VOŠZ a SZŠ Praha 1, Alšovo nábřeží 6
ABSOLVENTSKÁ PRÁCE
Praha 2018 Nikola Nováková
Klinický a biochemický obraz karcinomu pankreatu
Absolventská práce
Nikola Nováková
Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola
Praha 1, Alšovo nábřeží 6
Studijní obor: Diplomovaný zdravotnický laborant
Vedoucí práce: RNDr. Vávrová Lucie, Ph.D.
Datum odevzdání práce: 23. 4. 2018
Datum obhajoby: červen 2018
Praha 2018
Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracoval (a) samostatně a všechny použité prameny
jsem uvedl (a) podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů
informací.
Praha 23. dubna 2018
Děkuji RNDr. Lucii Vávrové, Ph.D. za odborné vedení absolventské práce. Děkuji také všem,
kteří mi poskytli pomoc při zpracování této práce.
Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována v knihovně Vyšší odborné
školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6.
Podpis
ABSTRAKT
Jméno: Nikola Nováková
Název práce: Klinický a biochemický obraz karcinomu pankreatu
Název anglicky: The Clinical and Biochemical Picture of the Pancreatic Carcinoma
Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6
Vedoucí práce: RNDr. Lucie Vávrová, Ph.D.
Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2018, 52
Karcinom pankreatu (KP) je zrádné onemocnění, které pacientům v jeho počátku nezpůsobuje žádné
potíže, je tedy asymptomatické, což vede k pozdní diagnóze. Nemoc je často odhalena až
v pokročilých stádiích onemocnění a má tedy velmi špatnou prognózu a vysokou mortalitu.
Problematická je i volba vhodných markerů, které by přesně odrážely stádium onemocnění a přispěly
k včasné diagnóze. Patogeneze onemocnění je multifaktoriální a podílí se na ni mimo jiné i oxidační
stres.
Cílem této práce bylo porovnat hladiny lipidových markerů oxidačního stresu (oxidované LDL – ox-
LDL a konjugované dieny - KD) a s lipidy spojeného antioxidačního enzymu paraoxonasy (PON) u
pacientů s KP a zdravých kontrol (KON). Dalším cílem bylo srovnat různé dnes užívané nádorové
markery (CEA, CA 19-9, CA 72-4) u pacientů v různém stádiu KP, porovnat, do jaké míry odrážejí
stádium onemocnění. Sledován byl i nově navrhovaný marker KP – sérový amyloid A (SAA).
Do studie bylo zařazeno celkem 52 pacientů (M/Ž = 31/21) s KP a 52 KON spárovaných se skupinou
KP na základě věku a pohlaví. Z 52 pacientů s KP bylo 12 pacientů ve stádiu 2, 20 pacientů ve stádiu
3 a 20 pacientů ve 4. stádiu onemocnění. Aktivita PON a koncentrace KD byly měřeny
spektrofotometrickými metodami, hladiny SAA a ox-LDL byly stanovovány metodou ELISA.
U pacientů s KP byly pozorovány snížené aktivity jak arylesterázové tak laktonázové aktivity PON (p
0,0001), zvýšené koncentrace SAA (p 0,0001), KD (p 0,05) a ox-LDL (p 0,01) a též všech
sledovaných tumorových markerů (p 0,001) v porovnání s KON. Tumorové markery CEA a CA72-4
byly signifikantně nižší u pacientů ve stádiu 2 a 3 ve srovnání s pacienty ve finálním stádiu 4. U
markeru CA 19-9 nebyl pozorován signifikantní rozdíl mezi pacienty v různých stádiích. Nejlépe
stádium onemocnění odrážely koncentrace nově navrhovaného markeru pro karcinom pankreatu
(SAA) a stejně tak arylesterázová aktivita PON.
Získané výsledky potvrzují zvýšený oxidační stres u pacientů s KP spojený se sníženou aktivitou
antioxidačního enzymu PON1. Dále bylo zjištěno, že dosud užívané tumorové markery nekorelují se
stádiem onemocnění a že nově navrhovaný marker SAA by potenciálně mohl být markerem
odrážejícím pokročilost onemocnění KP.
Klíčová slova: karcinom pankreatu, stádium onemocnění, tumorové markery, paraoxonasa, sérový
amyloid A
ABSTRACT
Jméno: Nikola Nováková
Název práce: Klinický a biochemický obraz karcinomu pankreatu
Název anglicky: The Clinical and Biochemical Picture of the Pancreatic Carcinoma
Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6
Vedoucí práce: RNDr. Lucie Vávrová, Ph.D.
Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2018, 52 Carcinoma of pancreas (KP) is treacherous disease that doesn’t cause any problems in early stages, so
it is asymptomatic and it leads to the late diagnosis. The disease is discovered in its late stages and
thus the prognosis is not good and the mortality is very high. Questionable is also the suitable option
of tumor markers that would be reflective of disease stage and would contribute to the early diagnosis.
The pathogenesis of KP is multifactorial. Important role in the pathogenesis of KP plays oxidative
stress.
The aim of this study was to compare the levels of lipid markers of oxidative stress (oxidized LDL –
ox-LDL, conjugated dienes – KD) and with lipid connected antioxidant enzyme paraoxonase (PON) in
patient with KP and healthy controls (KON). Next aim was to compare different tumor markers (CEA,
CA 19-9, CA 72-4) in patients in different stages of the KP, to compare, how these markers correlate
with the stage of the disease. Analyzed were also the levels of serum amyloid A (SAA) – newly
proposed marker of KP.
52 patients (M/F = 31/21) with KP and 52 sex- and age-matched KON were included into the study. In
the KP group, there were 12 patients in grade 2, 20 in grade 3 and 20 in grade 4 of KP. Activity of
PON and concentration of KD were measured spectrophotometrically, the levels of SAA and ox-LDL
were estimated with ELISA.
Decreased activities of arylesterase as well as lactonase activities of PON (p 0.0001), and increased
levels of SAA (p 0.0001), KD (p 0.05), ox-LDL (p 0.01) and also all observed tumor markers (p
0.001) were observed in patients with KP in comparison with KON. Tumor markers CEA and CA
72-4 were significantly decreased in patients in stage 2 and 3 compared to those in the final grade 4.
No significant differences were observed in the levels of tumor marker CA 19-9. Best correlation with
the grade of KP has shown the newly proposed KP marker SAA and the arylesterase activity of PON.
The obtained results confirm increased oxidative stress in connection with depressed activity of PON
in KP patients. Furthermore were find out that up to now used tumor markers don’t correlate with the
disease stage and that the newly proposed KP marker SAA could be good predictive marker of KP.
Key words: pancreatic carcinoma, stage, tumor markers, paraoxonase, serum amyloid A
Obsah
1 Úvod ........................................................................................................................... 10
2 Fyziologie pankreatu ................................................................................................ 11
2.1 Anatomie pankreatu ................................................................................................... 11
2.2 Histologie pankreatu .................................................................................................. 12
2.2.1 Stavba Langerhansových ostrůvků ............................................................................ 12
3 Vyšetřovací metody .................................................................................................. 14
4 Druhy onemocnění ................................................................................................... 16
4.1 Zánětlivé léze pankreatu ............................................................................................ 16
4.1.1 Akutní pankreatitida-akutní nekróza pankreatu ......................................................... 16
4.1.2 Chronická pankreatitida ............................................................................................. 16
4.1.3 Autoimunitní pankreatitida ........................................................................................ 16
4.2 Nenádorové cystické léze pankreatu .......................................................................... 17
4.2.1 Pseudocystické léze pankreatu ................................................................................... 17
4.2.2 Kongenitální cysty a cysty střevní duplikatury .......................................................... 17
4.2.3 Vaskulární tumory ...................................................................................................... 17
4.3 Duktální adenokarcinom pankreatu ........................................................................... 17
4.3.1 Duktální adenokarcinom ............................................................................................ 18
4.4 Varianty duktálního adenokarcinomu pankreatu ....................................................... 21
4.4.1 Adenoskvamózmí karcinom pankreatu ...................................................................... 22
4.4.2 Nediferencovaný karcinom ........................................................................................ 22
5 Nádorové markery ................................................................................................... 23
5.1 Tumorový marker CA 19-9 ........................................................................................ 24
5.2 Tumorový marker CEA.............................................................................................. 25
5.3 Tumorový marker CA 72-4 ........................................................................................ 25
6 Paraoxonáza ............................................................................................................. 26
6.1 Struktura paraoxonázy ............................................................................................... 26
6.2 Funkce paraoxonázy................................................................................................... 26
6.3 Stanovení paraoxonázy .............................................................................................. 27
7 Metodika ................................................................................................................... 28
7.1 Soubor vyšetřovaných pacientů ................................................................................. 28
7.2 Odběr a zpracování vzorků ........................................................................................ 28
7.3 Stanovení Paraoxonázy .............................................................................................. 29
7.3.1 Arylesterázová aktivita PON...................................................................................... 29
7.3.2 Laktonázová aktivita PON ......................................................................................... 31
7.4 Stanovení SAA ........................................................................................................... 31
7.5 Stanovení koncentrace konjugovaných dienů ............................................................ 31
7.6 Stanovení koncentrace oxidovaného LDL ................................................................. 32
7.7 Výpočet HOMA-IR .................................................................................................... 32
7.8 Statistické zpracování dat ........................................................................................... 32
8 Výsledky .................................................................................................................... 33
9 Diskuze a závěr ......................................................................................................... 40
10 Seznam použité literatury a zdrojů informací....................................................... 43
11 Seznam zkratek ........................................................................................................ 48
12 Seznam tabulek ........................................................................................................ 51
13 Seznam grafů ............................................................................................................ 52
10
1 Úvod
Tato absolventská práce se zaměřuje na karcinom pankreatu (KP) a jeho stanovení. Pankreas
neboli slinivka břišní je retroperitoneální orgán, který se nachází pod brániční klenbou mezi
žaludkem a velkými břišními cévami. Má společný vývod se žlučníkem, který ústí do části
dvanáctníku, kam se dostává natrávená potrava ze žaludku. Tím se uplatňuje jedna z funkcí
slinivky břišní, schopnost trávení potravy a její přeměny v důležité živiny jako je štěpení tuků,
složitých cukrů a bílkovin. To umožňují trávicí enzymy (trypsin, lipáza a amyláza). Pankreas
je také orgán, který je důležitou žlázou s vnitřní sekrecí, a to hlavně díky sekreci inzulínu, ale
i jiných hormonů jako jsou glukagon a somatostatin. Inzulín je pro náš lidský život
nepostradatelný, napomáhá totiž snižovat hladinu glykémie. Nedostatek i nadbytek inzulínu
může způsobit vážné komplikace zdravotního stavu až smrt pacienta. Proto se slinivka břišní
řadí k nejdůležitějším orgánům v těle.
Karcinomy jsou zhoubné nádory mající svůj původ v epitelových buňkách. Jsou to nádory
postihující nejčastěji dospělé, u dětí se vyskytují jen ojediněle. Karcinom pankreatu má u nás
incidenci okolo 12 - 20 případů na 100 000 obyvatel a rok. V posledních letech pacientů
přibývá. Karcinom pankreatu se řadí na třetí místo v žebříčku příčin smrti na nádorová
onemocnění u mužů mezi 35. až 54. rokem.
Tuto práci jsem si vybrala, protože karcinom pankreatu je velice zrádné onemocnění, které ze
začátku nezpůsobuje žádné potíže. Jedná se o asymptomatické onemocnění, což většinou vede
k pozdní diagnóze. Nemoc je často odhalena až v pokročilých stádiích onemocnění a má tedy
velmi špatnou prognózu a vysokou mortalitu.
Cílem této práce bylo porovnat jednak hladiny lipidových markerů oxidačního stresu –
oxidované LDL (ox-LDL) a konjugované dieny (KD) jednak aktivity s lipidy spojeného
antioxidačního enzymu paraoxonázy (PON) u pacientů s KP a zdravých kontrol (KON).
Dalším cílem bylo srovnat různé dnes užívané nádorové markery (CEA, CA 19-9, CA 72-4) u
pacientů v různém stádiu KP, porovnat, do jaké míry odrážejí stádium onemocnění. Sledován
byl i nově navrhovaný marker KP – sérový amyloid A (SAA).
11
2 Fyziologie pankreatu
2.1 Anatomie pankreatu
Slinivka břišní (pankreas) se nachází v dutině břišní, za pobřišnicí. Je označován jako
retroperitoneální orgán. Pankreas se rozděluje na tři části: hlava, tělo a ocas. Rozkládá se přes
celou dutinu břišní pod bránicí a játry, před aortou a dolní dutou žílou, dále pak za žaludkem a
malou předstěrou, nad příčným tračníkem, mezi dvanáctníkem a slezinou (1).
Části slinivky břišní
Hlava (caput pancreatis): Největší část pankreatu, která je umístěna v pravé polovině
trupu ve výši druhého bederního obratle. Hlava se spojuje s plochou dvanáctníku, do
kterého ústí vývody slinivky břišní (ductus pancreaticus major et minor). Velký vývod
shromažďuje pankreatickou šťávu z pankreatu. Než se vyústí do dvanáctníku, tak se
spojí se žlučovými cestami (ductus choledochus). Oba tyto vývody mají vlastní
kruhové svěrače a jeden společný, který se otevírá pouze v případě tráveniny ve
dvanáctníku (duodenum). Ústí vývodu v duodenu tvoří papilu (papilla duodeni major),
která se nazývá papilla Vateri. Malý vývod shromažďuje pankreatickou šťávu jen
z horní části hlavy pankreatu a ústí do papilla duodeni minor duodena, která je výše
než papilla Vateri. Mezi hlavou a tělem na spodině pankreatu se nachází zářez incisura
pancreatis a prochází přes něj cévy (vasa mesenterica superiora). Tyto cévy zásobují
střevo krví. Z vasa mesenterica superiora vychází malá část hlavy zvaná processus
uncinatus.
Tělo (corpus pancreatis): Užší část pankreatu, která spojuje hlavu s ocasem. Dosahuje
k levé ledvině.
Ocas (cauda pancreatis): Výběžek těla pankreatu, který je zúžený a směřuje směrem
ke slezině (1; 2).
12
2.2 Histologie pankreatu
Hlavní exokrinní složkou pankreatu je alveolární žláza, která se rozčleňuje do lalůčků, neboli
acinů. Stěny acinů vytváří acinární sekrečně aktivní buňky. Mají tmavší cytoplazmu, obsahují
větší množství zymogenních a sekrečních granul s proenzymy, ty jsou umístěné ve vrcholové
části buněk a jsou otočené do lumina lalůčku. Vznikající pankreatické šťávy se odvádějí
vsunutým vývodem. V luminu lalůčku jsou rozesety buňky toho vsunutého vývodu, tam
vytváří takzvané centroacinózní buňky se světlou cytoplazmou, které neobsahují zymogenní
granula. Z vazivového pouzdra, které obaluje pankreas, vybíhají septa, která od sebe oddělují
jednotlivé lalůčky. Podél sept proniká k lalůčkům hustá síť kapilár. Endokrinní složkou
pankreatu jsou Langerhansovy ostrůvky (3).
2.2.1 Stavba Langerhansových ostrůvků
Ostrůvky jsou obalené vazivovým obalem, který obsahuje retikulární a kolagenní vlákna. Jsou
ohrazeny sítí krevních kapilár, které mají charakter sinusoid. Sinusoidy přechází k ostrůvku
od okolních acinů. Propojují se do sítě a dále pokračují dovnitř ostrůvku mezi buňky, které
jsou sestaveny do nepravidelných trámců (4).
Buňky se dělí na tři typy, podle granul, které obsahují:
A buňky (-buňky): Větší buňky uloženy na periferii ostrůvku. Tvoří asi 20% buněk
ostrůvku. Obsahují malá kulatá uniformní granula, která se barví červeně, při Gomoriho
metodě. Produkují polypeptidový hormon-glukagon, který zvyšuje hladinu glukosy
v krvi a to stimulací glykogenolýzy v játrech.
B buňky (- buňky): Menší buňky, tvoří jádro (dřeň) Langerhansových ostrůvků. Jsou
nejpočetnější skupinou, zaujímají asi 60-80% buněk. Obsahují granula, která jsou menší
než granula A-buněk. Gomoriho metodou se barví modře. Granula jsou kulatá nebo
oválná o různé velikosti. Produkují polypeptidový hormon- insulin, který snižuje
glykémii. Hladinu glukosy snižuje tím, že zvyšuje přísun glukosy do jater a syntézu
glykogenu. Dále taky insulin zvyšuje vychytávání vstřebané glukosy z cirkulace tkáně a
orgánů (kosterní svalstvo, srdeční sval, tuková tkáň aj.).
13
D-buňky (-buňky): Podobné A- buňkám a B-buňkám. Obsahují jemná granula, která se
impregnují solemi stříbra. Mají nejmenší populaci, asi 5%. Produkují polypeptidové
hormony- gastrin, somatostatin. Gastrin ovlivňuje zvýšenou sekreci žláz žaludečního
fundu. Somatostatin je peptid, který působí inhibičně na sekreci polypeptidových
hormonů. Proto může v Langerhansově ostrůvku působit jako lokální regulátor sekrece
insulinu a glukogenu.
V Langerhansových ostrůvcích se vyskytují i další buňky, které jsou zastoupeny v malé míře
(méně než 1%). Jsou to buňky D1 a PP-buňky (4).
14
3 Vyšetřovací metody
Včasná a správná diagnostika nemocí slinivky břišní představuje i v dnešní době velký
problém. Podkladem pro diagnózu je vždy anamnéza pacienta a pečlivé fyzikální vyšetření
klinickým lékařem, doplněné klinicko-biochemickými metodami. Pomocí těchto metod se
stanovují hladiny pankreatických enzymů v krvi, které jsou vyplavovány při poškození
slinivky břišní (1).
Zásadní roli hrají neinvazivní metody. Převládající zobrazovací metodou pankreatu je
ultrasonografie (ultrazvuk), dále pak díky své nenáročnosti a neinvazivnosti endoskopická
ultrasonografie (EUS). Dále se pak využívá počítačová tomografie (CT), magnetická
rezonance (MR), nebo i endoskopická retrográdní cholangiopankreatografie (ERCP),
případně intraduktální sonografie (IDUS); (5).
Vyšetření pomocí EUS se využívá hlavně: (1)
k diferenciální diagnostice ultrasonografií solidních i cystických lézí pankreatu,
k diagnostice malých lézí pankreatu,
k časné diagnostice chronické pankreatitidy,
při hodnocení postupu léčby u pacientů s akutní pankreatitidou a idiopatickou
recidivující pankreatitidou,
ke stanovení genetického statutu nádorů, zvl. mutační analýzy K-ras, p53,p16 a LOH
chromozomu 18q (lokace genu DPC4) a dalších.
Endosonografie s použitím tenkojehlové aspirace (Fine needle aspiration, FNA) je poměrně
nová metoda, kterou v roce 1984 popsal japonský lékař Tio. Ve výzkumu ho následovala
řada dalších lékařů. V roce 1992 pan Vilmann uveřejnil jako první případ EUS-FNA odběru
léze v hlavě pankreatu pomocí lineárního echoendoskopu. EUS-FNA byla rozšířena pro
různé druhy orgánů a lézí (1; 5).
Další možnost představují cytologická vyšetření. V cytologické laboratoři se vzorky
získávají z několika různých zdrojů: z tkáně podezřelé z pankreatické masy, z obsahu
cystické léze, z regionálních lymfatických uzlin a z ložisek v játrech. Cytologické a
15
bioptické vyšetření se může provádět ze vzorku, který se získá perkutánní cestou,
retrográdně z vývodného biliárního a pankreatického systému (1).
16
4 Druhy onemocnění
4.1 Zánětlivé léze pankreatu
Záněty pankreatu probíhají buď jako akutní nebo chronické. Výskyt těchto onemocnění v naší
populaci stoupá díky zvýšené spotřebě alkoholu, kouření, špatným stravovacím návykům
spojených s obezitou aj.
4.1.1 Akutní pankreatitida-akutní nekróza pankreatu
Zánětlivé onemocnění pankreatu, které může mít od lehké až po těžkou formu se znaky
multiorgánového selhání nebo abscesy, pseudocystami a nekrózou pankreatu a přilehlé tkáně.
Akutní pankreatitida patří k nejzávaznějším a i prognosticky nejhorším náhlým příhodám
břišním. Pokud se akutní pankreatitidy opakují, může se stát z akutní pankreatitidy chronická.
Výskyt se udává mezi 20-50 případy na 100 000 obyvatel, nejčastěji postihuje osoby ve věku
50-55 let (1).
4.1.2 Chronická pankreatitida
Chronická pankreatitida je onemocnění pankreatu s poruchou zevní a později i vnitřní
sekrece. Fibrotická tkáň potupně nahradí funkční tkáň. V poslední době incidence tohoto
onemocnění neustále narůstá, v České republice je největší výskyt na jižní Moravě a je
srovnatelný s Německem nebo Maďarskem. Činí téměř 8 nově diagnostikovaných případů na
100 000 obyvatel za rok (1; 6).
4.1.3 Autoimunitní pankreatitida
Toto onemocnění tvoří 4-6% všech chronických pankreatitid. Je typické, že se krom
pankreatitidy objevuje postižení jiných i dalších orgánů, hlavně žlučových cest a jater,
slinných žláz nebo ledvin (5).
17
4.2 Nenádorové cystické léze pankreatu
Cystické léze pankreatu představují skupinu patologických změn. Dají se rozdělit na dvě
základní skupiny: netumorózní etiologie a tumorózní etiologie. Dále se taky dají rozdělit
podle typu epitelu, který je vystýlá (6).
4.2.1 Pseudocystické léze pankreatu
Pseudocysty se vyskytují častěji než cystické tumory. Uvádí se poměr 9 : 1. Pseudocysty
bývají tlustostěnné a obalené vazivem, často bývají mimo vlastní tkáň pankreatu. Ve velkém
procentu komunikují s vývodným systémem pankreatu. Jen výjimečně tato cysta vznikne
z obstrukce vývodu v důsledku karcinomu (7).
4.2.2 Kongenitální cysty a cysty střevní duplikatury
Vrozené cysty se vyskytují v pankreatické tkáni většinou samostatně, ale výskyt může být i
mnohočetný. Zvláště mají-li vzájemný vztah s jinými vrozenými cystickými vadami (např.
polycystické onemocnění ledvin); (6; 7).
4.2.3 Vaskulární tumory
Vaskulární tumory jsou v pankreatu velmi vzácné. V roce 1991 byl popsán Kabayashim
raritní nález kavernózního hemangiomu v pankreatu. V pankreatu se spíše vyskytují
lymfangiomy (8).
4.3 Duktální adenokarcinom pankreatu
Zhoubné nádory pankreatu patří k prognosticky nejhorším nádorům. V České republice je
diagnostikováno asi 1700 pacientů s tímto onemocněním. Je to pátá nejčastější příčina úmrtí
18
na nádorové onemocnění v ČR. Celosvětově je pozorován pomalý nárůst počtu případů.
Evropa a severní Amerika vykazují vyšší nárůst než ostatní kontinenty (1).
4.3.1 Duktální adenokarcinom
Duktální adenokarcinom (Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDA), mucinózní
cystadenokarcinom (MCC) a intraduktální papilární mucinózní neoplazie (IPMN) vznikají
z duktálních buněk a tvoří společně zhruba 90% všech exokrinních pankreatických neoplázií.
Ostatní nádory vychází z lalůčkové tkáně nebo jejich histogeneze není úplně jasná. V 75-81%
případů se jedná o PDA, z toho 61% je lokalizováno v hlavě pankreatu, v těle cca 15% a
v poslední části pankreatu – ocasu kolem 5%. Podle statistických údajů onemocnění postihuje
častěji muže než ženy, s výrazným nárůstem počtu zjištěných případů u mužů i žen ve věku
nad 70 let. Až jedna pětina nádorů vytváří v pankreatu mnohočetná ložiska.
Karcinom je pomocí endoskopické ultrasonografie zobrazován jako ložisko heterogenní
solidní masy nepravidelných hypoechogenních (místo se slabší odezvou při ultra zvukovém
vyšetření) hranic. Zobrazovací metody nám mohou pomoci vytvořit si představu o vztazích
k vaskulárním strukturám, zjistit přítomnost zvětšených uzlin a metastáz v játrech.
Největším problémem se stává rozlišení PDA od chronické pankreatitidy. Diferenciálně-
diagnostické rysy adenokarcinomu ve srovnání s reaktivní hyperplazií u chronické
pankreatitidy jsou shrnuty v tabulce 1. Karcinom hlavy pankreatu se projevuje progresivní
žloutenkou spojenou s bolestí vyplývající z neoplastické invaze stěny společného žlučového
vývodu. Karcinom těla a ocasu pankreatu nemá výrazné příznaky, a proto může dorůstat
větších velikostí (1; 8).
19
Tabulka 1: Diferenciálně diagnostické rysy adenokarcinomu a reaktivní hyperplazie u
chronické pankreatitidy (1)
Chronická pankreatitida
s reaktivní atypií
Adenokarcinom pankreatu
Architektonické rysy Kohezivní trsy duktálních
epitélií, jednovrstevné
plachtovité formace, místy se
zmačkanými jádry
Nepravidelné shluky duktálních
epitélií a jednotlivé nádorové buňky
Plachtovité a trojrozměrné trsy
s výraznými nakupenými stlačenými
buňkami, které se i překrývají
(drunken honeycomb pattern)
Jaderná membrána Hladká jaderná membrána Jaderná membrána s rýhami, záhyby,
nepravidelnostmi, konzistentně
neostrá
Jaderný chromatin Euchromazie až lehká jaderná
hyperchromazie
Výrazná jaderná hyperchromazie
Nukleoplasmatický
poměr (N/P)
Normální, místy lehce zvýšený
N/P
N/P poměr ve prospěch jádra
(minimálně 2x větší jádro než červená
krvinka)
Morfologie jádra Minimální jaderný
pleomorfismus
Výrazný jaderný pleomorfismus
Mitotická aktivita Minimální Zvýšený počet mitóz
Přítomnost nekrózy Bez přítomnosti nekrózy Nekrózy časté
Přítomnost stromatu Fibrotizovaná stromální tkáň
Kalcifikace
Nádorové stroma sklerotického
vzhledu
Acinární buňky Skupinky acinárních buněk
prostoupené vazivovými
buňkami
Nečetné acinární buňky bez
patologických změn
Pozadí Granulovaná drť na pozadí se
zánětlivými elementy
Čisté nebo „špinavé“ pozadí
s mucinem, zánětlivými elementy a
buněčnou nekrotickou drtí
20
4.3.1.1 Histologický obraz duktálního adenokarcinomu
Mikroskopicky se jedná o struktury různě diferencovaného adenokarcinomu s epitelem, který
připomíná struktury duktů pankreatu (1).
4.3.1.2 Cytologické nátěry z EUS-FNA
Cytologické nátěry z FNAB (tenkojehlová aspirační biopsie pod sonografickou navigací),
které se získávají punkcí PDA, jsou buněčně bohaté a obsahují shluky atypických duktálních
epitélií. Morfologie atypických buněk se mění od izolovaných buněk, tubulek až po
trojrozměrné klastry. Ve větším množství by přítomnost jiných typů buněk měla upozornit na
možnost jiné léze. Nádorové buňky jsou anizonukleózní (významná variace jaderné velikosti),
mají nepravidelnou jadernou membránu a zvětšené jádro. Cytoplazma je bazofilní
s vakuolizací a jádra mají zářezy tzv. molding, což znamená pomačkaná jádra. Stupeň atypie
souvisí s diferenciací adenokarcinomu. Ten může být popsán jako dobře diferencovaný typ
nebo může mít obraz anaplastického karcinomu. Dobře diferencovaný PDA je velmi těžké
odlišit od chronické pankreatitidy, ale také od intraepiteální neoplazie high grade. V praxi se
setkáváme se dvěma variantami cytologického obrazu:
1. známky změněných atypických epitélií, které se jeví jako maligní
2. obraz odpovídá dobře diferencovanému adenokarconimu - benigní nález
Je nutné znát klinický průběh onemocnění a výsledky dalších vyšetření (4). Typické
cytologické rysy adenokarcinomu pankreatu podle míry jeho diferenciace shrnuje tabulka 2.
21
Tabulka 2: Typické cytologické rysy adenokarcinomu pankreatu podle stupně diferenciace
(1)
Obecný nález
malignit PDA
Dobře diferencovaný
adenokarcinom
Středně a nízce
diferencovaný
adenokarcinom
Buněčné nátěry s čistým nebo
se špinavým pozadím
s hlenem, nekrózou,
zánětlivými elementy
Velký počet dvojrozměrných
trsů epitélií duktálního typu
Trojrozměrné buněčné trsy a
shluky atypických buněk
Predominantní buněčná
populace-atypické duktální
epitélie
„Opilé“ voštinovité struktury
s přítomností holých jader mezi
shluky
Jaderné stlačení a překrývání
buněk, prominující
makronukleoly
Nepravidelná jaderná hranice Minimálně změněná jaderná
hranice
Jaderná membrána
s nepravidelnostmi
Zvětšená jádra větší než
dvojnásobek erytrocytu
V některých buňkách nízký
nukleoplasmatický poměr
Vzestup nukleární atypie
Roztroušené, izolované, silně
atypické buňky
Zhrubělý chromatin Roztroušené izolované
atypické buňky
Buňky vzhledu náhrobního
kamene
Velké, kolumnární buňky
s výraznou atypií
Nekrózy v různém množství Nekrózy ojediněle Bohaté nekrotické elementy
Mitózy v různém množství Mitózy jsou zachyceny Četné mitózy
Dvojjaderné až mnohojaderné
buňky
Pyramidální až mrkvovitá jádra Přítomnost cytoplasmatického
mucinu střední až slabá
4.4 Varianty duktálního adenokarcinomu pankreatu
Signifikantní podklady pro odhad a managment neoplazie jsou jen u karcinomů z buněk
pečetního prstenu a u malobuněčných nediferencovaných karcinomů. Zde je velmi špatná
22
prognóza a přežití se počítá často na týdny. Při brzkém zahájení chemoterapie u
malobuněčného karcinomu může dojít k úplné nádorové remisi (8).
4.4.1 Adenoskvamózní karcinom pankreatu
Tento karcinom tvoří necelých 5 % všech PDA. Typickým rysem je výskyt dvojí populace
nádorových struktur. Jsou to žlázové a dlaždicové komponenty.
4.4.2 Nediferencovaný karcinom
Nediferencovaný karcinom byl poprvé popsán v roce 1954 Sommersem a Meisnerem. Je to
vzácný a vysoce maligní nádor. Rozeznáváme celkem 3 varianty nediferencovaného
karcinomu: anaplastický karcinom, sarkomatoidní karcinom a karcinosarkom.
Nediferencovaný karcinom lze charakterizovat rozmanitou buněčnou populací s přítomností
bizarních a mnohojaderných buněk, a také pleomorfního a vřetenovitého vzhledu. Díky
svému polymorfismu zahrnuje rozsáhlou paletu diferenciálně diagnostických malignit od
melanomu, lymfomu, sarkomu až po mestatické postižení karcinomem (6; 8).
23
5 Nádorové markery
Nádorové markery představují skupinu látek, které jsou produkovány nádorovými buňkami,
nebo hostitelem jako odpověď na přítomnost tumoru a přitom nejsou přítomny, nebo jen v
omezeném množství, v normálních buňkách (9).
Mezi markery produkované tumorem se řadí enzymy (např. laktátdehydrogenáza-LD, neuron
specifická enoláza-NSE, prostatická kyselá fosfatasa-PSA), imunoglobuliny nebo jejich
fragmenty či podjednotky (monoklonální imunoglobuliny, tzv. "paraproteiny"), hormony
(např. lidský choriogonadotropin-hCG, parathormon, adrenokortikotropní hormon-ACTH,
kalcitonin, gastrin, prolaktin, norepinefrin, epinefrin), fragmenty komplexních glykoproteinů,
(např. glykolipidový nádorový marker-CA19-9, glykoproteinový nádorový marker-CA15-3,
sérový nádorový marker-CA125), fragmenty cytokeratinů (tkáňový polypeptidický antigen-
TPA, tkáňový specifický polypeptidový antigen-TPS, fragment cytokeratininu 19-
CYFRA21-1), onkofetální antigeny (alfa-fetoprotein-AFP, karcinoembryonální antigen-
CEA), molekuly receptorové povahy (estrogenový a progesteronový receptor, receptor pro
interleukin 2, transmembránový receptor- HER2/neu a epidermal growth factor receptor -
EGF) a cirkulující buněčné elementy (10).
Jejich přítomnost se testuje z odebrané krve a jde o rutinně prováděné vyšetření, které má
velký přínos pro další diagnostiku a léčebné postupy (11). Tumorové markery můžeme
stanovovat jak metodami kvalitativními (tedy pouze dokázat jejich přítomnost), tak
kvantitativními. Využít lze metody chemické, imunologické nebo metody molekulární
biologie.
Tumorové markery se v určité velmi nízké koncentraci vyskytují v těle každého z nás.
Zvýšená koncentrace tumorových markerů značí, že něco není v pořádku. Přesto většina
tumorových markerů není příliš spolehlivým ukazatelem – nezřídka se objevují případy, kdy
člověk s nádorem nemá zvýšenou koncentraci tumorového markeru, nebo naopak člověk bez
nádorového onemocnění má zvýšenou koncentraci některého z tumorových markerů. Příčinou
tohoto falešně pozitivního výsledku může být např. zánět nebo nezhoubný nádor. Náhodně
zjištěné zvýšení specifického tumor markeru nám ukazuje, že se v určité tělní soustavě může
odehrávat nějaký patologický děj a je nutné další vyšetření.
24
Zásadní význam mají tumor markery ve chvíli, kdy je nalezen určitý nádor. Zvýšení
koncentrace příslušného tumor markeru v krvi bývá velmi často přímo úměrné
počtu nádorových buněk v těle. Tumorové markery slouží též ke sledování úspěšnosti terapie
(chirurgie, ozařování, chemoterapie). Během terapie se sleduje koncentrace určitého
specifického tumorového markeru, a pokud je terapie úspěšná, jeho koncentrace by měla
klesat. Tumorové markery mohou být i dobrým ukazatelem relapsu nádorového onemocnění
(11).
5.1 Tumorový marker CA 19-9
Tumorový marker CA 19-9 je glykoprotein fetálního epitelu gastrointestinálního traktu
(GIT), pankreatu a jater, u dospělých je velice omezeně produkován epitelem bronchů a GIT.
Tento marker je spojen s nemocemi a nádory trávicího traktu, hlavně s onemocněními
slinivky břišní. Většinou se zjišťuje jeho koncentrace v krvi při normálním odběru žilní krve,
na specializovaných pracovištích. Může se hodnotit spolu s jinými markery (zejména CEA) i
v jiných tekutinách jako je tekutý obsah cyst slinivky získané odsátím tenkou jehlou.
Zvýšená hladina CA 19-9 může znamenat rakovinu slinivky břišní, ale také ji najdeme i u
některých nádorů tlustého střeva, u rakoviny jater a rakoviny jícnu. Samo o sobě však zvýšení
CA 19-9 není dostačující a nemůže vést k diagnóze. Musí být dále potvrzeno zobrazovacími
metodami (ultrazvuk, CT vyšetření), endoskopicky a biopsií (odběr podezřelé nádorové tkáně
a jeho vyšetření pod mikroskopem). Stanovení markeru CA 19-9 je pro diagnózu pouze
pomocná metoda, průběžné monitorování jeho hladin se hodí u již potvrzené rakoviny během
léčby. Kdy změny koncentrace CA 19-9 nám sdělují informace o její úspěšnosti. Koncentrace
CA 19-9 není zvýšená jen u nádorů, ale vysoké koncentrace mohou být i u pacientů
s akutním a chronickým zánětem slinivky břišní, při cirhóze a u lidí s poruchou odtoku žluči.
Naopak u některých lidí nedochází i u pokročilých forem nádorů ke zvýšení hladiny CA 19-9
a marker je falešně negativní (11).
25
5.2 Tumorový marker CEA
CEA je karcinoembryonální antigen, který se řadí mezi běžně používané tumorové markery.
Karcinoembryonální antigen se vytváří v těle plodu. Po porodu je jeho normální koncentrace
minimální. CEA je nejčastěji spojován s nádorovými onemocněními trávicí trubice, jeho
koncentraci v krvi vyšetřujeme z běžného krevního náběru.
Zvýšená hladina CEA bývá v případě rakoviny tlustého střeva a rakoviny žaludku, dále ji pak
můžeme najít i u rakoviny slinivky břišní, rakoviny plic, rakoviny štítné žlázy a rakoviny
prsu. Pravidelné měření hodnot CEA je vhodné u již prokázaného tumoru u pacienta
podstupujícího léčbu, kdy nám změny koncentrace CEA vypovídají o úspěšnosti léčby.
Pokles koncentrace CEA naznačuje úspěšnou a naopak zvýšení koncentrace neúspěšnou
léčbu.
CEA nemusí být zvýšené jen u nádorů, vysoké koncentrace mohou být i u pacientů s akutním
a chronickým zánětem slinivky břišní, při cirhóze, u ulcerózní kolitidy a u Crohnovy nemoci.
Zvýšení hladiny CEA je také u pravidelných kuřáků. U některých lidí nedochází i u
pokročilých forem výše zmíněných nádorů ke zvýšení hladiny CEA a marker je falešně
negativní (11).
5.3 Tumorový marker CA 72-4
Tumorový marker CA 72-4 je glykoprotein mucinového typu, řadí se mezi onkofetální
nádorové markery. Fyziologicky CA 72-4 je intenzivně produkován u vyvíjejícího se plodu
povrchovými epiteliálními buňkami jícnu, žaludku a pankreatu. U zdravých dospělých
jedinců je produkován těmito buňkami ve velmi malé míře. Jeho fyziologická funkce není
zatím známa.
Marker CA 72-4 je hlavním ukazatelem u karcinomu žaludku, dále pak u karcinomu ovaria.
Zvýšená hladina CA 72-4 může být i u kolorektálního karcinomu (v 3-70% případů a to v
závislosti na stagi tumoru), dále u tumorů biliárních, pankreatických, esophageálních,
endometriálních a u tumorů prsu (12).
26
6 Paraoxonáza
Gen paraoxonázy je u lidí umístěn na 7 chromozomu a skládá se ze tří složek PON1, PON2 a
PON3 (13). Jednotlivé proteiny PON sdílí přibližně 60% sekvenční identity. Název
paraoxonasa je čistě historický, odvozený od její schopnosti katalyzovat přeměnu paraoxonu.
Paraoxonázy se řadí mezi hydrolázy (14). Paraoxonáza-1 je syntetizována v játrech a vylučuje
se do krve, kde se spojuje s částicemi HDL (high-density lipoprotein) prostřednictvím
Apolipoproteinu A-1 (apo A1); (15).
6.1 Struktura paraoxonázy
Lidská PON1 je glykoprotein o velikosti 43 000 kDa, složený z 354 aminokyselin (16) 3
polysacharidových jednotek a dvou atomů Ca2+
. Jeden atom Ca2+
plní s největší
pravděpodobností důležitou strukturní úlohu, proto je považován za tzv. „strukturní vápník",
jehož disociace vede k nevratné denaturaci proteinu (17). Druhý atom Ca2+
se označuje jako
"katalytický vápník" a nachází se v katalytickém centru molekuly PON1 spolu s fosfátovým
iontem. Celkem existují čtyři potenciální N-glykosylační místa na PON1: dva glykanové
řetězce jsou spojeny asparaginovými zbytky v polohách 253 a 324 na povrchu molekuly (18),
dvě další potenciální pozice jsou Asn224 a Asn270 v centrální části molekuly PON a jsou z
velké části nepřístupné (14). Glykosylace není důležitá pro hydrolytickou aktivitu PON (16),
ale může být důležitá pro zvýšení její rozpustnosti a pro její stabilitu (14).
6.2 Funkce paraoxonázy
Paraoxonáza plní řadu důležitých fyziologických rolí. Sérová PON1 katalyzuje hydrolýzu a
tím i inaktivaci oxonů, jako je například paraoxon (diethyl-4-nitrofenylfosfát), chlorpyrifoson
a diazoxon, což jsou toxické metabolity organofosfátových insekticidů jako je parathion (O,
O-diethyl-O- (4 nitrofenyl)-fosforothioát) a chlorpyrifos (O,O-diethyl O-3,5,6-trichlorpyridin-
2-ylfosforothioát). Paraoxonáza je schopna hydrolyzovat i nervové látky sarin ((RS) -propan-
2 ylmethylfosfonofluoridát) a soman (3,3 dimethylbutan-2-ylmethylfosfonofluoridát). Navíc
PON1 hydrolyzuje arylestery, jako je fenylacetát, thiofenylacetát a 2-naftylacetát (20, 21).
27
Dále je schopná hydrolyzovat různé aromatické a alifatické laktony, jako je lakton kyseliny
homogentisové, dihydrokumarin, γ butyrolakton a homocystein thiolakton (22; 23).
Vědci spekulují, že původní, přirozená aktivita PON, je laktonázová aktivita (24; 25), pro
kterou je zásadní volný cystein-284 ve struktuře PON1 (26). Z fyziologicky se vyskytujících
látek, by jejím substrátem mohl být nějaký derivát procesu oxidace mastných kyselin, jako je
5-hydroxy-6E, 8Z, 11Z, 14Z (5-HETE) lakton kyseliny eikosatetraenové, který se nachází
v částicích HDL. Dále bylo prokázáno, že homocysteinthiolakton je přirozeně se vyskytující
substrát PON1 (27). Homocysteinthiolakton je metabolitem homocysteinu a může způsobit
dysfunkci a poškození cév (28). Detoxikací homocysteinuthiolaktonu PON1 chrání proteiny
před homocysteinylací (27; 29).
In vitro testy ukázaly, že PON1 může inhibovat peroxidaci LDL (lipoprotein s nízkou
hustotou) částic a inaktivovat oxidované fosfolipidy odvozené od LDL (30; 31; 32). Bylo
prokázáno, že PON1 má také peroxidáze podobnou aktivitu - je schopna hydrolyzovat peroxid
vodíku, snížit koncentraci lipoproteinových peroxidů (až o 19%) a hydroperoxidů cholesteryl-
linoleátu (až o 90%); (13; 21).
6.3 Stanovení paraoxonázy
Aktivitu PON 1 je možno stanovovat ve vztahu k různým druhům jejích substrátů (tři druhy
aktivit – paraoxonázová, arylesterázová, laktonázová). K měření arylesterázové aktivity
PON1 se jako substrát využívá fenylacetát (33). Paroxonázová aktivita PON1 se stanoví s
pomocí paroxonu (33; 34; 35). Pro stanovení laktonázové aktivity PON1 se mohou použít
různé substráty, jsou vypracovány metodiky pro stanovení s 5-thiobutylbutyrolaktonem (36;
37), 2-kumaranonem (22) a laktonem kyseliny homogentisové (22).
28
7 Metodika
7.1 Soubor vyšetřovaných pacientů
Do studie bylo zařazeno celkem 52 pacientů (M/Ž = 31/21) s KP a 52 KON spárovaných se
skupinou KP na základě věku a pohlaví. Z 52 pacientů s KP bylo 12 pacientů ve stádiu 2, 20
pacientů ve stádiu 3 a 20 pacientů ve 4. stádiu onemocnění. Všichni pacienti byli obeznámeni
s podmínkami a průběhem studie a podepsali informovaný souhlas. Studie byla prováděna na
IV. interní klinice Všeobecné fakultní nemocnice (VFN) v Praze a byla schválena etickou
komisí.
Mezi vylučovací kritéria patřila manifestní kardiovaskulární, jaterní či renální onemocnění,
užívání antioxidantů, suplementů polynenasycených mastných kyselin či ethylalkoholu
v dávce vyšší než 20 g denně, prodělaný operační zákrok či infekční onemocnění. Pro
kontrolní skupinu pak bylo dalším vylučovacím kritériem jakékoli onemocnění.
7.2 Odběr a zpracování vzorků
Odběry krve byly prováděny po celonočním lačnění. Hodnoty všech zkoumaných tumorových
markerů (CA 19-9, CA 72-4, CEA, SAA), hladiny parametrů lipidového profilu (TC, TAG,
HDL-C, LDL-C, apo-AI, apo-b), stejně jako aktivita PON a koncentrace markerů oxidačního
stresu (konjugovaných dienů, oxidovaných LDL) byly stanoveny v séru. Vacutainery s
odebranou srážlivou krví necháme po odběru cca 30 minut stát při laboratorní teplotě a
následně centrifugujeme při 3000 rpm po dobu 10 minut, sérum následně rozpipetujeme na
jednotlivé vzorky. Všem vzorkům byly přiřazeny unikátní anonymizační kódy, vzorky byly
poté před analýzou skladovány při -80ºC. Rutinní analýzy byly provedeny v laboratoři Ústavu
lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN v Praze.
29
7.3 Stanovení Paraoxonázy
7.3.1 Arylesterázová aktivita PON
Arylesterázová aktivita paraoxonázy (PON-A) se stanovuje v séru spektrofotometrickou
kinetickou metodou. Ke stanovení se využívá schopnosti paraoxonázy katalyzovat hydrolýzu
fenylacetátu na fenol a kyselinu octovou. Měří se nárůst absorbance při 270 nm, daný
narůstajícím množstvím vznikajícího fenolu. Měřeno modifikovanou metodou dle Eckerson a
kol. (33).
Použité chemikálie:
A. TRIS-HCl pufr (20mM) pH 8,0; s přídavkem CaCl2 (1mM)
Příprava 250ml pufru: Navážíme 0,6058g TRIS a 0,003675g CaCl2 a rozpustíme ve vodě,
pomocí 2M HCl upravíme pH na hodnotu 8,0 a doplníme do 250 ml. Pufr uchováváme při
teplotě +4°C maximálně 1 týden nebo zamražený při -20°C.
B. Fenylacetát (100mM) v pufru (startovací roztok)
Příprava 2ml roztoku: Ve skleněné zkumavce rozpustíme 0,0272g fenylacetátu v 0,8 ml
methanolu a během stálého míchání na třepačce po kapkách přidáme 1,2 ml TRIS pufru.
Z důvodu spontánní hydrolysy substrátu připravujeme roztok vždy čerstvý pro 4-5 analýz. Po
nárůstu absorobance blanku (slepého vzorku) o 0,100 připravíme nový startovací roztok.
Roztok fenylacetátu je nejstabilnější za laboratorní teploty.
C. Sérum
Sérum ředíme pufrem těsně před měřením a to podle předpokládané aktivity:
a) pacienti v kritickém stavu- ředění 40x a 60x
b) pacienti s méně závažnými onemocněními- ředění 80x a 60x
c) zdravé osoby- ředění 80x a 100x
30
Postup měření
Každé stanovení se provádí v tripletu. V tabulce 3 jsou uvedeny parametry provedení metody
a nastavení přístroje. V tabulce 4 je zobrazeno pipetovací schéma.
Tabulka 3: Parametry měření pro stanovení PON 1
Parametr Hodnota parametru
Vlnová délka 270nm
Počet kyvet 7
Délka měření 2 min
Interval 40 s
Teplota 25°C
Tabulka 4: Schéma pro stanovení aktivity PON 1
Roztoky Blank (l) Vzorek (l)
20mM TRIS-HCl pufr
pH 8,0
945 945
Ředěné sérum, plasma - 50
Voda/pufr 50 -
Promíchání reakční směsi v kyvetě
100mM fenylacetát 50 50
Výpočet aktivity paraoxonázy:
Výpočet aktivity PON-A provádíme s pomocí molárního extinkčního koeficientu pro fenol při
270 nm, kdy 270= 1310M-1
*cm-1
. Aktivitu PON-A vyjadřujeme v mezinárodních jednotkách
enzymové aktivity (U= mol/min) vztažené na ml séra (U/ml séra). Aktivita je dána
množstvím (počtem molů) vzniklého fenolu za jednotku času.
31
7.3.2 Laktonázová aktivita PON
Laktonázová aktivita PON (PON-L) byla měřena modifikovanou metodou, která byla dříve
popsána ve studii Draganov et al. (37). Jako substrát pro PON sloužil dihydrocoumarin o
konečné koncentraci 1mM. Po dobu 2 minut byl sledován nárůst absorbance při 270 nm.
Enzymová aktivita byla počítána na základě hodnoty molárního extinkčního koeficientu
výsledného produktu reakce 3-(2-hydroxy-fenyl)-propionát; (ε = 1295dm3mol
-1cm
-1); (38).
Aktivita PON-L byla vyjádřena v mezinárodních jednotkách enzymové aktivity (U=
mol/min) vztažené na ml séra (U/ml séra).
7.4 Stanovení SAA
Koncentrace sérového amyloidu A (SAA) byla stanovena za použití metody ELISA pomocí
kitu firmy Invitrogen (kat. č: KHA 0011).
7.5 Stanovení koncentrace konjugovaných dienů
Koncentrace konjugovaných dienů (KD) byla měřena modifikovanou metodou dle Wieland et
al. (39). Lipoproteiny s nízkou hustotou v séru byly izolovány srážecí metodou dle Ahotupa et
al. (40).
Postup měření:
K 1 ml 0,064 M citrátového pufru (pH = 5,05 s 50 000 U/I heparínu) bylo přidáno 110 μl
séra s přídavkem EDTA (10:1),
suspenze byla následně inkubována po dobu 10 minut při pokojové teplotě,
centrifugací při 2800 rpm po dobu 10 minut se poté oddělily vysrážené lipoproteiny,
sraženina se resuspendovala ve 100 μl fyziologického roztoku,
extrakce lipidů byla prováděna směsí dichlor-metan – methanol (2:1), a dále bylo k
separaci použito 250 μl redestilované vody,
poté byla směs centrifugována při 3000 rpm po dobu 5 minut,
32
800 μl dolní vrstvy (infranatant) bylo vysušeno pod dusíkem, a znovu rozpuštěno v 300 μl
cyklohexanu. Následně byla měřena absorbance při 234 nm.
Koncentrace KD byla vypočítána s použitím molárního absorpčního koeficientu (2,95 x
104
M-1
cm-1
).
7.6 Stanovení koncentrace oxidovaného LDL
Hladina oxidovaného LDL (ox-LDL) byla stanovena metodou ELISA prostřednictvím kitu
firmy Mercodia. Při stanovení se využívají myší monoklonální protilátky proti
konformačnímu epitopu v oxidovaném apo B-100.
7.7 Výpočet HOMA-IR
Index modelu homeostasy insulinové rezistence (HOMA-IR) byl vypočítán dle vzorce:
HOMA-IR =
7.8 Statistické zpracování dat
Všechny výsledky jsou vyjádřeny jako průměr směrodatná odchylka (SD) u parametrických
a jako medián (25-75percentil) u neparametrických proměnných. Ke statistické analýze
parametrických veličin byl použit t-test pro srovnání 2 skupin (KP vs. KON) a one-way
ANOVA s Newman-Keuls post testy pro srovnání 3 skupin (pacienti dle stádia onemocnění),
u neparametrických veličin byl použit Man-Whitney U-test respektive Kruskal-Wallis
ANOVA. Data byla zpracována v programu Statistica verze 12.0 (Statsoft , 2017 CZ). Za
statisticky významné byly výsledky považovány při p 0,05.
33
8 Výsledky
Tato absolventská práce byla zaměřena na pacienty s karcinomem pankreatu. Celkem bylo
sledováno 52 pacientů (M/Ž = 31/21) s KP v porovnání se zdravými kontrolami, které byly se
skupinou KP spárovány na základě pohlaví a věku. Základní charakteristiky sledovaných
skupin jsou shrnuty v tabulce 5.
Tabulka 5: Charakteristika skupin
Parametr KP KON
N (M/Ž) 52 (31/21) 52 (31/21)
Věk (roky) 64,3 ± 10,1 60,9 ± 9,07
Kuřáci (N; %) 33; 63,5% 12; 23%
DM 2 (N; %) 19; 36,5% 0; 0%
Malnutrice (N; %) 26, 50% 0; 0%
Staging T2 (N; %) 12; 24% -
Staging T3 (N; %) 20; 38% -
Staging T4 (N; %) 20; 38% -
BMI (kg/m2) 25,5 ± 4,9 25,9 ± 3,67
NRI 96,7 ± 11,4 -
P-AMS (kat/l) 0,32 (0,135 – 0,733) 0,48 (0,39 – 0,57)
Lipasa (kat/l) 0,77 (0,37 – 1,81)** 0,6 (0,51 – 0,71)
CEA (g/l) 3,87 (1,88 – 7,70)*** 0,81 (0,5 – 1,9)
CA 72-4 (kU/l) 3,14 (1,76 – 23,84)** 1,79 (1,07 – 4,08)
CA 19-9 (kU/l) 314,75 (59,25 – 3837,9)*** 8,6 (5,8 – 11,2)
-fetoprotein (g/l) 2,7 (2,1 – 4,0)* 3,5 (2,7 – 4,4)
CRP (mg/l) 16,6 (7,4 – 55,15)*** 2,65 (1 – 5,08)
N:počet, DM: diabetes mellitus,BMI: Body mass index, WHCR: poměr pas/body, NRI- nutrition risk
index, P-AMS: pankreatická amyláza, CEA: karcinoembryonální antigen, CA72-4, CA19-9: tumorové
markery, CRP: C-reaktivní protein, KP:karcinom pankreatu, KON: kontrolní skupina; Data
prezentována jako průměr S.D. pro parametrické a medián (25-75 percentil) pro neparametrické
veličiny. Statistické zpracování bylo provedeno t-testem pro parametrické a Man-Whitney U-testem
pro neparametrické veličiny. * KP vs. KON; * p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001.
34
Pacienti s karcinomem byli dále rozděleni podle pokročilosti jejich onemocnění. Onemocnění
bývá většinou diagnostikováno až v jeho pozdějším stádiu, proto není ve studii žádný pacient
v 1. stádiu a do studie mohlo být zařazeno pouze 12 pacientů ve 2. stádiu. Dále bylo zařazeno
vždy 20 pacientů ve 3. a ve 4. stádiu.
Z tabulky 5 vyplývá, že polovina pacientů s KP trpělo těžkou malnutricí a 36,5% pacientů
mělo diabetes mellitus 2. typu. Dle předpokladu měla skupina KP oproti kontrolní skupině
signifikantně zvýšené hodnoty všech sledovaných nádorových markerů. Nejvyšší nárůst byl
pozorován u tumorového markeru CA 19-9, který bývá zvýšen nejvíce právě u nádorů
v dutině břišní a hlavně u nádoru pankreatu. Z výsledků dále vyplývá, že karcinom pankreatu
je provázen zánětlivými procesy, jak ukazují zvýšené hladiny CRP u KP ve srovnání s KON.
Tabulka 6: Markery lipidového a sacharidového metabolismu
Parametr KP KON
TC (mmol/l) 5,4±2,10 5,3±1,03
TAG (mmol/l) 1,9±0,93*** 0,98±0,36
HDL-C (mmol/l) 0,9±0,38*** 1,6±0,37
LDL-C (mmol/l) 3,6±0,39 3,3±0,85
APO-B (g/l) 1,3±0,45*** 0,9±0,25
NEMK 0,7±0,37*** 0,5±0,25
Glukóza (mmol/l) 7,4±3,59*** 5,1±0,46
HOMA-IR 2,31 (1,27 – 4,08)* 1,41 (1,07 – 1,89)
Insulin (mU/l) 7,07 (1,3 – 4,1) 6,45 (5,1 – 8,7)
C-peptid (nmol/l) 0,87 (0,59 – 1,12)** 0,65 (0,56 – 0,71)
Mikroalbuminurie (mg/l) 314,75 (59,25 – 3837,9)** 4,81 (2,8 – 7,4)
TC: celkový cholesterol, TAG: triacylglyceroly, HDL-C: lipoproteiny s vysokou hustotou (High
density lipoproteins), LDL-C: lipoproteiny s nízkou hustotou (Low density lipoproteins), APO-B:
Apolipoprotein B, NEMK: neesterifikované mastné kyseliny, HOMA-IR: Homeostatické modelové
hodnocení inzulínové rezistence (Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance; HOMA-IR =
insulin*glukóza/22,5); KP: karcinom pankreatu, KON: kontrolní skupina. Data prezentována jako
průměr S.D. pro parametrické a medián (25-75 percentil) pro neparametrické veličiny. Statistické
zpracování bylo provedeno t-testem pro parametrické a Man-Whitney U-testem pro neparametrické
veličiny. * KP vs. KON; * p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001.
35
V rámci studie byly sledovány základní lipidové parametry a některé parametry
diabetologického panelu. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 6. Více jak třetina pacientů s KP
trpěla onemocněním DM, což se projevilo ve zvýšených hodnotách glukózy, C-peptidu,
HOMA-IR a mikroalbuminurii. Z parametrů lipidového profilu byly zjištěny zvýšené hladiny
triacylglycerolů, Apo B a neesterifikovaných mastných kyselin a snížené hladiny HDL
cholesterolu.
Při srovnání pacientů s KP a kontrolní skupiny jsme se v této studii zaměřili na markery
oxidačního stresu, odrážející působení reaktivních forem kyslíku na lipidy. Vybrány byly dva
markery – konjugované dieny a oxidované LDL částice. Jak ukazuje Graf 1, byly koncentrace
obou sledovaných markerů zvýšeny u KP oproti KON.
0
20
40
60
80
100
KP KON
mm
ol/l
Konjugované dienyA
*
0
50
100
150
200
KP KON
U/l
Oxidované LDL
**
B
Graf 1: Koncentrace markerů oxidačního stresu u pacientů s karcinomem pankreatu
KP: karcinom pankreatu, KON: kontrolní skupina Data prezentována jako průměr S.D. Statistické
zpracování bylo provedeno t-testem pro parametrické. * KP vs. KON; * p 0,05; ** p 0,01.
36
Dalším sledovaným parametrem byla arylesterázová a laktonázová aktivita antioxidačního
enzymu paraoxonázy, jejímž úkolem je ochrana HDL a LDL částic proti reaktivním formám
kyslíku. Spolu s aktivitou PON byly dále sledovány koncentrace sérového amyloidu A a
apolipoproteinu A1. Výsledky ukazuje Graf 2. Pacienti s KP měli ve srovnání se zdravými
osobami sníženou aktivitu jak arylesterázové (Graf 2a), tak laktonázové (Graf 2b) aktivity
paraoxonázy, sníženou koncentraci apo-A1 (Graf 2c) a zvýšené koncentrace SAA (Graf 2d).
Skupina pacientů s KP byla rozdělena podle stádia onemocnění, ve kterém se pacienti
nacházeli, na 3 skupiny. Jednak byly sledovány rozdíly v hladinách tumorových markerů
v závislosti na stádiu onemocnění, jednak byly sledovány rozdíly v hladinách markerů
oxidačního stresu a aktivity antioxidačního enzymu paraoxonázy.
Žádný z dnes používaných tumorových markerů není dost specifický a citlivý pro odlišení a
včasnou diagnostiku karcinomu pankreatu. Sérový amyloid A je navrhován jako možný nový
diagnostický marker KP. Rozdíly v hladinách dnes užívaných tumorových markerů a nově
navrhovaného markeru SAA ukazuje Graf 3. Jak je z grafu patrné, nejvíce zvýšené hladiny
všech tumorových markerů mají pacienti ve 4. finálním stádiu nemoci. Nejjasněji jsou rozdíly
mezi jednotlivými stádii vyjádřeny u koncentrace SAA.
V hladinách markerů oxidačního stresu nebyly nalezeny žádné signifikantní rozdíly mezi
pacienty v různých stádiích nemoci. Ze dvou sledovaných aktivit PON, stádium nemoci
reflektovala pouze arylesterázová aktivita PON, kdežto u laktonázové aktivity PON nebyly
pozorovány žádné rozdíly mezi jednotlivými stádii (Graf 4).
37
0
50
100
150
200
250
KP KON
mU
/lPON-AA
***
0
10
20
30
40
50
KP KON
mU
/l
PON-LB
***
0
0,5
1
1,5
2
2,5
KP KON
g/l
Apo A1C
***
0
50
100
150
200
KP KON
g
/ml
SAAD
***
Graf 2: Aktivita paraoxonázy u pacientů s karcinomem pankreatu
KP: karcinom pankreatu, KON: kontrolní skupina, PON-A: arylesterázová aktivita paraoxonázy, PON-L: laktonázová aktivita paraoxonázy, SAA: sérový
amyloid A. Data prezentována jako průměr S.D. Statistické zpracování bylo provedeno t-testem. * KP vs. KON; *** p 0,001.
38
0
5
10
15
20
25
30
35
40
T2 T3 T4
g
/l
******
CCEA
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
T2 T3 T4
kU
/l
**
CA 72-4B
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
T2 T3 T4
*
*
CA 19-9k
U/l
A
0
50
100
150
200
250
300
T2 T3 T4
g
/ml
***
SAAD
*
Graf 3: Tumorové markery v závislosti na stádiu onemocnění
T: stádium onemocnění, SAA: sérový amyloid A, CEA: karcinoembryonální antigen, CA72-4, CA19-9: tumorové markery. Statistické zpracování bylo
provedeno Kruskal Wallis Anovou s post testem. * T4 vs. T2, T3; * p 0,05; *** p 0,001.
39
0
50
100
150
200
T2 T3 T4
mU
/lPON-A
A
0
5
10
15
20
25
T2 T3 T4
mU
/l
PON-LB
***
x
Graf 4: Aktivita paraoxonázy v závislosti na stádiu onemocnění
T: stádium onemocnění, PON-A: arylesterázová aktivita paraoxonázy, PON-L: laktonázová
aktivita paraoxonázy. Statistické zpracování bylo provedeno testem one-way ANOVA s
Newman Keuls post testem. * T4 vs. T2, T3; x T3 vs. T2; * p 0,05; *** p 0,001.
40
9 Diskuze a závěr
Ve své absolventské práci jsem se zaměřila na karcinom pankreatu. Jednak jsem sledovala
parametry vypovídající o oxidační rovnováze organismu, jednak jsem se zaměřila na markery
sloužící k diagnostice a monitorování KP. Z parametrů vypovídajících o oxidační rovnováze
jsem si zvolila jednak markery oxidačního stresu – CD a ox-LDL, které charakterizují míru
poškození lipidů reaktivními formami kyslíku, jednak antioxidační enzym paraoxonázu, jehož
úkolem je ochrana LDL a HDL částic proti působení oxidačního stresu. Z markerů
využívaných v diagnostice a monitorování karcinomů byly sledovány hladiny markerů CEA,
CA 72-4 a CA 19-9. Dále byly analyzovány hladiny proteinu SAA, který je některými vědci
navrhován jako potenciální nový diagnostický marker pro karcinomy pankreatu.
Do studie bylo zahrnuto celkem 52 pacientů s KP a 52 na základě pohlaví a věku spárovaných
zdravých kontrol. Pacienti s KP byly dále rozděleni do skupin podle míry pokročilosti – podle
stádia onemocnění. Vzhledem k tomu, že KP je v prvé fázi asymptomatické onemocnění, jen
velmi zřídka se ho podaří diagnostikovat v raném stádiu. Ve většině případů, v době, kdy se u
pacientů začnou projevovat nějaké potíže, je nemoc již v pokročilém stádiu. Z tohoto důvodu
nebylo možno do studie zahrnout pacienty ve stádiu 1 onemocnění a ve 2. stádiu jsme získali
pouze 12 pacientů. V rámci této absolventské práce bylo vyšetřováno a hodnoceno vždy 20
pacientů ve stádiu 3 a 4.
Dle očekávání byly u pacientů s KP oproti KON pozorovány zvýšené hladiny všech
sledovaných diagnostických markerů karcinomů (CEA, CA 72-4, CA 19-9) a též pozměněný
diabetický soubor (hladina glukózy, koncentrace insulinu, HOMA-IR). Pozorované rozdíly
v diabetickém profilu mezi KP a KON jsou podmíněny poškozením pankreatu vlivem
karcinomu a rozvojem diabetu mellitu (DM) u KP pacientů (celkem u 19 z 52 pacientů byl
diagnostikován DM). Karcinom vychází z exokrinní části pankreatu a ovlivňuje tak tedy
trávení. Jedním z doprovodných projevů u pacientů s KP je tedy postupný úbytek na váze a
rozvoj malnutrice. Ve sledovaném souboru KP bylo celkem 28 pacientů s těžkou malnutricí,
což koresponduje se sníženými hladinami albuminu v krvi KP oproti KON.
Ve srovnání s KON byla u pacientů s KP pozorována zvýšená koncentrace CRP, markeru
zánětu. Chronický zánět pankreatu se řadí mezi faktory ovlivňující vznik karcinomu
41
pankreatu. A na druhé straně nekrotický proces vyvolaný působením nádoru vede k rozvoji
zánětlivého procesu.
Výsledky této studie ukazují, že KP je spojen se zvýšeným oxidačním stresem. Pozorovány
byly zvýšené hladiny jak CD, tak ox-LDL u pacientů s KP ve srovnání s KON. Tyto získané
výsledky jsou ve shodě se studiemi Vecka et al. (41) a Kodydková et al. (42). Jak
arylesterázová, tak laktonázová aktivita antioxidačního enzymu PON byla u KP pacientů
snížená ve srovnání s KON. V současnosti byly publikovány dvě práce zabývající se aktivitou
PON1 u pacientů s PC a v obou případech byla u tohoto onemocnění pozorována snížená
aktivita PON1 (42; 43).
Hladina SAA byla sledována hned ze dvou důvodů, jednak je prokázáno, že v případě
akutního zánětu SAA vytěsňuje PON z její vazby na apo-A1 v HDL a nahrazuji ji, jednak
protože je tento protein studován jako potenciální nový marker pro diagnostiku a monitoring
karcinomu pankreatu. V naší studii byly pozorovány zvýšené koncentrace SAA u KP oproti
KON, což je ve shodě s dříve publikovanými studiemi (42; 44; 45).
Bylo prokázáno, že SAA stimuluje svoji vlastní transkripci, stejně jako transkripci pro-
zánětlivých proteinů jako S100A8 a S100A9 a je tak spojeno s růstem a metastazováním
tumoru. Vzhledem k tomu, že SAA stimuluje migraci a invazi nádorových buněk, byl
některými vědci navržen jako možný diagnostický marker KP. Dřívější studie však
zpochybňují dostatečnou citlivost a specifičnost SAA jako potenciálního markeru KP (44;
45).
Výsledky získané v této studii ukazují, že zatímco arylesterázová aktivita PON u pacientů
s KP se s pokročilostí onemocnění snižuje, koncentrace SAA naopak vzrůstá a oba parametry
se signifikantně liší u pacientů v jednotlivých stádiích onemocnění. Podíváme-li se na běžně
testované tumorové markery a jejich změny podle pokročilosti onemocnění, ani jeden z těchto
markerů nekoreluje se stádiem KP. Z tohoto úhlu pohledu se SAA jeví jako lepší
monitorovací marker KP než tumorové markery CEA, CA 72-4 či CA 19-9. Zda je však
specifický pouze pro KP není možno v rámci této studie zjistit, vyžadovalo by to rozsáhlejší
studie s pacienty s různými druhy karcinomů a i dalších onemocnění.
42
Výsledky získané v rámci mé absolventské práce potvrzují zvýšený oxidační stres u pacientů
s KP spojený se sníženou aktivitou antioxidačního enzymu PON1. Dále bylo zjištěno, že
dosud užívané tumorové markery nekorelují se stádiem onemocnění a že nově navrhovaný
marker SAA by potenciálně mohl být markerem odrážejícím pokročilost onemocnění KP.
43
10 Seznam použité literatury a zdrojů informací
1. DVOŘÁČKOVÁ J.: Cytologie pankreatu: manuál EUS-FNA on site. Praha: Maxdorf,
2013. ISBN 978-80-7345-320-6.
2. BOROVANSKÝ L.: Soustavná anatomie člověka. Praha: Státní zdravotnické
nakladatelství, 1960.
3. MARTÍNEK J, Vacek Z.: Histologický atlas. Praha: Grada, 2009. ISBN 978-80-247-
2393-8.
4. ČIHÁK R.: Anatomie 2. Třetí, upravené a doplněné vydání. Praha: Grada Publishing,
a.s., 2013. ISBN 978-80-247-4788-0.
5. ZAVORAL M.: Karcinom pankreatu. Praha: Galén, c2005. ISBN 80-7262-348-6.
6. POVÝŠIL C, ŠTEINER I.: Speciální patologie. 2., dopl. a přeprac. vyd. Praha: Galén,
c2007. ISBN 978-80-7262-494-2.
7. SCHEIN M, ROGERS Paul N.(ed.): Urgentní břišní chirurgie: Schein's common sense
emergency abdominal surgery. Praha: Grada, 2011. ISBN 978-80-247-2357-0.
8. REJCHRT S.: Diagnostika cystických tumorů pankreatu. Bull HPB. 2007;15:35-7
9. https://www.linkos.cz/slovnicek/nadorove-markery-onkomarkery/ (platné dne 26. 1.
2018)
10. http://www.cskb.cz/cskb.php?pg=doporuceni--tumorove-markery#biol (platné dne 26. 1.
2018)
11. http://www.stefajir.cz/?q=tumor-markery (platné dne 26. 1. 2018)
12. https://www2.ikem.cz/plm_lp/_LP_12299-L0000006.htm (platné dne 9. 2. 2018)
13. PRÉCOURT LP, Amre D, Denis MC, Lavoie JC, Delvin E, Seidman E, Levy E.: The
three gene paraoxonase family: physiologic roles, actions and regulation. Atherosclerosis
2011; 214(1): 20-36.
44
14. HAREL M, Aharoni A, Gaidukov L, et al.: Structure and evolution of the serum
paraoxonase family of detoxifying and antiatherosclerotic enzymes. Nat Struet Mol Biol
2004; 11: 412-9.
15. DEAKIN SP, James RW.: Genetic and environmental factors modulating serum
concentrations and activities of the antioxidant enzyme paraoxonase-1. Clin Sci (Lond)
2004; 107(5): 435-47.
16. JOSSE D, Lockridge O, Xie W, Bartels CF, Schopfer LM, Masson P.: The active site of
human paraoxonase (PON1). J Appl Toxicol 2001; 21, S7–S11.
17. KUO CL, La Du BN.: Calcium binding by human and rabbit serum paraoxonases.
Structural stability and enzymatic activity. Drug Metab. Dispos. 1998; 26, 653–60.
18. KUO CL, La Du BN.: Comparison of purified human and rabbit serum paraoxonases.
Drug Metab Dispos 1995; 23: 935–944.
19. JOSSE D, Xie W, Renault F, Rochu D, Schopfer LM, Masson P, Lockridge O.:
Identification of residues essential for human paraoxonase (PON1)
arylesterase/organophosphatase activities. Biochemistry 1999; 38, 2816–2825.
20. DAVIES H. G., Richter, R. J., Keifer, M., Broomfield, C. A., Sowalla, J., Furlong, C. E.:
The effect of the human serum paraoxonase polymorphism is reversed with diazoxon,
soman and sarin. Nat Genet 1996; 14: 334–336.
21. AVIRAM M, Billecke S, Sorenson R, et al.: Paraoxonase active site required for
protection against LDL oxidation involves its free sulfhydryl group and is different from
that required for its arylesterase/paraoxonase activities: selective action of human
paraoxonase allozymes Q and R. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998a; 18(10): 1617-24.
22. BILLECKE S, Draganov D, Counsell R, Stetson P, Watson C, Hsu C, La Du BN.:
Human serum paraoxonase (PON1) isozymes Q and R hydrolyze lactones and cyclic
carbonate esters. Drug Metab Dispos 2000; 28, 1335–1342.
23. RAJKOVIC MG, Rumora L, Barisic K.: The paraoxonase 1, 2 and 3 in humans. Biochem
Med (Zagreb) 2011; 21(2): 122-30.
45
24. DRAGANOV DI, Teiber JF, Speelman A, Osawa Y, Sunahara R, La Du BN. Human
paraoxonases (PONÍ, P0N2, and P0N3) are lactonases with overlapping and distinct
substrate specificities. J Lipid Res 2005; 46: 1239-47.
25. NGUYEN SD, Hung ND, Cheon-Ho P Ree KM, Dai-Eun S.: Oxidative inactivation of
lactonase activity of purified human paraoxonase 1 (PON1). Biochim Biophys Acta
2009; 790: 155-60.
26. YILMAZ N.: Relationship between paraoxonase and homocysteine: crossroads of
oxidative diseases. Arch Med Sci 2012; 8(1): 138-53.
27. JAKUBOWSKI H.: Calcium-dependent human serum homocysteine thiolactone
hydrolase. A protective mechanism against protein N-homocysteinylation. J Biol Chem
2000; 275: 3957–3962.
28. MACHARIA M, Hassan MS, Blackhurst D, Erasmus RT, Matsha TE.: The growing
importance of PON1 in cardiovascular health: a review. J Cardiovasc Med (Hagerstown).
2012; 13(7): 443-53 .
29. PERLA-KAJÁN J, Jakubowski H. Paraoxonase 1 protects against protein
Nhomocysteinylation in humans. FASEB J 2010; 24: 31-6.
30. MACKNESS MI, Arrol S, Durrington PN.: Paraoxonase prevents accumulation of
lipoperoxides in low-density lipoprotein. FEBS Lett 1991; 286, 152–154.
31. MACKNESS MI, Arrol S, Abbot C, Durrington PN.: Protection of low-density
lipoprotein against oxidative modification by high-density lipoprotein associated
paraoxonase. Atherosclerosis 1993; 104: 129–135.
32. WATSON AD, Berliner JA, Hama SY, La Du BN, Faull KF, Fogelman AM, Navab M.:
Protective effect of high density lipoprotein associated paraoxonase. Inhibition of the
biological activity of minimally oxidised low density lipoprotein. J Clin Invest 1995; 96,
2882–2891.
33. ECKERSON HW, Wyte CM, La Du BN.: The human serum paraoxonase/arylesterase
polymorphism. Am J Hum Genet 1983; 35: 1126-1138 s.
46
34. HASSELWANDER O, McNaster D, Fogarty DG, Peter Maxwell A, Paul Nicholls D,
Young IS.: Serum paraoxonase and platelet-activating factor acetylhydrolase in chronic
renal failure. Clin Chem 1998; 44: 179–81.
35. FERRÉ N, Camps J, Prats E, Vilella E, Paul A, Figuera L.: Serum paraoxonase activity: a
new additional test for the improved evaluation of chronic liver damage. Clin Chem
2002; 48: 261.
36. GAIDUKOV L, Tawfik D.: The development of human sera tests for HDL-bound serum
PON1 and its lipolactonase activity. J Lipid Res 2007; 48: 1637–46.
37. DRAGANOV DI, Stetson PL, Watson CE, et al.: Rabbit serum paraoxonase 3 (PON3) is
a high density lipoprotein-associated lactonase and protect slow density lipoprotein
against oxidation. J Biol Chem. 2000; 275: 33435-42.
38. RAINWATER DL, Rutherford S, Dyer TD, et al.: Determinants of variation in human
serum paraoxonase activity. Heredity (Edinb). 2009; 102: 147-54.
39. WIELAND H, Seidel D.: A simple specific method for precipitation of low density
lipoproteins.J Lipid Res 1983; 24:904-909.
40. AHOTUPA M, Ruutu M, Mantyla E.: Simple methods of quantifying oxidation products
and antioxidant potential of low density lipoproteins.Clin Biochem 1996;29: 139-144
41. VECKA M, Jáchymová M, Vávrová L, et al.: Paraoxonase-1 (PON1) status in pancreatic
cancer: relation to clinical parameters. Folia Biologica. 2012; 58(6):231-7.
42. KODYDKOVA J, Vavrova L, Stankova B, Macasek J, Krechler T, Zak A.: Changes in
antioxidants and oxidative stress markers in pancreatic diseases. Pancreas 2013; 42(4):
614-21.
43. AKÇAY MN, Polat MF, Yilmaz I, Akçay G.: Serum paraoxonase levels in pancreatic
cancer. Hepatogastroenterology 2003a; 50 Suppl 2: ccxxv-ccxxvii.
44. YOKOI K, Shih LC, Kobayashi R, et al.: Serum amyloid A as a tumor marker in sera of
nude mice with orthotopic human pancreatic cancer and in plasma of patients with
pancreatic cancer. Int J Oncol 2005; 27(5): 1361-9.
47
45. FIRPO MA, Gay DZ, Granger SR, et al.: Improved diagnosis of pancreatic
adenocarcinoma using haptoglobin and serum amyloid A in a panel screen. World J Surg
2009; 33(4): 716-22.
48
11 Seznam zkratek
ACTH adrenokortikotropní hormon
AFP alfa-fetoprotein
APO-A1 apolipoprotein A
APO-B apolipoprotein B
BMI body mass index
CA125 sérový nádorový marker
CA15-3 glykoproteinový nádorový marker
CA 19-9 glykolipidový nádorový marker
CA 72-4 glykopeptidový nádorový marker
CD Clastr of Differentiation (zkratka pro identifikaci molekul na povrchu buněk,
které poskytují informaci o jejich imunofynotypu)
CEA karcinoembryonální antigen/nádorový marker
CRP C-reaktivní protein
CT počítačová tomografie
CYFRA21-1 fragment cytokeratinu 19
DM diabetes mellitus
EGF epidermal growth factor receptor / epidermální růstový faktor
ERCP endoskopická retrográdní cholangiopankreatografie
EUS endoskopická ultrasonografie
EUS-FNA tenkojehlová aspirace pod sonografickou navigací
EUS- FNAB tenkojehlová aspirační biopsie pod sonografickou navigací
hCG lidský choriogonadotropin
HDL-C lipoproteiny s vysokou hustotou (High density lipoproteins)
HER2/neu transmembránový receptor
49
HOMA-IR homeostatic model assessment of insulin resistance /homeostatický model
hodnocení inzulínové rezistence
IDUS intraduktální sonografie
IMPN intraduktální papilární mucinózní neoplazie
KD konjugované dieny
KON zdravé kontroly
KP karcinom pankreatu
LD laktátdehydrogenáza
LDL-C lipoproteiny s nízkou hustotou (Low density lipoproteins)
M muži
MCC mucinózní cystický karcinom
MR magnetická rezonance
N počet
NEMK neesterifikované mastné kyseliny
NRI nutrition risk index
NSE neuron specifická enoláza
ox-LDL oxidované LDL
p-AMS pankreatická amyláza
PDA duktální adenokarcinom / pancreatic ductal adenocarcinoma
PON paraoxonáza
PON-A arylesterázová aktivita paraoxonázy
PON-L laktonázová aktivita paraoxonázy
PSA prostatická kyselá fosfatáza
SAA sérový amyloid A
SD směrodatná odchylka
TAG triacylglyceroly
50
TC celkový cholesterol
TPA tkáňový polypeptidický antigen
TPS tkáňový specifický polypeptidový antigen
TRIS trisaminomethan
VFN Všeobecné fakultní nemocnice
WHCR poměr pas/body
Ž ženy
51
12 Seznam tabulek
Tabulka 1: Diferenciálně diagnostické rysy adenokarcinomu a reaktivní hyperplazie u
chronické pankreatitidy ............................................................................................................ 19
Tabulka 2: Typické cytologické rysy adenokarcinomu pankreatu podle stupně diferenciace 21
Tabulka 3: Parametry měření pro stanovení PON 1 ................................................................. 30
Tabulka 4: Schéma pro stanovení aktivity PON 1 ................................................................... 30
Tabulka 5: Charakteristika skupin ............................................................................................ 33
Tabulka 6: Markery lipidového a sacharidového metabolismu................................................ 34
52
13 Seznam grafů
Graf 1: Koncentrace markerů oxidačního stresu u pacientů s karcinomem pankreatu ............ 35
Graf 2: Aktivita paraoxonázy u pacientů s karcinomem pankreatu ......................................... 37
Graf 3: Tumorové markery v závislosti na stádiu onemocnění ................................................ 38
Graf 4: Aktivita paraoxonázy v závislosti na stádiu onemocnění ............................................ 39