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ANÁLISES BROMATOLÓGICAS
Profa. Ionara F. R. Vieira
PROTEÍNAS PROTEÍNAS EM ALIMENTOSEM ALIMENTOS
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PROTEÍNASDEFINIÇÃO Substâncias orgânicas complexas (C,
H, O, N, S, P, Fe, Cu, Zn). Polímero de alto peso molecular Unidade básica: aminoácidos
IMPORTÂNCIA• nutricional• propriedades
sensoriais2
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Unidades estruturais básicas das proteínas
PROTEÍNASAMINOÁCIDOS (aa)
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Cada aminoácido tem uma cadeia lateral (R) característica, que influencia suas propriedades físico-químicas.
Diferenças: tamanho, estrutura e carga elétrica.
Arranjo tetraédrico atividade ótica isômero L e D
Só os aminoácidos L são constituintes de proteínas naturais.
AMINOÁCIDOS (AA)AMINOÁCIDOS (AA)
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alanina
valina
leucina
triptofano
fenilalanina
metionina
AMINOÁCIDOS (AA)AMINOÁCIDOS (AA)
Apolares ou hidrofóbicas, exemplos:Apolares ou hidrofóbicas, exemplos:
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ácido aspártico
histidinaasparagina glicina
serina ácido glutâmico
tirosina
AMINOÁCIDOS (AA)AMINOÁCIDOS (AA)
Polares ou hidrofílicos, Polares ou hidrofílicos, exemplos:exemplos:
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PROTEÍNASPROTEÍNAS
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PROTEÍNASPROTEÍNASSão polímeros de aminoácidos. Vinte tipos de aminoácidos ocorrem
naturalmente nas proteínas.Diferem com o tipo, número e seqüência de
aminoácidos na cadeia polimérica, conformação molecular tridimensional.
Apresentam 50-55% de C, 20-23 % de O, 14-18 % de N14-18 % de N, 6-8% de H, 0-4 % de S.
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ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS
ESTRUTURA PRIMÁRIASeqüência linear de aminoácidos
Nível estrutural mais importante, dele deriva todo o arranjo espacial da molécula
Varia em 3 aspectos: número, seqüência e natureza dos AA
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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ESTRUTURA SECUNDÁRIA
Disposição espacial adotada pela cadeia polipeptídica
Estrutura helicoidal (-hélice) – interações H intra-moleculares
Estrutura foliar (folhas pregueadas) – interações H inter-moleculares
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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ESTRUTURA TERCIÁRIA
Organização tridimensional da cadeia polipeptídica contendo ou não zonas de estrutura secundária definidas
Estabilização: Ligações dissulfeto (Cys + Cys = cistina) interações de hidrogênio Interações eletrostáticas Interações dipolares Interações hidrofóbicas Forças de Van der Waals Grupos hidrofóbicos dispostos no interior da
molécula
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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ESTRUTURA QUATERNÁRIA
Resultado de associações não covalentes de unidades protéicas iguais ou diferentes
Estas subunidades se mantém unidas por forças covalentes, como pontes dissulfeto, e ligações não covalentes, como pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, etc.
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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Fonte de aminoácidos na dieta e de energia.
Aminoácidos essências (lisina, triptofano,
metionina, leucina, isoleucina e valina) não
podem ser sintetizados pelo organismo humano.
Proteínas alimentares são digeríveis, não
tóxicas e palatáveis. Têm diferentes estruturas
moleculares, atributos nutricionais e
propriedades físico-químicas.
PROTEÍNAS NO ALIMENTOPROTEÍNAS NO ALIMENTO
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Responsáveis por compostos aromáticos e substâncias coloridas formadas por reações térmicas ou enzimáticas ocorridas durante obtenção, preparação e armazenamento dos alimentos.
Componentes estruturais de muitos alimentos naturais, freqüentemente determinam sua textura, por exemplo, tenderness de produtos de carne e peixe.
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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Isoladas são usadas nos alimentos como ingredientes devidos a suas propriedades funcionais, p.e., sua capacidade de atribuir aparência, textura ou estabilidade desejáveis ao produto: agentes gelificantes, emulsionantes, espumantes e espessantes.
Alergias e intolerâncias – proteínas de leite, ovos, castanhas, etc.; celíacos, fenilcetunúricos.
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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IMPORTÂNCIA
Conhecer o valor nutritivoDeterminação da composição centesimal
de um alimento e análise para rotulagemEstimar rendimento industrialAvaliar a qualidade (ex.: glúten
qualidade da farinha)Avaliar a influência nas propriedades
sensoriais
MÉTODOS FISICO-QUÍMICOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS
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MÉTODOS DE DETERMINAÇÃOMÉTODOS DE DETERMINAÇÃO
A. Métodos que utilizam a determinação de Nitrogênio: Kjeldahl ** Dumas ** Destilação direta Métodos que utilizam técnicas nucleares: ativação por
nêutrons; ativação por prótons
B. Métodos químicos e físicos Reação do Biureto ** Interação proteína-corante (Dye-binding) ** Método do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Método do fenol
reagente ** Titulação com formol Espectroscopia no IV ou no UV ** Refratometria Turbidimetria ** Espectroscopia eletrônica Polarografia
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É a determinação mais utilizada.
Considera que as proteínas têm, em média, 16% de nitrogênio.
Fator geral (F) na transformação de nitrogênio para proteínas é de 6,25%.
%Proteinas = F x %N%Proteinas = F x %N
Fatores de conversão específicos: trigo-5,70; leite- 6,38; gelatina- 5,55.
Análise de nitrogênio
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Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl.
Não mede proteínas diretamente. A quantidade de proteínas presentes é calculada a partir da concentração de N no alimento.
Necessita de um fator de conversão (F) para converter a medida de N para proteínas.
F = 6,25 (equivalente a 0,16gN/ g proteína) é usado para muitas aplicações, existem outros fatores de conversão.
Proteínas - KjeldahlProteínas - Kjeldahl
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KJELDAHLKJELDAHL
É o principal método para determinação de proteínas em alimentos - é padrão e largamente usado.
Tem alta precisão e boa reprodutibilidade.
O método Kjeldahl é dividido em três etapas: digestão, destilação e titulação.digestão, destilação e titulação.
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MÉTODO KJELDAHLMÉTODO KJELDAHL1a etapa: DigestãoO alimento é colocado no frasco de digestão e então digerido pelo aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante que digere alimentos), e um catalisador (cobre, selênio, titânio ou mercúrio). A digestão converte o N do alimento (ou outro na forma de nitratos ou nitritos) em amônio, e a matéria orgânica em C02 e H20. O gás amônia não é liberado numa solução ácida porque a amônia está na forma de íon (NH4
+) que se liga ao íon sulfato (SO42-) e assim
permanece na solução:
CHON CHON (alimento)(alimento) (NH (NH44))22SOSO44 + C0 + C02(g)2(g) + H + H220 0 (g)(g) (1)(1)
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MÉTODO KJELDAHLMÉTODO KJELDAHL2a etapa: Neutralização e DESTILAÇÃODepois da digestão o frasco de digestão é conectado no destilador de nitrogênio. Adiciona-se hidróxido de sódio, que converte o sulfato de amônio em gás amônia:
(NH(NH44))22SOSO44 + 2 NaOH + 2 NaOH 2NH 2NH33 + 2H + 2H22O + NaO + Na22SOSO44 (2)
A amônia formada é liberada da solução. Por destilação por arraste a vapor a NH3 é transferida do frasco de digestão para um erlenmeyer contendo ácido bórico em excesso.
NHNH33 + H + H33BOBO33 NH NH44++ + H + H22BOBO33
-- (íon borato)(íon borato) (3) 23
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DIGESTOR
DESTILADOR
Água de arraste
Amostra
NaOH
Erlenmeyer com solução de H3BO3
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MÉTODO KJELDAHLMÉTODO KJELDAHL3a etapa: Titulação O conteúdo de N é estimado por titulação do borato de amônio com ácido sulfúrico ou clorídrico.
HH22BOBO33-- + H + H++ H H33BOBO33 (4)
A concentração dos íons H+ gastos na titulação equivalem à concentração do nitrogênio.O conteúdo de N é então convertido em proteínas usando um fator apropriado:
%Protein = F x %N%Protein = F x %N 25
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Falhas do processo (Kjeldahl): 1. Não é uma medida ‘verdadeira’ de proteínas,
dosa todo N - protéico e não protéico (purinas, piridinas, vitaminas, uréia, aminas, amidas, etc.). Pode melhorar a técnica precipitando a proteína e separando com lavagem (retira o N não protéico), mas, no entanto pode carregar peptídeos e aminoácidos.
3. F dá erros quando o conteúdo em N é muito diferente de 16%. Diferentes proteínas necessitam de diferentes fatores de correção pois tem diferentes seqüências de aminoácidos
5. Desvantagem: utiliza substâncias corrosivas/muito oxidantes
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DESTILAÇÃO DIRETADESTILAÇÃO DIRETA Modificação do método de kjeldahl.Sem digestão.Amostra + NaOH/Na2SO4 NH3
Mistura-se com H3BO3 e titula-se com ácido.
Necessita de curva de calibração.É usado como rotina em alguns
alimentos, produtos crus (no qual o tempo é mais importante que a exatidão).
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MÉTODO DUMAS MÉTODO DUMAS (1831)(1831)Também determina N total.
Princípio: Combustão a 700-900°C – produz CO2, H2O e N2.
O N2 liberado é analisado volumetricamente ou por técnica instrumental.
N2 pode ser medido quando passa através de uma coluna que tem um detector de condutividade térmica no final.
Combustão da amostra (700º-800ºC)
Medição do N
gasoso
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MÉTODO DUMASMÉTODO DUMASNecessário converter o teor de N na amostra para teor de proteínas - F.
Problemas: sujeita à erros pequena qtde de amostra – amostra pode ser não representativa.
Equipamento - melhora precisão;
- mais rápido, uns 4-10 minutos por medida, comparado com 4-6 horas para Kjeldahl;
-- não necessita de reagentes ou catalisador.
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TURBIMÉTRICOTURBIMÉTRICO Fundamento: medida da turbidez
causada pela proteína precipitada. Agentes precipitantes: ác.tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido Sulfosalicílico.
Precipitante + proteína turbidez Mede-se o grau de turbidez. Rápido, simples (proteínas líquidas). Desvantagens: não é usado p/sólidos;
depende da proteína; depende de padrões; precipitação de interferentes.
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MÉTODOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOSESPECTROFOTOMÉTRICOS
As principais diferentes entre os testes são os grupos químicos responsáveis pela absorção da radiação, exemplo: ligações peptídicas, grupos aromáticos, grupos básicos proteínas agregadas.
A concentração de proteínas é determinada a partir da curva de calibração.
As curvas de calibração de absorbância (ou turbidez) versus concentração proteínas é preparada usando uma série de soluções de concentração conhecida.
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MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS UV E MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS UV E VISÍVELVISÍVEL
Desvantagens: é necessário que as proteínas estejam diluídas em soluções transparentes, e que não contenham substâncias que absorvam no mesmo comprimento de onda que as proteínas.
Preparação de alimentos exigem muitas etapas: homogeneização, extração por solventes, centrifugação, filtração, que podem consumir muito tempo e trabalho.
Absorbância depende do tipo de proteína. 32
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Princípio - Sais de Cu+2 em soluções alcalinas produzem cor violeta ou roxavioleta ou roxa quando interagem com ligações peptídicas.
Medida feita em um Colorímetro ou espectrofotômetro.
Faz-se a reação e após uns 15-20 minutos lê-se a absorbância a 540 nm.
Determina proteínas.
Teste do Biureto (Teste do Biureto (Riegler, 1914)
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Cor formada depende de cada proteína e a intensidade é proporcional à quantidade.
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B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Follin-Ciocalteau-Lowry)
Reação das proteínas com reagente de fenol Folin-Ciocalteau e reagente de Biureto (Cu+2 em condições alcalinas).
Oxidação de aminoácidos aromáticos - tirosina e triptofano - com aparecimento de uma coloração azul.
Cor azul colorímetro (500 a 750 nm) curva padrão. 35
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B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Follin-Ciocalteau-Lowry)
Desvantagens: É lento: operações múltiplas e período de
incubação Necessita de uma curva padrão com proteína
conhecida Intensidade da cor depende de cada proteína.
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C. Métodos Espectofotométricos UVC. Métodos Espectofotométricos UVPrincípio - proteínas possuem absorção UV em
280nm (aminoácidos aromáticos: tirosina, triptofano, fenilalanina.
Rápido, simples, não usa reagentes e não destrutivo.
Pouco exato - depende da composição dos aminoácidos.
Ácidos nucléicos podem interferir. 37
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Método Dye-bindingMétodo Dye-binding Corantes que reagem quantitativamente
com proteínas. Lisina, histidina e arginina reagem com -
SO3H. Corante + proteína complexo insolúvel. Mede-se o excesso de corante
colorimetricamente. A quantidade de proteína :Corante ligado = corante inicial – corante livre.
Corantes: Laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo e preto amino 10B.
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DYE-BINDINGDYE-BINDING
Fundamento:
Boa correlação com o Kjeldahl. Rápido, simples, exato, econômico.
Desvantagens: Aquisição do equipamento
Amostra +
corante (exc.)
Formação de um complexo
insolúvel
Separação (centrifugaçã
o ou filtração)
Mede o excesso de corante que não reagiu
Por diferença obtém-se a
quantidade de proteína
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SEPARAÇÃO DE PROTEÍNASSEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS
Solubilidade
Cromatografia: - tamanho,
- carga, - adsorção.
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![Page 41: A NÁLISES B ROMATOLÓGICAS Profa. Ionara F. R. Vieira PROTEÍNAS EM ALIMENTOS](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062502/570638531a28abb8238f9ee8/html5/thumbnails/41.jpg)
ANÁLISE DE AMINOÁCIDOSANÁLISE DE AMINOÁCIDOSDeterminar a composição de aminoácidos
nas proteínas.A proteína é hidrolisada usando um
ácido forte ou enzimas libera aminoácidos.
Cromatografias separam os aminoácidos troca iônica, afinidade ou por absorção.
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