisan, L., Lindup, S., Lonsdale, D., 1999. Wheat regenerated from scutellum callus as a source of material for transformation. Plant Cell Tiss Org Cult 57, 153-156.
Harwood, W.A., Ross, S.M., Cilento, P., Snape, J.W., 2000. The effect of DNA/gold particle preparation technique, and particle bombardment device, on the transformation of barley (Hordeum vulgare). Euphytica 111, 67-76.
He, D.G., Yang, Y.M., Scott, K.J., 1989. The effect of macro elements in the induction of embryogenic callus from immature embryos of wheat (Triticum aestivum L.). Plant Sci 64: 251-258.
He, G.Y., Rooke, L., Steele, S., Békés, F., Gras, P., Tatham, A.S., Fido, R., Barcelo, P., Shewry, P.R., Lazzeri, P.A., 1999. Transformation of pasta wheat (Triticum turgidum L. var. durum) with high-molecular-weight glutenin subunit genes and modification of dough functionality. Molecular Breeding 5, 377-386.
He, G.Y., Lazzeri, P.A., Cannell, M.E., 2001. Fertile transgenic plants obtained from tritordeum inflorescences by tissue electroporation. Plant Cell Reports 20, 67-72.
Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T., 1994. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6, 271-282.
Higgins, T.J.V., 1984. Synthesis and regulation of major proteins in seeds. Annu. Rev. Plant Physiol. 35, 191-221.
Higgins, T.J.V., Beach, L.R., Spencer, D., Chandler, P.M., Randall, P.J., Blagrove, R.J., Kortt, A.A., Guthrie, R.E., 1987. cDNA and protein sequence of a major pea seed albumin. Plant Molecular Biology 8, 37-45.
Hoa, T.T.C., Bong, B.B., Huq, E., Hodges, T.K., 2002. Cre/lox site-specific recombination controls the excision of a transgene from the rice genome. Theoretical and Applied Genetics 104, 518–525.
Howarth, J.R., Jacquet, J.N., Doherty, A., Jones, H.D., Cannell, M.E., 2005. Molecular genetic analysis of silencing in two lines of Triticum aestivum transformed with the marker gene construct pAHC25. Annals of Applied Biology 146, 311–320.
Huang, S., Adams, W.R., Zhou, Q., Malloy, K.P., Voyles, D.A., Anthony, J., Kriz, A.L., Luethy, M.H., 2004. Improving nutritional quality of maize proteins by expressing sense and antisense zein genes. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52, 1958–1964.
Huang, S., Spielmeyer, W., Lagudah, E.S., James, R.A., Platten, J.D., Dennis, E.S., Munns, R., 2006. A sodium transporter (KHT7) is a candidate for Nax1, a gene for salt tolerance in durum wheat. Plant Physiol 142, 1718–1727.
110
Hughes, K.W., 1981. In vitro ecology: exogenous factors affecting growth and morphogenesis in plant tissue cultures. Env Exp Bot 21, 281-288.
I’Anson, K.J., Morris, V.J., Shewry, P.R., Tatham, A.S., 1992. Small-angle X-ray-scattering studies of the C hordeins of barley (Hordeum vulgare) Biochemical Journal 287, 183-185.
Iser, M., Fetting, S., Scheyhing, F., Viertel, K., Hess, D., 1999. Genotype-dependent stable genetic transformation in German spring wheat varieties selected for high regeneration potential. Journal of Plant Physiology 154, 509-516.
Ishida, Y., Saito, H., Ohta, S., Hiei, Y., Komari, T., Kumashiro, T., 1996. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnology 14, 745-750.
Jach, G., Binot, E., Frings, S., Luxa K., Schell, J., 2001. Use of red fluorescent protein from Discosoma sp. (dsRED) as a reporter for plant gene expression. The Plant Journal 28, 483-491.
Jelenska, J., Tietze, E., Tempe, J., Brevet, J., 2000. Streptothricin resistance as a novel selectable marker for transgenic plant cells. Plant Cell Reports 19, 298-303.
Jenes, B., Bittencourt, P.A.L., Csányi, Á., Pauk, J., Nagy, I., Toldi, O., Balázs, E., 1996. The GENEBOOSTER - a new microprojectile bombardment device - for genetic transformation of plants. Plant Tissue Culture and Biotechnology 2, 42-51.
Jensen, S.A. and Martens, H., 1983. The botanical constituents of wheat and wheat milling fractions. II. Quantification by amino acids. Cereal Chemistry 60, 172–177.
Jones, H., Doherty, A., Wu, H., 2005. Review of methodologies and a protocol for the Agrobacterium-mediated transformation of wheat. Plant Methods 1, 5.
Juhasz, A., Larroque, R.O., Tamas, L., Hsam, S.L., Zeller, F.J., Bekes, F., Bedo, Z., 2003. Bankuti 1201--an old Hungarian wheat variety with special storage protein composition. Theoretical Applied Genetics 107 (4), 697-704.
Kang, TJ., Loc, NH., Jang, MO., Jang, YS., Kim, YS., Seo, JE., Yang, MS. 2003. Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization. Transgenic Res 12, 683-691.
Karunaratne, S., Sohn, A.A., Scott, J., Steinbiss, H.H., Scott, KJ., 1996. Transformation of wheat with the gene encoding the coat protein of barley yellow mosaic virus. Australian Journal of Plant Physiology 23, 429-435.
Kermode, A.R. and Bewley, J.D., 1999. Synthesis, processing and deposition of seed proteins. In: Seed Proteins (Eds. Shewry, P.R. and Casey, R.) pp 807-841.
Kinney, A.J. Cahonn, E.B. Damude, H.G., Hitz, W.D., Kolar, C.W., Liu, Z-B., 2004. E.I. Du Pont de Nemours and Company. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed Plant, WO 2004/071467 A2
Kirkman, M.A., Shewry, P.R., Miflin, B.J., 1982. The effect of nitrogen nutrition on the lysine content and protein composition of barley seeds. Journal of the Science of Food and Agriculture 33, 115–127.
Kleese, R.A., Kirihara, J.A., Sandahl, G.A., 1991. Gene transfer to elevate methionine levels. In: Proceedings 46th Annual Corn and Soybean Industrial Research Conference. American Seed Trade Association, Washington DC, pp. 124–129.
Kohli, A., Gahakwa, D., Vain, P., Laurie, DA., Christou, P., 1999. Transgene expression in rice engineered through particle bombardment: Molecular factors controlling stable expression and transgene silencing. Planta 208, 88-97.
Kohli, A., Twyman, R.M., Abranches, R., Wegel, E., Stoger, E. and Christou, P., 2003. Transgene integration, organization and interaction in plants Plant Molecular Biology. 52, 247-258.
111
Komari, T., Hiei, Y., Saito, Y., Murai, N., Kumashiro, T., 1996. Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. Plant Journal 10, 165-174.
Komari, T. and Kubo, T., 1999. Methods of genetic transformation: Agrobacterium tumefaciens. In: Vasil IK (ed) Molecular Improvement of Cereal Crop, pp 43–82. Kluwer Academic, London.
Konishi, Y., Horikawa, K., Oku, Y., Azumaya, J., Nakatani, N., 1991. Extraction of two albumin fractions from amaranth grains: comparison of some physicochemical properties and the putative localization in the grains. Agric Biol Chem 55 (11), 1745-1750.
Koprek, T., Hänsch, R., Nerlich, A., Mendel, R.R. and Schulze, J., 1996. Fertile transgenic barley of different cultivars obtained by adjustment of bombardment conditions to tissue culture response. Plant Sci. 119, 79–91.
Kunkel, T., Niu, Q.W., Chan, Y.S., Chua, N.H., 1999. Inducible isopentenyl transferase as a high-efficiency marker for plant transformation. Nature Biotechnology 17, 916-919.
Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of bacteriophage. Nature 227:680-685.
Lai, J., Messing, J., 2002. Increasing maize seed methionine by mRNA stability. The Plant Journal 30, 395–402.
Larkin, PJ., 1982. Sugarcane tissue and protoplast culture. Plant Cell Tiss Org Cult 1, 149-164.
Larroque, O.R., Bekes, F., 2000. Rapid size-exclusion chromatography analysis of molecular size distribution for wheat endosperm protein. Cereal Chemistry 77, 451–453.
Laursen, C.M., Krzyzek, R.A., Flick, C.E., Anderson, P.C., Spencer, T.M., 1994. Production of fertile transgenic maize by electroporation of suspension culture cells. Plant Molecular Biology 24, 51-61.
Lawrence, G.J. and Shepherd, K.W., 1980. Variation in glutenin protein subunits of wheat. Aust. J. Biol. Sci. 33, 221-233.
Lee, Y.K., Békés, F., Gras, P., Ciaffi, M., Morell, M.K., Appels, R., 1999a. The low-molecular-weight glutenin subunit proteins of primitive wheats. IV. Functional properties of products from individual genes. Theor Appl Genet 98, 149-155.
Lee, T.T.T., Chung, M.-C., Kao, Y.-W., Wang, C.-S., Chen, L.-J., Tzen, J.T.C., 2005. Specific expression of a sesame storage protein in transgenic rice bran. Journal of Cereal Science 41, 23–29.
Lehmann, J. W., 1996. Case history of grain amaranth as an alternative crop. Cereal Foods World 41, 399-411.
León, E., Marín, S., Giménez, M.J., Piston, F., Rodríguez-Quijano, M., Shewry, P.R., Barro, F., 2009. Mixing properties and dough functionality of transgenic lines of a commercial wheat cultivar expressing the 1Ax1, 1Dx5 and 1Dy10 HMW glutenin subunit genes. Journal of Cereal Science 49(1), 148-156.
Lörz, H., Baker, B., Schell, J., 1985. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Molecular and General Genetics 199, 178-182.
Lu, S., Van Eck, J., Zhou, X., Lopez, A.B., O'Halloran, D.M., Cosman, K.M., Conlin, B.J., Li, L., 2006. The cauliflower Or gene encodes a DnaJ cysteinerich domain-containing protein that mediates high levels of beta-carotene accumulation. Plant Cell 18, 3594–3605.
Lucca, P., Hurrell, P., Potrykus, I., 2001. Genetic engineering approaches to improve the bioavailability and the level of iron in the rice grains. Theoretical and Applied Genetics 102, 392–397.
112
Machii, H., Mizuno, H., Hirabayashi, T., Li, H., Hagio, T., 1998. Screening wheat genotypes for high callus induction and regeneration capability from anther and immature embryo cultures. Plant. Cell. Tiss. Org. Cult. 53, 67–74.
Maheshwari, N., Rajyalakshmi, K., Baweja, K., 1995. In-vitro culture of wheat and genetic-transformation-retrospect and prospect. Critical reviews in plant sciences 14(2), 149-178.
Marchylo, BA., Kruger, JE., Hatcher, DW., 1989. Quantitative RP-HPLC analysis of wheat storage proteins as a potential quality prediction tool. J Cereal Sci 9, 113-130.
Marcone, M.F., 1999. Evidence confirming the existence of a 7S globulin-like storage protein in Amaranthus hypochondriacus seed. Food Chem. 65, 533-542.
Margiotta, B., Urbano, M., Colaprico, G., Johansson, E., Buonocore, F., D’Ovidio, R., Lafiandra, D., 1996. Detection of y-type subunit at the Glu-A1 locus in some Swedish bread wheat lines. J. of Cer. Sci. 23, 203-211.
Marion, D. and Dubreil, L., 1998. Lipids, lipid-protein interactions and the quality of baked cereal products. In: Interactions: The Keys to Cereal Quality (R.J. Hamer and R.C. Hoseney eds.) AACC, St. Paul, Minnesota, USA, pp 131-167.
Martínez, E.N., Castellani, O.F., Anón M.C., 1997. Common Molecular Features among Amaranth Storage Proteins. J. Agric. Food Chem. 45, 3832-3839.
Maruta, Y., Ueki, J., Saito, H., Nitta, N., Imaseki, H., 2001. Transgenic rice with reduced glutelin content by transformation with glutelin A antisense gene. Mol. Breed. 8, 273-284.
Masci, S., Lafiandra, D., Porceddu, E., Lew, E.J.L., Tao, H.P., Kasarda, D.D., 1993. D-glutenin subunits: N-terminal sequences and evidence for the presence of cysteine. Cereal Chem. 70, 581-585.
Masci, S., D’Ovidio, R., Scossa, F., Patacchini, C., Lafiandra, D., Anderson, O.D., Blechl, A.E., 2003. Production and characterization of a transgenic bread wheat line over-expressing a low-molecular-weight glutenin subunit gene. Mol Breeding 12, 209–222.
McElroy, D., Blowers, A.D., Jenes, B., Wu, R., 1991. Construction of expression vectors based on the rice actin 1 (Act1) 5’ region for use in monocot transformation. Molecular and General Genetics 231, 150-160.
McRitchie, F., 1987. Evaluation of combinations from wheat protein fractions to dough mixing and breadmaking. Journal of Cereal Science 6, 259-268.
McRitchie, F., Kasandra, D.D., Kuzmicky, D.D., 1991. Characterization of wheat protein fractions differing in contributions to breadmaking quality. Cereal Chemistry 68, 122-130.
McRitchie, F. and Gupta, R.B., 1993. Functionality-composition relationships of wheat flour as a result of variation in sulfur availability. Aust. J. Agr. Res. 44, 1767-1774.
Melo, M.M., Xavier-Filho, J., Lima, M.S., Prouvost-Danon, A., 1994. Allergenicity and tolerance to proteins from Brazil nut (Bertholletia excelsa H.B.K.). Food and Agricultural Immunology 6, 185-195.
Mertz, E.T., Bates, L.S., Nelson, O.E., 1964. Mutant gene that changes protein composition and increases lysine content of maize endosperm. Science 145, 279–280.
Meyer, F.D., Smidansky, E.D., Beecher, B., Greene, T.W., Giroux, M.J., 2004. The maize Sh2r6hs ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP) large subunit confers enhanced AGP properties in transgenic wheat (Triticum aestivum). Plant Science 167(4), 899-911.
Mossé, J., Huet, J.-C., 1990. Amino acid composition and nutritional score for ten cereals and six legumes or oilseeds: causes and ranges of variations according to species and to seed nitrogen content. Sciences des Alimentations 10, 151–173.
Munck, L., Karlsson, K.E., Hagberg, A., Eggum, B.O., 1970. Gene for improved nutritional value in barley seed protein. Science 168, 985–987.
113
Murashige, T. and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology 15, 473-497.
Newman, C.W. and McGuire, C.F., 1985. Nutritional Quality of Barley. In: Rasmussen DC (Ed.), Barley, Agronomy Monograph 26. ASACSSA- SSSA, Madison, WI, 403–456.
Nordlee, J.A., Taylor, S.L., Townsend, J.A., Thomas, L.A., Bush, R.K., 1996. Identification of a Brazil nut allergen in transgenic soybeans. New England Journal of Medicine 334, 688-692.
O’Kennedy, M.M., Grootboom, A., Shewry, P.R., 2006. Harnessing sorghum and millet biotechnology for food and health. Journal of Cereal Science 44, 224–235.
Olmos, S., Distelfeld, A., Chicaiza, O., Schlatter, A.R., Fahima, T., Echenique, V., Dubcovsky, J., 2003. Precise mapping of a locus affecting grain protein content in durum wheat. Theoretical and Applied Genetics 107, 1243–1251.
Oria, M.P., Hamaker, B.R., Axtel, J.D., Huang, C.-P., 2000. A highly digestible sorghum mutant cultivar exhibits a unique folded structure of endosperm protein bodies. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97, 5065–5070.
Osuna-Castro, J.A., Rascón-Cruz, Q., Napier, J., Fido, R.J., Shewry, P.R. and Paredes-López, O., 2000. Overexpression, Purification, and in Vitro Refolding of the 11S Globulin from Amaranth Seed in Escherichia coli. J. Agric. Food Chem. 48, 5249-5255.
Osborne,T.B., 1924. The Vegetable Proteins. 2nd edn. Longmans, Green and Co., London, p 154.
Oszvald, M., Kang, T.J., Tömösközi, S., Tamás, C., Tamás, L., Kim, T.G., Yang, MS., 2007. Expression of a synthetic neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus fused with synthetic B subunit of E. coli heat labile enterotoxin in rice endosperm, Molecular Biotechnology 35, 215-224.
Oszvald, M., Gardonyi, M., Tamas, C., Takacs, I., Jenes, B., Tamas L., 2008. Development and Characterization of a chimaeric tissue-specific promoter in wheat and rice endosperm. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 44, 1-7.
Oszvald, M., Tamás, C., Rakszegi, M., Tömösközi, S., Békés, F., Tamás L., 2009. Effects of incorporated amaranth albumins on the functional properties of wheat dough. Journal of the Science of Food and Agriculture DOI 10.1002/jsfa.3528
Paine, J.A., Shipton, C.A., Chaggar, S., Howells, R.M., Kennedy, M.J., Vernon, G., Wright, S.Y., Drake, R., 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nat. Biotechnol. 23, 482–487.
Paredes-López, O., Mora-Escobedo, R., Ordorica-Falomir, C., 1988. Isolation of amaranth proteins. LWT - Food Science and Technology 21, 328-333.
Pastori, G.M., Wilkinson, M.D., Steele, S.H., Sparks, C.A., Jones, H.D., Parry, M.A.J., 2001. Age-dependent transformation frequency in elite wheat varieties. J Exp Bot 52, 857-863.
Pauk, J. and Szarka, B., 1991. Protoplast isolation and investigations in common wheat (Triticum aestivum L.). Physiologia Plantarum 82, 1.
Paul, A.A., and Southgate, D.A.T., 1978. McCance and Widdowson’s The Composition of Foods, fourth ed. Elsevier, Amsterdam
Pawlowski, W.P. and Somers, D.A., 1998. Transgenic DNA integrated into the oat genome is frequently interspersed by host DNA. Proc Natl Acad Sci USA 95, 12106–12110.
Payne, P.I., Holt, L.M., Jackson, E.A. and Law, C.N., 1984. Wheat storage proteins: their genetics and their potential for manipulation by plant breeding. Phil Trans R Soc Lond B 304, 359-371.
114
Pellegrineschi, A., McLean, S., Salgado, M., Velazquez, L., Hernandez, R., Brito, R.M., Noguera, M., Medhurst, A., Hoisington, D., 2000. Transgenic wheat plants: A powerful breeding source. In Bedı, Z., Láng, L. (eds), Wheat in a Global Environment pp 325-330.
Pellegrineschi, A., Noguera, M., Skovmand, B., Brito, R.M., Velazquez, L., Salgado, M., Hernandez, R., Warburton, M., Hoisington, D., 2002. Identification of highly transformable wheat genotypes for mass production of fertile transgenic plants. Genome 45, 421-430.
Perutto, A.D.B., Pogna, N.E., Curioni, A., 1996. Evidence for the presence of disulphide bonds between β-amylase and low molecular weight glutenin subunits, pp 312-315. in: Gluten ’96. C.W.Wrigley, Ed. RACI, Melbourne, Australia
Petolino, J.F., Hopkins, N.L., Kosegi, B.D., Skokut, M., 2000. Whisker-mediated transformation of embryogenic callus of maize. Plant Cell Reports 19, 781-786.
Phillips, R.L., Morris, P.R., Wold, F., Gengenbach, B.G., 1981. Seedling screening for lysine-plus-threonine resistant maize. Crop Science 21, 601-606.
Phillips, R.L., McClure, B.A., 1985. Elevated protein-bound methionine in seeds of a maize line resistant to lysine plus threonine. Cereal Chemistry 62, 213-218.
Pomeranz, Y., 1988. Chemical composition of kernel structures. pp 97-158. in: Wheat Chemistry and Technology, Vol. 1, 3rd edition. Y. Pomeranz, Ed. Am. Assoc. Cereal Chem., St Paul, MN, USA.
Pons, J.L., de Lamotte, F., Gautier, M.F., Delsuc M.A., 2003. Refined solution structure of a liganded type 2 wheat nonspecific lipid transfer protein. J. Biol. Chem. 278, 14249-14256.
Pónya, Z., Finy, P., Fehér, A., Mityko, J., Dudits, D., Barnabás, B., 1999. Optimisation of introducing foreign genes into egg cells and zygotes of wheat (Triticum aestivum L.) via microinjection. Protoplasma 208, 163-172.
Popineau, Y., Deshayes, G., Lefebvre, J., Fido, R., Tatham, A.S., Shewry, P.R., 2001. Prolamin aggregation, gluten viscoelasticity, and mixing properties of transgenic wheat lines expressing 1Ax and 1Dx high molecular weight glutenin subunit transgenes. J Agric Food Chem 49, 395–401.
Potenza, C., Aleman, L., Sengupta-Gopalan, C., 2004. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 40(1), 1-22.
Potrykus, I., 1990. Gene transfer to cereals: an assessment. Bio/Technol. 8, 535–542. Prasanna, B.M., Vasal, S.K., Kassahun, B., Singh, N.N., 2001. Quality protein maize. Current
Science 81, 1308–1319. Pauk, J., Hänsch, R., Schwarz, G., Nerlich, A., Monostori, T., Mészáros, A., Jenes, B.,
Kertész, Z., Matuz, J., Schulze, J., Mendel, R.R., 1998. Genetic transformation of wheat (Triticum aestivum L.) in Hungary. Növénytermelés 47, 241-251.
Qi, B., Fraser, T., Mugford, S., Dobson, G., Sayanova, O., Butler, J., Napier, J.A., Lazarus, C.M., 2004. Production of very long chain polyunsaturated ω-3 and ω-6 fatty acids in Plant. Nat. Biotechnol. 22, 739–745.
Raina, A. and Datta, A., 1992. Molecular cloning of a gene encoding a seed-specific protein with nutritionally balanced amino acid composition from Amaranthus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11774-11778.
Rakszegi, M., Bekes, F., Lang, L., Tamas, L., Shewry, P.R., Bedo, Z., 2005. Technological quality of transgenic wheat expressing an increased amount of a HMW glutenin subunit. J Cereal Sci 42, 15–23.
115
Rascon-Cruz, Q., Sinagawa-Garcia, S., Osuna-Castro, J.A., Bohorova, N., Paredes-Lopez, O., 2004. Accumulation, assembly, and digestibility of amarantin expressed in transgenic tropical maize Theoretical and Applied Genetics 108, 335-342.
Rasco-Gaunt, S. and Barcelo, P., 1999. Immature inflorescence culture of cereals: a highly responsive system for regeneration and transformation. In Hall RD (eds), Methods in Molecular Biology: Plant Cell Culture Protocols pp 71-81. Humana Press Inc., Totowa, NJ.
Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., 1999a. Analysis of particle bombardment parameters to optimize DNA delivery into wheat tissues. Plant Cell Reports 19, 118-127.
Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Lazzeri, P., Barcelo, P., De Block, M., 1999b. A facile method for screening for phosphinothricin (PPT)-resistant transgenic wheats. Molecular Breeding 5, 255-262.
Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Cannell, M., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., 2001. Procedures allowing the transformation of a range of European elite wheat (Triticum aestivum L.) varieties via particle bombardment. Journal of Experimental Botany 52, 865-874.
Rascon-Cruz, Q., Sinagawa-Garcia, S., Osuna-Castro, J.A., Bohorova, N., Paredes-Lopez, O., 2004. Accumulation, assembly, and digestibility of amarantin expressed in transgenic tropical maize Theoretical and Applied Genetics 108, 335-342.
Regina, A., Bird, R., Topping, D., Bowden, S., Freeman, J., Barsby, T., Kosar-Hashemi, B., Li, Z., Rahman, S., Morell, M., 2006. High-amylose wheat generated by RNA interference improves indices of large-bowel health in rats. Proc Natl Acad Sci USA 103, 3546–3551.
Regina, A., Bird, R., Li, Z., Rahman, S., Mann, G., Chanliaud, E., Berbezy, P., Topping, D., Morell, M.K., 2008. Bioengineering Cereal Carbohydrates to Improve Human Health. Cereal Foods World 52(4), 182-187.
Robbins, G.S., Pomeranz, Y., Briggle, L.W., 1971. Amino acid composition of oat groats. Journal of Agricultural Food Chemistry 19, 536–539.
Roesler, K.R., Rao, A.G., 1999. Conformation and stability of barley chymotrypsin inhibitor-2 (CI-2) mutants containing multiple lysine substitutions. Protein Engineering 12, 967-973.
Roesler, K.R., Rao, A.G., 2000. A single disulfide bond restores thermodynamic and proteolytic stability to an extensively mutated protein. Protein Science 9, 1642-1650.
Romero-Zepeda, H. and Parades-López, O., 1996. Isolation and characterization of amarantin, the 11S amaranth seed globulin. Journal of Food Biochemistry 19, 329-339.
Rooke, L., Békés, F., Fido, R., Barro, F., Gras, P., Tatham, A.S., Barcelo, P., Lazzeri, P., Shewry, P.R., 1999. Overexpression of a gluten protein in transgenic wheat results in greatly increased dough strength. Journal of Cereal Science 30, 115-120.
Rooke L., Steele S.H., Barcelo P., Shewry P.R., Lazzeri P.A., 2003. Transgene inheritance, segregation and expression in bread wheat. Euphytica, 129, 301–309.
Rothfus, J.A. and Kennel, S.J., 1970. Properties of wheat β-amylase adsorbed on glutenin. Cereal Chem. 47, 140-146.
Ruiz, M. and Carrillo, J.M., 1993. Linkage relationships between prolamin genes on chromosomes 1A and 1B of durum wheat. Theor Appl Genet 87, 353-360.
Russell, D.A., Fromm, M.E., 1997. Tissue-specific expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice. Transgenic Research 6, 157-168.
Sanford, J.C., 1988. The biolistic process - a new concept in gene transfer and biological delivery. Trends Biotechnology 6, 229-302.
116
Sapirstein, H.D. and Fu, B.X., 1996. Characterization of an extra-strong wheat functionality
of 1) gliadin- and glutenin-rich fractions, 2) total HMW and LMW subunits of glutenin assessed by reduction-oxidation. In ’Gluten ’96, Proceedings of the 6th International Gluten Workshop’, (C.W: Wrigley, ed.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne. Australia. 212-216.
Schropp, P., Belitz, H.D., Weiser, H., 1995. Reoxidation of high molecular weight subunits of glutenin. Cereal Chem 72, 406-410.
Schropp, P. and Weiser, H., 1996. Effects of high molecular weight subunits of glutenin on the rheological properties of wheat gluten. Cereal Chemistry 73, 410-413.
Segal, G., Song, R., Messing, J., 2003. A new opaque variant of maize by a single dominant RNA-interference-inducing transgene. Genetics 165, 387–397.
Segura-Nieto, M., Vázquez-Sánchez, N., Rubio-Velázquez, H., Olguín-Martínez, L., Rodriguez-Nester, C. and Herrera-Estrella, L., 1992. Characterization of Amaranth (Amaranthus hypochondriacus) seed proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40, 1553-1558.
Segura-Nieto, M., Barba de la Rosa, A.P., Parades-López, O., 1994. Biochemistry of amaranth proteins. In: Amaranth: Biology, Chemistry and Technology. (ed. Parades-López, O.) CRC Press, Boca Ratón FL. Chap 5. pp 75-106.
Segura-Nieto, M., Shewry, P.R., Parades-López, O., 1999. Globulins of Pseudocereals: Amaranth, Quinoa, and Buckwheat. In: Seed proteins. Shewry, P.R., Casey R. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, Netherlands, pp 453-475.
Serik, O., Ainur, I., Murat, K., Tetsuo, M., Masaki, I., 1996. Silicon carbide fiber-mediated DNA delivery into cells of wheat (Triticum aestivum L.) mature embryos. Plant Cell Reports 16, 133-136.
Shewry, P.R., Franklin, J., Parmar, S., Smith, S.J., Miflin, B.J., 1983. The effects of sulfur starvation on the amino acid and protein compositions of barley grain. Journal of Cereal Science 1, 21–31.
Shewry, P.R., 1993. Barley seed proteins. In: MacGregor, A.W., Bhatty, R.S. (Eds.), Barley: Chemistry and Technology. AACC, St. Paul, MN, pp. 131–197
Shewry, P.R., Napier, J.A., Tatham, A.S., 1995. Seed proteins-structures and biosynthesis. Plant Cell. 7, 945-956.
Shewry, P.R. and Tatham, A.S., 1997. Disulphide bonds in wheat gluten proteins. J. of Cer. Sci. 25, 207-227.
Shewry, P.R., Tatham, A.S., Halford, N.G., 1999. The prolamins of the Triticeae. pp 35-78. in: Seed Proteins. P. R. Shewry and R. Casey (Eds.), Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands.
Shewry, P.R., Tatham, A.S., 2000. Wheat. The Royal Society of Chemistry. Cambridge CB4 OWF, UK: 335–339.
Shewry, P.R. and Jones, H.D., 2005. Transgenic wheat: where do we stand after the first 12 years. Ann Appl Biol 147, 1–14.
Shewry, P.R., 2007. Improving the protein content and composition of cereal grain. Journal of Cereal Science 46, 239–250.
Shewry, P.R., Baudo, M., Lovegrove, A., Napier, J.A., Ward, J., Baker, J., Beale, M.A., 2007. Is GM wheat different to conventionally bred wheat. Trends in Food Science and Technology 18, 201–209.
Shintani, D. and Della-Penna, D., 1998. Elevating the vitamin E content of Plant through metabolic engineering. Science 282, 2098–2100.
117
Shoup, F.K., Pomeranz, Y., Deyoe, C.W., 1966. Amino acid composition of wheat varieties and flours varying widely in bread-making potentialities. Journal of Food Sci 31, 94–101.
Silva-Sanchez, C.J., Gonzalez-Castaneda, J., De Leon-Rodriguez, A., De La Rosa, APB., 2004. Functional and rheological properties of amaranth albumins extracted from two Mexican varieties. Plant Foods for Human Nutrition 59, 169-174.
Simmonds, N.W., 1995. The relation between yield and protein in cereal grain. Journal of the Science and Food in Agriculture 67, 309–315.
Singh, N.K., Shepherd, K.W., Langridge, P., Gruen, L.C., 1991. Biochemical characterization of triticin, a legumin-like protein in wheat endosperm. J Cereal Sci 13, 207–219.
Singh, N.K. and MacRitchie, F., 2001. Application of polymer science to properties of gluten. J. cereal Sci. 33, 231-243.
Sissons, M.J., Békés, F., Skerritt, J.H., 1998. Isolation and functionality testing of low molecular weight glutenin subunits. Cereal Chemistry 75, 30-36.
Soriano-Santos, J., Iwabuchi, S., and Fujimoto, K., 1992. Solubility of Amaranth seed protein in sodium sulfate and sodium chloride: the main factor in quantitative extraction for analysis. Int. Journ. of Food Sci and Techn. 27, 337-346.
Sparks, C.A., and Jones, H.D., 2004. Transformation of wheat by biolistics. In: (Curtis I, ed) Transgenic Crops of the World. Kluwer Academic Publ., pp 1-16.
Srivastava, V., Anderson, O.D., Ow, D.W., 1999. Single-copy transgenic wheat generated through the resolution of complex integration patterns. Proceeding of the National. Academy of Science 96, 11117-11121.
Stacey, J., Isaac, P.G., 1994. Isolation of DNA from plants. In: Isaac PG (ed.) Methods in Molecular Biology – Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes. Humana Press Inc, Totowa, NJ. vol. 28, pp 9–15.
Stewart, Jr C.N., 2001. The utility of green fluorescent protein in transgenic plants. Plant Cell Reports 20, 376–382.
Stoger, E., Williams, S., Keen, D., Christou, P., 1998. Molecular characteristics of transgenic wheat and the effect on transgene expression. Transgenic Res. 7, 463–471.
Stoger, E., Williams, S., Christou, P., Down, R.E., Gatehouse, J.A., 1999. Expression of the insecticidal lectin from snowdrop (Galathus nivalis agglutinin; GNA) in transgenic wheat plants: effect on predation by the grain aphid Sitobion avenae. Molecular Breeding 5, 65-73.
Sugita, K., Matsunaga, E., Ebinuma, H., 1999. Effective selection system for generating marker-free transgenic plants independent of sexual crossing. Plant Cell Reports 18, 941-947.
Svitashev, S.K., Pawlowski, W.P., Makarevitch, I., Plank, D.W., Somers, D.A., 2002. Complex transgene locus structures implicate multiple mechanisms for plant transgene rearrangement. Plant J 32, 433-445.
Takumi, S. and Shimada, T., 1996. Production of transgenic wheat through particle bombardment of scutellar tissues: frequency is influenced by culture duration. Journal of Plant Physiology 149, 418-423.
Tamás, L., Békés, F., Greenfield, J., Tatham, A.S., Gras. P.W., Shewry, P.R., Apples, R., 1998. Heterologous expression and dough mixing studies of wild-type and mutant C hordeins Journal of Cereal Science 27, 15-22.
Tamás, C., Tamás, L., Morell, KM., Appels, R., 1999. The use of GFP gene as a reporter gene in wheat transformation. 4th Congress of the Hungarian Genetical Society, p 166.
Tamás C., Rakszegi M., Szőcs P., Tamás L., Bedı Z., 2000. Temperature, light and medium optimisation for plant regeneration of winter wheat varieties. 6th International Wheat Conference, p. 308. Budapest, Hungary, 5-9 June 2000.
118
Tamás, L., Gras, P.W., Solomon, R.G., Morell, M.K., Apples, R., Békés, F., 2002. Chain extension and termination as a function of cysteine content and the length of the central repetitive domain in storage proteins. Journal of Cereal Science 36, 313-325.
Tamás, C., Szucs, P., Rakszegi, M., Tamás, L., Bedo, Z., 2004. Effect of combined changes in culture medium and incubation conditions on the regeneration from immature embryos of elite varieties of winter wheat. Plant Cell Tissue and Organ Culture 79, 39-44.
Tamás, L. and Shewry, P.R., 2006. Heterologous expression and protein engineering of wheat gluten proteins. Journal of Cereal Science 43, 259-274.
Tatham, A.S. and Shewry, P.R., 1995. The S-poor prolamins of wheat, barley and rye. J. of Cer. Sci. 22, 1-16.
Terzi, V., Pastori, G., Shewry, P.R., Di Fonzo, N., Stanca, A.M., Faccioli, P., 2005. Real-time PCR-assisted selection of wheat plants transformed with HMW glutenin subunit genes. Journal of Cereal Science 41, 133–136.
Thorpe, T.A., 1980. Organogenesis in vitro: Structural, physiological and biochemical aspects. Int Rev Cytol Suppl 11, 71-111.
Thorpe, T.A., 1994. Morphogenesis and regeneration. In: Vasil, I.K., Thorpe, T.A. (eds) Plant Cell and Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 17-36.
Tingay, S., McElroy, D., Kalla, R., Fieg, S., Wang, M., Thornton, S., Brettell, R., 1997. Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation. The Plant Journal 11, 1369-1376.
Tosi, P., D’Ovidio, R., Napier, J.A., Bekes, F., Shewry, P.R., 2004. Expression of epitope-tagged LMW glutenin subunits in the starchy endosperm of transgenic wheat and their incorporation into glutenin polymers. Theor Appl Genet 108, 468–476.
Tosi, P., Masci, S., Giovangrossi, A., D’Ovidio, R., Bekes, F., Larroque, O., Napier, J., Shewry, P.R., 2005. Modification of the low molecular weight (LMW) glutenin composition of transgenic durum wheat: effects on glutenin polymer size and gluten functionality. Molecular Breeding 16, 113–126.
Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J., 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76:4350-4354.
Tömösközi, S., Varga, J., Gras, P.W., Rath, C., Salgó, A., Nánási, J., Fogor, D. and Békés, F., 2000. Scale down possibilities in development of dough testing methods. in Proc. 7th International Workshop Gluten 2000, ISBN 0-85404-865-0, Univ. of Bristol, UK.
Tömösközi, S., Nádosi, M., Ercsey, K., Nánási, J., Varga, J., 2005. Development of small-scale methods for measuring wheat quality - A new instrument for determination of sedimentation value. 50 YEARS ICC JUBILEE CONFERENCE 1955-2005”Cereals - The future challange” Vienna, Austria July 3-6.
Tulecke, W.R., 1953. The pollen of Ginko biloba. In vitro culture and tissue formation. Am. J. Bot. 44, 602-608.
Tzafrir, I., Torbert, K.A., Lockhart, B.E.L., Somers, D.A., Olszewski, N.E., 1998. The sugarcane bacilliform badnavirus promoter is active in both monocots and dicots. Plant Molecular Biology 38, 347-356.
Uauy, C., Distelfeld, A., Fahima, T., Blechl, A., Dubcovsky, J., 2006. A NAC gene regulating senescence improves grain protein, zinc and iron content in wheat. Science 314, 1298–1301.
Ullrich, S.E., 2002. Genetics and breeding of barley feed quality attributes. In: Slafer, G.A., Molina-Cano, J.L., Savin, R., Araus, J.L., Romagosa, I. (Eds.), Barley Science: Recent Advances from Molecular Biology to Agronomy of Yield and Quality. Food Products Press, pp. 115–142.
119
Uthayakumaran, S., Békés, F., Gras, P.W., 1997. Effect of varying protein content and gliadin to glutenin ratio on the functional properties of wheat dough. In ’Proceedings of the 47th RACI Conference’ (A.W. Tarr, A.S. Ross, and C.W. Wrigley, eds.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne, Australia, pp 212-216.
Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Békés, F., 1998. A systematic study of the wheat storage proteins and their functionality. In ’Proceedings of the 48th RACI Conference’ (A.W. Tarr, A.S. Ross, and C.W. Wrigley, eds.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne, Australia. 150-155.
Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Stoddard, F.L., Békés, F. 1999. Effect of varying protein content and glutenin-to-gliadin ratio on the functional properties of wheat dough. Cereal Chemistry 76, 389-394.
Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Stoodard, F.L., Békés, F., 2000. Optimized methods for incorporating glutenin subunits into wheat dough for extension and beaking studies. Cereal Chemistry 77, 731-736.
Uthayakumaran, S., Tömösközi, S., Savage, A.W.J., Tatham, A., Gianibelli, M.C., Stoddard, F.L. and Békés, F., 2001. Effects of gliadin fractions on the functional properties of wheat dough depend on molecular size and hydrophobicity. Cereal Chem. 78, 138-141.
Uthayakumaran, S., Lukow, O.M., Jordan, M,C., Cloutier, S., 2003. Development of genetically modified wheat to assess its dough functional properties. Molecular Breeding 11(4), 249-258.
Van Eenennaam, A.L., Lincoln, K., Durrett, T.P., Valentin, H.E., Shewmaker, C.K., Thorne, G.M., Jiang, J., Baszis, S.R., Levering, C.K., Aasen, E.D., Hao, M., Stein, J.C., Norris, S.R., Last, R.L., 2003. Engineering vitamin E content: From Arabidopsis mutant to soy oil. Plant Cell 15, 3007–3019.
Vasco-Méndez, N.L. and Parades-López, O., 1995. Antigenic homology between amaranth glutelins and other storage proteins. Journal of Food Biochemistry 18, 227-238.
Vasil, V., Castillo, A.M., Fromm, M.E., Vasil, I.K., 1992. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. BioTechnology 10, 667-674.
Vasil, I.K., Bean, S., Zhao, J., McCluskey, P., Lookhart, G., Zhao, H.- P., Altpeter, F., Vasil, V., 2001. Evaluation of baking properties and gluten protein composition of field grown transgenic wheat lines expressing high molecular weight glutenin gene 1Ax1. J Plant Physiol 158, 521–528.
Vasil, I.K., 2007. Molecular genetic improvement of cereals: transgenic wheat (Triticum aestivum L.) Plant Cell Rep 26, 1133–1154.
Veraverbeke, W.S., Verbruggen, I.M., Delcour, J.A., 1998. Effects of increased high molecular weight glutenin subunits content of flour on dough mixing behaviour and breadmaking. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46, 4830-4835.
Vogel, K.P., Johnson, V.A., Mattern, P.J., 1978. Protein and lysine contents of endosperm and bran of the parents and progenies of crosses of common wheat. Crop Science 18, 751–754.
Wakasa, K., Hasegawa, H., Nemoto, H., Matsuda, F., Miyazawa, H., Tozawa, Y., Morino, K., Komatsu, A., Yamada, T., Terekawa, T., Miyagawa, H., 2006. Highlevel tryptophan accumulation in seeds of transgenic rice and its limited effects on agronomic traits and seed metabolite profile. Journal of Experimental Botany 57, 3069-3078.
Weegels, P.L., Marseille, J.P., Bosveld, P., Hamer, R.J. l994. Large-scale separation of gliadins and their bread-making quality. Journal of Cereal Science 20, 253-264.
Weeks, T., 1998. USDA Agricultural Research Report.
120
Weir, B., Gu, X., Wang, M.B., Upadhyaya, N., Elliot, A.R., Brettell, R.I.S., 2001. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of wheat using suspension cells as a model system and green fluorescent protein as a visual marker. Australian Journal of Plant Physiology 28, 807-818.
White, P.J., Broadley, M.R., 2005. Biofortifying crops with essential mineral elements. Trends in Plant Science 10, 586-593.
Wieser, H., Seilmeier, W. and Kieffer, R. 1994. Relationship between the amount of gluten protein on rheological properties of different wheat cultivars. Pages 141-150. in: Gluten prteins 1993. Assoc. Cereal Res.:Detmold, Germany.
Wieser, H., 2007. Chemistry of gluten proteins. Food Microbiology 24, 115-119. Wright, M.-Dawson, J.-Dunder, E.- Suttie, J.- Reed, J.-Kramer, C.-Chang, Y.- Novitzky, R.-
Wang, H.-Artim-Moore, L.: 2001. Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum aestivum L.) using the phosphomannose isomerase gene, pmi, as the selectable marker. Plant Cell Reports 20, 429–436.
Wrigley, C.W., and Bietz, J.A., 1988. Proteins and amino acids. pp 159-275. in: Wheat: Chemistry and Technology Vol. 1, 3rd edition. Y. Pomeranz, Ed. Am. Assoc. Cereal Chem., St Paul, MN, USA.
Wrigley, C.W., 1996. Giant proteins with flour power. Nature 381, 738-739. Wu, G., Truksa, M., Datla, N., Vrinten, P., Bauer, J., Zank, T., Cirpus, P., Qiu, X. 2005.
Stepwise engineering to produce high yields of very long-chain polyunsaturated fatty acids in Plant. Nat. Biotechnol. 23, 1013–1017.
Wu, H., Sparks, C., Amoah, B., Jones, H.D., 2003. Factors influencing successful Agrobacterium-mediated genetic transformation of wheat. Plant Cell Reports 21, 659-668.
Wu, H., Sparks, C.A., Jones, H.D., 2006. Characterization of T-DNA loci and vector backbone sequences in transgenic wheat produced by Agrobacterium-mediated transformation. Mol Breed 18, 195–208.
Wu, H. X. Doherty, A. Jones, H. D., 2007. Efficient and rapid Agrobacterium-mediated genetic transformation of durum wheat (Triticum turgidum L-var. durum) using additional virulence genes. Transgenic Research 17(3), 425-436.
Xia, G.M., Li, Z.Y., He, C.X., Chen, H.M., Brettell, R., 1999. Transgenic plant regeneration from wheat (Triticum aestivum L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Acta Phytophysiologica Sinica 25, 22-28.
Xu, X., Li, B., 1994. Fertile transgenic Indica rice plants obtained by electroporation of seed embryo cells. Plant Cell Reports 13, 237-242.
Ye, X., Beyer, P., 2000. Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science 287, 303–305.
Yu, J., Peng, P., Zhang, X., Zhao, Q., Zhy, D., Sun, X., Liu, J., Ao, G., 2004. Seed-specific expression of a lysine rich protein sb401 gene significantly increases both lysine and total protein content in maize seeds. Molecular Breeding 14, 1–7.
Zhang, S., Cho, M.J., Koprek, T., Yun, R., Bregitzer, P., Lemaux, P.G., 1999. Genetic transformation of commercial cultivars of oat (Avena sativa L.) and barley (Hordeum vulgare L.) using in vitro shoot meristematic cultures derived from germinated seedlings. Plant Cell Reports 18, 959-966.
Zhang, L., Rybczynski, J.J., Langenberg, W.G., Mitra, A., French, R., 2000. An efficient wheat transformation procedure: transformed calli with long-term morphogenic potential for plant regeneration. Plant Cell Reports 19, 241-250.
Zhang W., Subbarao S., Addae P., Shen A., Armstrong C., Peschke V., Gilbertson L., 2003a. Cre/lox-mediated marker gene excision in transgenic maize (Zea mays L.) plants. Theoretical and Applied Genetics 107, 1157–1168.
121
Zhao, Y., Qian, Q., Wang, H., Huang, D., 2007. Heredity Behavior of bar Gene Cassette is Complex in Rice Mediated by Particle Bombardment. J of Gen and Genom 34, 824-835.
Zhao, Z.-Y., Glassman, K., Sewalt, V., Wang, N., Miller, M., Chang, S., Thompson, T., Catron, S., Wu, E., Bidney, D., Kedebe, Y., Jung, R., 2003. Nutritionally improved transgenic sorghum. In: Vasil, I.K. (Ed.), Plant Biotechnology 2002 and Beyond. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 413–416.
Zhu, C., Naqvi, S., Gomez-Galera, S., Pelacho, A.M., Capell, T., Christou, P., 2007. Transgenic strategies for the nutritional enhancement of Plant. TRENDS in Plant Science Vol.12 No.12.
Zuber, M.S., Darrah, L.L., 1987. Breeding, genetics and seed corn production. In: Watson, S.A., Ramstad, P.E. (Eds.), Corn: Chemistry and Technology. AACC, St. Paul, MN, pp 31–51.
122
8. FÜGGELÉK
I. táblázat İszi búza éretlen embriók szövettenyésztésében alkalmazott táptalajok Táptalaj Táptalaj összetétel BEG 2 MS makro- és mikroelemek (Murashige és Skoog, 1962). 770 µg/l glicin, 130 µg/l
nikotinsav, 25 µg/l tiamin·HCl, 25 µg/l piridoxin·HCl, 25 µg/l kalciumpantotenát, 100 mg/l mio-inositol, 200 mg/l kazaminsav, 200 mg/l L-aszparagin, 146 mg/l L-glutamin, 30 g/l szacharóz, 9 µM 2,4-D, 8 g/l agar, pH 5,8
MS9 MS makroelemek, MS mikroelemek, MS vitaminok (Murashige & Skoog, 1962), 2,0 mg/l glicin, 20 g/l szacharóz, 2,7 µM IAA, 4,4 µM BAP, 8 g/l agar, pH 5,8
MS9N MS9 táptalaj IAA nélkül, helyette 2,7 µM NAA MS92 MS9 táptalaj fele mennyiségő MS makro sóval MS92N MS9N táptalaj fele mennyiségő MS makro sóval
II. táblázat A transzformációban alkalmazott táptalajok összetétele (Sparks és Jones, 2004; Tamás és mtsai., 2004)
Táptalaj Táptalaj összetétel MD0,5 MS makroelemek (Murashige and Skoog, 1962), L mikroelemek (Lazzeri és
mtsai., 1991), MS Fe-Na-EDTA, MS(-Gly) vitaminok (Murashige and Skoog, 1962), 3AA aminosavak (Sparks and Jones, 2004), 100 mg/l mio-inozitol, 90 g/l szacharóz, 10 mg/l AgNO3, 0,5 mg/l 2,4-D, 8 g/l agar, pH 5,8
MD1 Mint MD0,5 de 1 mg/l 2,4-D tartalmú MD2 Mint MD0,5 de 2 mg/l 2,4-D tartalmú R0 L7 makroelemek (Barro és mtsai., 1999), L mikroelemek, MS Fe-Na-EDTA, L
vitaminok (Sparks és Jones, 2004), 200 mg/l mio-inozitol, 30 g/l maltóz, 8 g/l agar, pH 5,8
RZ+1/2Cu R0 táptalaj és 0,1 mg/l 2,4-D, 5 mg/l zeatin, 0,05 mM CuSO4 RZ R0 táptalaj és 5 mg/l zeatin RZPPT4 RZ táptalaj és 4 mg/l PPT RPPT4 R0 táptalaj és 4 mg/l PPT
123
III. táblázat Transzgénikus Cadenza búzavonalak T2 szemtermésébıl nyert lisztek esszenciális aminosav összetétele aminosav tartalom, %
aminosav Cadenza (donor)
Cadenza (null
transzgénikus) #28 #58 #59 #80 #83
His 2,26 2,20 2,28 (0,9) 2,28 (0,9) 2,28 (0,9) 2,28 (0,9) 2,27 (0,5)
Ile 3,38 3,33 3,46 (2,4) 3,45 (2,1) 3,46 (2,4) 3,46 (2,4) 3,44 (1,9)
Leu 6,53 6,45 6,58 (0,8) 6,58 (0,8) 6,58 (0,8) 6,58 (0,8) 6,57 (0,6)
Lys 2,19 2,18 2,33 (6,4) 2,32 (6,0) 2,32 (6,0) 2,32 (6,0) 2,30 (5,0)
Met 1,32 1,32 1,32 (0,0) 1,32 (0,0) 1,32 (0,0) 1,32 (0,0) 1,32 (0,0)
Phe 5,03 4,98 5,08 (1,0) 5,08 (1,0) 5,07 (0,8) 5,08 (1,0) 5,07 (0,8)
Thr 2,53 2,51 2,61 (3,1) 2,59 (2,4) 2,60 (2,8) 2,60 (2,8) 2,58 (2,1)
Tyr 2,61 2,57 2,71 (3,8) 2,71 (3,8) 2,71 (3,8) 2,71 (3,8) 2,70 (3,5)
Val 4,28 4,26 4,34 (1,4) 4,34 (1,4) 4,34 (1,4) 4,34 (1,4) 4,33 (1,2) Az értékek három párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,01. Zárójelben a nem transzformált búza növény lisztjében mért aminosav tartalomhoz viszonyított növekedést adtuk meg %-ban.
124
I. ábra A valorigram és a belıle leolvasható paraméterek
M A G L P
ATCAGATTAACATAATTTCACAATAAAAAAAAAAAAAAGAGCTTAAATGGCGGGATTACC 60 V I M C L K S N N N Q K Y L R Y Q S D N AGTGATTATGTGCCTAAAATCAAATAACAACCAGAAGTACTTAAGATATCAAAGTGATAA 120 I Q Q Y G L L Q F S A D K I L D P L A Q TATTCAACAATATGGTCTTCTTCAATTTTCAGCTGATAAGATTTJAGATCCATTAGCTCA 180 F E V E P S K T Y D G L V H I K S R Y T ATTTGAAGTCGAACCTTCCAAGACTTATGATGGTCTTGTTCACATCAAATCTCGCTACAC 240 N K Y L V R W S P N H Y W I T A S A N E TAACAAATATTTGGTTAGGTGGTCTCCCAATCATTATTGGATTACAGCATCAGCCAATGA 300 P D E N K S N W A C T L F K F L Y V E E ACCAGATGAAAATAAAAGCAATTGGGCATGCACATTATTCAAACCACTTTACGTAGAAGA 360 G N M K K V R L L H V Q L G H Y T E N Y AGGTAACATGAAAAAGGTTCGACTTTTGCACGTCCAATTAGGTCATTATACAGAAAATTA 420 T V G G S F V S Y L F A E S S Q I D T G TACCGTTGGTGGGTCCTTCGTATCATACTTATTTGCCGAATCAAGTCAAATTGATACCGG 480 S K D V F H V I D W K S I F Q F P K T Y CTCTAAAGACGTATTCCATGTCATAGATTGGAAATCAATCTTTCAATTTCCCAAAACATA 540 V T F K G N N G K Y L G V I T I N Q L P TGTCACATTTAAAGGAAATAATGGAAAATATTTAGGGGTTATCACAATTAATCAACTTCC 600 C L Q F G Y D N L N D P K V A H Q M F V ATGTCTACAATTTGGGTATGATAATCTTAATGATCCAAAGGTGGCTCATCAAATGTTTGT 660 T S N G T I C I K S N Y M N K F W R L S CACTTCTAATGGTACTATTTGCATTAAATCCAATTATATGAACAAGTTTTGGAGACTCTC 720 T D N W I L V D G N D P R E T N E A A A TACGGATAATTGGATATTAGTCGATGGGAATGATCCTCGCGAAACTAATGAAGCTGCTGC 760 L F R S D V H D F N V I S L L N M Q K T GTTGTTTAGGTCGGATGTGCATGATTTTAATGTGATTTCGCTTTTGAACATGCAAAAAAC 840 U F I K R F T S G K P E F I N C M N A A TTGGTTTATTAAGAGATTTACGAGTGGTAAGCCTGAGTTTATAAATTGTATGAATGCAGC 900 T Q I V D E T A I L E I I E L G S StpStp TACTCAAATTGTTGATGAAACTGCTATTTTAGAGATAATAGAATTGGGATCCAACAACTA 960 ATATATTGGATTGCTTTTAAGATTCAAATTAAAGTCTAGTTGTTAATGTAAGGAATAAAA 1020 CGTTGTAAGTCGTCTCTTTGGAAACAAGAGGGTTCTTCCTTGTATCATATCTCTATGGTC 1080 TCTTTCAGATTTTGACCATAAGATTACTATTAAATACTTGTAATGTGTTTGTCTGTGATG 1140 ATTACTCTTTGTTGGAATAAAATAATTGTTAGAATTATATTAC 1183
II. ábra Az AmA1 fehérje aminosav szekvenciája. A lizin (K) és a cisztein (C) aminosavakat
vastagított, valamint vastagított és aláhúzott betőkkel jelöltük.