Download - A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
![Page 1: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/1.jpg)
A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
![Page 2: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/2.jpg)
Histórico• 1952, Markham and Smith
– Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico
• 1955, Smithies– Géis de amido funcionam bem para separar
proteínas do soro humano
• 1967, Loening – Géis de acrilamida com maior resolução e permitem
separar ainda moléculas grandes de DNA
• 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos
enormes• É hoje impossível imaginar um laboratório de
biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...
Vou ali correr um gelzinho e
já volto
Tenho que ir senão vou perder meu gel
![Page 3: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/3.jpg)
Eletroforese• Movimento de partículas dispersas
num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme
• DNA, carga negativa– Tem tendência a se dirigir ao polo
positivo quando sujeito a um campo elétrico
• Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com
detergente (SDS)
• Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular
![Page 4: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/4.jpg)
Eletroforese, etapas
1.Preparação do gel
2.Aplicação das amostras
3.Eletroforese
4.Coloração
5. Análise dos resultados
![Page 5: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/5.jpg)
Preparação do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
![Page 6: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/6.jpg)
Aplicação das amostras
Definição do mapa das amostras por canaleta
![Page 7: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/7.jpg)
Corrida do gel• Aplicação do campo elétrico
• Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão
• Terminais positivo e negativo
• Tempo adequado, senão o DNA sai do gel
![Page 8: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/8.jpg)
Coloração das moléculas
• Brometo de etídio– Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
– Composto fluorescente à luz UV– Gel de agarose
• Prata– Gel SDS-PAGE
• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
– Melhor resolução
• Coomassie blue, etc
![Page 9: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/10.jpg)
![Page 11: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/11.jpg)
Eletroforese em campo pulsado
Grandes fragmentos de DNA
![Page 12: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/12.jpg)
PCR a reação em cadeia da polimerase
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
http://dotsub.com/view/538a719f-927b-4192-8e95-18a92a9e95a5
![Page 13: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/13.jpg)
Reação em cadeia
![Page 14: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/14.jpg)
Amplificação do DNA
![Page 15: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/15.jpg)
Síntese de DNA in vitro
• Polimerase Chain Reaction– Reação em cadeia da Polimerase
• Amplificação in vitro demoléculas de DNA– In vivo X In vitro X In silico
• Procedimento análogo à replicação do DNA– Amostra de DNA; 2 primers; DNA polimerase; Tampão; dNTP
![Page 16: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/16.jpg)
Etapas da PCR
• Ciclos da PCR– Separação das fitas → 96°C– Anelamento dos primers → 60°C– Síntese do DNA → 37°C
• Problema inicial da técnica– Durante a etapa de quebra das
pontes de H e separação das fitas (DNA melting) a 96°C, a enzima polimerase era desnaturada e precisava ser acrescentada ciclo a ciclo...
– Não permitia automação
![Page 17: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/17.jpg)
História da PCR• Químico, 1966
– Doutor em bioquímica, 1972– 2 anos de pós-doutorado numa industria farmacêutica
• Deixou a academia para escrever ficção científica, foi dono de padaria por dois anos; voltou à indústria
• 1983 → Teve a idéia de utilizar um par de primers para amplificação enquanto voltava para a casa à noite ao lado da namorada
• Avisou na empresa e deixou-se que ele ficasse trabalhando na PCR, demorou um ano para padronizar a técnica
• Perdeu a namorada logo depois, mas ganhou o Nobel de química (1993)
• 1986 → utilização da enzima polimerase de Thermus aquaticus– Permitiu finalmente a automação da técnica
• Controvérsias: Surfista, já foi divorciado 3 vezes, é um dos queacredita que o HIV não causa a AIDS, e diz ter tomado bastante LSD na década de 60/70 e que isso o ajudou a descobrir a afamada técnica!
Kary Mullis, 1944
Taq polimerase
![Page 18: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/18.jpg)
PCR
Sistema de reação:DNA molde (100 ng)Iniciadores (5 M)dNTPsTampão com MgCL2
Taq polimerase
Protocolo de amplificação:Desnaturação: 95º CAnelamento: 45-60º CExtensão: 72º C
![Page 19: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/19.jpg)
Filmes como técnica didática
• http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/• http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm• http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ
![Page 20: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/20.jpg)
Interlúdio explicativo
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
![Page 21: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/21.jpg)
Bioquímica + Biomol
• Enzimas são proteínas, portanto:
1. São formadas por sequências de aminoácidos
2. Derivam de informações dispostas por genes no DNA, que deve ser transcrito e, posteriormente, traduzido
3. Podemos saber a sequência delas, tanto de aminoácidos quanto de nucleotídeos
![Page 22: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/22.jpg)
![Page 23: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/23.jpg)
>gi|188497753|ref|NM_000188.2| Homo sapiens hexokinase 1 (HK1), nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1, mRNA GAGGAGGAGCCGCCGAGCAGCCGCCGGAGGACCACGGCTCGCCAGGGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCA CGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCAGCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAG CTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTCTATGCCATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCA TAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCTCCCGGGATTTTAATCCAACAGCCAC AGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTCTGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTG GATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAATCATGAGAAAAACCAGAATGTTCACA TGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCAGTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGT TGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGACAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACG TTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTGATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAG CGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAGCCATCAAAAAGCGAGGGGACTATGA TGCCAACATCGTAGCTGTGGTGAATGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGGCTATGACGACCAGCAC TGTGAAGTCGGCCTGATCATCGGCACTGGCACCAATGCTTGCTACATGGAGGAACTGAGGCACATTGATC TGGTGGAAGGAGACGAGGGGAGGATGTGTATCAATACAGAATGGGGAGCCTTTGGAGACGATGGATCATT AGAAGACATCCGGACAGAGTTTGACAGGGAGATAGACCGGGGATCCCTCAACCCTGGAAAACAGCTGTTT GAGAAGATGGTCAGTGGCATGTACTTGGGAGAGCTGGTTCGACTGATCCTAGTCAAGATGGCCAAGGAGG GCCTCTTATTTGAAGGGCGGATCACCCCGGAGCTGCTCACCCGAGGGAAGTTTAACACCAGTGATGTGTC AGCCATCGAAAAGAATAAGGAAGGCCTCCACAATGCCAAAGAAATCCTGACCCGCCTGGGAGTGGAGCCG TCCGATGATGACTGTGTCTCAGTCCAGCACGTTTGCACCATTGTCTCATTTCGCTCAGCCAACTTGGTGG CTGCCACACTGGGCGCCATCTTGAACCGCCTGCGTGATAACAAGGGCACACCCAGGCTGCGGACCACGGT TGGTGTCGACGGATCTCTTTACAAGACGCACCCACAGTATTCCCGGCGTTTCCACAAGACTCTAAGGCGC TTGGTGCCAGACTCCGATGTGCGCTTCCTCCTCTCGGAGAGTGGCAGCGGCAAGGGGGCTGCCATGGTGA CGGCGGTGGCCTACCGCTTGGCCGAGCAGCACCGGCAGATAGAGGAGACCCTGGCTCATTTCCACCTCAC CAAGGACATGCTGCTGGAGGTGAAGAAGAGGATGCGGGCCGAGATGGAGCTGGGGCTGAGGAAGCAGACG CACAACAATGCCGTGGTTAAGATGCTGCCCTCCTTCGTCCGGAGAACTCCCGACGGGACCGAGAATGGTG ACTTCTTGGCCCTGGATCTTGGAGGAACCAATTTCCGTGTGCTGCTGGTGAAAATCCGTAGTGGGAAAAA GAGAACGGTGGAAATGCACAACAAGATCTACGCCATTCCTATTGAAATCATGCAGGGCACTGGGGAAGAG CTGTTTGATCACATTGTCTCCTGCATCTCTGACTTCTTGGACTACATGGGGATCAAAGGCCCCAGGATGC CTCTGGGCTTCACGTTCTCATTTCCCTGCCAGCAGACGAGTCTGGACGCGGGAATCTTGATCACGTGGAC AAAGGGTTTTAAGGCAACAGACTGCGTGGGCCACGATGTAGTCACCTTACTAAGGGATGCGATAAAAAGG AGAGAGGAATTTGACCTGGACGTGGTGGCTGTGGTCAACGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGCTT ATGAGGAGCCCACCTGTGAGGTTGGACTCATTGTTGGGACCGGCAGCAATGCCTGCTACATGGAGGAGAT GAAGAACGTGGAGATGGTGGAGGGGGACCAGGGGCAGATGTGCATCAACATGGAGTGGGGGGCCTTTGGG GACAACGGGTGTCTGGATGATATCAGGACACACTACGACAGACTGGTGGACGAATATTCCCTAAATGCTG GGAAACAAAGGTATGAGAAGATGATCAGTGGTATGTACCTGGGTGAAATCGTCCGCAACATCTTAATCGA CTTCACCAAGAAGGGATTCCTCTTCCGAGGGCAGATCTCTGAGACGCTGAAGACCCGGGGCATCTTTGAG ACCAAGTTTCTCTCTCAGATCGAGAGTGACCGATTAGCACTGCTCCAGGTCCGGGCTATCCTCCAGCAGC TAGGTCTGAATAGCACCTGCGATGACAGTATCCTCGTCAAGACAGTGTGCGGGGTGGTGTCCAGGAGGGC CGCACAGCTGTGTGGCGCAGGCATGGCTGCGGTTGTGGATAAGATCCGCGAGAACAGAGGACTGGACCGT CTGAATGTGACTGTGGGAGTGGACGGGACACTCTACAAGCTTCATCCACACTTCTCCAGAATCATGCACC AGACGGTGAAGGAACTGTCACCAAAATGTAACGTGTCCTTCCTCCTGTCTGAGGATGGCAGCGGCAAGGG GGCCGCCCTCATCACGGCCGTGGGCGTGCGGTTACGCACAGAGGCAAGCAGCTAAGAGTCCGGGATCCCC AGCCTACTGCCTCTCCAGCACTTCTCTCTTCAAGCGGCGACCCCCTACCCTCCCAGCGAGTTGCGCTGGG AGACGCTGGCGCCAGGGCCTGCCGGCGCGGGGAGGAAAGCAAAATCCAACTAATGGTATATATTGTAGGG TACAGAATAGAGCGTGTGCTGTTGATAATATCTCTCACCCGGATCCCTCCTCACTTGCCCTGCCACTTTG CATGGTTTGATTTTGACCTGGTCCCCCACGTGTGAAGTGTAGTGGCATCCATTTCTAATGTATGCATTCA TCCAACAGAGTTATTTATTGGCTGGAGATGGAAAATCACACCACCTGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAG CCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACCAGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCC CGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCTTCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTG GCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGTCCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTG TGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGTCCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCA TTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAATTTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTC GTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
>gi|188497754|ref|NP_000179.2| hexokinase 1 isoform HKI [Homo sapiens] MIAAQLLAYYFTELKDDQVKKIDKYLYAMRLSDETLIDIMTRFRKEMKNGLSRDFNPTATVKMLPTFVRS IPDGSEKGDFIALDLGGSSFRILRVQVNHEKNQNVHMESEVYDTPENIVHGSGSQLFDHVAECLGDFMEK RKIKDKKLPVGFTFSFPCQQSKIDEAILITWTKRFKASGVEGADVVKLLNKAIKKRGDYDANIVAVVNDT VGTMMTCGYDDQHCEVGLIIGTGTNACYMEELRHIDLVEGDEGRMCINTEWGAFGDDGSLEDIRTEFDRE IDRGSLNPGKQLFEKMVSGMYLGELVRLILVKMAKEGLLFEGRITPELLTRGKFNTSDVSAIEKNKEGLH NAKEILTRLGVEPSDDDCVSVQHVCTIVSFRSANLVAATLGAILNRLRDNKGTPRLRTTVGVDGSLYKTH PQYSRRFHKTLRRLVPDSDVRFLLSESGSGKGAAMVTAVAYRLAEQHRQIEETLAHFHLTKDMLLEVKKR MRAEMELGLRKQTHNNAVVKMLPSFVRRTPDGTENGDFLALDLGGTNFRVLLVKIRSGKKRTVEMHNKIY AIPIEIMQGTGEELFDHIVSCISDFLDYMGIKGPRMPLGFTFSFPCQQTSLDAGILITWTKGFKATDCVG HDVVTLLRDAIKRREEFDLDVVAVVNDTVGTMMTCAYEEPTCEVGLIVGTGSNACYMEEMKNVEMVEGDQ GQMCINMEWGAFGDNGCLDDIRTHYDRLVDEYSLNAGKQRYEKMISGMYLGEIVRNILIDFTKKGFLFRG QISETLKTRGIFETKFLSQIESDRLALLQVRAILQQLGLNSTCDDSILVKTVCGVVSRRAAQLCGAGMAA VVDKIRENRGLDRLNVTVGVDGTLYKLHPHFSRIMHQTVKELSPKCNVSFLLSEDGSGKGAALITAVGVR LRTEASS
917 aminoácidos
3617 bp3,6 kb
917 x 3 = 2751
3617-2751 = 866
![Page 24: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/24.jpg)
Sequenciamento de proteínas• Degradação de Edman
– Quebra-se o aminoácido N-terminal– Identifica-se o aminoácido quebrado– Sequenciamento de 50 a 70 aa’s
• Espectometria de massa– Quebra-se a proteína em diversos
pontos e verifica-se a massa dos fragmentos
– Comparações com massas conhecidas dos aa’s identifica a sequência dos mesmos
• Técnicas com limite de automação– Não permitem produzir dados em larga-
escala– Para saber-se a sequência de um
proteína, muitas vezes sequencia-se o DNA do organismo de interesse
![Page 25: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/25.jpg)
O Sequenciamento de moléculas de DNAProf. Dr. Francisco Prosdocimi
>gi|33869444|gb|BC008730.2| Homo sapiens hexokinase 1, mRNA (cDNA clone MGC:1724 IMAGE:3163058), complete cds GGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCACGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCA GCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAGCTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTGTATGCC ATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCATAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCT CCCGGGATTTTAATCCAACAGCCACAGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTC TGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTGGATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAAT CATGAGAAAAACCAGAATGTTCACATGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCA GTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGTTGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGA CAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACGTTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTG ATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAGCGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAG(...)TGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAGCCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACCAGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCCCGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCT TCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTGGCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGT CCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTGTGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGT CCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCATTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAAT TTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTCGTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
![Page 26: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/26.jpg)
Frederick Sanger• Único vivo dentre os 4 indivíduos que já
venceram dois prêmios Nobel
• ~1955: publicou a primeira sequência de aminoácidos da insulina– Ganhou o Nobel de química em 1958
• 1964: descobriu que as proteínas de bactéria iniciavam-se com o aminoácido formil-metionina
• 1967: desvendou a sequência do RNA ribossomal 5S• 1975: inventou o método dideóxi para o sequenciamento do DNA• 1977: sequencia, pela primeira vez, o genoma inteiro
de um organismo, o bacteriófago phi X 174– 11 genes in 5386 bases sequenciadas “à mão“– Ganha o segundo Nobel de química em 1980
![Page 27: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/27.jpg)
O método de Sanger, 1975
Polimerização do DNA a ser sequenciado (molde)na presença de:
DNA polimeraseprimer
tampãodNTPs (desóxinucleotídeo)ddNTPs (didesóxinucleotídeo)
O que faria um nucleotídeo que, ao invés da extremidade 3’OH, tem uma extremidade 3’H?
Como acontece a síntese de moléculas de DNA?
http://www.youtube.com/watch?v=Mz-4LSfecM4&feature=related (dideóxi)
![Page 28: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/28.jpg)
Amplificação interrompida com didesoxinucleotídeos
O didesóxinucleotídeo não tem a extremidade 3’OH livre
(...)
e, portanto, não permite a incorporação de novas bases a 3’ quando é adicionado,
(...)
interrompendo a formação da nova cadeia definitivamente
Desoxinucleotídeos
dNTP
ddNTP
Didesoxinucleotídeos
![Page 29: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/29.jpg)
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA|||||||
5’3’
ATGCTTCATGCTTC5’ 3’
AA
AAAA
AA
AA
AA
AAAA
AA
AA
TT TTTT TT
TT TTTT
TT
TT
TTTT
GG
GG
GGGG
GG
GG
GG
GG
GG
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CCCC
CC
![Page 30: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/30.jpg)
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA|||||||||
5’3’
ATGCTTCATGCTTC5’ 3’
AA
AA
AA
AA
AAAA
AAAA
AA
AA
TTTTTT TT
TT TTTT
TT
TT
TTTT
GG
GG
GGGGGG
GG
GG
GGGG
CC
CC
CC
CCCC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
![Page 31: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/31.jpg)
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||
3’
ATGCTTCATGCTTCTGTG5’ 3’
AA
AAAA
AA
AA AA
AAAA
AA
AA
TT TTTT
TT
TT TTTT
TT
TT
TTTT
GG
GG
GGGG
GG
GG
GG
GG
GG
CC
CCCC
CC
CC
CC
CC
CC
CCCC
CC
![Page 32: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/32.jpg)
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA|||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTTGGCAGATCT5’ 3’
AA
AAAA
AA
AAAA
AA
AA
AA AA
TT TTTT
TT
TTTTTT
TT
TT
TTTT GGGG
GGGG GG
GG
GG
GG GG
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
![Page 33: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/33.jpg)
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA|||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT5’ 3’
AA
AA
AAAA
AA
AA
AAAA
AA
AA
TTTTTT
TTTT
TTTTTT
TTTT
TT
GG
GGGG
GG
GGGG
GG
GG GG
CCCCCC
CC CCCC
CC
CCCC
CC
CC
![Page 34: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/34.jpg)
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA|||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT5’ 3’
AA
AA
AA AAAA
AA
AAAA
AA
AATT
TTTT
TT
TTTTTTTT
TT TT
TTGG
GGGG
GG
GGGG
GG
GG GG
CC
CCCC
CCCC
CC
CC
CC
CCCC
CC
![Page 35: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/35.jpg)
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA|||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT5’ 3’
AA
AA
AAAA
AA
AA
AAAA
AA
AA TT
TTTT
TTTTTT
TTTT
TTTT
TTGG
GGGG
GG
GGGG
GG
GGGG
CC
CCCC
CCCC
CC
CC
CCCC
CC
CC
![Page 36: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/36.jpg)
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5’ 3’
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT
ATGCTTCATGCTTCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
População de moléculas
Incorporação aleatória do didesóxi
Quantidade precisa entre didesóxi e desóxi
![Page 37: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/37.jpg)
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT
ATGCTTCATGCTTCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
![Page 38: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/38.jpg)
G A T C
• moldemolde• polimerasepolimerase• ddNNTPsTPs
•ddddGGTPsTPs •ddddAATPsTPs •ddddTTTPsTPs •ddddCCTPsTPs
![Page 39: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/39.jpg)
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT
ATGCTTCATGCTTCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTTGGATGCTTCATGCTTCTGTGGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCATGGCAGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTTGGCAGATCTGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACATGGCAGATCTGAACAGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTTGGCAGATCTGAACAGTGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGG
ATGCTTCATGCTTCTGGTGGCC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATTGGCAGATCC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAATGGCAGATCTGAACC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGGCAGATCTGAACAGTGTTACC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCC
ATGCTTCATGCTTCTGGCTGGCAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGTGGCAGAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGTGGCAGATCTGAAATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGATGGCAGATCTGAAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACTGGCAGATCTGAACAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAA
G A T C
![Page 40: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/40.jpg)
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTT
ATGCTTCATGCTTCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTTGGATGCTTCATGCTTCTGTGGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCATGGCAGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTTGGCAGATCTGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACATGGCAGATCTGAACAGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTTGGCAGATCTGAACAGTGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGG
ATGCTTCATGCTTCTGGTGGCC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATTGGCAGATCC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAATGGCAGATCTGAACC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGGCAGATCTGAACAGTGTTACC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCC
ATGCTTCATGCTTCTGGCTGGCAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGTGGCAGAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGTGGCAGATCTGAAATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGATGGCAGATCTGAAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACTGGCAGATCTGAACAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAA
![Page 41: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/41.jpg)
![Page 42: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/42.jpg)
Modelo originalMarcação do primer
4 reações necessárias, uma para cada base
Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos
Leitura manual da sequência de baixo pra cima
Etapa 1
AmplificaçãoTipo-PCr
Etapa 2
Eletroforese
![Page 43: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/43.jpg)
Sanger e o fago Phi 174
De fato, esse tipo de sequenciamento manual continuou acontecendo por décadas...
![Page 44: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/44.jpg)
Modelo modernoApplied Byosystems, 1986
Marcação fluorescente do ddNTP
1 reação necessária, todas as bases lidas ao mesmo tempo
Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos
Leitura da automática sequência, de baixo pra cima, por um laser
http://www.youtube.com/watch?v=ezAefHhvecM
Leroy Hood, 1938-
![Page 45: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/45.jpg)
Cromatograma
![Page 46: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/46.jpg)
As máquinas necessárias para o sequenciamento
• Primeira etapa: junta-se os reagentes em poços de placas e coloca-se na máquina de PCR para a reaçãode amplificação interrompida
• Diferenças com relação ao PCR– Utilização de um só primer– Utilização dos ddNTPs
• Uma vez prontas, as sequências de diferentes tamanhos contendo os didesóxi amplificados devem ser enviadas ao sequenciador de DNA mais próximo
![Page 47: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/47.jpg)
O que faz um sequenciador de DNA?
• Segunda etapa: realiza a eletroforese capilar– O sequenciador executa a eletroforese em géis capilares ultra-finos– Um sensor é responsável por emitir um laser e verificar qual o comprimento
de onda emitido pelo didesóxi
![Page 48: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/48.jpg)
![Page 49: A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/552fc11d497959413d8ca648/html5/thumbnails/49.jpg)
Exercício
Dê a sequência de DNA da canaleta apontada
azul = Guaninaamarelo = Timinavermelha = Adenina verde = Citosina
http://www.youtube.com/watch?v=dUjMf2ZezIw&feature=related